Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нематоды рода Bursaphelenchus и их взаимосвязь с бактериями-симбионтами на хвойных породах

ВАК РФ 03.02.11, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Нематоды рода Bursaphelenchus и их взаимосвязь с бактериями-симбионтами на хвойных породах"

На правах рукописи

АРБУЗОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

НЕМАТОДЫ РОДА ВиШАРНЕЬЕЫСНт И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ С БАКТЕРИЯМИ-СИМБИОНТАМИ НА ХВОЙНЫХ ПОРОДАХ

Специальность 03.02.11 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ггт ?.ан

Москва-2014

005548854

005548854

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР») и Федеральном государственном бюджетном учреждении Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова Российской академии наук (ИПЭЭ РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, заведующая

лабораторией фитопаразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН

Зиновьева Светлана Васильевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник Зейналов Адалет Ссхраб оглы, ГНУ Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии) кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Шумилина Дарья Владимировна, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур (ГНУ ВНИИССОК) Ведущая организация ФБУ Всероссийский научно-исследовательский

институт лесоводства и механизации лесного хозяйства (ФБУ ВНИИЛМ)

Защита состоитсяа^Т^ЛЬЛ'.Д 2014 г. в // .QQ часов на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 006.011.01, созданного на базе ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИГИС Россельхозакадемии).

Адрес: 117218, Москва, ул. Б. Черемушкинская, д. 28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИГИС и на официальном сайте: http://www.vniigis.ru

Автореферат разослан » 2014 г.

Ученый секретарь Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, .

доктор биологических наук, профессор //)//// Бережко Вера Кузьминична

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вилт хвойных пород, возбудителем которого является сосновая стволовая нематода Bursaphelenchus xylophilus, относится к числу наиболее экономически значимых заболеваний хвойных лесонасаждений в мире. Большинство стран, включая Россию, внесли В. xylophilus в перечень карантинных организмов. Изучение этиологии этого заболевания в последние годы позволило сделать предположение о том, что болезнь вызывается не одним организмом — нематодой, а комплексом патогенов: нематодой В. xylophilus и связанными с ней бактериями-симбионтами, продуцирующими фитотоксины. Эта гипотеза принята рядом ученых, работающих по проблеме вилта хвойных пород (Han et al., 2003; Zhao et al., 2003, 2005; Tan et al., 2004; Guo et al., 2006, 2007a, 2007b; Yin et al., 2007), однако окончательной ясности о роли микробиоты в развитии заболевания на сегодняшний день нет.

В связи с широким распространением В. xylophilus в соседних с Россией странах (Китае и Японии), возможностью естественного заноса этого патогена, (как с жуками-переносчиками, так и с древесными материалами при импорте товаров), а также возможным риском адаптации этой нематоды в условиях нашей страны, актуальной проблемой является мониторинг В. xylophilus и близкородственных видов на хвойных породах на территории Российской Федерации и исследование симбиотических организмов ассоциированных с нематодой, играющих определенную роль в развитии вилта хвойных пород.

Сосновая стволовая нематода В. xylophilus считается видом, официально отсутствующим на территории РФ, но выявлено широкое распространение близкородственного вида В. mucronatus. Древесная хвойная нематода В. mucronatus считается непатогенным или слабопатогенным видом, однако в результате наблюдений и опытов показано, что некоторые изоляты этого вида могут вызывать в ряде случаев гибель хвойных насаждений. В связи с этим основной целью нашей работы стало изучение бактериальной биоты древесной хвойной нематоды В. mucronatus, распространенной на территории РФ, а также зарубежных изолятов нематод В. xylophilus.

Для достижения этой цели планировалось решение следующих задач:

1. Обследование территории РФ на наличие нематод рода Bursaphelenchus.

2. Изучение фауны нематод-ксилофагов в особенности видов группы «xylophilus».

3. Изучение микробиоты, ассоциированной с нематодами рода Bursaphelenchus.

4. Изучение взаимосвязи нематод рода Bursaphelenchus с патогенными бактериями - потенциальными возбудителями вилта хвойных пород.

Основные научные результаты и их новизна:

1. Впервые проведены широкомасштабные обследования лесонасаждений и складированных лесоматериалов в 14 административных субъектах РФ от Московской области до острова Кунашир на наличие опасного патогена — сосновой стволовой нематоды Bursaphelenchus xylophilus. Выявлено широкое распространение древесной хвойной нематоды В. mucronatus на

территории России и подтверждено отсутствие В. xylophilus. Изучена фауна нематод-ксилобионтов, обитающих в стволовой части хвойных деревьев на территории Российской Федерации. Обнаруженные нематоды относятся к представителям 18 родов, 12 семейств, 3 отрядов, 2 классов. Видовой состав нематод-ксилофагов рода Bursaphelenchus был представлен видом В. mucronatus, который зарегистрирован фактически во всех обследованных регионах страны.

2. Изучен нематодо-бактериальный комплекс, вызывающий наиболее экономически значимое заболевание хвойных лесонасаждений в мире — вилт хвойных пород:

а) С использованием методов молекулярной диагностики выявлены бактерии-симбионты различных географических изолятов нематод Bursaphelenchus mucronatus из различных регионов РФ;

б) Впервые на изолятах нематод В. mucronatus выявлены бактерии Pseudomonas ßuorescens - потенциально опасные бактерии патогенного комплекса, вызывающего вилт хвойных пород; ранее этот вид бактерий регистрировался только у нематод В. xylophilus в Китае;

в) Впервые отмечено, что бактерии Pseudomonas fluorescens находятся не только у нематод В. mucronatus, обитающих в древесине, но и в трансмиссивных личинках Liv(dauer larva), переносимых насекомыми;

г) Впервые при изучении изолятов нематод В. xylophilus были обнаружены бактерии Agrobacterium tumefaciens, вызывающие корневой рак плодовых и лесных древесных пород.

3. Создан банк живых культур нематод Bursaphelenchus mucronatus, включающий 25 географических изолятов, выделенных из древесины хвойных пород различных регионов Российской Федерации.

4. На основе подобранных праймеров и зондов разработана диагностика сосновой стволовой нематоды В. xylophilus и древесной хвойной нематоды В. mucronatus, которая позволяет в короткие сроки проводить их точную идентификацию методом ПЦР «в реальном времени».

Практическая значимость результатов исследований. По материалам проведенных исследований разработан стандарт организации ФГБУ «ВНИИКР» «Сосновая стволовая нематода Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle. Методы выявления и идентификации», а также методические рекомендации по досмотру древесных упаковочных материалов на наличие сосновой стволовой нематоды В. xylophilus, которые могут быть использованы в практике научных исследований и при проведении досмотра и экспертиз подкарантинной продукции на наличие карантинных вредных организмов.

Для оценки распространенности в России нематод В. xylophilus и В. mucronatus рекомендуется использовать:

- идентификацию видов методом ПЦР «в реальном времени» с подобранными нами универсальными праймерами и меченными флуоресцентными красителями (FAM, HEX) зондами, который позволяет в несколько раз по времени ускорить проведение фитосанитарной экспертизы, в сравнении с используемым методом классической ПЦР;

- секвенирование популяций нематод по митохондриалыюму гену цитохромоксидазы COI, которое показало наиболее точные результаты по идентичности последовательностей ДНК.

Созданный банк живых культур нематод рода Bursaphelenchus является учебным пособием при обучении диагностике нематод сотрудников Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Видовой состав бактериальной биоты различных географических изолятов нематод В. mucronatos из различных регионов России;

2. Видовой состав бактерий-симбионтов различных изолятов В. xylophilus;

3. Фауна нематод-ксилобионтов, обитающих в стволовой части хвойных деревьев;

4. Отсутствие на территории Российской Федерации сосновой стволовой нематоды В. xylophilus и широкое распространение древесной хвойной нематоды В. mucronatos;

5. Метод ПЦР «в реальном времени» для идентификации нематод

B. xylophilus и В. mucronatos с подобранными универсальными праймерами и меченными флуоресцентными красителями зондами.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на научных конференциях: на Международной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии», Москва, 2010 г.; на IX симпозиуме Российского общества нематологов с международным участием «Нематоды естественных и трансформированных экосистем», Петрозаводск, 2011 г.; на Всероссийской конференции с международным участием «Экологические и экономические последствия инвазий дендрофильных насекомых», Красноярск, 2012 г.; на Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии», Москва, 2012 г.; на Международной научной конференции «Pine Wilt Disease», Германия, Брауншвейг, 2013 г.

Личный вклад автора. Представленная диссертационная работа является результатом четырехлетних научных исследований автора. Сбор материала, экспериментальные лабораторные исследования, обработка полученных экспериментальных данных, написание текста работы и подготовка иллюстраций для диссертации проведены исключительно самим автором или при его непосредственном участии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ на русском (11) и английском (3) языках в отечественных и зарубежных изданиях. 4 публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства науки и образования РФ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, общих выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материал изложен на 119 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 26 рисунков. Список литературы включает 179 работ, в том числе 163 иностранных авторов.

Автор выражает глубочайшую благодарность научному руководителю д.б.н.

C.B. Зиновьевой за помощь и постоянное внимание к работе. Особую благодарность автор выражает д.б.н. O.A. Кулиничу за высокие требования,

ценные советы на протяжении всех этапов исследований и оказанную помощь. Автор искренне признателен к.б.н. Е.С. Мазурину, д.б.н. А.Ю. Рыссу, к.с.х.н. М.Б. Копиной, М.С. Егоровой, Е.Е. Соколовой, Г.Н. Мугол Хан, С.И. Приходько за помощь в выполнении экспериментальной части работы.

Данные исследования были поддержаны грантом РФФИ № 10-04-01644а.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность и практическая значимость темы диссертации, сформулирована основная цель и задачи исследования.

Глава I. Обзор литературы

В этой главе обобщены литературные данные, касающиеся опасного патогена - сосновой стволовой нематоды В. xylophilus и ее роли в заболевании вилт хвойных пород. Обобщены литературные сведения о географическом распространении В. xylophilus и наносимом экономическом ущербе в различных странах. Приведена краткая характеристика рода Bursaphelenchus, морфология и биология нематоды В. xylophilus и близкородственных видов. Детально рассмотрен нематодо-бактериальный комплекс как причина увядания хвойных пород.

Глава II. Материалы и методы

Исследовательская работа была выполнена в 2009-2012 гт. в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»): в отделе лесного карантина, в лаборатории молекулярных методов; в лаборатории фитопаразитологии Центра паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН (ИПЭЭ РАН). Определение фауны нематод проводилось в Зоологическом институте Российской академии наук (ЗИН РАН, г. Санкт-Петербург) в лаборатории по изучению микроскопических червей под руководством д.б.н. А.Ю. Рысса.

Сбор материала, представленного древесными пробами, проводили в ходе обследований лесонасаждений и складированных лесоматериалов на наличие сосновой стволовой нематоды В. xylophilus в 14 административных субъектах Российской Федерации. Всего было отобрано и проанализировано 3718 образцов.

В результате проведенной работы выделено и идентифицировано двадцать пять изолятов нематод В. mucronatus из древесины различных хвойных пород. При изучении бактериальной микробиоты нематод также исследовали изоляты В. xylophilus: ВхРо, ВхАш, BxMad, которые в течение длительного времени (нескольких лет) содержались in vitro в зарубежных лабораториях в Португалии и Финляндии. Поддержание и размножение живых культур проводили на бесспоровой линии гриба Botrytis cinerea, а также в древесных дисках сосны обыкновенной (Pinus sylvestris). Средой для культивирования гриба служил картофельно-глюкозный агар (КГА). Культуральные изоляты нематод использовали для изучения нематодо-бактериального комплекса патогенов.

Идентификацию нематод проводили морфологическим методом и методом молекулярной диагностики - секвенированием. Для морфологической

идентификации обнаруженных в древесных пробах нематод изготавливали временные и постоянные препараты. Идентификацию нематод проводили на основе постоянных коллекционных препаратов (Ryss, 2002). Для подтверждения результатов морфологического анализа применяли методы молекулярной диагностики.

Выделение ДНК из каждого изолята нематод проводили с использованием готовых наборов «ДНК-Экстран» кат. № НГ-511-100 (ЗАО «Синтол», Москва) согласно рекомендациям производителя. Концентрацию и чистоту выделенной из нематод ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000.

Классическую ПЦР проводили с праймерами: 18S/26S (Ferris et al., 1993; Vrain, 1993), 18SF-Burs/18SR-Burs (De Ley et al., 2002; Dorris et al., 2002), амплифицирующими участок гена 18S rRNA - SSU; D2A/D3B (Nunn, 1992), амплифицирующими участок гена 26S rRNA - LSU; COI-F1/COI-R2 (Kanzaki and Futai, 2002), амплифицирующими участок митохондриального гена цитохромоксидазы COI. Объем и состав реакционной смеси одной ПЦР-реакции, температурно-временные параметры изменяли в зависимости от применяемой пары праймеров. Анализ продуктов амплификации проводили посредством электрофореза фрагментов ДНК в 1,5%-м агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием в гель-документирующей системе Quantum-ST-4-1500 (Япония).

ПЦР «в реальном времени» проводили на амплификаторе i-Cycler iQ 5 (BioRad, США). Подбор праймеров и зондов осуществлялся на основе гена COI. Из базы данных GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) были выбраны нуклеотидные последовательности гена COI В. xylophilus и В. mucronatus. Анализ последовательностей и выбор праймеров проводили с помощью программы «BioEdit».

Культивирование выделенных с нематод бактерий осуществляли на питательных средах Кинг Б и YDC. Методом серийных 5-кратных разведений получали единичные колонии, идентификацию которых проводили с использованием прямого секвенирования гена 16S rRNA. Культуры после рассева хранили при -70 °С в 15%-м растворе глицерина. Выделение ДНК проводили с использованием набора «Проба ГС» кат. № Р-003/1 (ООО «АгроДиагностика», Москва). Для амплификации использовали универсальные праймеры: 8UA/519B (http://www.enotes.com/ topic/16S ribosomal RNA), амплифицирующие участок гена 16S rRNA. Реакционная смесь одной ПЦР-реакции объемом 25 мкл содержала: 1х ПЦР буфер (Диалат, Москва), 2мМ MgCl2, 200мкМ каждого из dNTP, 20пкМ каждого из праймеров, 2 ед. «hot-start» SmarTaq полимеразы (Диалат, Москва). Температурно-временные параметры амплификации включали: преденатурацию 95 °С - 5 минут, далее 35 циклов, состоящих из 95 °С - 15 секунд, 55 °С - 30 секунд, 72 °С - 30 секунд; финальный досинтез 72 °С - 10 минут; хранение при +4 °С.

Полученные продукты ПЦР очищали с использованием набора Fermentas (#К0701) «Gene JET PCR». Последовательности после секвенирования выравнивали при помощи программы BioEdit. Выровненные последовательности оценивали в приложении BLAST NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Реакцию секвенирования проводили с применением BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США).

Для построения филогенетического дерева использовали метод попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (Unweighted pair-group method using arithmetic averages - UPGMA) (Sneath & Sokal, 1973) при помощи программы MEGA4.

Глава III. Результаты исследований

1. Фауна нематод-ксилобионтов хвойных пород

В ходе проведенных обследований хвойных насаждений и складированных лесоматериалов в Московской, Воронежской, Сахалинской областях, Пермском, Красноярском, Забайкальском, Приморском, Хабаровском, Алтайском краях и Республике Алтай, а также в Чукотском автономном округе и на острове Кунашир было собрано и проанализировано 3718 проб: 1349 проб в 2010 г. и 2369 проб в 2011 г. (таблица 1).

Больше всего образцов древесины было отобрано в Хабаровском крае - 415 проб, а также в Республике Карелия - 848 проб. В 2010 г. нематоды различных таксономических групп были обнаружены в 33,1%, а в 2011 г. - в 23,5% всех проанализированных древесных проб.

Сосновая стволовая нематода В. xylophilus в результате наших исследований не обнаружена, однако почти повсеместно встречался близкородственный вид -хвойная древесная нематода В. mucronatus. Этот вид был обнаружен в 11,5% всех проанализированных проб в 2010 г. и 5,6% в 2011 г. Наиболее часто этот вид присутствовал в образцах древесины из Забайкальского края и Иркутской области (Арбузова и др., 2011).

В результате обследования хвойных лесонасаждений и складированной древесины вышеуказанных регионов Российской Федерации за 2010-2011 гг. было выделено и идентифицировано 25 изолятов нематод В. mucronatus.

По итогам обследования хвойных лесонасаждений и складированной древесины вышеуказанных районов России были зарегистрированы нематоды, относящиеся к 18 родам (таблица 2).

Обнаруженные нематоды согласно системе De Ley & Blaxter (2002) являются представителями 2 классов, 3 отрядов, 5 инфраотрядов, 12 семейств, 18 родов. Отряд Rhabditida представлен 10 семействами, 16 родами; отряд Monchysterida - 1 семейством, 1 родом и отряд Dorylaimida - 1 семейством, 1 родом.

Таблица 1. Результаты мониторинга хвойных лесонасаждений и складированных лесоматериалов на наличие нематод-ксилофагов в различных регионах РФ в 2010-2011 гг.

Регион РФ Количество проанализированных образцов (шт.) Количество образцов с выявленными нематодами (%) Количество образцов с выявленными нематодами Bursaphelenchus mucronatus (%)

2010 2011 2010 2011 2010 2011

Алтайский край 110 - 36,4 - 12,7 -

Архангельская область - 400 - 23 - 0,75

Воронежская область - 105 - 3,8 - -

Забайкальский край 156 100 61,5 20 50,0 15

Иркутская область - 200 - 41,5 - 30,5

Красноярский край 214 200 26,6 12 2,8 4,5 ■

Московская область 167 100 17,4 22 1,2 -

о. Кунашир - 16 - 0,4 - -

Пермский край - 100 - 22 - 4

Приморский край 223 200 22,9 33,5 3,6 9,5

Республика Карелия - 848 - 23,7 - 2,1

Сахалинская область 57 - 21,1 - - -

Хабаровский край 415 100 38,8 10 11,3 2

Чукотский автономный округ 7 - - - - -

Итого: 1349 2369 33,1 23,5 11,5 5,6

Наиболее часто встречались нематоды-ксилофаги рода Bursaphelenchus. Нематоды данного рода представлены одним видом - В. mucronatus, который был обнаружен во всех обследованных географических зонах, от Московской области до Приморского края. Вид В. mucronatus обнаружен в древесине различных хвойных пород: сосны, ели, лиственницы и пихты.

Наибольшим родовым разнообразием нематод отличалась сосна обыкновенная Pinus sylvestris, из древесины которой выделены нематоды, относящиеся к 12 родам. На втором месте среди растений-хозяев по родовому разнообразию нематод-ксилофагов ель обыкновенная Picea abies - обнаружены представители 9 родов и сосна корейская Pinus korajensis — 8 родов.

Анализ фауны нематод показал, что в хвойных лесонасаждениях различных регионов Российской Федерации при карантинных фитосанитарных обследованиях преобладали нематоды отряда Rhabditida, который включал 10 семейств: Aphelenchoididae, Aphelenchidae, Cephalobidae, Neotylenchidae, Diplogasteridae, Anguinidae, Tylenchidae, Panagrolaimidae, Plectidae, Rhabditidae.

Таблица 2.Фауна нематод-ксилобионтов обследованных хвойных лесонасаждений и складированной древесины

различных регионов РФ

Род нематод Регион РФ

Воронежская область Московская область Забайкальский край Красноярский край Хабаровский край Пермский край Алтайский край Приморский край остров Кунашир

АрИе!епсИо1с1ез + + + +

Ар/гекпсИш +

ВигьарЬеипсЬш + + + + + + + +

СерИЫоЬиз +

ОеШепий + + + +

+ + + + + + +

ОИу1епс1ш$ + + +

ЕийогуЫтш +

Ек1арШепсНо1(1е$ + + + +

ЕитопИуНега +

РИепскш + + + +

¿(¡¡таркекпскиз + + +

РапакгоЫтш + +

РагарЬекпсИш + + +

Р1есш +

ЯИаЬЛЧз + + + + +

Зетига +

Зускпо(у1епскиз + + + +

2. Идентификация сосновой стволовой нематоды В. xylophilus и древесной хвойной нематоды В. mucronatus с применением молекулярных методов диагностики

Учитывая сложность идентификационных отличий нематод В. xylophilus и В. mucronatus на основе морфологических параметров, проведен ПЦР-анализ (рисунок 1) со специфичными праймерами, по итогам которого были подтверждены данные морфологической диагностики о принадлежности всех выделенных нами изолятов к роду Bursaphelenchus. В результате проведенного секвенирования были расшифрованы последовательности ДНК изолятов нематод В. mucronatus по трем генам.

При анализе полученных данных можно сделать вывод, что наиболее информативным оказался ген COI.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 М 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 К- М

им

mm

Рисунок 1. Электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК изолятов нематод праймерами D2A/D3B. 1 - 24 изоляты В. mucronatus: А7, All, AI, 2-5-1-1, ЗЗА, 31, 185, 56А, 49Б, 65Б, 70Б, 73А, 78Б, 32А, 80А, 74А, 169Б, 203А, 46, 91В, 53А, 63Б, 10Б, Bmlr; 25 - 27 - изоляты В. xylophilus. Mad, BxAm, ВхРо; К- - отрицательный контроль; М - ДНК маркер

В таблице 3 приведены результаты секвенирования популяций нематод по двум генам: по гену 26S rRNA - LSU и по митохондриальному гену цитохромоксидазы COI, которые в проведенных исследованиях показали наиболее точные результаты по идентичности последовательностей ДНК.

Таблица 3. Результаты секвенирования гена 26S rRNA-LSU и митохондриапьного гена цитохромоксидазы COI исследуемых нематод

№ Код изолята 26 S rRNA-LSU COI

п/п нематод Идентичность, % Идентичность, %

Bursaphelenchus mucronatus

1 А7 В. mucronatus В. mucronatus

100% 99%

2 А11 В. mucronatus В. mucronatus

100% 99%

3 Al В. mucronatus В. mucronatus

100% 99%

4 2-5-1-1 В. mucronatus В. mucronatus

100% 99%

5 ЗЗА В. тисгопШш 99% В. тисгопаШз 99%

6 31 В. тисгопаШ 100% В. тисгопаШз 99%

7 185 В. тисгопаШз 100% В. тисгопаШз 99%

8 56А 5. тисгопаШз 100% В. тисгопаШз 99%

9 49Б тисгопаШз 100% В. тисгопаШз 99%

10 65Б Я тисгопаШз 99% В. тисгопаШз 99%

11 70Б - В. тисгопаШз 100%

12 73А В. тисгопаШз 99% В. тисгопаШз 99%

13 78Б В. тисгопа1 из 100% В. тисгопаШ 98%

14 32А В. тисгопаШз 100% В. тисгопаШз 99%

15 80А - В. тисгопаШз 96%

16 74А В. тисгопаШз 99% В. тисгопа1из 96%

17 169Б В. тисгопаШз 99% В. тисгопаШз 95%

18 203А В. тисгопаШз 100% В. тисгопаШз 99%

19 46 - В. тисгопаШз 99%

20 91В В. тисгопаШз 99% В. тисгопаШз 99%

21 53А - В. тисгопаШз 99%

22 63Б В. тисгопаШз 99% В. тисгопаШз 99%

23 10Б В. тисгопаШз 99% В. тисгопаШз 99%

24 ОУЫУ В. тисгопаШз 99% В. тисгопаШз 99%

25 Вш!г В. тисгопаШз 100% В. тисгопаШз 99%

ВигэарИе/епсИиэ х\1орМ1ш

26 ВхАгп - В. ху1орЫ1из 100%

27 Май В. ху1орЫ1из 100% В. ху1оркИиз 99%

28 ВхРо В. ху1орЫ1из 100% В. ху1орЫ1из 100%

Примечание: « - » - нет данных.

Построение филогенетического дерева (рисунок 2) показало, что исследованные изоляты нематод делятся на три отдельных кластера, в которых наблюдается объединение в следующие группы: группа исследуемых изолятов нематод В. тисгопаШя, группа исследуемых изолятов нематод В. хуЬрИИш, а также отдельная группа нематод Pseudodiplogasteroides яр. и Арке1епсИо'^ех эр., которые часто встречались в пробах и также были подвергнуты молекулярно-генетическому анализу.

и=

20]_I—

441—

-зтС

stZ

Л

731-

УН

¡с

B.mucronatus А7-АН B.mucronatus 185 Кг B.mucronatus 2-5-1-1 Кг B.mucronatus 56А Zab B.mucronatus 706 Zab B.mucronatus 31B Kr B.mucronatus 203A Xab B.mucronatus A1 Alt B.mucronatus 32A Zab B.mucronatus A11 Alt B.mucronatus 91В Xab B.mucronatus 46 Xab B.mucronatus 33A Kr B.mucronatus 10B-Perm В. mucronatus JF317258.1 B.mucronatus 63B Xab B.mucronatus 73A Zab B.mucronatus 53A Xab B.mucronatus JF317259.1 B.mucronatus 49B Zab B.mucronatus 65B Zab B.mucronatus Bmlr B.mucronatus juk Voronej B.mucronatus 78B Zab B.mucronatus JF317262.1 B.mucronatus 169 Xab B.mucronatus 74A Pr B.mucronatus 80A Pr B. xylophilus Am B. xylophilus BxPo B. xylophilus Mad B. xylophilus JF317248.1 B. xylophilus JF317249.1 Pseudodiplogasteroides sp.

- Aphelenchoides sp.

Рисунок 2. Эволюционные отношения 35 последовательностей ДНК митохондриального гена цитохромоксидазы COI с различных изолятов нематод Bursaphelenchus mucronatus и Bursaphelenchus xylophilus. Дерево построено методом попарного невзвешенного кластирования с арифметическим усреднением (Unweighted pair-group method using arithmetic averages - UPGMA) (Sneath, Sokal, 1973). Достоверность узлов дерева определена методом бутстреп (500 повторений) (Felsenstein, 1985). Эволюционные расстояния определены методом сложного наибольшего правдоподобия (Maximum Composite Likelihood method) (Tamura et al., 2004) и даны на шкале в виде числа замен нуклеотидов. В анализ включены 597 нуклеотидов

13

j

Проведенная работа по идентификации нематод В. mucronatus и B.xylophilus показала, что секвенирование ДНК изолятов нематод по митохондриальному гену цитохромоксидазы COI позволяет достоверно отличить морфологически близкие виды нематод В. mucronatus и В. xylophilus и получить наиболее точные результаты по идентичности последовательностей ДНК.

3. Разработка методов выявления и идентификации нематод В. xylophilus и В. mucronatus методом ПЦР «в реальном времени»

Данный этап работы проводился с использованием 24 изолятов В. mucronatus и 3 изолятов В. xylophilus.

Подбор праймеров и зондов, определение их специфичности На основании выровненных последовательностей гена COI нематод В. xylophilus и В. mucronatus нами были подобраны универсальные праймеры и меченные флуоресцентными красителями (FAM, НЕХ) зонды, специфичные для В. xylophilus и В. mucronatus соответственно (рисунок 3).

"Н "ш "' Ш 200 210 220 230 240 250 260 210 280 290 3!Я

А?595194.1Ви

Á8595193.1 Во -А.....г................................................ ................. ...............................................

АЬ595195.1BR ............................................................;.........................................I'"..................

АЭ5 95194 1 S» •*.....*............................................................................................1....................

,ЛБ5951?З.1 5ю ........................................................... —;......"............,.....

■A1S0S054.1 h 5.....*......................................................;•*..........Í".................' ' ...... .........

JVY5CS0S3.1 ы> -*•• ■ "................................'.....-....................5...............................;.....................

,WSC8052.1 Во -А-----?...........................................................................................\ ..................

Avsososi.i а> •*.....*.....................••• .................................................................; V

AY5oac5o.i so .....t.....................................................h.............;.....................»"" *................

АЙС3049.1Е* .I.....T...................................'.....>.....;.......................................;•••<............;.......

A35 95192.1 Ex .»..*..t........«.......................'.....;.....J- ■••«...........................................;.......

sÁB595i?i.i gx........*..........................1...........; "••?........1— .............,............

lonmr.u* .!..a..»........с....................«.................;.....o.........................................

«жя.1 »X .....«...............................i.....•••?..............................,-"»"•!.............vi""

СГРЗП255.ШХ .«..А ..1....... 6.....................................I.....Í.....................»••-....... í" ,............;......

JF31"254.1 Ex .С.. A. - г........«........t................1. ...».....t............................«•■{...........A...I....................

JM11253.1 fcc .................'.................I.....;...................................J..A...... - ..A...I.....................

JF3il252.1 в» .T..A..Í........С.........................I...........' ....a.......................«..A........ ............>

j?3i725i.i Bx .T..A..5........s.........................».....».....*.....$......................«••«.......................•••

JP311250. Ex .А. .Г........G.................. .......i--. ...... ................................... "V'":.............Д.......

J?3i?2!9.1 8x .I..A."........e.................6..............С.....I ....«.......................»••*...........A...I........... .........

J?3n:48.1 Ex ■> .........«................s..............'-...........0.......................*••'............. • ...................

M5951SS.1S» ..........................................................;........................................;....................

AB5S5194.IS» -A... ............................................................... ..........................; ........

A25 95153.1 ta ----5................................................................................................ .....................

ÍES9Sl?5.1ta ............................................................1........................................;....................

»595194.1 »i -A........................................................0........................................:....................

|AB595193.1 Be ¡.A...................................................... ............................................... .....................

Рисунок 3. Участок гена COI, используемый для подбора праймеров и зондов для нематод В. xylophilus и В. mucronatus (точками обозначена идентичность нуклеотидов в последовательностях)

При определении специфичности разработанных зондов установлено, что флуоресценция по красителю FAM В. xylophilus регистрировалась только при исследовании ДНК изолятов нематод В. xylophilus, а по красителю НЕХ В. mucronatus только при исследовании ДНК изолятов нематод В. mucronatus. При тестировании сапрозойных нематод Pseudodiplogasteroides sp. был получен отрицательный результат.

Определение чувствительности ПЦР «в реальном времени» с подобранными зондами

Для проведения этого эксперимента были подготовлены чистые культуры с известным количеством нематод В. xylophilus и В. mucronatus. Значения по количеству различных культур исследуемых нематод были введены в программу как

стандартные значения. В ходе дальнейшей работы при постановке последующих реакций программа на основе заданных нами параметров, определяла количество патогена в исследуемом образце.

Таблица 4. Количественная оценка чувствительности ПЦР «в реальном времени» при диагностике нематод В. тисгопаШя и В. ху1орШ1ия

№ п/п Краситель Значение (St,Unkn) Количество нематод, шт. Значение Ct Стандартные образцы (SQ)

1 ММ Std l.OOOE+OO 30,93 1.00E+00

'у 4 ГАМ Std 3,000E+00 29,27 3,00E+00

ШвШШщ Std 5,000E+00 28,90 5,00E+00

■мм Std 8,000E+00 28,79 8,OOE+00

5 FAM Std 1.000E+01 26,44 1,OOE+Ol

6 ■ ¡И Std 1.500E+01 25,55 1.50E+01

7 1 Л M Std 2,000E+01 23,62 2,00E+01

8 1'ЛМ Std 2,500E+01 21,90 2,50E+01

9 : ДМ Std 3,000E+01 19,26 3,00E+01

10 11 1 ЛМ Unkn 5,024E+01 16,57 Unkn

VAM Unkn 2,746E+00 28,92 Unkn

12 ййв Std 1.000E+00 33,20 1.000E+00

13 цГ ■ . Std 2.000E+00 31,23 2,000E+00

14 111 ЯЁЖ Std 3.000E+00 31,03 3,000E+00

15 Яш тт» Std 5,O00E+00 30,67 5,O00E+OO

16 17 .у, ■ Std 1.000E+01 27,22 1,000E+01

йи Std 2,500E+01 25,02 2,500E+01

18 i Std 5,000E+01 22,10 5,000E+01

19 ■ИД Unkn 5.016E+01 22,04 Unkn

70 Unkn 3,427E+00 31,37 Unkn

Примечание: Ct FAM и Ct HEX - значение порогового цикла по красителю FAM и HEX соответственно, Std - известное количество нематод, Unkn - неизвестное количество нематод.

Полученные результаты показали, что значение Ct увеличивалось при снижении количества нематод в пробе, что связано с уменьшением количества ДНК, используемого в проводимой реакции. При определении нижнего порога для достоверной диагностики нематод было установлено, что метод применим даже при наличии одной особи в пробе. Необходимо отметить, что ПЦР «в реальном времени» по срокам проведения в несколько раз быстрее классической ПЦР, что имеет большое значение при проведении фитосанитарной экспертизы, где необходимо получение результата в короткие сроки.

4. Видовой состав бактерий ассоциированных с исследуемыми изолятами нематод В. xylophilus и В. mucronatus

Полученные образцы ДНК исследуемых бактерий использовали для их исследования методом классической ПЦР с универсальными праймерами 8UA/519B.

В результате проведенного анализа секвенирования бактерий по гену 168 гКЫА были расшифрованы последовательности ДНК выделенных колоний с различных изолятов нематод.

По итогам изучения 25 географических изолятов нематод В. тисгопаШ из различных районов РФ выделено двадцать видов бактерий, относящихся к пяти классам (СтаттаргсЛеоЬасЛеп а, ВйаргсЛеоЬайепа, АсйпоЬайепа, РЧауоЬайепа, ВасШакв) и 9 семействам (Еп1егоЬас1ег'1асеае, ХапШошопаёасеае, Pseudoшonadaceae, ВигкЬоЫепасеае, ШнгоЫасеае, ЫосагсИасеае, РЬуоЬайепасеае, ВасШасеае, РаетЬасШасеае). Наибольшим видовым разнообразием представлен класс гамма-протобактерии, включающий представителей трех семейств: Е^егоЬайепасеае (7 видов), Xanthomonadaceae (2 вида) и Pseudomonadaceae (5 видов). Наибольшее: разнообразие бактерий обнаружено у иркутского изолята (Вш1г) — идентифицировано

8 видов бактерий (рисунок 4). _ _____________

Видовое разнообразие бактерий, выделенных с изолятов нематод ВикарМепсЫк тисгопагив из различных регионов РФ.

Рисунок 4. Видовое разнообразие бактерий, выделенных из изолятов нематод В. mucronatus

из различных регионов РФ

Проведено изучение бактериальной микробиоты трансмиссивных личинок (Lrv) нематод В. mucronatus, выделенных из большого черного елового усача Monochamus urussovi Fisch, из Воронежской области. Выделенные из нематод; бактерии были представлены четырьмя видами: Pseudomonas fluorescent, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Serratia sp. Бактерии родов Klebsiella и Serratia, относящиеся к сапрофитным организмам, выявлены только у трансмиссивных личинок нематод Lrv.

Особого внимания заслуживает обнаружение бактерий P.fluorescens, с присутствием которых связывают патогенность нематод В. xylophilus. Наличие

Rhodococcussp. Bacillus subtilis Paenibacillus sp.

1,1% \ 2,2% Г 1,1%

Burkholderia\Flavobacterium sp. I /

p. xenovorans \ 4,496. f

Hohnella sp.

1,1% Rahnella aquatilis 1,1% Serratia sp.

^¿^.Pantoeosp.

Pseudomonas — geniculate 1,1%

Pseudomonas lurida__

1,1% у

Pseudomonas , flourescens I 9,9%

. Pantoea agglomerons

^.Klebsiata sp. 1,1%

. Enterobacter sp. 1,1%

pr Stenotrophomonas sp. 11,0% Istemtrophomonas

Pseudomonas sp.

бактерий этого вида на особях нематод различных циклов развития подтверждает тесную связь бактерий Р. fluorescens с нематодой В. mucronatus.

Наиболее часто у исследованных изолятов нематод из всех регионов встречались бактерии рода Pseudomonas (в 45%). Идентифицировано 5 видов бактерий данного рода: Pseudomonas sp., Р. lurida, Р. brennen, Р. geniculata, Р. fluorescens. Все обнаруженные виды бактерий считаются сапрофитными. Бактерии Pseudomonasfluorescens обнаружены у девяти изолятов нематод из Алтайского, Забайкальского, Пермского, Приморского, Хабаровского краев и Воронежской области. Именно этот вид бактерии выделялся китайскими исследователями с нематод В. xylophilus и именно с ним связывают высокую патогенность нематодо-бактериального комплекса на соснах в Китае (Zhao, hin, 2005).

В результате изучения различных иностранных изолятов нематод В. xylophilus выделено десять видов бактерий, относящихся к двум классам (Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria) и 4 семействам (Enterobacteriaceae, Xanthomonadaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae). Большинство выделенных бактерий относятся к классу гамма-протобактерии, включающему представителей трех семейств: Enterobacteriaceae (4 вида), Xanthomonadaceae (2 вида) и Pseudomonadaceae (3 вида) (рисунок 5). Наибольшее разнообразие бактерий обнаружено у популяции нематод, выделенной из упаковочных материалов, импортированных из США в Финляндию, -идентифицировано 8 видов бактерий.

Pseudomonas flourescens 11,9%

Pseudomonas brenneti 11,9%

Pseudomonas sp. 17,5%

Agrobacterium

titmt»rfnrii>n <

Stenotropbomonas rhizophila 5,3%

Rahnella aquatitis 5,9%

Yersinia sp. 5,9%

_ Yersinia

mollaretii 5,7%

Rahnella sp. 17,5%

Stenotrophomonas makophiüa 11,3%

Рисунок 5. Видовое разнообразие бактерий, выделенных из изолятов нематод В. xylophilus

Проведенные нами исследования дополняют сведения по бактериям-симбионтам нематод В. xylophilus. Бактериальная биота исследованных нами изолятов В. xylophilus не была многообразной (возможно, ввиду того, что изоляты долгое время содержались в культуре гриба), однако и у американского, и португальского изолятов также выделены бактерии Pseudomonas fluorescens,

которые, по мнению китайских ученых (Zhao, Lin, 2005; Guo et al., 2007a, 2007b.; Yin et al., 2007; Li et al., 2009; Zhao, 2009), вызывают увядание хвойных пород. Эти выводы подтверждаются многочисленными исследованиями и опытами. Исследования бактериальной биоты изолятов нематод В. xylophilus из Северной Америки, где этот вид является аборигенным, ранее не проводились и данная работа проведена нами впервые. У исследуемых нематод изолята ВхАт также обнаружены бактерии P.fluorescens.

Особого внимания заслуживает обнаружение бактерии Agrobacterium tumefaciens, выделенной из португальского изолята нематод В. xylophilus (ВхРо). Это облигатно-аэробная палочковидная бактерия, способная трансформировать клетки растений при помощи специальной плазмиды и вызывающая бактериальный рак, например, рак ясеня, корневой рак плодовых и лесных древесных пород. И, если об обнаруженных нами бактериях рода Pseudomonas, Yersinia, Rahnella, Stenotrophomonas ранее сообщалось в работах зарубежных ученых, то присутствие бактерии А. tumefaciens на изолятах В. xylophilus зафиксировано впервые.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные широкомасштабные обследования лесонасаждений и складированных лесоматериалов в 14 административных субъектах РФ от Московской области до острова Кунашир на наличие опаснейшего патогена — В. xylophilus — позволяют сохранить за нематодой статус карантинного организма, отсутствующего на территории Российской Федерации. При этом было зафиксировано повсеместное обнаружение близкородственного вида - хвойной древесной нематоды В. mucronatus. Вид В. mucronatus, являющийся близкородственным В. xylophilus, относится к числу слабопатогенных (или непатогенных) организмов, но наблюдения и опыты показали, что в ряде случаев отдельные популяции этого вида также могут проявлять патогенность. В. mucronatus и В. xylophilus являются видами-двойниками и имеют сходную биологию, общих растений-хозяев и переносчиков, а в лабораторных условиях скрещиваются. Однако эти два близкородственных вида различаются по степени патогенности, причина которой до сих пор остается не ясной. Одна из гипотез предполагает, что, возможно, причина кроется в видовом составе бактерий-симбионтов, присутствующих у нематод этих видов или отдельных популяций.

Ниже приведены обобщающие данные (таблица 5) по видовому разнообразию бактерий-симбионтов, выделенных из различных географических изолятов В. mucronatus с территорий Российской Федерации и Китая (Zhao et al., 2009). Китайские изоляты нематод были выделены из древесины в провинциях, где вилт хвойных пород никогда не наблюдался.

Общее количество видов бактерий-симбионтов, выделенных из нематод В. mucronatus, составляет 35 видов. В настоящее время нами идентифицировано 20 видов бактерий и ранее российскими и китайскими исследователями (Арбузова и др., 2012; Kulinich et al., 2013; Zhao et al., 2009) было выделено еще 16 видов. Наиболее часто в обоих исследованиях встречаются бактерии, относящиеся к роду Pseudomonas.

Таблица 5. Видовой состав бактерий, выделенных с различных изолятов нематод В. mucronatus

Видовой состав бактерий По нашим данным По данным Zhao et al., 2009*

Acinetobacter Iwoffi/junti SC Ru2 Ru3

A. hydrophila SC

Achromobacter sp. +

Actinobacillus ureae Ru3

Aeromonas hydrophila SC

Bacillus subtilis +

Burkholderia xenovorans +

Enterobacter intermedius Rul Ru3

Enterobacter cloacae Rul JX2

Enterobacter sp. +

Enterococcus casseliflavus Ru3

Escherichia hermannii JX1 JX2

Flavobacterium sp. +

Klebsiella sp. +

Paenibacillus sp. +

Pantoea agglomerans + JX2

Pantoea sp. +

Pseudomonas aeruginosa Rul Ru2

Pseudomonas brennen +

Pseudomonas cloacae Ru2

Pseudomonas fluorescens +

Pseudomonas intermedium Rul Ru2

Pseudomonas geniculata +

Pseudomonas lurida +

Pseudomonas putida SC Rul

Pseudomonas sp. +

Rahnella aquatilis +

Rahnella sp. +

Rhodococcus sp. +

Serratia marcescens JX1

Serratia sp. +

Staphylococcus aeruginosa Ru2

Staphylococcus auricularis Ru2

Stenotrophomonas maltophilia +

Stenotrophomonas sp. +

Примечание: изоляты В. mucronatus Rul - Abies sp. (Свердловская обл.), Ru2 - Larix siberica (Иркутская обл..), Ru3 - Picea sp. (Красноярский край), SC - Pinus massoniana (пров. Sichuan), JX2 - P. massoniana (пров. Jiangxi), JX2 - P. massoniana (пров. Jiangxi) (no Zhao et al., 2009).

Бактерии P.fluorescens, обнаруженные нами у нематод В. mucronatus, впервые выделены у девяти изолятов из разных географических зон России. Ранее этот вид бактерий регистрировался только у нематод В. xylophilus (Zhao et al., 2009). По мнению китайских исследователей, значительная роль в нематодо-бактериальном комплексе, вызывающем вилт хвойных пород, отводится патогенным бактериям P.fluorescens, которые часто регистрируются на кутикуле В. xylophilus и показывают высокую степень токсичности на растениях. Китайские ученые считают данный вид бактерий основным возбудителем вилта хвойных пород в Китае (Guo et al., 2007а, 2007b.; Kong et al., 2009; Li et al., 2009; Yin et al., 2007; Zhao, Lin, 2005).

Исследования трансмиссивных личинок нематод В. mucronatus (Lrv, dauer larva), находящихся в имаго усача Monochamus urussovi, также показали наличие бактерии P.fluorescens. Это подтверждает факт тесной связи нематод с данным видом бактерии-симбионта на всех стадиях развития нематоды.

Можно предположить, что если российские изоляты В. mucronatus, содержащие бактерии P.fluorescens, перенести в условия, благоприятствующие развитию вилта (восприимчивые растения-хозяева; подходящие климатические условия: высокая температура воздуха и дефицит влаги), то мы также сможем наблюдать «вилт хвойных пород».

Согласно анализу фитосанитарного риска, значительная часть территории России благоприятна для акклиматизации сосновой стволовой нематоды В. xylophilus и проявления вилта хвойных пород, вызываемого этим патогеном. Считается, что увядание хвойных деревьев, заселенных нематодами В. xylophilus, происходит интенсивно, если среднемесячная температура воздуха самого жаркого месяца лета составляет +25 °С и выше. При температуре +20 °С заболевание растягивается на два года.

На территории России самый жаркий месяц — июль и в случае заноса нематоды В. xylophilus продолжительное увядание (2-3 года) хвойных насаждений может наблюдаться на значительной части европейской территории РФ (весь регион южнее широты Воронежской области, включая территорию Воронежской области), а также на юге Сахалинской области, Приморского и Хабаровского краев (Kulinich, Orlinski, 1998).

Сосна обыкновенная Pinus sylvestris, широко произрастающая на территории нашей страны, в частности в Воронежской области, относится к числу наиболее восприимчивых растений-хозяев нематод В. xylophilus и В. mucronatus. При анализе фитосанитарного риска сосновой стволовой нематоды В. xylophilus для территории России использовались среднестатистические климатические данные и не учитывались аномальные периоды. В 2010 г. — самом жарком летнем периоде нынешнего столетия в Европе, среднемесячная температура в Воронежской области составляла +26,4 °С в июле и +25,5 °С - в августе (что эквивалентно климатическим условиям в августе в Японии и на юге Китая) (рисунок 6).

2001-2012 гг.. -•-2010 г.

Рисунок 6. Изотермы средней температуры воздуха на территории Воронежской области за период 2010 г. и 2001-2012 гг.

В течение 2010-2011 гг. отмечалась массовая гибель участков соснового леса в Воронежской области (Кулинич и др., 2012). Представители лесного ведомства считают, что гибель сосновых древостоев вызвана нарушением водного режима территорий, однако мы не исключаем, что массовая гибель сосновых насаждений, наблюдаемая после крайне жаркого лета 2010 г. на территории России, могла быть связана в ряде случаев с воздействием нематодо-бактериального комплекса, для которого создались благоприятные климатические условия.

В результате исследования погибших деревьев выделены как нематоды В. тисгопаШз, так и сопутствующие им бактерии-симбионты Р. Аиогезсет (КиНшсЬ с* а1„ 2013).

Проделанная работа не исчерпывает всех вопросов, связанных с первопричиной заболевания «вилт хвойных пород» и ролью отдельных компонентов нематодо-бактериального комплекса в развитии заболевания. Требуются дальнейшие исследования механизма взаимосвязи нематодо-бактериального комплекса и растений-хозяев.

Последовательное решение поставленных задач проведенного исследования позволяет сделать следующие выводы, отражающие содержание выполненной работы.

выводы

1. Впервые проведены широкомасштабные обследования лесонасаждений и складированных лесоматериалов в 14 административных субъектах РФ на наличие сосновой стволовой нематоды Bursaphelenchus xylophilus. Вид В. xylophilus, входящий в перечень карантинных организмов Российской Федерации, на обследованной территории не выявлен. Отмечено широкое распространение древесной хвойной нематоды В. mucronatus. Степень заражения древесных проб В. mucronatus составляла 11,5% от всех проанализированных образцов в 2010 г. и 5,6% в 2011 г.

2. Изучена фауна нематод-ксилобионтов, обитающих в стволовой части хвойных пород в 14 административных субъектах РФ, которая включает представителей 2 классов, 3 отрядов, 5 инфраотрядов, 12 семейств, 18 родов. Род Bursaphelenchus представлен видом В. mucronatus.

3. Изучен видовой состав бактериальной биоты различных географических изолятов нематод В. mucronatus из различных регионов РФ, который включает 20 видов бактерий-симбионтов, относящихся к 5 классам (Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria, Actinobacteria, Flavobacteria, Bacillales) и 9 семействам (Enterobacteriaceae, Xanthomonadaceae, Pseudomonadaceae, Burkholderiaceae, Rhizobiaceae, Nocardiaceae, Flavobacteriaceae, Bacillaceae, Paenibacillaceae). Наиболее часто встречались бактерии рода Pseudomonas, представленные 5 видами: Р. lurida, Р. brennen, Р. geniculata, Р. fluorescens, Pseudomonas sp.

4. Впервые на изолятах нематод В. mucronatus выявлены бактерии-симбионты Pseudomonas fluorescens. Этот вид бактерий рассматривается как основной компонент нематодо-бактериального патогенного комплекса, вызывающего вилт хвойных пород и ранее регистрировался только у нематод В. xylophilus.

5. Впервые установлено, что бактерии Pseudomonas fluorescens имеются не только у нематод Bursaphelenchus mucronatus, обитающих в древесине, но и в трансмиссивных личинках этого вида Lrv (dauer larva), переносимых насекомыми.

6. Изучена бактериальная микробиота изолятов нематод В. xylophilus из Северной Америки и Португалии. Установлено, что видовой состав бактерий, выделенных с североамериканского и португальских илозятов, представлен десятью видами, относящимися к двум классам (Gammaproteobacteria и Alphaproteobacteria) и 4 семействам (Enterobacteriaceae, Xanthomonadaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae). Бактерии Pseudomonas fluorescens обнаружены у двух изолятов.

7. Впервые при изучении изолятов нематод В. xylophilus из Португалии были выделены бактерии Agrobacterium tumefaciens, "вызывающие корневой рак плодовых и лесных древесных пород.

8. На основании последовательностей ДНК гена COI нематод В. xylophilus и В. mucronatus подобраны универсальные праймеры и меченные флуоресцентными красителями зонды, специфичные для В. xylophilus и В. mucronatus, которые позволили проводить точную идентификацию этих видов

при постановке ПЦР «в реальном времени». Разработанной метод ПЦР «в реальном времени» позволял проводить идентификацию нематод В. xylophilus и В. mucronatus по одной особи, а также определять степень зараженности исследуемого материла.

Список публикаций автора

1. Арбузова E.H. Изучение увядания хвойных пород, вызываемого нематодами-ксилофагами в России / Кулинич O.A., Козырева Н.И., Арбузова E.H. // Теоретические и практические проблемы паразитологии. Материалы Международной научной конференции, М., 2010. С. 195-198.

2. Арбузова E.H. Лесопатологический мониторинг карантинных и инвазивных лесных организмов в Российской Федерации. / Абасов М.М., Арбузова E.H., Гниненко Ю.И., Кулинич O.A., Тузов В.К. // Защита и карантин растений, 2011, № 9. С. 36-37.

3. Арбузова E.H. Обследование территории РФ на наличие сосновой стволовой нематоды Bursaphelertchus xylophilus. / Арбузова E.H., Магомедов У.Ш., Абасов М.М., Пономарев BJL, Козырева Н.И., Рысс А.Ю., Кулинич O.A. // Нематоды естественных и трансформированных экосистем РАН, Петрозаводск, 2011, стр. 40-42.

4. Арбузова E.H. Бактериальная микробиота древесной нематоды Bursaphelenchus mucronatus. / Кулинич O.A., Арбузова E.H., Мазурин Е.С., Рысс А.Ю., Магомедов У.Ш., Козырева Н.И. // Нематоды естественных и трансформированных экосистем РАН, Петрозаводск, 2011. С. 74-76.

5. Арбузова E.H. Бактериальная микробиота древесных нематод-ксилофагов рода Bursaphelenchus. / Кулинич O.A., Арбузова E.H., Мазурин Е.С., Рысс А.Ю., Егорова М.С., Козырева Н.И. // Труды ЦП ИПЭЭ РАН, 2012. С. 120128.

6. Арбузова E.H. Упаковочные материалы как источник возможного заноса карантинных организмов. / Кулинич O.A., Магомедов У.Ш., Арбузова E.H., Й. Раутапяя, О. Хукка // Агробезопасность, 2012, № 4 (10). С. 47-50.

7. Арбузова E.H. Инвазивные лесные организмы — кандидаты в перечень карантинных объектов Таможенного союза / Кулинич O.A., Магомедов У.Ш., Арбузова E.H., Козырева Н.И. // Экологические и экономические последствия инвазий дендрофильных насекомых. Материалы Всероссийской конференции, Красноярск, 2012. С. 16-22.

8. Арбузова E.H. Нематоды-ксилофаги и бактерии-симбиотны как возможные возбудители «вилта хвойных пород» на территории России / Арбузова E.H., Кулинич O.A., Мазурин Е.С., Магомедов У.Ш., Рысс А.Ю., Козырева Н.И. // Экологические и экономические последствия инвазий дендрофильных насекомых. Материалы Всероссийской конференции, Красноярск, 2012. С. 129-132.

9. Арбузова E.H. Сосновая стволовая нематода Bursaphelenchus xylophilus — потенциальная угроза хвойным лесам России / Кулинич O.A., Арбузова E.H., Магомедов У.Ш., Козырева Н.И., Рысс А.Ю. // Экологические и экономические последствия инвазий дендрофильных насекомых. Материалы Всероссийской конференции, Красноярск, 2012. С. 164-168.

10. Арбузова Е.Н. Бактерии-симбионты нематод-ксилофагов Bursaphelenchus mucronatus на территории России / Арбузова Е.Н., Кулинич О.А., Мазурин Е.С., Рысс А.Ю., Козырева Н.И. // Современные проблемы общей паразитологии, Материалы Международной научной конференции, М., 2012. С. 25-31.

11. Арбузова Е.Н. Тара — объект возможного заноса карантинных организмов / Кулинич О.А., Магомедов У.Ш., Раутапяя Й., Хукка О., Арбузова Е.Н., Н.И. Козырева // Защита и карантин растений, 2013, № 3. С. 37-40.

12. Arbuzova E.N. Surveys for the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophilus in Russia. / Arbuzova E.N., Magomedov U.Sh., Abasov M.M., Ponomarev V.L., Kozyreva N.I., Ryss A.Yu., Kulinich O.A. // Abstracts of the Ninth International symposium of the Russian Society of Nematologists. Russian Journal ofNematology, 2011, N 19 (2), P. 190.

13. Arbuzova E.N. Bacteria associated with wood-inhabiting Bursaphelenchus mucronatus nematodes. / Kulinich O.A., Arbuzova E.N., Mazurin E.S., Ryss A.Yu., Magomedov U.Sh., Kozyreva N.I. // Abstracts of the Ninth International symposium of the Russian Society of Nematologists. Russian Journal ofNematology, 2011, N 19 (2), P. 195-196.

14. Arbuzova E.N. Recent research on pine wilt disease in Russia. / Kulinich O.A., Arbuzova E.N., Magomedov U.Sh., Kozyreva N.I., Mazurin E.S., Kolychikhina M.S., Ryss A.Yu. // IUFRO/REPHRAME International Conference on Pine Wilt Disease, Braunschweig, Germany, 2013, P. 54-55.

Подписано в печать:

23.04.2014

Заказ № 9982 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Арбузова, Елена Николаевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ

ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЭКОЛОГИИ И ЭВОЛЮЦИИ ИМ А.Н. СЕВЕРДОВА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ ЦЕНТР КАРАНТИНА РАСТЕНИЙ»

На правах рукописи

04201458548

АРБУЗОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

НЕМАТОДЫ РОДА ВиКЯАРНЕЬЕМСНШ И ИХ ВЗАИМОСВЯЗЬ С БАКТЕРИЯМИ-СИМБИОНТАМИ НА ХВОЙНЫХ ПОРОДАХ

Специальность 03.02.11 - паразитология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Зиновьева Светлана Васильевна

Москва -2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................................................4

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................11

1.1. Общая характеристика сосновой стволовой нематоды Виг8арке1епс11Ш ху1орЫ1и8 и близкородственных видов......................................11

1.2. Краткая характеристика нематод рода ВигзарИеЫпскиз..........................12

1.3. Географическое распространение..............................................................................15

1.4. Биология нематод В. ху1орЫ1т и В. тисгопаШх............................................18

1.5. Патогенез заболевания «вилт хвойных пород»....................................................22

1.6. Растения - хозяева сосновой стволовой нематоды В. ху1орШ1ш... 24

1.7. Влияние абиотических факторов на проявление болезни «вилт хвойных пород»............................................................................................................................24

1.8. Экономический ущерб..........................................................................................................25

1.9. Методы защиты хвойных насаждений от сосновой стволовой нематоды В. хуЬркИш..........................................................................................................26

1.10. Нематодо-бактериальный комплекс, как причина увядания

хвойных пород............................................................................................................................29

1.10.1. Краткая история исследования бактерий, ассоциированных с сосновой стволовой нематодой

В. ху1орЫ1т................................................................................................................................................................29

1.10.2. Роль бактерий в развитии вилта хвойных пород........................32

1.10.3. Токсины, выделяемые бактериями............................................................36

ГЛАВА И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................40

2.1. Обследование лесонасаждений и складированной древесины хвойных пород................................................................................................................................40

2.2. Отбор древесных проб и выделение нематод..................................................44

2.3. Культивирование нематод................................................................................................45

2.4. Идентификация нематод и бактерий........................................................................48

2.4.1. Морфологическая идентификация нематод.................... 48

2.4.2. Молекулярная диагностика нематод.............................. 49

2.4.3. Молекулярная диагностика бактерий........................... 52

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.......................... 55

3.1. Фауна нематод-ксилобионтов хвойных пород........................... 55

3.2. Идентификация сосновой стволовой нематоды В. xylophilus и древесной хвойной нематоды В. mucronatus с применением молекулярных методов диагностики................................... 66

3.3. Разработка методов выявления и идентификации нематод В. xylophilus и В. mucronatus методом ПЦР в «реальном времени»...................................................................... 73

3.4. Видовой состав бактерий, ассоциированных с исследуемыми изолятами нематод В. mucronatus и В. xylophilus.................... 79

3.4.1. Бактерии-симбионты, ассоциированные с нематодами

В. mucronatus................................................................... 80

3.4.2. Бактерии-симбионты, ассоциированные с нематодами

В. xylophilus..................................................................... 88

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................... 93

ВЫВОДЫ.............................................................................. 98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................... 100

ВВЕДЕНИЕ

Россия по запасу и площади лесов - крупнейшая лесная держава мира. На ее долю приходится четверть мирового лесного покрова. По обеспеченности лесами Россия занимает первое место в мире, обладая примерно 1/5 мировых запасов древесины.

Основные лесообразугощие породы в лесном фонде России - лиственница, сосна, ель, кедр, дуб, бук, береза, осина и др. Они занимают более 90% земель, покрытых лесной растительностью (рисунок 1).

Наибольшую площадь и запас в лесном хозяйстве составляют хвойные насаждения с преобладанием лиственницы (более 50% хвойных насаждений), произрастающие преимущественно в районах Сибири и Дальнего Востока. Сосновые древостой занимают 23%, еловые - 15% площади хозяйства.

Объектом пристального внимания лесных и карантинных служб многих стран мира в последние 25-30 лет стал опасный паразит хвойных пород -сосновая стволовая нематода (pine wood nematode) Bursaphelenchus xylophilus. Этот патоген относится к числу лесных карантинных организмов, представляющих наибольшую опасность для хвойных древостоев в Европе и Азии. Нематоды питаются на клетках смоляных каналов, вызывая их быструю гибель. В итоге, уже к концу летнего сезона, дерево полностью гибнет (рисунок 2). Увядание хвойных древостоев - вилт хвойных пород («Pine Wilt Disease»), вызываемое нематодами В. xylophilus, можно отиссти к числу наиболее опасных заболеваний хвойных насаждений в мире (Кулинич, 2009; Mamiya, 1999; Abelleira et al., 2011; Mota et al., 1999; Wang, 2009).

Рисунок 1. Схема распространения древесных пород на территории России

Рисунок 2. Участок соснового леса, пораженный сосновой стволовой нематодой В. xylophilus (Португалия, о. Мадейра) (фото О.А.Кулинича)

Сосновая стволовая нематода В. xylophilus впервые обнаружена в 1934 году на лесопилке в США в штате Луизиана в древесине сосны болотной Pinus palustris. Согласно гипотезе, этот вид нематоды был завезен из США в юго-восточную Азию и впервые выявлен в Японии в 60-х годах в погибших соснах (Mamiya, 1984). В настоящее время нематода В. xylophilus широко распространена в Японии, Китае, Тайване, Южной Корее. В 1999 году патоген обнаружен в

Португалии, куда он был занесен с деревянной упаковочной тарой, а в 2008 году паразит уже был зарегистрирован в Испании. Ущерб, наносимый В. xylophilus лесным насаждениям в вышеуказанных странах оценивается в миллиардах долларов (Кулинич и др., 2010; Wang, 2009; Mota et al., 1999; Shin Sang-Chul, 2009; Rodrigues et al, 2009).

Учитывая ограниченное распространение сосновой стволовой нематоды в мире и существенную угрозу со стороны В. xylophilus хвойным древостоям, большинство стран Европы, включая Россию, начиная с середины 1980-х годов, согласно рекомендациям Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений (ЕОКЗР), ввели жесткие ограничения на импорт древесных материалов из тех регионов мира, где распространен этот патогенный организм (Bergdahl, 1988). Территория пашей страны официально считается свободной от сосновой стволовой нематоды В. xylophilus, в то же время Россия, как крупнейший экспортер лесопродукции, уделяет особое внимание этому патогену и регулярно проводит мониторинг хвойных лесонасаждений на наличие этого объекта. Согласно анализу фитосанитарного риска, значительная часть территории России благоприятна для адаптации В. xylophilus. Подсчитано, что в случае проникновения и акклиматизации этого патогена на территории Российской Федерации возможный ущерб, по разным оценкам, может составить от 47 до 112 миллиардов рублей в год (Кулинич и др., 2010, 2012).

Актуальность темы диссертационной работы:

Вилт хвойных пород, возбудителем которого является сосновая стволовая нематода Bursaphelenchus xylophilus, относится к числу наиболее экономически значимых заболеваний хвойных лесонасаждений в мире. Большинство стран, включая Россию, внесли В. xylophilus в перечень карантинных организмов. Изучение этиологии этого заболевания в последние годы позволило сделать предположение о том, что болезнь вызывается не одним организмом - нематодой, а комплексом патогенов: нематодой В. xylophilus и связанными с ней бактериями-симбионтами, продуцирующими фитотоксины. Эта гипотеза принята рядом ученых, работающих по проблеме вилта хвойных пород (Han et al, 2003; Zhao et

а1, 2003, 2005; Тап а а1, 2004; вио е1 а!., 2006, 2007а, 2007Ь; Ут а а1, 2007), однако окончательной ясности о роли микробиоты в развитии заболевания на сегодняшний день нет.

В связи с широким распространением В. ху1орИИш в соседних с Россией странах (Китае и Японии), возможностью естественного заноса этого патогена, (как с жуками-переносчиками, так и с древесными материалами при импорте товаров), а также возможным риском адаптации этой нематоды в условиях нашей страны, актуальной проблемой является мониторинг В. хуЬрИНт и близкородственных видов на хвойных породах на территории Российской Федерации и исследование симбиотических организмов ассоциированных с нематодой, играющих определенную роль в развитии вилта хвойных пород.

Сосновая стволовая нематода В. ху1орМ1т считается видом, официально отсутствующим на территории РФ, но выявлено широкое распространение близкородственного вида В. тисгопаШБ. Древесная хвойная нематода В.тисгопаШя считается непатогенным или слабопатогенным видом, однако в результате наблюдений и опытов показано, что некоторые изоляты этого вида могут вызывать в ряде случаев гибель хвойных насаждений. В связи с этим основной целью нашей работы стало изучение бактериальной биоты древесной хвойной нематоды В. тисгопа1т распространенной на территории РФ, а также зарубежных изолятов нематод В. ху1орЫ1т.

Для достижения этой цели планировалось решение следующих задач:

1. Обследование территории РФ на наличие нематод рода ВигяарИекпсИия.

2. Изучение фауны нематод-ксилофагов в особенности видов группы «ху1ор1й1ш».

3. Изучение микробиоты ассоциированной с нематодами рода Вигб ар к е1епск т.

4. Изучение взаимосвязи нематод рода Виг5арИе1епсИш с патогенными бактериями - потенциальными возбудителями вилта хвойных пород.

Основные научные результаты и их новизна:

1. Впервые проведены широкомасштабные обследования лесонасаждений и складированных лесоматериалов в 14 административных субъектах РФ от Московской области до острова Кунашир на наличие опасного патогена - сосновой стволовой нематоды Bursaphelenchus xylophilus. Выявлено широкое распространение древесной хвойной нематоды B.mucronatus на территории России и подтверждено отсутствие В. xylophilus. Изучена фауна нематод-ксилобионтов, обитающих в стволовой части хвойных деревьев на территории Российской Федерации. Обнаруженные нематоды относятся к представителям 18 родов, 12 семейств, 3 отрядов, 2 классов. Видовой состав нематод-ксилофагов рода Bursaphelenchus был представлен видом В. mucroncitus, который зарегистрирован фактически во всех обследованных регионах страны.

2. Изучен нематодо-бактериальный комплекс, вызывающий наиболее экономически значимое заболевание хвойных лесонасаждений в мире - вилт хвойных пород:

а) С использованием методов молекулярной диагностики выявлены бактерии-симбионты различных географических изолятов нематод Bursaphelenchus mucronatus из различных регионов РФ;

б) Впервые на изолятах нематод В. mucronatus выявлены бактерии Pseudomonas fluorescens - потенциально опасные бактерии патогенного комплекса, вызывающего вилт хвойных пород; ранее этот вид бактерий регистрировался только у нематод В. xylophilus в Китае;

в) Впервые отмечено, что бактерии Pseudomonas fluorescens находятся не только у нематод В. mucronatus, обитающих в древесине, но и в трансмиссивных личинках L1V (dauer larva), переносимых насекомыми;

г) Впервые при изучении изолятов нематод В. xylophilus были обнаружены бактерии Agrobaclerium tumefaciens, вызывающие корневой рак плодовых и лесных древесных пород.

3. Создан банк живых культур нематод Bursaphelenchus miicroncitiis, включающий 25 географических изолятов, выделенных из древесины хвойных пород различных регионов Российской Федерации.

4. На основе подобранных праймеров и зондов разработана диагностика сосновой стволовой нематоды В. xylophilus и древесной хвойной нематоды B.mucronatus, которая позволяет в короткие сроки проводить точную их идентификацию методом ПЦР «в реальном времени».

Практическая значимость результатов исследований. По материалам проведенных исследований разработан стандарт организации ФГБУ «ВНИИКР» «Сосновая стволовая нематода Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle. Методы выявления и идентификации», а также методические рекомендации по досмотру древесных упаковочных материалов на наличие сосновой стволовой нематоды В. xylophilus, которые могут быть использованы в практике научных исследований и при проведении досмотра и экспертиз подкарантинной продукции на наличие карантинных вредных организмов.

Для оценки распространенности в России нематод В. xylophilus и В. mucronatus рекомендуется использовать:

- идентификацию видов методом ПЦР «в реальном времени» с подобранными нами универсальными праймерами и меченными флуоресцентными красителями (FAM, HEX) зондами, который позволяет в несколько раз по времени ускорить проведение фитосанитарной экспертизы, в сравнении с используемым методом классической ПЦР;

- секвенирование популяций нематод по митохондриальному гену цитохромоксидазы COI, которое показало наиболее точные результаты по идентичности последовательностей ДНК.

Созданный банк живых культур нематод рода Bursaphelenchus является учебным пособием при обучении диагностике нематод сотрудников Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на научных конференциях: на Международной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии», Москва, 2010 г.; на IX симпозиуме Российского общества нематологов с международным участием «Нематоды естественных и трансформированных экосистем», Петрозаводск, 2011 г.; на Всероссийской конференции с международным участием «Экологические и экономические последствия инвазий дендрофильных насекомых», Красноярск, 2012 г.; на Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии», Москва, 2012 г.; на Международной научной конференции «Pine Wilt Disease», Германия, Брауншвейг, 2013.

Данные исследования были поддержаны грантом РФФИ № 10-04-01644а.

Публикация результатов исследований. В основу работы положены оригинальные материалы автора, полученные в результате исследований нематод рода Bursaphelenchus и их взаимосвязи с бактериями-симбионтами на хвойных породах. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ на русском (11) и английском (3) языках в отечественных и зарубежных изданиях. 4 публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства науки и образования РФ.

По материалам проведенных исследований разработан стандарт организации ФГБУ «ВНИИКР» «Сосновая стволовая нематода Bursaphelenchus xylophilus (Steiner & Buhrer) Nickle. Методы выявления и идентификации», а также методические рекомендации по досмотру древесных упаковочных материалов на наличие сосновой стволовой нематоды В. xylophilus, которые могут быть использованы в практике научных исследований и при проведении досмотра и экспертиз подкарантипной продукции на наличие карантинных вредных организмов.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика сосновой стволовой нематоды Bursaphelenchus xylophiliis и близкородственных видов

Впервые массовое увядание местных видов сосен Pinns densißora и Pinns thunbergii отмечено в Японии еще в 1913 году (Mamiya, 1984), однако причина гибели деревьев была выявлена только в 70-х годах XX столетия. В результате многолетних исследований было установлено, что причиной эпифитотий является сосновая стволовая нематода Bursaphelenchus xylophilus, а вызываемое ею заболевание получило название «pine wilt disease» («вилт хвойных пород»).

Во многих странах мира вид В. xylophilus включен в перечень карантинных объектов, и импорт необработанных соответствующим образом лесоматериалов из районов распространения этого опасного паразита запрещен. Этот фактор послужил толчком для тщательного исследования фауны, систематики, диагностики, биологии нематод рода Bursaphelenchus и особенно видов, родственных В. xylophilus. Существует предположение, что не только вид В. xylophilus, но, возможно, и другие нематоды этого рода также могут наносить ощутимый вред и вызывать заболевания деревьев (Han et al., 2003; Zhao et al, 2003, 2005; Tan et al, 2004; Guo et al, 2006, 2007a, 2007b; Yin et al, 2007). Как уже указывалось во «Введении», вид В. xylophilus не обнаруживался в лесонасаждениях России. Тем не менее, исследование биологических особенностей В. xylophilus показало, что преобладающая часть территории Российской Федерации благоприятна для адаптации этого патогена (Кулинич, Козырева, 2004; Kulinich, Kolosova, 1995; Kulinich, Orlinski, 1998).

1.2. Краткая характеристика рода ВигъаркеЬепскиь

Род ВигБарИекпскт включает в себя более 80 видов нематод (КуэБ е1 а1., 2005; ВгаавсЬ, 8с1юг^е1(1, 2013), некоторые из них связаны с хвойными породами.

Рисунок 3. Сосновая стволовая нематода ВигзарНеЫпсЪт ху\орЫ1т (самец О)

(фото А.Ю. Рысса)

Возбудитель вилта хвойных пород - нематода В. xylophilus является карантинным организмом (рисунок 3). В настоящее время известны четырнадцать близкородственных видов нематод и два подвида, входящих в группу «xylophilus»: В. xylophilus, В. populi, В. mucronatus kolymensis, В. mucronalus mucronatus, В. fraudulentus, В. gillanii, В.