Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Начальные стадии адгезии Bacillus licheniformis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Начальные стадии адгезии Bacillus licheniformis"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

Направахрукописи

РОДИОНОВА Татьяна Анатольевна

НАЧАЛЬНЫЕ СТАДИИ АДГЕЗИИ BACILLUS LICHENIFORMIS

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2004 г.

Работа выполнена на кафедре ботаники и микробиологии Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.В. Шеховцова. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан. кандидат биологических наук И.В. Ботвинко.

Ведущее учреждение:

Институт физико-химиических и биологических проблем почвоведения РАН.

Защита состоится 10 июня 2004 года в 15 часов 30 мин. На заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, корп. 12, биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета

МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного совета

Актуальность проблемы. Адгезия - явление, широко распространенное в мире микроорганизмов и уже многие годы являющееся объектом пристального внимания микробиологов.

Прикрепление к поверхности и дальнейший рост в адгезированном состоянии являются факторами, оказывающими сильнейшее влияние на процессы жизнедеятельности микробов. Прикрепление к твердым поверхностям делает возможным потребление нерастворимых субстратов, изменяет скорость метаболизма микроорганизмов, позволяет им концентрироваться, обмениваться информацией и энергией и создавать сложные сообщества биопленок.

Прикладной аспект изучения бактериальной адгезии - это помехи, создаваемые биопленками, биокоррозия субстратов прикрепления с одной стороны, а также использование иммобилизованных микроорганизмов в биотехнологических производствах и очистке сточных вод - с другой.

К настоящему времени установлено, что адгезия микроорганизмов зависит от свойств их клеток, свойств адсорбента, состава среды, в которой происходит адгезия, от условий, определяющих возможность контакта клеток с поверхностью адсорбента [Звягинцев, 1973; Звягинцев, 1987, Marshall, 1984; 1989; 1996; van Loosdrecht, 1988]. Жизнь в биопленке дает микроорганизмам ряд преимуществ: повышенную устойчивость к действию антибиотиков [Evans et al., 1991; Coquet et al., 1998; Amorena et al., 1999; Anderl et al., 2000; Donlan, 2002;], к неблагоприятным значениям pH [Li et al., 2001], к повышенной температуре и высыханию [Звягинцев, 1973], к литическому действию бактериофагов [Hughes, Sutherland, Jones, 1998; 1998; Sutherland, 2001], а также к действию хлора, озона и УФ излучения [Flemming, Schaule, 1994]. При этом не следует думать, что адгезирован-ные клетки бактерий всегда получают преимущество перед свободноплавающими. Иногда прикрепление снижает скорость метаболических процессов микроорганизмов [Звягинцев, 1973; 1987].

Актуальным остается изучение особенностей первой быстрой и часто обратимой стадии бактериальной адгезии. Необходимо определить, является ли она лишь отражением баланса физико-химических взаимодействий в системе, либо же это активная адаптивная реакция, связанная с освоением нового местообитания и

• ........ .MdibHAD I

БИБЛИОТЕКА ]

, ¿"ГШ!

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Изучить особенности начальных» стадий адгезии, физико-химические и биологические механизмы их регуляции, а также их роль в стрессоустойчивости бактерии, выделенной из пластовой воды, загрязненной буровым раствором.

Основные задачи исследованиям

1. Идентифицировать способный к адгезии микроорганизм, выделенный из термальных высокоминерализованных пластовых вод, загрязненных буровым раствором.

2. Провести сравнительное исследование скорости роста и первичного прикрепления изучаемого микроорганизма в широком диапазоне значений разных физико-химических факторов среды (температуры, рН, солености и др.).

3. Выяснить роль первичной обратимой адгезии в стрессоустойчивости исследуемого микроорганизма.

4. Выделить, идентифицировать и исследовать некоторые особенности вещества, фактора ауторегуляции обратимой адгезии исследуемого микроорганизма.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые проведено систематическое исследование начальных стадий адгезии дикого штамма микроорганизма, выделенного из термальных» пластовых вод, загрязненных буровым раствором.

1. Изучены физиологические и биохимические свойства, а также особенности периодического роста в жидкой культуре бактерии Bacillus licheniformis 603.

2. Выявлены закономерности влияния различных физико-химических факторов на рост и величину первичной адгезии исследуемого микроорганизма.

3. Описаны физико-химический и ауторегуляторный механизмы адгезии на начальных этапах периодического роста культуры исследуемого микроорганизма.

4. Впервые показана защитная функция обратимой) адгезии у В. licheniformis 603 при воздействии химического стрессора N-этилмалеимида.

5. Выделено, идентифицировано и исследовано вещество - ингибитор обратимой адгезии В licheniformis 603.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. Новые данные о механизмах регуляции обратимой адгезии бактерий могут быть использованы для разработки эффективных методов контроля биообрастаний в биореакторах и гидротехнических системах.

2. Было показано, что антиадезин Bacillus licheniformis, циклический ли-попептид, кроме антиадгезионной активности в отношении бактерии-продуцента, обладает еще избирательным антибактериальным действием, подавляя рост коринебактерий, и может быть рекомендован для дальнейших испытаний на пригодность в качестве средства против заболеваний, вызываемых этими бактериями.

Результаты диссертации введены в учебный процесс по дисциплине "Экология микроорганизмов" и могут быть введены в общий курс "Микробиология" в раздел "Регуляция жизнедеятельности микроорганизмов". АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ; Основные положения и результаты работы были доложены на Всероссийской конференции "Биоповреждения в промышленности" (Пенза, 1994); Всероссийской конференции "Биосинтез и деградация микробных полимеров; Фундаментальные и прикладные аспекты" (Пущине, 1995); IV Конференции молодых ученых "Актуальные проблемы биологии" (Сыктывкар, 1996); Областной конференции "Вузовская наука в решении экологических проблем Верхне-Волжского региона" (Ярославль, 1996); Международной конференции "Микробное разнообразие" (Пермь; 1996), Областной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Современные проблемы естествознания. Биология. Химия". (Ярославль, 1997); на 9 и 10-й Международных конференциях по бациллам (Лозанна, Швейцария, 1997; Осака, Япония, 1998); трех Международных симпозиумах по подземной микробиологии (Давос, Швейцария, 1996; Колорадо, США, 1999: Копенгаген, Дания, 2002); Международном симпозиуме по прикладной микробиологии и бактериологии (Париж, Франция, 2002).

ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 130 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы (5 глав), описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и выводов. Работа проиллюстрирована 16 рисунками, 8 таблицами и 1 схемой. Список использованной литературы включает 183 источника.

Автор выражает глубокую признательность Ю.А. Николаеву, Н.С. Паникову и СТ. Батракову за помощь в работе и ценные рекомендации. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Объектом данного исследования являлись бактерии штамма 603, выделенные методом Холодного (с использованием стекол обрастания) [Звягинцев, 1991] из пластовой воды, загрязненной буровым раствором. Выделение проводили из пласта с температурой 54 °С. Бактерии из биопленок пересевали на поверхность агари-зованной среды LB [Sambrook, Fritsh, Maniatis, 1987]. Исследуемый микроорганизм был выделен на третьи сутки после погружения стекол.

Идентификация исследуемых микроорганизмов. Микроскопирование исследуемой бактерии проводили с помощью микроскопа Docuval, (Carl Zeiss, Jena, Германия) с фазовым контрастом прижизненно, а также после окраски по Граму. Физиолого-биохимические свойства изучали общепринятыми методами [Герхард, 1983; Звягинцев, 1991; Claus, Berkeley, 1986]. Способность к росту при различных уровнях солености и значениях температуры, а также рН среды проверяли на среде LB. Возможность использования различных веществ в качестве источников углерода и энергии определяли на минеральной среде М9 [Sambrook, Fritsh, Maniatis, 1988] по нарастанию светорассеяния (Spicol, Carl Zeiss, Jena). Способность использовать в качестве источника углерода н-алканы определяли на среде Буш-нелла-Хааса с 0,5 % углеводородов [Звягинцев, 1991]. Образование газа или кислоты при использовании того или иного источника углерода определяли на синтетической среде с индикатором [Шелоболина и др., 1997].

Определение последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК осуществляли стандартным методом термоциклического секвенирования (CD 3000 D Science Tec) с использованием в качестве матрицы гена 16S рРНК исследуемого организма [Rudner et al, 1998]. Для ДНК-ДНК гибридизации использовали штаммы Bacillus subtilis BKM 1537 и В. licheniformis В (ИН-МИРАН). Содержание ГЦ-пар в ДНК находили с помощью кривых термической денатурации. Определение уровня гомологии в ДНК осуществляли методом оптической реассоциации по Де Лею [De Ley et al., 1970].

Анализ жирно-кислотного состава липидов исследумого микроорганизма был проведен д.б.н. Осиповым Г.А. в НЦССХ им. А.Н. Бакулева (Москва)

Методы изучения периодического роста и бактериальной адгезии.

Все эксперименты были проведены по следующей схеме. Вегетативные клетки, взятые из экспоненциальной фазы культуры В. licheniformis 603, растущей в оптимальных условиях (45 °С; рН 7,5) в среде М9, отделяли от культуральной жидкости (КЖ) фильтрованием (Millipore, 0=0,45 мкм) и ресуспендировали в свежей М9, с заданным значением исследуемого показателя (температуры, рН, концентрации NaCl или СаС12, концентрация и тип источника углерода) так, чтобы исходная ОП540 полученной суспензии была 0,05 — 0,07. Колбы с суспензией помещали на термостати-руемую качалку (100 об./мин) и регистрировали изменение OIIj4o бактериальной суспензии (Spicol, Carl Zeiss, Jena). О величине первичной адгезии В. licheniformis 603 на стекле колб судили по первоначальному снижению ОП540 [Николаев, Проссер, Паников, 2000].

Для подтверждения того, что причиной снижения ОП540 клеточной суспензии является адгезия, а не лизис определяли концентрацию белка по Лоури в КЖ, концентрацию СО2 в газовой фазе герметично закрытого флакона на ИК-анализаторе Инфралит 4 ("Junkalor Dessau", Германия) [Николаев, Проссер, Паников, 2000], а также количество жизнеспособных клеток в бактериальной популяции: бактерии подвергали десорбции встряхиванием со стерильными стеклянными шариками. Качество десорбции и наличие агрегатов клеток проверяли микроскопированием. Количество жизнеспособных клеток в полученной после десорбции суспензии определяли методом серийных разведений Коха [Герхард, 1983], высевая на среду LB.

Микроскопические наблюдения за ходом бактериальной адгезии проводили следующим образом: стеклянный сосуд с суспензией отмытых от КЖ клеток и предметными стеклами, погруженными в нее и закрепленными в вертикальном положении, помещали на термостатируемую качалку. В процессе культивирования каждые 5-10 мин измеряли ОП540 бактериальной суспензии, а также поочередно вынимали, ополаскивали в стерильной среде М9 и высушивали предметные стекла. Препараты фиксировали в пламени, окрашивали водно-спиртовым раствором фуксина и мик-роскопировали прикрепленные клетки.

Культивирование во всех экспериментах проводили в течение 1,5 -2,5 часов. Все эксперименты повторяли не менее 4 раз. Для расчета и ве-

личины адгезии, выраженной в процентах от исходной ОП540, применяли синтетическую хемостатную модель СХМ [Паников, 1991] и эмпирическую модель бактериальной адгезии [Паников и др., 2003; Родионова и др., 2003]. Определение параметров математических моделей проводили таким образом, чтобы минимизировать среднюю квадратичную ошибку имитации, для подгонки параметров модели использовали Solver, Excel, Microsoft Office 1997. На численные значения параметров накладывали дополнительные ограничения, следующие из биологического смысла, а также предварительных кинетических данных.

Для определения влияния антибиотиков на адгезию исследуемой бактерии в процессе голодания к отмытым от глюкозы и ресуспендирован-ным в не содержащей источника углерода среде клеткам немедленно добавляли гидрохлорид доксициклина (Феррейн) и левомицетин (ХФК Акрихин), растворенные в 96 %-ом спирте.

Определение роли обратимой адгезии в профилактике стресса исследуемого микроорганизма. Две субпопуляции бактерий (адгезированные и свободноплавающие) были разделены в момент максимальной адгезии путем переноса бактериальной суспензии в другой сосуд (в первый добавляли свежую среду), и подвергнуты действию сильного окислителя, N-этилмалеимида (NEM), Sigma. Через 20 мин бактерии десорбировали встряхиванием со стеклянными шариками. Количество бактерий в обеих субпопуляциях определяли методом разведений Коха.

Экстракция ингибитора ОА - антиадгезина (А) из КЖ и бактериальных клеток, его анализ и изучение структуры и свойств. Исследуемое вещество (А) экстрагировали хлороформом из КЖ и биомассы и очищали хроматографически [Rouser et al., 1963], метилировали СНг^и подвергали ИК-спектроскопии (Specord 71, Carl Zeiss, Германия) и ЯМР [Batrakov et al., 2003]. Полученную в результате кислого гидролиза А смесь аминокислот анализировали, используя тонкослойную хроматографию (ТСХ) и газожидкостную хромато-масс-спектрометрию ГХ-МС. Конфигурацию аминокислот определяли, окисляя L-и D-оксидазами [Debono et al., 1987]. Ли-пофильную фракцию гидролизата антиадгезина метилировали, полученные таким образом метиловые эфиры жирных 3-гидрокси кислот анализировали методами ГХ-МС и ЯМР [Batrakov et al., 2003].

Антимикробную активность А проверяли методом диффузии в агар, используя в качестве тест-объектов: В. licheniformis В и В. subtilis В1537 (ИнМи РАН); Pseudomonas fluorescens NCIMB 9046 (National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen UK), Corynebacterium variabilis Ac1122 (BKM, Москва); Micrococcus sp., Escherichia coli MC 4100, Candida drymidis CL-5, Trichoderma coningii (ИнМи PAH); Rhodococcus erythropolis-Ac 74 (Институт генетики и экологии микроорганизмов РАН, г. Пермь) и-Acinetobacter sp. (ЯрГУ им. П.Г. Демидова). Антибиотиком сравнения служил доксициклин.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Идентификация исследуемого микроорганизма

Морфология клеток, характер колоний. Исследуемые бактерии представляли собой прямые спорообразующие палочки, окрашивающиеся по Граму положительно. Вегетативные клетки палочковидной формы (3-3,75^0,4-0,6 мкм) одиночные или в коротких цепочках, подвижны. Споры эллипсоидные, расположены в центральной части клетки.

Физиолого-биохимические свойства. Исследуемые микроорганизмы являлись хемоорганотрофами с дыхательным и факультативно анаэробным типом метаболизма, способными утилизировать довольно широкий спектр органических субстратов (табл. 1).

Таблица 1

Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов штамма 603

Окраска по Граму + Утилизация:

Ширина клеток, мкм 0,4-0,6 Пирувата +

Длина клеток, мкм 3-3,75 Формиата -

Наличие спор + Изопропанола -

Форма спор Э Этанола -

Расположение спор ц Гексана -

Вздутость спорангия - Октана -

Подвижность + Декана -

Анаэробный рост + Тетрадекана +

Каталазная активность + Гексадекана +

Лецитиназная активность Докозана +

Тест Вогсс-Проскауэра + Дезаминирование фенилаланина -

Образование кислоты без газа из: Образование индола -

Б-Глюкозы + Рост на среде ЬВ, рН

Ь-Арабинозы + 6,8 +

О-Фруктозы + 5,7 +

Сахарозы + Температура, °С

Лактозы - 10 -

О-Мальтозы + 15 +

Ь-Рамнозы + 20' +

О-Ксилозы + 25 +

Глицерина + 30 +

Э-Сорбита + 35 +

О-Маннитола' + 40 +

Гидролиз крахмала + 45 +

Гидролиз казеина + 50 +

Гидролиз желатины - 55 +

ъю3-»мо2 + 60 -

Утилизация: Концентрация NaCl, %

Лактозы + 0

Цитрата + 3 +

Малата + 5 +

Сукцината + 7 +

Бутирата - 10 +

Пропионата + 15 +

Лактата + 20 -

Обозначения:"+" - положительная реакция,"-" - отрицательная реакция, "Ц" - центральное, "Э" - эллипсоидные

Генотипическая характеристика. Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК, проведенный с помощью программы BLAST по базе данных GenBank, определение количества ГЦ-пар в ДНК и степени гомологии (табл. 2) а также определение жирно-кислотного состава липидов показали, что выделенный штамм относится к виду Bacillus licheniformis.

Таблица 2

Нуклеотидный состав и уровень гомологии ДНК штамма 603, Bacillus licheniformis В и Bacillussubtilis BKM1537

Штамм ГЦ, мол%- Уровень гомологии ДНК, %

Bacillus licheniformis В Bacillus subtilis ВКМ 1537

Bacillus licheniformis В 46,5 100

Bacillus subtilis ВКМ 1537 44,3 12 100

Bacillus sp. 603 47,0 85 14

Бактерии этого вида широко распространены в природе и исполь-

зуются в биотехнологических производствах. Однако к настоящему времени имеется немного сведений об адгезивных свойствах этого микроорганизма и о возможности его участия в образовании биопленок.

2. Влияние физико-химических факторов окружающей среды на периодический рост и адгезию B.lichenlformis 603

Бактерия В. licheniformis 603 способна к обратимой адгезии на стекле культиватора (рис.1, А). Подобное явление было хорошо охарактеризовано ранее на примере Р. Дыо^сет [Николаев, Милько, 2000; Николаев, Прос-сер 2000, Николаев, Проссер, Виттли, 2000, Николаев, Паников, 2002]. Обратимое прикрепление псевдомонады особенно хорошо проявляется при введении в свежую среду небольших количеств инокулята или клетками, отмытыми от КЖ. Данный процесс сопровождается обратимым снижением ОП бактериальной суспензии.

В отличие от Р. Аиоесет исследуемая бацилла адгезировалась при резком изменении условий культивирования, например при снижении температуры на 15 °С (рис 1, А). Цикл прикрепления-открепления проходил гораздо быстрее чем у псевдомонады (в течение 30 мин) Так же как и у Р. Дыо^сет собственная КЖ ингибировала процесс адгезии В. licheniformis 603 (РИС. 1. Б2).

А I 4Г А 1 Я

Рис 1. А. Динамика ОП540 суспензии клеток В.licheniformis 603, выращенных при 45 °С, отмытых от КЖ и помещенных в свежую среду (1) и прикрепленных к стеклу бактерий, по данным микроскопии (2).

Б. Динамика ОП540 суспензии клеток В.licheniformis 603, выращенных при 45 °С, отмытых от КЖ и помещенных в свежую среду (кривая 1) или в свежую среду с добавлением 50 % фильтрата культуральной жидкости (кривая 2) при 30 °С.

О 20 40 60 80 мин

0 20 40 60 80 100 МИН

Мы проследили корреляцию между степенью проявления способности к первичной адгезии исследуемого штамма и оптимальностью условий

для роста. Критерием оценки оптимальности являлась удельная скорость роста (д ч'1),

1_2 1----------------—. во Нами было пока-

зано, что отклонение значения температуры среды от оптимального для роста вызывает прикрепление клеток исследуемого микроорганизма (рис. 2). Оптимум адгезии наблюдали при супра- и субоптимальных температурах культивирования.

Большее отклонение от оптимума снижало процент адгезии, которая становилась необратимой (рис.3).

Значение рН не оказывало влияния на адгезию исследуемого микроорганизма в диапазоне роста (рис. 4). Наблюдали лишь необратимое прикрепление

с. 2.

(1) и

и только при экстре мально кислой для В.

Рис. 3.' Динамика 0П540 О), КОЕ (2) и концентрации бежка33ДшКййка10Пы) В У}Кг@т?аут шбОЗнцяоращии шлкае(32 вСКЖ культуры В. кекет/огтгя 603 при темпе

рЩрег§тОт® 603 реакции среды (рис. 5). /гс/геж/опии 603 реакции среды (рис. 5).

Влияние №С1 и Саг+ (рис. 5 и 6) можно описать кривой адсорбции Лэнгмюра. Адгезию наблюдали лишь при концентрациях в значительной степени замедляющих рост В. 11екет/агт1$ 603.

Результаты по влиянию температуры на адгезию В. liеhemfаrmis 603 отличаются от литературных данных. Зависимость адгезии и таких мик-

роорганизмов как P. fluorescens, Enterobacter cloacae, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus, Lactobacillmplantarum и Chromobacter

sp. от температуры находятся в прямой коррелляционнои связи друг с другом [McEldowney, Fletcher, 1988; Reina, Flemming, Breidt, 2002; Wolska et al., 2002].

В то же время ряд микроорганизмов прикрепляется к поверхности преимущественно при неблагоприятных (как правило, слишком высоких) для роста значениях температуры, как было показано на Archaeoglobus fulgidus [LaPaglia, Hartzell, 1997] и S. epidermidis [Rachid et al., 2000].

Адгезия В. licheniformis 603 не вписывается ни в одну из этих схем. Ее величина обратно коррелирует с ц. Тот факт, что максимумы адгезии наблюдались при супра- и субоптимальных условиях, указывает на активный адаптивных характер этого процесса, важную роль в осуществлении которого, по-видимому играют собственная подвижность бактерии и усиленный синтез адгезинов при неоптимальных для роста условиях [Donlan, 2002; Dunne, 2002].

Результаты по влиянию концентрации if, NaCl и Са2+ на начальные стадии адгезии В. licheniformis 603 находятся в согласии с данными, полученными в экспериментах с другими микроорганизмами, и подтверждают адекватность теории ДЛВО. С другой стороны, в случае с NaCl и Са2+, очевидно, что адгезия происходит тогда, когда скорость роста заметно снижена. Можно предположить, что адгезия исследуемого микроорганизма при повышении концентрации NaCl и Са2+ является приспособительной неспецифической реакцией, осуществляемой за счет особенностей строения поверхности клеток.

3. Источники углерода, экзогенное голодание и адгезия В. licheniformis 603

Концентрация и вид источника углерода оказывали влияние на способность исследуемой бациллы к адгезии: клетки, выросшие в среде с источником углерода, обеспечивающим рост с высокой скоростью (глюкоза) и перенесенные в среду с неоптимальным источником углерода (ацетатом) или в голодную среду адгезируются на стекле сосуда (рис. 8). Это подтверждает полученные ранее сведения о формировании фенотипа преимущественно адгезионного типа при голодании у морских вибрионов и спирилл [Kjellerberg, Hamphrey, Marshall, 1982, 1983, Kjellerberg, 1984], Aci-

Рис. 8. Влияние источника углерода на удельную ско-ростьроста (1)мадге5шю(2))ffil/Chten$ormís603.

netobacter sp. [James et al., 1995], микроорганизмов ротовой полости [Bowden, Hamilton, 1984] и т.д. Считается, что прикрепление во время голодания является приспособительной реакцией, позволяющей: 1) утилизировать молекулы органического вещества, сорбированные поверхностью [Morgan, Dow, 1986; Marshall, 1996]; 2) снизить энергетические затраты на передвижение [Паников, 1991]. Показано, что адгезия голодающих микроорганизмов замедляет их гибель [Шеховцова, 1988; Шеховцова, Паников, Дорофеев, 1988; Паников, 1991].

Интересно, что введение антибиотиков (левомицетина или докси-циклина) в голодающую культуру В. licheniformis 603 в субингибиторных концентрациях еще более ускоряло процесс адгезии и увеличивало максимальное количество прикрепляющихся клеток (рис. 9).

Рис 9. Влияние доксициклина (А) и левомицетина (Б) на величину адгезии, вызванной голоданием (1), и ее скорость (2).

Возможно, антибиотик, как дополнительный стрессирующий агент, ускоряет синтез адгезина. Такой факт уже был описан ранее на примере S epidermidis [Rachid et al., 2000]. Однако, имеются сведения об ингибирую-щем воздействии хлорамфеникола на прикрепление к твердой поверхности морских бактерий [Раилкин, 1998], а ванкомицина и тейкопланина на адгезию некоторых штаммов стафилококков [Carcenty-Etess et al., 1993; Drago etal., 1003].

4. Роль обратимой адгезии в защите клеток В. llcheniformis 603 от летальных воздействий

Имеется немало сведений о большей устойчивости адгезированных микроорганизмов к антимикробным факторам. Однако при ближайшем рассмотрении оказывается, что вся эта информация относится лишь к обитателям биопленок с развитым матриксом, который в большинстве случаев играет ключевую роль в устойчивости микроорганизмов к стрессирующим воздействиям. До настоящего времени не было сведений о чувствительности к биоцидам обратимо прикрепленных бактерий. Нам удалось показать протекторную роль состояния обратимой адгезии В. licheniformis 603 при действии N-этилмалеимида (NEM). Доля выживших клеток была на порядок выше в иммобилизованной части популяции (рис. 10).

Защитное действие состояния обратимой адгезии может быть объяснено изменением уровня экспрессии некоторых генов. Так, например, уже в первые минуты контакта с поверхностью в клетках P. aeruginosa усиливается экспрессия генов, ответственных за выработку альгината и супероксиддисмутазы [Donlan, 2002; Sauer et al., 2002]. He исключено также, что прикрепление клетки инду-

Рис 10. Выживаемость прикрепленных цирует гежрШГООШтью изменения

И свободноплавающих клет°к в. конформации мембранных структур, licheniformis 603 при действии N-

этилмалеимида (NEM). изменяющие их устойчивость и

функциональную активность [Конев, 1987].

5. Структура и свойства ауторегулятора обратимой адгезии В. licheniformis603 (Антиадгезина)

Как и в случае обратимой адгезии Р.Аиогеъсет первичное прикрепление В. Искет/огт1$ 603 регулируется самой бактериальной популяцией. Анализ КЖ и биомассы В. Искет/огт1$ 603 показал, что при росте в благоприятных условиях при определенной плотности популяции

исследуемая бацилла выделяет в среду вещество липопептидной природы являющееся ингибитором адгезии, - антиадгезин (А) (рис. 11). Структура А представлена на схеме 1. Вещество такой структуры выделено впервые. А является аналогом лихенизинов и сурфактина,

био-ПАВ, синтезируемых разными штаммами В. licheniformis и В. subtilis, соответственно [Konz et al., 1999; Doekel, Marahiel, 1999; Yakimov et al. 1999]. И сурфакти— ны, и лихенизины являются поверхностно активными веществами и демонстрируют некоторое антибактериальное, фунгицидное [Vater, 1986; Yakimov et al, 1995] и антивирирусное [Naruse et al., 1990; Itokava et al., 1994] действие. -Полученные нами результаты дополняют и поясняют данные Ко-лари с соавторами об ингибирова-

<jX)OR СН(СН,)2 CH(CH3)j ROCO^Hj СН(СН3)2

СН2 CHj CHj CK(CHJ)j CH(CHJ)J CHj ^H,

(CHjbCH(CH2), CHjCHCHJCONHCHCO- NHCHCO-NHCHCO-NHCHCO- KHCHCO- NHCHCO-NHCH | L-Asp L-ltil L-Liu L-Val L-Val L-Glu i-iiiij

О-CO

Схема 1. Химическая структура антиадгезина (А)

нии образования биопленки Deinococcus geothermalis при совместном культивировании или добавлении бесклеточного экстракта В. licheniformis [Kolari, Nuutinen, Salkinoja-Salonen, 2001].

Выделенный нами липопептид проявлял некоторую антибактериальную активность, выразившуюся в подавлении роста С. variabilis (табл. 3).

0 15 30 45 60 75 90

мин

Рис. 11. Динамика ОП540 суспензии клеток экспоненциально растущей культуры В. licheniformis 603, помещенных в свежую среду (1), среду, содержащую 50 % КЖ (2), среду, содержащую антиадгезин, 1,6 мкг/мл (его нормальная концентрация в КЖ) (3)

По сравнению с сурфактином В. subtilis, который в значительной степени подавляет рост таких бактерий, как A. calcoaceticus, Alcaligenes eu-trophus, Е. coli, Enterobacter sp., P. fluorescens, R. globerulus, S. aureus, B. cereuSy B. Ucheniformis и некоторых штаммов В. subtilis, а также с лихени-зинами [Yakimov et al., 1995], антиадгезин В. Ucheniformis 603 обладает более высокой избирательностью антимикробного действия.

Таблица 3

Антимикробная активность антиадгезина в сравнении с гидрохлоридом докси-циклина_

Микроорганизм Диаметр зоны подавления роста, мм

Доксициклин Антиадгезин

Bacillus Ucheniformis 603 30 0

Bacillus Ucheniformis В 19 0

Bacillus subtilis В1537 28 0

Micrococcus sp. 22 0

Escherichia coli 0 0

Pseudomonas fluorescens 14 0

Corynebacterium variabilis 19 10

Acinetobacter sp. 34 6

Rhodococcus erythropoüs 18 0

Candida drymidis 0 0

Trichoderma coningii 0 0

Таким образом, полученные нами результаты, позволяют констатировать активный характер начальных стадий адгезии В. исквпг[огт18 603. Прикрепление исследуемой бациллы является адаптивной реакцией. В благоприятных условиях рост происходит преимущественно гомогенно. Внезапное изменение условий культивирования (изменение температуры, концентрации №С1 или изменение качества источника углерода и голодание) инициируют этот процесс прикрепления. В диапазоне ростовых значений физико-химических показателей среды адгезия является обратимой и часто соответствует фазе замедленного роста. В состоянии обратимой адгезии исследуемый микроорганизм более устойчив к действию ядов. Процесс первичной адгезии находится под контролем со стороны микробной популяции, в ходе экспоненциального роста клетки выделяют в среду ингибитор бактериальной адгезии.

ВЫВОДЫ,

1. Исследован и идентифицирован способный к адгезии микроорганизм из термальных пластовых вод, загрязненных буровым раствором. По совокупности физиолого-биохимических и генотипических признаков этот организм отнесен к виду Bacillus Hcheniformis.

2. Впервые исследованы условия и регуляторные механизмы начальных стадий адгезии В. Hcheniformis. Установлено, что величина и продолжительность обратимой адгезии регулируются как физико-химическими факторами среды (температура, рН, ионная сила раствора), так и биологически, за счет образования внеклеточных метаболитов.

3. Впервые экспериментально показано адаптивное значение обратимой адгезии бактерий - при летальных воздействиях токсиканта, N-этилмалеимида.

4. Впервые выделен и идентифицирован ауторегулятор обратимой адгезии В. Hcheniformis (антиадгезин), по своей структуре являющийся циклическим липопептидом.

5. Обнаружено, что антиадгезин В. Hcheniformis, помимо регуляции адгезии клеток продуцента, проявляет также высокоспецифичное антибактериальное действие в отношении коринеформных бактерий, тем самым, являясь полимодальным ауторегулятором-адаптогеном, ингиби-руя адгезию и численность возможных конкурентов.

ПУБЛИКАЦИИ

1. Шсховцова Н.В., Родионова Т.А. Обоснование новой стратегии в поиске биоцидов для микробных обрастаний// Всеросс. конф. Биоповреждения в промышленности", Пенза, 1994, С.30-31.

2. Шеховцова Н.В., Родионова Т.А. Влияние силикатов на синтез экзополиса-харида бациллами// Всеросс. конф. "Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты", Пущино, 1995, С. 61.

3. Верховцева Н.В., Шеховцова Н.В., Кондакова Г.В., Рыжикова И.А., Родионова Т.А. Структурные группы биоценоза подземной биосферы// Разведка и охрана недр, 1996, № 7, С. 37 - 39.

4. Шеховцова Н.В., Родионова ТА. Выделение и изучение гелеобразующих бактерий подземной биосферы// Тез. межд. конф. "Микробное разнообразие", Пермь, 1996, С. 125 - 126.

5. Верховцева Н.В., Шеховцова Н.В., Рыжикова И.А., Родионова Т.А. Использование подземных ресурсов и концепция глубинной биосферы// Тез. обл. конф. "Вузовская наука в решении экологических проблем ВерхнеВолжского региона", Ярославль, 1996, С. 36 - 37.

6. Shekhovtsova N.V., Rodionova ТЛ. The distinctive properties of the underground microorganisms liberated at the glasses of colonisation// Abstracts of Int. Symp. on Subsurface Microbiology, Davos, 1996, P. 158.

7. Шеховцова Н.В., Родионова ТА. Сравнительная характеристика микроорганизмов, выделенных из Медягинской и Воротиловской скважин методом обрастания// Обл. конф. "Современные проблемы естествознания. Биология. Химия", Ярославль, 1997, С. 131 - 132.

8. Verkhovtseva N.V., Shekhovtsova N.V., Rizhikova I.A., Kondakova G.V., Rodionova Т.А. Bacilli of the deep subterranean biosphere// 9th Int. Conf. on Bacilli, Lausanne, 1997, P. 177.

9. Родионова Т.А., Шеховцова Н.В., Брума Д.Ю., Литвиненко Э.С. Влияние температуры на рост и выживание гелеобразующих бацилл в гетерофазных средах// Современные проблемы биологии и химии, Ярославль, 1998, С. 87 -92.

10.. Rodionova TA., Shekhovtsova N.V., Litvinenko E.S., Bruma D.J. Solid phase influence on Bacillus sp. survival under nitrogen deficit stress// Conf. on Bacilli, Osaka, 1998, P. 33.

11. Shekhovtsova N.V., Rodionova T.A., Bruma D.J., Litvinenko E.S. Thermal subsurface factors influence on allochtonic bacilli survival ways// Int. Symp. on Subsurface Microbiology, Colorado, 1999.

12. Rodionova T.A., Nikolaev Y.A., Shekhovtsova N.V., Panikov N.S. Reversible adhesion of Bacillus licheniformis is an active adaptive response to unfavourable growth conditions// Int. Symp.on Bacteriology and Appl. Microbiology, Paris, 2002.

13. Rodionova T.A., Shekhovtsova N.V., Panikov N.S., Ryzhikova I.A., Turova T.P., Nikolaev Y.A. Isolation and identification of microorganisms which are primary colonizators of solid surfaces in parametrical borehole// Int. Symp. on Subsurface Microbiology, Copenhagen, 2002, P. 51.

14. Шеховцова Н.В., Кондакова Г.И., Осипов Г.А., Родионова Т.А., Хохлов С.С., Яковлев М.Ю. О некоторых особенностях выделения микроорганизмов - аборигенов глубоких горизонтов земной коры// Разведка и охрана недр, 2003, №6, С. 63-65.

15. Родионова Т.А., Шеховцова Н.В., Николаев Ю.А., Паников Н.С. Рост и обратимая адгезия Bacillus licheniformis 603 в зависимости от условий культивирования// Микробиология, 2003, Т. 72, № 4, С. 521 - 527.

16. Batrakov S.G., Rodionova T.A., Esipov S.E., Polyakov N.B., Sheichenko V.I., Shekhovtsova N.V., Lukin S.M., Panikov N.S., Nikolaev Y.A. A novel lipopep-tide, an inhibitor of bacterial adhesion, from the thermophilic and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis 603// Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 2003, Vol. 1634, № 3, P. 107 - 115.

17. Родионова Т.А., Николаев Ю.А. Защитное действие обратимой адгезии термофильной бактерии Bacillus licheniformis от N-этилмалеимида// Микробиология, 2004, т. 73, № 1, С. 133 - 134.

Лицензия ПД00661. Печ. л. 1. Заказ 877. Тираж 100. Отпечатано в типографии Ярославского государственного технического университета г. Ярославль, ул. Советская, 14 а, тел. 30-56-63.

»-97 09

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Родионова, Татьяна Анатольевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Твердая поверхность как место обитания микроорганизмов

1.2. Механизмы транспорта микроорганизмов к поверхности

1.2.1. Физические механизмы

1.2.1.1. Турбулентность

1.2.1.2. Броуновское движение

1.2.2. Биологические механизмы

1.2.2.1. Собственная двигательная активность микроорганизмов

1.2.2.2. Седиментация

1.3. Подходы к изучению адгезии микроорганизмов 19 1.3.1 .Физико-химический подход

1.3.1.1. Термодинамика адгезии

1.3.1.2. Теория Дерягина-Ландау-Вервея-Овербика (ДЛВО) 22 1.3.2. Биологический подход

1.3.2.1. Первичное (обратимое) прикрепление

1.3.2.2. Необратимая адгезия

1.4. Факторы, влияющие на адгезию микроорганизмов

1.4.1. Природа и свойства субстрата адгезии

1.4.2. рН среды

1.4.3. Ионный состав среды

1.4.4. Температура

1.4.5. Источники питания и экзогенное голодание

1.4.6. Состояние культуры микроорганизмов и свойства их клеток 36 1.4.6.1. Фаза роста микробной культуры

1.4.6.2. Гидрофобность клеточной поверхности

1.4.6.3. Диссоциация микроорганизмов 38 1.5. Регуляция адгезии микроорганизмов и образования биопленок 38 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

2.2. Питательные среды

2.3. Методы исследования

2.3.1. Методы идентификации исследуемого микроорганизма

2.3.1.1. Микроскопические методы

2.3.1.2. Изучение физиолого-биохимических свойств

2.3.1.3. Амплификация, сиквенс и анализ гена 16S рРНК

2.3.1.4. Анализ тотальной ДНК

2.3.1.5. Анализ жирно-кислотного состава липидов

2.3.2. Изучение влияния условий культивирования на рост и первичную адгезию Bacillus licheniformis

2.3.3. Определение роли обратимой адгезии в профилактике стресса

В. licheniformis

2.3.4. Выделение и идентификация ингибитора обратимой адгезии

В. licheniformis 603 (Антиадгезина)

2.3.4.1. Приборы, материалы, системы растворителей

2.3.4.2. Получение биомассы и культуральной жидкости

В. licheniformis

2.3.4.3. Экстракция липидов культуральной жидкости

2.3.4.4. Очистка внеклеточного антиадгезина

2.3.4.5. Получение и анализ диметилового эфира антиадгезина

2.3.4.6. Экстракция клеточных липидов

2.3.4.7. Хроматография клеточных липидов и очистка антиадгезина, содержащегося в бактериальных клетках

2.3.4.8. Анализ продуктов гидролиза антиадгезина

2.3.4.9. Определение конфигурации аминокислот антиадгезина

2.3.4.10. Восстановление антиадгезина и его диметилового эфира 60 2.3.5. Изучение антимикробных свойств антиадгезина

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Идентификация исследуемого микроорганизма 62 3.1.1 Морфология клеток, характер колоний

3.1.2. Физиолого-биохимические свойства

3.1.3. Генотипическая характеристика и жирно-кислотный состав липи

3.2. Влияние физико-химических факторов окружающей среды на периодический рост и обратимую адгезию В. licheniformis

3.2.1. Температура

3.2.2. рН среды

3.2.3. NaCl

3.2.4. Концентрация Са2+ в среде

3.3. Источники углерода, голодание и адгезия В. licheniformis

3.4. Роль обратимой адгезии в защите клеток В. licheniformis 603 от летальных воздействий

3.5. Структура и свойства ауторегулятора обратимой адгезии В. licheniformis 603 (Антиадгезина)

3.5.1. Структура антиадгезина

3.5.2. Антимикробные свойства антиадгезина

4. ОБСУЖДЕНИЕ 99 ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 106 ПРИЛОЖЕНИЯ 107 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Начальные стадии адгезии Bacillus licheniformis"

Актуальность. Адгезия - явление, широко распространенное в мире микроорганизмов и уже многие годы являющееся объектом пристального внимания микробиологов.

Прикрепление к поверхности и дальнейший рост в адгезированном состоянии являются факторами, оказывающими сильнейшее влияние на процессы жизнедеятельности микробов. Прикрепление к твердым поверхностям делает возможным потребление нерастворимых субстратов, изменяет скорость метаболизма микроорганизмов, позволяет им концентрироваться, обмениваться информацией и энергией и создавать сложные сообщества биопленок.

Прикладной аспект изучения бактериальной адгезии - это помехи, создаваемые биопленками, биокоррозия субстратов адгезии с одной стороны, и использование иммобилизованных микроорганизмов в биотехнологических производствах и очистке сточных вод - с другой.

К настоящему времени четко установлено, что адгезия микроорганизмов зависит от свойств их клеток, свойств адсорбента, состава среды, в которой происходит адгезия, от условий, определяющих возможность контакта клеток с поверхностью адсорбента [Звягинцев, 1973; Звягинцев, 1987, Marshall, 1984, 1985; 1989; van Loosdrecht, 1988; van Loosdrecht et al., 1989; Marshall, 1996].

Известно, что жизнь на поверхности раздела фаз и особенно в биопленках дает микроорганизмам ряд преимуществ: повышенную устойчивость к действию антибиотиков [Evans et al., 1991; Coquet et al., 1998; Amorena et al., 1999; Anderl et al., 2000; Donlan, 2002;], к неблагоприятным значениям pH [Li et al., 2001], к повышенной температуре и высыханию [Звягинцев, 1973], к ли-тическому действию бактериофагов [Hughes, Sutherland, Jones, 1998; 1998; Sutherland, 2001], а также к действию хлора, озона и УФ излучения [Flemming, Schaule, 1994]. Однако, иногда прикрепление снижает скорость метаболических процессов микроорганизмов [Звягинцев, 1973; 1987].

Актуальным остается изучение особенностей первой быстрой и часто обратимой стадии бактериальной адгезии. Необходимо определить, является ли она лишь отражением баланса физико-химических взаимодействий в системе, либо же это активная адаптивная реакция, связанная с освоением нового местообитания и выбором характера дальнейшего роста

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Изучить особенности начальных стадий адгезии, физико-химические и биологические механизмы их регуляции, а также их роль в стрессоустойчивости бактерии, выделенной из пластовой воды, загрязненной буровым раствором.

Основные задачи исследования:

1. Идентифицировать способный к адгезии микроорганизм, выделенный из термальных высокоминерализованных пластовых вод, загрязненных буровым раствором.

2. Провести сравнительное исследование скорости роста и первичного прикрепления исследуемого микроорганизма в широком диапазоне значений разных физико-химических факторов среды (температуры, рН, солености и др.)

3. Выяснить роль первичной обратимой адгезии в стрессоустойчивости исследуемого микроорганизма.

4. Выделить, идентифицировать и исследовать некоторые особенности вещества, фактора ауторегуляции обратимой адгезии исследуемого микроорганизма.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые проведено систематическое исследование начальных стадий адгезии дикого штамма микроорганизмов, выделенного из смеси бурового раствора и термальных сильноминерализованных пластовых вод:

1. Изучены физиологические и биохимические свойства, а также особенности периодического роста в жидкой культуре бактерии Bacillus licheniformis 603.

2. Выявлены закономерности влияния различных физико-химических факторов на рост и величину первичной адгезии исследуемого микроорганизма.

3. Описаны физико-химический и ауторегуляторный механизмы адгезии на начальных этапах периодического роста культуры исследуемого микроорганизма.

4. Впервые показана защитная функция обратимой адгезии у В. licheniformis 603 при воздействии химического стрессора N-этилмалеимида.

5. Выделено, идентифицировано и исследовано вещество - ауторегулятор обратимой адгезии В. licheniformis 603.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. Новые данные о механизмах регуляции обратимой адгезии бактерий могут быть использованы для разработки эффективных методов контроля биообрастаний в биореакторах и гидротехнических системах.

2. Было показано, что антиадезин Bacillus licheniformis, циклический липо-пептид, кроме антиадгезионной активности в отношении бактерии-продуцента, обладает еще избирательным антибактериальным действием, подавляя рост коринебактерий, и может быть рекомендован для дальнейших испытаний на пригодность в качестве средства против заболеваний, вызываемых этими бактериями.

Результаты диссертации введены в учебный процесс по дисциплине "Экология микроорганизмов" и могут быть введены в общий курс "Микробиология" в раздел "Регуляция жизнедеятельности микроорганизмов".

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Родионова, Татьяна Анатольевна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Исследован и идентифицирован способный к адгезии микроорганизм, из термальных пластовых вод загрязненных буровым раствором. По совокупности физиолого-биохимических и генотипических признаков этот организм отнесен к виду Bacillus licheniformis.

2. Впервые исследованы условия и регуляторные механизмы начальных стадий адгезии В. licheniformis. Установлено, что величина и продолжительность обратимой адгезии регулируются как физико-химическими факторами среды (температура, рН, ионная сила раствора), так и биологически, за счет образования внеклеточных метаболитов.

3. Впервые экспериментально показано адаптивное значение обратимой адгезии бактерий - при летальных воздействиях токсиканта, N-этилмалеимида.

4. Впервые выделен и идентифицирован ауторегулятор обратимой адгезии В. licheniformis (антиадгезин), по своей структуре являющийся циклическим липопептидом.

5. Обнаружено, что антиадгезин В. licheniformis, помимо регуляции адгезии клеток продуцента, проявляет также высокоспецифичное антибактериальное действие в отношении коринеформных бактерий, тем самым, являясь полимодальным ауторегулятором-адаптогеном, ингибируя адгезию и численность возможных конкурентов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Родионова, Татьяна Анатольевна, Москва

1. Ангелопуло O.K., Подгорнов В.М., Аваков В.Э. Буровые растворы для осложненных условий. М.: Недра, 1988, С. 6 8., С. 12-13.

2. Ботвинко И.В. Экзополисахариды бактерий/ Успехи микробиологии, М.: Наука, 1985, т.20, с.79 122.

3. Герхард Ф. Методы общей микробиологии. М.:Мир, 1983, 536 с.

4. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий. Л.: Издательство ЛГУ, 1989, 248 с.

5. Давид Р. Введение в биофизику. М.: Мир, 1982, 207 с.

6. Данилова И.В., Ботвинко И.В., Егоров Н.С. Реологические свойства и некоторые функции экзополисахаридов Azotobacter beijerinckii и Mycobacterium lacticolumll Микробиология, 1993, т.62, № 4.

7. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. М.: МГУ, 1973, 175 с.

8. Звягинцев Д.Г. Ферментативная активность почв/ Экологическая роль микробных метаболитов (под ред. Д.Г. Звягинцева), М.:Изд-во МГУ, 1986, С. 5-56.

9. Звягинцев Д.Г. Почва и микрорганизмы. М.: МГУ, 1987, 256 с.

10. Звягинцев Д.Г., Гузев B.C., Гузева И.С. Адсорбция микроорганизмов в связи с этапами их развития// Микробиология, 1977, т. 46, № 2., С. 295-299.

11. Ивачев Л.М. Промывка и тампонирование геологоразведочных скважин: Справочное пособие. М.: Недра, 1989,247 с.

12. Конев С. В. Структурная лабильность мембран и регуляторные процессы. М.: Наука и техника, 1987, 240 с.

13. Лахтин В.М. Лектины в исследовании белков и углеводов. Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Серия "Биотехнология" 1987, т.2, с.289.

14. Методы почвенной микробиологии и биохимии/ под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991, 304 с.

15. Николаев Ю.А., Милько Е.С. Адгезивные и ростовые свойства R- и S-диссоциантов Pseudomonas fluorescens// Микробиология, 2000, т. 69, № 2, с. 293 294.

16. Николаев Ю.А., Паников Н.С. Внеклеточная протеаза как регулятор обратимой адгезии Pseudomonas fluorescens/7 Микробиология, 2002, т. 71, № 1, С. 629-634.

17. Николаев Ю.А., Проссер Дж.И. Внеклеточные факторы, влияющие на адгезию Pseudomonas fluorescens на стекле// Микробиология, 2000, т. 69, № 2, С. 231 -236.

18. Николаев Ю.А., Проссер Дж.И. Свойства адгезина и антиадгезина Pseudomonas fluorescens/7 Микробиология, 2000, т. 69, № 2, с. 237 242.

19. Николаев Ю.А., Проссер Дж.И., Виттли Р.И. Регуляция адгезии клеток Pseudomonas fluorescens к стеклу летучими соединениям, выделяемыми культурой// Микробиология, 2000, т.69, № 3, с.352 355.

20. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов// Микробиология, 2000, т.69, №3, с. 309-327.

21. Паников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов. М.: Наука, 1991, 311 с.

22. Паников Н.С., Шеховцова Н.В., Дорофеев А.Г., Звягинцев Д.Г. Количественные исследования динамики отмирания голодающих микроорганизмов// Микробиология, 1988, т. 57, № 6, С. 983 1003.

23. Паников Н.С., Попова Н.А., Дорофеев А.Г., Николаев Ю.А, Верховцева Н.В. Рост термофильной бактерии Geobacillus uralicus в зависимости от температуры и рН: кинетический анализ с использованием СХМ// Микробиология, 2003, т. 72, № 3, с. 320 327.

24. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978,331 с.

25. Пирог Т.П. Биологические функции экзополисахаридов Acinetobacter sp// Биополимеры и клетка, 1998, т. 14, № 2, С. 136 143.

26. Пирог Т.П. Роль экзополисахаридов Acinetobacter sp. в защите клеток продуцента от действия тяжелых токсичных металлов// Микробиология, 1997, т.66, № 3, С. 341 -346.

27. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Малашенко В.Р. Защитные функции экзополисахаридов, синтезируемых бактериями Acinetobacter sp// Микробиология, 1997, Т. 66, № 3, С. 335-340.

28. Раилкин А.И. Процессы колонизации и защита от биообрастания. СПб: Изд-во С.-Петербург.Ун-та, 1998, 272 с.

29. Родионова Т.А., Шеховцова Н.В., Николаев Ю.А., Паников Н.С. Рост и обратимая адгезия Bacillus licheniformis в зависимости от условий культивирования// Микробиология, 2003, Т. 72, № 4, С 521 527.

30. Рубин А.Б. Биофизика. Кн. 1. Теоретическая биофизика. М.: Высш. Шк., 1987,319 с.

31. Сафронова И.Ю., Ботвинко И.В. Межклеточный матрикс Bacillus subtilis 271: полимерный состав и функции// Микробиология, 1998, т. 67, № 1, с. 55 60.

32. Семенова Е.В., Гречушкина Н.Н. Внеклеточные полисахариды микроорганизмов, условия их биосинтеза и физиологическая роль. В кн. "Экологичеекая роль микробных метаболитов"/ Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1986, 240 с.

33. Шеховцова Н.В. Кинетика роста и выживания почвенных бактерий в свободном, агрегированном и иммобилизованном состоянии., Автореф. канд. дисс., 1988, МГУ, 24 с.

34. Шеховцова Н.В., Звягинцев Д.Г., Паников Н.С. Кинетика роста Arthrobacter globiformis и Pseudomonas fluorescens на средах со стекловолокном// Микробиология, 1992, т. 62, № 6, с. 995 1003.

35. Шеховцова Н.В., Кондакова Г.И., Осипов Г.А., Родионова Т.А., Хохлов С.С., Яковлев М.Ю. О некоторых особенностях выделения микроорганизмов аборигенов глубоких горизонтов земной коры// Разведка и охрана недр, 2003, № 6, С. 63-65.

36. Allan V.J.M., Callow M.E., Macaskie L.E., Paterson-Beedle M. Effect of nutrient limitation and phosphatase activity of a Citrobacter sp.ll Microbiology, 2002, Vol. 148, p. 277-288.

37. Amorena В., Gracia E., Monzon M., Leiva J., Oteiza C., Perez M., Alabart J.-L., Hernandez-Yago J. Antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus in biofilms developed in vitro// J. Antimicrob. Chemotherap., 1999, Vol. 44, p. 43 -55.

38. Anderl J.N., Franklin M.J., Stewart P.S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin// Antimicrob. Agents and Chemother., 2000, Vol. 44, № 7, p. 1818 1824.

39. Angles M.L., Marshall K.C., Goodman A.E. Plasmid transfer between marine bacteria in the aqueous phase and biofilms in reactor microcosms// Appl. Environ. Microbiol., 1993, Vol. 59, № 3, p. 843-850.

40. Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. Surfactin, a crystalline peptidolipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation// Biochem. Biophys. Res. Commun.,Vol. 31, 1968, p. 488-494.

41. Ascon-Cabrera M.A., Thomas D., Lebeault J.M. Activity of synchronized cells of a steady-state biofilm recirculated reactor during xenobiotic biodegradation// Appl. Environ. Microbiol., 1995, Vol. 61, № 3, p. 920 925.

42. Asselineau, J. Bacterial lipids containing amino acids or peptides linked by amide bonds//Fortsch. Chem. org. Naturst., Vol. 56, 1991, p. 1 85.

43. Bardoniotis E., Ceri H., Olson M.E. Biofilm formation and biocide susceptibility testing of Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium marinumll Curr. Microbiol., 2003, Vol. 46, № 1, 28 32.

44. Batrakov, S.G., Nikitin, D.I., Sheichenko, V.I., Ruzhitsky, A.O. A novel sulfonic-acid analogue of ceramide is the major extractable lipid of the gram-negative marine bacterium Cyclobacterium marinus WH. Biochim. Biophys. Acta, V. 1391,1998, p. 79-91.

45. Blanco M.A., Negro C., Gaspar I., Tijero J. Slime problems in the paper and board industry// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996, Vol. 46, p. 203 208.

46. Bos R., van der Mei H.C., Busscher H.J. Physico-chemistry of initial microbial adhesive interaction is mechanism and methods for study// FEMS Microbiol. Rev., 1999, Vol. 23, p. 179-230.

47. Bowden G.H., Hamilton I.R. Survival of oral bacteria// Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 1998, Vol. 9, № 1, p.54-85.

48. Bowen W.R., Fenton A.S., Lovitt R.W., Wright C.J. The measurement of Bacillus mycoides spore adhesion using atomic force microscopy, simple counting methods, and a spinning disk technique// Biotechnol. Bioeng., 2002, Vol. 20, № 79 (2), p. 170 179.

49. Burchard R. P., Sorongon M.L. A gliding bacterium strain inhibits adhesion and motility of another gliding bacterium strain in a marine biofilm// Appl. Environ. Microbiol., 1998, Vol. 64, No. 10, p. 4079 4083.

50. Busalmen J.P., de Sanchez S.R. Adhesion of Pseudomonas fluorescens (ATCC 17552) to nonpolarized and polarized thin films of gold// Appl. Environ. Microbiol., 2001, Vol. 67, No. 7, p. 3188 3194.

51. Busscher H.J., Geertsema-Dornbusch G.I., van der Mei H.C. Adhesion to silicone rubber of yeast and bacteria isolated from voice prostheses: influence of salivary conditioning films// J. Biomed. Mater. Res., 1997, Vol. 34, № 2, p. 201 -209.

52. Carter G., Wu M., Drummond D.C., Bermudez L.E. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium/1 J. Med. Microbiol., 2003, Vol. 52, № 9, p. 747 752.

53. Castet J.C., Craynest M., Barbotin J.-N., Truffaut N. Improvement of plasmid stability of recombinant Bacillus subtilis cells in continuous immobilized cultures// FEMS Microbiol. Rev., 1994, Vol.14, p.63 68.

54. Claus D., Berkeley R.C.W. Genus Bacillus Cohn 1872. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Sneath, P.H.A., Mair, N.S, Sharpe, M.E., Holt J.G. eds), 1984, Vol. 2, p. 1105-1139. Williams & Wilkins, Baltimore.

55. Coquet L., Junter G.A., Jouenne T. Resistance of artificial biofilms of Pseudomonas aeruginosa to imipenem and tobramicin// J. Antimicrob. Chemother. 1998, Vol. 42, No. 6, p. 755 760.

56. Cowell B.A., Willcox M.D., Schneider R.P. A relatively small change in sodium chloride concentration has a strong effect on adhesion of ocular bacteria to contact lenses// J. Appl. Microbiol., 1998, Vol. 84, № 6, p. 950 958.

57. Davey M.E., Caiazza N.C., O'Toole G.A. Rhamnolipid surfactant production affects biofilm architecture in Pseudomonas aeruginosa PAOl// J. Bacterid., 2003, Vol. 185, № 3, p. 1027 1036.

58. Davies D.G., Geesey G.G. Regulation of the alginate biosynthesis gene algC in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture// Appl. Environ. Microbiol., 1995, Vol. 61, № 3, p. 860 867.

59. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglevski B.H., Costerton J.W., Greenberg E.P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm// Science, 1998, Vol. 280, p. 295 298.

60. Delaquis P.J., Caldwell D.E., Lawrence J.R., McCurdy A.R. Detachment of Pseudomonas fluorescens from biofilms on glass surfaces in response to nutrient stress// Microb.Ecol., 1989, Vol. 18, p. 199 210.

61. Donlan RM. Biofilms: microbial life on surfaces// Emerg. Infect. Dis. 2002, 8(9), p. 881-90.

62. Doolittle M.M., CooneyD.D., Caldwell D.E. Lytic infection of Escherichia coli biofilms by bacteriophage T4// Can. J. Microbiol., 1995, Vol. 41, № 1, p. 12 -18.

63. Doolittle M.M., Cooney J.J., Caldwell D.E. Tracing the interaction of bacteriophage with bacterial biofilms using fluorescent and chromogenic probes. J. Ind. Microbiol., 1996, Vol. 16, № 6, p. 331 341.

64. Drago L., De Vecchi E., Nicola L., Gismondo M.R. Antimicrobial activity and interference of tobramycin and chloramphenicol on bacterial adhesion to intraocular lenses// Drugs Exp. Clin. Res., 2003, Vol. 29, № 1, p. 25 35.

65. Dunne W.M. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately?// Clin. Microbiol. Rev., 2002, Vol. 15, № 2, p. 155 166.

66. Evans D.J., Allison D.G., Brown M.R., Gilbert P. Susceptibility of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli biofilms towards ciprofloxacin: effect of specific growth rate// J. Antimicrob. Chemother., 1991, Vol. 27, №.2, p. 177-184.

67. Feldner J., Bredt W., Razin S. Adherence of Mycoplasma pneumonia to glass surface// Infect. Iramun, 1979, Vol. 26, № 1, p. 70 75.

68. De Flaun M.F., Oppenheimer S.R., Streger S., Condee C.W., Fletcher M. Alteration in adhesion, transport, and membrane characteristics in an adhesion-deficient pseudomonad//Appl. Environ. Microbiol., 1999, Vol. 65, №. 2, p. 759 -765.

69. Flemming H.-C., Schaule G. Mikrobielle werkstoffzerstorung biofilm und biofouling in wasrigen systemen// Werkst. und Korros., 1994, №. 1, s.40-53

70. Fletcher M. The effect of proteins on bacterial attachment to polystyrene// J. Gen. Microbiol., 1976, Vol. 94, № 2, p. 400 404.

71. Fletcher M. Attachment of Pseudomonas fluorescens to glass and influence of electrolytes on bacterium-substratum separation distance// J. Bacterid., 1988, Vol. 170, №5, p. 2027-2030.

72. Fletcher M. Bacterial attachment in aquatic environments: a diversity of surfaces and adhesion strategies/ Bacterial Adhesion. Molecular and Ecological Diversity, 1996, p. 1-25.

73. Fletcher M., McEldowney S. Microbial attachment to nonbiological surfaces/ Current Perspectives in Microbial Ecology, 1984, p. 124-129.

74. Flint S., Palmer J., Bloemen K, Brooks J, Crawford R. The growth of Bacillus stearothermophilus on stainless steel// J. Appl. Microbiol., 2001, Vol. 90, № 2, p.151-157.

75. Gelpi,E., Koenig, W.A., Gilbert, J, Oro, J. Combined gas chromatography -mass spectrometry of amino acid derivatives// J. Chromatogr. Sci., 1969, Vol. 7, p. 604-613.

76. Gordon A.S., Millero F.J. Electrolite effect of an estuarine bacterum// Appl. Environ. Microbiol., 1984, Vol. 47, №. 3, p. 495 499.

77. Habash M.B., van der Mei H.C., Reid G., Busscher H.J. Adhesion of Pseudomonas aeruginosa to silicone rubber in a parallel plate flow chamber in the absence and presence of nutrient broth// Microbiology, 1997, Vol.143, p.2569-2574.

78. Hanlon G.W., Denyer S.P., Olliff C.J., Ibrahim L.J. Reduction in exopolysaccharide viscosity as an aid to bacteriophage penetration through

79. Pseudomonas aeruginosa biofilms// Appl. Environ. Microbiol., 2001, Vol. 67, №6, p. 2746-2753.

80. Hoppensack A., Oppermann-Sanio F.B., Steinbuchel A. Conversion of the nitrogen content in liquide manure into biomass and poyglutamic acid by a newly isolated strain of Bacillus licheniformisII FEMS Microbiol. Lett., 2003, Vol 21 (218), № 1,39-45.

81. Horowitz, S., Gilbert, J.N., Griffin, W.M. Isolation and characterization of a surfactant produced by Bacillus licheniformis 86// J. Ind. Microbiol., 1990, Vol. 6, p. 243-248.

82. Hughes K.A., Sutherland I.W., Jones M.V. Biofilm susceptibility to bacteriophage attack the role of phage-borne polysaccharide depolymerase// Microbiology, 1998, Vol. 144, p. 3039-3047.

83. Husmark U., Ronner U. Forces involved in adhesion of Bacillus cereus spores to solid surfaces under different environmental conditions// J. Appl. Bacterid., 1990, Vol. 69, № 4, p. 557 562.

84. Itokawa, H., Miyashita, Т., Morita, H., Takeya, K., Hirano, Т., Homma, M., Oka, K. Structural and conformational studies of Ile7. and [Leu7] surfactins from Bacillus subtilis nattoll Chem. Pharm. Bull., 1994, Vol. 42, p. 604-607.

85. James G.A., Korber D.R., Caldwell D.E., Costerton J.W. Digital image analysis of growth and starvation responses of surface colonizing Acinetobacter// J. Bacteriol., 1995, Vol. 177, № 4, p. 907 915.

86. Jana Т.К., Srivastava A.K., Csery К., Arora D.K. Influence of growth and environmental condition on cell surface hydrophobicity of Pseudomonas fluorescence in nonspecific adhesion// Can. J. Microbiol., 2000, Vol. 46, № 1, p. 28-37.

87. Jenny, K., Kappeli, O., Fiechter A. Biosurfactants from Bacillus licheniformis: structural analysis and characterization// Appl. Microbiol. Biotechnol., 1991, Vol.36, p. 5-13.

88. Kakinuma A., Hori M., Sugino H., Yoshida I., Isono M., Tamura G., Arima K. Determination of lactone ring in surfactin// Agr. Biol. Chem., 1969, Vol. 33, p. 1523-1524.

89. Kates, M. Techniques in lipidology: laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, 2nd ed., Elsevier Science, Amsterdam, 1986.

90. Ketyi I. A model for testing drug susceptibility of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus grown in biofilms on medical devices// Acta Microbiol Immunol Hung., 1995, Vol. 42, № 2, p. 215-219.

91. Kim D.-S., Thomas S., Fogler H.S. Effect of pH and trace minerals on long-term starvation of Leuconostoc mesenteroidesll Appl. Environ. Microbiol., 2000, Vol. 66, №3, p. 976-981.

92. Kjelleberg S. Effects of interfaces on survival mechanism of copiotrophic bacteria in low-nutrient habitats/ Current Perspectives in Microbial Ecology, -1984, -p.151-159.

93. Kjellerberg S., Humphrey B.A., Marshall K.C. Effect of interfaces on small starved marine bacteria// Appl. Environ. Microbiol., 1982, Vol. 43, № 5. p. 1166-1172.

94. Kjellerberg S., Humphrey B.A., Marshall K.C. Initial phases of starvation and activity of bacteria at surfaces// Appl. Environ. Microbiol., 1983, Vol. 46, №. 5. p. 978-984.

95. Klemm P., Schembri M.A. Bacterial adhesions: function and structure// Int. J. Med. Microbiol., 2000, Vol. 290, p. 27 35.

96. Kolari M, Nuutinen J., Slkinoja-Salonen M.S. Mechanisms of biofilm formation in paper machine by Bacillus species: the role of Deinococcus geothermalisll J. of Ind. Microbiol, and Biotech., 2001, Vol. 27, № 6, p. 343 -351.

97. Kolari M., Schmidt U., Kuismanen E., Salkinoja-Salonen M.S. Firm but slippery attachment of Deinococcus geothermalisll J. of Bacteriol., 2002, Vol. 184, № 9, p. 2473-2480.

98. Konz, D., Doekel, S., Marahiel, M.A. Molecular and biochemical characterization of the protein controlling biosynthesis of the lipopeptide lichenysin//J. Bacteriol., 1999, Vol. 181, № 1 , p. 133-140.

99. Kovacs Т., Bihari Z., Hargitai A., Mecs I., Kovacs K.L. Stress related changes of cell surface hydrophobicity in Bacillus subtilis/l Acta Microbiol. Immunol. Hung., 2002, Vol. 49, № 1, p. 21-35.

100. Kowall, M., Vater, J., Kluge, В., Stein, Т., Franke, P., Ziessow, D. Separation and characterization of surfactin isoforms produced by Bacillus subtilis OKB 105//J. Colloid Surf. Interface Sci., 1998, Vol. 204, p. 1-8.

101. LaPaglia C., Hartzell P. Stress-Induced production of biofilm in the hyperthermophile Archaeoglobus fulgidusll Appl. Environ. Microbiol., 1997, Vol. 63, №.8, p. 3158-3163.

102. Lee C., Kim J., Chang J., Hwang S. Isolation and identification of thiocyanate utilising chemolithotrophs from gold mine soils// Biodegradation, 2003, Vol. 14, № 3, p. 183-188.

103. Lee D.G., Kim S.J. Bacterial species in biofilm cultivated from the end of the Seoul water distribution system// J. Appl. Microbiol., 2003, Vol. 95, № 2, p. 317 -324.

104. Leite В., Ishida M.I., Alves E., Carrer H., Pascholati S.F., Kitajima E.W. Genomics and X-ray microanalysis indicate that Ca2+ and thiols mediate the aggregation and adhesion of Xylella fastidiosall J. Med. Biol. Res., 2002, Vol. 35, №6, p. 645-650.

105. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The Quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates// Eur. J. Biochem., 1970. № 12, p. 133142.

106. Li Y-H., Hanna M.N., Svensater G., Ellen R.P., Cvitkovitch D.G. Cell density modulates acid adaptation in Streptococcus mutans: implication for survival in biofilms//J. Bacterid., 2001, Vol. 183, № 23, p. 6875-6884.

107. Lin, S.-C., Lin, K.-G., Lo, C.-C., Lin, Y.-M. Enhanced biosurfactant production by a Bacillus licheniformis mutant// Enzyme Microb. Technol., 1998, Vol. 23, p. 267-273.

108. Lin, S.-C., Minton, M.A., Sharma, M.M., Georgiou, G. Structural and immunological characterization of a biosurfactant produced by Bacillus licheniformis JF-2//Appl. Environ. Microbiol., 1994, Vol. 60, p. 31-38.

109. Liu Y, Fu J, Li R, Zhang X, Hu Z. Studies on biosorption of Pd2+ by bacteria.// Wei Sheng Wu Xue Bao, 2000, Vol. 40, № 5, p. 535-539.

110. Loosdrecht M.C.H. van. Bacterial adhesion. Wageningen, -1988, -200 p.

111. Loosdrecht M.C.M. van, Lyklema J., Norde W., Zehnder A.J.B. Bacterial adhesion: a physicochemical approach//Microbial Ecol., 1989, Vol. 17, p. 1-15.

112. Losel D.M. Fungal lipids/ Microbial Lipids. Vol. 1. (Ratledge C., Wilkinson S.G., eds), Academic Press, London 1988, p. 699-806.

113. MacLehose H.G., Gilbert P., Allison D.G. Biofilms, homoserine lactones and biocide susceptibility// J. Antimicr. Chemotherapy, 2004, Vol. 53, № 2, p. 180 -184.

114. Marmur J. A procedure for the isolation DNA from microorganisms// J. Mol. Biology, 1961, № 3, p. 208-218.

115. Marshall K.C. Interfaces in microbial ecology. Harvard.:Univ. Press. -1976. Microbial adhesion and aggregation/ Rep. of Dahlem Wockshop. -Berlin, 1984.

116. Marshall K.C. Mechanisms of bacterial adhesion at solid-water interfaces/ Bacterial Adhesion, Mechanisms and Physiological Significance, 1985, p. 133 -157.

117. Marshall K.C. Adhesion as a strategy for access to nutrients/ Bacterial adhesion. Molecular and chemical approach// Microbial. Ecol., 1989. Vol. 17, p. 1-15.

118. Marshall K.C. Adhesion as a strategy for access to nutrients/ Bacterial Adhesion. Molecular and Ecological Diversity, -1996, -p.59-89.

119. Martin J.H. Fatty acid of vegetative cells and spores of Bacillus licheniformisH J. Dairy. Sci., 1976, Vol. 59, № 10, p. 1830 1834.

120. Martino P.D., Fursy R., Bret L., Sanduraraju В., Phillips R.S. Indole can act as an extracellular signal to regulate biofilm formation of Escherichia coli and other indole-producing bacteria// Can. J. Microbiol., 2003, Vol. 49, № 7, p. 443 -449.

121. McEldowney S., Fletcher M. Effect of pH, temperature, and growth condition on the adhesion of a gliding bacterium and three nongliding bacteria to polystyrene//Microbiol. Ecol., 1988, Vol. 16, p. 183 195.

122. Meadows P.S. The attachment of bacteria to solid surfaces// Archiv fur Mikrobiologie, 1971, B. 75, № 4, s. 374 381.

123. Mikkola R., Kolari M., Andersson M.A., Helin J., Salkinoja-Salonen M.S. Toxic lactonic lipopeptide from food poisoning isolates of Bacillus licheniformisH Eur. J. Biochem., 2000, Vol. 267, № 136 p. 4068 4074.

124. Mireles J.R. 2nd, Toguchi A., Harshey R.M. Salmonella enterica serovar typhimurium swarming mutants with altered biofilm-forming abilities: surfactin inhibits biofilm formation//: J Bacteriol., 2001, Vol. 183, № 20, p. 5848-5854.

125. Morgan P., Dow S. Bacterial adaptations for growth in low nutrient environments// Microbes in extreme Environments. London: Academic press. 1986, p. 187-214.

126. Naruse N., Tenmyo O., Kobaru S., Kamei H., Miyaki Т., Konishi M., Oki T. Pumilacidin, a complex of new antiviral antibiotics: production, isolation, chemical properties, structure and biological activity// J. Antibiot., 1990, Vol. 43, 267-280.

127. Nielsen Т.Н., Christophersen C., Anthoni U., Sorensen, J. Viscosinamide, a new cyclic depsipeptide with surfactant and antifungal properties produced by Pseudomonas jluorescens DR 54// J. Appl. Microbiol., 1999, Vol. 87, № 1, p. 80-90.

128. Otto K., Silhavy T.J. Surface sensing and adhesion of Escherichia coli controlled by the Cpx-signalling pathway// Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, Vol. 99, № 4, p. 2287 2292.

129. Owen R.J., Hill L.R., Lapage S.P. Determination of DNA base composition from melting profiles in delute buffers// Biopolymers, 1969, № 7, p. 503-516

130. Ornek D., Jayaraman A., Syrett B.C., Hsu C.-H., Mansfeld F.B., Wood Т.К. Pitting corrosion inhibition of aluminium 2024 by Bacillus biofilms secreting polyaspartate or g-polyglutamate// Appl. Microbiol. Biotechnol., 2002, Vol. 58, p. 651 -657.

131. Parkar S.G., Flint S.H., Brooks J.D. Physiology of biofilms of thermophilic bacilli potential consequences for cleaning// J. Ind. Microbiol. Biotecnol., 2003, Vol. 30, № 9, p. 553 - 560.

132. Peypoux F., Bonmatin M., Labbe H., Das B.C., Ptak M., Michel G. Isolation and characterization of a new variant of surfactin, the Val7. surfactin// Eur. J. Biochem., Vol. 202, 1991, p. 101-106.

133. Peypoux F., Bonmatin M., Labbe H., Grangemard I., Das B.C., Ptak M., Wallach J., Michel, G. Ala4. surfactin, a novel isoform from Bacillus subtilis studied by mass and NMR spectroscopies// Eur. J. Biochem., Vol. 224, 1994, p. 89-96.

134. Piette J.P., Idziak E.S. A model study of factors involved in adhesion of Pseudomonas fluorescens to meat// Appl.Environ.Microbiol., 1992, Vol. 58, № 9, p. 2783-2791.

135. Pringle J.H., Fletcher M. Influence of substratum wettability on attachment of freshwater bacteria to solid surfaces// Appl. Environ. Microbiol., 1983, Vol. 45, №3, p. 811-817.

136. Pringle J.H., Fletcher M. Influence of substratum hydration and adsorbed macromolecules on bacterial attachment to surfaces// Appl. Environ. Microbiol., 1986, Vol. 51, № 6, p. 1321 1325.

137. Reina L.D., Fleming H.P., Breidt F Jr. Bacterial contamination of cucumber fruit through adhesion// J. Food Prot., 2002, Vol. 65, № 12, p. 1881 1887.

138. Rouser G., Kritchevsky G., Heller D., Lieber E. Lipid composition of beef brain, beef liver and the sea anemone: two approaches to quantitative fractionation of complex lipid mixtures// J. Am. Oil Chem. Soc., 1963, Vol. 40, p. 425-454.

139. Rudner R., Martsinkevich O., Leung W., Jarvis E.D. Classification and genetic characterization of pattern-forming bacilli// Mol. Microbiol., 1998, Vol. 27, № 4, p. 687-703.

140. Sagripanti JL, Bonifacino A. Resistance of Pseudomonas aeruginosa to liquid disinfectants on contaminated surfaces before formation of biofilms// J AOAC Int., 2000, Vol. 83, № 6, p. 1415 1422 .

141. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Springs Harbor Laboratory Press. 1987.

142. Schwank S., Rajacic Z., Zimmerli W., Blaser J. Impact of bacterial biofilm formation on in vitro and in vivo activities of antibiotics// Antimicrob. Agents and Chemoter., 1998, Vol. 42, №. 4, p. 895 898.

143. Schwartz Т., Hoffmann S., Obst U. Formation of natural biofilms during chlorine dioxide and u.v. disinfection in a public drinking water distribution system// J. Appl. Microbiol., 2003, Vol. 95, № 3, p. 591 601.

144. Shih P.-C., Huang C.-T. Effects of quorum-sensing deficiency on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation and antibiotic resistance// J. Antimicrob. Chemother., 2002, Vol. 49, p. 309 314.

145. Simhi E., van der Mei H.C., Ron E.Z., Rosenberg E., Busscher H.J. Effect of the adhesive antibiotic ТА on adhesion and initial growth of E.coli on silicone rubber// FEMS Microbiol. Lett., 2000, Vol. 192, №. 1, p. 97 100.

146. Snoeyenbos G.H., Weinack O.M., Smyser C.F. Protecting chicks and poults from Salmonellae by oral administration of "normal" gut microflora// Avian Dis., 1978, Vol. 22, № 2, p. 273 287.

147. Soler-Rivas C., ArpinN., Olivier J.M., Wicher H.J. WLIP, a lipodepsipeptide of Pseudomonas "reactans" as inhibitor of the symptoms of the brown blotch disease of Agaricus bisporusll J. Appl. Microbiol., 1999, Vol. 86, p. 635-641.

148. Sorokulova I.B., Reva O.N., Smirnov V.V., Pinchuk I.V., Lapa S.V., Urdaci M.C. Genetic diversity and involvement in bread spoilage of Bacillus strains isolated from flour and ropy bread// Lett. Appl. Microbiol., 2003, Vol. 37, № 2, p. 169-173.

149. Stanley P.M. Factors affecting the irreversible attachment of Pseudomonas aeruginosa to stainless steel// Can. J. Microbiol., 1983, Vol. 29, № 11, p. 1493 -1499.

150. Stoodley P., Wilson S., Hall-Stoodley L., Boyle J.D., Lappin-Scott H.M., Costerton J.W. Growth and detachment of cell clusters from mature mixed-species biofilms//Appl. Environ. Microbiol., 2001, Vol. 67, № 12, p. 5608-5613.

151. Sutherland I.W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework// Microbiology, 2001, Vol. 147, p. 3 9.

152. Teng R., Dick T. Isoniazid resistance of exponentially growing Mycobacterium smegmatis biofilm culture// FEMS Microbiol. Lett., 2003, Vol. 24, № 227(2), p. 171 174.

153. Tiirola M.A., Suvilampi J.E., Kulomaa M.S., Rintala J.A. Microbial diversity in a thermophilic aerobic biofilm process: analysis by length heterogeneity PCR (LH-PCR)// Water Res., 2003, Vol. 37, № 10, p. 2259-2268.

154. Tremoulet F., Duche O., Namane A., Martinie В., Labadie J.-P. A proteomic study of Escherichia coli 0157:H7 NCTC 12900 cultivated in biofilm or in planctonic growth mode// FEMS Microbiol., 2002, Vol. 215, p. 7 14.

155. Vaskovsky, V.E., Latyshev N.A. Modified Jungnickel's reagent for detecting phospholipids and other phosphorus compounds on thin-layer chromatograms// J. Chromatogr., 1975, Vol. 115,246-249.

156. Vater J. Lipopeptides, an attractive class of microbial surfactants// Progr. Colloid Polym. Sci., (Polym. Colloid Syst), 1986, Vol. 72, p. 12-18.

157. Velraeds MM., van der Mei H.C., Reid G., Busscher H.J. Inhibition of intial adhesion of uropathogenic Enterococcus faecalis by biosurfactants from Lactobacillus isolates. Appl and Environ Microbiol, Jun. 1996, Vol. 62, №. 6, p. 1958- 1963.

158. Vogelstein В., Giilespil D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979.

159. Waligora A.-J., Bare M.-C., Bourlioux P., Collignon A., Karjalainen T. Clostridium difficile cell attachment is modified by environmental factors// Appl. Environ. Microbiol., 1999, Vol. 65, №. 9, p. 4234 4238.

160. Weinack O.M., Snoeyenbos G.H., Smyser C.F. A supplemenal test system to measure competitive exclusion of Salmonellae by native microflora in chiken gutII Avian Dis., 1979, Vol. 23, № 4, p. 1019 1030.

161. Williams V., Fletcher M. Pseudomonas fluorescens adhesion and transport through porous media are affected by lipopolysaccharide composition// Appl. Environ. Microbiol., 1996, Vol. 62, No. 1, p.100 104.

162. Wolska K., Pogorzelska S., Fijol E., Jakubczak A., Bukovski K. The effect of culture conditions on hydrophobic properties of Pseudomonas aeruginosaII Med. Dosw. Mikrobiol., 2002, Vol. 54., № 1, p.61 66.

163. Yakimov M.M., Timmis K.N., Wray V., Fredrickson H.L. Characterization of a new lipopeptide surfactant produced by thermotolerant and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis BAS50// Appl. Environ.Microbiol., 1995, Vol. 61, №. 5, p. 1706-1713.

164. Yakimov M.M., Abraham W.-R., Meyer H., Giuliano L., Golyshin P.N. Structural characterization of lichenysin A components by fast atom bombardment tandem mass spectrometry// Biochim. Biophys. Acta, 1438, 1999, p. 273-280.

165. Yan L., Boyd K.G., Adams D.R., Burgess J.G. Biofilm-specific cross-species induction of antimicrobial compounds in bacilli// Appl. Environ. Microbiol., 2003, Vol. 69, № 7, p. 3719 3727.

166. Yarwood J.M., Schlievert P.M. Quorum sensing in Staphylococcus infections// J. Clin. Invest., 2003, Vol. 112, p. 1620 1625.

167. Zheng Z., Stewart P.S. Penetration of rifamin through Staphylococcus epidermidis biofilms// Antimicrob. Agents and Chemother., 2002, Vol. 46, №. 3, p. 900-903.