Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутагенные эффекты гербицидов триазинового ряда

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутагенные эффекты гербицидов триазинового ряда"

• 5 V

г ^ На правах рукописи

и

УДК 57S.224.044

БОЗШАТАЕВА ГУЛЫ11АТ ТУГЕЛЬБАЕВНА

МУТАГЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ГЕРБИЦИДОВ ТРИАЗИНОВОГО РЯДА

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Республика Казахстан Алматы 1998

Робота выполнена на кафедре микробиологии Казахскою государственного национального университета пмеин аль-Фарабн.

НаучныН руководитель: Член-корр. НАН РК, до-гтор

биологических наук, крофессор ШИГАЕВА М.Х."

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор БИГАЛИЕВ А.Б. Кандидат биологических наук ИСКАНДЕРОВА К.А.

Ведущая организация: Институт физиологии, генетики

н бноннженерни растений НЦБ РК

Защита состоится 1998 гола в " /£Г"*~часов на

заседании диссертационного совета Д14/А.01.01 в Казахском государственном национальном университете имени аль-Фараби по адресу:

480078, г.Алматы, проспект аль-Фарабн - 71, Учебный корпус ГУК-6 КазГУ, биологический факультет, ауд. 214.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КазГУ имени аль-Фараби.

Автореферат разослан "ЛО " О^^Х, 1998 года.

Ученый секретарь .

диссертационного совета у^ииЦи*/— Колумбьгва С.Ж.

Актуальность теш. Триазиновые гербицида широко используются в сельскохозяйственной практике для защиты зерновых, овощных культур и виноградников от сорных растении. Они весьма „ разнообразны как по химической природе, так и по генотоксич-ности. Изучение мутагенной активности нз про- и эукариотных организмах показало, что среди триазиновых гербицидов обнару-иивавтся прямые мутагены и промутагены, генотоксичкость которых регистрируется только с помощью растительных и животных клеток. Безусловно, промутагены представляют большую опасность, чем прямые мутагены. Тем не менее эта группа триазиновых пестицидов остается сравнительно мало изученной, хотя методические предпосылки для этого имеются. Так, еще в конце 70-х годов рядом ученых (Gentile, Plewa, 1978, 1982, 1988; Loprieno, 1980) предложена тест-система Salmonella / гомогенат . растении, в которых микросомы млекопитающих были заменены мик-росомальной фракцией гомогенатов растений. Возможности этого теста недостаточно использовались для более полной характеристики триазиновых промутагенов.

Большинство исследовании было посвящено сравнительному изучению активирующей способности ферментной системы различных растений и выявлению наиболее активных фракции растительных гомогенатов. Мало сведении о характере трансформации промутагенов в прямые мутагены, о влиянии на этот процесс активаторов и ингибиторов оксигеназ. Мутагенный эффект метаболитов, образующихся под влиянием растительных ферментов, обычно устанавливается с помощью индикаторных бактерий, т.е. речь идет о регистрации- превращения промутагенов в прямые мутагены. К сожалению многие иссдэдовайия заканчиваются ка этой стадии. В то' же время важно знать в каком направлении изменяются мутагены, образовавшиеся в растениях из промутагенов, при попадании в организм млекопитающих. Происходит ли их детоксификация или, наоборот, токсификация.

Более того, оказалось, что недостаточно изучены не только прсмутагенные, но и мутагенные триазиновые препараты.

Так, несмотря на то, что в последние годы получили развитие исследования по выявлению связи между структурой и мутагенной активностью химических соединений, сведений относительно триазиновых гербицидов практически нет. Все это свидельствует о недостаточной изученности мутагенности триазиновых гербицидов.

С учетом широких масштабов использования триззиновых гербицидов, решение указанных вопросов весьма актуально для оценки их потенциальной генетической опэсности.

Цель и задачи исследований. Цедыо настоящей работы Сиас изучение мутагенных и цитогенетическях эффектов тртаэннэьки гербкцадов и их метаболической трансформации под влиянием ферментных систем животных и растений.

Для достижения поставленной цели решались следух-чие задачи:

- Изучение мутагенной активности структурно различных триазинов на индикаторных штаммах Salmonella typhímurium.

- Изучение мутагенной активности триазинових гербицидов i системе бактерии / микросомы печени крыс и бактерии / гомоге-нат растений.

- Изучение роли окислительно-восстановительных ферментов i трансформации триазинов в растениях.

- Изучение модификации активности мутагенных метаболито! под влиянием микросом животных.

- Изучение характера совместного действия различных триази-нов.

- Изучение мутагенной активности в цитогенетических тестах.

Научная новизна исследований. Впервые получены данные с

связи мутагенной активности триазинов о их химическсй структурой.

Впервые дана цитогенетнческая оценка мутагенного эффект? метаболитов пробиотиков, образующихся в процессе растительно/ биотрансформации.

Получены данные о вкладе различных ферментных систем растений в Оиотрансформащх промутагенкых триазинов.

Обнаружено комутагенное действие различных сочетаний прому-тагенных соединений.

Практическая ценность работы. Для выявления мутагенной активности атразина, пропаэина, симаэнна рекомендуется тес: Salmonella / гомогензт ячменя, для цианазина, триэтазинз -Salmonella / гомогекат традесканции.

Мутагенные метаболиты хлорпроизводных триазинов не полностью инактивируются микросомами печени млекопитающих, а и: сочетания оказывают аддитивный эффект. Эти данные позволя: разработать дополнительные научно обоснованные меры от рнсю их применения.

Б

Положения, выносимые на защиту.

- Мутагенная активность триазиновых гербицидов, зависит от ту. химической структуры.

- Для установления потенциальной опасности промутагенных зоединений необходимо сочетание тестов Ба1тспе11а / растения о датогенетиче-скнмн.

- Мутагенный потенциал триаэиновьк гербицидов может проя-зиться в комбинации двух нэмутагенных соединений, или немута-"енкъх с мутагенными.

Личный вклад автора. Все основные разделы представлегаюй заботы выполнены лично автором.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 7 заботах.

Апробация диссертационной работы. Материалы работы дсклзды-5ались и обсуждались на конференции молодых ученых Казахского государственного национального университета имени аль-Фзраби (1935, 1997, 1998гг), на первом съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, 1997г).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 104 стра-гицах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, вы-5сдов и списка использованных источников.

Работа вклзсчает 19 таблиц, 12 рисунков, в списке литературы 185 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Индикаторные системы:

1) Культуры' микроорганизмов. Использовали индикаторные зтэымы Salmonella typhimuriun: ТА ?8 - his D2C52, rfa, uvr В, ;КМ 101; ТА 100 - his G45, rfa, uvr В, рКМ 101; ТА 15S5 - his J45, rfa, uvr В: ТА 1533 - his D3052, rfa, uvr В; ТА 1537 -Us С 3076, rfa, uvr В.

2) Семена ячменя Hordeura vul^are L. сорта Черниговский-5. Пестициды. Атразин, пропазин, симазин, цианазин, тризтазин,

грометрин, семерон, симетрин, метопротрин, С18898, игран, си-

меток, норатон, платан, приматол, мезургш, ВЛ 9385. Препараты растворяли в диметилсульфоксиде и использовали в концентрациях 0,05 - 50 мг/мл.

Методы исследования.

1. П о я у коли я с с.712 енныЯ метод учета. генных ыутаций у индикаторных бактерий S.typhimríum.

Использовали чашечный тест (Aries е. а., 1973). Мутагенный эффект учитывался по кратности превышения числа ревертантов, индуцировзнных препаратами, над спонтанным фоном (Фонштейн, 1935).

Ночную культуру бактерий, отмытую от бульона, вносили в селективную полуобогэденну» гистидином и биотипом среду с 0,7Х агара, добавляли раствор испытываемого препзрата в исследуемых концентрациях, активирующую смесь. Содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара. Учет результатов проводили путем подсчета ревертантов на опытных и контрольных чашках.

' 2. Приготовление растительной активирующей смеси.

В экспериментах использовали ячмень сортз Черниговский-5. Проростки выращивали в течение 5 суток в лабораторных условиях с естественной фотопериодичностью, затем растения собирали, игмельчали и замораживали. Растительный материал гомогенизировали в ступке, добавляя десйнсй объем фосфатного буфера (рН 7,4), и центрифугировали 15 минут при режиме 9000g и температуре 2-4°С. Супернзтантную жидкость отбирали и сразу использовали в опыте.

В экспериментах использовали полную актизируювото смесь (ПАС) и неполную активирующую смесь (НАС). В состав ПАС входили: исследуемый, препарат, суспензия бактерий, растительный го-могенат и кофакторы, необходимые для работы окислительно -восстановительных ферментов. В вариантах с НАС вместо кофакторов вносили соответствующий объем растворителя - воды.

3. ПолуколичесггзенныЯ учет генных мутация с активацией препаратов ферментными системами растений в условиях in vivo.

Проростки растений в течение двух недель обрабатывали различными концентрациями триазиковых гербицидов, затем из этих растений готовили гомогенат и на индикаторных бактериях определяли их мутагенную активность.

4. Цшпсгенетческий иегад изучения действия шриазинавых гербицидов на Семена ячменя.

Учитывали число индуцированных аСеррзций хромосом в клетках гарнеЕой зародьлгевой меристемы ячменя на временных давленых препаратах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1 СВЯЗЬ к1УТЛГЕ1ШОЙ AKTHBUOCTH СО СТРУКТУРОЙ ПРЕПАРАТОВ

Изучал)! 17 гриазиновых гербицидов, содержащих различные бункциональккэ группы, на серии индикаторных штаммов Salmonella typhimuriun.

Мутагенными свойствами обладали метилтиопроизводные триаэи-13 (Таблица 1). Максимальный уровень мутаций у штамма ТА 1535 одуцировзл семерси (превышение над уровнем контроля в 14 раз) t игран (8 раз). Игогенныи ему штамм ТА 100 оказался более гувствигельным. Число ревертантов индуцированных триазинами зревьшает спонтанный уровень в 12-20 раз. Замена метилтиогруп-ш на метоксигруппу приводила к увеличению регистрируемой мутагенной активности. Соедгаения ипатон, симетон, норатон, при-¿атол обладают бсльпей мутагенной активностью, чем метилтиоп-эоизвсдные, фен индуцированных реверсий в 20-35 раз превосхо-1ит контроль в зависимости от препарата. Причем эти препараты :РСЯЕЛЯЛИ мутагенную активность уже в малых дозах (0,05, 0,1 <г/мл).

Введение в эксперимент смеси микроссмальнон фракции меняет сзртину мутагенного действия метилпроизводных триагиновых пре-¡аратсв - ¡функционирование системы млкросомального окисления ¡ечени млекспитакздих приводило к их дезактивации, что выражз-¡тся е резксм снижении числа ревертантов (Таблица 1).

Хлсрпрсизнодные триазина и азидо-содержэдие триагины ке [ролаляли мутагенной активности при прямой проверке. Стсутс-'вие достоверного увеличения уровня индуцированных мутаций по :рагиен1за с контролем у 'этих групп препаратов наблюдалось й в жгпгртаентах, моделирующих возможную биотрансформацию в орга--шзме млекопитающих - тесте Salmonella / микросомальная фракция печени крыс.

Таблица 1

Мутагенная активность трказпнових гербицидов в тесте Эймса, 5а1гтопе11а 1урп1тиг1ъл с и Сео ¿„елиэдией

Пестициды Концентрация мг /мл Среднее кслстесгр.о колоний реверталтов на чалку

ТА100 ТА1525

-59 +59 -БЭ +25

Прсметрин 50 10 1 0,1 1170178,0 1042152,0 930148,0 280115,0 210115,0 215113,0 180+12,0 1471 8,5 21С Иб,0 295117,0 120111,0 6С± 3,9 5013,0 5213,2 3612*4 2511,6

Семерок 50 10 1 0.1 1462189,0 1423183,0 13901У2.0 345118,0 200113,0 201112,0 1е51 8,0 1411 7.5 252114,0 183113,0 1501 9,0 561 3,0 3611.8 3511,7 4Ы2,8 3011,7

Симетрин 50 10 1 0,1 1316175,0 1292168,0 1210174,0 250113,0 160+11,0 163И0,0 1331 8,3 1101 7,2 230113,0 1801 7,3 С81 5 2 531 2^9 5213,4 5013,3 3812,3 2511,6

Метопротрин 50 10 • 1 0,1 1090169,0 1035167,0 981161,0 221113,0 175112,0 160+12,0 155111,0 13217,8 212112,0 191110,0 921 4,9 521 3,0 4812,8 47 ¡2 7 Г»К+«>' 1 А

С 18898 50 10 1 0.1 1200119,0 804142,0 678143,0 219112,0 14219,3 14019,0 11917,3 9815,5 205112,0 189110,0 901 4,8 561 3,4 4012,7 3912,2 2211,2 2011,0

Игран 50 10 1 0.1 863142,0 791149,0 622144,0 220113,0 13018,0 13518,2 113+7,1 9515,8 144+7,8 12118,1 11016,2 6013,4 4012,6 4И2,5 2711,5 1911,2

Симетон 10 1 0,1 0,05 1667170,0 1702173,0 2530110,0 1795160,0 14218,8 12016,3 9715,6 9015,5 315116,0 303±15,0 340+19,0 332117,0 4913,0 2511,5 2511,2 2611,4

Норатон 10 1 0,1 0,05 1515184,0 1507175,0 1848190,0 1578171,0 13518,5 10418,3 8215.3 8415.4 289114,0 285115,0 300113,0 292114,0 4312,Е ген, 7 2011,£ 2211,2

Илатон 10 1 0.1 0,05 1392168,0 1410175,0 1461173,0 1480170,0 200113,0 167+10,0 185111,0 180111,0 201112,0 1931 9,4 235111,0 221113,0 5213,е 3611,Е 4513,1 4413,С

. Приматол 10 1 0,1 0.05 1400167,0 1395164,0 1410165,0 1462170,0 156110,0 13018,0 9915,8 9515,6 17819,8 17119,0 187111,0 19019,5 4412,5 5012, ( 4612,' 4512, (

Контроль 7343,8 11517,9 18+1,0 2711,1

2 ИУТЛГВПЮСТЬ ТГиХПШОВОХ ПЕСТИЦИДОВ

в тесте ьшкроорглннзт / растения

Первоначально активирующую способность гомогенатов различных растений проверяли на пропааине, Гомсгенаты растений готовили из 5-дневных проростков гороха, пшеницы, кукурузы, ячменя, огурцов и традесканции. В эксперименте были использованы более чувствительные плззмидные штаммы Salmcnella typhimurium ТА 38 и ТА 100.

Наибольшим активирующим эффектом обладали гомогенаты из ячменя, огурцов и традесканции. Гомогенаты из этих растении были использованы для исследования мутагенной активности всех других трназиновых гербицидов. Оказалось, что мутагенная активность соединений, проявивших активность в прямом тесте на бактериях снижалась при использовании гомогенатов растений.

Хлорсодержадие триазинозые гербициды атразин, пропазин, си-мзэин, цианазин и триэтазин не активные при прямой проверке, активировались в мутагены использованными растительными микро-сомальнкми системами (Таблица 2).

Из двух штаммов S.typhimurium наиболее чувствительным оказался штамм ТА 98, коэффициент индукции мутаций при активации пропазина нз штампе ТА 98 - 11, а у штамма ТА 100 - только 3,4. Поэтому в дальнейших экспериментах использовали штамм S. typhímriun ТА 98.

Результаты экспериментов по активации триззиновых гербицидов растениями а условиях in vivo показали тзкже, что только хлорсодержавле триззины способны активироваться до мутагенов.

Как было установлено ранее, введение системы микросомалького окисления млекопитающих может оказывать существенное влияние нз мутагенную активность триззинов, проявивших активность при прямой проверке с индикаторными бактериями. Как правило, микросомы печени приводили к их дезактивации. Поиному микросо-мальная фракция печени действует на активированные растениями промутзгены. Во-первых, снижение мутагенности препаратов незначительна, а активность пролазила в дозе 1 мг/мл,■атрзэина в дозе 10 мг/мл и цизназина в дозе 0,1 мг/мл возрастает (Рисунок 1). ■

В условиях сельскохозяйственной практики триззиновые гербициды* применяются как индивидуально, так и в комбинации. При

Таблица 2

Мутагенная активность триазинов в тесте CV&tca с активацией фракциями S-9 растений in vitro

— |Пести-|циды Г---- Конц Количество колоний р-эвертантов

etiipi ■■ ация| S.typhimurium ТА 68 S.typhimuriun ТА 100

| ячмень огурцы традеск ячмень огурцы традес

|Атра-| айн 10 1 0.1 143±8,3 125111.0 9816,1 10216,0 9115,0 7414.2 11317,3 9716,1 8315,5 370125,0 336119,0 278118,0 342121,0 207120,0 275117,0 327121,■ 310122, 2С0115,

¡Сима-1 ЗИН 10 1 0.1 190112,0 166±9.7 120*7,6 15819,9 13017,5 12617,8 175112,0 9813,0 7614,0 402127,0 337122,0 239118,0 330127,0 359122.0 230119,0 ЗС0122, 353123, 276114,

|Циана- | ЗИН 10 1 0.1 10016,3 85±5,2 5113,2 0015,8 6113,8 4212.3 12917,6 9615.6 6313.7 325119,0 274118,0 219И4.0 282119,0 246116,0 192113,0 354124, 298 И9, 231115,

|Триата | эин 10 1 0.1 12217,1 10317,0 5914,1 11317,2 9716,3 4312,9 151110.0 11617,8 6814,6 350123,0 314118,0 232114,0 300117,0 264114,0 210113,0 375125, 34U20, 254И7,

|Пропа-| айн 10 1 0.1 2ё0117,0 195112,0 13218,1 182111,0 138г9,3 6714,5 223115,0 170111,0 9015,2 390123,0 333122,0 280117,0 141110,0 290119,0 245116,0 375125, 341120, 254117,

|Контроль I-1- 2411,2 2411,3 2411,1 1 11016,2 _____ _ . 11016,9 , ............. 11016,: 1

совместном действии комбинации препаратов дают иные результаты, чем при действии каждого из них в отдельности, мутагенный аффект может увеличиватся или, наоборот, уменьшатся по сравнению с индивидуальными препаратами ( Means, 1988; Kuroda, luklhlko, 1992; Шигаева и др., 1994).

Нами изучены мутагенные эффекты комбинаций двух немутаген-

¡мутагенность растительных метаоолигов триазиновых геронцидов з условиях животной

активации. (Б9 крыс)

1Т7<]т

0,1 I ю

Ктоп;ц>г< яг/ил

1 »0

1300

2 « 5

( 2С0 л

. * «О ■

| 1СО

! »

■Л

в

сямазни

т

0.1 1 10 Каяасятршии »г/ид

СО

№

I»

!*> а

:

I

3 о

шшшия

41 1 в

Кмаеату ат жЫл

<и 1 ю

КмЮТТ)«»!* иг/и.1

Рисунок 1

13-59 Я+39

ных для бактерий препаратов, а также сочетание мутагенных немутагенных соединении. Смеси немутагенных пгепарзтов, вэяти в высоких дозах, оказались мутагенной, их активность была рзв на сумме составляющих их компонентов. В случае же комбинаци пропагин + симазин активность смеси даже превышала суммарны аффект в три раза.

Во всех использованных комбинациях немутагенных препарато о мутагенными число индуцированных ревертантов, как правило превышало суммарный эффект. Немутагенные соединения оказывал комутагенное действие (Таблица 3).

Большинство комбинаций исследуемых препаратов при расти тельной активации не проявили мутагенной активности за исклю чением трех: атраэин+пропззин, атразин+симазин, пропазин+сима вин. Их мутагенная активность после растительной активации го могенатом ячменя возрастает.

3 ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ РАСТЕНИЙ В БШРАНОООРОЩЫ АТРАЭШ1А, ПРОПАЗИНА Н ШШША

К настоящему времени известно, что Сиотрансформация пести цидов в растениях может осуществляться при помощи двух рзань ферментных систем - микросомальными монооксигензгаыи, преиму щественно ферментами цитохрсма Р-450 (Blair et al., 198Z Plewa, Gentile,. 1982) и пероксидазами, осуществляющие 1-электронное окисление (Gentile et al.,1987, Wilder.-,ar.r Nazar, 1982).

Об участии тех или иных ферментов, осуществляющих мутаген • кую активацию пестицидов, можно судить по результатам эксперу ментов, в которых используются ингибиторы, или наоборот, т. ■ дукторы энзимов. Этот подход использовали для выяснения бое можных биохимических особенностей активации промутагенных тр-v азиновых гербицидов атразина, пропазина и симазина.

В качестве ингибитора пероксидаз использовали диэтилдитис карбаыат (ДЭДК), а 1шгибитора цитохромного комплекса - метирг пон, Микросомными индукторами служили - совол, фенобарбитал; •2.,4-дихлоруксусная кислота (2,4-Д). (Plewa et al.-, 1990).

Растворами ДЭДК в концентрации 100, 250 и 500 мМ обрабап вали растения ячменя в течение всего времени их роста. Из оС работаммых проростков готовили микросомадьные супернатанты,

Ыутзгеннал активность kcí--íi:h3i uyrarsHHir' тризг;::го2'« пестицидов с не мутагены-:^::.

i-1-------------------1

| | Среднее количество рсг-ертаптов ::а чагку |

| Концен-1------¡--------1

|трация 1 комбинации пестицидов | препараты по отдельности |

| иг/ид.)—--,-г----,--,------1--1-;-,--1-1

| ' |атразин+1 пропззин | С1шази.ч+1 атразигн1 пропаг::н| скыазин | атразпн | пропазин| симззин | семерон|симетон | I |семерон |+сеыерон|+семерсн|сиыетон |+сиыетон|+симетсн| | I I I I

| 10' |230±10,0|252±14,0|243±11,0|105г5,5 |110±б,3 |118iB,3 |24±1,0 | 19¿1,0 |2б±1,4 |142±8.9|102±4,0| | 1 |152±6,8 |189±8,2 |155+6,4 |132±б,8 |150i5,5 |147±7,8 |17±2,0 | 25±1,3 |2Ш,0 |116±7,Ц 98i3,0| | 0,1 |136¿7,0 Ц41+5.0 |121i6,3 |184±9,5 |194i6,7 |1S9±6,7 |18±1,0 | 26±1,0 |19±2,0 | 60i3,4|105±4,5| |контрольI 27±2,0| 27±2,0 | 2?г2,0 | 27±2,0 | 27±£,0 | 27±2,0 |17±0,9 | 17±0,9 |17¿0,9 | 17±0,9| 17i0,9| i_ '_i_i_i___i_i , , '_i_i-1-1-1_i

со

которых определяли активность персксидззы. ДЭДК в доое 5СО (¿7 почти полностью подавлял персксидзаную активность, поэтому в экспериментах по определения роли пероксидагы в мутагенной активации триаэинов использовали гомогензты растений, обработанные Д5ДК в концентрации 250 иЧ, в которых активность перокси-дазы снижалась на 50-70Х.

Активирующую способность гомогенатов оценивали по уровню мутзгенного эффекта, индуцированного пропазинсм, симазннсм и атразином у индикаторного штамма S.typhimuriur. TAS8. В зкспе-риментах с использованием ДЭДК не наблюдалось статистически значимого снижения регистрируемого эйекта, '.го свидэтедьстзу-ет о несущественной роли пероксидазы в мутагенной активации триазиновых гербицидов.

Другим ферментом, принимаете участие в метаболизме ксенобиотиков в растениях, является цитохром Р-450. Для выявления роли микросомалькых монооксигеназ в мутагенной активации триаэинов проведены три варианта экспериментов. Ео-первых, определяли участие кофакторов в метаболической активации триаэинов, что служит косвенным 'указанием на участие этой системы микре-соыального окисления трансформации триаэинов. Бз-вторых, изучали влияние ингибиторов и индукторсв мокоаксигеназ на активность цитохромов Р-450 в гомогенатах ячменя в условиях in vive и in vitro, В третьих, исследовали влияние индукторов и ингибиторов микрссом на трансформацию'прсмутагенов в мутагены.

Для активации триазиков наличие кофакторов в активирувще? смеси является существенным - в этом случае число ревертантсв, ■ индуцированных пропазинсм а 2,1 - 2,5, сшззинсм в 1,9-2,5, атразином в 1,7 - 2,1 раза вше, чем в вариантах с НАС. Елия-ние кофакторов, обеспечивающих более эффективное фуккцисниро-вание системы микрссомального окисления на мутагенную активацию триазиков, косвенно указывает на участие этой системы в ш трансформации в мутагены.

Для подтверждения этого предположения провели эксперимент с индукторами и ингибиторами микросомальных монооксигеназ. Е качестве маркерной реакции на активность цитохрома Р-450 у •растений использовали реакцию гидроксилирования коричной кислоты, которую измеряли по изменению интенсивности скраски.

Метирапон, являясь эффективным ингибитором растительных ци-тохромоа Р-450, в доев Е5мМ на 407. и доее БОмМ, на 70X снижал

уровень активности цитохромов в гомогенатах растений. Из индукторов цитохрома Р-450 наиболее эффективное действие оказывал 2,4Д, коэффициент индукции в дозе 200 мМ составлял 3,2.

Из обработанных индукторам и ингибиторами (метирапон -50мМ, совод - 100 мМ, фенобарбитал, 2,4Д - 200 иЧ) гомогенатов растении готовили микросомальные супернатанты с целью выявления их роли в активации триазинов. Метирапон почти полностью подавлял активацию атрззина, симазина и пропазина. Наблюдалось снижение мутагенной активности пропазина в 5-Б,б, симазина в 6-7, атразина в 4-0 раза по сравнению о контролем. Увелз'чение микросомальной алгивности растительных гомогенатов приводило соответственно к возрастанию мутагенного аффекта всех трех препаратов. Наиболее эффективным микроссмальным индуктором окззался 2,4Д, мутагенная активность пропазина - активированного гомогенатом, индуцированным 2,4Д в 4,4, атразина в 4, симазина в 4,1 раза превосходила таковую без индукции (Рисунок 2).

4 ИЗУЧЕНИЕ УПАГЕШЮГО ДЕЙСТВИЯ ТРНАЭН110ВЫХ ГЕРБИЦИДОВ ИЛ СЕМЕНА ЯЧМЕНЯ

Обработка семян ячменя триаэиновыми гербицидами индуцировала аберрации хромосом с частотой, достоверно превышающей естественный уровень мутирования.

Сравнительный анализ общей частоты метафаз со структурными нарушениями хромосом, индуцированными триазиновыми гербицидами, пскззал, что из трех изучаемых препаратов наибольшей мутагенной активностью обладает пропазин (14,4?%±1,612), наименьшей - атразия (10,58Ш,29*).

Анализ спектра аберраций хромосом показал, что изучаемые триазиновые гербициды индуцируют все типы нарушений: хромосомные, хроматидные, изолокусные разрывы н микрсфрагменты (таблица 4).

В результате обработки семян ячменя триазиновыми гербицидами во всех вариантах опыта появлялись хромосомные перестройки, которые отсутствовали в контрольном варианте. Пропазин индуцировал структурные нарушения хромосом о частотой 1,05£±0,47Х, которые были представлены дицентриками и центрическим кольцом (Рисунок_3, 4). Статистически значимое увеличение выхода

Модификация мутагенных эффектов проназина, атразина и симазина под действием индукторов и ингибиторов растительной активации

пролазим отразим скчлнм

Препараты в концентрации 10 иг/нл

□ Контроль е.+БЭ вСобол пФе>абар(х7ггл :::2,4-Д оМегиргпсн пДЭДК

Рисунок 2

Таблица 4

Спектр структурных нарушений хромосом индуцированных в семзнах ячменя тркззкновыми гербицид:^.

-г

| |Кол|Все-

I Вариант ¡-во|го |обработ-|ме-|пере | ки | та-1 стро | |фаз|ек

I II

I I I

В тем числе

-!-г

Хромосомные | хрематидные I

чио| на 100 |чис| на 100 ло | иетафаз |ло | иетафаз

изолокусные разрывы

микрофрагменты

-!-(-1--

чис[ на 100 |чис| на 100 ло | иетафаз |ло | иетафаз

(Контроль|410| 13 |Пропазин|477| 69 |Атразин |56?| 60 |Симазин | -460 { 54

- | - | 2|0,49±0,34

5 |1,05±0,47| 21|4,40±0,94

1 |0,18±0,1?| 17|3,00±0,72

3 |0,65±0,37| 15|3,26±0.83

4|0,98Ш,49| 7|1,71±0,64

34|7,1341,18| 9|1,89±0,62

19|3,35±0,76| 23|4,05Ю,83

29|В,3011,13| 7|1,53±0,57

_I_г, ,".. 1_

Метафазные пластинки ячменя в норме (?.п - 14) х 200

Рисунок 3

Структурные изменения хромосом. Центрическое ксш>цо х L"CO

Хрсклгкднзя ¡хкцевяя деления

X 200

ÍLJT

I

«

Рисунок 5

аберрантных клеток происходило главным образом за счет перестроек хроыатидного типа, составивших 4,4010,94 на 100 метафаз, в контроле этот показатель был равен 0,9410,34 и изолокусных разрывов в опытном варианте 7,1311,18, в контроле 0,9810,49.

В случае атразина из 60 индуцированных структурных нарушении хромосом лишь 1 была зафиксирована как хромосомного типа, что составило 0,1810,17 на 100 метафаз. Доля нарушений хрома-тидного типа (Рисунок 5) и изолокусных разрывов примерно была равной. С наибольшей частотой, равной 4,0510,83 на 100 мета-фаз, появлялись микрсфрагменты (Рисунок 6).

Обработка семян ячменя раствором симазина также индуцировала все Т1шы аберраций хромосом. Увеличение уровня аберрантных клеток происходило главным образом га счет изолокусных разрывов и хроматидных концевых делецки, которые соответственно составили 6,ЗОН,13 и 3,26Ю,83 на 100 метафаз.

Структурные нарушения хромосом.

Микрофрагменты х 200

Рисунок в

выводи

1. Выявлена зависимость прямого мутагенного эффекта триа-зккоЕих соединений от их химической структуры.. Хлор- и ази-дссодержащие соединения не вызывали мутации у штаммов Ба1тспе11а 1урМшиг1ит. Все метилпроизводные оказались мутагенными. Замена метилтиогруппы на метоксигруплу усиливала мутагенность соединений.

2. Пропазин, атразин, симззин, цианазин и триэтазин являются растительными промутагенами,проявляющими мутагенные свойства только в присутствии растительных ферментов. Наибольшим активирующим эффектом обладали гомогенаты ячменя и традесканции. Выявлена относительная специфичность их действия: гомогенат ячменя лучше активирует пропазин, атразин и симаэин, гомогенат традесканции - цианазин и триэтазин.

3. Ингибитор пероксидагы ДЭДК не влияет или слабо влияет на мутагенную активность тризэинов, т.е. пероксидагы не играют существенной роли в биотрансформации промутагенных три-азинов.

4. В биотрансформации промутагенов в мутагены участвуют микросомальные монооксигенззн.

5. Тризашювые гербициды прспзэин, атразин и симазин в концентрации 1 мг/мл индуцировали в клетках корневой зародышевой меристемы ячменя структурные перестрой™ хромосом с чзстсгой, достоверно превышающей спонтанный уровень мутирования .

6. Спектр структурных нарушений хромосом, индуцированных пропазинсм, атрззином и симазином, был представлен всеми типами перестроек.

?. Установлена комбинационная и дозсвая зависимость мутагенного эффекта триазиновых гербицидов при использовании высоких концентраций смесей атразин + семерон, пропазин + семерок, симазин + семерон, атразин + симаэин, атразин + пропазин, пропазин + мезурон, симазин + мезурон, симазин + пропазин и низких концентраций смесей пропазин + симетон атра-зин+симетон и симазин + симетон.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Камешева Г.К., Бозшатаева Г.Т., Салихова Ж.А., Мухитдинс A.C. Исследование мутагенной активности пестицидов в мш робных тест-системах // Вестник КазГУ. Сер. биол. -1РЭ1 -3. С.45-50

Z. Бозшатаева Г.Т. Симм-триазинд1 гербицидтер жене олардыц м} тагенд! белсенд1л1г1н Эймс тест!нде зерттеу // Жарш, 1997. - 2. Б. Б7-63.

3. Бозшатаева Г.Т., Салихова Я.А., Шигаеаа М.Х. Кейб1р песп цидтерд!ц генотоксикологиялык касиеттер1н Salmonei; typhimurium индикаторлыц штаммдарында зерттеу // i'-aptm -1997. -4. Б.42-51.

4. Бозшатаева Г.Т., Камешева Г.К. Скрининг симтриазиновых rej Сицидов в тесте Salmonella / растения // Поиск. -1997. -< С.35-37.

Б. Бозшатаева Г.Т., Савицкая И.С., Мухитдинов A.C. Исполъзов; ние теста растения / микроорганизмы для определения генет] ческой активности триазиновых гербицидов / I съезд микроб! ологов Узбекистана: Тезисы докл. -Ташкент, 1997. -С.117.

6. Бозшатаева Г.Т., Савицкая И.С., Мухитдинов A.C., Шигае М.Х. Метаболическая активация триазиновых гербицидов гомс генатами растении // Вестник КазГУ. Сер.биол. -19Q8.

С.78-81.

7. Бозшатаева Г.Т., Колуыбаева С.Я., Шигаева М.Х. Мутагенн: действие триазиновых гербицидов на семена ячменя.- Алма: // Деп.в КазГосИНТИ 8116-Ка 98. 1

Боашатаева Гулшат Тугелбайкызы Триааин кагарыиыц гербицидтер!н1ц мутагеид! ©сер!

Биология гылымдарьшыч кандидаты гылыми дережес! уш1н коргай-тьш диссертация 03.00.15- генетика

ТИШРШ

Кураыында ер турл! функционалдык топтары бар триазин татарина жататын гербицидтерд1к мутагенд1 жене вдтогенетикалыц всер1 оерттедд!. Генд1к мутациялар 5а1топе11а £урМ1Шг1ит ин-дикаторлын штаммдар тобында аныкталды.

Икелей тексеруде триааиндерд1ц метнлтуындылары мутагенд! белсевд!л1к керсетт!. Суткорект1лерд1ц Оауырьшан алкнган мик-росомалыц фракция олардыц мутагенд1 белсендШг1н темендетед!.

Зерттелген пестицидтерд1ч доспалары аддитивт! аффект кер-сетт1.

Триазинн1ц хлортуындылары ес1мд1ктерден дайывдалган микро-сомалдык активтенд!руш1 коспалардыц всер1нен мутагенд1 касиет-ке ие болады.

9с1мд1ктерд1ц фермеитт!к куйелер!н1ц промутагенд! препарат-тар пропазин, атразин жене сиыааинн1ц биотрансформациясындагы рел1н зерттеу, олардыц ыутатендерге трансформациям микросо-малдш^ монооксигеназалардыц кеыег1мен жузеге асырылатынын кер-сетт!.

Арпа дендер1н зерттел1п отырган препараттармен евдеу, таби-ги мутация децгей!мен салыстырганда, хромосомалык аберрациялар санын арттырады. Хромосомалыц аберрациялар спектр1н зерттеу триааинд! гербичидтерд1н барлык за!<^л(дану турлер1н тугызатынын керсетт1: хромосомалык,' хроматидт1к, изолокустьи^ уз!лулер жене микрофрагменттер.

Bozchataeva Quichat. T.

Mutagenic effects of triasin row herbicides

Thesis for the Degree of the Candidate of Biological

Sciences 03.00.15- genetics

SUWAIW

Mutagenic and cytogenetic effects of triasin row herbicides which contain different functional groups were studied. Gene mutation on Indicator strains of Salmonella typhlmurlun »ere registered.

The metylderivative triasin revealed mutagenic activity on the Salmonella typhlmiirlum.The introducing the microsomal fraction of rat's liver disactivates them.

Mixtures of pesticides display additive effect. Triasin chlorderlvative are transformated into mutagen of the plant organism. The study of plant enzyme system role in biotransformation of promutagen equipment propasln, atrasin and symasin shewed that their transformation in mutagen is realised by microsomal moncoxygenases.

The treatment by examined preparations of barley seeds Induced chromosome aberrations with frequency trustworthy exceeding its natural degree of mutation.

The analysis of aberration chromosome spectrum showed that studied triasin herbicides induct all the types of breaches (chromosome, chromatid isolocus tesrings and microfragments).