Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Накопление V, Li и Co клетками цианобактерий рода Spirulina (Arthrospira)

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Накопление V, Li и Co клетками цианобактерий рода Spirulina (Arthrospira)"

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА Светлана Геннадьевна

НАКОПЛЕНИЕ V, 1л И Со КЛЕТКАМИ ЦИАНОБАКТЕРИЙ РОДА БРтиЬША (АЯТШЮБРША)

03.03.04

клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2012

1 0 Г.;АП 2012

005017011

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Тамбиев Александр Хапачевич

Официальные оппоненты: Смирнова Елена Александровна,

доктор биологических наук, профессор, кафедра клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Скальный Анатолий Викторович, доктор медицинских наук, профессор, директор Института биоэлементологии Оренбургского государственного университета.

Ведущая организация: Российский государственный аграрный

университет - МСХА им. К. А. Тимирязева.

Защита состоится «22» мая 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «¿Л> ¿¿Лфг^ЬЛ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Калистратова Елена Николаевна

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Цианобактерии и, в частности, представители рода Spirulina (Arthrospira) являются распространенными объектами научных исследований (Гусев, Никитина, 1979) и одновременно широко культивируются в настоящее время как объекты фотобиотехнологии (Vonshak, 1987; Borowitzka et al., 1999; Тамби-ев и др., 2006). Биомасса видов спирулины используется в производстве пищевого белка, лечебно-профилактических препаратов, высококачественных кормов, витаминов, пигментов, пищевых красителей и других полезных продуктов для медицины, животноводства, аквакультуры, косметологии и др. В биомассе спирулины отмечается высокое содержание белка - от 55 до 70%, присутствует широкий спектр витаминов группы В, значительное количество р - каротина и других биологически активных соединений (Ciferri, 1983).

Нужно отметить, что обогащение биомассы исследуемых в данной работе видов рода Spirulina (Spirulina platensis, Spirulina maxima) различными необходимыми для человека (эссенциальными и условно-эссенциальными) микроэлементами придает ей дополнительно высокую полезность.

В литературе известны различные классификации микроэлементов, как по их содержанию в организме человека и животных, так и по степени их необходимости для протекания нормального метаболизма (Авцын и др., 1991; Скальный и др., 2004). В данной работе изучалось накопление в клетках цианобакгерий рода Spirulina следующих микроэлементов.

Ванадий. За последние десятилетия значительно вырос интерес в изучении биологических эффектов соединений ванадия, который до этого считался микроэлементом с неопределенной биологической ролью, а в настоящее время находится в группе условно-эссенциальных элементов. Это объясняется потенциальной возможностью его использования при лечении диабета, показанной в большом количестве исследований. Многие эффекты инсулина в организме человека имитируются соединениями ванадия, они же способны увеличивать чувствительность человеческого организма к вводимым препаратам инсулина (Poucheret et al., 1998).

Литий - относится к группе условно-эссенциальных микроэлементов. В ряде исследований показано, что его дефицит может приводить к нарушениям жирового обмена, дисфункциям репродуктивной системы и аномалиям в поведении. Соли лития обладают психотропным действием и используются уже несколько десятилетий при

лечении различных психических отклонений. В настоящее время литий используется также при лечении онкологических заболеваний и в дерматологии (Anke et al., 1991).

Кобальт — является необходимым (эссенциальным) микроэлементом, входит в состав молекулы витамина В,2 (цианокобаламина) и является кофактором ряда ферментов. Он необходим в первую очередь для кроветворных тканей костного мозга и нервной ткани, особенно после травм и кровопотерь, для стимуляции образования эритроцитов, а также при заболеваниях нервной системы и анемии, развивающейся при исключительно вегетарианской диете (Скальный, Рудаков, 2004).

В целом ряде работ показано, что органические соединения вышеуказанных элементов более безопасны и эффективны для человека по сравнению с неорганическими (Reul et al., 1999; Dean et al., 1999).

Изучение влияния ванадия, лития, кобальта, введенных в среду культивирования, на выход биомассы и накопление этих элементов клетками цианобактерий позволяет определить их оптимальные концентрации в среде для получения биомассы, обогащенной исследуемыми элементами в органической форме.

Значительное внимание уделялось нами изучению влияния различных концентраций ванадия, лития и кобальта в среде культивирования на изменение элементного состава клеток, который является важнейшей характеристикой биологического объекта. Для решения этих задач было необходимо правильно подобрать комплекс аналитических методов, позволяющих определять как макро- так и микроэлементный состав клеток цианобактерий. Эти же методы дали возможность определить количество исследованных микроэлементов, связанных с поверхностными структурами клеток и их распределение во фракциях клеточных компонентов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение условий максимального накопления эссенциальных и условно-эссенциальных элементов V, Li, Со в клетках культур цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние V, Li, Со на рост культур Spirulina platensis и Spirulina maxima и исследовать динамику накопления указанных элементов клетками обеих культур.

2. Определить оптимальные концентрации указанных элементов в среде культивирования для получения обогащенной биомассы культур S. platensis и S. maxima.

3. Изучить влияние различных концентраций V, Li и Со в среде культивирования на элементный состав клеток культур цианобактерий

4. Определить соотношение между адсорбированным поверхностными структурами клетки количеством микроэлементов и их внутриклеточным содержанием.

5. Изучить распределение перечисленных микроэлементов во фракциях клеточных компонентов.

Научная новизна работы. Впервые установлена возможность значительного накопления V, Li, Со клетками цианобактерий S. platensis, S. maxima и определены оптимальные концентрации вводимых в среду культивирования микроэлементов. Впервые показано, что накопление ванадия клетками цианобактерий зависело от степени его окисления (V+4, V+5) при введении в среду культивирования. Коэффициент накопления исследованных микроэлементов в клетках был наибольшим для кобальта, значительно превосходя этот показатель для ванадия и лития. Выявлены изменения общего элементного состава клеток культур, вызванные введением ванадия, лития и кобальта в среду. Показано, что значительная часть V, Li, Со адсорбируется поверхностными структурами клеток. Изучено распределение указанных элементов между полярными, неполярными и амфифильными компонентами клеток.

Практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы для создания лечебно-профилактических препаратов на основе биомассы цианобактерий S. platensis и S. maxima, обогащенной V, Li, Со, являющимися полезными для человека микроэлементами.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на:

Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009, 2011; Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 2009; Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Крым, Гурзуф, 2010, 2011; Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности», Москва, 2010.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов исследования и использованных методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 99 страницах и включает 22 рисунка и б таблиц. Список литературы содержит ссылки на 209 источников, из которых 170 -зарубежных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования использовали термофильную нитчатую циа-нобактерию Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. IPPAS B-256 из коллекции культур микроводорослей Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (Семененко, 1991) и нитчатую цианобактерию Spirulina maxima из коллекции Флорентийского университета.

Обе культуры выращивали на среде Заррука (Stanier et al., 1971) при постоянном качании-120 об/мин и постоянном освещении 1,6 Вт/м2ФАР, температуре 26-28°С в течение 21 суток. Соединения ванадия, лития, кобальта в виде солей V0S04-3H20, NaV03, LiClH20, CoS04-7H20 вводили в среду культивирования однократно на 7-ые сутки роста, так как в предыдущих работах было показано, что введение элементов в середине экспоненциальной фазы роста (7-10 сутки) является оптимальным. По окончании культивирования клетки отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через нейлоновую сетку, тщательно отмывали дистиллированной водой и высушивали при 105°С в течение 2-х часов.

Определение биомассы. Биомассу цианобактерий S. platensis и S. maxima определяли весовым и нефелометрическим методом (ФЭК-М).

Минерализация. Для полной минерализации биомассы цианобактерий и предотвращения потерь летучих соединений использовали микроволновый минерализатор («Минотавр»), Навеску пробы 10-70 мг помещали во фторопластовую емкость (50 мл) приливали по 3 мл HN03, 2 мл Н202 и разлагали в течение 20 мин. После охлаждения, раствор пробы разбавляли дистиллированной водой до 10-20 мл. Конечное содержание HN03 в растворах не превышало 20 %.

Десорбирование элементов, связанных с поверхностными структурами клеток. Отмытую от среды биомассу S. maxima (0,01-0,07 г) заливали 15 мл 0,03М раствора ЭДТА и оставляли на 30 мин., после чего центрифугировали при 2000 об/мин в течение 15 мин., супернатант отделяли. К осадку добавляли 15 мл дистиллированной воды и центрифугировали. Полученный супернатант объединяли с предыдущим. Осадок высушивали при 105°С в течение 2 часов. Определяли содержание ванадия, лития, кобальта как в осадке, так и в супернатанте.

Фракционирование биомассы. Получение фракций для культуры S.maxima, содержащих гидрофильные, гидрофобные и амфифильные компоненты клеток осуществляли по методу Фолча (Folch et al., 1957).

Осадок, полученный после обработки биомассы раствором ЭДТА, заливали смесью хлороформа и метанола (в соотношении 2:1) и тщательно растирали смесь в гомогенизаторе, затем переливали смесь в пробирки и оставляли на 1 час при температуре 3-5°С, после чего центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин., су-пернатант отделяли, осадок повторно заливали смесью хлороформа и метанола и центрифугировали, полученный супернатант объединяли с предыдущим. К объединенному супернатанту добавляли дистиллированную воду, в результате чего смесь разделялась на фракцию гидрофильных (водно-метанольная) и гидрофобных (хлороформная) компонентов клеток. Осадок (фракция амфифильных компонентов) высушивали при температуре 105°С в течение 2 часов и разлагали методом микроволновой минерализации в смеси НЫ03 и Н202. Для оценки возможных в результате фракционирования потерь микроэлементов и определения их суммарного баланса во фракциях, из каждой колбы отбирали инакулят объемом 10-15 мл. Клетки отделяли от культуралыюй жидкости фильтрованием, промывали их сначала дистиллированной водой, потом 0,03 М раствором ЭДТА. Осадок высушивали при температуре 105°С в течение 2 часов, затем подвергали микроволновой минерализации в смеси НЫОз и

н2о2.

Аналитические методы исследования. Определение содержания элементов проводили в Институте геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН.

Определение содержания V в клетках, в растворе ЭДТА и во фракциях клеточных компонентов проводилось методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии (ЭТААС) на спектрофотометре фирмы Перкин Элмер «Зееман/ЗОЗО». В работе использовали печь с пиролитическим покрытием.

Определение содержания 1л в клетках, в растворе ЭДТА, во фракциях клеточных компонентов проводилось методом пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии (ПААС) на спектрофотометре Перкин-Элмер 603, в пламени «ацетилен-воздух».

Определение содержания Со в клетках, а также в водно-метанольной и хлороформной фракции проводили методом ПААС, содержание Со во фракции амфифильных компонентов (осадок) и в растворе ЭДТА определяли методом ЭТААС.

Общий элементный состав биомассы цианобактерий (N3, К, Са, Ре, Мп, Хп, Си, Мо, В, V) определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктив-

но-связанной плазмой (АЭС-ИСП) на 48-канальном спектрометре ICAP-9000 (Thermo Jarrell Ash).

Полученные растворы исследованных микроэлементов в ЭДТА и фракцию полярных компонентов (водно-метанольная) непосредственно вводили в пламя ацетилен-воздух и графитовую печь. Растворы сравнения для определения элементов в водно-метанольной фракции и растворе ЭДТА готовили на основе метанола и 0,03 М раствора ЭДТА. Метанол и ЭДТА не влияли на величину аналитического сигнала. Определение V, Li, Со в хлороформной фракции осуществляли после удаления указанного растворителя нагреванием в течение 30 мин. при температуре 60 °С. Затем в образовавшийся осадок приливали 2 мл конц. HNO3 и несколько капель Н2Ог до полного растворения осадка. Раствор охлаждали и разбавляли дистиллированной водой до 10-20 мл.

Микроскопированне. Оптическая микроскопия: морфологию клеток изучали с помощью светового микроскопа Axiophot, фирма Carl Zeiss (Германия) методом фа-зово-контрастной микроскопии. Сканирующая электронная микроскопия: обработку образцов биомассы S.maxima проводили, как описано ранее (Звягинцев и др., 2010). Образцы биомассы после фиксации и обезвоживания высушивали на установке Dryer НСР-2 ("Hitachi", Япония) и просматривали в сканирующем электронном микроскопе JSM-6380LA ("JEOL", Япония).

Статистическая обработка. Статистическая обработка данных осуществлена с использованием программы Excel. По полученным данным рассчитывалось среднее квадратичное отклонение, число повторностей отдельных опытов было не менее 3-х.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение влияние V. Li и Со на рост и выход биомассы S. platensis и S. maxima. определение их оптимальных концентраций в среде. При введении в среду культивирования V0S04'3H20 (катионная форма, V+4) ингибирование роста и снижение выхода биомассы у S. platensis начиналось при концентрации 20 ммоль/л ванадия в среде, у S. maxima -30 ммоль/л (рис.1). Ингибирование роста и выхода биомассы S. maxima при введении NaV03 (анионная форма, \^5) начиналось при концентрации 15 ммоль/л (рис.1), а у S. platensis при меньших концентрациях 10 ммоль/л ванадия в

среде. Сравнение влияния двух форм ванадия на кинетику роста культур цианобакте-рий S. piatensis и S. maxima показало, что V+:> вызывал большее подавление роста и снижение выхода биомассы по сравнению с Vм. Сравнивая накопление ванадия клетками piatensis и S. maxima, вводимого в среду в виде ванадил-катиона и ванадат-аниона мы пришли к выводу, что накопление ванадия более эффективно при добавлении в среду ванадата.

В отношении лития изучение роста обеих культур показало, что ингибирование выхода биомассы S. piatensis начиналось при концентрации лития 0,07 моль/л. Для S. maxima ингибирование роста и снижение выхода биомассы начиналось при большей, чем для S. maxima концентрации лития в среде равной 0,14 моль/л (рис.1). При одинаковых условиях культивирования накопление лития в клетках S. piatensis и S. maxima практически не отличалось. Сравнение динамику роста культур S. piatensis и S. maxima при введении различных концентраций ванадия и лития в среду культивирования показало, что клетки S. maxima более устойчивы к высоким концентрациям этих элементов, а значит, эта культура является более перспективным объектом для получения обогащенной ими биомассы. Поэтому изучение накопления кобальта проводили на культуре S. maxima.

Изучение динамики роста S. maxima при введении в среду Со показало, что уже незначительные его концентрации в среде (в сравнении с V и Li) приводят к ингиби-рованию роста и выходу биомассы. Так при концентрации кобальта - 25 мкмоль/л выход биомассы S. maxima снижался в среднем на 50% сравнению с контролем (рис.1). Внесение кобальта в концентрации выше 45 мкмоль/л приводило к гибели культуры к 21 суткам роста.

Сравнивая величины концентраций V, Li, Со в среде культивирования, вызывающих подавление роста и выхода биомассы, мы пришли к выводу, что по степени ингибирующего влияния на скорость роста и выход биомассы цианобактерий S. piatensis и S. maxima изучаемы микроэлементы можно расположить в следующем порядке Li+<V+4<V+5<Co+2.

El 91

X н o

.0

d о z (о t; с к го зе и

аI ■у

■s. н с О

Время культивирования, сут.

Концентрация микроэлементов:

(1) - контроль (среда Заррука) V*4 (ммоль/л) - (2) - 20, (3) -30, (4) - 40, (5) - 60. V* (ммоль/л) - (2) - 20, (3) - 30, (4) - 40, (5) - 60. Li (моль/л) - (2) - 0,14, (3) - 0,21, (4) - 0,28, (5) - 0,35. Со (мкмоль/л)- (2)- 17,0 (3) - 25,0.

Рис. 1. Влияние V, Li, Со на рост и выход биомассы S. maxima Исследования накопления ванадия, лития, кобальта клетками культур Spintlina platensis и Spirulina maxima позволили нам определить их оптимальные концентрации в среде культивирования для получения биомассы цианобактерий обогащенных указанными микроэлементами (табл. 1), при которых происходит достаточно высокое накопление микроэлемента в клетках, что не сопровождается заметным сни-

жением выхода биомассы. Для определения оптимальной концентрации вводимого в среду микроэлемента был предложен критерий, который определяется как произведение значений накопления элемента в клетках на выход биомассы. Максимальное значение критерия соответствует точке оптимальной концентрации.

Таблица 1. Содержание V, Гл и Со в клетках £ рШею^ и Я. тахша при их введении в среду в оптимальных концентрациях._

S. platensis 5. maxima

Оптимальные Накопление Оптимальные Накопление

концентрации м моль/л в клетках, мкг/г концентрации ммоль/л в клепсах, мкг/г

V1"4

30,0 1245±105 30,0 1550±75

V+5

30,0 2855±254 20,0 2650±206

Li

210,0 805±78 210,0 853±104

Со

- - 0,017 320±38

Мы считаем, что еще одним фактором, который следует учитывать при определении оптимальной концентрации, является отсутствие изменений в морфологии клеток цианобактерий, которые могут говорить о серьёзных сдвигах в метаболизме клеток, что нежелательно для получения обогащенной биомассы. Задачей являлось получение максимального накопления исследуемых микроэлементов в клетках при отсутствии в них морфологических изменений.

Таблица 2. Коэффициенты накопления V, Li, Со для культур S. platensis и S. maxima.

Элемент Со (ммоль/л) С (ммоль/г) К

S. platensis S. maxima S. platensis S. maxima S. platensis S. maxima

V** 30 30 0,024 0,030 0,8 1,0

V+s 30 20 0,056 0,052 1,9 2,6

Li 210 210 0,114 0,115 0,5 0,5

Со - 0,017 - 0,005 - 290

По результатам сравнения значений содержания ванадия, лития и кобальта в клетках S. platensis, S. maxima и значений оптимальных концентраций этих элементов в среде были рассчитаны коэффициенты накопления указанных микроэлементов

(табл.2). Коэффициент накопления (К) определяется, как соотношение накопления элемента в клетке (С) к оптимальной концентрации данного элемента в среде (С0), то есть К = С/Со ХЮ00. Как видно из таблицы 2, наибольшее значение коэффициента накопления было для кобальта, а наименьшее для Li. Таким образом, можно предположить, что высокая токсичность кобальта для S. maxima, которая проявляется уже при относительно низких концентрациях его в среде, связана с высокой аккумулирующей способностью этого металла клетками цианобактерий.

Влияние V, Li и Со на элементный состав клеток S. platensis и S. maxima. Полученные в нашей работе данные о влиянии различных концентраций V, Li, Со, введенных в среду культивирования в повышенных концентрациях, на элементный состав клеток суммированы в таблице 3.

Таблица 3. Изменение элементного состава клеток S. platensis и S. maxima при введении в среду различных концентраций V, Li, Со.

Элемент Концентрация в среде, ммоль/л Вид культуры Наблюдаемые изменения

макроэлементы микроэлементы

+4 +5 V ,v 30-60 S. platensis S. maxima |Na TFe, TMn, |Zn

Li 200-400 S. platensis S. maxima TNa, |K |Fe, fMn

Со 0,015-0,035 S. maxima |Na |Fe, TMn, TZn

Было показано, что введение в среду культивирования повышенных концентраций ванадия, лития и кобальта вызывало схожие изменения элементного состава клеток как S. maxima, так и S. platensis, что подтверждает данные о физиологическом сходстве обеих культур (Тамбиев, Лукьянов, 2009) (табл. 3).

В литературе имеются данные, указывающие на особую роль ионов Na* в поддержании рН-гомеостаза клеток бактерий, участие этих ионов в транспорте различных соединений в клетку и в энергетических процессах клеток алкалофильных бактерий (Гусев, Минеева, 2003). Известно, что в клетках микроводорослей и цианобактерий при стрессе, вызванном присутствием токсического металла, наблюдается изменение цитоплазматического рН (Arunakumara, Xuecheng, 2008). Не исключено, что процессы накопления V, Li, Со в клетках влияют на транспорт ионов натрия через мембраны клеток. Увеличение содержания Мп и Fe может быть связано также с тем,

что токсическое действие V, Li, Со отражается в способности к образованию в клетках активных форм кислорода. Как известно, в клетках цианобактерий ферментами, принимающим участие в детоксикации активных форм кислорода являются Fe- и Мп-содержащие супероксиддисмутазы, каталазы и перокисдазы (Priya et al., 2007). Возможно, увеличение поступления железа и марганца в клетку при введении всех трех элементов в среду культивирования связано с индукцией синтеза указанных ферментов антиокислительной защиты.

Определение внутриклеточного и связанного с поверхностными структурами клеток количества микроэлементов. Процесс аккумуляция бактериями металлов представляет собой двухстадийный процесс. Первая стадия быстрая - физико-химическая адсорбция металла поверхностными структурами клетки. Этот процесс включает связывание металлов клеточной стенкой, цитоплазматической мембраной, а также поверхностными слизистыми структурами (капсулы, чехлы) (Hall, 2002; Volesky, Holán, 1995; Soldo et al., 2005). Вторая стадия медленная - проникновение ионов металла в клетку (Бекасова, 2000; Hall, 2002; Arunakumara, Xuecheng, 2008). Металлы легко образуют прочные комплексные соединения за счет взаимодействия ионов с функциональными группами белков, полисахаридов, пептидогликанов, входящих в состав поверхностных структур клеток и поэтому в них могут накапливаться в относительно больших количествах (Битюцкий, 1999).

Для определения количества V, Li и Со, связанного с поверхностными структурами клеток мы использовали стандартную методику с применением в качестве де-сорбента ЭДТА (Volesky, Holán, 1995; Da Costa, Da Franka, 1998). Полученные данные представлены на рис. 2.

03 100

о

О 80

> 60

0)

s X 40

*

о. 20

СГ

о и 0

1

V'5 Li Со

□ содержание элемента адсорбированного поверхностными структурами клеток П внутриклеточное содержание элемента

Рис. 2 Соотношение внутриклеточного и связанного с поверхностными структурами клеток S. maxima количества V, Li, Со.

Из рис.2 видно, что значительная часть ванадия и лития (более 70%) адсорбируется поверхностными структурами клеток S. maxima. При этом данные по ванадилу и ванадату существенно не отличаются. Внутриклеточное содержание кобальта приблизительно равно количеству кобальта, адсорбированного поверхностными структурами клеток (около 55%).

Адсорбция металлов поверхностными структурами клетки является одним из механизмов устойчивости организмов к высоким концентрациям металлов, так как при этом уменьшается их проникновение в клетку (Kuyucak, Volesky, 1990; Hall, 2002; Soldo et al., 2005).

Изучение распределения ванадия, лития и кобальта между полярными, неполярными и амфифильными компонентами клеток S.maxima. С целью изучения распределения V, Li и Со в клетках цианобактерий было проведено разделение с получением фракций следующих компонентов: амфифильных (нерастворимые компоненты), которая включает фрагменты клеточной стенки, амфифильные белки и полисахариды; неполярных (хлороформная фракция), которая включает гидрофобные белки и липиды; полярных (водно-метанольная фракция), которая включает низкомолекулярные полярные соединения, гидрофильные белки цитоплазмы, моносахариды.

Как видно из рис. 3 меньше всего ванадия, лития и кобальта содержалось во фракции неполярных компонентов.

ІЩ2 амфифильные компоненты і і полярные компоненты I 1 неполярные компоненты

Рис. 3 Распределение V, Li, Со между полярными, неполярными и амфифильными компонентами клеток S.maxima.

Основными металлсвязывающими агентами соединений, входящих во фракцию неполярных клеточных компонентов, могут быть амино- или фосфатные функциональные группы фосфолипидов, липополисахаридов и липопротеинов (Augustoda et al., 1998).

Большая часть ванадия, лития, кобальта, как видно из рис.3, содержалась во фракции полярных компонентов, состоящей в основном из растворимых белков цитоплазмы. Металлотионеины, принимающие участие в детоксикации металлов также входят в эту группу белков. В некоторых работах показано, что S. platensis обладает способностью синтезировать металлотионеины в ответ на стресс, вызванный введением различных металлов в среду культивирования (Саванина, 1998, Черникова, 2009). Присутствие ванадия, лития, кобальта в составе нерастворимых клеточных компонентов может быть связано с их включением состав углеводных гранул, а также со связыванием с белками, входящими в состав хлорофилл-белкового комплекса.

Влияние лития и кобальта на морфологию клеток S.maxima. При концентрации лития в среде культивирования - 0,28 моль/л мы начинали наблюдать образование сгустков трихомов и первые морфологические изменения в клетках обеих культур. Данные эффекты побудили нас к более подробному исследованию влияния лития на морфологию клеток цианобактерий. Эту часть работы мы проводили на культуре S. maxima.

Изучение влияния лития на морфологию клеток S. maxima проводилось с помощью сканирующей электронной микроскопии. На рис. 4 (А, Б) представлена культура S.maxima, выращенная на среде Заррука без добавления лития в среду культивирования (контроль). Как видно, для трихомов S. maxima характерна полная деспира-лизация. На рис. 4 Б видно, что в трихоме выявляются места локализации клеточной перегородки. На рис. 4 (В, Г) представлена культура S.maxima, выращенная на среде Заррука с добавлением лития в концентрации 0,35 моль/л. Как видно в этом случае морфология клеток S. maxima под действием хлористого лития существенно менялась. Происходило слипание трихомов различной длины, одиночных клеток, имела место деградация содержимого значительного количества клеток. Видны разломы в местах соединения клеток трихома. В отличие от контроля не выявлялись места локализации клеточной перегородки в трихомах. Наблюдалось отделение клеточной стенки от протопласта, на концах трихомов возникали вздутия. Наблюдаемая картина согласуется с данными, имеющимися в литературе, при этом известно, что хлористый

литий может вызывать образования форм несбалансированного роста у некоторых бактерий (Прозоровский и др., 1987), однако механизм его действия плохо изучен.

Рис. 4 Общий вид клеток в культуре S.maxima (сканирующая электронная микроскопия). А, Б - контроль (без Li в среде); В, Г - концентрация Li в среде 0,35 моль/л. Стрелками обозначено: Б - место локализации клеточной перегородки в трихоме, В - разлом в месте соединения клеток трихома, Г- отделение клеточной стенки от протопласта, вздутие на конце трихома.

Изучение влияния кобальта на морфологию клеток S. maxima проводилось с помощью метода фазово-контрастной оптической микроскопии. Введение кобальта в среду в концентрации 25 мкмоль/л и выше приводило к значительным изменениям в морфологии клеток обеих культур.

На рис. 5 видно, что под действием сульфата кобальта у части клеток в трихоме происходит деструкция протопласта и выброс содержимого через разрывы в поверхностных структурах. Отмечается утолщение трихомов в среднем на 25-30%.

Рис. 5 Общий вид клеток в культуре S. maxima (фазово-контрастная оптическая микроскопия). А - контроль (без Со в среде), Б - концентрация Со в среде 0,25 мкмоль/л. Стрелками обозначено: выброс содержимого клетки через разрывы в поверхностных структурах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе изучены условия накопления микроэлементов V, Li, Со клетками цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima, которые являются широко распространенными объектами фотобиотехнологии и обладают выраженным физиологическим и морфологическим сходством.

Для исследованных микроэлементов были определены оптимальные концентрации при введении их в среду культивирования, при которых происходит достаточно высокое накопление микроэлемента в клетках, что не сопровождается заметным снижением выхода биомассы и отсутствием видимых морфологических изменений клеток. В качестве предложенного критерия оптимальной концентрации микроэлемента в среде рассматривалось, в первую очередь, его максимальное значение, равное произведению содержания микроэлемента в клетке на выход биомассы. Значения критерия в области оптимальных концентраций различались для обеих культур и были выше у S.maxima по сравнению S. platensis.

В работе показано, что накопление ванадия в клетках цианобактерий зависит от формы (анионной, катионной) при введении его в среду культивирования. Большее накопление в клетках обеих культур отмечалось при введении в среду ванадата (V"5) по сравнению с ванадилом (V*4).

Коэффициент накопления исследованных микроэлементов в клетках, определяемый как отношение количества элемента в клетке к количеству его в среде, был наибольшим для кобальта и наименьшим для лития.

При введении в питательную среду обеих культур указанных микроэлементов

наблюдались изменения в общем элементном фоне клеток. Было исследовано соотношение между количеством микроэлементов, связанных с поверхностными структурами и находящихся в цитоплазме клеток цианобактерий.

Изучение распределения исследованных микроэлементов между полярными, неполярными и амфифильными компонентами клеток цианобактерий показало, что большая часть микроэлементов содержалась во фракции полярных, а меньшая часть во фракции неполярных компонентов.

выводы

1. Определены оптимальные концентрации эссенциальных и условно-эссенциальных для человека микроэлементов V, Li, Со, вводимых в среду культивирования, при которых наблюдалось их значительное накопление в клетках цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima, сопровождавшееся небольшим понижением выхода биомассы. По степени ингибирующего влияния на рост и выход биомассы культур цианобактерий исследованные микроэлементы можно расположить в следующий ряд: Li+ <V+4<V+5<Co+2.

2. Показано, что накопление в клетках цианобактерий ванадия, вводимого в среду культивирования, зависит от степени его окисления (V+4, V+5). Введение ва-надата натрия (V+5) приводило к большему накоплению ванадия клетками обеих культур, чем при введении сульфата ванадила (V+4).

3. Коэффициент накопления исследованных микроэлементов в клетках цианобактерий различался и был наибольшим для Со, значительно превосходя этот показатель для V и Li.

4. Введение V, Li, Со в среду приводило к изменению элементного состава клеток - увеличению содержания Na, Fe, Мп в клетках обеих культур. При введении Li наряду с этим наблюдалось уменьшение содержания К. в клетках. При введении V и Со наблюдалось также увеличение содержания Zn.

5. Более 70% V, Li и около 55% Со связывалось с поверхностными структурами клеток S. maxima.

6. Большая часть V, Li и Со обнаруживалась во фракции полярных, а меньшая -во фракции неполярных компонентов клеток S. maxima.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васильева С.Г., Лукьянов A.A., Лябушева O.A., Тамбиев А.Х. Изменение элементного состава клеток цианобактерий при введении в среду отдельных микроэлементов. Мат. 5-го Межд.конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития», М., 2009, ч.2, стр.148-149.

2. Тамбиев А.Х, Лукьянов A.A., Васильева С.Г. Проявление «памяти среды» при действии миллиметровых волн низкой интенсивности на культуры цианобактерий. Тез. 5-го Межд.конгр. «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», С.Птб., 2009, симп. А, стр.26.

3. Тамбиев А.Х., Васильева С.Г., Лукьянов A.A., Седых Э.М., Банных Л.Н. Включение ванадия и лития клетками некоторых цианобактерий. Труды XVIII Меж-дун. конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2010, стр.103-104.

4. Vasilieva S.G., Tambiev A.Kh., Lukianov A.A., Sedykh E.M., Bannykh L.N. The investigation of the accumulation of vanadium and lithium by Spirulina platensis and Spirulina maxima cyanobacteria's cells. Trace Elements in Medicine, 2010, v. 11, №2, p.48-49.

5. Тамбиев A.X., Седых Э.М., Лябушева O.A., Банных Л.Н., Васильева С.Г., Лукьянов A.A. Изучение влияния некоторых химических и физических факторов на элементный состав клеток цианобактерий с использованием атомно-спектральных методов. Съезд аналит. России «Аналитическая химия - новые методы и возможности», М., 2010, стр.110-111.

6. Васильева С.Г., Тамбиев А.Х., Седых Э.М, Лукьянов A.A. Влияние условий культивирования на обогащение биомассы цианобактерии Spirulina maxima ванадием. Мат. 6-го Межд. конгр. «Биотехнология: состояние и перспективы развития», М., 2011, 4.2, стр.224-225.

7. Vasilieva S.G., Tambiev A.Kh., Sedykh I. M, Lukyanov A.A., Bannikh L.N. The enrichment of biomass of cyanobacteria with vanadium by using the cation and anion forms of its compounds. J. of Trace Elements in Medicine and Biology, 2011, v.25 p.109-112.

8. Тамбиев A.X., Васильева С.Г., Лукьянов A.A., Седых Э.М. Влияние повышенных концентраций Li на морфологию и соотношение содержания Na и К в клетках цианобактерий Spirulina maxima и Spirulina platensis. Труды XIX Межд.

конф. «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» Украина, Крым, Ялта-Гурзуф 2011, стр. 150-151.

9. Тамбисв А.Х., Васильева С.Г., Лукьянов A.A. Проявление солетолерантности цианобактерий рода Arthrospira (Spirulina) - Spirulina platensis и Spirulina maxima. Вест. моек, универ. сер. 16. Биология, 2011, №4. стр. 17-21.

Ю.Васильева С.Г., Седых Э.М., Лукьянов A.A., Омарова Е.О., Тамбиев А.Х. Изучение накопления лития клетками цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima. Вопр. биол., медиц. и фармацев. химии, 2011, №11, стр. 50-54.

Подписано в печать 18.04.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 75 экз. Заказ № 1207 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильева, Светлана Геннадьевна, Москва

61 12-3/888

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. Ломоносова Биологический факультет

На правах рукописи

Васильева Светлана Геннадьевна

НАКОПЛЕНИЕ V, 1Л И Со КЛЕТКАМИ ЦИАНОБАКТЕРИЙ РОДА БРШиЬША (АЛТНКОБРША)

специальность: 03.03.04 — цитология, гистология, клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н, профессор А.Х.Тамбиев

Москва 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................6

1.1. Общая характеристика цианобактерий рода Spirulina (Arthrospira).....................6

1.1.1. Таксономическое положение и экология рода Spirulina (Arthrospira)..................6

1.1.2. Морфология и цитология клеток S. platensis и S. maxima......................................7

1.1.3 Химический состав клеток S. platensis и S. maxima.................................................9

1.1.4 Культивирование.......................................................................................................11

1.1.5. Использование биомассы спирулины в питании человека...................................14

1.2. Физиолого-биохимическая роль отдельных микроэлементов.............................17

1.2.1 Классификация элементов минерального питания................................................17

1.2.2 Биологическая роль ванадия.....................................................................................20

1.2.3. Биологическая роль лития.......................................................................................25

1.2.4. Биологическая роль кобальта..................................................................................27

1.3 Влияние микроэлементов на клетки цианобактерий.............................................31

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................41

2.1 Характеристика объектов исследования...................................................................41

2.2 Культивирование...........................................................................................................41

2.3 Определение биомассы..................................................................................................43

2.4 Минерализация биомассы............................................................................................43

2.5 Микроскопирование......................................................................................................43

2.6 Десорбирование элементов, связанных с

поверхностными структурами клеток.............................................................................44

2.7 Фракционирование биомассы.....................................................................................44

2.8 Аналитические методы исследования.......................................................................45

2.9 Статистическая обработка...........................................................................................46

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................47

3.1 Влияние ванадия, лития, кобальта на рост и выход биомассы культур S. platensis и S.maxima..............................................................................................................47

3.2. Изучение динамики накопления исследованных микроэлементов в клетках цианобактерий и определение их оптимальной концентрации в среде культивирования..................................................................................................................50

3.3. Влияние V, Li и Со на элементный состав клеток S. platensis и S. maxima........58

3.3.1.Влияние ванадия на элементный состав клеток S. platensis и S. maxima.............59

3.3.2 Влияние лития на элементный состав клеток S. platensis и S. maxima.................62

3.3.3 Влияние кобальта на изменение элементного состава клеток S. maxima............65

3.4 Определение внутриклеточного и связанного с поверхностными структурами клеток S.maxima количества микроэлементов...............................................................66

3.5. Изучение распределения ванадия, лития и кобальта между полярными, неполярными и амфифильными компонентами клеток S.maxima...........................70

3.6 Влияние лития и кобальта на морфологию клеток S. maxima..............................72

ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................................................................................76

ВЫВОДЫ...............................................................................................................................78

ЛИТЕРАТУРА......................................................................................................................79

ВВЕДЕНИЕ.

Жизнь, как известно, зарождалась в океане и всевозможные элементы наряду с органическими соединениями, составляют её основу. В организме человека из известных 92 химических элементов встречается 81 элемент. Все минеральные элементы в организме млекопитающих и человека делятся на три группы в зависимости от их содержания в клетках. Первую группу составляют макроэлементы, содержание которых превышает 0,01% от массы тела. Вторую группу составляют микроэлементы с концентрацией от 0,00001% до 0,01%. В третью группу входят ультрамикроэлементы, содержание которых ниже 0,000001% (Авцын и др., 1991; Битюцкий, 1999; Скальный, Рудаков, 2004).

Согласно классификации по физиологическим функциям все элементы в организме делятся на три группы: 1) жизненно необходимые (эссенциальные), 2) вероятно (условно) необходимые, 3) токсичные и элементы малоизученного действия (Авцын и др., 1991; Скальный, Рудаков, 2004).

Химический элемент считается эссенциальным, если при его отсутствии или недостаточном поступлении в организм нарушается нормальная жизнедеятельность, прекращается развитие, становится невозможной репродукция.

В данной работе изучено накопление Со (эссенциального) и V, О (условно-эссенциальных) микроэлементов в клетках цианобактерий.

Изучение влияния ванадия, лития, кобальта, вводимых в питательную среду в повышенных концентрациях, на выход биомассы и накопление их в клетках цианобактерий дает возможность определить оптимальные концентрации этих элементов в среде культивирования, для получения биомассы обогащенной эссенциальными и условно-эссенциальными микроэлементами в органической форме.

Объектами исследования были цианобактерии рода Spirulina (Arthrospira) Spirulina platensis и Spirulina maxima, являющиеся широко распространёнными объектами фотобиотехнологии, культивируемые в целом ряде стран (США, Мексика, Индия, Китай, Тайвань, Япония и др.).

Нас интересовали условия накопления V, Li, Со клетками цианобактерий, влияние их на элементный состав клеток, распределение изучаемых элементов между поверхностными структурами клеток и цитоплазмой, а также между полярными, неполярными и амфифильными компонентами клеток. Поставленные задачи исследования потребовали использования комплекса современных атомно-абсорбционных и атомно-эмиссионных методов анализа.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика цианобактерий рода Зр1гиИпа

{ЛгШгоБрЬа).

К цианобактериям относится большая группа организмов (около 1500 видов), сочетающих прокариотное строение клетки со способностью осуществлять фотосинтез, сопровождающийся выделением кислорода, что свойственно разным группам водорослей и высших растений (Гусев, Никитина, 1979; Гусев, Минеева, 2003). В течение длительного времени цианобактерии рассматривались как одна из групп низших растений, их относили к сине-зеленым водорослям и систематика осуществлялась в соответствии с правилами Международного кодекса ботанической номенклатуры. Только в 60-х г.г. XX в. было окончательно определено их таксономическое положение (Кондратьева и др., 1998).

1.1.1. Таксономическое положение и экология рода БркиПпа {АПкгоБрЬга).

Род БрииНпа (пор. ОБсИШопаЫБ) объединяет группу нитчатых, не образующих гетероцист грамотрицательных филаментных цианобактерий, для которой характерна спиралевидная форма трихома (Громов, 1976; (Жегп ег а1, 1985; Тамбиев и др., 2003), состоящего только из вегетативных клеток. Размеры клеток, степень спирализации и длина трихома варьируют в зависимости от вида. Последняя характеристика может также изменяться в пределах вида в зависимости от условий среды культивирования и возраста культуры (рис.1, рис.2) (Вогошйгка, 1988).

^ J

Рис.1 А. Трихомы S. maxima в природных условиях (фазово-контрастная микроскопия)

Род Spirulina весьма широко распространен. Представители этого рода были обнаружены в самых разнообразных местах обитания от тропических вод до северных морей (Hurnm et al., 1980), в горячих источниках, почве, болотах, соленых озерах (Goluble, 1980). Наиболее изученными в настоящее время являются виды Spirulina platensis и Spirulina maxima. Вид S. platensis происходит из Африки, где её биомасса под названием «дихе» в течение уже долгого времени служит питанием местным жителям в районе озера Чад и в некоторых других районах. S. maxima происходит из Мексики и употреблялась в пищу еще ацтеками в виде лепешек, в настоящее время ее добывают из озера Тескоко.

1.1.2. Морфология и цитология клеток S. platensis и S. maxima.

Представители рода Spirulina — многоклеточные, нитевидные цианобакгерии. Виды S. platensis и S. maxima обладают выраженным морфологическим и физиологическим сходством (Ciferri et al., 1985; Kyle, 1989; Kay, 1991). Трихом неразветвленный, спиральный. Этот признак

Рис. 1 Б . Трихомы S. maxima при лабораторном культивировании (фазово-контрастная микроскопия)

отличает виды БрггиИпа от видов рода ОясИШопа. Трихом может состоять из различного числа витков (от 2 до 30). Длина его варьирует от 20-300 мкм, толщина спирали 35-50 мкм, а самого трихома — 10 мкм. Как в природе, так и в лабораторных условиях, встречаются морфологические варианты, отличающиеся различной степенью спирализации трихомов, с постоянными переходами от типичной равномерной спирализации до полной деспирализации.

Рис. 2 Общая схема строения вегетативной клетки цианобактерий в разрезе (Баулина,

Цитология видов S. platensis и S. maxima хорошо изучена. Клетки трихома обоих видов окружены тонким чехлом. Протопласт ограничен цитоплазматической мембраной (плазмалеммой) толщиной примерно 10"2 мкм, которая образует избирательный барьер между внешней, крайне богатой бикарбонатом средой и цитозолем. Клеточная стенка, типична по

ч

ГВ- газовые везикулы Ка-карбокисома КС —клеточная стенка МТ-мембрана тилакоида Н-нуклеоид

НМ- наружная мембрана Пи- пили

Пг- пептидогликановый слой

ПГБ- гранулы поли (3 -

оксибутирата

ПП- периплазматическое

пространство

Пф- полифосфатные гранулы

Р-рибосомы

Т-тилакоиды

Ф-фикобилисома

ЦГ- цианофициновая гранула

ЦПМ- цитоплазматическая

мембрана

Ч-чехол

Ш-шипы

а-а-гранулы гликогена р — липидные (З-гранулы высокой электронной плотности

в- поверхностные 8-слои

2010).

строению для грамотрицательных бактерий и имеет толщину 60 нм (Ciferri etal, 1985; Torzillo et al, 1986, 1991).

Жизненный цикл спирулины в лабораторных условиях довольно прост (Громов, 1976; Ciferri et al, 1985). Зрелый трихом разделяется на несколько частей через образование специализированных клеток-некридий, которые подвергаются лизису. Фрагментация трихома дает скользящие короткие клеточные цепи-гормогонии, которые отделяются от исходной нити, давая новый трихом. Во время этого процесса цитоплазма становиться менее гранулированной и клетки приобретают более светлую окраску. Число клеток в гормогонии увеличивается при делении клеток, при этом цитоплазма становится гранулированной и приобретает яркое сине-зеленое окрашивание (Ciferri, 1983; Torzillo etal., 1986).

1.1.3 Химический состав клеток S. platensis и S. maxima.

Цианобактерии видов Spirulina platensis и Spirulina maxima являются одними из наиболее изученных и широко распространенных объектов фотобиотехнологии. Они обладают выраженным морфологическим сходством, но при изучении их биохимического состава и физиологических свойств обнаружены различия в количественном соотношении компонентов клеток (Cireffi, et al, 1985), которое может меняться под воздействием температуры (Olivera et al, 1999, Тамбиев, Лукьянов, 2009).

Биохимический состав цианобактерий Spirulina platensis и Spirulina maxima хорошо изучен (Vonshak et al, 1982; Ciferri, 1983; Reed et al, 1985; Ciferri, Tiboni, 1985)

В таблице 1 представлен общий биохимический состав клеток Spirulina биомасса которой содержит от 55 до 70% белка, сбалансированного по аминокислотному составу и приближающегося к белку куриного яйца. Содержание липидов в клетках колеблется в

пределах 6-8%, при этом отмечается высокий уровень моно- и полиненасыщенных жирных кислот, особенно гамма-линоленовой кислоты (0,8-2%) (Cohen et al, 1987), которую обнаруживают только в семенах некоторых цветов, в женском молоке и которая стимулирует образование простагландинов. К главным жирным кислотам относится также пальмитиновая (1,65%) и линолевая (1,09%) кислоты.

Табл.1 Биохимический состав клеток Spirulina (Vonshak et al, 1982).

Состав Содержание (% сух. биомассы)

Белок 55-70

Углеводы 15-25

Липиды (у-линоленовая, линолевая, пальмитиновая кислоты) 6-8

Минеральные вещества (Р, К, Са, Бе, гп, Мп, Со, В, Си и др.) 3-5

Витамины ф-каротин, Вь В2, В3, В5, В6, В8, В12, Кь Е, Н, фолиевая кислота) 0,8-1,5

Белок 50-70

В отличие от большинства водорослей клеточная оболочка Spirulina состоит из комплекса Сахаров, а не целлюлозы, благодаря отсутствию которой спирулина легко переваривается в организме человека, а её усвояемость по разным данным соответствует величине 85-95%. (Мазо и др., 1997).

Цианобактерии Spirulina platensis и Spirulina maxima содержат в своем составе широкий спектр витаминов, прежде всего витамины группы В, фолиевую кислоту, а содержание p-каротина в ней в 10-20 раз выше, чем в сырой моркови.

Основные пигменты спирулины включают хлорофилл а (до 1,5% от веса сухих клеток у S.platensis и S.maxima), (3-каротин, порфирин, миксоксантофил и С-фикоцианин, проявляющий иммуно-модулирующую и антиоксидантную активность (Boussiba et al., 1980; Рудик, Бульмага. 2000)

Спирулина относительно богата калием, железом, магнием, фосфором, кальцием, в ней содержатся многие эссенциальные микроэлементы, а такие, как цинк, марганец, медь, железо — в достаточно высоких количествах, причем минеральные вещества находятся в спирулине в основном в виде хелатных соединений, что обуславливает хорошую усвояемость их организмом человека, чему способствует «мягкая» клеточная оболочка, как говорилось состоящая из комплекса Сахаров и легко переваривающаяся в желудочно-кишечном тракте человека (Мазо и др., 2004).

1.1.4 Культивирование.

Одним из объектов массового культивирования во многих странах — Мексика, Бразилия, Египет, Германия, Япония, Италия, Франция. США, Израиль Таиланд, Китай, Индия, Тайвань, Румыния, Швейцария и других — является пищевая и кормовая цианобактерия спирулина, в первую очередь ее виды Spirulina platensis и Spirulina maxima. Известно, что коммерческое массовое культивирование S. platensis для использования в питании существует с 1970 года (Ciferri, 1983; Ciferri, Tiboni, 1985; Vonshak, 1997).

Поскольку спирулина является фотосинтезирующим организмом, то условия ее выращивания оказываются достаточно простыми: необходима углекислота, вода, неорганические соли и свет. Другим преимуществом является ее потребность в сильнощелочной среде (Dragos et al., 1987).

В 1980 г. общее производство спирулины составило приблизительно 500-600 т (Dragos et al, 1987). В настоящее время массовая продукция спирулины достигла коммерческой стадии с ежегодной продукцией 25003000 тонн. Будущее этой индустрии сильно зависит от дальнейшего развития исследований, которые должны способствовать увеличению

скорости продукции и уменьшению ее стоимости (Vonshak, 1987; Reed, 1985, Тамбиев и др., 2006).

В благоприятных условиях урожайность спирулины чрезвычайно

высока. Сообщалось о получении до 20 — 25 г сухой массы спирулины с 1

2 ~ м в день, а годовой выход сухой массы с единицы площади по расчетам

примерно в 10 раз превышает выход биомассы пшеницы. Выход белка оказывается примерно в 10 раз выше, чем у сои. Основное преимущество спирулины перед другими микроводорослями — объектами для массового культивирования состоит в простоте сбора биомассы, ее высушивания, в хорошей извлекаемости содержимого клеток и высокой биологической ценности (Dragos et al., 1987).

Интересно сравнить биомассу спирулины с наиболее богатым источником белка наземных растений — соевыми бобами. В расчете на сухой вес в спирулине содержится белка примерно вдвое больше, а ее урожайность в действующих биореакторах в пересчете на единицу площади превосходит сою в 15 раз по массе и, следовательно, в 30 раз по белку.

В зависимости от конечного использования биомассы происходит выбор способа культивирования — открытые пруды, фотобиореакторы, ферментеры (Torzillo et al., 1986, 1991; Tridichi et al., 1991).

Системы для открытого культивирования микроводорослей представляют собой искусственные мелкие водоемы с пластиковыми или цементными берегами и дном, воды, оснащенные устройствами для автоматического перемешивания соды, контроля рН, температуры, солености концентрации С02и др.

Принципиальное преимущество системы открытого культивирования в водоемах заключается в относительно небольших капиталовложениях для производства биомассы и использования свободных источников энергии, например, солнечного света. Такое культивирование микроводорослей распространено в областях с мягкими климатическими

условиями и высокой инсоляцией. (Wagener, 1987). Причиной успешного культивирования спирулины состоит в том, что её виды могут существовать в условиях высокой щелочности (рН более 10) или высокой солености (более 2 М NaCl) соответственно. (Vonshak, 1987). При таких условиях риск контаминации культур рода Spirulina значительно снижен.

Для культивирования Spirulina также используются закрытые электрические фотобиореакторы с естественным освещением (Bossi et al., 1987). Такие системы сочетают преимущества контролируемых фотобиореакторов, требующих больших капиталовложений, с низкой энергетической стоимос�