Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые аспекты репродуктивной биологии видов и сортов Lilium L.

ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Некоторые аспекты репродуктивной биологии видов и сортов Lilium L."

На правах рукописи

005016564

ЛАБУНСКАЯ Наталия Александровна

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ БИОЛОГИИ ВИДОВ

И СОРТОВ ыыим Ь.: ПОЛИПЛОИДИЯ, СЕМЕННОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ, ПИГМЕНТЫ ОКОЛОЦВЕТНИКОВ

03.02.01 - Ботаника

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАЙ 2012

Белгород-2012

005016564

Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Сорокопудова Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты: Калаев Владислав Николаевич

доктор биологических наук, доцент ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», профессор кафедры генетики, цитологии и биоинженерии

Пятых Андрей Михайлович

кандидат сельскохозяйственных наук ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Я. Горина», зав. кафедрой землеустройства и ландшафтного строительства

Ведущая организация ГНУ Всероссийский научно-исследовательский

институт садоводства имени И.В. Мичурина Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится «15» мая 2012 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 212.015.12 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».

Автореферат разослан «9» апреля 2012 г. Автореферат размещен на сайте http://www.bsu.edu.ru/

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Н.Г. Габрук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Известно, что растения рода Lilium L. не склонны к самопроизвольному умножению числа хромосом ни в природе, ни в культуре. Сорта-полиплоиды единичны в мировом сортименте этого рода, поэтому искусственная полиплоидизация имеет важное значение.

Многие виды и сорта лилий обладают крупными генеративными побегами и цветками, поэтому при получении полипоидов чаще хотят получить растения не столько с эффектом гигантизма, сколько с другими ценными признаками, такими как более плотные (толстые) листочки околоцветника и листьев, прочные, крепкие стебли, обуславливающие пряморослость цветоносного побега и более долгую сохранность их в срезке, устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, в том числе к вирусным болезням, более высокая продуктивность. Тетраплоиды необходимы для получения триплоидов, а также очень перспективны в селекции при отдаленной гибридизации. Многие триплоиды, полученные в результате отдаленных скрещиваний и считавшиеся ранее неперспективными для селекции вследствие стерильности, оказались способными завязывать семена при опылении тетраплоидами (Schenk, 1987). Несмотря на то, что вопросами полиплоидизации лилий в мире занимаются более полувека (Emsweller, 1946, 1949; Darby, 1965), в России подобные работы очень малочисленны (Матвеева, 1980).

Так как многие виды и сорта лилий не имеют аромата, окраска их околоцветников играет большую роль в процессе опыления для привлечения насекомых, влияя на семенную продуктивность растений. Кроме того, пигменты околоцветников (антоцианы и каротиноиды) представляют значительный интерес для пищевой промышленности как потенциальное сырье для производства естественных красителей. Однако в настоящее время пигментный состав околоцветников изучен слабо. Известно, что околоцветники растений-полиплоидов имеют более интенсивную окраску (Матвеева, 1980). Поэтому актуален поиск перспективных видов и сортов лилий - источников ценных пигментов в околоцветниках - для их полиплоидизации и использования в селекции.

Цель и задачи исследований. Цель работы - создание полиплоидов лилий и совершенствование методов их идентификации, выявление пигментного состава околоцветников у некоторых видов и сортов для пополнения ассортимента травянистых поликарпиков новыми хозяйственно-ценными формами.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- получить полиплоиды методами митотической и мейотической полиплоидизации с последующей их идентификацией;

- выявить информационно значимые метрические характеристики устьич-ного аппарата для косвенного метода оценки уровня плоидности у лилий;

- усовершенствовать методику подсчета хромосом на давленых препаратах из корешков лилий для определения уровня плоидности;

- оптимизировать методику проращивания ценных семян лилий in vitro;

- исследовать пигментный состав листочков околоцветника лилий.

Научная новизна. Получены полиплоидные формы и гибриды лилий путем митотической и мейотической полиплоидизации. Впервые изучена вариабельность длины замыкающих клеток устьиц для прогноза и оценки уровня плоидности у лилий. Предложены новые методические подходы для оценки эффективности различных способов предфиксационной обработки растительного материала при приготовлении давленых препаратов для подсчета числа хромосом. Выявлены наиболее простые и эффективные способы предобработки корешков лилий для подсчета числа хромосом на давленых препаратах и усовершенствованы некоторые из них. Для повышения выхода ценных сеянцев оптимизирован способ проращивания гибридных семян на безгормональной питательной среде in vitro. Получены новые данные по пигментному составу листочков околоцветника и выявлены наиболее ценные виды и сорта лилий по данному признаку.

Практическая значимость. Усовершенствованы методики получения и идентификации полиплоидов лилий на различных этапах. Выявлены ценные виды и сорта, являющиеся источниками капсантина, капсарубина и цианидин-3-рутинозида, перспективные для использования в качестве пищевых красителей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мейотическая полиплоидизация с использованием сортов-тетраплоидов 'Foggia' и 'Nove Cento' с последующим проращиванием семян in vitro позволяют обогатить генофонд лилий ценными полиплоидными формами.

2. Метрические данные замыкающих клеток устьиц листьев лилий с учетом их вариабельности позволяют повысить эффективность работы по выявлению полиплоидов на начальных этапах исследований.

3. Для подсчета числа хромосом у гибридов и форм лилий оптимальна комбинированная предфиксационная обработка цитологического материала, сочетающая обработку растворами мутагенов и охлаждение.

4. Некоторые виды и сорта лилий с красными (L. buschianum и L. pumiliim) и бордовыми ('Summer Night', 'Забава') околоцветниками являются ценным сырьем для получения каротиноидов (капсантина и капсорубина) и антоцианов (цианидин-3 -рутинозида).

Апробация результатов работы. Результаты исследований докладывались и публиковались на конференциях молодых ученых (Санкт-Петербург, 2006; Белгород, 2006; Владикавказ, 2007), межрегиональной конференции «Биоразнообразие - от идеи до реализации» (Тамбов, 2007), всероссийских научно-практических конференциях «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Белгород, 2008), «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар-Уфа, 2008), международных научных конференциях «Цветоводство без границ» (Харьков, 2006), «Биологические науки. Секция молодых ученых, студентов и специалистов» при РАЕ (Москва, 2007), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии» (Белгород, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, 3 из которых в изданиях, рекомендуемых Перечнем ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах текста, состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций, содержит 26 таблиц, 31 рисунок. Список используемой литературы включает 218 источников, в том числе 64 - иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ПРОБЛЕМЫ УВЕЛИЧЕНИЯ БИОРАЗНООБРАЗИЯ И РАЗМНОЖЕНИЯ У LILIUM (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Приводятся сведения о способах получения и идентификации полипоид-ных растений, достижениях экспериментальной полиплоидии лилий за рубежом и в России, преимуществах полиплоидных форм лилий. Рассмотрены аспекты по введению лилий в культуру in vitro, обобщены данные по пигментному составу лилий.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ, УСЛОВИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проведены в 2005-2008 гг. Объектами исследований являлись виды и сорта лилий, культивируемые на интродукционном участке Ботанического сада Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ») в открытом грунте: 5 видов - Lilium buschianum Lodd., L. lancifolium Thunb., L. pumilum Delili, L. henryi Baker, L. pensylvanicum Ker.-Gawl., 161 сорт Азиатских гибридов отечественной и иностранной селекции, 35 ЛА гибридов (LA hybrids - Longiflorum х Asiatic hybrids) иностранного происхождения, 4 ОТ гибрида (ОТ hybrids - Oriental х Trumpets hybrids), 2 Восточных гибрида (Oriental hybrids) и 2 Трубчатых гибрида селекции ВНИИС им. И.В. Мичурина.

Представлены данные о погодных условиях в годы исследований в сравнении со среднемноголетними показателями.

Для митотической полиплоидизации проводили обработку базальных частей чешуй лилий 0,2% раствором колхицина в течение 6 часов, для мейоти-ческой - межсортовые скрещивания Азиатских гибридов с привлечением тет-раплоидов 'Foggia', 'Nove Cento', 'Tetra' иностранного происхождения. Искусственную гибридизацию лилий проводили с учетом основных правил селекции (Френкель, Галун, 1982; Леди..., 2005).

При проращивании семян лилий использовали метод культуры in vitro, используя питательную среду Мурасиге-Скуга (Murashige, 1962) с различными ее модификациями (Zwierzykowski и др.,1985; Бутенко, 1999; Lian и др., 2002; Ветчинкина и др., 2003; Байбурина и др., 2006; Калашникова и др., 2006). Культивирование гибридов в условиях in vitro осуществляли при комнатной температуре с естественным фотопериодом и в полной темноте, с последующей пересадкой в перлит-вермикулитовый субстрат и дальнейшей адаптацией к естественным условиям.

Длину замыкающих клеток устьиц листьев лилий изучали на световом микроскопе «Микмед-5», микрофотосъемку осуществляли фотоаппаратом Са-

non Power Shot - A520. Онтогенетические состояния растений определяли по качественным признакам, согласно данным в работах М.В. Барановой (1990), О.А. Сорокопудовой (2005).

Уровень плоидности форм, сортов и гибридов лилий определяли путем измерений и сопоставлений длины замыкающих клеток устьичного аппарата (у свежих и фиксированных листьев) и прямым подсчетом числа хромосом на давленых препаратах, приготовленных из верхушек корней, руководствуясь общепринятыми методиками (Паушева, 1974; Барыкина, 2004; Сорокопудова, 2005) с некоторыми модификациями.

Анализ пигментов (антоцианов и каротиноидов) околоцветников проводился на кафедре общей химии НИУ «БелГУ» у видов и сортов лилий с окраской околоцветников от желтой до темно-бордовой.

Для исследования накопления антоцианов и каротиноидов была использована хроматографическая система, составленная из насоса «Altex 110А», крана дозатора «Rheodyne 7200» с петлей объемом 20 мкл. Хроматографические колонки: 4x250 мм, Диасфер-110-С18, 5 мкм, 4x250 мм, Кромасил-100-С18, 5 мкм, защищенные предколоночным фильтром. Детектор - спектрофотометрический с варьируемой длиной волны (Nicolet LC/9563). Для регистрации и обработки хроматограмм использовали ПП «МультиХром 1.5». Спектры пигментов записывали на спектрофотометре КФК-3-01. Для разделения каротиноидов методом ТСХ (тонкослойной хроматографии) использовали пластины с силикаге-лем «Сорбфил».

Названия видовых таксонов приведены согласно справочнику С.К. Черепанова (1995), деление лилий на гибридные секции дано по монографии М.В. Барановой (1990, 1999), названия сортов указаны согласно International Lily Register (2007) и электронному ресурсу The Online Lily Register.

Экспериментальный материал, полученный в лабораторных и полевых опытах, обработан методами вариационной статистики: дисперсионного и корреляционного анализов (Плохинский, 1970; Доспехов, 1973) в компьютерной программе Excel в среде операционной системы Microsoft Windows.

Глава 3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЛИПЛОИДОВ

Изучение признака длины замыкающих клеток устьиц

Одним из способов определения уровня плоидности лилий является измерение длины замыкающих клеток устьиц (ЗКУ). Зная длину ЗКУ, можно прогнозировать уровень плоидности растения. Для его подтверждения в случаях, когда длина ЗКУ достоверно больше, чем у диплоидов, используется точный цитологический метод с подсчетом хромосом.

Длину ЗКУ измеряли на нижнем эпидермисе свежих и фиксированных листьев. В качестве фиксатора использовали смесь из равных частей спирта, глицерина и воды (Пленник,1976; Немченко, Новиков, 1979). В каждом варианте измеряли по 30 и более клеток у 3-4 листьев нескольких растений - по 10 наиболее типичных клеток с одного листа.

Для сравнительной оценки длины ЗКУ у различных видов и сортов измерения проводили в средней части листовой пластинки среднего яруса у лилий во взрослом генеративном онтогенетическом состоянии. Длина ЗКУ варьировала от 56 до 120 мкм. Наиболее длинные ЗКУ - в среднем 113,7 ± 0,8 мкм - имели известные сорта-тетраплоиды 'Foggia', 'Nove Cento', 'Tetra', 'Gran Paradiso'; у диплоидных видов и сортов лилий длина ЗКУ в среднем составляла 80,2 ± 1,6 мкм, что сопоставимо с данными O.A. Сорокопудовой (2005).

Вариабельность длины ЗКУ в зависимости от места расположения на листовой пластинке у листьев среднего яруса. Исследовали длину ЗКУ листьев среднего яруса взрослых растений у 37 видов и сортов лилий, которая варьировала от 4,2% ('Royal Sunset') до 9,7% ('Aubade'); у сортов 'Marakesh', 'Rosello', 'Lagio', 'Royal Delight' коэффициент вариации по данному признаку составил немного более 10% (табл. 1).

По полученным результатам выявлено, что изменчивость длины ЗКУ в зависимости от места расположения устьиц на листовой пластинке видо- и сортос-пецифична. У 92% исследованных сортов и видов лилий выявлена тенденция к увеличению длины ЗКУ от апикальной части листовой пластинки к базальной, г = 0,82. Исключения составляют сорта 'Aubade', 'Glossy Wings', 'Royal Grace', у которых средняя длина ЗКУ в апикальной части листовых пластинок превышала их размеры в центральной части, и сорта 'Foggia', 'Nove Cento', 'Royal Delight', у которых длина ЗКУ в базальной части листовых пластинок была меньше, чем в центральной (см. табл. 1).

Вариабельность длины ЗКУ у растений разных онтогенетических состояний. Показатель длины ЗКУ в зависимости от онтогенетического состояния лилий для поликарпических растений с длительным прегенеративным периодом онтогенеза важен для оценки уровня плоидности у молодых растений, не дожидаясь вступления растений в генеративный период онтогенеза.

Этот показатель изучали у листьев Азиатских гибридов 'Светлица', 'Желтая Птица', 'Foggia' и JIA-гибрида 'Royal Delight' в ювенильном, виргинильном, молодом и взрослом генеративном онтогенетическом состоянии. У сорта 'Светлица' длина ЗКУ листьев ювенильных растений была больше, чем у взрослых генеративных растений среднего яруса и отличалась на 14,6%, у сорта 'Royal Delight' -на 45,4%, у сорта 'Foggia' - на 26,1% (рис. 1, табл. 2). У виргинильных растений длина ЗКУ листьев отличалась от длины ЗКУ взрослых генеративных растений по-разному: у сортов 'Светлица' и 'Желтая Птица' она была меньше на 3,7-9,8 %, чем у взрослых генеративных, у сортов 'Royal Delight' и 'Foggia' - меньше на 11,0-15,0 %. У всех сортов длина ЗКУ листьев у молодых генеративных растений была меньше, чем у средневозрастных на 0,5-12,0 % (см. табл. 2).

Длина ЗКУ в зависимости от яруса взрослого растения. В результате сравнений оказалось, что длина ЗКУ в центральной части листовых пластинок уменьшалась снизу вверх, то есть у листьев верхнего яруса ЗКУ была достоверно короче, чем у листьев нижнего яруса, независимо от происхождения и уровня плоидности (табл. 3).

Таблица 1

Средняя длина замыкающих клеток устьиц (ЗКУ) у листьев лилий взрослых растений среднего яруса в различных частях листовой пластинки

Средняя длина ЗКУ, мкм (x±Sx) Коэффициент вариации, %

Проис- Уровень Часть листовой пластинки

Вид, сорт хожде- плоид- HCPos

ние ности апикальная центральная базальная

Aubade 0 - 63,2±0,9 56,0±0,9 59,7±0,9 3,1 9,7

Marco Polo О - 71,4±1,2 71,8±0,8 72,0±1,0 2,9 7,6

Star Gazer О - 66,3±0,6 72,0±0,6 72,5±0,9 2,5 6,8

Shocking ОТ - 70,6±0,7 73,4±0,9 74,4±0,8 2,5 6,6

Orania ОТ - 75,8±1,0 76,1±1,0 78,1±1,0 3,0 7,3

Marakesh А - 78,8±0,8 80,1±0,8 95,5±0,6 4,5 10,1

L. lancifolium Вид - 81,8±1,1 82,5±1,3 84,3±1,1 3,3 7,6

Snow Storm А - 83,6±0,8 83,0±1,0 82,1±0,9 2,7 6,1

Royal Grace ЛА - 86,9±0,9 84,3±0,8 89,0±0,9 2,6 5,8

Royal Dream ЛА - 84,5±0,9 84,4±0,7 90,5±0,7 2,6 5,8

L. henryi Вид 2п 82,7±0,7 84,5±0,9 88,8±1,3 3,1 6,9

Ballade ЛА - 86,5±0,8 84,9±0,8 94,8±1,0 3,4 7,3

Spirit ЛА - 85,5±0,8 85,1±0,6 93,1± 0,6 2,8 6,1

Tetra291 А - 89,2±1,0 8б,2±1,0 89,3±1,0 3,1 6,6

Showroom ЛА - 87,2±0,9 87,9±0,9 90,8±0,6 2,5 5,3

Salmon Pride ЛА - 87,0±0,8 88,7±0,7 96,3±0,7 3,0 6,2

Royal Wonder ЛА - 91,0±1,0 90,9±о,8 95,8±0,8 2,7 5,6

Royal Justice ЛА - 91,9±1,0 91,6±0,5 100,5±0,9 3,2 6,4

Rosello А - 90,7±0,9 92,5±1,0 109,5±1,2 5,4 10,4

San Mateo ЛА - 91,7±0,8 93,3±1,2 101,8±1,0 3,8 7,5

Glossy Wings ЛА - 102,9±1,3 93,4±0,9 91,5±0,9 4,0 7,9

84-592 ЛА 2п 87,9±0,8 94,1±1,0 101,8±0,7 3,9 7,8

Светлица А 2п 87,4±1,2 94,2±2,0 97,2±1,3 4,9 10,0

Lagio А - 88,2±0,9 94,7±1,0 109,3±0,7 5,3 10,3

Royal Fantasy ЛА - 94,7±1,2 95,1±1,1 98,0±1,1 3,3 6,6

Royal Delight ЛА 2п 94,2±1,1 95,3±1,0 90,0±1,4 6,9 11,0

Samur ЛА 2п 98,6±1,0 96,6±1,3 101,2±1,1 3,5 6,6

Close Up ЛА - 95,0±0,9 98,4±0,8 102,6±0,8 2,9 5,6

Fangio ЛА - 98,2±1,3 99,1±0,9 101,8±0,8 3,1 5,8

Donau ЛА - 94,6±0,9 100,0±1,0 105,1±0,8 3,5 6,6

Glow ЛА - 92,7±1,1 100,8±1,0 103,8±0,8 3,7 7,1

La Spezia ЛА - 97,4±0,9 100,8±0,9 98,4±1,0 2,8 5,4

Algarve ЛА - 98,5±1,1 100,9±1,4 98,5±0,6 3,2 6,0

Top Gun ЛА - 101,3±1,0 102,2±1,2 99,7±1,3 3,4 6,3

Royal Sunset ЛА - 104,3±0,8 106,1±0,7 108,5±0,8 2,3 4,2

Nove Cento А 4п 113,0±1,1 111 ,7± 1,2 107,1±1,0 3,4 5,7

Foggia А 4п 116,7±1,4 121,0±1,3 108,5±0,8 4,3 7,1

* А - Asiatic hybrid, О - Oriental hybrid, J1A - Longiflorum/Asiatic hybrid, ОТ - Oriental/Trumpet hybrid, «-» - уровень плоидности не определялся.

а б в

Рис. 1. Замыкающие клетки устьиц (ЗКУ) у листьев растений сорта (4п) различных онтогенетических состояний (*280) а - ювенильные растения, длина ЗКУ = 152,4 ± 0,9 мкм; 6 - виргинильные растения, длина ЗКУ = 132,6 ± 1,5 мкм; в - генеративные растения, длина ЗКУ = 120,9 ± 1,0 мкм.

Таблица 2

Средняя длина замыкающих клеток устьиц (мкм) у листьев некоторых сортов лилий в различных онтогенетических состоянииях (в центральной части листовой пластинки среднего яруса)

Онтогенетическое состояние Сорт

Светлица (2п) Желтая Птица (2п) Royal Delight (2n) Foggia (4n)

X±Sx V, % X±Sx V, % X±Sx V, % X±Sx V, %

j 101,7±1,2 8,4 - - 138,6±1,3 9,3 152,4±0,9 3,4

V 90,8±1,4 8,3 70,7±0,7 5,6 109,6±1,6 8,6 132,6±1,5 6,1

gl 84,0±1,0 6,7 75,7±0,5 3,9 95,0±1,1 4,7 115,7±0,9 4,3

g2 94,2±2,0 11,7 77,6±0,8 5,5 95,3±1,2 5,4 120,9±1,0 4,4

HCPos HCPo, 6,3 8,5 2,5 3,4 6,6 8,8 8,1 10,9

Примечание: ) - ювенильное, V - виргинильное, gl - молодое генеративное, §2 - средневозрастное генеративное онтогенетическое состояние; V — коэффициент вариации.

ЗКУ брактей по сравнению с листьями различны по величине: у Азиатских гибридов 'Светлица', 'Foggia', 'Желтая Птица' они короче по сравнению с ЗКУ среднего яруса (брактей похожи на срединные листья побега, но значительно мельче) и крупнее у ЛА-гибрида 'Royal Delight' (брактей отличны по форме от срединных листьев - короче и имеют широко-округлую форму) (см. табл. 3). Коэффициент вариации длины ЗКУ был незначительным у исследованных образцов, за исключением листьев среднего и верхнего ярусов у сорта 'Светлица', где коэффициент вариации был в пределах средних показателей (10,1% и 11,7% соответственно).

Таблица 3

Средняя длина замыкающих клеток устьиц (мкм) у листьев лилий сортов 'Светлица', 'Желтая Птица', 'Royal Delight', 'Foggia' различного яруса взрослых растений (в центральной части листовой пластинки)

Ярус листьев Сорт

Светлица (2п) Желтая Птица (2п) Royal Delight (2n) Foggia (4n)

X±Sx V,% X±Sx V,% X±Sx V,% X±Sx V,%

Брактеи 85,7±1,0 6,5 66,8±0,9 7,3 102,0±1,0 5,3 100,6±0,8 4,2

Верхний 90,0±1,7 10,1 77,5±0,6 3,9 82,0±2,0 5,5 106,0±0,8 4,0

Средний 94,2±2,0 11,7 77,6±0,8 5,5 95,3±0,9 5,4 120,9± 1,0 4,4

Нижний 96,8±1,4 8,0 85,3±0,8 5,2 100,0±1,3 5,7 127,3±1,4 4,4

НСР05 HCPoi 5,0 6,7 4,1 5,5 3,3 4,5 6.3 8.4

V - коэффициент вариации.

Таким образом, длина ЗКУ листьев лилий может значительно варьировать в зависимости от генотипа, возраста растений, яруса листьев, места расположения устьиц на листовой пластинке. У большинства изученных сортов длина ЗКУ в базальных частях листовых пластинок достоверно превышала показатели в центральной и апикальной их частях. Выявлена тенденция к укрупнению ЗКУ от листьев верхнего яруса к нижнему.

Длина ЗКУ у листьев лилий отражает уровень плоидности растений. Метрические данные замыкающих клеток устьиц листьев лилий позволяют повысить эффективность работы по выявлению полиплоидов на начальных этапах исследований. Выявленные закономерности позволяют точнее прогнозировать уровень плоидности у растений лилий.

Определение числа хромосом на давленых препаратах

В данной работе были апробированы многие методики предобработки цитологического материала для подсчета числа хромосом на давленых препаратах, описанные в литературных источниках (Паушева, 1974; Трунин, 1976; Матвеева, 1980; Бороевич, 1984; Van Tuyl, 1990; Отрошко, 1993; Ishikawa, 1997; Dabkevi-ciene, 1999), однако следуя им не всегда удавалось получить качественные препараты для подсчета хромосом лилий. Поэтому была проведена серия опытов для оценки вариантов предфиксационной обработки, предложенных ранее и модифицированных с различным сочетанием условий предобаботки.

Испытывали следующие варианты предобработки:

- обработка пророщенных в обычных условиях корешков луковиц-деток лилий химическими мутагенами: а) растворами колхицина, различающимися концентрацией (0,01; 0,03; 0,05; 0,2%) и временем экспозиции (1, 3, 6, 24 часа); б) раствором 8-оксихинолина (0,002 М); в) раствором 8-оксихинолина совместно с раствором колхицина (0,05%);

- обработка холодом (0-2°С) в течение 1 и 2 суток;

- различные варианты сочетаний обработки мутагенами (растворами колхицина и 8-оксихинолина) и охлаждения.

Для выявления оптимальных способов предобработки корешков лилий проводили их оценку по разработанным нами 5-ти балльным шкалам с учетом наиболее важных показателей, к которым относятся: особенности расположения клеток, наличие повреждений; качество окрашивания препарата; количество митозов; степень укорочения хромосом; степень расхождения хромосом.

Ш 48,

г д

Рис. 2. Набор хромосом (2п = 24) в соматической клетке после предобработки (*400): а - без предфиксационной обработки; б - 0,03 % раствором колхицина (3 ч); в - 0,03 % раствором колхицина (3 ч), охлаждение (1 сут); г - 0,05 % раствором колхицина (3 ч), 0,002М раствором 8-оксихинолина (1 ч); д - 0,05 % раствором колхицина (3 ч), 0,002М раствором 8-оксихинолина (1 ч), охлаждение (1 сут).

Всего исследовано 35 вариантов предобработки корешков лилий для подсчета числа хромосом на давленых препаратах. Исходя из полученных данных, лучшими вариантами предобработки оказались: обработка корешков лилий 0,03% раствором колхицина в течение 3 часов (рис. 26) и 0,05% раствором колхицина в течение 3 часов; те же варианты с последующим охлаждением в течение 1 суток (рис. 2в); комбинированная предобработка 0,05% раствором колхицина (3 ч), 0,002 М раствором 8-оксихинолина (1 ч), (рис. 2г), либо с добавлением, к последнему этапу охлаждения в течение 1 суток (рис. 2д). В данных вариантах количество митозов было до 30% в области поля зрения, степень укорочения хромосом - до 60% от первоначальной величины, степень расхождения хромосом составила 4 балла, особенности расположения клеток -4-5 балла, окрашивание препарата - 3-4 балла по пятибалльным шкалам.

Глава 4. МИТОТИЧЕСКАЯ ПОЛИПЛОИДИЗАЦИЯ

Получение полиплоидов

Предпринята попытка создания полиплоидных лилий при воздействии колхицином. Для получения полиплоидных форм были отобраны луковицы сортов лилий различного происхождения, включая ЛА-гибриды ('Algarve', 'Royal Delight', 'Royal Drim', 'Royal Fantasy', 'Royal Justice', 'Royal Sunset', 'Showroom', 'Spirit', '84-592'), Азиатские гибриды ('Аэлита', 'Диадема', 'Желтая Птица', 'Корона', 'Лионелла', 'Наина', 'Новелла', 'Отрада', 'Форте', 'Эмблема', 'Connecticut King', 'Rosello'), Трубчатый гибрид, вид Lilium henryi. С луковиц снимали чешуи и помещали их во влажные теплые (при температуре около 25°С) условия до образования каллуса, с последующей обработкой 0,2% раствором колхицина в течение 6 часов. После колхицинирования на внутренней базальной части чешуй сформировались луковицы-детки, некоторые из которых были со специфическим строением, свойственным полиплоидам - их нижние чешуи в почке расположены не вдоль оси, а почти под прямым углом (в виде «розочки»).

Спустя 1,5 месяца после колхицинирования чешуи с образовавшимися луковицами-детками были высажены в открытый грунт.

Анализ полученного материала

На второй год после посадки у каждого полученного растения независимо от его биологического возраста были проведены учеты длины ЗКУ. Были выявлены растения, у которых величина ЗКУ была выше, чем у исходных более чем на 25%. Так, длина ЗКУ листьев колхицинированных растений превышала длину ЗКУ исходных форм: у сорта 'Желтая Птица' (6 растений) - на 30-48% (106,0 ± 1,1 мкм у полиплоидов, 77,6 ± 0,8 мкм у исходных форм), у сорта 'Аэлита' (2 растения) - на 37-38% (119,0 ± 1,0 мкм у полиплоидов, 86,7 ± 0,9 мкм у исходных форм), у сорта 'Connecticut King' (3 растения) - на 60-72% (127,5 ± 1,2 мкм у полиплоидов, 76,7 ± 0,5 мкм у исходных форм), у сорта 'Диадема'(4 растения) - на 31-49% (98,0 ± 0,7 мкм у полиплоидов, 65,7 ± 0,9 мкм у исходных форм), у сорта 'Отрада' (4 растения) - на 60-62% (108,5 ± 0,8 мкм у полиплоидов, 67,5 ± 0,5 мкм у исходных форм), у сорта 'Корона' (2 растения) - на 55-57% (129,0 ± 1,4 мкм у полиплоидов, 83,4 ± 0,6 мкм у исходных форм). При выявлении у растений ЗКУ, контрастно отличающихся величиной от исходной формы, проводили дополнительно подсчет хромосом в корешках.

По длине ЗКУ таких лилий можно было предположить, что все они являются полиплоидами. Для окончательного утверждения был проведен подсчет хромосом на давленых препаратах, который показал, что из 21 предполагаемого полиплоида истинными оказались 12 (рис. 3).

а2 б2 в2

Рис. 3. Набор хромосом в соматических клетках у некоторых экспериментально полученных тетраплоидных форм в сравнении

с исходными диплоидными сортами лилий: а; - Желтая Птица (4п = 48), б/- Аэлита (4п = 48), в/ - Connecticut King (4n = 48); а2 - Желтая Птица (2п = 24), б2- Аэлита (2п = 24), в2 - Connecticut King (2n = 24).

Таким образом, из 596 чешуй луковиц L. henryi и 22 сортов лилий, подвергшихся митотической полиплоидизации, на второй год после обработки отросло 386 растений в условиях открытого грунта, из которых 12 растений 6 сортов оказались полиплоидными (3,5% от общего числа образовавшихся растений), что подтверждено данными цитологического анализа с предварительным измерением длины ЗКУ у срезанных листьев растений.

Полиплоидные растения отличались длиной ЗКУ, которая превышала длину ЗКУ исходных сортов на 37-72%. Сорт 'Connecticut King' подвергся полиплоидизации на 66% от общего числа полученных растений этого сорта, 'Диадема' - на 17%, 'Отрада' - на 10%, 'Желтая Птица' - на 6%, Корона' - на 5%, 'Аэлита' - на 4%. Остальные сорта, участвующие в колхицинировании чешуй, при данных условиях оказались устойчивы к полиплоидизации.

В целом в результате колхицинирования чешуй выход полиплоидных растений оказался около 3,5 % от общего числа сформировавшихся растений по данным цитологического анализа.

Глава 5. МЕЙОТИЧЕСКАЯ ПОЛИПЛОИДИЗАЦИЯ

Искусственная гибридизация: варианты скрещиваний и семенная продуктивность

Для получения мейотических полиплоидов проводились искусственные скрещивания диплоидов различного происхождения с полиплоидами зарубежной селекции, а также полиплоидов между собой. Для скрещиваний с тетрап-лоидами ('Foggia', 'Nove Cento', 'Tetra') были выбраны разнообразные по внешнему виду и происхождению, цветущие в близкие сроки диплоидные сорта. В 2005, 2006 гг. проведено более 80 комбинаций скрещиваний.

При использовании в скрещиваниях тетраплоидного сорта 'Foggia' в качестве отцовского растения с диплоидными сортами в 3 из 45 комбинациях скрещиваний продуктивность семян оказалась наибольшей (37-77 семян в 1 плоде) - с использованием в качестве материнских форм сортов 'Калинка', 'Галактика' и 'Огненная Земля'. Средняя продуктивность (13-20 семян в 1 плоде) отмечена в комбинациях, где материнскими формами были сорта 'Венера', 'Оксана' и 'Пелеринка'. В 19 комбинациях скрещиваний в 1 плоде формировалось менее 10 семян, в 20 комбинациях семена не образовались. Жизнеспособные семена завязались в 56% скрещиваний.

При использовании в качестве отцовского растения тетраплоида 'Nove Cento' наиболее продуктивными оказались 3 комбинации скрещиваний (21-30 семян в 1 плоде) из 25, где материнскими формами были сорта 'Красная Поздняя', 'Огненная Земля' и 'Лоретто'. В скрещиваниях с другими сортами продуктивность жизнеспособных семян в 1 плоде была менее 10 шт. Жизнеспособные семена завязались в 60% скрещиваний.

В 4 комбинациях скрещиваний из 8, где в качестве отцовского растения был тетраплоидный сорт 'Tetra', в качестве материнских форм - сорта 'Пелеринка', 'Ротонда', 'Мичуринская Ода', 'Royal Fantasy' образовалось по 2-7 семян в 1 плоде. Остальные варианты скрещиваний оказались не продуктивными. Жизнеспособные семена завязались в 50% скрещиваний.

При скрещивании сортов-тетраплоидов между собой выход жизнеспособных семян составил 16-42 шт. в 1 плоде. Жизнеспособные семена завязались во всех комбинациях скрещиваний.

При свободном опылении у растений, использовавшихся в качестве материнских форм, образовывалось больше семян, чем при скрещивании их с тетраплоидами (рис. 4), за исключением нескольких вариантов скрещиваний: 'Калинка'(2п) х 'Foggia'(4n), 'Пелеринка'(2n) х 'Foggia'(4n), 'Красная Позд-няя'(2п) х 'Nove Cento'(4n), Тлафира'(2п) х 'Nove Cento'(4n), 'Пелеринка' (2п) х 'Tetra'(4n), в которых среднее число жизнеспособных семян в 1 плоде оказалось больше, чем при свободном опылении. Семенная продуктивность при свободном опылении невысока, что можно объяснить небольшим числом насекомых-опылителей (чешуекрылых) во время цветения Азиатских гибридов - в конце июня - первой половине июля. Таким образом, при скрещивании полиплоидов между собой выход жизнеспособных семян оказался значительно выше, чем в большинстве вариантов скрещиваний диплоидов с тетраплоидами.

Сорт

Число жизнеспособных семян в 1 плоде при естественном опылении

Число жизнеспособных семян в 1 плоде при искусственной гибридизации с использованием тетраплоидов в качестве отцовских форм

Рис. 4. Семенная продуктивность лилий при различных способах опыления

Культивирование гибридных сеянцев

Ввиду того, что семенная продуктивность в комбинациях скрещиваний с тетраплоидами невысока, для увеличения выхода жизнеспособных сеянцев семена проращивали в условиях in vitro.

Стерилизация семян. Для проращивания семян лилий в культуре in vitro необходимо соблюдение стерильных условий. Для оценки влияния дезинфицирующего раствора на всхожесть семян использовали гибридные семена сорта 'Сиреневая Кудрявая' (2п) от свободного опыления. Для подбора оптимальных условий дезинфекции и прорастания семян выбрали несколько вариантов: контроль (без обработки); обработка 0,5% раствором КМп04 в течение 20 минут (Байбурина, 2004); обработка 1% раствором КМп04 в течение 20 минут; обработка 2% раствором КМп04 в течение 20 минут; обработка 3% раствором Н202 (температура 38-40°С) (Обработка ..., 2005) в течение 7-8 минут; обработка стерильной водой температурой 52°С в течение 20 минут (Merel, 1998; Шафранский, 2005); обработка 70 % спиртом (Байбурина, 2006; Калашникова, 2006) в течение 2-3 минут; обработка раствором гипохлорита натрия (Ветчинкина и др., 2005; Калашникова и др, 2006) (использовали отбеливатель Белизна в разведении с водой 1:1) в течение 10 минут до начала обесцвечивания краев покровов семян.

Наиболее оптимальными из изученных способов дезинфекции семян лилий, не снижающих их всхожесть, оказались обработки: раствором гипохлори-

О

та натрия в течение 10 минут, 70% раствором спирта в течение 2-3 минут, 0,5% раствором КМ11О4 в течение 20 минут с последующей промывкой в стерильной воде, которые взяты из литературных источников. Наряду с известными способами выявлены новые варианты дезинфекции семян лилий, не снижающие их всхожесть: 3% раствором Н202 температурой 38-40°С в течение 7-8 минут; 2% раствором КМп04 в течение 20 минут; 1% раствором КМПО4 в течение 20 минут с последующей промывкой в стерильной воде. Наименее эффективный способ дезинфекции семян лилий - обработка стерильной водой температурой 52°С в течение 20 минут.

Оценка питательной среды для культивирования сеянцев. Изучено влияние питательной среды на прорастание семян и дальнейший рост сеянцев. Для введения в культуру in vitro использовали нормально развитые семена, отобранные при визуальном осмотре, от скрещиваний: 'Tetra' х 'Foggia'; 'Nove Cento' х 'Foggia', 'Tetra' x 'Nove Cento' (комбинации с тетраплоидами), 'Калинка' х 'Foggia', 'Красная Поздняя' х 'Nove Cento' (комбинации диплои-дов с тетраплоидами).

Для выявления оптимальной питательной среды, благоприятной для прорастания семян и развития сеянцев лилий при минимальном числе пассажей использовали питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга (Mura-shige, 1962) с добавлением витаминов и гормонов. Исследовали следующие варианты питательных сред: 1) Мурасиге-Скуга (MS); 2) MS + экстракт ростков пшеницы (10-15% от общей массы питательной среды); 3) MS + кокосовое молочко (10-15% от общей массы питательной среды); 4) MS + 6-БАП (5 мг/л) + ИУК (1,5 мг/л) + витамины группы В (1,5 мг/л); 5) MS + аскорбиновая кислота (20 мг/л); 6) MS + аскорбиновая кислота (10 мг/л); 7) MS + витамины группы В (1,5 мг/л); 8) MS + аскорбиновая кислота (1,5 мг/л). Часть семян в пробирках проращивали при естественном освещении, другую часть - в темноте. Наблюдение и учет за сеянцами in vitro проводили от начала прорастания семян. Первые проростки были отмечены на 9-й день.

Для развития сеянцев из семян в культуре in vitro наилучшими средами из исследованных вариантов оказались: питательная среда MS с добавлением аскорбиновой кислоты; питательная среда MS с добавлением витаминов группы В (по темпам развития сеянцев эта среда немного уступала средам с добавлением аскорбиновой кислоты); питательная среда MS без дополнительных компонентов при естественном освещении.

Питательная среда с добавлением кокосового молочка, содержащего витамины группы В, витамин С, фитогормоны и другие питательные вещества, оказалась наихудшей, так как семена на ней не проросли.

Питательная среда с добавлением гормонов (6-БАП, ИУК) показала хорошие результаты: семена прорастали, происходило развитие луковиц и розе-точных побегов лилий, но корневая система развивалась слабо, что обусловлено составом гормонов в питательной среде, и в дальнейшем сеянцы необходимо пересаживать на другую среду для нормального ризогенеза и укоренения. Прорастание семян лилий в темноте происходило хуже, чем при естественном освещении. Внешне проростки, которые развивались в темноте, были более

вытянутыми, имели обесцвеченные ткани, луковицы более мелкие по сравнению с проростками, развивающимися при естественном освещении. Возможно, развитие в темноте специфично для отдельных групп лилий.

Часть семян от скрещиваний сортов 'Tetra' и 'Nove Cento' проращивали на питательных средах трех вариантов: MS, MS с добавлением фитогормонов (6-БАП +ИУК) и MS повторной (питательной среде, вторично используемой после проросших на ней семян) (рис. 5).

В результате данного эксперимента оказалось целесообразным вторичное (повторное) использование питательной среды для проращивания семян и развития растений на начальных этапах. Растения на повторной среде развивались полноценными: формировались луковички величиной 2-7 мм в диаметре, листья — до 5 шт., корневая система.

В одном из вариантов до пересадки растений в перлит-вермикулитовый субстрат делали 2 пассажа: сначала проращивали семена на питательной среде MS, потом пересаживали растения на среду MS с фитогормонами и очередной пассаж проводили на среду для укоренения с добавлением активированного угля (50 мг/л). Этот вариант оказался наихудшим, так как после пересадки растений на среду с активированным углем происходила массовая гибель материала из-за активизации выделений у растений. Таким образом, питательная среда с добавлением активированного угля, рекомендованная в некоторых источниках (Румынии, 1989; Чурикова, 1994), оказалась не подходящей для укоренения гибридных полиплоидных сеянцев лилий, полученных нами.

MS-Г

Рис. 5. Сеянцы лилий через 4 месяца после посева семян на питательную среду:

МБ "п" - безгормональная («повторная» среда), МБ - безгормональная питательная среда МБ, МЭ-Г - питательная среда МБ с гормонами.

Таким образом, для проращивания гибридных семян и начального роста и развития растений лилий в культуре in vitro наиболее оптимальным является использование питательной среды MS. После достижения луковицами величи-

ны более 5 мм в диаметре их пересаживали на субстрат, где происходит адаптация растений к естественным условиям. Растения поливали питательным раствором Кнопа. Спустя 2 месяца их пересаживали в почву.

Анализ гибридных сеянцев. Анализ гибридного потомства производили у ювенильных растений. Вначале косвенным методом определяли длину ЗКУ, затем проводили подсчет хромосом на давленых препаратах. В результате анализа комбинаций скрещиваний тетраплоидов между собой полученные гибриды оказались тетраплоидами (4п = 48), диплоидов с тетраплоидами - триплои-дами (Зп = 36) (рис. 6).

Рис. 6. Набор хромосом в соматических клетках у полученных полиплоидных

форм лилий при искусственной гибридизации: а- сеянец 'Tetra'(4n) х 'Foggia'(4n), п = 48; б-сеянец 'Калинка'(2п) х 'Foggia' (4n), п =36.

Использование метода мейотической полиплоидизации с проращиванием семян в культуре in vitro на среде MS позволило получить новые полиплоидные лилии от родительских форм: 'Tetra'(4n) х 'Foggia'(4n); 'Nove Cento'(4n) х 'Fog-gia'(4n), lTetra'(4n) x 'Nove Cento'(4n), 'Калинка'(2п) x 'Foggia'(4n), 'Красная Поздняя'(2п) x 'Nove Cento'(4n).

Судя по окраске цветков некоторых сортов лилий, в них накапливаются каротиноиды или антоцианы. Биосинтез этих соединений представляет большой интерес не только в плане получения наиболее декоративных растений, но и при рассмотрении этих растений в качестве потенциальных источников для получения колорантов в пищевой и медицинской промышленности. Тем не менее, у большинства исследованных в настоящей работе сортов сведений по типу и уровню накопления антоцианов или каротиноидов в литературе не обнаружено.

В настоящей работе для определения антоцианов были выбраны сорта лилий, имеющих окраску околоцветника от темно-розовой до темно-бордовой: 'Сиреневый Туман', 'Калинка', 'Люстра', 'Сибирячка', 'Вишенка', 'Восточная Сказка', 'Забава', 'Наина', 'Sammer Night'. С использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии было установлено, что у всех этих сортов

Глава 6. ПИГМЕНТЫ ОКОЛОЦВЕТНИКОВ ЛИЛИЙ

основным компонентом был цианидин-3-рутинозид. Суммарное накопление антоцианов определяли спектрофотометрическим методом в 0.1 М растворе соляной кислоты с пересчетом на цианидин-3-глюкозид (СНивй, 2001). Полученные результаты представлены на рис. 7.

й о

и

ч о О

б

Название сорта

Рис. 7. Концентрация антоцианов в околоцветниках некоторых сортов лилий — в пересчете на цианидин-3-глюкозид

По полученным данным у изученных сортов лилий наиболее высокий уровень накопления концентрации антоцианов в листочках околоцветников имели сорта с бордовой и темно-бордовой окраской - 'Summer Night', 'Забава' (рис. 7). По содержанию антоцианов сорта лилий с бордовыми цветками сопоставимы с плодами таких ягодных культур, как смородина черная (Ribes nigrum L. -150-300 мг/100 г) (Дейнека и др., 2003) и магония падуболистная (Mahonia aquifo-lium (Pursh) Nutt. - 160-400 мг/100 г) (Сорокопудов и др.). При этом антоцианы у Азиатских гибридов лилий однотипны, то есть наследуются только гены, отвечающие за биосинтез одних и тех же ферментов, в конечном итоге способствующие биосинтезу цианидин-3-рутинозида, и околоцветники имеют окраску от светло-розовой до темно-бордовой в зависимости от степени их активности.

Для исследования каротиноидного состава были отобраны лилии с окраской околоцветника от бордовой до желтой (табл. 4). Оказалось, что бордовая окраска цветков сорта 'Забава' является следствием одновременного накопления каротиноидов и антоцианов. Наибольший уровень накопления каротиноидов был найден у видов L. pumilum и L. buschianum с красно-оранжевой и красной окрасками околоцветников. Комбинацией методов высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектрофотометрии было установлено, что все исследованные околоцветники имели сходный состав и в качестве основных компонентов содержали эфиры капсантина и капсорубина, причем вид L. pumilum по селективности биосинтеза эфиров капсорубина не имеет равных среди всех известных растений - источников каротиноидов.

Таблица 4

Концентрация каротиноидов в околоцветниках различных видов и сортов лилий

Вид, сорт Окраска околоцветника Содержание каротиноидов, мг/г*

Lilium pumilum красно-оранжевая 6,240±0,011

Lilium buschianum красная 1,280±0,005

Вилтигринум оранжевая 0,358±0,005

Сибирячка красная 0,311 ±0,003

Сакала оранжево-красная 0,271 ±0,004

Волхова желтая 0,232±0,003

Foggia оранжевая 0,217±0,002

Люстра красная 0,212±0,003

Lilium lancifolium оранжевая 0,210±0,004

Красная Поздняя красная 0,193±0,003

Мария красная 0,172±0,002

Забава бордовая 0,163±0,002

Желтая Цапля желтая 0,113±0,004

Апельсинка оранжевая 0,088±0,002

Венера желтая 0,085±0,003

Желтая Птица желтая 0,078±0,002

Трубчатый гибрид 1 желтая 0,074±0,002

Огненная Земля розово-оранжевая 0,070±0,001

La Specia желтая 0,039±0,001

Frans Hals желтая 0,032±0,001

Трубчатый гибрид 2 желтая 0,029±0,001

НСРо5 0,051

* - в пересчете на капсантин.

В целом по накоплению ксантофиллов исследованные цветки лилий уступали бархатцам (Дейнека и др., 2007); появление антоцианов приводило к некоторому снижению уровня их накопления.

Лилии желтой окраски накапливают меньше ксантофиллов по сравнению с лилиями оранжевой окраски, что согласуется с литературными данными (ВапЬа, 1968.). При этом в листочках околоцветников лилий желтой окраски (у Трубчатых гибридов) найден более сложный состав моноэфирной фракции при небольшой степени этерификации, гипсохромное смещение максимума абсорбции каротиноидов свидетельствует о прекращении цепи биосинтеза на более ранних стадиях. Появление вместо диэфиров большой доли моноэфиров сопровождается снижением уровня накопления каротиноидов, и такие сорта лилий не могут иметь технологического значения (как источники природных колорантов). Из оранжевых и красноцветковых сортов исследованных лилий наивысшее содержание ксантофиллов обнаружено в цветках Ь. РитИит (6,24 мг/г в свежих листочках околоцветника) и Ь. ЪтсЫапит (1,28 мг/г в свежих листочках околоцветника и около 25,86 мг/г - в высушенных). Это достаточно высокое содержание ксантофиллов, что обуславливает перспективность этих видов, легко размножающихся семенами, как потенциальных источников сырья для производства пигмента ксантофилла.

Таким образом, у оранжево-красно-бордовоцветковых видов и сортов лилий окраска околоцветников обусловлена биосинтезом эфиров ксантофиллов (капсантина и капсорубина) и антоцианов (цианидин-3-рутинозида) с высоким уровнем их накопления.

ВЫВОДЫ

1. При мейотической полиплоидизации лилий наиболее продуктивными оказались комбинации скрещиваний полиплоидов между собой с участием в качестве исходных форм сортов-тетраплоидов 'Foggia' и 'Nove Cento'; при использовании тетраплоидов в качестве отцовских форм. Уровень плоидности полученных тетраплоидов и триплоидов подтвержден данными по длине замыкающих клеток устьиц и подсчетом числа хромосом.

2. Обработка чешуй луковиц лилий 0,2% раствором колхицина в течение 6 часов, позволила получить полиплоидные формы лилий сортов 'Аэлита', 'Отрада', 'Желтая Птица', 'Диадема', 'Корона', 'Connecticut King'. Удвоенный набор хромосом у полиплоидных растений подтвержден данными цитологического анализа; длина замыкающих клеток устьиц в их листьях была выше, чем у исходных растений, на 37-72%.

3. На этапе введения семян лилий в культуру in vitro для их стерилизации наряду с известными способами выявлены варианты обработки, не снижающие всхожесть семян: 3% раствор Н202 температурой 38-40°С в течение 7-8 минут; 2% раствор КМ11О4 в течение 20 минут; 1% раствор КМп04 в течение 20 минут. Выявлена целесообразность повторного использования питательной среды Мурасиге-Скуга.

4. Длина замыкающих клеток устьиц листьев (ЗКУ) лилий может значительно варьировать в зависимости от генотипа, возраста растений, яруса листьев, места расположения устьиц на листовой пластинке. Для предварительной диагностики уровня плоидности растений после искусственной полиплоидизации следует учитывать индивидуальные особенности изменчивости длины ЗКУ у видов и сортов лилий, особенно у молодых растений.

5. Выявлена тенденция к увеличению длины ЗКУ от апикальной части листовой пластинки к базальной (у 92% исследованных сортов и видов лилий, г = 0,82) и укрупнению ЗКУ ог листьев верхнего яруса к нижнему у некоторых сортов. У 4-х изученных сортов длина ЗКУ листьев в ювенильном онтогенетическом состоянии была больше, чем во взрослом генеративном на 14,6-45,4%.

6. Установлено, что комбинированная предфиксационная обработка растений лилий растворами мутагенов и охлаждением позволяет получить наиболее качественные цитологические препараты: 1) 0,03%-0,05% раствором колхицина в течение 3 ч с последующим охлаждением в течение суток или без этапа охлаждения; 2) последовательная обработка 0,05% раствором колхицина в течение 3 ч и 0,002 М раствором 8-оксихинолина в течение 1 ч.

7. Из изученных оранжевых и красноцветковых сортов лилий наивысшее содержание ксантофиллов обнаружено в околоцветниках Lilium pumilum (6,24 мг/г в свежих листочках околоцветника) и L. buschianum (1,28 мг/г в свежих

листочках и около 25,86 мг/г — в высушенных). Красные тона окрасок связаны с присутствием в околоцветниках антоцианов, главным образом цианидин-3-рутинозида, содержание которых у сортов с бордовыми цветками сопоставимо с таким источниками антоцианов, как плоды Ribes nigrum, Mahonia aquifolium.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В цитологическом анализе для оценки способов предфиксационной обработки растительного материала видов и сортов с крупными и многочисленными хромосомами предложены балльные шкалы по признакам: расположению клеток относительно друг друга, наличию повреждений, окрашиванию хромосом, степени их укорочения и расхождения.

2. Виды Liliumpumilum и L. buschianum, сорта 'Summer Night' и 'Забава', содержащие в околоцветниках максимальное количество пигментов (капсан-тина и капсорубина, цианидин-3-рутинозида), рекомендуются для культивирования в промышленных целях для получения естественных красителей и в селекции в качестве источников высокой концентрации этих пигментов.

3. Семена лилий, полученные в ценных, но низкопродуктивных комбинациях скрещиваний, целесообразно проращивать на безгормональной питательной среде Мурасиге-Скуга in vitro.

4. Для получения полиплоидов рекомендуется использовать метод гибридизации с использованием сортов-полиплоидов 'Foggia' и 'Nove Cento', продуктивность которого оказалась выше, чем при обработке базальных частей чешуй раствором колхицина - выход полиплоидных растений составил 3,5 %.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

*- публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК

1. Лабунская, Н. А. Морфологическая изменчивость замыкающих клеток устьиц у лилий / Н. А. Лабунская // Материалы I (IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге (21-26 мая 2006). - СПб.: Издательство ТЭТУ. - 2006. - С. 164.

2. Лабунская, Н. А. Селекция полиплоидных Lilium / Н. А. Лабунская, О. А. Сороко-пудова//Биологический вестник. - 2006. - Т. 10, № 1.-С. 18-20.

3. Лабунская, Н. А. Полиплоидия лилий / Н. А. Лабунская // Материалы Международной молодежной научно-практической конференции, 14 апреля 2006 г. - Белгород: ИПЦ «ПОЛИТЕРРА». - 2006.-С. 144-146.

4. Лабунская, Н. А. Дезинфекция семян лилий для выращивания гибридных растений в культуре in vitro / Н. А. Лабунская, К. С. Анисимова // Селекция и семеноводство полевых культур: Юбилейный сборник научных трудов. - Воронеж: ФГОУ ВПО ВГАУ. -2007 г. - С. 78-79.

5. Сорокопудова, О. А. Перспективы интродукции и селекции Lilium в БелГУ / О. А. Сорокопудова, Н. А. Лабунская, И.С. Шахова // Науч. ведомости БелГУ. Серия «Ес-теств. науки". - 2007. - Вып. 5, № 5 (36). - С. 21-24.

6. Лабунская, Н. А. Колхицинирование - один из способов полиплоидизации лилий / Н. А. Лабунская, О. А. Сорокопудова // Успехи современного естествознания. - 2007. -№ 12.-С. 137-138.

7. Лабунская, H. А. Искусственная полиплондизация лилий / Н. А. Лабунская // Материалы III Международной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Актуальные и новые направления сельскохозяйственной науки». - Владикавказ. - 2007. - С. 96-97.

8. *Лабунская, Н. А. Вариабельность длины замыкающих клеток устьиц у Lilium / H. А. Лабунская, О. А. Сорокопудова // Цитология. - 2008. - Т. 50, № 6. - С. 549-552.

9. Лабунская, Н. А. Селекция полиплоидных лилий / Н. А. Лабунская // Биоразнообразие - от идеи до реализации: Тезисы межрегиональной конференции. - Тамбов. - 2007. -С. 213-216.

10. Лабунская, Н. А. Полиплоидизация - одно из перспективных направлений в селекции лилий / Н. А. Лабунская // Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии: Материалы II Международной научно-практической конференции. - Белгород. - 2007. - С. 192-195.

11. Лабунская, Н. А. Использование метода культуры in vitro для проращивания гибридных семян лилий / Н. А. Лабунская // Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира: Материалы II Всероссийской научно-практической конференции 19-21 августа 2008 г. - Белгород. - 2008. - С. 16-18.

12. Лабунская, Н. А. Пигменты цветков 30 сортов 3 видов Lilium / H. А. Лабунская, О. А. Сорокопудова, В. И. Дейнека // Химия и технология растительных веществ: Тезисы докладов V Всероссийской научной конференции. - Сыктывкар-Уфа. - 2008. - С. 185.

13. *Дейнека, В. И. Каротиноиды и антоцианы листков околоцветников некоторых видов лилий (Lilium L.) / В. И. Дейнека, Н. А. Лабунская, О. А. Сорокопудова // Сорбцион-ные и хроматографические процессы. - 2008. - Том 8, Выпуск 5. - С. 819-825.

14. *Лабунская, H.A. Митотическая полиплоидизация азиатских гибридов лилий / H.A. Лабунская, O.A. Сорокопудова // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия «Естественные науки». - 2011. -№9 (104). Выпуск 15/2. - С. 50-53.

Подписано в печать 06.04.2012. Гарнитура Times New Roman. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 92. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИПК НИУ «БелГУ» 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лабунская, Наталия Александровна, Белгород

61 12-3/1160

Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

На правах рукописи

ЛАБУНСКАЯ Наталия Александровна

некоторые аспекты репродуктивной биологии видов и сортов ыыимъ.: полиплоидия, семенное размножение, пигменты околоцветников

03.02.01 - Ботаника

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор О.А. Сорокопудова

Белгород - 2012

содержание

введение...........................................................................................................3

глава 1. проблемы увеличения биоразнообразия и размножения у lilium (обзор литературы)............................8

1.1. Роль полилоидии в формировании ассортимента декоративных растений..............................................................................................................8

1.2. Методы идентификации полиплоидов................................................16

1.3. Достижения экспериментальной полиплоидии у лилий.................28

1.4. Культура лилий in vitro..........................................................................31

1.5. Пигменты цветков лилий.......................................................................38

глава 2. объекты, условия и методы исследований ....40

2.1. Объекты исследований...........................................................................40

2.2. Условия исследований...........................................................................43

2.3. Методы исследований............................................................................47

глава 3. идентификация полиплоидов...................................52

3.1. Изучение признака длины замыкающих клеток устьиц..................52

3.2. Определение числа хромосом на давленых препаратах.................69

глава 4. митотическая полиплоидизация...........................83

4.1. Получение полиплоидов........................................................................83

4.2. Оценка полученного материала...........................................................86

глава 5. мейотическая полиплоидизация...........................93

5.1. Искусственная гибридизация: варианты скрещиваний и семенная продуктивность...............................................................................................93

5.2. Культивирование гибридных сеянцев...............................................101

5.2.1. Стерилизация семян.........................................................................103

5.2.2. Оценка питательной среды для культивирования сеянцев.............107

5.2.3. Плоидностъ гибридных сеянцев.......................................................118

глава 6. пигменты околоцветников лилий.......................120

список литературы..............................................................................133

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Лилии на протяжении многих веков почитались народами мира за нарядные, изящные и ароматные цветки. Лилии использовались как пищевые, лечебные и декоративные растения, украшавшие дворцы и храмы. О лилиях слагались легенды и песни, изображения лилий часто встречались в разнообразных произведениях искусства. Издавна известны целебные свойства лилий. Древнегреческий врач Диоскорид в своём знаменитом медицинском трактате "О лекарственных средствах" отметил, что лилии лесная и белая способствуют заживлению ран, ожогов, синяков и ссадин, успокаивают зубную боль, исцеляют сердечные болезни (Недялков, 2009). Использование лилий в цветоводстве растет с каждым годом. Самую большую популярность получили лилии на приусадебных и дачных участках. Разнообразие лилий по окраске, форме цветка, высоте растений, срокам цветения позволяет их использовать в самых различных сочетаниях между собой и другими многолетниками. Лилии пригодны для контейнерной культуры, что дает возможность размещать цветущие растения в самых неудобных местах - на асфальте, каменистых участках, балконах, внутренних двориках (Киреева, 1992). Лилии используются в медицине и косметике. Препараты из белой лилии используются как кровоостанавливающее, раноза-живляющее и болеутоляющее средство. Они тонизируют нервную систему, обладают отхаркивающим действием (Лойко, 2010).

В настоящее время известно около 100 видов лилий, в нашей стране и за рубежом создано свыше 10 тысяч сортов лилий, и каждый год этот список пополняется (The International ..., 2007).

Вопросами полиплоидизации лилий в мире занимаются исследователи более полувека. Весомый вклад в развитие отечественного лилиеводства внесли ученые ботаники и селекционеры - М.В.Баранова, Н.Г. Коршикова, Е.И. Шиповская, М.Ф. Киреева, а также цветоводы-любители, такие как -

A.B. Отрошко, B.M. Чучин (Баранова, 1977, 1990, 1999, 2000; Коршикова, 1980, 1981, 1988; Шиповская, 1972; Киреева, 1981, 1984, 1988, 1992, 2000, 2001; Отрошко, 1992, 1993; Чучин, 1999).

Известно, что растения рода Lilium L. не склонны к самопроизвольному умножению числа хромосом ни в природе, ни в культуре. Сорта-полиплоиды единичны в мировом сортименте этого рода, поэтому искусственная полиплоидизация имеет важное значение.

Многие виды и сорта лилий обладают крупными генеративными побегами и цветками, поэтому при получении полипоидов чаще хотят получить растения не столько с эффектом гигантизма, сколько с другими ценными признаками, такими как более плотные (толстые) листочки околоцветника и листьев, прочные, крепкие стебли, обуславливающие пряморослость цветоносного побега и более долгую сохранность в срезке, устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды, в том числе к вирусным болезням, более высокая продуктивность. Тетраплоиды необходимы для получения триплоидов, а также очень перспективны в селекции при отдаленной гибридизации. Многие триплоиды, полученные в результате отдаленных скрещиваний и считавшиеся ранее неперспективными для селекции вследствие стерильности, оказались способными завязывать семена при опылении тетраплоидами (Schenk, 1987). В России работы по полиплоидизации лилий очень малочисленны, несмотря на их актуальность (Матвеева, 1980).

Так как многие виды и сорта лилий не имеют аромата, окраска их околоцветников играет большую роль в процессе опыления для привлечения насекомых, влияя на семенную продуктивность растений. Кроме того, пигменты околоцветников (антоцианы и каротиноиды) представляют значительный интерес для пищевой промышленности как потенциальное сырье для производства естественных красителей. Однако в настоящее время пигментный состав околоцветников изучен слабо. Известно, что околоцветники растений-полиплоидов имеют более интенсивную окраску (Матвеева, 1980). Поэтому актуален поиск перспективных видов и сортов лилий - источников

ценных пигментов в околоцветниках - для их полиплоидизации и использования в селекции.

Цель и задачи исследований. Цель работы - создание полиплоидов лилий и совершенствование методов их идентификации, выявление пигментного состава околоцветников у некоторых видов и сортов для пополнения ассортимента травянистых поликарпиков новыми хозяйственно-ценными формами.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- получить полиплоиды методами митотической и мейотической полиплоидизации с последующей их идентификацией;

- выявить информационно значимые метрические характеристики усть-ичного аппарата для косвенного метода оценки уровня плоидности у лилий;

- усовершенствовать методику подсчета хромосом на давленых препаратах из корешков лилий для определения уровня плоидности;

- оптимизировать методику проращивания ценных семян лилий in vitro;

- исследовать пигментный состав листочков околоцветника лилий.

Научная новизна. Получены полиплоидные формы и гибриды лилий

путем митотической и мейотической полиплоидизации. Впервые изучена вариабельность длины замыкающих клеток устьиц для прогноза и оценки уровня плоидности у лилий. Предложены новые методические подходы для оценки эффективности различных способов предфиксационной обработки растительного материала при приготовлении давленых препаратов для подсчета числа хромосом. Выявлены наиболее простые и эффективные способы предобработки корешков лилий для подсчета числа хромосом на давленых препаратах и усовершенствованы некоторые из них. Для повышения выхода ценных сеянцев оптимизирован способ проращивания гибридных семян на безгормональной питательной среде in vitro. Получены новые данные по

пигментному составу листочков околоцветника и выявлены наиболее ценные виды и сорта лилий по данному признаку.

Практическая значимость. Усовершенствованы методики получения и идентификации полиплоидов лилий на различных этапах. Выявлены ценные виды и сорта, являющиеся источниками капсантина и цианидин-3-рутинозида, перспективные для использования в качестве пищевых красителей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мейотическая полиплоидизация с использованием сортов-тетраплоидов 'Foggia' и 'Nove Cento' с последующим проращиванием семян in vitro позволяют обогатить генофонд лилий ценными полиплоидными формами.

2. Метрические данные замыкающих клеток устьиц листьев лилий с учетом их вариабельности позволяют повысить эффективность работы по выявлению полиплоидов на начальных этапах исследований.

3. Для подсчета числа хромосом у гибридов и форм лилий оптимальна комбинированная предфиксационная обработка цитологического материала, сочетающая обработку растворами мутагенов и охлаждение.

4. Некоторые виды и сорта лилий с красными (L. buschianum и L. pumi-lum) и бордовыми ('Summer Night', 'Забава') околоцветниками являются ценным сырьем для получения каротиноидов (капсантина и капсорубина) и антоцианов (цианидин-3 -рутинозида).

Апробация результатов работы. Результаты исследований докладывались и публиковались на конференциях молодых ученых (Санкт-Петербург, 2006; Белгород, 2006; Владикавказ, 2007), межрегиональной конференции «Биоразнообразие - от идеи до реализации» (Тамбов, 2007), всероссийских научно-практических конференциях «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Белгород, 2008), «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар-Уфа, 2008), международных научных конеренциях «Цветоводство без границ»

(Харьков, 2006), «Биологические науки. Секция молодых ученых, студентов и специалистов» при РАЕ (Москва, 2007), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии» (Белгород, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, 3 из которых в изданиях, рекомендуемых Перечнем ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 155 страницах текста, состоит из введения, 6 глав, выводов, практических рекомендаций, содержит 26 таблиц, 31 рисунок. Список используемой литературы включает 218 источников, в том числе 64 - иностранных.

глава 1. проблемы увеличения биоразнообразия и размножения у ыьшм (обзор литературы)

1.1. Роль полилоидии в формировании ассортимента декоративных

растений

В естественных условиях и в культуре полиплоидные формы могут возникать под влиянием различных факторов (физических, механических, химических и др.), способных воздействовать на процесс образования половых клеток (мейоз) и на механизм клеточного деления в соматических тканях (митоз). Под влиянием этих факторов происходит образование нередуцированных гамет в процессе мейоза или нарушается расхождение хромосом к полюсам делящейся клетки в процессе митоза. Такими факторами могут быть резкие смены температуры, крайние высокие или крайние низкие температуры, ионизирующие излучения, изменение светового режима, различные механические повреждения тканей растения, действие гербицидов и фунгицидов и других химических воздействий, бактериальные и грибковые инфекции, укусы насекомых, изменение содержания в почве минеральных веществ, нарушение нормального водоснабжения и т. д. (Наза-ренко, 1975; Матвеева, 1980; Современные, 1991; Седышева, 1994; Санкин 1997; Яшин и др., 2000).

Возникновение спонтанных полиплоидов может происходить тремя основными путями (Матвеева, 1980).

1. Полиплоиды появляются в результате нарушений мейоза и слияния гамет, из которых одна или обе нередуцированы. Соединение двух нередуцированных гамет дает зиготу с удвоенным числом хромосом, из которой развивается тетраплоидный организм (2п+2п=4п). Однако гораздо чаще нередуцированные гаметы сливаются в процессе оплодотворения с нормальными гаплоидными, давая начало триплоидному организму (2п+п=3п). В

обоих случаях спонтанные полиплоиды образуются в первом поколении

(Fi).

2. Увеличение числа хромосом происходит в результате образования во время мейоза нередуцированных гамет во втором или в последующих поколениях гибридов, а также при скрещивании этих гибридов с другими компонентами или в результате обратных скрещиваний.

3. Увеличение числа хромосом наблюдается в соматических тканях в период деления их клеток (митоза). Образование полиплоидных клеток связано с нарушениями, сущность которых сводится к подавлению функции веретена деления, обеспечивающего движение хромосом к полюсам. При этом в клетках идет нормальный митотический цикл, но хромосомы не расходятся к полюсам. В результате образуются клетки с удвоенным числом хромосом. Митотическое удвоение числа хромосом широко используется в практике экспериментального получения полиплоидных растений. В природе этот путь возникновения полиплоидии, по-видимому, встречается значительно реже мейотического. Достоверных случаев спонтанного соматического удвоения известно очень мало (Матвеева, 1980; Отдаленная..., 1989).

Частота возникновения спонтанных полиплоидов зависит от частоты появления нередуцированных гамет и их общего количества, а также от факторов, способствующих участию именно этих нередуцированных гамет в оплодотворении. Такими факторами могут быть различные, необычные для данного вида неблагоприятные условия окружающей среды. Функционирование нередуцированных гамет часто наблюдается и при отдаленных, экзотических скрещиваниях, значительно реже - при внутривидовой гибридизации (Матвеева, 1980; Васариетис, 1993).

Появление спонтанных полиплоидов в природе чаще всего наблюдается на границе распространения исходных диплоидных видов, где они встречаются с необычными для них условиями. Описан ряд случаев массо-

вого возникновения полиплоидных форм у некоторых культурных плодовых и кормовых растений под влиянием резких похолоданий, например, после необычной волны холода, распространившейся во время микроспоро-генеза в фазу бутонизации растений. Таким образом, возникновение спонтанных полиплоидов - сложный процесс, обусловленный взаимодействием ряда генетических, цитологических, эмбриологических и экологических факторов (Матвеева, 1980).

За рубежом широко используется искусственная полиплоидизация.

Преимущества полиплоидов у декоративных растений. У полиплоидов наблюдается увеличение размера растений и, соответственно, размера цветков. Изменяются не только размеры, но и структура тканей, текстура листочков околоцветника, что очень важно для успешной транспортировки растений. Цветок становится очень плотным, «восковым», медленнее увядает. Многие полиплоидные гибриды также обладают более интенсивной окраской листьев. Кроме того, способны лучше переносить суровые климатические условия (среди всех цветковых растений в арктических широтах полиплоиды составляют более 70%, на Памире - 86%, на Алтае - 65%) и лучше приспособлены к неблагоприятным местам обитания; они могут устоять перед более широким диапазоном температур и влажности, чем диплоиды (Клоц, 1998; Polyploidy, 2003; Жимулев, 2006).

Недостатки полиплоидов. У полиплоидов часто замедлено развитие растений. Цветение наступает позднее, как правило, с меньшим количеством цветков, хотя и более крупного размера. Кроме того, часто полиплоиды, в частности триплоиды, обладают низкой фертильностью. У растений завязывается относительно небольшое количество семян с низкой жизнеспособностью (Отрошко 1992; Жукова, 2008). Полиплоидия имеет тенденцию понижать осмотическое давление у растений. Это может быть неблагоприятной чертой, поскольку растение с более высоким осмотическим давле-

нием способно добывать больше воды из почвы, чем растение с низким осмотическим давлением (Клоц, 1998).

Методы получения полиплоидов. Выделяют несколько способов получения полиплоидов:

- преобразование в тетраплоидные уже существующих сортов, обрабатывая их диплоидные ткани колхицином или другим веществом, ин-гибирующим функции веретена клеточного деления (Трунин, 1976; Jaap М. van Tuyl и др., 1990; Отрошко, 1993; Ishikawa и др., 1997; Dabkeviciene,

1999);

- есть вероятность, что триплоиды и тетраплоиды появляются в нормальных диплоидных кроссах (например, скрещивания с видом Lilium pumilum Delile могут давать тетраплоидные сеянцы) (Отрошко, 1993; Lim Ki-Byung, 2004);

- скрещивания 2nx4n и 4nx2n для получения триплоидов (Jaap М. van Tuyl и др., 1990; Отрошко, 1993);

- опыление триплоидов пыльцой от тетраплоидов для получения тетраплоидных сеянцев (Васариетис, 1992);

- наиболее результативный способ получения тетраплоидов — скрещивание двух тетраплоидов между собой (Отрошко, 1993; Kazunori,

2000)