Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЦИАНОБАКТЕРИИ КАК ВОЗМОЖНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ДИАЗОТРОФНЫХ МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАСТЕНИЯ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ЦИАНОБАКТЕРИИ КАК ВОЗМОЖНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ДИАЗОТРОФНЫХ МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАСТЕНИЯ"

зпзу-

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

•. ' На правах рукописи

КАЛИНИН Андрей Александрович

ЦИАНОБАКТЕРИИ КАК ВОЗМОЖНЫЕ КОМПОНЕНТЫ ДИАЗОТРОФНЫХ

МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА РАСТЕНИЯ

Специальность 03.00.07 — Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1995

юк ио/1 >; - ь

п

' ' с

Работа выполнена на кафедре ботаники Вятской сельскохозяйственной академии

Научный руководитель — заслуженный деятель наук РФ, доктор биологических на\к, профессор Е. М. Панкратова.

Официальные оппоненты — профессор, доктор биологических наук В. К. Шильникова, старшин научный сотрудник, кандидат биологических иа\ к В. П. Шабаев.

Ведущее учреждение- ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии г*

Защита состоится Г'*^ ^^^^^ О/®*1. . 1995 г

У/. /

в часов на заседании диссертационного совета

К 120 35 06 в Московской сельскохозяйственной академии им К А Тимирязева по адресу- 127550, Москва, Тимирязевская ул , 49 Ученый совет ТСХА

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХ\

Автореферат разослан 1995 г.

Ученый секретарь П

тисеертационного совета — Л^о /

кандидат биологических наук К/^/ Мосты

Актуальность темы. Новая системе землепользования - адаптивное земледелие; опирающееся на ресурео-сберегаюцивтехнолопя о максимальнім использованием, резервов почвы и растения в создании урожая, возникла в связи сосложивтейся экономической ситуацией, энергетическим кризисом и экологическими проблемами (Жученко,1993) Большое значение.в ее становлении придается исследованиям по регуляции почвенного плодородия через стимулирование или подавление определенных микробиологических процессов в почве, либо биотехно--логическим путем; предусматривающим введение в агросистемы запрограммированной ассоциации микроорганизмов. Оба пути ограничительными планками имеют степень изученности участников процесса и неполноту инфорыации о результирующих на его выходе . учитывая множественные функции организмов. не адекватно меняющиеся при изменении у словиЯсреды.Более очевидные результаты часто получаются при Интродукции микробной ассоциации в почву. ' -

До недавнего времени основными объектами изучения являлись _ -хемотрофные организмы. Инфорыация. полученная в последние годы, , привлекаетвниманиекдругой груЯпе организмов - фототрофоде циа-нобактериям. Это типичные обитатели почв (Штина.Голлербах,1976),: 'способные"образовывать от 70 до 600 кг/га легко трансформируемого органического вещества (Панкратова, 1979! Мезенцева, 1986,1992) и накапливвть до 30 кг/га азота (Панкратова, 1987; Панкратова и др., 1989; Резник,1991)- До 50* продуктов фотосинтеза и азотфихсеции выделяется цианобактериями в среду, в результате - чего они воз; действую1); на ^растения и окружающую их, микрофлору прижизненно. Цианобактерии устойчивы к резким колебаниям влажности и температуры и достаточно ацидотолерантны (Панкратова,1969). Особенности - втих организмов сожительствовать о разнообразными хемотрофшми почвенными бактериями, поселяющимися в слизи, окружавшей их клетки, обеспечивают; им экологическую поливалентность и эволюционную устойчивость. Это свойствопрограммирует работы по созданию на основецианобактерий искусствеяныхмикробных ассоциаций для решения задач агробнотехяологии в частности; стабилизации- эффекта нитраганизации и интродукции в почву микробных компонентов полива лентного дейотвия. Таким образам,.изучение цианобактерий как возможных организмов для биотехнологии, их взаимоотношений сэалро-' грамлфованной для интродукция микрофлорой с целью создания высо-

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧНА С 'зл<.0 Т ЕЧА Моск. соль;-:о".эз д • им.. К.

Инв.,№

комплементарных микроеш»х ассоциация представляет интерес для решения как теоретических вопросов микробиологии, так а практических задач биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Цель исследований заключалась в использовании цианобактерий в качестве объекта для культивирования агрономически полезных микроорганизмов и в создании модели практического применения цианобактерий как вектора для внесения композита в почву.

В связи с этим, перед работой стояли следующие задачи:

- выделить из коллекции наиболее аффективные по накоплению биомассы и технологичности Культивирования штаммы цианобактерий;

- проверить наличие ризогеняого аффекта у различных растений при обработках цианобактериями и композитами на ах основе:

- , .^работать систему получения аксеничных культур цианобактерий;

- изучить возможность культивирования бактерий р.Ш:оЫш (R.galegae и R.leguminosarum) и Agrobaotertum radiebacter с цианобактериями как единственными продуцентами органических веществ и исследовать некоторые физиолого-биохимические свойства композитов;

- дать оценку эффективности созданных, композитов на горохе и козлятнике.

Научная новизна. Впервые показана возможность создания устойчивых бактериальных композитов на основе цианобактерий, как продуцентов органического вещества. Разработана система аксенизация цианобактерий, дающая возможность создания новых комбинаций цианобактерий с хемотрофными бактериями. Показана комшгементарность цианобактерий о бактериями p.p. Rhizobium и Agrobacterium, с способностью партнеров к длительному совместному существовании. Обнаружена высокая степень приживаемости циано-бактериальных композитов в почве, обеспечивающая полноценную инокуляцию растений клубеньковыми бактериями» Установлена эффективность использования композитов Hostoo paludoeum-Rhizobium galegae и N.paludoeum-R.Ie-guminoearum на козлятнике и горохе.

Практическая ценность. Рекомендовано использование циано-бак-териальных композитов как способа усиливающего эффект штрагиниза-шга семян бобовых растений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научных конференциях Вятской государственной сельскохозяйственной

академии (1991,1992,1993.1994),.Й Воеооїган^ научнсЛ ковференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пушино,1992), Международной конференции молодых ученні "Экология сельского хозяйства л перерабатывающего производства агропромышленного комплекса" (Пущине,1993) Публикации. По теме диссертации опубликовано б работ, одна находится в публикации. ' .:' , .' V; V * -

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинопйсного текста, состоит из введения, 4 глав и выводов. Работа содержит 11 рисунков и 02 таблицы. Библиография представлена 153 отечественними и 92 иностранными, источниками. '

• • : . / ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы цианобактерий. Использованы штаммы цианобактерий коллекции кафедры ботаники ВГСХА. При отборе шт§ммов учитывали скорость накопления биомассы я азота, легкость отделения о« культуральной среды и последующей гомогенизации. • ; ' , "Я • . " '

Цианобактерии культивировали на жидких безазотистых средах: Громова N6 (1965), ВС-11 (Мррка еХ а!.. 1979) И Ы (Таха.1963) в колбах Зрленмвйера на100 см3, в лкыиностате ггри освещенности 2-3 тыс. лк и температуре 22-25°С. Накопительные культуры цианобактерий получали на среде Громова N6 в конических колбах емкостью 300 СМ3: длительность культивирования 1 месяц. Эта же среда использо-' велась при совместном культивировании цианобактерий и хемотрофов. .

' Для аксекизацан выбран штамм Ыоа^о рв1иЛоеит,18 как наиболее продуктивный-при культивировании и результативный при определении ризогенного аффекта на проростках различных растений. Кроме того, ■ он обладал наименьшим разнообразием бактерий-спутников, выявленных на елективних микробиологических средах. Попользованы методики,* рекомендованные Институтом микробиологии РАН. кафедрой мнкробиоло-' гии МГУ, приводимые в основных руководствах по микробиологии. -

:- Изучали еффективнооть;оледупцих приемов освобождения циано- , бактерий от спутников: термическую обработку (многократное прогревание культур« при 45°С, разовое - щи 60°С к 80°С); механическое отделение слизи цианобактерий путем фильтрации через асбестовый -фильтр: обработку УФ-лучами' лампой ПРК-4 (о раоотояния ЗОом при : вкопозиции 2,5 и 10 минут) и антибиотиками - генТамицинои, тетрациклином, левомицитнном, ряфампицинсы. Индивидуальную чувствительность микроорганизмов к антибиотикам устанавливали.о помсцью анти-

биотических тестовых колец фирмы HEINRICH MACK NACHF.CHEM. При установлении выживаемости цианобактерий применяли трифенилтатразо-лий хлорид (метол Ивановой и Михайловской,і96?). Кбнтроль чистоты цианобактерий проводили высевом культуральных сред на среды МПА, Эшби, соляно-кислотный гмдролизат казеина и микроскопированием нитей цианобактерий.

Штаммы хемотрофных организмов были получены из ВНИИСХШ Rhizoblum galegae шт.0702 и шт.0706, R. 1 eguminoearum шт. 1022. Ag-robaoterlum radiobaoter шт. 17 и A.radiobaoter шт. 10 rlf1" 8trr, устойчивый к 40 мкг/мл рифампицина и 500 мкг/мл стрептомицина. Культивирование я выявление Bhizobium проводили на бобовом агаре, A.radiobaoter - на агаризованной (о содержанием агара 2%) среде ДАС (Ререотецкий и др.,1985).

Биомассу цианобактерій определяли по сухому веществу и по оптической плотности на спектрофотометре VSU2-G (Carl Zeiss.Jena.DDR)

Численность клеток бактерий определяли по стандарту мутности и методом высева из разведений на плотные среды.

Нитрогеназную активность - методом ацетиленовой редукции (Hardy et al.,1973). Хроматографическое разделение и детектирование исследуемых компонентов в газовых смесях проводили на хроматографе "Цвет-101В с пламенно-ионизационным детектором и колонкой о Рогарак Q. В качестве газа-носителя использовали аргон с подвижной скоростью 50 мл/мин*.

Содержание белке определяли по методу Лоури (Lowrjr et al.,195 Ризогешшй аффект изучали на 5-7 сутки после обработки семян гороха, редиса, салата и козлятника цианобактериями и композитами. Проращивание проводили в чашках Петри в термостате при температуре 20-22°С. Повторность шестикратная. Количество семян в одной повторнооти брали согласно соответствующему ГОСТу (1991). Промеры корней проростков осуществляли в течение 2-3 часов, количество измерений колебалось по культурам, составляя от 120 до 600, Попользовали шесть сортов гороха коллекции Фаленской селекционной станции (Кировская область): Краоноуфимский-70, Лучезарный и Надежда (районированные) и три, находящиеся на размножении -А-16620, А-10666 и А-17495! два сорта редиса - Вюрцбургский, Заря и одни сорт кресс-салата. Вегетвционно-лабораторный опыт с бактеризацией семян ставили на промытом и прокаленном песка в стеклянных сосудах емкостью 1,2 л (Журбицкий,1968) о сортом гороха Надеж-

да. Схема опыте видаа из риеуакаб.Количеетвр «шокулюма приваде-го в ^ейете.Владаость- песка поддерживали на уровне бОЛ от полно® . вяагоемкости в контрольном -варианте полной средой Кнопа (10-ти Кратной концентрации), в варианте о бактеризацией семян - той «в средой, но с исключением азота. • .■»..'. , . , ■

Полевой опыт, с. горохом проведен на дерново-подзолистой средае-с у глинистой почве соеледующими агроимичеекими показателями: . ' рН^б.г; гуму« - 3,1%; общий азот 0,П%; Рг0ь 50,4 , KgO 40,1 мг/ 100 г почвы! сумма поглощенных оснований 15, гидролитическая кис-' лотность 1,4 МГ-8КВ/100 Г ПОЧВЫ. ПврвД посевом, внесены удобрения в форме диаммофооа (N56, Р'9& кг/га), калийные в форме хлористого. калия (К-63)-. Площадь .делянки 1кв.м, пойторноеть иеотикратная. Схема опыта включала три варианта:-1. Посев ;семенами без бактеризации (контроль); 2. Семена обработаны.R.legumlnoearumшт; 1022;• 3. Семена обработаны R.legunlnosarum-Hloroohaete teñera.

• '. Полевой опыт, с козлятником, сорта Гале проведен на дерново- . сласоподэолиетой среднесуглинистой почве о агрохимическими показателями: рНцо! 5,6; гумуй ~ 1,73*; Р2°5 36,4 , K¿0 32,8 мг/100 г почвы; су>ма.поглощенных оснований-6,8 , гидролитическая кислотность 3.4 ыг-8кв/100 г почвы; степень насыщенности основаниями , 69.3*. Перед посевом был внесен двойной суперфосфат - 90 кг/га и сульфат калия - 90 кг/га. Схема опыта аналогична, но вместо. M.tenera использован N:paludOBum(рис.5)>

,* В вегетационно-лабораториом и полевых опытах определяли динамику. появления всходов,.ксеромассу надземной части к корневой системы, площадь листьев (методом высечек), количество клубеньков.'. . (в полевых пробах - в монолите 0,25 м Содержание азота в растении определяли методом Кьельдаля!. ; ; ; •

.....Микробиологический статус почвы при бактеризации оемян изучали путем учета в динамике численности амюнификаторов;' олигонитро-филов, клубеньковых бактерий, водорослей и циаиобактерий (совместная работа с А.Л.Ковиной). Видовой соотав фототрофов исследовали ' с помощью прямого микроскопкрования,. чашечными культурами со стеклами обрастания и постановкой водных культур; чиоденность клеток -определяли методом прямого счета по Виноградскому s видоизменении Штиной (Штина, 1956). ' i V/ : ; , . - . : ■ Статистическую обработку експериментальных данных проводили . по Люпттпоогттсому, (Поппсостгогеий, 1969),тт иомпт.гторо ТГЯГ ТО.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ЮС ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение перспективных штаммов цианобактерий для создания биопрепарата

Музеи фототрофных организмов кафедры ботаники ЕГСХА к настоящему времена насчитывает 101 штамм цианобактерий. Рекогносцировочный анализ, основанный на наблюдениях за состоянием культур и скоростью роста в стационарных условиях, позволил выбраковать штаммы не представляющие интерес для целей работа. На основания втого оставлено для испытания 50 штаммов, которые были в результате дальнейших исследований условно разделены на три группы.

Группа I объединяет штаммы, обладающие высоким темпом роста и накопления биомассы. По характеру роста это штаммы, образующие в жидко® культуре на средах М, BG-11 и Громова N6 колонии во взвешенном состоянии, с хорошо заметной слизью. В группу IX отнесены штаммы, для которых характерны средняя скорость роста и взвешенное состояние колоний. В группу III попали штаммы, обладающие очень слабым ростом и донным иди постенным расположением колоний. В результата селекции для работы оставлены следующие штаммыt М.teñera шт.9, N.línolcla шт.21, S.musoorum шт. 13, N.paludoeum шт. 18, Т.tenuis шт.17 (табл.1). В этот список также были включены 2 штамма: С.punotaturn шт.70 и Оезгетероцистная цианобактерия Р.inunda turn шт.8 по следующим соображениям. Виды eylindroapermuni широко распространены в почвах Нечерноземной зоны, часто выходя в доминантный вал при "цветении" почвы. Р.Inundaturn привлек внимание в связи о быстрым ростом в культуре по сравнению с другими безгете-роцистными цианобактериями.

Таким образом, на первом этапе работы удалось провести скрининг , имеющихся штаммов цианобактерий. На основании его выделить культуры интенсивного роста, накопления биомассы, азота и установить, что оптимальной средой для культивирования оказалась среда Громова N6.

2. Влияние различных штаммов цианобактерий на рост корней проростков (ризогенный еффект)

Ускорение роста корней проростков при инокудяшш цианобактериями (ризогенный эффект) связан со способностью последних выделять в процессе жизнедеятельности спектр физиологически активных

. ;' Таблица 1

. Характеристика росте и накопления азоте перспективными , штакмами цианобактерий л-а средеГромова N6 * ВС-11 „*. (в- міг на §0 мл среди за месяц)

Вид, .штамм ' '. Ксеромасса' не средах Азот на среде Громова N6

Громова'1 ;. N6 , : -ВС-11 накопление в клетках и среде содержание в клетках, %

Cylindroepermu» >'.' punctatUB,70 Microohaete teñera,9 Mostoc Iinckla,21 •, N.musoorur, 13 ." N.paludoeum,l8-Phormidium inunda- / tum.a - TolypothrlX'tenuis,1? Примечание При культі KN03 (1. г/л). . - 36,8 41.8 : , 75,4 -- 154,5 60.6 103.3 109,1- івировании-1 27,8 • 31.4 85,8 , 60,8 41,3 ■ 61.6 ;= 40-7 ; Inunda tun " 3.57 2.56 6,60 7.40 • 5,08 . ' 4.06 ' i,8 в среда 9,70 6,12 .... 8,75 4,78 .8,38 9,70 добавляли

веществ,, таких как витамины, индолсодержащие, цитокининподобные и гиббереллиновые вещества- (Chauhan,Gupta.1984;: Козицкая,Сиренио, 1988 ї Андреюк и. уц?.,1990 і:Кучкарова,1990).. В опыте использовали -растения гороха, редиса и кресс-салата, проростки которых весьма чувствительны,,к присутствию в.среде,- стимуляторов роста (Кафели,

1973). . - ; v\ ^-л

,'..' . Было показано, что для: разных растений существует своя ости- -мальная доза.ннокулята^ за никними пределами которой ризогенный- -вф^ект-мокет отсутствовать,' за верхними,- переходить в фитотокси- , ческое действие. Последнее выражено у,разных штаммов иианобактерий в различной степени. Например, наиболее токсичным иэ испытанных оказался N.linckia шт.21. Эффект яри обработке семян гороха и ре- ' лиса безгетеровдстной формой цианобактерии P.inundatum шт.8 варь- -ировал от. слабоположительного:до ингибирупцего действия, что в . последующем заставило отказаться от. ориентирования на эту циано-.бахтерию. ': '-Л-,'•■•-.'--■'.V •; ; ' V . ,'' ". - "" ' ' ,"v- . ■' . > ; Оптимальная доз а иноку люма" для'других шанобактерий, составила по ксеромассе,0,07: 0.03 я 0,01 г на 100 семян гороха, редиса и салата,- соответственно. /";. -у' \ ' ' '.' '., -. , ■ Наибольшее число, положительных: случаев отмечено при обработке семян.редиса.я салата,, меньше - гороха {табл.2).t ■ . •

ТчОляца z

Эффективность обрзботок снлрч герою. р°дяео и cnj-ата по pifo генному действию

Цианобактерия, штамм Число ОРЫТОЧ с положите чыпм результатом^

горох: I -аддие сала" от общего •числа опытов

C.punetatum.TO 15,6 7* 100

М.tañara,9 ко 100

N.UncKla.2.1 ТОО 36 „Ь

N.muBCOrum, 13 1(0 <00 54.S

H.raludosum,ta 50.0 100 73.7

T.tenuie, V? 33.3- 75 'СО 54.5

Различные сорта, как видно ич примера гтроха. по разному от-швалиеь на обработку штанобак?йршши. Нарчдь с сортами малоотзывчивыми (Лучезарный. А-10666 и А-"74^51, существуют юрта, на которых ризогеяны® аффект был сильно- мгрнжек - Красяоуфиме^ий.-ТО Срис.1) и надежда (рис.2).

Рио.1. Влияние цианобакт^рий на рост корнвп у пророоткев рполичних сортов гороха (см).

Обозначения: 1. Контроль 2.evpum ta tum.70 З.М,teñera,9 4.N.musnerum, 1? 5.N.llnokla.21 S.N.palUdosum.18 7.T.tenuis.T7.

Сортовая реакция на обработку шаноб8кт°риями мокет сыть объяснима метаболитичеекимн особенностями, выражающимися в неодинаковой потребности в определенных веществах млгроеной грироды.

Таким образом показано, что цианобактерии вызывают ризогенный аффект при проростании семян .Наиболее аффективными признаны М.teñera шт.8 и N.paludosum шт.18, которые "или подвергнуты дальнейшему изучению с целью создания на их cchow высокомплементарных ком-

зм

2Н 20- ' 1918171610$-

. в - л 7- ' 6-■ 5- ' 4321 -

1 2

В9РИ9НТЫ

Рис.2. Влияние цианобактерий на■ рост корней гороха сорта Надежда. ,■ Обозначения вариантов аналогично рис.1.' '- длина основного , .корня; пунктир;- суммарная длина основного и боковых корней. •

бинаций с. хемотрофными бактериями. .Однако.их создание требует очистки цианобактерий от природных слизевых, спутников,, которая затруднена из-за отсутствия четких прописей, позволяющих достичь , желаемого результата. •• ■ >. - * . .- ■•■..■

• ■ З.АкеенизацияцианоСактериЯ. -

• ; ■ * В литературе описаны многочисленные приемы освобождения циа- ■ нобактерий от сопутствующих микроорганизмов, однако общепринятых .

-приемов получения чистых культур цианобактерий нет (Андреюк и др.,' -.1990)» Мы поставили цель.разработать систему получения аксеничных \ культур цианобактерий.- Модель» для разработки прописи аксенизации послужил штямм который имел наименьшее разнообразие и

. титр бактерий-спутников. -, . . - . .• . • - -

, • : . В начала работы определяли степень, загрязнения'цианобактерии -с помощью-докроскопичеекоте. просмотра.' и высева- ее :культуральной: ■ среды-на,селективные- среды МПА, Эшби .и Чапека. Титр бактерий-спутников у.меснчной>культуры ^ра1и<1оецпгколебался от 22,4 до -30 млн - кл;/мл. и <5ыя."йредставлен всего-. 3 штаммами. По предварительному .

заключение первый спутник был отнесенк ?1а7оЬао1ег1ит вр., второй , к.-РвеиЛошопаз- ер.третий - - к А1ЧЬгоЪао1ег ар. .... . . ■: •••-■. .:•„. - Попытка очистить 30-днеьную культуру :И.ра1и(1о8ии .одноминутной

однократной обработкой температурой 80 С на смела усгехл из-га гибели. цианобактерий.

Обработка циаяобяктерий- УФ-лучами, дампой HPK-1- с расстояния 30 си с вкепозицией г.5- и 10 мин не вызывала елиминащш в~пммсв бактерий я только временно переводила поагедниа в латентнее состояние. Риск получении мутантчих форм заставил-отказаться ст этого приема.

Пропускание трихомов цианобактерий через асбестовый фильтр, приводило к снижений титра бактерия с ¿2,4 до 1.5 млн кл./мл- среды и> некоторому очищению нитей от слизи. Это? прием целесообразно использовать В' начале работы по аксенизадаи, так как освобождение трихомов, о* слизи делает их Соле е--доступными к воздействию чнтя-бактериальил агентов.

За основу СШ! взят метод очистки ционобактррий с- использованием антибиотиков. Принципиальное отличие новой технологии от общеизвестной-. заключавшейся вч попытках, фронтального воздеРствия на бактерии-спутники', ^ состоит в целенаправленном- действии ка определенный микроорганизм по- типу» стрельбы по мишеням. Очистке предшест-' воввли последовательные шерашш, имеющие- целью подбор препаратов о б акте ригидным аффектом» направленный на хемотрофный компонент и одновременно не обладающих таковым к цианоСактеривльной клетке.

На селективных агаризованныг средах а чашках Петри получали газонц конкретных бактерий, на которыегнакладывали^антибиотические тестовые кольца. Чувствительность шганобактедай проверялась вд газонах« выращенных-на фильтровально®, Ojruare. Антибиотики» переносимые гдаанобактерией, во елишширупдие спутники оказались - хлорам!»-никол (левомицитин), тетрациклин а гевтамшяш (табл-.З).

' , - .. Таблица У

Чувствительность K-.palwlosüiffTr сопутствующих бактерий tc действию антибиотиков (зоны лизиса, мм)

Объект Антибиотики

А ОТ : с & ■ Ё МУ , NA ; ТО] Ö РВ

N.paludoeum, 18 . Plsvobaoterlum вр Pseudomonas» ер. Artftrobaoter ар. Примечание. Проче! Условные обозначен Т-тетрациклин, G-I NA-налидоксиновая сациллия, Р—пенидк жи тяг чвНТ£ ким [ЛЛШ- 53НВ' A-ai 1МИЩ юта G, 4 5 12 15 :ают шиш ш, TS-РВ-г • 1 ' 8 8 ото] шла ü-epi -три» голга '< У 15 7 ГТСТ1 I. С! 1трок «етог OTKCI 10 зие : опдп 1РИМ/ я В, гок- J 5алоа I, ГО гсул1 14 Л газж таг, >фамЕ G'V 'Рофз ггак< zopai грат :asoj афеш гошс I. 0- скол -OK-

' ■ На сяє думаем етапе устэдаляфадж время ыёедоэиции цивнобакте- : ряи с антибиотиками и дсдезирали ¡te О&тзйяУ ве»ряст«жя его концентрацию, деталь »г» ляя rtsttrepuft-eftv изийа, ju&bs» Рврвнтив, воспроизведения популяции иияйобактРрй*> •Через онреялвдняй Интервалы времени кяяяси оийн^зактрриЯ отмвьалй vyr suncíкотика и длч установление not3Hecfraco®tfr>3Tft помещали а свету» среду Громова с 0.075% (по конечной йошлктраиии« трпфрнилячгтрззояий хлоридом. Не еледу-' ющий день по наличии s ключах хпйсталлоа формвзава су далі о процент« выживших ы»'ок ностока _ t рис. 3 > . . • -

Рис.3. Чурствительность клеток:»,раХ\)<1овит.к действию, антибиотиков (А- гентамчцин.'-Б- хлорт.етрчцнклин", Р-.''евомицртин).. На .оси абциес :время экспозиции' в чае; на. девой; оси ординат -. концентрация. антибиотиков в мкг/ил: на правой оси процент мертвых- клеток.

С помощь» гентамицйна; (концентрация юОО мгк/цл,' экспозиция , б чэсоб) культура, Я.ра1ш108иа\ была «очищена от ?1атоЬао^ег11ла ер.' ■ : Пятикратная обработке левомицитином-(через каждые-54-часа, кон- . г -центрпция 2О0 мгк/мл,' экспозиция 3 часа) позволила вловшировэть . Рвеийотопав ар. Однако, &ти антибиотики были неэффективны Для оо-; вобозденяя от АПЛгоЬаз1ег яр.; максимальный -титр клеток которого ■ достигал в культуре циаягобактерии 400 тыс./мл. Для уничтожения -»того спутника и выведения клеток из лерсистентного.состояния про. воцироьалиего размножение на среде на основе соляно-кислотного < . гидролизата казеина с последующей: обработкой. рвфвдаицикоМ и. гента-ииципом; Многократное последовательное сочетание■провоцирования -размножения клеток, спутника с обработкой антибиоттоса»« не дало же^-■ лйемого результата.что заставляет предположить.неслучайность его

присутствия в слизи цианобактерий. Дальнеяшие исследования доказали, что АгШгоЬжНег ар., не проявляет аЙТ-іГСНИСТИЧ^СКИХ отношений к подселяемым в культуру ностокя бнктериопышм партнрран. Вынете о тем, при проведении физиологических исследований этот ^путник переводился в латентное состояние, когда он ер^мечно терял способность к размножению, обработкой цианооактерий рифзмпицином и г^нтяшіцяном

Методика била апробирована на двух других штамма» цгчнеппкте-рий, имеющих первоначально значительно больше« заіря н»чи*; -11.рипо<;1Гогтв шт.273 И М.тизсогит шт.2?2.

Изложенная Последовательность манипуляций по очистке циано-бактерий, включающая тестирование яа наличие слизевик ^актериЯ-спутников {микроскопический контроль Я выс»в на ученые среди),

частичное освобождение трихомов с°ред стери'мзліией п* слизи (с фильтрацией месячной культуры через асбестовые ф'льтри), утанов-ление индивидуальной чувствительности к антибиотикам да^чооактррий И сопутствующих бактерий (с помощь» аНТИбИДОНЧОстх т"^-колец)» подбор рабочих Концентраций и времени обработки нивнкбчктерий (по контролю с ТТХ>» целенаправленное уничтожение отдельных спутников по типу стрельбы по мишєчямі даят возьюхнос-ъ якеенивировэть штаммы цианобактерий. При втом результативно идет очистка от больиин-ства бактериальных загрязнений, но не всегда гарантируется освобождение от симбиотрофных микроорганизмов, иногда одного-двух видов.

4» Составление микробных композитов на основе циан^Рактерий и взаимодействие компонентов

Наличие очищенных от загрязнений цианобактерий и потенциальная способность последних образовывать новые ассоциации, ключевым елементом которых является аатотрофный партнер как единственный продуцент органического вещества в микрокосме, обусловило оозданш программируемых композиций, отличающихся от монокультур высокой толерантностью к неблагоприятным условиям и поливалертноетьхг действия.

В качестве программируемых вселенцев в слизь цяячай рыбрчны два микроорганизма семейства ШЦгоЫааеае: виды рода ЯМгоЬіип и АегоЬаоІегіит гайІоЬасгег. Возможность совместного ¡'х применения изучалась и ранее (ВЗаІІУе,1962: Перминовв,1972: Штина и др.1972) но прием не вышел из ра^эк попыток, т.к. исследование деР^-^вия компонентов проводилось с использованием не аксеничных культур

цианобактерий (альтодогически чистый материал). Эффект поэтому зависел не столько от ийтРодуцгруемЫ! бактерий" или ожидаемого

микрофлоры, взаимоотношения которой' со слизевой микрофлорой цианобактерий* трудно было -предсказать. Естественно, что для исследования. вэзшюотноаечнй цианобактерий с искусственными вселенцами. необходимы селя культурн. срободнье от сопутствушей микрофлоры»

Совместное культивирование К.ра1Щоеит шт.Ш о В.^а1е§ае шт.070£ и А.га<И.оЬао1:гр шт. 17 на гадкой минеральной среде Громова N6 показало» что испытанны» бактерии не обладают агрессивность» по отношения к ноетоку. До"тов«>ргой раакиц» в размножении клеток цианобактерий в монокультур» л в состаб1'- композита не отмечено. Так, оптическая плотность чистсХ культуры К.ра1и<1<уаит на 10-е сутки кульгиБирсвэш!Я была 0,9"и0,С2 , б варианте о -0,98?0,0Э , а с А.гЗД1оЪчси>г - О,-4*0.04. Чиолеяность клеток ря-зобий росла параллельно масс нон ока, -.е. вселяемые бактерии существовали за счет органических выделений нобтока, ксеромасса котором через месяц возрастала с 5.4ТС.93 до 52.512.7 мг/30 мл сре-

Рис.4. Динамика роста М.рагиаовига и В.^ахе^ае в бикомпозите. Уеловяье обозначения: А - логарифм Численности клеток- И.^аХе^ае/ 1 мл среды» Б - ксеромасса Н.раХшЗовит, иг/30 мл среда.

Нитрогеназная активность монокультура М.ра1ий0Бит была сравнительно невысока, в то же время, в композитах она достоверна увеличивается (тасл.4), что сопровождается достоверным увеличением белка в композитах на 10-е сутки (табл.5).

Последуйте опыты, провелеша»-» сотрудниками кафедры показали, что бактерия подселяемые к циаьеям аьтсвно колонизируют их слизь, капсулируяоь в ней.

Таким образом, удачный состав композита, возможность его длительного сохранения я функционирования, позволил перейти к изуче-

действия композита, сколько от побочного, действия загрязняющей

303" ао-

2- Ю-

шш влияния композита на растения. . .. • г * ..

■ - Таблица 4.'

Читрогеназная активность монокультуры Ы-раТийовию и;композитов - .

Вариант- . . ' GgH^ (нмоль/мг белка в мин) •

■ сутки культивирования

4-е 6-е 10-е

NoBtoo paludoeu» штг18 N.paludoeum шт. 18 +*- • R.galegae шт.0702 '■ N.раludoeun тт.18 + • A.radiobecter шт+17 - :0,20+0,01 0,22+0,01 0,53*0,08 0,29*0+10 0,34ї0.06 0,46+0,07 0,42+0,09 1,09+0,17 1,10+0,02

*. - . . .- ■- - . .. ї , ■ " - . * = ■* ■. . • - ■ -• :'*-'.-..:•' v .- , * • .'- - -■ і . л *..,' -Таблица 5«

Содержание белка в монокультуре N.paludooura " ~v ■■ , и в композитах (мг/30шг среда'* • ■. • w ■ ™

.Вариант сутки культивирования * -.

4-е. ' ■ . ь-е ..-.,- 10-е

Nostoo*pajudosum шт;18- N.paludoeum шт.18 + R.gttlrtfy,* uir.O"fO¿ .. ■ N.paludoBum шт. 18 + . Alradiobaotep літ, 17 --1 2,20+0,08 2,б2+и,Я0 2,37+0,2Q ■¿.Уіі+ч.иу 3,56+0,28 4,00+0,37 '4¿a4+u,u¿ 5,28+0,18

5.1. Влияние микробного композита.на козлятник восточный

- Культура козлятника была овыбрана благодаря ее чрезвычайной"*' специфичности к клубеньковым бактериям, Которая.не-развивается:>на ' вновь осваиваемых землях без бактеризации семян, что дает возмож-нооть'.однозначно проследить за эффектом инокуляции, •- Ризогенный аффект ліри, обработке :'семяя козлятника имкробныи : композитом оказался весьма значительнми; длина корней" проростков •4 увеличилась в восемь раз по сравнению с необработанными-семенами • (при обработке одними цианобактериями -■в четыре раза). Обработка ■ семян только штаммами ризобиума также давала-достоверное увеличе-. ние длины корней.проростков, но ризогвнный еффект был значительно ! ниже. г »V . ,■:.. • •-. ••

. - В полевом, опыте "композит; на основе цианобактерий значительно . увеличивал анергию прорастания семян•(рис.5). Это во многом определило последующую разницу в соотоянии растений :(табл.6>. -^

, Наблюдение за козлятником на второй год жизни после обработки

количество ВСХОДОВ ™

♦ер "¿2 «оо

2е.и? -.об ia.ee 19.06 д®та

Р"0.5-£»жз«икз р^сол-к ко"пятршкз при бякт°ризчиии семян.

г.Мрчевткя оймян. К.^а.«»^" от.0?г^ I.- лт.0702+

"Т. рч5 ийоч иг ',пт.

Таблица 6

2~'яки» -ричн ч > кслятника (г°рчыя год)

Лзтэ Бари- "ЯТ Чат^мм" I , тч-т^.г^м" ."у,—'ья яч Рсрни.г/м"^ Клубеньки, шт

П5ГГ ■>-ычссч п:гр„-| пдо-иассз. ¡-"чдь,-г | м' гигро-мчеса ксеро-мз^сч 2 на м На 1 расте нив

11.07 I «2.0 40.0 124.4-| Т.244 171.6 40.0 - -

г ОО.О 1.0ЯЭ 223.2 64.4 . -

13.04 1 158". Ч 2г« ,5( 1,б1> 96 7070 105

л ¿64.? 412,01 3.0*0 »331 308 18870 117

Пр.^.ач'.ч!'». Вчричрт '-'^"ряСо":--» срмоч от.0702? вариант С-о"ра<5ог«я пт.о"''\% 1> .ра1£к*оешг шт. 18. Разница мевду контреирм я епнточ д-стоверна по гсказотелям нч уревне 99.

бакт®риляьшали. пр*"тэрзтамк пэдт^ррлкло явное преимущество бикомпо-зита па сравнению с моно-ггрепзсчтом- (табл.7").

Таблица 7

Влияние бактеризации смян на развитие козлятника. образование и азотфикевцшо клуСвчьксв (втерой год}

N Я8рИ-чнта Ксеромасса НЭДЗО1Ш0К. части за 2 укоса,ц/га Корневая система на- ♦Урожай с°мян. кг/га

ЙМ, см3 ксеромасса. г клу'-ньки

шт. С-чН,. нмоль иг сух» вещества

12. Прчм« ■*у ко» ур^вж 79.79 97.30 !ание. Вари? ггролем и и у 99.9*. 23У0 4020 тты мтом 680 1080 шглоги* достов« 13756 26240 гчы тче >рна т 2.71 3.76 «лицег 6. Р<к > всем пока: 18,41*2,2 24,20*1,0 )няаа мея-тт»ля на

СлАдоватрльво, ссв*>рш°нно "Ч№идно преимущество обработок мукроОЬим <<омпозитЫ яз основе «иряобвктерий по сравнвчяю с чисто? культурой клубеньковА Сзчтррий.

5.2. Влияние микробного композита на горох

Влияние микробного композита на горох было изучено ввегеташ-онно-лабораторном опыте -(прокаленный речной песок, сосуды емкостью 1,2л» увлажнение,питательной средой Кнопа)..и ь полевых условиях..- .

В строго юснтрав1руе»шх условиях вегетационнбго опыта гобработ-- . касемяв гороха микробными препарат»« замейяла применение минерального • азота, (1 вариант,'рис,6 и 7). Так, в варианте с азотом; сред-.: няя высота растений - была см,, в варианте 'с обработкой. ее-

мяи би- и трихомпозитом68,5+3,2 и 63,6+0,9 см, соответственно. Цлсщадь листьев и ксеромасса надземной, части в вариантах4 о бакте»-ризацией семян;(пределы колебаний по вариантам - 544,8-579,0 ом2, : 2,31-2.49 г, соответственно) быладостов^рно вшеконтрольных по- , казателей (462,9 см2 и 2,0 г. соответственно). Та.же картина была ¡ получена при аналое, развития корней: ксеромасса и объем-корневой, ; . системы после микробных обработок бшш вша, чем при использовании ■ митфальшл'о aaoit» (рис.6). - ■ •. , , , ; ; •■ .-■ - -

: ■ при сравнении действия moho-, бя- и трехкомпанентных npenapa-■,: тов стабильный аффект был при сочетании Двух'партнеров;Nostoo- -Rhlzoblun. Как и на козлятнике, обработка семян бикомпозитом при- . -водила.к увеличеипо количества клубеньков до.491 иг на сосуд про- . тив 326, где инокуляция проводилась-одним ризобием. Клубеньки отличались достоверно'более.выоокой нитрогеназной активностью^ <> ■■-■.- Несмотря на то, что агробактеряи хорошо' приживались в ризо- • сфере,(раздел 6), введение их В.композит оказалось малоэффективным.. По-видимому,.вто связано с нереализуемостью способности агробактериб к утилизации труднодоступяых:фосфетов в условиях песчаных культур; .

Полевой опыт бил заложен с использованием в качестве вектора -для внесения ризобий в почву другой, аффективной по ризогенному ч действию циаиобактерии - И.teñera от.9. Как видно из таблицы 8, ,-. даже на фоне высокого урожая гороха, бактеризация семян оказалась ■ . аффективной. ' .■-■■-■. . " • . • ; ■ . .

' . .Обработка семян бикомпозитом,*' также как и в опнтах. о козлят- • , иком, стабилизировала вффект нитрагинизации; увеличив, по сравнению .с ней ксеромассу надземной части гороха на 9,2*, корневой системы >i

• - на 17,4*. а количество клубеньков - на 21%. Урожай семян увели-

• чилоя на 5 ц/га.. ■ ■, •,-..'-..:.■.■ - : :

Таким образом,'использование циаиобактерий как основы бакте- •.. . риального композита на бобовых культурах оказалось- весьма успешным;..

- . я I I

Щзт

Й'С.п. К,"-»яние /■яктер'.'-чции семян на рост гороха в лабораторно-ве r^T'iiui '.-iHc м сп;^". A-i-uLOTa растений» Б-шющадь листьев. В-ксеро-ыоссз чздз"\вдоР 'лети. Г и Д-кееромасса и объем корневой системы,

CDJTFHTLTE^HHO.

■ - Контроль (полная среда Клопа о чзатем) - вариант 1 В ~ R. U-gnmlT '"itira шт. 1022 - вариант 2

РЛ"f^on-i^.L'xriy ««-.1022 t 4,pal.udosum шт. 18 - вариант 3 III" N.piiua_"ijn в~. 14 - вариант 4

°. lfi-jrlr- ■■ I1-«- jt.iQT Ч-pnludoeum ST. 18 A.;-«liot и'и" -.'О вчрионт 5

' нмоль С~Н,/ ;/ 1 кпуб.гч* ;

- Рис.7. Влияние микроодах обработок-семян гороха на:количество ;

. -клубеньков на-корнях. (А)» ихазотфикйирующую активность (Б) и -. ' -., .- субстрата (В) ; содержание азота: в растениях (Г);. Условные обо-.-- •

- .'значения теле, что яа-рис.6., у., . ■ : . ; '. -' -..'.'

Л' *'," '-.'"•'.•■ " '"'.'Л / . - . - -Ч. Таблица 8

■: " / ' Влияние бактериальных препаратов на горох: сорта ' Надежда. \*'■ «. .

N Вариант'. - Ксёромасеа Корневая система. - Урожай,

п/п надземной части, 5 - г/»г- ксеро-масса,, • г/м количество клубеньков шт./реет. -ц/га

1. Контроль , - (без обработки)-: : «'. 140,3+7,4 88,8?2,6 28,1Я,4 41,0+1,1

г; ИДейиШлозагия, 1022 (контроль) 5 ,. 265,7:5,8 106,30,4 : Я,072.2 45¿010,9

3- К. 1в|*!я1поеагит 1022 -+ :МДепега,9• »■ 124,9?4'.7

ь. Изменения иикрг",юлагичеокого статуса псчвн при лнску,"Я1за' бь" р1яльными препаратами

Картина деРетвля ' "'грепзрзтов выла Си не полней определения стни»чи пр1эжг">-к;гл шгочу.-ятз в почве и учета изменений ее микробиологического г">са.

Л""-рптегчо-Р"~ 1!и"Г"ЧНЫЙ стыт показчл, ЧТО В Прокаленном к°ске, рргулр ю тр^питыааечом Сазотистым раствором, хорошо прн-киввет"Я носток (рис.Н), а нп корнях растения - клубеньковые Гак-Т>»р.1Я (рлс.7, А).

Ряс.Н. Численность кл«ток Л.раИЛовит в песке прй о<Грчботке

с°инн горстя различными микробными препаратчми.

1 - Н.1<:'1гцт1по'-чггл "нт. 1022 * N.раЫйозит ят.18;

2 - К-ряХийовит а".*ч;

У - Н»ра1ийрЕ от + Р. 11;>1ит1п&еа1-агг эт. 1022 + А.гжИоеао^г шт.'О.

Расмножеяие монокультуры цианобактерий Сало практически одинаковым е присутствии и отсутствии клубеньковых бактерий. Это Н" расходится с результатами огытсв в жидких культурах, где нрис>тетей е ркссС5й практически не отражалось на плотности клеток востока. А.г-яЛоЬа^ег стимулировал размножение клеток носто^са, численность которых возрастала с .',44 до 5,34 млн/см^, при этсы, как показало применение А.гзШоМс£ег г1ХГ81гг, титр клеток этого микроорганизма в ризосфере достигая 4,5»10** кл./г корней. Очевидно, стимуляция размножения клеток нсетока под вяигашем агробактерий связчна с уве-ззотфиксируг^."й споссис^ти циэне^актерчй (пбл.4).

В полевых счът^х годтвврзлтэ, что бактеризация СеМЯН влияет НЭ Ч/ГГ' "1* ^Г/Чвст» ПЧТИВНОСТЬ 'ТОЧЕК . Тя", ери взятии пробы вз ризосферы КОЗЛЯТНИК"! ^тсрого годз ЖИЗНИ было Сбнаружечо, ЧТО СХОЛО коря^й р".т : \ 'I с+нм — -¡и,- ь ые- "ч ■ "мо

ш"дакатсрсЕ-гр.'0с8 (¿."'»Зб,'1* "*-<с./1 г "•>«« грптг *>.г 1.6,40 .

г "р " ■ " 5 г С! 1 г:^ * и ' ( Л '' Т • Г1Ч~

' ■'-«г " (3,1'1»1>»и И .О. >-4 мгн К.-./1 Г

соответственно); - более чем в .2. раза .возросла численность .свободно-^. ■ живущих клубеньковых бактерий (2,65*0,25 млн.кл./1 г.почвы против. 1,1 з?0;0б), что;сопровождалось увеличением количества клубеньков на растениях (табл.7.и 8). В то *е время в пробе, взятой с поверх- ,-кости почвы, достоверное различие меаду, аариаитамн,№ое1;оо+ЙЫ2оЫш> . и один ЯМгоМит было только. по численности .овободаоживуиих клу- ..-., клубеньковых бактерий! она увеличилась при обработке.семян биком-. позитом на 59,7* (1,55*0,49 мян кл./1 г почвы). • - ; ..

Одновременнокомш1ексантамитеш1{Г.Н.11ерминовой,А.Л.Ковиной) исследовалась возможность изменения..под веянием бактеризации семян фототрофюго компонента почвенной микроОиоты, исходя из : соображения, что цианобактерии могут вотупйть в: тесные взаимоотноиения о еукариотшли водорослями:- Обдай список фототрофов под козлятником составил 96 аидов: цианобактерий - гб, зелены1водороолей - 41," желтозеденых19. диатомовых- - 3,: гшрофитовых - 1, золотистых - 1. Закономерных изменений в видовом еоставефототрофовпривнесении . микробных препаратов в почву не- отмечено.: В то же .время численность водорослей в резных отделах -возрастала при внесешш инокулюма: наиболев/значительно у цианобактврий и зеленых водорослей. Так, на второй, год наблюденийза посевамичисланностьклеток фототрофов , около посевов (контроль) била до 20 тыс./г почвы, под посевами -она достигала в'пяьской и сентяб]^>ской пробах сотен тысяч.:

Изменение микробиологического стетуоа пооле бактеризации, семян мы связываем, в первую очередь,.сувеличением численности вводимых в. почву партнеров композита- цианобактерий и-клубеньковых . бактерий. Влияние на основные гру^ш хемотрофных организмов и "еукариотных водорослей опосредовано через степень, развития рвете-вий, влияющих на проективное покрытие почвы, величину опадаивк--■ оудатов, как источников внергии для хемотрофов. „■ . - »:

выводы' 4 . . . .

.1. Проведен скрининг. птв»4мов инанобакте{ий, коллекции ВГСХА и'вы- 1 делены культуры интенсивного роста» накопления азота и предполага-1-технолотчносян О.рипо1а^ шт.70, М.гепега шт,9, Я.11пок1а ' ВТ.21, н.гаивоогип шт. 13, Л.ра1иЛовит шт.18, Р.1пип<1а1плп шт.8 и ТЛепи1в шт,17. 0птималъная среда дпя их культивирования оказалась ' .'Громова N6. . . .'-. ..- ; . .: . ■•..:>, ,.ч

2.. Показано, что цианобактериж вызывают ризогенный аффект у реете-

ний, который зависит от инокулюма, взятого для обработок, штчмиа

tw3Hc6jKT»prt» и с.....v ывости ta»да и сорта растений. Наиболее оф-

фектиЕшаи и г-рсчек-ивными (по ризогенному действию) в плане раз-рчло^ки биопре"прзта тризнами M.t-nera шт.9 И N.paludosum 18. Наибольший риэогенгай эффект под влиянием цианобактериальных обработок семян получек у растений салата, редиса и козлятника. Реакция гороха зависела от сорта.

3. Подведена основа под аксенизашто цианобактерий и найдены несколько важных стратегий: а) безазоттстые среды наиболее благоприятны для начальной очистки цианобактериР'; б) рекомендуется максимальное освобождение трихомов от слизи, облегчающее последующую очистку клеток от загрязняющей микрофлоры, путем разбивки колоний на качалке со стеклянными бусами и фильтрации суспензии через асбестовый фильтр; в) после этих процедур проводится определение стеаени загрязнения культуры методом высева культуральной жидкости на селективные микробиологические среды, устанавливается видовое разнообразие бактерий-спутников; г) следующий втап заключается в выделении чистых культур бактерий-спутников, идентификация их при этом необязательна: д) с помощью антибиотических тест-колец выявляется индивидуальная чувствительность бактерий-спутников и цианобактерий к спектру антибиотиков; е) устанавливается доза и время действия различных антибиотиков (с контролем за количеством живых клеток цианобактерий) для выбивания определенного (конкретного) спутника и проводится по той же схеме поэтапная очистка от остальных. При невозможности очистить цианобактерию при разовом воздействии антибиотиков следует применить многократную обработку: ж) контроль за чистотой культуры проводится прямым микрои&пированием и сопровождается высевом на провоцирующие органические среды. Используя выше описанную технику, удалось получить в очищенном состоянии культуры Nostoe muECorum шт.272, N.punottforme шт.273 и N.paludosum шт.18.

4. Счищенные культуры цианобэктерий дают возможность- составления на их основе программируемых микробных композитов из нескольких партнеров, в которых »ютотрофный компонент является единственным Продуцентам органического вее°етва и при интродукции в почву он служит -"наитий от неблагоприятных абиотических и биотических факторов.

5. Совместное" культии'рование диазотрофов N.paludosum шт. 18 о

ным бактериям. В свою очередь, Я^1ейае шт.0702 и А.га(11оЪао1ег вт.17 не являются антагонистами по отношению к востоку. Бикомпози-ты Ноегоо-НМгоЫит, Но81оо-А£гоЬа(ие:1г1ит обладают большей интенсивностью роста, нитрогеназной активностью и скоростью накопления белка, чем монокультура Лов^о. Доказана возможность длительного сосуществования заданных партнеров в ассоциации с ностоком. 6.'Показаны существенные преимущества бактеризации семян композитом, по сравнению о чисфой культурой клубеньковых бактерий. Обра-' ботка семян козлятника восточного композитом агрономически значимо увеличивала всхожесть и анергию проростания семян, улучшала ростовые характеристики растений и увеличивала урожай сана на 17,5 ц/га, семян - на 5,8 кг/га, по сравнению о нитрагинизацией. Урожай семян гороха при обработке композитом увеличился на 5 ц/га. ,7. В строго контролируемых условиях песчаных культур использование композита, состоящего из даазотрофных микроорганизмов заменяло; . минеральные формы азота. Высота растений, площадь листьев, ксеро— масса надземной части и корневой системы во всех вариантах с бак- ■, тернзацией семян была достоверно выше или равна показателям у растений получавшим нитратную форму азота.

8. На.основании использования меченого антибиотиками штамма микроорганизма, прямого очета под микроскопом клеток цианобактерий, учета свободно живущих клубеньковых бактерий в почве: и клубеньков на ; корнях бобовых доказано лучшее приживление инокудша при его вне-' оении в форме композита (цианобактерии + ризобии), чем при раздельном применении партнеров. , • .«•-" .

9. Микробиологический статус почвы может быть неоколько изменен ин-тродуцируемыми микроорганизмами: за счет размножения компонентов инокулюыа и опосредованного через растение развития аммонифицирующих микроорганизмов^ Закономерных изменений в видовом ооставефо-тотрофов при внесении микробных препаратов не отмечено, однако» численность их клеток могла быть существенно увеличена. * .

10. Дианобактерии могут быть рекомендованы для создания сложных

' микробных препаратов о перспективой снижения энергетических затрат ори выращивании хемотрофных организмов, стабилизации аффекта интродукции агрономически полезной микрофлоры в почву.,

. По материалам диссертации опубЛиковвнн следующие работы:

1. Панкратова К. М., Калинин А. А. Цианобактерии, как возможные ' организмы для создания бактериальных препаратов '//. Сб. науч. -

статей / Роль научных исследований в развития сельскохозяйственного производства Кировской области.- Киров, 1991.- С.25-33.

2. Калинин А. Д., Бородина Н. В., Ковина А. Л. Влияние гетероцист-них цианобактерий на рост и развитие гороха //Микроорганизмы в сельском хозяйстве: Тез докл. IV всесоюз. науч. конф. 20-24 января 1992 г.- Пущино, с. 79.

3. Калинин А. А., Мезенцева Р. В., Ковина А. Л. Бактериальный ком-ш зит и его влияние на микрофлору почв // Рациональное использование земельных ресурсов России: Тез. докл. науч.-произвол, конф,-Киров, 1993.- С. 121-122.

4. Панкратова Е. М., Калинин А. А. Акоенизация цианобактерий // Ai-рономическая наука - достижения и перспективы: Тез. док. науч. конф. 9-Ю июня 1994 г.- Киров, 19Q4.- С. 19-20.

5. Калинин А. А., Ковина А. Л.. Панкратова Е. М., Перминова Г. Н. Шанобактерии как возможные организмы для создания диазотрофных микробных препаратов и их влияние на растения // Современные проблемы почвоведения и экологии: Тез. докл. конф. молодых ученых факультета почвоведения МГУ, 23-28 мая 1994 г.- Москва, 1994.- С. 82

6. Pankratova Ye. К., Kalinin A. A., Kovlna A. L. Growth interaotl on between Nostoo and Rhlzobium // I0tn International congress on Nitrogen Fixation 28 May - 3 June 1993.- Saint-Petersburg, Russia, 1995.- P. 665.

7. Pankratova Ye. M.. Kalinin A. A., Kovlna A. L. Growth Interaotl on between Nostoo and Rhlzoblum // Prooedlgs of the l£>-th International Congress on Nitrogen Fixation (в печати).

Объем IV2 п л

Заказ 857

Тираж 100

Типография издатечьства Московской с х академии им К А Тимирязева 127550 Москва И 550 Тимирязевская ул, 44