Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутагенное действие трития, инкорпорированного в ДНК фага лямбда

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Мутагенное действие трития, инкорпорированного в ДНК фага лямбда"

министерство здравоохранения и медицинской промышленности россии

Митральный научно- исследовательский

2 7 .,р^1тгено-радиологический институт

. На правах рукописи удк 577. 346: 677. 217

Коневега Леонид Владимирович

МУТАГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ ТРИТИЯ, ИНКОРПОРИРОВАННОГО' в днк

ФАГА ЛЯМБДА.

03.00.01. - Радиобиология.

А В Т О Р Е Ф ЕР А Т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им.Б.П.Константинова Российской АН.

Научный руководитель: доктор биологических наук В. Л КАЛИНИН.

официальные оппоненты:

доктор биологических наук И.И.ПЕЛЕВИНА, кандидат биологических наук В. Н.ШЕЛЕГ'ЕДИН.

Ведущее учреждение: ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РАН.

Защита диссертации состоится 1994 г. '

в|'2_часоЕ на заседании специализированного'Совета Д П74.23.01 поп Центральном научно-исследовательском реатгено-радиологи-ческом институте ИЗ и МП РОССИИ, по адресу: ] 88646. С.-Петербург, ПесочньШ-2, ул. Ленинградская, д.,70/4.

С диссертацией можно ознакомиться в бислиотеке института.

МКНД... К' г.

Ученый секретарь ' /

специализированного совета.

доктор медицинских наук Л. И.'Корытова

Автореферат разослан .1..'

Актуальность темы. Серьезной проблемой XX века стало обогащение среды обитания человека радионуклидами. Их усиленная генерация связана,в первую очередь,с интенсивным развитием поенных и энергетических' программ.В широком спектре радиоактивных изотопов,каждый из которых представляет определенную биологическую опасность, особое место принадлежит тритию(3II).Этот долгоживущий радиоактивный изотоп водорода может легко заменять свой более легкий аналог в биополимерах, в том числе в ДНК.Известно, что составляющие моле кулу ДНК нуклеотиды обладают определенным набором так называемых трудно обмениваемых(ТО) положений, включившись в которые однажды, тритий может находиться в них достаточно долго. Распад 3П ь структуре ДНК представляет особую биологическую опасность. Изучению мутагенных последствий распада ЭН,инкорпорированного п ТО-положь-ния ДНК, посвящена представляемая работа.Имеющиеся литературные данные по затронутому вопросу крайне ограничены и в некоторой своей части противоречивы. Кроме того, в исследованиях, проводившихся на уровне клеток бактерий.дрожжей и млекопитающих.достаточно затруднительно было решить вопрос о возможной роли индуциОельных систем клетки в ответе на распад инкорпорированного 3Н .Поэтому нами в качестве экспериментального объекта избран внеклеточный фаг лямбда. Используя его термочувствительный мутант X, , 85 UkT, можно уверенно регистрировать и изучать индукцию прямых с-мутаций, приводящих к образованию прозрачных негативных колоний на фоне множества мутных. К важным достоинствам избранной экспериментальной системы можно отнести:1)мишенью является сама ДНК. в которой происходит изучаемый распад 3Н. чего нельзя достичь в клеточных системах, где для большинства ТО-положений 3Н метку в ДНК молтю включить только параллельно с РНК.Этим закладывается неопределенность в установлении однозначного соответствия между распадом3Н и мутагенным эффектом; 2)регистрируется широкий спектр индуцированных мутаций, включая замены пар нуклеотидов,мутации сдвига рамки, де-мции и вставки; 3) имеется возможность изучать раздельно мутагенные последствия в условиях функционирования SOS-ciictomu рогл рации и без нее; 4)доступны мутанты по репаративным Функциям кле ток-хозяев и самого фага.Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ПИЯФ км.Б.II. Константином РАН. (lio мер гос. регистрации АЛОЭ. 1503. )

Основные задачи___исследования. Главна» экспериментальная задача

состояла в: i)получении сопоставимых данных о мутагенном действии трития,инкорпорированного в разные ТО-положения ДНК фага Х;2)выя~ влении вклада SOS-системы репарации в мутагенные эффекты 3Н. инкорпорированного в ДНК; 3) сопоставлении мутагенных эффектов 3Н, инкорпорированного в ДНК. с эффектами внешнего облучения ß-части-цами 3Н 0 и Y-квантами 60Со.

Научная нопязна результатов.В работе впервые обнаружен и изучен мутагенез на двунитевом Фаге от инкорпорированного 3Н. Впервые изучен вклад' SOS-системы в мутагенез, индуцированный распадом3^ Впервые измерены летальный и мутагенный эффекты 3Н,инкорпорированного в ?.'-положение дезоксирибозы. Впервые при изучении мутагенных эффектов,индуцированных распадом3Н в фаговой ДНК, использованы клетки Б. col i с репаративными дефектами (rec/Г и ung"). Практическое значение работы. Полученные результаты создают расширенную базу данных по мутагенному действию инкорпорированного трития и могут использоваться при соадании систем дифференциальной биологической дозиметрии повреждений ДНК. Представленные данные указывают на повышенную мутагенную опасность сочетанного действия инкорпорированного трития с УФ-облуч'эиием либ > другими индукторами SOS-подобного эффекта. Рекомендуется при соадании ДНК-аондо» вводить тритневую метку в положение 2' девокеирибозы с целью увеличения стабильности препаратов.

Агцюбаппн работы.Материалы диссертации были доаожены на 1-ом Всесоюзном Биофизическом съезде,Москва, 1982. и на 1-ом Радиобиологическом съезде, Москва, 1989.

Объем работ».__Диссертация состоит из введения; 4-х глав:обзор литературы. материалы и методики,экспериментальные результаты, обсуждение результатов: заключения, и выводов. Материал изложен на 120 страницах машинописного текста, включая 28 рисунков и И таблиц. Список цитированной литературы содержит 121 наименование.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Фаги и бактерии. В работе,использован фаг )v- белок-репрессор кморого не активен при повышенной (42°С) температуре, а также Xr е , имеющий дополнительно дефект в Red-системе фаговой рекомбинации.Для получения ,5Н-меченного Фага Х'3Н-Х) использовали термоинп'шкга (-12° С, 17 мин"! лизегетшх гг: X ,,,, бактерий Е. coll.

1 с I 6 / 1

имеющих ауксотрофность по одному из 3 -х маркеров: thy; руг; pur. Для титрования Фагов использовали бульонные культуры E.ooll как дико го типа, так и о дефектами в системах репарации: гесА, nvbi: shcB, ung.

Питательные среды и 3н-соединения. Выращивание бакгс-рий и титрование Фагов проводили в средах на основе аминопептида.Для 'получения 3Н-Х использовали синтетическую среду PLM, в которую в 'зависимос ти от конкретной цели вносили один из меченых предшестеешшкой: 5 -3 H-тимидин\5-3Н-Т) ; б-3Н-тимидин (б-3Н-Т) ; 5-3Н-уридин (5-3Н-У) или 6-3Н-урпдин(б~3Н-У).которые при внутриклеточном развитии Фага инкорпорировались в его ДНК,соответственно.в виде 5~3Н-цитоаина(5 -3Н-Ц) или 6-3Н-цитозина(6-3Н-Ц);8-3Н-аденозин,который метил остатки обоих пуринов [8-3Н-А (Г) ] ; (2'-3Н)дезокситимидин [ (2' --3Н) дт] и ( 2 ' -3Ш дезоксиаденозин[ (2 ' -3Н) дА].

Измерение удельной радиоактивности 3Н-Х.Для прецизионных пзмере ■ ний удельной (в расчете на одну фаговую частицу) радиоактивности лизат 3Н-Х обрабатывали ДНКазой и после однократного осаждения с ПЭГ-6000 подвергали дополнительной очистке: 1)хроматографией па Sepharose 2В или 2)центрифугированием в градиенте плотности С s СМ. После подходящего разбавления аликвоты с точным значением концентрации 3Н~Х вносили во флаконы с жидким сцинтиллятором и просчитывали на счетчике "Beckman" mod.LS5801. Измерение выживаемости.частоты с-мутантов и коэф. летальности (а ). Регистрацию инфекционных центров,образуемых фагом аН-Х при заражении соответствующих штаммов Е.coli,проводили на питательном агаре стандартным двухслойным методом.Выживаемость(S) фага получали как отношение S=n/n ,где по титр 3Н-Х в начальный день эксперимента, а n-титр в соответствующий день от начала эксперимента.Титр фагов измеряли после 16 часов инкубации при 37°С,а число с-мутантов(n î, образующих при 32°С прозрачные негативные колонии, через 24-30 ч. Относительную частоту рассчитывали как отношение n /п.Коэффициент детальности а, который характеризует- вероятность инактивации фа га vi' одного распада 3К, связан простым соотношением с д ia«l/fl ) i вычисляется п? параметров кривых инактивации Фага. Д здесь км* • .т размерность числа распадов.

эксперимент проводились ь 3-х 1 I4U1ÍV !!0¡:¡ líp-'iX. AO'iWi.iyW иШ'Оку О 1 ;ПОПТ< ЛЬПОЦ ЧаСЧОТЫ МУ7!|Ц

тип (А ) рассчитывали по Формуле Пуассона: ЛЧ р и ):».

м

Лозовые зависимости выживаемости и мутагенеза хороши аппроксимировались уравнением прямой линии (у- а Ьх ).Эффективности инактивации (а) и мутагенеза (Б ) вычисляли, используя угловые коэффициенты соответствующих прямых. С целью получения тртотров (а) и (Ь) и их дисперсий данные экспериментов обрабатывали стандарт-ним методом наименьших квадратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Все опыты £ю изучению мутагенного действия Зц, ннкирнорирован. .чого в, каждое из 7-ми изученных -ТО- положений на ДНК фага К, Они» проведены в однотипных условиях и по единому план\.3Н-\ фаг поел; концентрирования и соответствующей очистки при тигре « Ю1Г: фаговых частиц(фч)/мл помещался в экспозиционную среду ОС: буф .ф ТМ. дополненный 4Х-ним питательным бульоном в качс. тле перемотчик: свободных радикалов) и хранился в- герметично закрытой пробирке 1 холодильнике (45° С). Из этой фаговой суспензии отбирали, в мал!« иориии для измерения титра, относительной частот« с-мутантов I удельной радиоактивности в день начала эксперимента и далее дд: текущих измерений.Для оценки мутагенного эффекта использовали величину мутагенной эффективности (Е ), которая рассчитывалась ка> угла наклона прямой, выражающей зависимость гг/п от шсда распадов в геноме. Летальность оценивали по параметру а.

(5-метпл)3 Н-тимидин. Под действием распада 3Н в 5-ом положенш остатков тимина происходит инактивация 3¡1-Х фага, которая следуе' экспоненциальной кинетике.Зависимость от среднего числа N ра; спадов на фаговый геном (Н=М* ■ I; К* --уд. 3Н-активность в расп/сут-кп-геном, Ь--время экспозиции, сут.), измеренная в трех и более независимых экспериментах, описывается прямой линией (рис.1,пряма; 1).Угловой коэффициент(Ь) прямой )§5=ИМ>, рассчитанный по метод: наименьших квадратов, использован для вычисления параметра « п< Формуле а^.З-Ь. В случае инактивации под действием 5-3И-Т полу ч'-но значение а=0.14. Надо отметить, что 3 ) время эксперимента .! контрольном (немеченом) препарате Фага не .зарегистрировано ника-коп инактивациифис.1,прямая 2).

Распад ¡:|'|я>рпорироканного 5-3Н-Т сопроь.->.;!..^¡зтея значительны: ун-чпчечзг-м зз'.-тчаь с мутации ,'рие. 1, и;-лг. 3). п /п нарастает :

Рис.1.Летальное (1,2) и мутагенное (3,4) действие распада трития, инкорпорированного в ДНК фага лямбда в виде 5-3Н-тимидина. (1)- меченный 5-3Н-Т и (2)- немеченый фаг на газоне штамма АВ1157.

на клетках штамма АВ1157 без предварительного УФ-облучения и (4.1- предварительно облученных УФ-светом (80 Дж/м2). По оси абсплсс - число распадов 3Н на геном. По оси ординат: lgS-(левая шкала); (пм/п)-103 - правая шкала.

первом приближении пропорционально числу распадов на геном и при выживаемости S_10"5 достигает значения 4-10"3,что на два порядка больше величины спонтанного фона с-мутантов в немеченых препаратах фага X В57 (_5'10"5). Источником мутаций, по-видимому, является ошибочное спаривание в процессе репликации ДНК с продуктом трансмугацш в сайте распада.Таким продуктом, как установлено в опытах in vivo и In vitro, является 5-гидроксиметилурацил(5ТМУ), который образуется In sit,и в ДНК при распаде 3Н в метальной группе тимина, а также при облучении растворов ДНК ионизирующей радиацией. Проявлению мутагенного действия 5-3Н-Т на фаг X способствует еще тот факт,что для эффективной репарации образующегося в ДНК 5-ГМУ в клетках E.culi не существует 5-ГМУ-ДНК-гликозилазы,хотя в клетках других организмов этот фермент существует и эффективно работает.В пользу преимущественно решшкативного характера фиксации мутаций в рассмотренном случае говорит независимость выхода с-мутаций от функции гесА клеток хозяина: • на штамме АВ2463 гесА" выход с-мутантов такой же,как на диком типе. ■

При заражении Фагом,меченным 5-3Н-Т.клеток E.coll АВ1157,предварительно облученных умеренной дозой УФ-света--(80 Дж/м2), обнаружено незначительное увеличение выхода с-мутантов(рис.1,прям.4). Прямая 4, соответствующая W-мутагенезу. проходит несколько выше, однако, после расчета соответствующих Едостоверных различий между ними не установлено(табл.2,п.1) . Отметим, что ранее мутагенез от 5-3Н-Т на двунитевом фаге не изучался, а на огнонитевом -S13 не был зарегистрирован.

i'-Jll--THMiifli!H. Распад трития в 6-ом положении тимина. сопровождается небольшим,но достоверным возрастанием относительной частоты с-мутантов (рис.2,прям.2), которая при выживаемости 3=10"4 достигает величины п /п -1,5-10 "3.Считается,что основным продуктом перестройки молекулы 6-3Н-тимина является 5-метил(:арбитуровая кислота. зтрт продукт относится к производным тимина о насыщенной я.ь-ивпйной связью, которые образуются такте и при радиолизе ДНК •í достаточно высоким выходом.Особенностью структуры этих произ-|-.сЛ1шх является изменение информации гетероиикла и связанное с ¡им паруислше нормальной способности образовывать ¿одородные связи с аденяном.Это,по-ишимому, и приводит к возрастанию сшопк при репликации. надо отмети гь. чг> с-н-ектрпносто иугагкне.м в ¿тих

Рис.2.Летальное (1) и мутагенное (2,3) действие распада трития, инкорпорированного в ДНК фага лямбда в виде б-^Н-тимидина.Индикация на клетках штамма АВ1157:(3)- с индуцированной SOS-сиетемой и (2)-- без индукции. По оси абсцисс- (распады 'ЭН на геном).По оси ординат:lgS-(левая шкала);(nM/n)-103 - правая шкала.

опытах ct.ставила Е = (2, 4±0,3) 10~5 и это на _45% ниже мутагенности, зарегистрированной у фага, меченного ;>-эН-Т. Возможно, это отражает лучшую репарабельность продукта трансмутации 6-3Н-Т. которая может начинаться о удаления измененного основания с помощью ДНК-гликозилазной активности эндонуклеазы 111 E.coll.

При заражении Фагом, меченным 6-3Н-Т, клеток с индуцированной SOS-системой репарации.наблюдалась небольшая стимуляция мутагенеза (рис.2,прям.3).Для рассмотренного случая эффективность W-мута-геноза характеризуется Б =(3, 6±0.6)10""5.а это означает, что около 30% прелмутациойних повреждений служат субстратами дпя S0S-cn<;Te-мы. В частности, таковыми могут быть AP-сайты, образующиеся в Фаговой ДНК после удаления поврежденного основания эпдонуклеазоПШ.

Таким образом, на нашей модели для распада3Н в 5-ом и 6-ом положениях тимина-пиримидинового основания,строго специфичного для ДНК. показано: 1(наличие * мутагенных эффектов,которые с достоверностью различаются между собой: 2)уровни W-мутагенеза для этих положений достоверно не различаются.Существенно ¿ругой характер мутагенеза обнаружен нами при изучении распада ''Н в 5-ом и 6-ом положениях другого пиримидинового основания - цитозина, 5~3Н-иитозин.Распад инкорпорированного 5-3Н-цитозина сопровождается резким увеличением частоты с-мутаций, которая нарастает пропорционально числу распадов на геном(Н) и при выживаемости фага S« 10"5 (80 расп/геном) достигает 6% (рис. 3. прям. 1) . что на 3 порядка величины больше спонтанного фена с-мутаций в немеченых препаратах фага(~5-10*5).Е Для 5-3Н-Ц на клетках E.coll дикого типа составляет (6, 5± 0. 6) 10"4, т. е. почти в 15 раз выше 'Е для 5-3Н-Т (рис.3.прям.2).Далее мы проверили для двух значений N (30 и 45 расп/геном) уровень мутагенеза на клетках E.ecli гесА. дефектных по репарации.и он оказался не ниже(рис. 3. треугольи. символы),чем на клетках с нормальным репаративным генотипом. Независимость Фиксации мутации от RecA функции указывает на г ущественно рвплпка-тивный характер мутагенеза.в основе котор ого, по-видимому,лежит ошибочное спаривание с продуктом перестройки 5-лН-1! в сайте распада. По литературным схемам конечным продуктом перестройки молекулы 5~3Н-Ц вследствие трансмутация3Н является урапи.п. '-бразутеийся как продукт доминирования пиго;.ина.Мн проварили эта данные, основываясь на юн фагт^. ч': и; и репарации оотаагааз ураиила •: ЛИК !а«?л

чевую роль играет фермент урацил---ДНК-глик.озилзза(УДР). разрезающий М-Г'ликозидную связь между урапнлом и дезоксирибозой, с образованием АР-сайта.Отсутствие в клетках УДГ сопровождается повышен ним уровнем мутаций в случае появления остатков урацила и ДНК. При посеве фага X.инактивированного распадом 5-3Н-Ц на газон Е.еоП чпй" частота с-мутаций не превышает п /п (рис. 3, светл.кружки),измеренную при использовании хозяина ип^ (рис. 3. теми, кружки).

Эти результаты очень полезно сопоставить с нашими данными по индукции е-мутантов в популяции немеченого фага X. обработанного ЗМ раствором бисульфита натрия.Известно, что такая обработка приводит к дезампнированию существенной доли (пропорциональной времени обработки) остатков цитозина и образованию на их месте остатков урацила.Этот процесс сопровождается инактивацией ф.ч. и возрастанием доли с-мутантов.Зэ 8 часов обработки бисульфитом при 37°С титр фага снижается на 2 порядка (Б »10*2) и частота с-мута-ций возрастает до п /п-5-10"3 при посеве на газон клеток (рис. 4. прямая 1).При посеве на газон клеток ипв" имеет место резкое возрастание частоты с-мутаций.которое к восьмому часу обработки достигает _ 2% (рис.4.кривая 2).По нашему мнению,представленная сумма результатов по индукции с-мутаций под действием

5-3Н~Ц и бисульфита на ыпв" и является наиболее прямым доказательством того.что продукт,возникающий в сайте распада 5-3Н-Ц , не соответствует урацилу.

Другой отличительной особенностью мутационного процесса у фага X.меченного 5-3Н-Ц,является его полная независимость от клеточной БОБ-функции.Чтобы оценить роль мутагенного пути БОБ-репарации в индукции с-мутаций у фага X,инактивированного распадом 5-3Н-Ц,фа-, гом заражали клетки ипя* и иг^'.предварительно облученные дозой УФ-света, достаточной для оптимального М-мутагенеза.В обоих случаях индукция БОБ-сисгемы репарации не приводила ни к увеличению выживаемости,ни к стимуляции мутагенеза(таблица 1).Следовательно, эффекты М-реактивации и М-мутагенеза в случае распада 5-3Н-цито-зина отсутствуют.

6-3Н-цитозин.Распад 3Н в 6-ом положении остатков цитозина так же, как и для других уже изученных положений,приводит к инактивации ф. ч.(рис.5. прям.1),которая характеризуется коэффициентом деталь -ности а--- (0. !3±0. 03), что хорошо соответствует измерениям дчя дру

Рис.3. Мутагенное действие распада трития, инкорпорированного в виде б-Зн-цитозина (1) или 5-3Н-тимидина (.2) в Д1!К фага лямбда. Измерения на газонах клеток Е.ео11:(о)-иле';(о)- ипг"; (А)-гесА'\ По оси абсцисс - (распады ^ на.геном).По оси ординат- пы/п(Х).

Рис.4. Зависимость частоты с-мутантов (лм/п) фага А от времени обработки бисульфитом.Измерения на газонах клеток Е.со11:(о)~ иле". По оси абсцисс-время обработки (час). По оси ординат - пм/п (X).

- 14 -

гих положений 3Н в остатках пиримидинов.

Инактивация 3Н-Х Фага сопровождается отчетливо выраженным возрастанием частоты с-мутаций(рис.5. прям. 2). которая при выживаемости S=- 1СГ4 ( 70 расп/геном) достигает ri /п ~4-10"3. При этом Е =(4,4± 0.3)10"5.что почти совпадает с Ем,измеренной нами ранее для 5-31ЬТ. Наиболее вероятным конечным продуктом перестройки молекулы б-3Н--Ц является 6-гидроксицитозин [либо его кето-форма 0-оксоцитозин].Характерным для этих производных цитозина является наличие насыщенной 5.6-двойной связи . что приводит к искажению планарностн гетероцикла и,как следствие, ухудшению нормальной способности образовывать водородные связи с гуанином.По-видимому, этого уже достаточно для возрастания ошибок при репликации.Надо отметить,что регистрируемый уровень Ем~4, 4•10"3 от 6-3Н-Ц может быть результатом уже прошедшей в некотором объеме безошибочной репарации.Начало таковой может давать- удаление модифицированного основания с непланарной структурой ДНК-гликозилазной активностью эпдонуклеазой 111.В результате удаления поврежденных оснований в ДНК образуются АР-сайты.Есть основания полагать,что обнаруженный нами сильный W-мутагенез у фага X .меченного 6-3Н- цитозином (рис. 5. прям. 3), связан как раз с ошибочной репарацией именно АР сайтов. Действительно,в соответствии с"правшюм "А",по которому в условиях SOS-репарации при решшкативном обходе неинструктивных повреждений напротив АР-сайтов с наибольшей вероятностью должен подставляться адениновый нуклеотид. Очевидно.что это в следующем раунде репликации должно приводить к транзициям Ц-->Т.Таким образом, наши данные по мутагенному действию трития в 5-ом и 6-ом положениях цитозина доказывают наличие хорошо различимых " локальных мутагенных эффектов".6-ое положение хорошо различимо в SOS-индуцированных хозяевах,а 5-ое положение даже не требует такой индукции.

Вопрос о наличии "локальных мутагенных эффектов" при распаде 3Н. инкорпорированного в ДНК биологических объектов, был в центре внимания многих исследователей.Суть его состоит в том.что распаду 3Н сопутствуют два основных процесса: 1)вылет (i-частицы, способной осуществпять ионизации на своем пути, т. е. типично радиационный эффект и 2»химическая трансмутация атома трития.который превращается в 3Не и далее 'запускает процесс перестройки органической моле-

Распады ^ на геном.

Рис.5. Летальное (1) и мутагенное (2,3) действия распада трития, инкорпорированного в ДШ фага лямбда в виде б-3Н-цитоэияа. Заражение клеток штамма АБ1157: с индуцированной SOS-системой (3) и 6рз индукции (2).По оси абсцисс- (распады ^ на геном).По оси ординат: lgS - левая шсала ; (пм/п)-103 -правая шкала.

кули. Поэтому регистрируемый в эксперименте мутагенный эффект (К ) складывается из двух составляющих:чисто радиационного (Е „„.„,' и

р а д и а ц

трансмутационного (Етра1)(,мутац) эффектов:

Е =Е +Е

м радиан. транскктаи.

Понятно, что Е >0, т. к. имеет место всегда, а другое слагаемое,

радиан ^

характеризующее степень мутагенности продукта, Етраномггаи Из этого следует, что Е минимальна тогда, когда Е„п<1,......=0. Полу -

И Г р Й I) С и У Г Я ц

ценные нами значения Ем для пяти разных положений Н в азотистых основаниях не позволяют однозначно утверждать,что все они имеют трансмутационную составляющую.Дозовые расчеты из-за их недостаточной точности также мало помогают окончательному решению вопроса. С цель» его прояснения нами впервые использованы при изучении мутагенных последствий распада инкорпорированного 3Ц предшественники, меченные тритием в положении 2' дезоксирибозы.В этом варианте распад 3Н происходит также в ДНК и его радиационная компонента, по-видимому, статистически неразличима от предыдущих вариантов. но трансмутационной перестройке при этом подвергается уже сахарная часть молекулы ДНК.

Инактивация 3Н-Х фага и в этом случае следует экспоненциальной кинетикефис.6.прям.1).Параметр а оказался одним и тем же для фагов, меченных как (2'_3Н)дезоксиаденозином. так и (2'-3Н)дезокси-тимидином.Но для них а =0.07 и это в 2 раза меньше,чем среднее значение а для ТО-положений в пределах остатков азотистых основании в ДНК.Достоверное понижение а при распаде 3Н в дезокснрибозе позволяет считать,что модифицированные основания , возникающие вслед за трансмутацией трития,ответственны примерно за 50% летальных событий. Другие 50%. по-видимому, связаны с радиационной, неспецифической компонентой распада.

Распад 311 в положении 2'вызывает одинаковое и достоверное повышение частоты с-мутаций по сравнению со спонтанным фоном в немеченых препаратах фага. Как для (2' -3Н)дА, так и для ('/ -3Н)дТ:при выживаемости фага Б-Ю"4 <п /п) в необлученных клетках достигает „Ю"3. Е обоих (2 -3Щ-предшественников составляет,соответствен -но, (0. 7± 0.6)-КГ6 и (6.2 ± ±0,8) 10"6 на распад в геноме. Ранее минимальное значение Е было зарегистрировано в опытах с 0-3Н-тими-дином и составило ?.. 4 • 10".8/раси в геноме, что примерно в А раза ый)е. ч».-м при распаде в положении 2 ..'¡то озн:1ч:»чт. что в клетках с

Рис.6.Летальное (1) и мутагенное (2,3,4) действия распада "^Н. инкорпорированного, в положение 2"'дезоксирибоэы ДНК фага лямбда.

1-выживаемость фага Л,меченного(2'-3Н)дА или (2'-3Н)дТ.

2-относительная частота(пм/п) с-мутантов фага, меченного(2'-3Н)дА или (2'-3Н)дТ.Индикация на клетках СБН25 без индукции БОБ-системы репарации.(3)- пм/п для меченного (г'-^ОдА и (4)- для меченного (г'-^ПдТ фага X при заражении УФ-облученных клеток СЗН25.

По оси абсцисс- распады 3Н на геном . По оси ординат:¡^Б- левая шкала ; (пм/п)-103- правая шкала.

неиндуцированной БСЗ-системой все модифицированные'.основания, появляющиеся как продукты молекулярных перестроек, вызванных транс -мутацией 3Н в ТО-положениях азотистых оснований, могут служить предмутационными повреждениями и отвечать за трансмутационную компоненту в суммарной Е . Из сказанного следует, что минимальные значения а и Ем для распада 3Н в положении 2' дезоксирибозы можно рассматривать как базальный уровень генетических эффектов, обусловленный радиационной составляющей распада 3Н в ДНК.

Интересный "эффект положения" был обнаружен в V)--мутагенезе у фагов, меченных (2'-3Н)дезоксинуклеозидами.При заражении клеток с индуцированной 80$-системой Е возрастает в 5,3 раза для (2 •3И)дА и лишь в 1,8 раза для (2*-3Н)дТ, по сравнению с необлученными клетками (рис.6, прям.З и 4). Очевидно, что при распаде трития в положении 2 дезоксирибозы на ДНК появляются повреждения, итог мутагенной 303-репаращш которых зависит от того,с каким основанием ДНК (А или Т.) бил связан остаток (2 -3Н)дезоксирибозы в остове ДНК. Для объяснения этого необычного" эффекта положения" можно предположить,что при распаде 3Н в положении 2' в ДНК локально возникают АР-сайты. Их появление нефер>ментативным путем можно объяснить разрывом гликозидной связи основания с дезоксирибозой при прямом переносе энергии возбуждения от распада3Н или альтернативной схемой окислительной стабилизации первичного продукта распада 3Н в дезоксирибозе. известной по литературным данным.

В соответствии с известным "правилом А" при мутагенной ЗОЗ-репарации АР-сайтов напротив неспариваемого АР-сайта при синтезе ДНК гораздо чаще включается остаток А,чем другие основания.В случае (2'--3Н)дТ образование .АР-сайта вызвано отрывом из ДНК остатка Т. а последующая репарация АР-сайта вызовет подстановку напротив него нормального остатка А, т.е. приведет к восстановлению канонической А:Т пары. Мутация не состоится. В случае(2' -3Н)дА образование АР-сайта вызвано отрывом из ДНК остатка А, а последующая репарация АР-сайта с подстановкой А вызовет появление трансверсии А-Т->Г-А. Именно в рамках такой гипотезы удается удовлетворительно объяснить наблюдаемый эффект. Наши данные по мутагенному действию 3Н в 8-ом положении пуринов (табл.2, п.5) также поддерживают предложенное объяснение.

Таблица 1.Влияние УФ-облучения клеток E.coll (80 Дж/м*-) на мутагенное действие инкорпорированного 5-3Н-цитозина.

Число |Выжи-| Штамм АВ1157 |

распа- Клетки |пае - | --------1 -----1 -------|

дов на |моеть| 1 Г 1

геном. 1Ш I п I 1 пм |пм/п-10э| „ 1. _ 1

Необлученные Г 14 i 535501 312| 5,8*0,31

14,4 УФ-облученные 1 16 | 1 __■ 1. 644001 1 430| 6,6±0,3|

. Необлученные 1 1.6| 158801 342| 22*1 |

¡0,4 УФ-облученные 1 1.9| 350501 806| 23*1 |

Штамм BD10

П | Г1М |ПМ/П-103

________I.... I ..

595001 26?| 4,5Ю,3 700001 263| 3,8-10,2

147101 2691 18*1 185001 297| 16J1

Таблица 2.Летальное и мутагенное действие 3Н, инкорпорированного в ДНК фага лямбда.Измерения выполнены на штаммах E.coll о нормальным репаративным генотипом.

Зн - предшест- Мутагенная эффективность(Ем)на: Коэф.летальности

венник. необл. кл. УФ-обл,клетках ( а )

1 , 5- 3Н-тимидин (4,4*0,5)10" 5 (4,?*0,вИ0~5 0,14+ о,оГ

2. 6- эН-тимидин (2,4+0,3)10" -b (3,6+0,6) 10"'5 0,16* 0,02

3. 5- 3Н-цитовин (б,5*0,6) 10" 4 6,1-Ю""4 (") 0,14± 0,04

4. 6- 3Н-цитозин (4,4 ±0,3) 10" b (20i2)10~5 0,13+ 0,03

5. 8- 3Н-аде/гуа (2,9+0,2)10 5 (11*1)10 5 0,14 + 0,01

6. (2 '-эН)дЛ(П (5,7+0,6110 b (3,6±0.4)10"5 0,07* 0,01

(2 •■■3Н)дТ (6,2+0,8)10" Ь (1,1+0,3)Ю"5 0,07 + 0,01

(*)■■ оценка сделана дли двух значений N (расп./геном).

- 20 -В ы води.

1.Распад 3Н,инкорпорированного в ДНК фага л,сопровождается отчетливо выраженным "локальным" мутагенным эффектом."Локальность" относится не только к самому меченому нуклеотиду,но и к положению "^Н в пределах нуклеотида.

2.Наименьшим летальным действием обладает распад 3Н в положении 2'дезоксирибозы (а-0,07).Для всех изученных положений 3Н в пределах азотистых оснований коэффициенты летальности близки по величине (0^*0.14).

3.Наименьшим мутагенным действием обладает распадэН в 2'положении дезоксирибозыСЕм^б-Ю-6). Все измеренные значения Ем различны и по величине связаны между собой следующими соотношениями: (2'-3Н)д? *(2'-эН)дА< 6-3Н-Т *8-эН-Пур< Б-3Н-Т< б-3Н-Ц< 5-3Н-Ц.

4.Установлено в условиях SOS-репарации существенное усиление мутагенеза для 6-3Н-Ц и в-^-АСГ).Усиление отсутствует для любого 3Н-тимидина и это,по-видимому,связано с выполнением "правила А".

5.SOS-зависимый мутагенез отсутствует для 5-3Н-Ц.

6.Продукт,образующийся в ДНК в результате распада трития в 5-3Н-Ц > не соответствует урацилу.

7.Фиксация мутаций .возникающих при распаде 3Н,инкорпорированного в 5-е положение пиримидиновых оснований, не зависит от функций гена гесА и потому носит преимущественно репликативный характер.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО JEME ДИССЕРТАЦИИ.

1.Коневега Л.В..Калинин В.Л.Летальное и мутагенное действие три-тиевой воды и инкорпорированного [3Н-метилЬтимидина на внеклеточный фаг А. -Радиобиология,1984,т.24,5,167-172.

З.Коневега Л.В..Калинин В.Л.Летальное и мутагенное действие инкорпорированного 5-3Н-цитозина на внеклеточный фаг X.-Радиобиология, 1985,т.25,3,319-323.

3.Коневега Л.В..Калинин В.Л: W-мутагенез у фага лямбда,обработанного бисульфитом.-Генетика.1985.т.21,7,1105-1110.

4.Коневега Л.В..Калинин В.Л.Летальное и мутагенное действие инкорпорированных 6-^-пиримидинов на внеклеточный фаг Л. -Радиобиология, 1989 ,т.29,1,17-22.

Б.Коневега Л.В..Калинин В.Л.Мутагенное действие трития, инкорпорированного в ДНК фага лямбда. I ВСЕСОЮЗНЫЙ РАДИОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СЪЕЗД.1989 г.• Тезисы докладов:т.1.стр.111.

6.Коневега Л.В..Калинин В.Л. Летальное и мутагенное действие 3Н, инкорпорированного в_ положение 2' дезоксирибозы в ДНК внеклеточного фага лямбда.-Радиобиология,1992,т.32,2,194-197.

7.Коневега Л.В..Калинин В.Л.- Способ введения трития в ДНК. -Авторское свидетельство об изобретении №1662097 с приоритетом от 27.11.1989 г.

РГП ШШ,зак.264,тирЛОО,уч.-изд.л.1; 19/У-19Э4г. Бесплатно