Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутанты с повышенной убивающей активностью как модель для создания штаммов дрожжей SACCBAROMYCES CEREVISIAE - продуцентов днРНК

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутанты с повышенной убивающей активностью как модель для создания штаммов дрожжей SACCBAROMYCES CEREVISIAE - продуцентов днРНК"

РГБ ОД

Па пропах рукописи

¿дсиУ

ДАВЦДЕНКО Светлана Геннадьевна

МУТАНТЫ С ПОВЫШЕННОЙ УБИВАЮЩЕЙ АХТИВЯОСТЬИ КАК ОСНОВА для СОЗДАНИЯ ШТАММОВ ДРСЕГЕЙ гАССШШОМУСКв СЕКСТ 151АК - ПРОДУЦЕНТОВ Ди1»ЕК

03.00.15 - Генетика

Автореферат диссертации на соисканмо ученой степени кандидата биологических нггя

Москва - 1995г.

Роботе выполнена п лаборатории генетики промышленных микроорганизмов иаучно-исс жодоветсл ьокого института гидролиза растительных материалов

Научный руководитель: кандидат биологических наук Нестерова Г.*.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Девии А.Б. кандидат.биологических наук Вустин И.И.

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский государственный университет Зацита диссертации состоится "3/

на заседании Специализированного соватс 038- ¡Л.О! при Государственном научно-исследовательском институте -генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: г. Москва, 1-й Дорожный проезд, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научно-исследовательского института генетики к селекции промышленных микроорганизмов Автореферат разослан "■М" се^ВА^МОа^г. Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Щербакова В.И.

ОГСЙЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Дрожди-сахаромицети относятся к низщин эухориотичсекич организмом и являются одним из наиболее улоб.чих объектоз для изучения Фундаментальных проблем биологии и прокигалстюго использования. Изучоиио киллермих снегом занимает особое косто в частной гонстикс дрожхей ЗассЬаготуссз сегсг!з1ав, поскольку киллерние снмбионти представляют собой удобную модель для д«~ талиэациипзакмостноионий и путей взаимной адаптации пря изучении симбиоза - одной из осиошшх проблем'биологии. В соответствии с классификацией вирусов хиллерныо сиибиоп-гц дроэтеой вместе с близкими к ими по своей организации вирусоподобними симбионтами лрожхеподобпих и пяеенегшх грибов относятся к рсовн-руспм, для которых характерен сегмоктиропанний гоном, представ-лонный несколькими видами днРПК. Реовируси обнаружен» в организме человека и животных. В этой связи актуально изучению знтиея-русного хонтролл со стороны дрожжевой клотии, чему посвящен один из разделов данной работ».

Фенотипичсским проявлением присутствия кмллор'шх симбионтов в клетке является наличие антагонистической активности (ДА) вследствие продукции ммкоцина - токсина белковой лрироди, убивоидего дроаии-сахаронице-т, которые но имеют таких симбионтов. Спектр АЛ птаггма определяется его убиваюпей активность» (УЛ) (признаком К) и устойчивость» (признаком К) или чувствительностью к действии микоаинов (признаком 3). Изпестнпн в настоящее время у дрожжей сахаромицетов 6 типам АЛ соответствуют 6 типов киллерных систем :К1-6. АЛ у дрожжей является адалтйшшч признаком и играет существенную роль т> регуляции численности популяций и экосистемах (Наумов и др..1976).

Одним из проявлений биологической активности днРВК киллерных симбионтов (дрожжевой днРНК) является способность при попадании в организм млекопитающих индуцировать синтез интерферона и, следовательно, оказывать противовирусное действие, повышая иммунологическую сопротивляемость организма к вирусной инфекции. При введении п организм экзогенного интерферона не всегда достигается желаемый эффект, поэтому стимуляция синтез« соб-

- А -

ственпого интерферона является весьма актуальной.!) связи с этим целесообразно изучение возможности селекции дрожхеикх продуценте о д»И1К.

Доли и задачи исследования. Цель настоящей олбота - раз-

работка кетодо» селекции продуцентов диГЕ'К на основе изучения регуляции пэаимоотнопенкй между дроххеаой клеткой и кнллорньгми еннбиовтакн.

Для достижения этой цели были поставлен« следующие зададим, которые ¡--свались на модели килл^рной системы КЯ дрожжей БассКагооусен ссге'^зхае:

1. Пг.лучгшие коллекции мутантов с повышенной УЛ и выделение среди ни* группы с изнененкин содержанием диИ1К киллерных симбионтов.

2. Ьмивлсшав гонов, регулирующих содержание киллерных симбионтов р дрозогаоой клетка.

3. Изучанио кажаллелышя взаимодействий этих гонов с целью установить обиу» схему регуляции содержания киллершах симбионтов.

4. Использование полученных данных для разработки мето-доз селекции продуцентов днРНК.

Научная новизна палученних результатов. Получена коллек-

ция оригинальных мутантов с повышенной УА. По Физиологическим свойствам мутанты подразделено на 4 группы. К нерпой группа относятся мутанты с увеличенным содержанием обоих видов днРНК, основного 1.2 и минорного М2, свойственных киллерны;ч симбионтам типа К2. У мутантов второй, третьей и четвертой групп содержание диРНК ив изменено, но снижена секреция альфа-фактора. Мутанты »тих групп различаются по устойчивости к антибиотикам и осморе-эистенткости. Поскольку мутанты первой группы имеют увеличенное содержание днРНК, аллели лихого типа соответствующих гонов негативно регулируют размножение симбионтов. Следовательно, эти генк представляют интерес для выяснения механизмов антивирусной защиты клетки.

Для большинства мутаций установлена ядерная локализация. Обнаружена рецессивность проявления мутонтных аллелей первой группы как на уровне повышения АЛ, так и на уровне содержании дШ'ПК. Показало, что гены 8К15, БК113, БК127, БК128 образуют

единую группу сцеплгтия.

Выявлены два типа взаимодействия гелоэ SKI, Получоиниа нани данные об эпистатическом характере взаимодсйстоия аллелей подгруппы Л:skill, sklZl, ski13 с аллель» sfclS гопорйт о существовании иерархии продуктов негативного контроля репликации днРНК Ь2 и М2. Кумулятивный тип взаимодействия аллели подгруппа В ак133 с аллолъ» той хо подгруппы skl5 указывает «а существование в клетке нескольких негативных регуляторов кониЯности днРНК, продукты которых кооперативно действуют на одну ннпечь (например, на участки copL и еорМ по схеме рогулянии воспроизведения днгак кихлериых симбионтов на уровне транскрипции (Нестерова, 1993)).Выявленные детали позволяют уточнить механизм негативного контроля репликации диРНК и предложить собственный вариант схемы регуляции воспроизведения днРИК на уровне трансляции.

Анализ электрофоретических кариотипов (ЭФХ) представителей високогомозиготной линии 1 akl5 дрогшей-киллероз типа К2 зы-выявил хариотипические аномалии у ятаммов пятого и пестого поколений с наиболее рысоким содержанием днКЗК.

Практическая ценность работы, Дрожгрвая днРНК обладает выраженной противогрипноэкой активность», а такхо является перст пективиым противовирусным агентом при инфекции мыяеЗ вирусом клещевого и герпетического энцефалита. Очищенная дрожжевая днРНК оказалась наиболее эффективной среди известии* интерфероногонов как ингибитор экспрессии антигена вируса СПИД я культур« кхетох человека. По этой причине в настоящее время отечественный препарат дроээсевой днРПК под названием "ридостин", получаемый с использованием мутантов, исследованных в мазой работе, проходит доклинические испытания по выявлению спектра активности претив вируса СПИД.Иизхая токсичность, высокая иитерфероногепиость и иирокий спектр антивирусной активности этого препарата говорят о перспективности исгользования его о клинике (Носик и др., 1041, 1988). .

Разработаны методы создания продуцентов дрожжевой днРПК и поддержания у них высокой продуктивности. Создан ковнй эхе-пресс-мотод »«деления дрожжевой дпИЖ и количественной оценки ее содержания. Депонирован итакм-продудент днРИК, полученный в ре-

зультата внутритетродиых скрещиваний потомков штамма с мутацией eki29.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались но IV Всесоюзной МехуниЕерсихетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1335г.). на X Всесоюзном совещании по программе "Пльэ-кида" (Пуцеао-нп-Оке 1585), на XI Конференции Ленинградского университета (Лененград, 1И88), на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные кохапизни гонеткческих процоесов" (Москьа, 1S!;0), но V Съезде РОГиС (Минск, 1091), на 11-м и 15-м Международных споци&лнзированиых симпозиумах по генетике и молекулярной биологии дрожжей (Парна, 1085; Рига 1891),

Пу&лихацми. По томе диссертации опубликовано S работ.

Объем работа. Диссертация изложена на JS1 страницах на-винописиого текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследовании, результатов исследования, об-зугдекия, вывояози и списка литературы, содержащего 145 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация кллыстри-роьана 21 рисунком и 16 таблицами.

МАТЕРИАЛ и метода ИССЛЕДОВАНИЯ.

Основные вггаммы дрожжей, использованные с работе: 6А-К25 (НАТа Мз7-1 leuZ-2 fKIt,-k21) и 15-6А-К25 (КАТа Ыо7-1 1еи2-2 [KlL-k2]) киллерных линий дрожжей К2; 2С-Г5 (МЛТо ade2) и 7А-П192 (МДТо Мз7~1 adral f! ш>Ъ13-Л1). Среды и условия культивирования дрожжей, использованные в работе, описаны в известных руководствах (Захаров и др.,1885). Определение убивающей активности (УА), осморезистентноста, устойчивости к действие антибиотиков, чувствительности к альфа Фактору и витальное окравиваниа дрожжей проподили известными и оригинальными методами (Нестерова II др., 1903, Давидонхо я др., 1991). Генетические методы, ис-пользопапние о роботе приведены в методических руководствах (Захаров и др., 1985). Биохимический метод выделения и количественной оценки содержание днРНЕС и дрожжак является модифицированным методом фрайдо и Финка и описан о статьях (Нестерова и др., 1983), использовали также разработанный нами экспросс-мотод (Далцденко и др., 1889).Использовали аппарат и режимы пульс-форезв, описанные в статье (Межевая и др.,1969). Препараты получал» по иатоду {Carle, Olson, J.989),

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Получение коллекции мутантов с повыиенноЯ убивающей активность» Tiina KZ (мутантов - "суперкиллероэ" K2sS,1R2+)T

С цел,» изучения генетического контроля хлоточной ангк-вирусной зациты и расвирения возможностей конструирования штам-mod с повышенным содержанием киллорчых плазмнд у дрожжей Saccha-rorayens cercvlsiae типа К2, то ость содерхалшх киллерную систему К2 <5ыла получена коллекция мутаптоп-суперхиллеров с повцаепной убмвалщей активность» (Фенотип K2S XU2+}. В качестве исходного пта.ч.ча использовали ятамм 6Л-К25 - представителя шестого поколения високогомозиготно'д линии дрожжей типа к2. Мутанты получали с помог,!.» Н-нитрозогуанидкна. Отобрали двадцать мутантов с увеличенной способностью убивать клетки газона чувствительного птам-ма, регистрируемой по величине стерильной зоны вокруг колоний мутантеи.

ski +

физиологические особенности мутантов К2 R2 .Поскольку система К2 является своеобразной, для выяснения деталей оо функционирования следовало установить иозможные физиологические причини повыиенип УЛ киллеров К2. Для выявления отаммов о увеличенной хопийность» киллирных симбионтов мы провели количественное определение содержания у них днРБК (табл.1). Для более полной феаотипической характеристики полученных нами мутантов и сравнения их с суперхиллорами системы К1 мы изучали их осморозистент-ностъ, чувствительность к ингибиторам роста, жизнеспособность, ' секрецио альФа-Фактора, элиминации минорной фракции днРНК М2 циклогоксимидом. По проявлению гэтих призпаков мутанты были пэд-разделоны на четыре группы (табя.1).

Нутанти первой группы, характеризуются увеличенным содержанием основной (1.2) н минорной (М2) фракций днШК, составлятоцих геномный материал хиллерних симбионтов типа К2, что коррелирует с устойчивостью ятоямоа к элиминации днРНК циклогоксимидом (кроме мутантов 11-SA-K25 и 31-GA-K25). Мутанта этой группы не отличались по осмореэистентности, чувствительности к ингибиторам роста и по секреции альфа-фактора от штамма дикого типа. Среди остальных мутантов, у которых содержание днШК и элиминация УЛ циклогоксимидом не иэмесеш/, можно выделить втору» группу: му-

- в -

•санти 24-6А-К25 и ?5-6А-К2& с множественной устойчивостью к различный по своему воздействию на клетки ингибиторам роста и «ЕВОТИЛИЧЕСКИЕ П7ЛШЫ МУТАНТОВ К2вк1И2+. Таблица 1.

Штамм Мутация Содер- Элиминация Окга- Осмо- Чувствитель- Сок-ре-

[К1Ь-Ь2] шива- реэис ность К ЦИК., ктид., нис *4 ция

мкг/г Циклогекси-мид 0040,5 иг/л ние тент-иость лак-тора

ЬА-К25 23 +*1 к*э . *5 *6 4,5

Перваа группа

15-6А-К25 107 +++ ИВ И.Ъ. 6.0

13-6А-К26 эк! 13 85 *7 нр ++ ВБ «.г. А.О

21-6А-К25 эк! 21 53 - + КЗ н.-ь. 4.0

26-6А-К26 гк!26 46 - й и. г. 4.0

27-6А К25 51(127 74 - ЕБ «.г. 2.0

2Э-6А-К25 зк!23 69 - ++ И ».г. 5.0

33-6А-К25 зк!33 106 - ++ К 6.0

35-6А-К25 зк135 71 + в ».г. 6.0

11-6А-К25 skJ.ll 30 + +++ КБ п.Ь. ¿■0

31-6А-КЙ5 вкА31 32 + + ВБ м.%. 4.5

Вторая -руппа

24-6А-К25 1 23 + + К к 1,0

25-6А-К25 вк!25 23 не провер. + к к не щ

трагья группа

14-6А-К25 зк!14 23 не провер. ++ 8 & не щ

22-6А-К25 вк!22 23 + ++ в е 3,5

28-6А-К25 эк! 2 8 16 + • ++ Э Б 0

30-6А-К25 Ек130 16 + ++ Б Б 0

ЗН-6А-К25 еЫ.36 23 нр ++ 5 г 0

39-6А-К25 2? не провер. . ++ В 8 не пр

Четвертая группа

2-6А-К25 зк!2 1 25 + ++ К «.г. 2,0

1В-6А-К25 СК1Ь-з 1 + - К ».г. на пр

32-6А-К25 як!32 I 29 + + к 3,5

"+"- появление конов [К1Ь-03, среди клонов, вьгросвих в доных

условиях;"-"- отсутствие клонов [KIL-0].*Z"+"- белый или голубой,"++"- синий, "+++■"- темно-синий.*3 Н- Рост;S-отсутстпио роста ;КЗ-слабый рост на полной среде с 10% НаС1 или 20%г льжоэы. *4 Качественный тест по радиусу зоны подавлении роста втакма вокруг бумажных мнвеней,пропитанных IX р-ром ингибитора:цикло~ гексимида, актидиона или нистатина.

*5- и.t.-рлдиус зоны подавления роста мутанта в км такой sa хах у исходного отакМл; В-мсньае, S-болъие чем у 8А-К25. *6- Радиус в ни подавления роста штамма, чувствительного к .-< « фактору.*7 - нет роста. В табл.1 и 4 представлены средние данные о содержании диРПК по результатам 3 экстрименгоп. Ошибка, использованного метода выделения диГКК равна (IX,

снижением секреции альфа-фактора, а такхе третье группу: мутанты 14-0А-К25, 22-6А-К25, 28-6А-К25, 30-6А- К25, 36-6Л-К25, 39-6Л-К25 с множественной чувствительностью к ингибиторам роста, осмочувсяг-вительностью и снижением или отсутствием секреции альфа-фактора.

Мутанты четвертой группы: 2-6А-К25, 33-6А-К25, 32-.-ВА-Х26 «в отличаытся от исходного итамма по перечисленным признакам, за исклвченисм повипенной УА и снижения секреции альфа-фактора.

Среди мутантов, у которых содержание днРЯК ио изменено, отсутствует фенотипичеекгя группа с повышенной секрецией альФа-фактора, описанная у киллеров К1.

Изменение чувствительности мутантов групп 2 в 3 одиосре-ненно к нескольким ингибиторам роста, киппнмо которых являются разные клеточные процессы, показывает, что обцей причиной мио-жественпой устойчивости мяи чувствительности могут быть дефект« клеточной стенки. Осмочупствительность мутантов тротьой группы подтверждает это предположение. С подобными дефектами могут быть связаны и противоположно направленные нарушения секреции микоцина и альФа-Фактора.

«1г4 4-

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ МУТАНТОВ К2 К2 . Для уста-

новления типа наследования полученных мутаций изучали их проявления ма уровне УА н на уровне содержания дирак у соотвдаст-вуюцих гетерозиготных гибридов. Т всех изученных гибридов зона УА была меньве, чем у исходных мутантов, что свидетельствует о рецессивности проявления мутаций аХЮ, skill, eklI3, akll4.

Bki21,ski27, eklZS. aki31. cki33, skl35, оЫЗН но уровне УА.

Доминирование признака псвивенного содержания днРНК, как характеристики мутаций ski первой группы. изучали путем сравнения содержания днГНК у диплоидои дикого типа, с таковым у «!!г.ломдоь гомо- и гетерозиготных по мутациям ski этой группы. Содержание днРНК у гомозигот по мутациям зЯ129 и ранее полненной о лаборатории мутации зк!5 существенно выше, чем у гетерози-гот. Следовательно, проявление мутаций oki5 и skl2S рецессивно на уровне содержания ДнРНК. Иутанты 13-6А-К26, 27-6А-К25, 35-6А-К25 содержат больва днРНК, чем соответствующие им гетерозиготные гибриды. Следовательно, мутации вкИЗ, skl27, ski3S также рецессивны. Данные, о рецессивности проявления мутации f-.ktis, eki2S и oki33 подтверждает и низкое, характерное дли ди-ллоидов дихого типа, содержание днРНК у гибридов К608, Kí¡09 и К610. дигетерозиготиых по перечислении« выве новым мутациям и по мутации ski5. Рецессивность проявления мутаций ski на уролю УА дает возможность установить тип наследования полученных нами нутаций и провести комплементационный тест на их аллелиэм. Расцепление в потомстве, характерное для ядерного типа наследования было обнаружено у гибридов, гетерозиготных по мутациям первой

группы: okilJ, akil3, aki2l, ski27, eki29,aki33, ckl35. Кдинст-

eki +

венный случай цитсплазматического наследовании признака К2 Н2 наблюдали у мутанта четвертой группы 1.8-6А- К25.

Комплементациоиный тест па аллеяизм мутаций ski первой группы.

Сжрецмвали нутанты - суперииллеры и сегреганты, несучие новые кутацми eki в сочетании с различными ауксотроФностяни и типом спаривания. Все гомозиготы по мутациям ski, за исключением гомозигот по нутации ак129. доли зоны, по величине сопоставимые с зоной галлоидиих (граммов с этой же мутацией. У 6 проверенных независимых гомозигот по мутации еЫ29 зона лизиса была больке, чем у гаплоидных родителей. Можно предположить наличие эффекта дозы для этой мутации. Содержание днРНК L2 и И2 у гибрида с Двумя дозами eki29 шив, чем у исходного мутанта, что подтверждает эффект дозы аллели вк19 не только на уровне УА, но и на уровне содержания днРНК. Промежуточные зоны, характерные для дигеторозиготных гибридов, указывали на отсутствие аллельности

соответствующих мутаций суперкиллерности. Таким образом, все

+ +

гетерозиготные гибриды имели Фенотип К2 R2 , что подтворхдапт рецессивность исследованных мутаций по признаку УЛ. Исключение-составляет гибрид втаммов 35-6Л-К25 и 52С- K2GG, который дел зону лизиса такую же, как гомозигота по aki5. Эти данные указывают на возможный аллелизм мутации зк15 и ski35.

Рекомбинационный тест на аллелизм. При изучении расщепления по УА в тетрадных анализах гибридов, дигетерозиготных по новым мутациям skx наблюдали возникновение мейотических сег-регантов с Фенотипом К2+Я2+ бто есть нутации p>í комбинировал и , за исключением мутаций ski5 и ski35, что подтверждает данные об аллельности этих мутаций.

Изучение сцепления мутаций ski. Мутанты первой группа, 13-6Л-К25Г~27-6А7К25, ¿9-6A-K2íTh 35-ВА-К25 содержат наибольвео количество диРНК. При изучении рекомбинации этих мутаций друг с другом и с известной мутацией skl& выяснилось, что оич сбразуглг одну группу сцепления (рис.1).

ski27 - ski29 - aki5 <aU3S) - ekil3

! ! ¡ .1

1______Ju.___>L_____

17cM 38oH 42cH

Рис. 1. Группа сцепления мутаций ski, коктролмруюдих содержание днГОК у киллеров К2.

Возможно, что Физическое сцепление генетических кхусов играет роль о механизме Функционировании продухтоо эти* геноо.

взаимодействие генов SKI. Изучение а система К2 взяя-модсйствйя~мггадйй~зкГ-ймоёт~практичосков значение, асли использовать оз&имодействмо генов как способ получения продуцентов днРНК. Том. если мутации обладают кунуляп»аним действиои.то сочетание их о одной генотипе может привести к увеличении содержанка киллориых ллазмид о к лотке. Если аса мутации ачистати-руют, то сочетание их неперспективно. Ранее Счдо показано! что используюдаяся дли создание продуцентов аллолъ »Мб обладает эффектом дозы (Нестерова и др., ¡889) (тай*. 2). Отбор гтаймов с повышенной дозой аллоли aki6 можно хонторлиропать ливь по содержание у них дхГМК, что весьма трудоемко. Ъ связи о этих биде поставлена зодачв конвггуировешиа итанноп, носуцих кроме аллели

t&iS аналогично действуииии другие иной ski, чтобы направленно

СО.ГГРЖаНИЕ днГ'НЧ У ШТАМКОВ ГЕНЕТИЧЕСКИХ таблица 2.

ЛИНИИ К вк15 Б ЗАЖСИМО&ТИ ОТ КОПИИНОСТИ АЛЛЕЛИ sk!5.

Штаммы Содержание

количество копий skiS плоилность Количество npoeeрепных мтаммов r днРНК мкг/г

дикий тип: 0 18 23-3

дикий тип: 0 2п 3 23-5

1 In 9 110^11

? In 10 255-17

2 2 и 12 215-54

3 In 7 343-25

3 ?n 6 355-7

4 In 7 449-26

4 2 n 2 460

1 In 8 703-21

*Х - "п" - пдоидкость атанма. В тебл.2 и 3 приведены средние значения днРПК для нескольких втамнов. объединив их в одном.генотипе, повысить содержание днИ1К у продуцентов. В тетрадах гибридов KBQ6, KS07 и К860, объединяющих нутациь ак.15 с мутациям» uklll<K606'), aki21(K607) и skil3(KB60) {подгруппа А) наблюдалось дмгпниос расиепленио по УА . Наиболее високой Уд обладали мейстичеекио согрегантц, содержание в генотипе аллель cki5 и одну из указанных аллелей nki, что указывает не кумулятивный тип взаимодействия иутантних оллолой skill cki13 ц Pki21 со вЫБ на уровне УА. В то жо время содержание днРНК у кейотическшс сегрегантов этих гибридов, имеющих по две мутантные аллели, было эначитвхыю ниже, чем у сегрегонтов с одной аллель» ski5, и несколько сыче, чем у иойотических согрогантов с одной аллель» skill, ski13 или skl21. Объединение мутаций skiS и ski33 (подгруппа В) а гаплоидном генотипе приводит к повышению содержания ХиШК до 240. мкг/г, что почти вдвоо по сравнению с гаплоидами линии вк15, содержащими одну аллель вк15, а у дипдоида К8Т4, гомозиготного по обеим нутациям, содержание днРНК равно 498 нхг/г, что значительно въие, чем г диплоидов, гомозиготных

по зк!5 и приближается к уровню, характерному дли гибридов, содержащих с своем генотипе более я»ух доз вМ5 (табл.2). По- ви-днному, мутантным аллелям зк15 н aki33 свойственен кумулятивный тип взаинодейотиня на уропне днРНК. Отличительным свойством генов подгруппы G в этом случае должен быть эффект дозы мутант-них аллелей ski по отношению к содержанию дирше. Анализ еодер-ржания днРПК у диплоидов , гомозиготных по мутантнык аллидяи aki29 (162-250 мкг/г) по сравнению с во уровнем у гаплоидов (6в мкк/г), содержащих одну мутяитнуп аллель, показывает, что аллель shi29 обладает эффектом до;ш, как н а»лс?*ь як!Е и по этому признаку так же иожст бить отнесен к подгруппа Б. Кутании гонов этой подгруппы, таким обрлзом, перспективны для селекционной работы по сопданию Продуцентов днГНК.

По предложенной Нестеровой Г.4>. модели регуляции кил-лерной системы К2 на уровне транскрипции, контроль кояийности L2 и И2 заключается в узнавании специфическими геиныни продуктами участков copt. и сорН на родительских "-"цепях обоих видов диГПК, регулирующих темп синтеза дочерних -ранскриптов (рис.1). Продукт SKI5 узнает эти участки и лимитирует темп транскрипции. Поскольку мутантныа аллели skill, ski 13 Ь зк!21 эпистагируют проявление аллели ski5, в результата чего происходит снижение содержания И, мы можем предположить, что продукты гонов SKtll, SKI13 и f>KI21 позитивно контролируют синтез негативного регулятора транскрипции - продукта гена SKI5 (рис.1). Кумулятивный тип взаимодействия аллелей ski33 с аллолы» aki5 говорит о существовании в клетке нескольких негативных регуляторов Х0ний:10сти днРНК, продукты которых кооперативно действуют на одну мнлеиь (например, на участки copL и сорМУ (pise. 1»). Если же принять во внимание схему регуляции копийности днРПК на уровнэ трансляции (рис 16), по которой продукт гена S8I5 отвечает за точность связывания рибосомы с транскриптон и продотврадае? сдвиг ранки считывания, и результате которого образуется химерный беюк вад-pol, осуществляющий репликация и транскрипцию киллерного генома, то продукты генов негативного контрила, skill, ekil3, ski21 (подгруппа А), эпнотатируюних аллель ак15, Также должны позитивно регулировать образование продукта гона 6KI5, возможно путем неспецифического увеличения уровня транскрипции или уво-

подгруппа Л подгруппа Б

рис. 1 •

о

I

рос. i б

orí i. jjag pol

П 1-1

- It-

rop L

B^.

or', M

w п

«ftp M

[ski 11, », 21 ¡ski S, 33

Схема фунта» retios шлншфусяой защиты клеткк SaccharoroycCH cercvisiae '

личения стабильности либо времени г.изни транскриптов. Кумулятивный ry.it взаимодействия аглели ski33 (подгруппа Б) с аллель» ski5 в данном случпо может говорить о роли продукта гена SKI33 в увеличении точности движения рибосомы по трпнскрипту (рис.16).

Селекция атпммов - продуцентов днПЖ. Каллерныо системы лчгко реагируют на изменение генотипа к*отки хозяина. Покоторив мутации, непосредственно не относящиеся к киллерной системе, как например, доиннэнтиыо и рецессивные нонсенс супрессоры приводят к уменьаенип копийпости киллерных плазмид (Нестерова и др. 1975, 1081).Б спязи с этим в генотип ятаимов, с которыми проподилпсь селекционная работп, была вводонп нонсенс- мутация hia'/-l в качестве селоктипного маркера, юдаиляемого как доминантными, так и рецессивными нэнсснс-супрессорами, что позволило стабилизировать содержание днГНК у штаммов К245 и 15-6А-К2Ь.

При проиедснми отдаленных скречипаннй предеггвителей линии К2 eklb всегда происходило снижение содержания днРПК. При проведении скрсяизаннй о пределах двух родственных линий К2 ek!5 наблюдали высокое содержание днИШ. Нежлинейные гибриды в среднем содержат 134 мкг/r днРНХ, а «нутрилинейные - 265 мкг/г при скрещивании между представителями разных поколений, и 286 мкг/г в случае внутрисемейных скрещиваний {381мкг/г при проявлении дополнительных доз f.kib и 220 при возврате к генотипу диплоидов с днуия дозами ski5). Использование внутрисемейных скродивалий, таким образом, дает 3-4 кратное увеличение содержания днРИК у гибридов и согрегактов (табл. 3, рис.2). Возможны дэо причини повышения копийпости киллерных плазмид при внутрисемейных скро-ципаниях:элиминация мутаций, ошжаюцнх содержание д.чРНК и сохранение возпиктих в линии генетических факторов, увеличивающих содержаний днРНК.

Недостатком полимерных линий К2 silá является их негативное влияние на скорость роста продуцентов.В навой работе мы обнаружили по моньгюй мере еде два гона SKI - SKI33 и SKI29, мутации которых влияют на содержание днРШС аналогично мутации

С целью увеличения содержании днИЗХ и повышения стабильности птаимоо с мутацией uki23 нами, так же как и и линии eUiS, бия применен метод внутрилинейной гомоэиготизации - пнутрктетра-

- 1С -

Линия 1 К2 зк!5

6А-К25 (15-20) г

3-К18*—X--' 16-6А-К25 зк!5 ■

^ ' (107) — К243 !эк15/+ (30) ' Н0-К23зк15 — X12С-Г5+ (62) • !' 1

Линия 2 К2 зк!5

----X-----

(30)

-52Б-К12+ (26)

■ 7В-К234+— X •

Г

Г'

---К266

(20! =к15/> 270-К266зк15 1 (119) '

\**№**+ ;

Х*К247зк15/зк15 ' (247)

-10Г-К234ек15-(100)

J

•К240ек15/зЧ15 (270)

Х-ИСг41зк15/ I ;г5) -52С-К266— X —

(125) ' у зк!5 К24Р , , „п.. у

як1Ь/ак15

28-К245зк15~- X •

| К2Тб (118)

I— 16-К245ак15 - X--35-К245зк15

---и—„4 ¡95)

1-К24 (103) 31:15 22-К245

К264 9к15/5к15

1-К248зк15/ак15 (392)

зк!5/гк15 К252 (140)

I

2-К248 (704) (вк!5)п

К24Взк15/зк15 (304)

6-К248зк15 ~ X -7А-К220зк16' 1 (105) т (50) л К290зк15/+Ек16/+—,

7Г-К290вк1оск16----1

(63)

->-К291вк15/5к15вк1е/+

- X —7-К248зк15гк15------?-

| (245) 1-Х>К285(260)- £283

Кг53(Ек15)п(460) Г—Ч-К275П09) (350

Д..

-93-К253-(632)

Д265

(630) ?^365) . Г -95-К253 -15А-К253 (770) и20А-К253 (718) 20В-К25Э (704) 20Г-К253 (736)

~Х— К282 —X —

к1э7

5Б-К253-(534)

•6А-К253 " (474) (230)'-4-3-Кг53

-16В-К253 (550)

,К275 (1:691

' (290)

16Г-К253 (336) 3 5Б-К253(448)

15Г-К253 ■ (315).

К264 (284) (—10-К264 | (297) '-19-К264 (300) ' К282 -г-К (198) -

■6-К253• (280)

—1Б-К253• (250) 53Г-К253-(250)

■ 4А-Х253-(250)

•Ц?

и

-15В-К253-

(258) 57В-253 (304) ■20Б-К253

__________________(254)

ис То дословная линий кй "ёк15. 6 скобках дано содерТднРЖ

V

кг 96

(350)

СОДЕРЖАНИЕ днРНК У ГИБРИДОВ ЛИНИИ К£ зк15 Таблица 3. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТИПА СКРЕЩИВАНИЯ.

Гиб- Предполагаемый генотип Проис- Содер-

РИД хождение жание

днРИК

МКГ/Г

Меллинейные скрещивания

К247 5к15/ак15[КИ-к2] 5-К2413 X 10-К243 247

К249 (ак!5) /ак15(К1Ь-Ч21 1-К248 X 52С-К266 180

К268 зк15/( 5к15^[КИ|~к2] 2-К248 X 276-К243 110

К269 вк1Ь/(ак15^СКа-к2] 2-К218 X 12Б-267 80

К276 5к15/(8к15^[Ка-к2] 2-К248 X 463-К266 110

К277 ак15/(вк15^К1Ь-к2] 2-К248 X 34А-К286 110

К278 (ак15£/Бк15[К1Ь--к2] 7-К248 X 52С-256 125

Х-п 134-39

Внутрилинейныо скрещивания

а)Между представителями рапных

поколений

К283 ;эк15>2/(вк15)|К1Ь-кг] 7-К248 X 4А-253 350

К264 (8к15)2/(ак15)^К1Ь-к2] 2-К248 X 1Б-К253 165

К285 (ак15)2/(5к16)|^К1Ь-к21 7-К248 X 5В-К253 280

Х-о 25 ¿67

б)Внутрисеме(1ный инбридинг

К253 (зк15>2/(вк15)^К1Ь-к2] 2-К248 X 7-К248 460

К265 (зк!5)п/(зк15){;КХЬ-кг1 93-К253 X 95-К248 ЗЯ*

К295 С /(зк!5)^К1Ь-к23 15А-К253Х 15Б-К253 360

К296 (Ек15)п/(эк15)^Ка-к25 15В-К2 53Х 15-К253 350

Х-о 38 ¿37

К252 {5к15у2/ак15[К1Ь-к21 5-К248 X 7-К248 140

К264 (зк15)2/(ак15;^К1Ь-к2] 6-К253 X 6А-К253 204

К275 <зк15)2/(ак15)£КП,-кг] 1-К253 X 5-К253 :э.9

К279 (ак15)2/(як15)|1К11,-к2] ЗВ-К25Э X 6А-К253 230

К282 (вк15)2/(эк15)|К11,-к25 4А-К253 X 1Б-К253 198

Х-о 226-29

дных скроцкваиий и последующего отбора на увеличение содержания днРНК. Полученный в результате диплоид К851, гочозиготный по мутации r.ki29, имеет сравнимое с аналогичными диплоидами линий К2 вк!5 содержание днРНК - 250 мкг/г. Этот стамм передан в коллех-ци» ВКПМ, имеет справку о депонировании и коллекционный номер ВКПМ ¥-1017.

Голь стабилизации генома при селекции продуцентов днРНК. При создании высокопродуктивных втаммов на базе генетических линий К2 skiS было обнаружено, что у ряда диплоидон, содержащих дополнительные дозы мутантной аллели ок15, наблюдаются аномалии расцепления по маркерам ауксотрофкости, указывающие на присутствие дополнительных доз соответствующих мутантных аллелей или аллелей дикого типа . У потомства таких итшмов при селехции на повышение продуктивности путем внутрисемейных скрещиваний дополнительные дозы skiS могут утрачиваться , что резко снижает продуктивность селекционного материала. Возможной причиной хромосомной нестабильности представителей линии К2 ski5 может яв-являться наличие в геноме факторов, ее вызыоахшжх, о чем свидетельствует возникновение и утрата дополнительных доз генов LYS2, 8IS3 b SKI5.

Изучение электрофоретического кариотипа (ЗФК) у представителей последовательных этапов создании высокопродуктивной линии 1 К2 ок15 позволило выявить динамику изменения хромосомного материала. Родительские ят&мми первого гибрида линии К2 ski5, К234, отличаются друг от друга по 4 элоктрофоретическим особенностям (табл.4). Гибрид К234 наследует хромосому, соответствующую полосе 13 от родителя 15- 6А-К2Ь, объединяет обо родительских варианта комплекса пятой и восьмой хромосом и имеет обе формы третьей хромосомы, что соответствует представленном о дискретности наследственного материала при гибридизации.Кариотип гомозиготного по мутации ski5 высокопродуктивного гибрида К245,полученного при скрещивании сегрегантов гибрида К234. идентичен хариотипу гибрида К234. Эти данные показывают, что мутация вИ5 не влияет на стабильность ЭФК. Последующий гибрид. К248, полученный при скрещивании согрегантов гибрида К245, отличался величием дополнительных доз ядерной аллели Iys2-A12, что указы-вет иа аиеуплоидию или хромосомные перестройки (Нестерова и

ИЗМЕНЧИВОСТЬ ЭЛЕКТЮМРЕТИЧРСКИХ

клгаотнпоа и генотипов линии кг емь.

Таблица 4.

Штамм

52В-К12

15-ед-К2&

К-234

К-245

К-248

22-К248

27-К248

К253

15А-К253

16Б-К253

15В-К253

15Г-К253

20А-К253

20Б-К253

20В-К253

20Г-К253

Ио-коле-ние

[Содер-|Жаиие IднРНК |мг/г

кариотипа

Изменчивость генотипа

I

р*3

Р II

¡111

I*

|У1

I"

¡VII 'VIII VIII VIII VIII VIII VIII VIII VIII

28 107 30 270 304 704 245 4С0 770 448 258 315 718 254 704 736

К>л-во измененных полос

мчн. полос

*2

Дополнительные аллоли

вк!б|Ма7-1 1- ч2-А12

0 0 о о

43 21 7 О О

о о о

о , о о о

■ч*4

I*4 2*4 п 3 1 2 г. 1 п

О О О О

О*4

О

о*4 ,*4

»4

Э*4 , *4

*1 - В качестве критерии изменчивости электрофоретического кариотипа приведено количество измененных полос, получаемых при раздолениин ДНК индивидуальных хромосом с помочь» метода

пульс- электрофореза. 5(изм,полосу

Обиеечисло полос

- В

Числоиэмен.полос кичестпо критерия изменчивости генотипа приэедено количество

дополнительных доз хромосомных геноч по срш>неннл о нормой

(1 доза у гепяоиднигс ятаммов и две дозы у днллокдных

атакмоз) «3 - "Р" - родоначальники яипии. - количество

дополнительных аляалей показано методон тетрадного анализа

(29);"-"не проверяли. В остальных случаях число доп, аллелей

зк15 выставлено на основании данных о содержании днИ1К » зависимости от дозы аллели skia (табл.14). *5 - "п" - число аллелей не установлено, др., 3 933). Во сравнению с гибридом К245 гибрид К248 инеот в изменений ЭФК (табл.'!).Некоторые сегреганти этого гибрида имеют дополнительные дозы аллели akiS и, в связи с этим, необычно высокую хопийиость днИ1К ю В ЭФК таких сегрегаитов появляются новые полосы, отсутствовавшие у родителей.

Таким образом, в линии произошла дестабилизация генома гибрида К24Б, которая позволила отобрать ьысоконройуктивнич втамны с несколькими копиями aki5. Ео причиной, возможно, является возникновение дестабилизирующего генетического Фактора.

У гибрида К2ЬЗ нежду сегрегантами гибрида К248 с аномалиями ЭФК содержание днРНК вдвое выше, чем у обычных линейных динлоидов и характерно для динлоидов с четырьмя корнями мутант-ной аллели ski5, в соответствии с нормами коиийиости киллерных плазмид для штампов - продуцентов днРИК (табл.2). Гансе было показано, что гибрид К253 имеет дополнительные дозы двух других ядерных аллелей Ыз7-1 и 1ув2-А12, что также может быть следствием хромосомных перестроек( табл.4). ЭФК гибрида К253, несмотря на кариотипичоские аномалии родителей, практически идентичен ЭФК гибрида К234 (табл.6), что говорит о стабилизации ЭФК в результате применения внутрисемейного инбридинга. ЭФК сегрегаитов двух полных тетрад гибрида К253 различаются лишь но наличию одной из двух Форм третьей хромосомы (табл.3), что подтверждает стабилизации кариотипе». Все эти сегреганти имеют необычно высокое содержание днШК и являются перспективными кандидатами на роль продуцентов днРВК, что указывает на закрепление у них благоприятного генетического фона.

Таким образом,при создании производственных втаммо» ка-риотипический контроль позволит прогнозировать разнообразие потомства для отбора и выбират» стратеги» селекции. Отбор стабильных по своому генотипу и продуктивности «таймов с учетом их ЭФК, сократит масштабы заключительных этапов селекции, направленных но стабилизации высокой продуктивности. На основании подученных результатов для создания продуцентов ридостина предлагаем следующие рекомендаций:

1 - введение в генотип нонсенс мутаций для получении возможности контроля за появлением нонсенс супрессоров, снихлшчих содержание днИЗК;

2 - выбор наиболее перспективных мутаций по характеру взаимодействия мутшгпшх аллелей;

3 - нспольэопоние тенденции штаммон к хромосомным перестройкам дяя получении болоо разнообразного потомства; 4 - применение близкородствснних скречипапий для стабилизации геномов продуцентов и увеличения дозы аллелей, повыиаю'дих содержание днРНК;

5 - электроФорктический контроль кприотипоп продуцентов для поддержания стабильности генома продуцентов.

вдшды

1.Получена коллекция мутантов дрожжей ЗасоЪлготуоея cerevisiae с посытенной антагонистической активностью.

2.На основании ^изиологичесхих особенностей видолонныо мутанты подразделены на 4 групп«. Мутанта первой группы имеют повыиенное содержание днРЖ. У мутантов остальных групп содержание днШК не изменено и все они имеют сниженную секреции альфа-фактора. В дополненио к этому мутанты второй группы устойчиоц к действию антибиотиков, а представители третьей группы к ним чувствительны. Мутанты четвертой группы отличаются от исходного штамма снижением секреции альфа-фактора.

3.Изучена комплементация и мокаллольнап рекомбинация мутантов с ловиоешшм содержанием днРНК. Показано, ч+о гены SKI27, f>KT:;9, SKI5, GKI13 образуют линейную группу сцепления.

4.Выявлены два типа межаллолышх взаимодействий среди мутантов с повышенной антагонистической активность»: эпистатическое подавление проявления аллояи зк!5 аллохами aklll, skil3, зк!21 и кумулятивное взаимодействие аллелей зк!5 и sk!33.

5.Предложена схема регуляции на уровно трансляции ниллерной системы К2.

S.Изучены возможности селекции продуцентов днРИК с использованием известных и полученных нами мутаций и депонирован втамм - продуцент днРНК.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМ2 ДИССЕРТАЦИИ

1.Войкова С.Г.(Давыденко), Бобылева Т.В., Нестерова

Г.4>. , Столбова A.B.. Тучннская Е.В., табалина М.В. ВэапмомеЯсгпиа некоторых хромосомных геном, я^гигюиих на содержание киллорной плапмиды К7. дрохжой Sacc.hnronycen «crcviclac, тео. докл. VI Всесоюзной Межуниверситетской конференции "Биология клетки", 1985, с.811

2. Nooterovn G.K., ßhabalina M.V., Zckhnov А.И., Stoibova A.V., Boykova S.C. (Davydenko), Tuchinskaya E.V., BohysVtova т. V. Chroieosoua 1 defconaina-tion of сору rtumb'vr of K2 Plasmid of Saochnrouiyces cor«vii;?ne //Abstr. of tho X Intorn. SpecialiKed ñympos. on Ycar.t, Bulftaria, Vanw, 1905, p.14.

3. Нестерова Г.Ф., Шаталина Ч.Б., Fofiiincca Т.П., Тучинская F.. П., Столбова A.B., Бойкона С..Г. (Лапиденко). Скдяипа JÍ.JI. , Генетический контроль копийностч кмллерних плапмид типа К2 у Snccharoiryces ccrevioiao //Генетика, 1989, т.26, ТЮб с.) 725-1739.

4- Лавыденко С.Г. , Ниловатсг.ий B.C., Меновая К.В., Нестерова Г.Ф., Склярова Л.Л.. Яровой Е.ф. Пульс-электрофоротичоскоо кариотилировэнио дроххей Saocharoraycoo ceroviain«; - представителей генетических линий K'-i //Tod. докл. YII Всесовзного симпозиума "Молекулярные механизмы гекстичоскнх процессов", Носква, 1990, с.?1Т.

5. Давыдонко С.Г., Ниловатский B.C., Нестерова Г. Ф., Склярова Л.Л., Ножевая Е.В., Яровой П.Ф. Полиморфизм хромосом у дролжей сахаромицетов.//Генетика,1990, т.26, Т12, с.2135-2346.

6. Дпаыденко С.Г., Миловатскнй B.C., Воробьев A.B., Вьюнов К.Л. Определение содерхання плазмидных двунитсвих РПК в кнллермых системах дрожжей Saccbaromyceo cercvioiae //Молохулярная биология, генетика и вирусология, 1990, т.11, с.10-13.

7. Nesterova Ü.F, Dovydonko ß.G., Vorobiov A.V., Scliarova Ь.Ь. //Ahnt, of tbe 15th Int. Spccialised. Symp. of Ysasta Regulation of Motabolism and Biotecnology, 1091, o.98.

8. Довиденко С.Г., Нестерова Г.Ф. , СтолСпва A.B.. 'Тхларооа Я.Я., Генетический контроль и Физиологические особенности мутаций ski у втоммои-хиллоров типа К? дрожек Sacoharomyooa cerevisina У/Геиатика, 1992, т 28, Т2б C.72-B7.

9. Востерова Г.*., Склярова Л.Л., Давмденко С.Г., Миловатский B.C. Генетический контроль киллерних систем у дрожжей сахаромицетов //Теэ. докл. Н Съезда РОГиС, Нинск, 1992.