Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Направленная реконструкция основного белка оболочки нитчатого бактериофага М13

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Направленная реконструкция основного белка оболочки нитчатого бактериофага М13"

г я 0Ё:!11^зкз:шпляР!

' МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ НАУЧНО-ЙССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЯ ИНСТИТУТ ШЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ,

НТО "ВЕКТОР"

Ей, правах рукописи

ЮШЕНКОВА Ольга Олеговна

НАПРАВЛЕННАЯ РЕКОНСТРУКЦИЯ ОСНОВНОГО БЕЛКА ОБОЛОЧКИ НИТЧАТОГО БАКТЕРИОФАГА ШЗ

03.00.03 - йэпекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 1992

Работа выполнена в Научно-исследовательском конструк-торско-технологическом институте биологически активных веществ, НПО "Вектор"

Научныэ руководители: кандидат биологических каук

Официальные оппоненты: - член-корреспондент РАН, доктор

химических наук, В. Б. Власов. - кандидат химических наук, а А. Каргинов

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов РАН, г. Пувдно на Оке.

Защита состоится " в J часов

на заседании специализированного совета К 098.08.01 в .НИИ молекулярной биологии НПО "Вектор", Кольцово.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института молекулярной биологии НПО "Век;

А. А. Ильичев

доктор химических наук В. А. Петренко

Автореферат разослан ' ^^ 1992г.

Ученый секретарь Специализированного сове* кандидат химических нау!

Щубина Т. Е

Y - AirrVaJibHooTb проблемы.

В последнее врзмк широко используется технология рексм-зшшй&ЙоЙ ДНК для получения гибридных белковых молекул, содержащих эпитопы микробных антигенов, и являющихся потенци-ш>ными компонентами вакцин или тест-систем. Представляется зесьма перспективным использовать в качестве носителей эпи-гопов либо пустые белковые 1апсиды, либо безвредные для че-говека вирусы. Такие белковые комплексы состоят из множества ионоыэрных суб"единиц, что обеспечиваот высокую эффективность представления антигенных детерминант в фиксированной информации. При конструировании таких "искусственных" антигенов принципиальное значение имеет правильный выбор как антигенной детерминанты, так и бежа носителя.

Цель работы.

Основной целью настоящей работы было исследование возможности использования в качестве носителя антигенных детерминант бактериофага ШЗ Е. coli.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В настоящей работе впервые была проведена направленная встройка пептидов в основной белок оболочки фага ШЗ. Показано сохранение жизнеспособности гибридных фагов.

Впервые обнаружено изменение специфичности процэссинга гибридного белка одного из фагов.

Проведены физико-химические исследования фаговых частиц с измененной аминокислотной последовательностью основного белка оболочки. Изучено влияние внесенных изменений ка пространственную структуру белка и упаковку белковых суб"единиц в вириоя-?.

Полученные в настоящей работе сведения однозначно указывают на возможность направленного изменения антигенных и иымуногенных свойств основного белка оболочки нитчатого бактериофага ■ Ш.З и на возможность его использования в качестве носителя пептидных антигенных детерминант.

Получен бактериофаг M13B0L2 являвшийся потенциальным компонентом вакцины против ВИЧ 1.

Фаги с измененными белками оболочки нашли применение для исследований структурной организации вириона нитчатых

бактериофагов б работах, выполняемых совместно с Востонскж университетом.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Бутцино, 1988) и (Москва, 1990), на Мэждународном Симпозиуме "Seventh Internati onal Symposi um ort Kfetaboli sm and Enzymology of Nucleic Acids Including Gene and Protein Engineering" (Bratislava, 1990), на Международной Конференции "International Conference on KfedicaJ Biotechnology, Imrnunization and AIDS" (Ленинград, 1991), на Международной Конференции "Phage display" (Cold Spring Harbor Laboratory, Long Island, New York, 1992).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи к тезисы трех докладов.. -

Об"ем и структура диссертации.

' Диссертационная работа изложена на 135 страницах' магта-нописного текста, состоит из введения, 3-х глав, выводов, заключения, списка цитируемой литературы из 184 наименований и содержит 5 таблиц и 27 рисунков.

Содержание работы.

1. Получение бактериофага Ш.ЗВ, несущего ген устойчивости к ампициллину.

На первом этапе наш был получен рекомбинантный фаг Й.ЗВ, содержаний ген устойчивости к ампициллину. Такой 'фаг можно поддерживать в селективных.условиях на бактериальной культуре как плазмиду, даже если он утратит инфекционность в результате модификации основного белка оболочки. Схема конструирования бактериофага представлена на рис. 1.

2. Конструирование векторов внедрения и замещения на

OCHCSS бактериофага ШЗВ-

Посколъку С-конец покровного бежа фага ориентирован внутрь вириона (kfodel Р. and Rüssel М., 1988), а его N-конец обращен наружу, то для того, чтобы встроенный пептид был доступен иммунной системе, наиболее подходящей представляет-

СЙ1СС-

с-

СйТСС-

стлсй-

\

М13

1ас 2

ВгтШ

гидролиз Ва»Н1

Фратент Кложгаа

•С

сале

■ССАТС ССТА6

5'"

гидролиз Нае11,

электрофорез 8 3,57. ПАЙ",

Нае11-А фрагмент

1.8 тнс.п.0.

Нае1]-Й

эрагпеят Хяеиова

-5'

врагтент Кданова, Л«!?

ешс "ССТЙС

АрГ

М13В

I ШК-яагаза *?ага 14

шсс

^стАее"

Рис. 1. Схема конструирования бактериофага Ш.ЗВ.

ся N-кокцевая область. В пользу возможности модификации это? области свидетельствует к значительная вариабельность N-koh-цэбой части основного белка оболочки родственных одноцепо-чечных фагов fF<ML3, fl, fd), Ifl, IKe.

Определив район В-белка, который можно изменять, мы с помощью олигонуклеотиднапраьленного мутагенеза последовательно ввели в район гена VIII, соответствующей начала В-белка, сайты узнавания рестриктаз ВапгШ, Smal и PstI. 3 результате была получена серия новых векторов: М13В1, M13BÍ-2, M13S (рис.2), которые можно использовать и как вектора внедрения, обеспечивающие возможность введения дополнительных аминокислот, и как вектора замещения, позволяющие проводить замену различных участков В-белка на целевые. Следует отметить, что во всех полученных векторах BamHI cafc уникален. Однако геном фага содержал по одному дополнительному сайту Smal и PstI.

3. Излучение бактериофагов с химерными вариантами В-белка.

Ка следующем этапе работы синтетический фрагмент ДНК, кодирующий модельные пептиды, был гг. "'¡тонирован в RF фаг; ШЗВ1 (рис. 3). Эти пептиды содержали по пять аминокислот, что соответствует минимальной антигенной детерминант* (Reddchase Н. J. et al. ,1939).

Выбранная нуклеотидная последовательность при встройю в одной ориентации кодировала аминокислоты, которые встречаются в Н-концевых районах покровных белков родственных фагов (Ш.З, IF1, IKe). Обратная цепь ДНК кодировала аминокис лоты L, М, Н, которые по своим физики-хийкческим свойства отличаются от аминокислот Н-коцевого района покровного белк (L, М, Н является крупноразмерными остатками; L и KÍ имею высокую гидрофобнооть; Н- положительно зарпжен).

Полученные фаги обозначили М13В0Ш и M13B0L1. При рабо те с фагом ШЗВ0М1 был отобран субклон М13В0!л2, содержащи транзицию (А -> G), приводящую к камене аминокислотного ос татка аспарагиновой кислоты на глицин в +5 положении В-белк

шзв

-б-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 АЕБООРАКААРНЗЬСЗАЗА 5'... 6СТСАОеаТ6ЛС6АТССС0САЛААОСО6ССГГТТААСТСССтеСАА8ССТСА6Оа... 3' З'-ТСССАСТ СТАвВЗС-5'

с

ШЗВ1

олигонуклеотид-направленный мутагенез

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 АЕЗЕОРАКААРЙЗЬОАЗА 5*...О]ТЗА6&ЗТ6А£0АТСССиСАААА6СаЗССТТТААСТСССТ6СААБССТПД.дСй .

ВагаН! З'-ТеАШЗАСОТ СйбАЗТС-б'

С

олигонуклеотид-направленный мутагенез

Ш. 381-2

5'.

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 АЕбЕОРАКААРМЗЬОАЗА

,. 0СТШ058ТеАШАТССС6СААААСГ:00ССТТТМСТСССГГа:А5дХТСАвСй .. 3' 3' -ТССТАШЗС ТТТСаСС6-5' "ЖГ

ЕаШГ" СС

олигонуклеотид-направленный мутагенез

12 3 15 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

АЕВЕОРбКААРИЗ ЦСЗАЗА 5'... еетеАе^таАса\тссс500ААА5Сбш:тттАА0тссст0дА0бсстсА0са.. з' ЗагпГО--ЖГ

Хлга!

Рис. 2. Схема мутагенеза. Последовательное введение мутаций для организации сайтов рестрикции. Сплошной линией подчеркнуты сайты рестрикции и измененные аминокислоты в последовательности Б-бежа.

М13В1

-61 Е 3 4 5 6 7 А Е в Е О Р А .вСТ !ЗА6 03Г РАЗ 5АТ ССС СЗСА...З' БалН!

оонированре синтетического одигонуклеотидаого дуплекса

о о а б б 5' -(оатсакзс атс аозт

тшзтастссастаеьб'

ШЗВОШ

б н ь м р 5' -батсасстбатвсст

тшастас80астаз-5*

5'.

1 2 3 4 * 5 6 7

АЕбЕОСЗАЗеОРА ..ост 6а5 шт (за6 ш са8 (зса тса озт бат .ссс 0са...з'

ШЗВОШ

1 2 3 4 5 6 7

АЕ6Е8 0АЗаБРА б* ... ост еле озг ела езт саз ¡зса тса.азт вдт ссс вса. ,

м13в0ы

5'.

.3'

1 2 3 4 5 6 7

аебебньмрора ,. ест (Ш бот 0аз Ш сас ста атв сот бат ссс (зса..,

Рис. 3. Схема клонирования синтетического одагояуклео-тидного дуплекса в VIII гене бактериофага ШЗВ1.

-74. Получение неполной антигенной детерминанты вируса HIV-1 в составе В-бедка.

В дальнейшем сайт-локализованным мутагенезом были заменены 2 аминокислоты в последовательности фага M13BOLi и получен бактериофаг M13B0L2, который нес неполную антигенную детерминанту БИЧ! о пробелом (риз. 4), (Papsidero L. D. et al. ,-1989). Бактериофаг M13B0L2 сохранял инфекциояность и образовывал бляшки на газоне клеток Е.coll.

5. Исследования биологических и физико-химических свойств гибридных фагов.

5.1. Влияние изменения аминокислотной последовательности гибридных В-белков на их процессинг.

Было.праведено определение N-концевой аминокислотной последовательности В-белка в фагах ШЗВ, ШЗВ1, М.ЗВ0Ш, KÛ3BOM2, VË3B0L1, M.3B0L2. Результаты определения последовательности представлены на рис. 5. фи созревание гибридного В-белка фага M13E0L1 происходит отщепление, кроме сигнального пептида, четырех N-концевых аминокислотных остатков с сохраяейкек* дополнительного иентапептида. В других фагах со ййтройкамй сигнальный пептид отщепляется так же, как и у фага дикого типа.

Специфичность сигнальной пегггздаЗы и сайт узнавания для этого фермента до сих пор не известны (Несмеянова М. А., 1986). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что последовательность, несколько отдаленная от точки процессин-га может влиять на его специфичность. На основе различий во вторичной структуре гибридных белков было предложено возможное об"яснение природы этого воздействия: в результате изменений структуры белка меняется его расположение в мембране и лидерная пептидаза расщепляет другой, доступный ей район.

5.2. Влияние встроенных аминокислотных последовательностей на различные участки В-белка в вирионе.

В данном разделе представлены впервые полученные наш сведения о третичной структуре химерных В-белков и о их взаимодействии с ДКК в составе вириона фага ШЗ. Влияние ветро-

Фрагыент аминокислотной последовательности бедка р17

11 12 13 14 15 16 17 18 19 ... GEL DRWEKI ...

Фрагмент последовательности гена VIII фага M13B0L1.

5 6 7 8 9 DHLMPDPAKA...

5'... QCTGAGGSTGAGGATCACXTrGATGCCTGATCCCSCAAAAGCS... 3' 3' -CCACTOC1AS G CTACGGAC-5' С АС

олиговуклеотид-направленный мутагенез

Фрагмент последовательности гена VIII фага ШЗВ012.

1234 56789

AEGEDRWMPDPAKA... 5'... GCTGAGGGTGAGQArCuCTGSATGCCTSATCCCIKAAAAGCG... 3'

Рис. 4. Конструирование бактериофага M13B0L2, несущего фрагмент неполной антигенной детерминанты р17 ВНЧ1.

ШЗВ . AEGDDPAKA...

M13S1 AEGEDPAKA...

ШЗВОШ AEGEDQASGDP...

ШЗВОКБ AEGEGQASGDP... ШЗВОЫ DHLMPDPA...

M13BOL2 AESEDRWMPDPA..,

Рис. 5. Определение аминокислотной М-концевой последовательности Б-белка рекомбинантных фагов.

енных пептидов на упаковку В-белка в капсиде детально исследовано.

Измерение контурных: длин на электронно-микроскопических фотографиях и спектрофотометрическое определение отношения ДКК: белок показали, что модификация N-конца не влияет ни на компактность ДНК, ни на плотность расположения молекул В-белка в вирионе.

Методом флуориметрии и измерения ДД (линейного дихроизма) фагов показано, что измененный N-концевой район в некоторых случаях влияет на полярность окружения аминокислот центральной части белка и на ориентацию их боковых цепей. Результаты измерений флуоресценции (I) и линейного дихроизма (дА) приведены ь табл. 1.

Для проверки того, не приводит ли встройка олигопепти-дов к "выворачиванию" центральной части В-белка ( возникновению необычного чередования скрытых и экспонированных аминокислот) , мы изучили тушение флуоресценции остатков триптофана и тирозина с помощью йодистого калия (KI), (рис. б). Полученные результаты показали, что у всех штаммов остатки триптофана спрятаны в оболочке вириона, а остатки тирозина -экспонированы.

Таким образом, изменения аминокислотной последовательности N-концевой части В-белка не повлияли на его взаимодействие с фаговой ДНК. Изменение спектра ДЦ у двух штаммов при сохранении скорости тушения KI нужно интерпретировать, как изменение двугранного угла боковой цепи (определяющего ориентацию аминокислотного остатка) при сохранении значений двух двугранных углов основной полипептидной цепи. Такой результат возможен только при условии взаимодействия N-конце-вых районов молекул В-белка с центральными частями соседних белков в капсиде. Таким образом, мы впервые подтвердили модель структурной организации вириоков бактериофагов Ff, согласно которой центральные ,части белковых молекул каадого пентамера В-белка пространственно сближены с N-концами другого пентамера (Makowski I. and Caspar D. L., 1981).

„« „„,. -аА(280) общее кол-во число групп относитель- суммарный 8а-

штамм /129С дА( 250) карбоксильных титруемых ная инфекци- ряд В~белка гиб-

групп на Аурамином О онность (%) ридных фагов М-конце

ШЗтрЮ 1.91 1.9310.02 4 1 100 О

ШЗВ 1.91 1.9310 02 4 1 114430.7 О

ШЗВ1 1.69 ! 1.9640.02 4 2 110*38 О

ШЗВ0М1 1,93 1.8640,02 5 1 80±17.2 -1 д

М13В0М2 1.93 1.9040.02 4 1 81430.7 0 ?

ШЗВ01Л 1.85 2.35*0.02 3 1 127436.2 +1

ШЗВ0!-2__5_Г 33410.5_______ О

Табл. 1. Данные физико-химических исследований вирионов гибридных бактериофагов.

Рис. 6. Зависимость интенсивности флуо- ' ресценции фаговой суспензии от концентрации К1. Верхняя кривая - при возбуждении светом- с длиной волны 295 мкм и измерении флуоресценции на 365 мкм. Нижняя кривая - при вовбуждении « светом с длиной волны 268 мкм и измерении флуоресценции на 320 мкм. о - усредненная по всем-штаммам интенсивность флуоресценции, фаговой-оуапенаии, • - интеноивнооть флуорвоцонцда-

-115.3. Титрование карбоксильных групп на поверхности фз--а Дурашном 0.

Для изучения возможности получения искусственных имму-югенов на основе фага ШЗ особый"интерес представляют дан-гае о расположении аминокислот чузюродных пептидов на поверхности вирионов.

Количество кислых аминокислотных остатков на поверхнос- • га вирионсв определяли титрованием белка основным красителем \урамином О (Богач Е Г. и др. 1980). В табл. 1 приведено сравнение числа титруемых в В-белке карбоксильных групп и их эбщэго количества, вычисленного из аминокислотной последовательности зрелого В-белка. Легко видеть, что между к: тми отсутствует прямая корреляция, Зто свидетельствует о том, что se все отрицательно заряженные аминокислотные остатки экспонированы на поверхности вириона.

5.4. Элего'рофоретичеокая подвижность фагов.

Другой косвенный показатель экспонированяости заряженных аминокислот на поверхность фаговой частицы - скорость движения фаговых частиц под действием электрического поля. Электрофорез целых вирионов проводили в 2% агарозном геле при рН 9.5. Расчетное значение суммарных зарядов белков при рН 9.5 приведено в табл. 1. На электрофореграмме (рис. 7) i ¿ Ъ JL _£L ^ верхняя полоса соответствует

полноразмерному фагу, йэжно видеть, что наиболее отрица-* г тельно заряженный фаг ШЗВОШ. ' ' движется в геле быстрее ос" " • тальных, а фаг с наименьшим

зарядом M13B0L1 - медленнее всех (4 и 6 дорожки). Однако, несмотря на одинаковые заря-Рис. 7. Электрофорез целых вири- ды сЕйгов ШЗпрЮ, М13В, ШЗВ1, дров в 2Z агарозно),! геле. 1 - №ЗВ0М2, M13B0L2 (дорожки -^ЗврШ, Г М13В, ОДЗВ1, 1,2,3,5,7), некоторые из них 4 - M13B0MÍ, 5 - М13В0М2, б - обладает различной электро-M13B0L1, 7 - M13B0L2. фореткческой подвижностью.

Зависимость скорости двиаэния в геле от зкспонированности заряженных аминокислот неодназначна, т. к. она зависит ещэ от гибкости фаговой частицы. Несмотря на это, данные хорошо согласуется с результатами титрования карбоксильных групп, которые говорят о том, что М-концы B-белков разных фагов упакованы различным образом к далеко не все заряженные аминокислоты обращены наружу.

5.5. Сравнение икфекционности фагов.

¡Три культивирован; :;г мутантных фагов происходит накопление в культуральной жидкости минифагов. Поэтому при оценке влияния изменений покровных белков на икфекционность фаговых частиц сначала определяли долю полноразмерной ss-ДНК в препарате с помощью сканирования геля с суммарной ДНК на "Chromoskan 400". Затем, измеряя оптическую плотность препаратов при Я=268 нм, вычисляли в мг реальное содержание в препаратах «одноразмерных фагов. Полученные значения соотносили с титром фага в препаратах. Относительную инфекцион-ность всех фагов определяли в % (за 10Ш считали инфекцион-ность фага М13пр10) (табл.1).

Приведенные результаты показывает, что только в одном случае (M13B0L2) встройка приводит к заметному снижению ин-фекционности, а у остальных фагов значительных изменений не наблюдается. Наблюдаемое снижение титра может быть результатом того, что более мелкие бляшки этого фага не все визуально регистрируются.

5. б. Исследования антигенных и иммувогенных свойств гибридных фагов.

№ того, чтобы использовать векторы на основе нитчатых фагов, для получения иммуногекных и антигенных частиц необходимо, во-первых, быть уверенным, что район встройки фрагментов в В-белке доступен антителам и, во-вторых, энать, как изменения в этой области влияют на антигенные свойства фаговых частиц.

Чтобы выяснить это нами исследованы в перекрестных реакциях с фагами кроличьи сыворотки к бактериофагам М13пр10 и M3B0L2. Антитела, выделенные из сывороток, биотинилировали

и использовали . в опытах со смесью, состоящей из фагов двух типов. Один из них, взятый в избытке служил фоном, а другой, с существенно меньшим титром, - мишенью. Последний подвергался обогащению с помощью антител к этому фагу. Смесь фагов смзшивали с биотинилированныш антителами, а затем та фаги, которые формировали комплексы с антителами, отделяли на чашках, покрытых стрептпвидином. Фоновый фаг отмывался буфером, содержащим детергент, после че; о элпдарэвали фаг, связанный с антителами. Злюат титровали на чашках с у-га!, на которых ШЗпрЮ образует синие бляшки, а М13В0Ь2 - белые. Результаты приведены в таблице 2.

Смесь 1 ( антитела к ШЗщзЮ).

! фаговый ¡штамм титр исходный титр после обогащения обогащение

фон МЗВ0Ь2 мишень ШЗггрЮ 8. 25*10 1- 55*105 3.6*10*" 6. 7*10у в 10 раз

отношение титров фон: мишень 53.2:1 5.3:1

Смесь 2 ( антитела к М.ЗВ012).

фон КйЗгарЮ мишень М13В0Ь2 2.8*10* 6*10 ? 5.4*10* 6*10* обогащения не наблюдается

отношение титров фон: мишень . 466:1. 900.1 _

Таблица 2. Взаимодействие смесей фагов с биотикилиро-ванными иммуноглобулинами.

Так как в первой сиеси происходит заметное обогащение бактериофагом М13тр10, следовательно антитела к нему слабее взаимодействуют с фагом ШЗВ012. Таким образом, изменение последовательности аминокислот в фаге Ы13В0Ь2 нарушило антигенную детерминанту В-бэлка натквного фага на которую нарабатываются антитела. Из этих данных следует, что выбранный для модификации район является антигенно значимым и доступным для антител. Кроме того, можно заметить, что встройка пептидных последовательностей в этот сайт будет снижать нара-

ботку дополнительных антител на бактериофаг при иммунизации.

Ео второй смоси обогащения бактериофагом не происходит. Это означает, что пептидная встройка в Б-белке этого фага слабо изгмуногонна по сравнению с другими эпитопами фага. Тем ке менее антитела на этот участок могут быть выявлены более чувствительными методами. Используя стрипы вирусных белков ВИЧ 1, был проведен иммунофершнтный анализ с использованием антител к k*13B0L2 и MíSmplO. Оказалось, что вирусный белок р17 и его предшественник р55 взаимодействует с антителами к фагу M13B0L2 и не взаимодействует с антителами к ШЗтрЮ (рис.8). Следовательно, данные антитела теоретически могут быть использованы для нейтрализации вируса ВИЧ 1, т.к. известно, что ыожжлональные антитела к р17 нейтрализуют этот вирус m vitro (Papsidero L.D. et al.,1939). Следовательно, фаг M1380L2 необходимо исследовать дальше как потенциальный компонент вакцинц против ВИЧ 1, т.к. известно, что вакцины на основе gag белков уже проходят испытание на добровольцах (Schild G.C. , Minor P.D., 1990).

Проведенное исследование й!.::,г/ногвнности рекоьйлнантньа фагов является предварительным и требует продолжения, которое выходит ва ражи данной диссертации. Тем не менее полученные сведения однозначно указывают на возможность направленного изменения антигенных и йммуногенных свойств поверхностного капсидного белка нитчатого фага ШЗ и на возможность его использования в качестве носителя пептидных антигенных детерминант.

ВЫВОДЫ

1. Впервые получены векторы на основе нитчатого фага ШЗ, позволяющие клонировать нуклеотидные последовательности в VIII гене фага, кодирующем основной белок оболочки.

2. Впервые показана возможность получения жизнеспособных фаговых частиц со встройкой в В-белок дополнительных аминокислот, составляющих до 102 от исходного количества

3. Предложена гипотетическая модель влияния встроенных

Рис. 8. Стрипы вирусных белков ВИЧ 1, 10 - обработка ВЙЧ 1 положительной сывороткой, 9 - антителами к ШЗирЮ, 11 и 12 - антителами к ШЗВОЬЗ (сыворотка подучена от двух различных животных)..

-1Б-

ашвокжзлот на точность процессинга В-белка изменением вторичной структуры полипептида, хорошо об"яс!гяюдая полученные экспериментальные результаты й способствующая понимании механизма процессинга и действия лидерной пептидазы.

4. С помощью физико-химических методов установлено, что:

I. встройка чужеродных аминокислот не влияет на характер взаимодействия С-конца В-белка с фаговой ДНК в вирионе,

II. в некоторых случаях встройка чужеродных ашнокис-лот приводит к изменении двугранных углов боковой цепи ароматических аминокислот в центральной части B-белка, однако без ее выворачивания и без необычного чередования скрытых и экспонированных остатков,

III. встройка аминокислот, а также единичные аминокислотные замены приводят к изменению расположения (зкепониро-ванностй) различных остатков N-концевого района на поверхности вириона.

5. Показано, что район В-белка, выбранный для встройки антигенно активен и доступен антителам.

6. Доказана возможность .получения иммуногенных частиц при встройке антигенных детерминант в основной покровный болок нитчатых фагов.

Основное содержание диссертации изложено в следуюдах работах:

1. Ильичев A.A., Шшейкова О. О., Татьков 0. И., Карпышзг Е Н., Ерошкин А. М., Петренко Е А., Сандахчиев Д. С. Получение жизнеспособного варианта фага Ш.З со встроенным чужеродкь» пептидом в основной белок оболочки / ДАЕ -1989. -Т. 307. -112. -С. 481-483.

2. Ильичев А. А., Миненкова О. О., Татьков С. Л , Карпыше] Е Е , Ерошкин А. М., Офицеров Е И. , Акименко 3. А., Петренкс Е А., Сандахчиев .1 С. Использование нитчатого бактериофаге Ш.З для белковой инженерии / Пол Биол.. -1990. -Т. 24. -С. 530-535.

3. Кищенкс Г. Ii , Ыиненкова 0.0., Ильичей А. А., Грузде] А. Д., Петренко Е А. Изучение структуры вирионов фага Ш.З содержащих молекулы химерных В-Селков / Мол. Биол., -1991,

-17Т. 25. -С. 1497-1503.

4. Petrenko V. А., II ychev А. А., Kfi. nenkova 0.0., Tatkov LI., Kishchenko G.P. Study of ШЗ bacteriophage as a ossible carrier of infective agent antigen pi topes./Proceeding of the Seventh International Syitposium in Mstabol i sm and Enzyrrclogy of Nuclei с Acids Including Gene ind Protei n Engi neeri ng. -1990. Brati si ava. -P. 97-103.

5. Ильичев A. A., Шненкова 0.0., Тзтьков С. К., Карпыдав L Н. , Ерошкин А. М., Петренко а А. Использование нитчатого ¡актериофага ШЗ для целей белковой инженерии /Тез. Докл. icecoKSH. конференции "Новые направления биотехнологии" -Пу-щно. -1988. -0. 97-98.

6. Миненкова 0.0., Ильичев А. А., Кищэнко Г. П , Петренко 1 А. Требования к аминокислотной последовательности антиген-гых детерминант, встраиваемых в В-белок фага ШЗ/Тез. Докл. 5сесою8н. ковференции "Новые направления биотехнологии" Москва. -1990.

7. Ml nenkova 0.0. et al., "A study of ШЗ as a possible ¡airier of antigenic determinants". *abstract*, Internatio-lal Conference on Ktedical Biotechnology, Immunization ana tlDS, - Leningrad (USSR). -1991, -P5-18.

Отпечатано во ВНИИ МБ Заказ.164 тираж 100