Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейраминидазный компонент распространенных вирусов гриппа птиц

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Нейраминидазный компонент распространенных вирусов гриппа птиц"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВБГГЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ именй К. И. СКРЯБИНА

МУНТЯНУ Любовь Николаевна

НЕЙРАМЩЦАЗШЙ КОМПОНЕНТ РАСПРОСТРАНЕННЫХ ВИРУСОВ ГШША ГГПЩ ОЗ.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соиекашэ ученой степени кандидата биологических наук

Для служебного пользования

Экз.

На правах рукописи

Работа вшолиеиа во Всесоюзной научи о-яс следователь ском ветеринарном иистштутв птицеводства Госагропрома СССР.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Официалыше оппоненты: доктор медицинских наук М.А.Яхно;

Ведущее учреждение: Ленинградский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера МЭ СССР

" *" часов на заседании специализированного совета К 120.36.05 по присуждение ученой степени кандидата наук в Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им.К.И.Скрябина по адресу: 109472, Москва, ул.Академика Скрябина, 23, тел.377-93-63.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан " " 1991 г.

Д. Б. Голубев.

кандидат биологических наук З.Ф.Богаутдино

Защита состоится

1991 г. в

Ученый секретарь специализированного совета

ОЩЛЯ ХАРЫОТЗРИСТИКл РАБОТЫ

Актуальность продлеми. Среди шгфекциошьк вирусных болезней птиц грипп является одной из наиболее актуальных (Осидзе, 1980). Эпизоотическая обстановка по гриппу птиц усугубилась в последние четыре года, в частности, в 10 странах Африки, 5 Азии и США (Макарович и др., 1985). В 1983-84 г.г. напряжшшая эпизоотическая ситуа-щя возникла сроди домашних птиц в США и среди индеек в Ирландии ( Есгоаде et а1.9 1984). В СССР выбраковка птицы за счет патоген-ностл вируса гриппа А шестого сероподтила составила 10-15 %, летальность 10-12 %, сшшише яйценоскости - 45-50 $ (Дьяконова и др., 1983).

Все сказанное свидетельствует об актуальности изучения гриппа птиц, и в частности особенностей его возбудителей.

Структура И'строение вирусов гриппа птиц подобны вирусам гриппа человека и других млекопитающих. Поверхность частиц покрыта двумя типами выступов, один из них гемагглютшшн (ГА), другой нейра-шпгадаза (НА ) ( НоЪег-Ь et а1о„ 1984 )«

ГА является одним из самых крупных белков в вирионе, на его долю приходится 25-35 % белков» Он ответственен за прикрепление вирусной частицы к клетке хозяина и вовлекается в начальные стадии инфекции. Именно против ГА направлены антитела, нейтрализующие пн-фекционность вируса гриппа ( С1юрр1п et а1.» 1973 ). В виду столь важной роли гемагглютинина в развитии инфекции, структура этого белка привлекала внимание многих исследователей, и к настоящему времени в структурном отношении он наиболее изучен { ТУеЪвйег о1., 1986 ).

Второй поверхностный антиген вируса гриппа - нейраминидаза. Этот фермент в составе вируса гриппа известен с 1942 года, однако функциональная роль его в репродукции вируса до сих пор в полной :,;еро не выяснена. Предполагается, что главная функция нейралшшда-зы - предотвращение агрегации вирусных частиц на поверхности клеток. Также известно, что нейраминидаза играет большую роль в иммунологии и патогенезе заболевания ( КИЪоигпе et с1., 19В7 ). Опреде-

ленке антинейрагляшвдазных антител является важным фактором в диагностике гриппозной инфекции у птиц, так как антинейраминидазные антитела сохраняются в течение длительного времени и титрд этих антител возрастают при встрече с родственным антигеном. Поэтому вполне оправдано титрование их с целью ретроспективной диагностики

и определения иммунного статуса птицопоголовья. На сегодня такой диагностики в лтацаводстве нот.

Цель .я задача -работу. Целью настоящих исследований явилось разработка способа получения препаратов нейрамлшдаз вирусов грш птиц пригодных для использования их в.реакции подавления нойралш дазпой активности о цоль^ индикации штшофадишдазшх антител.

В соответствии о цель® работы поставлены слодувдю задачи:

1. Определить температуру инактшадш тйргшшдааного ко;,гас вента в различных вирусах (ТИН^ и-ТЯЦдод) и сопоставить нолучсш; данные о итогами аналогичного исследования вирусов гриппа человек

2. Сравнительно охарактеризовать гемагглтошшругаций и иоИра:.: шщазный компоненты по юс термочувствителыюсти с различных штага

3. Разработать иа основе всех полученных данных способ полуп йия ноИраюшндазного компонента вирусов гриппа птиц, как антигена цригодпого для постановки реакции подавления неЕраыпшдазпо!: акти нооти о сыворотками, птиц.

4. Выявление антинейршшщдазных антител в ИНГА о использова ниом препаратов нейралшшдаз вируса гриппа, в гнперкшушпк и половых сыворотках птиц.

Научная норизяа. Установлено, что уровень нейрашгадазной активности раз!шх штаммов вирусов гриппа птиц колебался в весьма . широких пределах, и эти колебания по корродируют с уровнем гемаг-глютигафующей и инфекционной активности. -

Впервые обнаружено, что нейраминвдаза 7 исследованных эталонных штаммов вируса гриппа птиц, в отличие от большинства вирусов человека, более термостабильна, чем гемагглютишш тох :::о вирусов.

Впервые установлено, что прогревание впруссодорагицсК агаап-тоисной жидкости при температуре инактивации гемагглютпппиа ырн-. водит к получению препаратов нойрамшшдаз вирусов гриппа Й'тиц, при годных для постановки реакции подавлешш нейраашпщазиоД октиыюст

Установлено наличие аптгаюПрампнндазиых антител в половых сыворотках птиц, из неблагополучию; по гриппу нтпцехозяЯств.

Практдчеокдя иенгрсть. Разработан иовнИ способ приготовления препарате» пойрампщаз вирусов гриппа птиц, прнгодтх длй постановки реакции подавления пойршшщдазной активности с енвокоткялг больных гриппом птиц. Сущность опособа приготовления составила сод шю заяпзг на изобретете (.'Г 4483390/15-135640 Полаптольноо релеп

выдаче авторского свидетельства от 31.07.8?г.) и явится основой охнологичеохой документации на производство препаратов (Выполнена I соавторстве с Голубевым Д.Б.».который подготовил общие сведения ю способу получения нейрамшвдаз и предложил использовать антигены 1 РПШ.

Составлены мет одические рекомендации по использованию препара-'оп нейрамшшдаз вирусов гриппа птиц в реакции подавления нейрами-мдазной активности (ИШ.) о целью,выявления антикейрамшвдазных , штптол, одобренные Ученым советом Всесоюзного НИШ птицеводства СЗ апреля 1989 г.- Указанные рекомевдации вошли в наставление по лабораторной диагностика гриппа.птиц, что даст возможность унифицировать, повысить качество и ускорить диагностику гриппа птиц в промышленном птицеводстве.- (Выполнены в соавторстве с Голубевым Ц.Б., который подготовил общие сведения об использовании антигенов в ША),

Апробация -работа. Материалы, диссертационной работы доложены па производственной конференции молодых ученых и специалистов ЩИВИП "Новой в диагносте, лечении и профилактике болезней птиц" (Ленинград. 1987 г.), па научном семинаре "Использование современ- . тле методов в исследовании в биологии" (Ленинград» 1988 г.), на Методическом и Ученом советах Всесоюзного НИШ птицеводства (Ленинград, 1987, 1988 г. г.).-

Объем я структура т>аботн. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения. Диссертация иллюстрирована 7 рисунками и 24 таблицами. В1блиографический указатель включает 270 источш-ков литературы, в том числе 204 иностранных автора.

Основные полояеиня вцносимш на зашгу.

1. Нейрашшдаза вирусов гриппа птиц обладает большей термо-стабялыюстьв, чем'гемагглюташия, в отлизие от вирусов гриппа человека, где наблюдается обратное соотношение.

2. Приготовление вкруейодержащей аллаитоисиой квдкости при температуре инактивации гемагглюишина позволяет получить препараты нейргмпнидаз вирусов гриппа-птиц, пригодные для постановки реакции подавления нейра\шидазной активности , с полевыми сыворотками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и метода исследований.

В лабораторных опытах использованы 7 эталонных штсшмов вирус гриппа птиц и 9 штаммов вирусов гриппа человека-, 30 кур, породы "Бройлер-6", 60-120-днввного возраста и 12000 эмбрионов. Исследов полевые сыворотки, доставленных из различных птицехозлйста.

Вирусы накапливали в аллантоисной полости Ю-даювншс куриных эмбрионов при заражающей дозе 3,6 Э1Щ50/0,1 мл. Титр гомагглютина определяли общепринятым методом. Величину инфекционного титра рас. тывали по методу Рида и Менча { Яееа et а1. , 1938).

При определении шйрачлшщцазиой активности аллаптоисиые виру| содержащие жидкости разводили в 0,15 М ФСБ (рН 5,9-6,0) от 1:2 до 1:4096. В качестве субстрата использовали овомуцин, приготовлении по методу А.Оо^есЬаИг е* а1, (1949). Об активности НА суда по количеству освобожденной n -ацетилнейрамдповой ( иаиа ] кислотн, определенной по методу а.апйпо;« (1961). Колик

ство фермента вцралгали в условных едшшцах, которые расчитывали по формуле.

Условные единицы = К®месэ®о^§Ш§нтатишшс_ашШЦ_____

^ ив едшшцн количество гемагглютинирунцих едшшц

За одну ферментативную единицу активности принимали такое ко/ чество фермента, выраженное в £ , которое катализирует отщеплен от субстрата I мкг нейраминовой молоты в точение I минуты (рН 5,9-6,0, 37 °С).

В отдельных разделах работы, для сопоставления полученных результатов о данными опубликованных работ по нейрашншдазной активности вирусов гриппа человека, нейраминидазную активность выражали в единицах оптической плотности.

Температуру инактивации нейрашшвдазы 100 % (ТШ100) и 50 % (ТННэд) определяли при прмраваши рабочего разведения вирусной жидкости в течение 30 минут при тспнературо от 40 до 70 °С, с инте валом в 2 градуса. Остаточную ИА активность определяли, как огогса выше.

При определении температуры инактивацшх ГА вирусов гриппа птиц и человека использовали вируссодераацую яидаость с Активность: ид от 0,300 до 0,900 ед.опт.плт. с титром гемагглкшшацпи по нилсо 1:8. Поело прогревания вирусной яндкостп определяли остаточную иеПрг;.:1гп1дазпз'» активность л наличие агглитиншцтп.

Реакцию подавления нейрамнпвдазиой гйтпвиостн (Ш1Л) с целышм прусом л получсгаиы препаратом яейрашшидазного антигена ставили о мотодуд.А;)тагû-Непгу al(I974).

РЕЗУЛЬТАТ!!

Характеристика кнфекшотюй. . гемагглвтинитшодой и нейрамитшааиой :

ктнвностп вирусов гриппа птиц.

Достаточно хорошо изучена антигенная сшдафичность НА вирусов риппа птиц, которая получила отражение в классификации вирусов гриппа :тиц ВОЗ 1980 г. ( Aeeaed е4 в1. . , 1980). Так, по иммунологи-:ескш показателям выделяется 9 различных серологичоских подтипов Ш , >езко не различающихся между собой сколько-нибудь существенно по >ерментативной активности С Blok et al» , 1902). По друптм

;аннш, активность НА бша различной у разных штаммов одного и ■ого же сероподтша (Ткаченко, 1973; Ким л др., 1977). Следует также ¡тметить, что нет единой системы измерения и оценки на шстивности ярусов гриппа птиц. Мы сделали попытку уточнить этот вопрос, т.е. -;ать характеристику в сравнительном шгано и в единой системе измерения на активности семи различных эталонных атомыов вирусов гриппа птиц. В результате исследования установлено, что эталошше штаммы iiipycoB гриппа птиц (семь различных серолодтипов) обладают разной ,емагглютшп1рущеИ-(1:б4 - 1:1024} и инфекционной активностью :5,23 - 8,70 ЭЗД50/1 мл) при однотипных условиях накопления (табл.1).

Таблица I

Гсмагглютигсфущий титр, инфекционная и нейрашшидазиая активность 7 оталоших штагдаов вирусов гриппа птиц

' К Ъттпг, ЧЧит ТА W1T /Т „* НА ШОТГОНОСТЬ,

t/n

Вирусы : Титр ГА 3!%/!« NA

А/щшлепок/Гермагп1я/49Н10Е71:1024 6,27-7,68 1,64-10,5

>. Д/утка/Англ:1я/56 (НШб) 1:128-1:512 5,65-7,80 42,0-299,0

3. А/уткаЛехословакпд/беСнадб)' 1:64-1:256 5,39-8,70 39,0-157,0

!. «/1фач1'л/Ю.Л:рпса/61 (Н5ИЗ) 1:64-1:256 б;77-3,23 -26,0-165,0

>. А/пкдш1:г/;!ассачузотс/6С|йнА1:128-Х:512 5,84-8,31 6,0-39,0

5. А/утка/Лфг:я1а/63(НЗЛв) 1:120-1:255 5,28-7,66 85,0-390,0

7. А/пцдпк/Онтарио/6118/68$ЙМ4) I:I28-1:512 6,59-3,0 1.2-2.5П

НА • активность,в условных единицах,у разных штаммов варыгрус в широких пределах от 2,2 до 390 усл.ед. Активность нейрсшгащази исследованных вирусов не зависит от.гшагглютшшрукщей и не коррелирует с ней. Так, высозювирулентпыв штатан характеризуются низкой ЫА активностью, а среда авирулентннх встречаются штаммы с высокой и низкой активностью нейрашвддазн (Соколов и др., 1970). В то ее время вирусы гриппа группируются по патогенности по зависимо от активности НА а ГА (Пысина и др., 1970). Наши результаты частично подтверждают данные Т.В.Пысиной и др., (1978), Так, самые патогенные штаыш среда вирусов гриппа птиц - с гамагглютшшиоми 115- и Н7 (Н5 ж НЗ по новой номенклатуре) С Но« ех а1. , 1985; Нее1;ого wi.cz в* а1»,1987) - штамм А/утка-Украина/63 ( НЗК8 ) имели активность на 390 усл.ед., и Л/крачка/Ю.Ахрпка/б! ( Н5ИЗ ! - 165,0 усл.ед. Это явно противоречит даннш М.И.Соколова и др. (1970), поскольку самая высокая активность среда всех исслодоватшх нами вирусов гриппа обнаружена у штамма Л/утка/Украина/63 ( нэке ).

Итак, полученные результаты существенно дополняют номногочпс-леншо литературные данные (Ткаченко, 1973; Ким и др., 1977) об уровне на активности вирусов гриппа птиц и свидетельствует о чрезвычайно широкой вариабельности этого показателя у вирусов гриппа птиц о различной антигенной структурой, что не соответствует далнш ¿.В1ок «г е1. (1982),

Сравнительная характеристика тешочувотвительности нейрамптщдаз вирусов гриппа А человека и птиц.

Как уже отмечалось выше, КА сочетает в себе свойства формсита и антигена. По имещимся данным, изыонения ангигешюго профиля НА , обусловленные вариабельной областью нсСрамшидазы, могут сочетаться с изменением энзиматической активности на (Деэр и др., 1985),

Целью нашх исследований было изучение двух разных, но вместо с тем связашшх мааду собой свойств вирусов гриппа - индивидуального антигешого профиля и отношения к температурим:.! воздействиям при функционировании иа в качество фермента, а тшао сравнение физико-химических свойств вирусов гриппа птичьего„и человеческого пронехоздения в связи с тем, что имеются литературные данные об идентичности нейраминядаз некоторых "человеческих" п "птичьих" ытачмов вирусов (Львов, 1974; . «Кеъвъег ег а1. , 1902).

Дяя изучения зависимости уровня ферментативной активности от температуры продевания, мы прогревали пробы вируссодержащей жидкости в диапазоне температур от 40 до 70 °С о интервалом в 2 градуса, Это позволило установить температуру, при которой происходит полная 'инактивация НА . Например, у вируса А/утка/ Укрглпа/С3(нзн8) она оказалась равной 68 °С, Расчет процента остаточной ыа активности в прогретых пробах по отношению к. контрольной (не прогретой) пробе позволил установить наличие зависимости уровня ферментативной активности вирусной нейромшшдазы от температуры прогревания. Одним из показателей, отражающих уровень термочувствительное«! ферментов, монет. служить температура, при которой после прогревания происходит снижение активности на 50 %. В наших исследованиях температуру 50 $-ной инактивация нейрашпщдазн

определяли методом 1рафической интерполяции по кривой, построенной по результатам определения уровня КА активности в прогретых при разных температурах пробах вирусов, например, Л/утка/ Украииа/63 ( Н3"8 ) (Ряс.1).

«Л 63 «4 <6 М' 70

'Рис-,1. Определение величины ТШзд у вируса ' А/утка/Украина/63 ( нэпа ).

О термочувствительное™ фермента судили по кривой, а также по величине ТИН^. Указанная щшвая дает возможность определять уровега

ка активности вируса после прогревания при любой температуре (в диапазоне иоследовашшх температур) и наоборот: определять температуру, при которой происходит снижение активности на после 30-мииутного прогревания. Так, например снижение активности на вируса А/утка/Украина/бЗ < нзыэ ) па 50 % произойдет посла хфогревашш в течение 30 минут при температуре 65,0 °С, а при 60 °0, она снизится лишь на 10 % (Рис.1). Практически полная инактивация фермента Ш^оо произойдет при 68 °С.

Полученные значения Т1И100 и ТШ150 у обследованных вирусов гриппа птиц (табл.2) колебались от 48 и 45,9° у штамма Д/утка/ Чйхословакия/56 ( н4и6 ) до 68 и 65,5 °0 у штамма А/утхаДкраина/б ( нзн8 ), соответственно.

Таблица 2

Показатели температуры инактивации иейраминидазн и ТИНдр различных вирусов гриппа птиц

^ ® Штаммы вируса ц/п тин100 (в градусах) ™%о

I. Л/нндшка/Массачузетс/65 (Н6Ы2) 56,0 52,2

2. Л/крачка/Ю. Африка/61 (в5нз) 54,0 50,4

3. А/иадюшса/Онтарно/био <н8н4) 64,0 50,8

4. А/утка/Чехословакия/56 <н4яб) 48,0 45,9

5. А/утка/Апглид/56 (н11н6) 52,0 49,4

6. А/цыплено1^Гермаш1я/49 (н10в7) 50,0 46,2,

?. Д/утка/Украина/63 <нзн8) 68,0 65,о

Штаммы вирусов гриппа птиц А/крачка/'О. АЭрика/61 ( Н5ИЭ ) и Л/и15дашка/Онтарио/6118/68(нвН4) , содержащие НА. .различных ссро-нодтипов В} и 84 - по показателям ТНН|00 и ТШ150 мезду собой совпадали, Виру си гриппа птиц, содерзадае нойраулнидазу одного и того же сороподтипа ( Кб ) - А/угка/Чехословакия/бб ( надб ) и А/утка/Англпя/56 ( ншб ) имели разные показатели термочувстви-толыюсти нейряшшдазы. При сравнении результатов с итогами онало-

итого изучения вирусов гриппа человека (Аптекарева, 1974; Грин-баум, 1974; Поляков, 1977) Остановлено, что разныо вирусы гриппа А человека и птиц о одинаковой гшйрашгнидазой ( М2 ) имели одинаковые так и разныо показатели T!Ü1j0q и TWIgQ. Нейрамшшдазы "птичьих" вирусов в целом oiсазались более термостабилыша, чш пеИрдаинвдаэн • вирусов гриппа А человека.

Получешшо даипио позволяют говорить о широкой варкаб льностя пейрашигадазы по т ерм о чувс т штольне с ти вирусов гриппа птиц д об отсутствии четкой корреляции меяду этим свойством и особенностями антигешой специфичности этого поверхностного вирусного ишкопрогои-да. Это последнее обстоятельство резко отличает вирусы гриппа птиц от вирусов грчппа человека, у которых тсриочувствитолыюстъ и их антигенная специфичность костко связаны (Поляков, 1977).

Сравштельяая хатактортсткка тегтчувстшгалыгост» г&тагглю-тишша и нейрачтаащазц вирусов шиша птиц; я человека.

Из литературы известно, что ГА ц КА вирусов гриппа человека инактивирувтея прп разных температурах, Гомогглютшшрущая активность вирусов гриппа А С H0Ht,HlH1,K2M2,H3N2) я В более стабильным к термоинактпвацпи при 55-5S, °С/30 минут, чем нейрамтэддозиая • активность (Поляков, 1977; Иовака , 2382; Hoeaka

et el. (1982); scholttaeefe ,1985). Особенно подробно изучена термочувствктольно'сть , НА ,п ГА у вирусов гриппа А Человека. Что же касается вирусов rptnma птиц, то сравнительшб данные такого рода почти отсутствуют.

Все вше описанные исследования проводились при температуре 56 °С, однако некоторые вирусы язляются резистентными и к более высокой температуре, а некоторые чувствительны к более низкой (Лярски, 1980). ло в своей работе взяли более широкий диапазон температур от 46 до 56 °С и вше, в зависимости от инактивации гликопротоццов. Методика, описанная ранее, позволила обнаружить * ел едупцее - подавляющее большинство вирусов грпппа человека характеризовалось большей теркостабплыгостью гамагглютинина, чш нойрзми-ггидазы (табл.З).

Таблица 3

Сравнительная характеристика термочувствительности гшагглотшша и нейрашнидази вирусов гриппа птиц и человека

К й п/л

Вирусы

Исходило данные

После прогрев.

Титр ГА Титр ТА НА

I. АЛ*. 1.1/1/4? (Н1Н1) 1:64 0,740 0 0,072

2. А/Смпгалур/1/57 (нги2> 1:16 0,704 0 0,112

3. //Гош'.оиг/1/68 <нз:12) 1:16 0,834 0 0,300

4. Д/Хабаровск/74/77 (Н1Н1) 1:64 0,712 1:32 0,070°

б. А/Вимория/35/72(кэнг) 1:64 • 0,668 1:16 0,076

6. А/Техас/1/77 СН ЗИ 2) 1:32 ■ 0,623 1:8 ' 0,055

7. Д/йшшшны/2/Б2 (НЗЕ2) 1:32 0,493 0 0,069

8. В/1ео/40 •1:32 0,317 1:16 0,099

9. АДиев/84 (НЭИ2) 1:32 0,700 0 0,047

10. ^индшка/1.'ассачузетс/65 {Ибн2)1:16 0,675 0 0,273

II. А/крачка/Ю. АХроса/61 (Ы5ЙЗ) 1:8 0,952 0 0,633

12. А/индшка/0нтарио/6118 < НИИ) 1:32 . 0,549 0 0,308

13. А/у?ка/Чехословакия/56 <Н4»6> 1:16 0,908 0 0,311

14. А/упса/Англ:!я/56 (Н11В6) 1:16 0,697- 0 ' 0,501

15. А/цыпле!Юк/Гер,5акля/49 (Н10Б7) 1:32 0,749 . 0 0,321

16. А/ухка/Дкраина/бЗ (нзле) 1:32 1,039 0 0,811

Наш исследования подтвердили результаты других авторов (£рлнбаум, 1$74{ НоваЗса оЬ ¿1» , 1982; БсЬоШ.вве1г , 1985). Б гояв время аналогичной методикой исследования мы выявили обрат-ш9 соотнош&еея у глзп'.опротбидов вирусов гриппа птиц. Нейрамювздаз-иый компонент ,а№х антигенов более терлостабилен, чем гемагглютшшн. Это обстоятельство ^раэко отличает вирусы гриппа птиц от вирусов .гриппа человека.

Способ получения гаепиыуга; яейраютомазпого антигена вирусов

РЩЛ является строт^р специфической реакцией и широко попользуется при идентификации ка наделенных штаммов, а также антиней-э.гмпшдазппх антител (Парамонова и др., 1975). Однако, гомологичные гнтига'лагглютншгрувдно антитела создают пространотвегтую помеху дат озашодеЛствия ид с субстратом. Это лпяонло получившее иазвашо "сторичоского оОйекто" существенно искажает результаты РШ1Л (Эймар-Лнри и др., 1974), В связц с этим определение антигенной структуры

на лоолю5шо лишь при примепошш рокомбипаптных штаммов о раэнша антигенными оболочками пли при использования разобщенных антигенов (Эймар. 1976).

Упнворсашюй могодигог для извлечения пойрамтпщазц из вирусов гриппа пет (йи, ЮС.?).

Используя установленный нами биологический признак, а имошю, более высокой тср,\;очувствителвности ТА по сравнит» с иойрашпшда-зой, у эталошшх цтоммоп вирусов гриппа яящ, мы разработали доступный способ получения пейршшщдазиых пропаратов, которые могут ' использоваться в качестве мпигонов в ИЩА.

Лейрампшдазтго алтигонн готовили следующим образом, Внрув-содоргкшгуп отшштоисную явдкоеть с титром гемагглютяиадип не май 1:128 и пойрашивдазпой активностью - на ниже 3,000 единицы опти-чос2сой плотности разводили в 4-0 раз в фоофагнб-соловом буферо (р1[ 5,9-6,0), для устранения фона овободных опаловых кислот (табл.4).

Таблица 4

Содергашю енотовых кислот в оллаятоисноЙ лсвдкости М-дневшсс инактных омбриошй кур

(в ед.оптической рлотностк) __________________________________:.................<-_-)—.-—,

цельная ' • 0,400-0,411

0,055-0,053

1:0 0,025-0,020

Кп: в::дпо кз таблицы 4, в цельной нормальной аллаг.топепой глупости обнаруживается папа в количество еоотпстстэугцом 0,400-0,411 од.гпт.глотпост;:. При разведена! в 1:1 п 1:0, ото кол:-"

чество резко уменьшается. При' аналогичном разведении вируссодерка-щой-аллаптоисной жидкости в пой определяли титр гемагглютипацм и нейраминидазпую активность. При этом титр ТА уменьшался в 4-8, а иейрамигаздазная активность от 1,09 до 1,63 раза.

После этого пробы разливали по стерильнш пробирка.: и прогревали в течение 30 минут, при этом подбирали температуру прогревания для каздого штамма вируса гриппа птиц (табл.5).

Таблица 5

№ Л п/п

Пределы верхней к нижней границы температуры инактивации ГА и к а, вирусов гриппа птиц

Вирусы

1. А/щашеноц/Гермаш1д/49 (Н10В7) . развед.1:й

2. А/угка/Англия/56 (Нцнб) , развед.1.'8

3. А/утка/Чохословакия/56 (Н4В6) , развед.1:8

4. А/щачха/^.Лфрющ/бХ (Н5ВЗ) , развед.1:4

Температура прогревания ГЛ на активность в ед.опт.плт.

52 +н-+ 0,416-0,449 -

54 --- 0,235-0,237

56 — 0,067-0,060

52 -++++ 1,200-1,100

54 --- 0,902-0,950

56 - .0,900-0,901

58 -— 0,889-0,890

60 ---- 0,687-0,689

62 -- 0,281-0,283

64 --- 0,068-0,065

50 ++++ 0,900-0,904

52 ++++ 0,745-0,750

54 -- 0,604-0,608

: 56 -- 0,132-0,135

58 --- 0,058-0,059

65 0,726-0,730

66 --- 0,151-0,154

• 68 --- 0,083-0,085

о о сз о

о и to со

со ю и о

о о о о

I I I I

ь-г и и сэ

П О О N

CJ ю H о

to о о о о о

ю й ю н « <о

ю и о со ы о

1—I и и о о о

» t » J « t

§0> H Ol о о Ю О Ы Ю

■ Ю И О О M о

inOOHOOfflO OVOOCíNOUC-

юююотоыно о о о о" о* о о о

i I I I 1 I ! I

нодооиюю

O^ÖOIHOIHÖ in iB-ю о га н н о

о о о о м м w ö ft о оооооооо

+ f 1 1

+ I I t

t » I t-

+ t I 1

Íl t I ( I (litt , (lilt + I I I 1 I

t t 1 1 It« I i: t 1 » • • « 1 it' I 'I ! ! + +■111111

"Ч1 O O O O O O 0¡ О О О О N В С) О Г)

1аююо-ююад£>с^с- »? ю u to w а о

»

со

я

ю

сз

О M

ti • о f=(

tí о

1>

г> «

р.

р- N

& я

t; vo " 35

>

сз

tí о

сэ я

о о >0

р.

s &

S ta

s

>

О

О СЭ

CD M

w •

M Ci

О V

^ Я

о г.

ti ö f=í p» ri

f -

«r

■ И ' ra

as

! &

нейрамшгщазы .для каждого штамма весша индивидуальна.

Способ получения препаратов исйраминидазных антигенов относительно прост, и может быть легко внедрен в практику производства соответствующих диагностических препаратов.

' ' Использование оригинальных препаратов кейпамига^аз вттусор гриппа птиц в реакции подавления нейрамииндазной активности.

Настоящая глава посвящена изучению использования препаратов йейрамшзздаз вирусов гриппа птиц в НША. Дхя этого бишг получены экспериментальным путем гипериммуннш сыворотки к гриппу птиц. Титры гшшришунной сыворотки в РТГА и ИНА были приблизительно одинаковы т 1:128-1:512. Для болев объективной оценки пригодности9 препаратов нейрамкнидаз С М антигенов) в ЕПНА, исследовали как препарат нейрамшидазного антигена, полученного температурной инактивацией, так и пативный вирус, тлеющие равную нейраминвдазпую активность. Б результате иосаедов-зт установлено, что вирус гриппа птиц, у которого устранен путем прогревания ГЛ компонент, дает более точную оценку татра 83]гииейра*»яшу;азто: антител. В первом случае, титр антикейра'шащазнше антител составил 1:32-1:64, а во втором 1:255-1:512, В качества контроля, использоваш гретый вирус я птершмукную сыворотку к другим сероподтшгеы .нейрамищдаз. Контроль был отрицательнш. Отсюда следует, что препараты яейрамшвдаз 'вирусов Гриппа птиц йбляйтся строго подтипоспецифичпьш. Аяалогач-ные результаты бшп! получены и при" постановке РППА с полевыми сыворотками вз хозяйств неблагополучных по гриппу птиц, при. использовании в качестве антигенов препарата кейрамшпдаз в 2,8 6, Я 8, Результаты НША была иодтворздеш вроакдал торЛаоиия гемагглютп-нацт. .

В результате-исследования, в полевых сыворотках обнаружены ' штшейрашщдазные антитела'к аейралшшдазв В 2 в титро.от 1,5 до' 4,0 16" саддетельстауег о цуркулящц вируса 1ршша

в хозййегае.

выводы

о

1. Нойрашцщдазная активность эталонных штаммов вирусов гриппа птиц A/iwsaomi</Topiaim/i9 ( Н10Я7 ), Д/утса/А1ШЛия/56 (Н11Н6) , 1/утка/Чохословшаш/5С(Н411б) , А/крачкп/Юхнся Лйрико/61 (Н5НЗ) . /ц/п вдтка/'ас сачузотс/65{нбнг) . а/утка/Укроипа/бз (кэш) , А/ицдшкз/Оптарио/бНй (HBN4) не коррелируют с уровном гемагглзо-тшшруюцоЦ и инфекционной активности этих штаммов. Показатели активности нейрамговдазц указаиш вирусов колебались от 2,58 до 390,0 усл.од.

2. Пейрамянидаза вирусов хрипла птиц более термоотабильиа, чем исЦрамшсадаза вирусов, гриппа человека. У нойршшгадазк вируса гриппа Д/уткаД1фа-ша/63 (изнэ} податель THHjqq равнялся 68 °С, TiHlgQ - G5,5 °С. Среди изучешпос "человеческих" вирус03 гриппа А о нойраминпдазой сороподтипоп 5 I и Н 2, штаммов с такой теплоустойчивостью но обнаружено, -

3. Иойрамштдаза вирусов гриппа птиц изучешнос штаммов более' термостабильна, чем гомагглмтишт.

4. НоАрамппидазн вирусов гриппа птиц сероподтипов S 3 и Н 4 мевду собой ндс!mt41 м по показателям "MHjqq а ТИП^л. У ттшмов "птичьих" вирусов, содсряшщх нсйрпмцнидазу Н бчА/утга/Чехосло-вакия/56 (к4и6) и л/утка/Англ1ш/5б<Н11Вб) - показателя MIjqo и ТШ50 были различными: 48 и 45,9; 52 я 49,9 °0, соответственно.

5. Прогрезаше вируссддоржащёй аллантоионой яндкости агалошшх штаммов вирусов гриппа птиц при температуре инактивации гемагглю-тшпта обуславливает получение препаратов гайремияидаз, пригодных

в качестве антигенов, для постановки реакции подавления пейрамини-дазной активности. ■ •

6. Препараты нейрзмштдаз вирусов гриппа птиц пригодны для выявления алт1П1оЛра\ятидазных антител в сыворотках птиц. На осповд-пии исследования 150 проб полевых сывороток кур из неблагополучных по гриппу птицехозяйств г» реакции подавлейпй нейраминидазной активности с препаратом нейрачкиидозиого антигена И 2, в 59 положительных по ГТГА пробах, установлено наличие антинейрашшцдазных антител в тптро от 1,5 до 4,0 lg , что' свидетельствует о циркуляции вируса гриппа в хозяйстве.

ПРЖГИЧЕСКИЕ ПРДШЮШШ

1. Предлагается новый слоооб получения препаратов нейрамшт; вирусов гриппа птиц, пригодных для постановки реакции подавлишя нейрашшдазшй активности.

2, На основании проведешшх исследований предлагаются метод! ческие рекомендации по использованию препаратов пейраминидаз шод сов гриппа птиц в реакция подавления нейрампнидазной активности (ИНА) с целью выявления аятинейршшщдазгшх антител.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нейрамшшдазная активность различных штаммов вирусов гриппа птиц //Сб.науч.тр./ Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями сельскохозяйственных птиц. - Л., 1988. 4.1. С.38-44 (Князева ЛЛ.)«

2. Сравнительная характеристика термочувствительном:: неЯрам: кидаз вирусов гриппа А человека и птиц //Ветеринария. 1982. Г 7. С.30-31 (Князева О.).

3. ЗнзшатЕческая активность нейршшшдаз вирусов гриппа А

и ее чувствительность к температурным воздействиям //Методические рекомендации научн.семинара/Совреаешше методы исследований в Еивотноводстве и птицеводстве. - Л., 1939. С.29-30 (Князева Л.П.),

4. Способ получения лейрашпшдазяЕХ антигенов вируса гриппа птиц. (Полояательяоо решите о выдаче авторского свидетельства

Л 4483390/15-135640 от 31.07".89.) (Л.Н.Кпязсва, Д.Б.Голубев).

Подписало * печати 2O.OO.S0. Заказ 29Б. Формат 60x34/16. Объем 1 лл. Тираж 100. Бесплатно. Ломсяосовокая тшкя-рафия Ланупрвадата. 18Э5Ю, г. Ломонссое, пр. Юного лошоща, 0.