Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цианобактерии как возможные компоненты диазотрофных микробных ассоциаций и их влияние на растения

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Цианобактерии как возможные компоненты диазотрофных микробных ассоциаций и их влияние на растения"

ЛНЧ'ЖОВСКЛЯ ОРД 1.1 ¡А ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОПОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

Па правах рукописи,

'^ КАЛИНИН Аилпрй

ЦИАН!ОБАКТЕРИИ КАК ВОЗМОЖНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ДИАЗОТРОФНЫХ

МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАСТЕНИЯ

Специальность 03.00.07 — Микробиология

Днторефераг диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена на кафедре ботаники Вятской сельскохозяйственной академии.

Научный руководитель — заслуженный деятель наук РФ, доктор биологических наук, профессор Е. М. Панкратова.

Официальные оппоненты — профессор, доктор биологических наук В. К. Шильникова, старший научный сотрудник, кандидат биологических наук В. П. Шабаев.

Ведущее учреждение—ВНИИ сельскохозяйственной био-

в . ета

К 120.35.06 в Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская ул., 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

г.

Автореферат разослан

1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат биологических наук

Л. В. Мосина

Актуальность темы. Новая си стема землепользования - адчпп'п-ное земледелий, опирающейся на ресурсо-сберегающие технологии о максимальным использованием резервов почвы и растения п создании урожая, возникла, в.связи со сложившейея экономической ситуацией, 'энергетическим кризисом и экологическими проблемами (Жученко, 1993). Большое значение в ее становлении! придается исследованиям по регу-.. ляшш почвенного плодородия через стимулирование ила

определенны* ^»-¿о- лмлп

"¿гЗДмсшм пут«»-,' введение в агросиотемы запро-

граммированной ассоциации микроорганизмов. Оба пути ограничительными планками имеют степень изученности участников процесса и неполноту информации о результирующих на его выходе, учитывая множественные функции организмов, не адекватно меняющиеся при изменении условий среды. Более очевидные результаты часто получаются при интродукции микробной ассоциации в почву.

До недавнего времени основными объектами изучения являлись хемотрофные организмы. Информация, полученная в последние годи, привлекает внимание к другой группе организмов - фототрофным ция-нобактериям. Это типичные обитатели почв (Штиня.Голлербах,1975). способные образовывать от 70 до 600 кг/га легко трансформируемое, органического вещества (Панкратова,1979; Мезенцева,1986,1992) и накапливать до 30 кг/га азота (Панкратова,1987; Панкратова и др., 19В9; Резник,1991). До 50% продуктов фотосинтеза и азотфиксашга выделяется цианобактерияни в среду, в результате чего они воздействуют на растения и окружающую их гакрофлсру прижизненно. .Дианобактерии устойчивы к резким колебаниям влажности к туры И достаточно аетдотолерантны (Панкратова, 1989). Особенности этих организмов сожительствовать с разнообразными хе.чстраХными почвенными бактериями поселяхадимися в слизи, окружахщей их клетки, обеспечивают им экологическую поливалентность и эволюционную устойчивость. Это свойство программирует работы по созданию па основе цианобактерий искусственных микробных ассоциаций для решения задач агробиотехнолопш в частности, стабилизации еф$скта нитрагинизации и.интродукции в почву микробных компонентов поливалентного действия. Таким образом, изучение цианобактерий как возможных организмов для биотехнологии, их взаимоотношений с запро-. граымированной- для интродукции микрофлорой с целью создания высо-

комплементарных микробных ассоциаций представляет интерес для решения как теоретических вопросов микробиологии, так и практических задач биотехнологии.

Цели и задачи исследований. Цель исследований заключалась в использовании цианобактерий в качестве объекта для культивирования агрономически полезных микроорганизмов и в создании модели практического применения цианобактерий как вектора для внесения композита в почву.

В связи с этим, перед работой стояли следующие задачи:

- наделить из коллекции наиболее эффективные по накоплению биомассы и технологичности культивирования штаммы цианобактерий;

- проверить.наличие ризогенного эффекта у различных растений при обработках цианобактериями и композитами на их основе г

- -.«зработать систему получения аксеничных культур цианобактерий;

- изучить возможность культивирования бактерий p.RMzobium (R.galegae и R-leguminosamn) и Agrobacterium radiobacter с цианобактериями как единственными продуцентами органических веществ и исследовать некоторые физиолого-биохимические свойства композитов;

- дать оценку эффективности созданных композитов на горохе и . козлятнике. ■ . ...

Научная новизна. Впервые показана возможность создания устойчивых бактериальных композитов на основе"цианобактерий, как продуцентов органического вещества. Разработана система аксенизации, цианобактерий, давдая возможность создания новых комбинаций цианобактерий с хемотрофными бактериями. Показана комплементарность цианобактерий с бактериями'p.p. Rhizobíum и Agrobacterium, с способностью партнеров к длительному совместному существованию. Обнаружена высокая степень приживаемости, циано-бактериальных композитов в почве, обеспечивающая полноценную инокуляции, растений клубеньковыми бактериями. Установлена ' еффективностЬ' использования .. композитов Nostoo paludoewn-^Rhizobium galegae и N.paludoeum-R.le-guatlnoearum на козлятнике и' горохе. .• - -

Практическая ценность. Рекомендовано использование; циано-Оак-териальных композитов как способа усиливающего эффект нитрагиниза-ции семян бобовых растений.",; •■•:

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на• научных конференциях Вятской государственной сельскохозяйственной

якадеми: ( '991.1992, !99Э, "994), IV йееоек.:;К0!Г Я2ута>а конференция "'А'.;;росргиниумп в со.дьеком хозяйстве" (Пукино, 1992), Международной конференции молодых ученых "Экология сельского хозяйства а перора батывакаего производства агропрощкиснного комплекса" (П;.~.;но, ч^уч).

Публикации. По теме дооеертйшот опубликовано 6 работ, «лн* ь.ч ходатся в публикации.

Структура и ооъйц-диссертации. Диссертация изложена ия 1е-"7 страницах машинописного текста "-"--- я3 »»»*""".';, 4- »лип п »л» . "¿„¿и ун*"13 " .„ч/л*«!!. игблцографня пред-

„„,„„„.--_ _ ,_.тетссть«1шюгл и 92 иностранными источниками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы цианобактерий. Использованы шташы циаяобактерий коллекции кафедры ботаники ВГСХА. При отборе штаммов учитывали скорость накопления биомассы и азота, легкость отделения от культуральноЗ среды и последуквдей гомогенизация.

Циавобактерют культдачрепзля на жилках «»»азешг-тмх ср^дчх: Грдаоьа Я»> (196%), ВО-11 (Мрркв а1..Н7«» и М (Гаха,19ъЗ) ь колбах Эрленмейера на 100 см , в л»*.вп»остчто пр» ссьеп^на^сга тис. лк и температуре 22-25°С. Накопительные культу г" в»исл»ктр р-л'Л получала на среде Громова Кб с кеттсхах колб.« смкост»в ЗГХ:

Ч

см'} длительность культивирования 1 ме^яц. Эта же среда неполно ?9яяя. при совместном культивировании иианобактернЯ и ?:••!>•*

Для р.ксенизвцви выбран аггакч Нпг^ос ; ;>1и<1ор.г.::\, 18 как пгм*алп-г продуктитпл при культивировании и роэультатэт?1"^» «нредедеюго рнзогАнного иф$чктп на ароростка*' различных растения. Кпои» т—. он обладал наименьшим разнообп»»»^: ^ р'П-г-гтутннк'п, >«.•>.-. .•. ия ¡¡.г микробиологических су лиг. Лгпачч'.'г.! аии »"•тсди^е,

У»1Г»"ПГЗТ.:1ПЯН'» ИНСТИТУТОМ "ПКРйС^АИОИШ РАН, кофёдрой МШфОбИОЛО-.г- приводимые в основных руководствах по микробиологии.

Изучали объективность следующих приемов освобождения нит«-бактерий от спутников: термическую обработку (многокротисе прогревания культура ¡три 45сС, разовое - при 60°С и ?0°С); механически отделение слизи циапобактерий путей 5альтрации чярез зсбостсвый фильтр; обработку УФ-лучами лампой ПРК-4 (с расстояния 30 см при экспозиции 2,5 и Ю минут) п антибиотиками - гент^мацином, тетрациклином, левомицитином, рифампицином. "Индивидуальную чувствительность микроорганизмов к антибиотикам устанавливали с помогаю анта-

биотических тестовых колец фирмы HEINRICH MACK NACHF.CHHi. При установлении выживаемости цианобактерий применяли' трифенилтетразо- . : лий хлорид (метод Ивановой и Михайловской,1962). Кбнтроль чистоты цианобактерий проводили высевом культуральных сред на" среды МПА, Эшби, соляно-киолотный гидролизат' казеина и микроскопированием нитей цианобактерий. ' • -. ■

Штаммы хеыотрофных организмов были получены из .ВНЩСХМ:-Rhizobium galegae шт.0702 и шт.0706, R.leguminoearum шт.1022, Ag-robacterium radiobaoter шт.1? и A,radiobaoter ит.Ю rttr Btrr, ус-.' тойчивый к 40 мкг/мл рифампишша и 500 мкг/мл стрептомицина.:Куль^: тивирование и выявление Rhizobium проводили на бобовом агаре,' A.radiobaoter - на агаризованной (с содержанием агара 2%) среде. . ДАС (Берестецкий и др.,1985). „\- .'•'

Биомассу цианобактерий определяли по. сухому веществу и по оптической плотности на спектрофотометре VSU2-G (Carl Zeiss.Jena.DDR).

Численность клеток . бактерий определяли по.•стандарту мутности я методой высева из разведений на плотные среды. .,

Нитрогеяазную активность методом ацетиленовой редукции , ■' .' (Hardy et al.,1973). Хромзтографичеекое разделение и детектирование исследуемых компонентов в газовых смесях проводили на хроматографе "Цвет-101" ,с пламевдо-ионизационным детектором й колонкой с Рога рак Q. В качестве газа-носителя использовали aproii с подвижной скоростью 50 мл/мшг. '.,'' './/■'■ :

Содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry etal., 195 Ризогенный аффект изучали на 5-7 сутки после обработки семян: гороха, редиса, салата и козлятника цианобактериями и композитами.

■ Проращивание проводили в чашках Петри в термостате при, температуре 20-22°С. Повторность шестикратная. Количество оемян в одной ':.•"• повторности брали согласно соответствующему ГОСТу (1991). Промеры корней проростков осуществляли в течение 2-3 часов, количество -.-•,-: измерений колебалось по культурам, составляя от 120 до 600. Использовали шесть сортов гороха ксйшекцшгФаленской селекционной ;У отанции (Кировская область)? Красноуфиыский-70,' Лучезарный и Надежда (районированные) и три, находящиеся на размножении -А-16620, А-10666 и А-174955 два "сорта редиса - Вюрцбургский, Заря и одни сорт кресс-салата. Вегетационно-лабораторный опыт с бактеризацией семян ставили на. промытом и прокаленном песке в стеклян- • ных сосудах емкостью 1,2 л (Журбицкий, 1963) с сортом гороха Кадеж- .

да. Схема опита видна из рисуцка i>.- Количество кнскулша приведено, а тексте..'Влажность* песка поддерживали на уровне 60$ от полной влагоемкости в контрольном варианте полной средой Кнопа' {10-ти кратной концентрата),, в варианте- с бактеризацией семян - той же ', средой, тю о исключением азота. ... ...

Полевой опыт с горохом проведен-на дерйоёо-подзолистоЯ средне-_суглинистой почве "со следуххвдши агроыашч»"^«---„.^и-г*««»»*- "-p^ef>16,2.!- fC.4 1Í.¿V 40,1 иг/

v-ri n«""- оснований 15, гидролитическая кис-

лотность 1,4 мг-экв/ЮО г почвы. Перед посевом внесены удобрения в форме даамм'офоса (N 36, Р 96 кг/га), калийные в форме хлористого калия (К-63). Шющадь делянки 1кв.м, повторность шестикратная. Схема опыта включала три варианта: 1. Посев семенами без бактеризации (контроль); '2. Семёна обработаны.R.leguminoBarum шт. 1022; ■ ■ 3. Семена обработаны R.1 egurainosarura-Microchaete teñera.

: , Полевой опыт с козлятником;Сорта Галс проведен на дерново-слабоподзолистсй Ореднесуглинистой почве с агрохимическими показателями: рНкс1 5,6; гумус - 1,73%; Р20^ 36,4 , К20 32,8 мг/100 г почвы; сумма поглощенных оснований 6,8 , гидролитическая кислотность 3,4 мг-екв/100 г почвы: степень насыщенности основаниями 69,3%. Перед посевом был внесен двойной суперфосфат - 90 кг/га и сульфат калия - 90 кг/га. Схема опыта аналогична, но вместо М.teñera использован N.paludosuffl (рис.5).

В вегетационно-ляборзторном и полевых опытах определяли динамику появления всходов, ксеромяссу.надземной части к корневой системы,., площадь листьев' (методом высечек). кг>.«гтгс7Ьо клубеньков (в полевых пробях - ~ Монолите 0,25 м ). Содержите азота в ряс-тешш определяли методом Кьелъдаля. ,-■■■•

МлкроЛиолсгачоский-статус почвы при бактеризации семян изучали'путем учета в динамика численности аммонификаторов, олигонитро-филов, клубеньковых бактерий, водорослей и циянобактерий (совместная работа с А.Л.Комтпсй). Видовой состав фототрофов исследовали с помощью прямого микросколирования, чашечными культурами со стеклами обрастания и постановкой водных культур; численность клеток -определяли'методом прямого счета по Виноградскому в видоизменении Штиной (Штина,1956).

Статистическую обработку експериментальных данных проводили ...по' Попттсттстеому (ПояповспокиЛ, i960) па теомпмптсро: ШГ РО.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ЮС ОБСУЖДЕНИЕ • ' ; ■ •

1. Выделение перспективных штаммов цианобактерий для создания биопрепарата • .

Музей фототрефных' организмов кафедры ботаники ВГСХА к настоящему времени насчитывает 101 штамм.цианобактерий. Рекогносцировочный анализ, основанный на наблюдениях за -состоянием культур и скорость» роста в стационарных условиях, позволил выбраковать штаммы не представляющие интерес для целей работы. На основании . этого оставлено для испытания 50 штаммов, которые были в результате дальнейших исследований условно разделены на три группы.

Группа I объединяет штаммы, обладающие высоким.темпом роста и накопления биомассы. По характеру роста ето штаммы, образующие в жидкой культуре на средах Ы, BG-11 и Громова N6 колонии во взвешенном состоянии, с,хорошо заметней слизью. В группу II отнесены штаммы, для которых характерны средняя скорость роста й взвешенное состояние колоний. В jppynny III попали штаммы, обладающие очень слабым ростом и донным или поетенным расположением колоний. В результате селекции для работы оставлены.следующие штаммьи \ М.teñera шт.9, N.íinokia шт.21, M.musoorum шт.13, N.paludosum шт. 18, Т.tenuis шт;17 (табл.1).'В этот список такие были включены 2 штаммаг С. puno ta tum. шт. 70 и безгетероцистная циавобактерия P. inun-datum шт.8 по следующим соображениям. Виды CyHndrospermua широко распространены в почвах Нечерноземной зоны, часто выходя в дома- v иантный видпри "цветении"почвы. P.inundatuffl npMBJieK вниманий в.;-овязи с быстр!» ростом в культуре по сравнению с другами безгете- ■ роцистными цианобактериями. : .4 '.;{: ; V ... ...

Таким образом,>яа первом "этапе работы -удалось провести скри- :. нинг, имеющихся щтаммов цианобактерий. На основашш 'его ваделигь культуры интенсивного роста.» накопления' биомассы, азота и установить, что оптимальной средой для культивирования оказалась среда .Громова N6;. - ;:-'.:V'.v ''4''.•. •■ "О -."'

- 2. Влияние различных штаммов цианобактерий на рост корней ,..' г проростков (ризогенный еффект) .

Ускорение роста корней проростков при инокуляции цианобактериями (ризогенный эффект), связан со способностью последних выделять в процессе жизнедеятельности спектр физиологически активных

Таблица 1

Характеристика роет» и'яакопЛмтая йротп перепективиыма :. ..штаммами циавобмктерий на среде Громов« N6 и ВС-11 (ь мг на 50 мл среди зя месяц)

Рид , 2!?эмм

[К седом&сс& на ор»л а х

! Громова I ВС.-.11. ■ N6' !

Азот на среде

Громокн N6 _ __ накоплениеI содержание в'клетках в клетках,

......... -».. - - " —'

Су 11 пйгевпвтт »»_...,. ' 9,70

^иьиКГЬЯТ!"»'.'"1" " '*.,"' 3.57 2.56

4ьа 31,4 6,12

Нов^с 11пек1з,21 75,4 85,8 6,60 8,75

и.шзеогш, 13 154,5 60,8 7,40 4,78

Й.раХшЮеиш, 18 60,6 41,3 5,08 8,38

Йгот1й1т 1пип<1а-

103,3 61,6 - -

То1уроИгг1х' геш1в, 17 V.109,1 40,7 4,06 9,70

Примечаете. При культивировании р.1пипйа1;ит,8 в среди добавляли КЖ>3 (1 г/л). ■

веществ, таких как витамины, индолссдержаеие, цитскиттподог.нио и гиб<>реллшюкце вещества (СЬаиЬап.ОчрЪа, 1084; Кс?.тшпя,Сир>*нко, 1Ч8Я; Аняреик и др.,199''1; Кучкярова, 19'Л>) ■ В опыте кепольроввла рястония гороха, редис-) и креес-сплвта, проростки которщ рпсьми чувствительны к присутствию В среде стимуляторов роста (Ке^ГИ, 1973).

Рыло тюкчпяно, что для рчэных растения существует своя опта мальняя доза .инокулята, за нижними пределвторой ргеогенвиЯ аффект межа» отсутствовать, за веригами - переходить в ческое действие. Полявяч^ «^вленп'у ропных стяммпв ш'.тг^чкт'-я-й в различной степени. Например, наиболее токситшд» иг» "оли-с-иньи оказался Я.ИпекЦ, ят.21. Оф^кт:при обработке семян гороха и редиса безгетероцистной формойцианобактерии Р.1пип<1а1;ит шт.8 варьировал от слабоположительного до ингибирукщего действия, что > последующем заставило отказаться от'ориентирования на эту цимно-бактерим.

Оптимальная доза инскулша для -другая ничнобактерий составило •по ксеромаог*«» 0,07; 0,03 и 0,01 г на 100 семян гороха, редиса и салата, соответственно. .... . ---

Наибольшей число•положительных случаев отмечено при обработке ;семян редиса я салата, меньше - гороха (таол.2).

Эффективность обработок семян .гороха* -"..., \ - •'•. рйзогенному действию .

Тао'ляцо ¿ редиса и оплата по:

Цианобактерйя, итамм Число," опытов с полоя&тельным результатом,й

■ горох - | •■ i редис-, ,- салат : от. общего числа.опытов

C.punctatum,70 ■ ib,6 ' 75 : - ' "' loo :: ¿5,5 ■"•..

М.teñera,9.■■■ ' --33,3/ ' 100 Л 100 ' V 63,-6- -

N.linckiaí,2l. 16.6 "" - .50 ■ ■:. - . -.100' " 36,6. •

K.muecorum.13 ■ ■-.' -16.6,- ^ -100' ',' -100' • 54,5

fj.paludosum, 18 : '50.0 v. 100 "■ ' VJ-O - . - 73,7 ; '

l'.ter.uls, 17 . ' 33.3 , 74 ■ - '00 - 54,5 .-.

Различные сорта. ;как видно.на примере гороха,. tíc¿ разному отзывались на обработку'.цйанобак^ериями. Наряду, с сортами, малоотзьсэ-. чивыми (Лучезарный, - А-10ёб6 и А-'7495), су^етг-уют сорта, на кото-, рых риз'огеаный вффект был." сильно -»¿¡ражен - Красноуфимекий-70 . (рис.1), и Надежда (рис.2).

A-foáíá.

A'W9S"

kfacm>жне*м-Ю Лтзориый

Рис.1. Влияние цианобакт<:>рий на'рост корней .у-проростков различных-сортов гороха (ом). : - 'W'' '." ■"■..-'•• ' .'■.■"' .-';■'.-

Обозначения: 1 .Контроль • 2.C.puttcstátüm,70 , 3-M,ter)era,9 í.N.musco-rura.13 . 5.N. 1 Incida,21 6.W.paludoeuffl. 18 7.Г. tenuís,.i7. . . ...:.

Сортовая .реакция, на обработку, дааНббактериями' может -быть объяснима метаболитичеекими' особенностями, выра:котошисп в неодинаковой потробноста.в определенных веачетвах микробной природы. ■ . - .

Таким, образом показано* что -цйаноСакте'рии.'вызывают ризсгершй. эффект при проростзнии семян.Наиболее- аффективными.признаны М.teñera шт.8 и N.paluáosum шт., 18,, которые, были подвергнуты дальнейшему изучению.с целью создания на их ослссе высоксмплементарных кем-

ом

¡ ..

20.191817.16-

3- ." " '

• 2- ' ■

. i 2 3 4 5 6 7 / варианты

' Рис.2. Влияние цианобактерий на рост корней; гороха 'сорта Надежда.

v'•'Обозначения вариантов аналогично рис. 1. Ч--г->'— длина'-основного

',' корня; пунктир - еуммарвая длина основного и боковых корней.

Оинаций с хомотрофными бактериями. Однако, их создание требует очистки цианобактерий от природных слизерых спутников, которая затруднена из-за отсутствия четких прописей, позволяющих достичь желаемого результата.

3. Акоенизация цианобактерий.

В литературе описаны многочисленные приемы освобождения цианобактерий от сопутствугеих. микроорганизмов, однако общеприняты* ...-приемов получения чистых культур ш»1""<п!гг*рий нет Цнлрошк и др., '. 1990К Mu гт!.-:-,ьили u<Vb разработать систему получения вхгоничцщ культур цичн.-б,1.чт>»рнй. Моленью для разработки прописи акеенизяциа поглужид aiíHWM-.N.pálüdosun; который, имел наименьшее разнообразие и : титр бактерий-спутников'.-■,. -.'...'• .

•; • -'V В начало работы определяли, степень яагрязнонйя цианобяктерии _ ■ С , troMofflwn'просмотра и рысеич ее культ,ура.п> ч"й ср'.-'лы на с:'-/'.KTi'b.HíJf силы ШТЛ, эдем и Чапека. Титр бактерий-спутнике н у ««^¡'шой-культуры H.pnJttdOsiBi кол»бался от 22 Л до-10 млн ■ кл.-А/.ч и г,к,т ,трлдстп?>,»*>н poto 1 штчммчми. По предварительному -

smuvwnw» гн-ргий спутник.сил отнесен к Piávóbaoterium' sp. , второй , , х r-.««í;W"r,'!ru> Ър:,. третий - к Arthróbaoter яр.

- П'опуткя очистить ЗО-даеьяую культуру N,paíudosum одноминутной

одно^атцрЯ:о6|>20а^^ успеха из-за ги-

боли цианобактерий. "';' . :-'У'-'''.■■/ ' -.'.'У •'■'•'.';' ..-''.'л;.-

' лампой ПГК--4- о. расстояния .-•■'.'-

... .■ 30 сн с вкепозидаей 2,5 у. 10 мин не зызкваМ'.эл^мкнадаи/шташов^:',;■ -" бактерий и только '- временно пейв^ -

; яние. ;Риск. получения мутантш« .фс;зм 'заставил; отказаться; от этого'; >'*. • • приема. •.'.-.'":»;

; ;; ',■ '. Пропусшше'.трихсмор циштобрктерий через асбестс1;ий фильтр, -.*--.'■:

приводам к'снжкешно титра бактерий с'22,4' го. 1,5 -ляг кл./м,п ере. "ды-[ииекртод^/оед^^ Отот приг-м цо,т>н:ссбразно '-- использовать в начале; работы по океенизащш, _ так как а'оьооовд>Ш!е трихомов, 'от:,олизй;делает1 орлее 'ДЬстзшными. к.воздействийзнти-:' V; . бактериальных агентов." . •,- . , •• . - • . -.4/ За основу.си. взят метод очистки циансбактериЯ' с иепользсвана-!.;• ем антибиотиков. Принципиальное отличие новей технологии .от общо;: известной,;¿акдачаки^йЬя^В; попытка? \"ф{^тальнргча воздействия нч -■■.•.;.

■ 1 бактерии-ситники;' состоит в. ¡»лй-чаправлецном дейстнии на/о^еде-

ленвдй

. вовали последовательные операщп!, имовсте ;целью подбор препаратов '' с бактерицидным оффектом, нап^звлош1ш на хемотрофкый компонент и У !• 'аднедременвю. фа^^ериэ^ой." «летке. ;'„• -'л

.. На селоктившх. агаризовашых средах, в чапках Котри получали ' газоны. к'рнкр^тйыхГбак^^^^ *;

■ тестов^ кейвд^

,. зонах/ вщ^щв^Щго;--..бдааге,;, Антибиотики^ Переноси^> , ■ше |дааноб^'терией,

':'.■'никол '(левсшдатин), тетрациклин.и гентгшкцик (табд;3). '' -' '.„;

.:--""Ч-":'^V^.;О.-^ -Таблица 3 ■■Л' Чувст1&тельна0ть;ЖрзХЫр'8^;'Х'■сШуъсувущих бактерий к ? л,; ;.-. ( :•;-': V.--- действии адтибиотиков (зоны лизиса; ш) •: -*;;'..

Объект ' ' : ■ : Антибиотики ■■ ''■' • г ■ '.:'..

А - СР С. Ж N1' 0 -Цй

Я.ра1ийрвиа, 18 -. г1а70Ьасгег1ит вр Рееийотопае ер. А^ЬгоЬаргег ор. Примечание. Проче| Условные обозначь Х-тетрадиклин, 0-1 КА-надидоксиновая. оацаллин Р-пеницг жи'с шя: 'ент* КИМ [ЛЛШ- гзна^ к-ш юта, с, 4'. 12 ' 15 ¡вют ши® Ш.1 "•'55-•РВ-г ■ 1. ' 8 ' 8 отс5 Ц1Ш >ерр урик • 3 15 гтет! 1,. СР !ТрО(. сетог мкс!' : ю ше;: опдо ФИм/ кяг 5алоз ¡,. № сум 14 •7 здёис 'ИН, '-НИ! 4ЙМС 1Роф1 »такс ВДрак граН1 •азш фш от, 1,0- ¿кол ОК-.

,:. ..;-''ú* -медущем ртапе устанавливали время експозишя цнанобчкта-■ рии с зятибиотгагоми и подСктали цо.^гншч^'ВОЗ'рабтежгт- егй'кон-.1КНХ1ЙШ», 'ЯвтадаЛу^-Жт'-^«ítepult-cnvтникп, двкшую гарпнтию вос-' произведения псяулячии цааяооэктврий •• -Через определенный, интервалы времени клетки- и для уста-■ ковле|Ш-А "wws!!?ciioooÖHcoT!: гтемрвтм в сеея.7» среду Громова с 0,075%. (по конечной концентрации1 тр1^°™лте^озолиЙгхла^Д0М,.'''Йя 'следующий день_.до. наличия"Йяеткдх гтатотчлдов форкззаиз. ~ . -------- '' - ....

цент" быкиеикх

' 1000 '■800 -' - 600 -400 200

.. .'А:

¡> «Г

- 100 90-СО 70 ."

300 *?50 200-, 150-шо. ' 50-i

■ 100 •95. ,

1 Т~~2 5 ь~

'••'.""•'■■'Б'

>0

■250"

200 150 100 50

1

>0

3 ¿ *

б'

:.3. Чувствительность клеток H.i-ali.'dcsun к действию антиСяоткков - '-с-ртъчпбя, Улортетрчциклин, Р- .•'»вомищггкн). На оси абппсс гр-'-мя зкепозиш! в час: из л»вой оси - концентрация зн-

в мкг/мл: на правой '-си - процент мертвих клеток.

С п-меаьа т!тз!япп«2д...(концчятрацйАÍÓÓO мгк/млвкспозич»«

б часоЕ)' Ку.тьтур'э' fí.paludosuni. <йдо» "ст ¿"lavobaetertira >?p.

Пятшсг.зтнег: crpu..'ÓTK8 л^рсмеиптянсм (через кзгхые 24 часа, feil-. . цеятряцдя 2СС мгк/мл, экспозиция ,3 .часа)- ¡позволила "влимгаировзть Pseudo'sepao- si¡*: Однако,' эти■антибиотики.были неэф$ектавйы для оо-" вобоудения от Arthrobacter вр. jмаксимальный титр клеток которого: достигая в''культуре гаанобактеpira-400'тне.7ш. Для' уничтожения , этого1 спутника 'Я' БЙвёдения клеток из персистентного состояния провоцировали его размножение на среде ня .основе соляно-^слотного гидролизата. казеина е. -пой^едувясй' обработкой рифампицином и гента-'мигйпбм. Многократное последовательное сочетание провоцирования. : ■'. размножения клеток спутника с обработкой айтибйотиками: не дало »е-; ..лаемого,- результата, что. заставляет предположить неслучайность его

присутствия в слизи цианобактерий. Дальнейшие исследования'показа- V: ли, что АгШгоЪа^ег не* проявляет; антагонистических отношений. .■>:. к подселяемым в культуру ностока„бактериальным партнерам. Вместе с ' тем, при проведении физиологии о о ких исследований &то„т ёйутник пере- -водился в '^тентное состояние.,, когда он временно терял, с-нособнбсть к размножению, обработкой цианобактерий рифймпицином и гентамициром • , / Методика была: апробирована'на двух -других штаммах циано'бакт'е-••-" ' ■рий, имеющих. первоначально значительно..большее'загрязнение-•-.'•' Ы.puпctiíoгmв шт^гТЗ И.^.тизаоИзт -шт, ¿72 .'.. .•'-■■'■''- .":/. ; .

. Изложенная последовательность манипуляций по очистке циано- " " ' бактерий, в&яюч&ювая ^е'^'рйв.янйв даа\най«йе сли?ввну,-ба1«т^р1?Й-', ".. спутников .'■ {микроскопический контроль И виста на селективные среды)-, частичное ос^^оаденйе.%трИХЬмов перед стерилизацией от ,слизи (с 'Л' V фильтрацией месячной; культуры,-через асбестовые" фильтры),.; у'ст.энов-,. ; ление отдаидуальнйй •'яуэе»вйтвЛ1лое^;'й: антибиотикам, цианобактерий и сопутствующих бактерий:(е пpмQщi'ю^.антибиотических- -тест-колец)':,. : -подбор рабочих',- концентраций ,й времени, обработки. цианобактерий (по/ -контролю' с ИХ), целенаправлённЬе уничтожение -отдельных спутников, -по типу стрельбы по :миаен^(/дает.до^ ;

мы цианобактерий.. При втом результативно вдет очистка'6т большинства бактериальных загрязнений, но не всегда-гарантируется освобож- . дение от,симбиотрофных микроорганиамов. иногда одного-двух ЕИДов. ■

"- 4. Составление иикробных. композитйв на основе. цианобактерий ' '.' и взаимодействие компонентов . . ; '-'-/.'' V- V '

Наличие очищенных,от загрязнений цианобактерий й потенциал,ь^/-* ;-ная способность последних образовывать новые ассоциации, ключевым •; алементом которых .является автотрофный партнер как единственный" продуцент органического 'вещества в микрокосме, обусловил^ создание*;.: программируемых' композиций,', отличающихся '.от монокультур высокой /:..,.. толерантностью к - неблагоприятным , условиям и тюливалентностъю действия . ; '-'.'■:'/>?'-г'' '• '- ';; •■'; ■ ■; •'■.".'•'''• <■'

В качестве программируемых вседенцев в слизь цианай .адбраны ' ''■;■. два микроорганизма семейства КМгоМасеае: ыиы рода. Rhir.ob.bai и / А®гоЬаогег1цш гаа!оЪас1ег. Возможность/совместного .их применения ; : изучалась и ранее (ВЗааГуе,'19б2; Перминова,1972.;. Штина.'й др.1972) .. но прием не вышелиз.ра^ж попыток, т.к.'исследование"действия4. ;'. ; компонентов проводилось с. использованием, но аксеничных культур =', -

цианобактерий {альгологйчески чистый материал). Эффект_ поэтсму зависел не столько,; от, -ИйтгояущтрушйГбвктёряй* гом ояадаемого : действия 'композита, сколько от побочного, действия загрязняющей микрофлоры, вззимостноз!?!гия которой со. слизевоИ микрофлорой ш»<>-. HoQaKTepitít' .тр?яно''^йло ;тгреясказатъ. Естественно, что для исследования взаимоотношений цианооакт?рий с искусственными вееленцама, ■ необяодамы бкли дулыгурн,- ср.обогже'от сбпутствутааей микрофлоры.

■ Совместное культавяров&ниА 'ч.^"■•t^T-z. ^'í.^iá- &'.'. ¿i.G70¿~ ¿-й;i / н* ' fefeaральноя. среде Громова

¡J5 показало* что йсхШт'онные бактерии не обладают агрессивность» " по отношена» к. ностску'.' Достоверной-рйггатцы'"в размножении клеток -' ци'аноб&йтерк::' в монокультуре и'в сэМавс композита не отмечено.

Так, оптическая плотность «metes кульгуры. íí.paludosum на 10-е сут-: ки куль'гйБирсватгая била' 0,93-0,02 , в варианте с R.galegaé -

<í,$8«j.Ó3'¿ h 0¿?4i&,04. Чнслёнкость клеток ри-

': забйй. íofcjie"царалЯельйс массе '■ ностька;- tVe»" вселяемые;¿актерки' су-шествовали-эз Ьчет .органических зыделекнй ностокз, ксеромасса • ко-

торого через месяц возрастала с 5.4+0,93 до 52,552.7 мг/30 мл сре-

ды (ряс. 4).

e3i¡ б -

54

3 4

2

МР

50 40 ЗОН 20 104

сутки л

Ряо.4; »яттсмика роста*Н.рз1и<1овмт я в бикомпозитэ.

Условнее обозначения: А - логарИм численности клеток 1 мл среды, В - ксеромассэ Д.^даоэш, мг/ЭО мл.среД».'

Нктрогеназнзя активность монокультуры Л.раШоета была сравните льво невысока, в то же время, в композитах, она достоверно увеличивается (тайл.4), что' 'сшровдкдается достоверным увеличением белка в композитах на 10-е сутки (табл.5).

Последующая. опыты,., цроведеющ*. сотрудниками квфедрн показали, что.бактерии подселяемые к циакеям активно колонизируют их слизь,

капсулируясь в ней.'. -••■-.-.....■'- .'' ■ ,, .

*^ысим .осразец;- УДачный' состав..щтвзюъ,/розмбжность ел> длительного сохранения и функционировать, позволил перейти к. изуче-

шш влияния композита на растения.

-■..-■ ' ' '. . . ' ';;.'■'.•'■'.'. Таблица-. 4

'¡итрогеназная активность монокультуры N.paludosum и ; композитов'.

Вариант . , С,Н} (нмрль/мг белка в.мин)

: - сутки -культивирования

4-е. ;6-е. •' ■ ^ -. 10-е

Nostoo paludosum шт-. 18 N.paludosim. шт. 18 +*• . R.gàlegae шт.0702 ; N.paiudoeiim шт. 18 + A.raàfoba.oter-шт.17 - ' ,0,20î0;6l 0,22+0,01 0,53+0,08 0,2.9+0,10 '0,34+0,06 0,4?-.0,07 0,42+0,05 .1,09ï0,17 ' ' 1,10+0,02

«" ■. - ; ';■-■ - ''-Таблица 5

Содержание белка в монокультуре-M.paludasun - .-.и в композитах (мг/ЗОмл среды)- ■'" - '•-.'. -■•'

■. " . Вариант ' ' сутки культивирования '"-- '-'

■ 4-e, ; 6-e • -•-10-e' :•

Nos'tDc paludOBum шт.18- N. paludosum шт! 18 +'. R-guletfa« lUï.OYCté , - N.palndoeum шт.18 + '.'-A'.radiotoaoter шт.17. .2,20+0,08 •2,62+0,¿0 2,37+0,20 ■2,93+0,15 3,56+0,28, .4,00+0,37 5,28+0,1$

'/ 5.1. Влияние микробного композита на козлятник восточный/ '.

-.'Культура козлятника была выбрана благодаря ее чрезвычайной ■ специфичности к клубеньковым бактериям, которая не •развивается на ' вновь осваиваемых зёмлда без бактеризации/семян, что дает возможность однозначно проследить за еффектом инокуляции. ','-.'-. • "

- :Рнзогенный йф$ект/цри обработке семян козлятника микробным ' '■композитом оказался весьма значительном: .длина корней проростков увеличилась в восемь раз по сравнению с,необработанными-семенами, ■', (при обработке одними цианобактериями - в,четыре 'раза). Обработка \ семян только штаммами ризобиума,также 'давала-достоверное увеличе.-. ние длины корней проростков, но.ризогенный аффект был Значительной ниже. .',-"•.•''." . ' '. ■ . . * .""';.'-' '■'.'• -'*-■"

В полеЕом опыте^композит на'основе цианобактерий значительно "увеличивал анергию прорастания семян (рис.5). Это во многом онре-делило последуицую разнвду в состоянии -растений! (табл^ 6 ). •• 'у •' I". •'-, Наблюдение за козлятником на второй годжизни после обработки. "

количество всходсв

-225" 200 150

.та. -100'

18... „АМ'З- - , !2.06 ' '19.0? дата

. Ра5.э«&«!вмикв"1тскрл?1нпя '^с^одсч? ксглятнгаса при бактвсиэчцая ееивя 1.Обработка семян пт.07иь. о - ' '

_ti.no:..л»—' " -,^-^.и..-.-

'-,-•""'' Таблица б

Влияние бактеризации сект на разгит'ие козлятника (первый год)

Дата Вариант-' ; ' Надземная часть.г/м^ о ■ Листья на ч Корни, гЛ/ Клубеньки, шт

гигро-массч ксеро--мэссз' ,ГИГрС-|ПЛа-- • масса. ' мг пегро-масса ксеро-мэссэ 2 на м на 1 раств ние

11.07 192.0 ■'4о;о • "' 124,41 .1.244 171.6 49,0 ,- . . -.

д. ' ТСТ.О" "ТОй'.з} 1,*988 223,2 64,4 - -

10. се 1 299-0 - 1?а,5 20Г|, 5 | 1,61-' 365 96 7970 105

2 629.5 '¿в '1.5 ¿32.0\ 3,0^0 1331 3 од 18370 117

Вариант 1-обработка грмон пт.0702; вариант 2-обработка К.иаХс-дач щт.'Л02 1 И.р«1'дг,08и» шт. 18. Нгнпца между контролем и огштс«~ достоверна по показателям кя уровне 99.931

• бактериальными пр?тэрэт9«я подтвердило явное преимущество бикошо-зита по сравнению с моно-препзгатсн (табл.7).

Таблица 7. .. . .

Влияние бактеризации с<*мя-н.дагразьити.* козлятт»кз'-; образование - •.■—■■..-•-:- и--азотфгшсайий 'клубеньков, (второй год)

Ксеромасеа Корневая система ка 1 >/

I вари- надзетгС объ- кеоро- К.Ч V'? :ныо!

анта части.2. укоса,ц/га ем, . СМ^ ; массй,- . г - - - ИТ-.' -. с,,Нл нмоль мг".1. сух. вещества к'г/га

, 1. 79,79. . . .2.090 .'-680'., 13756 2.71 18,4172,2

2. 97.30 4020 1080 26240 3,76 24,20^1,0

Пг™ечание..,.Вар;шнть!,1,яналогК1.пш та<Шяю''Я.' Рвзятя'18'Иеж-«у"контролем и"опытом достоверна по всем показателя на уровне 9.9; 9!?. ' ' •

преимущество, обработок ; мга^бвым'-^ по сравнении с чисто®

культурой -клубенькзвА Сачтер'Дй. ; .' '■ '

г 16

5.2. Влияние микробного композита на горох

Влияние микробного композита на горох било изучено в вегётаци- ■'; онно-лабораторном опыте (прокаленный речной песок,, сосуда емкостью ; 1,2 л, увлажнение питательней средой Кнопа) и в полевых условиях.

В строго контролируемых условиях вегетационного опыта.обработ- . ка' семян гороха микробными препаратами заменяла .применение минерального азота (1 вариант, рис.6 и 7). Так, в варианте с азотом, средняя высота растений била«59,7+2,2 см, в варианте с обработкой семян би- и трикомпозитом - 68,5*3,2 и 63.6?0,9 см, соответственно. Цлощадь листьев и ксеромасса надземной.части в вариантах о бакте- ' ризацией семян (пределы колебаний по вариантам - 544,8-579,0 см , ' 2,31-2,49 г, соответственно)была достоверновышеконтрольных. показателей (462,9 см2 и 2,0 г, соответственно). Та же картина была получена при анализе развития корней: ксеромасса и объем корневой системы после микробных обработок были выше; чем при использовании минерального азота (рис.6). ■"■'.,' ' .

При сравнении действия moho-, би- и трехкомпонёнтных препара- -тов стабильный аффект.был при сочетании Двух партнеров: Nostoó-' Rhizoblum. Как и на козлятнике, обработка семян бикомпозитом lipa- :. водила.к увеличению количества клубеньков до 491' тт на сосуд против 326, где инокуляция проводилась одним риэобием. Клубеньки отличались достоверно более высокой нитрогеназной Активностью.

, Несмотря на то, что агробактерии хорошо приживались в ризосфере (раздел 6), введение их в композит оказалось малоэффективным. По-видимому , вто связано с нереализуемость» способности агробактери!) ; к утилизации труднодоступных фосфатов в условиях песчаных культур.

Полевой опыт был залохен о использованием в качестве вектора для внесения ризобий в почву другой, эффективной по• ризогенному ,. . действию цианобактерии - М.teñera шт.9. Как видно из таблицы 8,; ; даже на фоне высокого урожая гороха, бактеризация семян оказалась аффективной. 1 ' ' •' .•'•'.••..'

.Обработка семян бикомпозитом,1 также как и в опытах-.о козлят- '-'У' иком, стабилизировала, еффект нитрагинизации; увеличив по сравнению с ней ксеромассу надземной части гороха на 9,256, корневой системы -;.- на 17,4$, а количество клубеньков - на Урожай семян увели-*.' чился на 5 ц/га. .,-.•„ \' - . "...-v . '.:

. : Таким образом, использование цианобактерий как.основы бакте- ■ -' риального композита на бобовых культурах оказалось весьма успешным;

'он :

70 _

•бо":

Г~ч г

50

1'ШШШ

- _____'

итш

ст/хое" вещество,г

. 2,5

о .

0,50,2 -0,4 -0,6 -

1 ; ? 4 3

___

г~!

I Ытт

. Рис,ё.- Влияние бактеризации семян на рост гороха в лабораторно-ве-гетационном.опыте. А-виоота растений, Б-площадь листьев, В-ксеро-' масса надземной части, Г и Д-ксеромасса и'объем-корневой системы, , соответственно. ■ '

- Контроль июлная ереда Кнопя с азотом) - вариант 1 Щ йЛ(.-е1да1помигш1.шг*1022.- вариант 2-' "■'"" '

- I?.}^отмпогагиге шт. 1022 + М.ра1ш1ойш> шт. 18 - вариант 3

¡11 М.р'лШ()ови'Г! шт.18 - вариант 4. . .. ,

Щ -' КЛе^итхпЬра.г-шя шт. 1022 + ?/.ра1ш163т ит:18 +

А.га[ЯоЬао1ег.ат. 10, - вариант 5 .

шт 500400 300-

нмоль С0Н./ 1 клуб.Уч4

нмоль 10 С,Н.

-1 -12 4

г песка ч V •

14- —

12-

10- i

8- '|jgjg й.

Рис.7. Влияние микробных обработок семян гороха на количество клубеньков на-корнях (А), их азотфиксируюцую активность (Б) и субстрата (В), содержание азота в растениях (Г). Условные обозначения теже, что на рис.6. /. ■ .

' Таблица 8

Влияние бактериальных препаратов на горох сорта Надезда

N Вариант* Ксеромасса Корневая система Урожай,

п/п надземной части, ~ . г/м - ксеромасса г/м - количество клубеньков шт./раст. • ц/га

1. Контроль. -(без обработки)- ; : 140,3*7,4 S8,8í2,6 28,1+1,4' 41.0+1,1

2. R.leguitiinoaarum,1022 (контроль) . 265.7+2,8 106.3Í3.4 51,0+2,2 45 ,05:0,9

3. R.legvrainosárum,1022 +_V> teñera, 9 260.4-.5.9 .1 S;4.9 т 417 61 ♦8+3.1" 50,0;1,2

6. Изменения Шкробиологичеокого статуса почвы при " инокуляции бактериальными препаратами

Картина действия биопрепаратов была бы не полной без спреда-лення степени прижшлення инокулята в почве и учета изменений ре

микробиологического статуса. ..... .....

•Яаборзторта-йегетзцкашшЯ'огтнт показол, что в прокаленном

ь нй п.->ь»м« растения - кяубсньковив о'ак-

.3

терий (рис.7, Л).

мдн./см 5

....... • 4'Н

' : - 2 -

1 2 3

Рис.в. Численность клеток !4.ра1ш1овит в песке при обработке

семян гороха различными микробными препаратами.

1 - Я.Iе^ситпоеягш шт. 1022 + Л.ра-Шйовют шт. 18;

2 - N.рч1ис108!Ш1 шт. 18;

3 - Я.ра11к1оЕит + К Ле^шпповагт тт.1022 + А.гасЦоЬг-кЧег шт.Ю.

Размножение монокультуры цианобактерий было практически одинаковым в присутствии и отсутствии клубеньковых бактерий. Это не расходится с результатами опытов в жидких культурах, где присутст-. ше, ризобий практически не отражалось яэ Плотности клеток ностока. ; А.гза:1оЬас"кег стимулировал ряяиисяченйе клеток яостс^м, 'численность которых возрастала с ¿,44 до 5,34 млн/см-*,- при !>том, как показало

титр- клеток е'юге микроорганиз-

применение А.

ма.в-ризосфере достигал 4,5-Ю^ кл./г корней. Очевидно, стимуляция :размножения клеток.ностока под влиянием агробактерий связана с уве-л^чена^м;азотфиксируюйвй• <Яггослбнолти цияяо-бэктеряй (тпбя.4).

В полевых опытах подтверждено, что бактеризация семян влияет но микробиологическую активность гатеы. Гак, при взятии,пробы из ' ризосферы Козлятника второго года жизни било обнаружено, что около корней яря шеоешт увеличилась численность «алю

нификаторов-грнбов Л 152,2*35,94 тыс;/1 г почвы против ЬЭ,80;8,40 , при, обработке одним фЦхоМт) .и» фоне одинаковой численности ом-, .мо'тфлирутойих бактерий"(3.49*0,34 и 3,б2?0,?9 млн кл./1 г почвы.

.соответственно); более чей в.2.раза возросла 'численность.свободно-, - .' живущих клубеньковых бактерий (2,65*0,25 млн..кл./1'г..почвы против. ' 1,1110,06)., что сопровождалось увеличением количества клубеньков . на растениях (табл.7 и 8). В то же время в пробе, взятой с поверх- .-у кости почвы, достоверное ..разотчие.меауцг" вариантами Nostcc+Rhlzobiuat и один Rhio'oMua было 'только , по численности ;свободноживущих клу-клубеньковых бактерий: ока увеличилась при обработке семян биком- • позитсм на 59,7% (1.55?0,Í9 млн кл./1 г почвы).

Одновременно" кшмексанташ'тешЛГ.Н.Перминовой,. А.Л.Ковиной) : Исследовалась возможность изменения иод влиянием бактеризации семян -фототрефного компонента.почвенной микробиоты, 'исходя из соображе- у : ния, что цианобактерии могут;вступать в тесные взаимоотношения с вукариотными водорослями.. Общий, список'фототрофов под козлятником • составил 96 видов: цианобактерий - 26, зеленых водорослей -41, желтозелешх - 19, диатомовых - 8, ггарофитовых - 1, золотистых - 1. Закономерных изменений в. видовом; составе'фототрофов при внесении '. микробных препаратов в почву но отмечено. В то же время численность " водорослей в. разных, отделах возрастала при внесении, инокулкма: -наиболее, значительно у вданобактерий и зеленых, водорослей. Так, на второй год наблюдений за, посевами численность клеток фототрофов .. .около посевов (контроль) была до 20 тыс./г почвы, пед посевами -•она достигала" в" июньской и сентябрьской пробах сотен тысяч.

Изменение микробиологического статуса .после бактеризации семян мы связываем, в.. первую очередь, с увеличением численности вводимых в. почву партнеров композита - цианобактерий и'клубеньковых бактерий. Влияние на основные rpyjpii хемотрофных. организмов и 'еукариотных водорослей опосредовано через степень развития расте- •. ; ний, влияющих на проективное покрытие почвы, величину'опада и ек- -оудатов, как источников, энергии для хемотрофов. .

V ;'.„■' ; выводы

л". Проведен скрининг штаммов цианобактерий, коллекции ВГСХА и'вы- ! деланы культуры интенсивного роста, накопления азота и предполагаемой технологичности: C.pmotatum шт.70, М.teñera шт.9, N.llnclcla. ... ' вт.21, N.muBcarum ВТ.13, N.paludosum,mT.l8, P.inundatm шт.8 й . Т..tenuie шт.17. Оптимальная среда для'их культивирования оказалась- ' Громова N6. "

2. Показано, что Цианобактерии вызывают ризогенный,аффект у расте-

'яий; который зависит от ияокулюма, взятого для обработок, штамма цианобактерий и отгыггчивооти пида и сорта растений. Наиболее ьф-. фектагныун и перспективными- (по ризогенному 'действию) в плане раз-'"работки биопрепарата признаны МЛепега шт.9 и Н.раШовии 18. Наибольший ризогенннй эффект под влиянием .цианобактеризльных обработок семян" получен у растений салата, редиса и козлятника. Роашгая

•• 4(г>лт»вл<>нч' мг?ез' г^Д "аксениэацй» цкопобактерий и найдены несколько важных-стратегий: а) безазотиетые среды наиболее благоприятны для начальной очистки цианобактерий; б) рекомендуется максимальное освобождение трихомов от слизи, облегчающее последующую очистку клеток .от загрязняющей микрофлоры, путем.разбивки колоний - на качалке со стеклянными бусами и фильтрации суспензии через ас. • бестовый. фильтр'; в) после.этих процедур проводится определение

степени загрязнения культуры методом высева культуральной жидкости - на селективные микробиологические среды, устанавливается видовое разнообразие бактерий-спутников; г) следующий этап заключается в выделении чистых культур бактерий-спутников, идентификация их при этом необязательна; д) с помощью антибиотических тест-колец выявляется индивидуальная чувствительность бактерий-спутников и циано-бактерий к спектру антибиотиков; е) устанавливается доза и время действия различных антибиотиков (с контролем за количеством живых клеток цианобактерий) для выбивания определенного (конкретного) спутника и проводится по той же схеме поэтапная, очистка от осталь-■ : них. При невозмбашости очистить цианобактерию при разовом.воздействии- аятибтатикоЕ "следует применить многократную обработку; ж) контроль за чистотой культуры проводится ■ прямым микроиАпированиРМ и .. _____сопровождается высевом на провоцирующие органические среды. Используя выше описанную технику, удалось получить.в очищенном состоянии • : культуры №зз1о<з' ииесогит шт.£72,' К.ривсШогше шт.273 и. Н.ра1и<1сеигг1 ."■ ШТ. 18:' - ' ' :

4. Очищенные культуры цианобактерий дают возможность составления^ на,их основе программируемых микробных композитов из нескольких партнеров, в которых фототрофный компонент является единственным продуцентом органического вещества и при интродукции - в почву он

■;- -'служйт защитой от неблагоприятных абиотических и биотических фэк-торов.- -- -' ■-.- .' -• .

5. Совместное культивирование даазотрсфов №.ра1и<1оеит шт. 18 с. -

нш бактериям. В свою очередь, К.йа1еаае шт.0702 и А.га<ЦоЪао1ег шт. 17 не являются антагонистами по отношению к ноотоку. Бикомпози-ты Яоб1;ос-Шг12оЫит, Иов1;ос-А£гоЬас1,ег:1ит обладают большей интенсивностью роста, нитрогеназной активностью и скоростью накопления бежа, чем монокультура !1ов1юо. Доказана возможность длительного сосуществования заданных партнеров в ассоциации с ностоком.

6. Показаны существенные преимущества бактеризации семян композитом, по сравнению о чистой культурой клубеньковых бактерий. Обработка семян козлятника восточного композитом агрономически значимо увеличивала всхожесть и енергию проростания семян, улучшала ростовые характеристики растений и увеличивала урожай сена на 17,5 ц/га, семян - на 5,8 кг/га, по сравнению с нитрагинизацией. Урожай семян гороха при обработке композитом увеличился на 5 ц/га.

7. В строго контролируемых условиях песчаных культур использование композита, состоящего из диазотрофных микроорганизмов заменяло минеральные формы азота. Высота растений, площадь листьев, ксеро-масса надземной части и корневой системы во всех вариантах с бактеризацией семян была достоверно выше или равна показателям у растений получавшим нитратную форму азота.

8. На.основании использования меченого антибиотиками штамма микроорганизма, прямого счета под микроскопом клеток цианобактерий, учета свободно живущих клубеньковых бактерий в почве и клубеньков на корнях бобовых доказано лучшее приживление инокулюма при его внесении в форме композита (цианобактерии + ризобии), чем при раздельном применении партнеров.

9. Микробиологический статус почвы мокет быть несколько изменен ии-тродуцируемыми микроорганизмами: за счет размножения компонентов инокулюма и опосредованного через растение развития аммонифицирующих микроорганизмов. Закономерных изменений в видовом составе фо-тотрофов при внесении микробных препаратов не отмечено, однако, численность их клеток могла быть существенно увеличена.

10. Цианобактерии могут быть рекомендованы для создания елозит

/

микробных препаратов с перспективой снижения энергетических затрат при выращивании хемотрофных организмов, стабилизации эффекта интродукции агрономически полезной микрофлоры в почву.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Панкратова Е. К., Калинин А. А. Цианобактерии, как возможные организмы для создания бактериальных препаратов '// Сб. науч.

ciaTeJS / Роль научшп исследований в развитии сельскохозяйственного производства Кировской области.- Киров, 1991.- C.2S-33.

2. Калинин А. А., Бородина Н. В., Кована А. Л. Влияние гетероцист-

нч* шияебзктеряй на рост и развитие гороха //Ммкрооргчниг-чи т: сь-льском хозяйстве: Тез докл. IV |:->еесюз. науч. конф. л)-,-_ч янг.я-рл 1932 г.- Пущино, 1992.- С. 79.

3. Калинин А. А.. Ыезенидня г a v—--- ^.„„»«»г»« нт»<-

:: и» в«««™««' ггл.™ // •>.•■•<>« •"•ess-

Kiis земельных ресурсов России: Тез. дога. науч.-произвол, конф.-Кнров, 1993.- С. 121-122.

4. Панкратова Е. М., Калинин А. А. Аксенизэгдая цианобактерий // Агрономическая наука - достижения и перспективы: Тез. док. науч. конф. 9-Ю июня 1994 г.- Киров, 1994.- С. 19-20.

5. Катит А. А., Кевина А. Л., Панкратова Е. М., Перминова Г. Н. Цианобактерии как возможные организмы для создания даазотрофных мдаробних препвратс2 :: кг влияние на растения /У Современные проз л*мы почвоведения и экологии: Тез. докл. конф. молодых ученых факультета почвоведения МГУ, 23-28 мая 1994 г.- Москва, 1994.- С'. &-■ £. I'anfcratova Ye. М., Kalinin A. A., Kovina A. L. Growth Interacts on between Nostoc and Rhizobium // 10th International чощугеез on Nitrogen Fixation 28 May - 3 June 1993.- Saint-Petersburg, Russia, 1V95• - P. 665.

7. Pankratova Ye. M., Kalinin A. A., Kovina A. L. Growth interact! on between Nostoc and Rhizobium // Procedig3 of the 10-th International Congress on Nitrogen Fixation (в печати).