Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенез в культуре клеток земляники в норме и в условиях солевого стресса.

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Морфогенез в культуре клеток земляники в норме и в условиях солевого стресса."

? : нац1ональна академ!я наук укра1ни

шститут ф1310л0ги рослин i генетики

КОЛЕСН1ЧЕНКО Олена Валеривна

УДК 634.75:518.143.6.1.051

МОРФОГЕНЕЗ У КУЛЫУР1 кштин СУНИЦ1 В НОР1Ш 1 В УМОВАХ СОЛЬОВОГО СТРЕСУ

03.00.12 - с{изтлопя рослин

Автореферат

дисертацн на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчннх наук

Ки!в - 1998

Дисерташею е рукопис

Робота виконана в Нацюнальному аграрному утверситетс

Науковий кершшк - доктор бюлопчних наук, професор Малюта Сташслав Сташславович, 1нститут молекулярноТ бюлогп i генетики Нацюнально1 Академп Наук, завщувач вщдшом молекулярноТ генетики

Офщшт опоненти - доктор бюлопчних наук, старший науковий сшвробпшис Сарнацька Вереса Васшивна, 1нститут ф1зюлоги рослин i генетики HAH Укра'ши, провщний науковий ствробггник

- кандидат бюлопчних наук, Панюта Ольга Олександр1вна, Ки1вський ушверситст iMeHi Тараса Шевченка, асистент

Провщиа установа - 1нститут клшшноТ бюлогц та генетично! шженерн HAH Укра'ши

Захист вщбудеться "-/ О " Q& 1998 р. о 10 годиш на за-сщанш вчено! ради Д 50.09.01. в 1нстшуп ф13Юлоги рослин i генетики HAH Укра'ши за адресою: 252022, м.Кш'в, вул. Василыавська, 31\17.

3 дисерташею можна ознайомитись у б1блютещ 1нституту ф1зюлогц рослин i генетики HAH Укра'ши

Автореферат розюланий " О 2 " О О_ 1998 р.

Вчений секретар спещал!зовано1 вченоТ ради У'7[/'^ ^ ///¿л Труханов В. А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальшсть теми. Одним з найважпшших напрямюв у бюлопчнш наущ е отримання рослин за допомогою методу культури клгган i тканин. Даний метод використовуеться для створення видозмшених форм рослин, оздоровления та клоналъного розмноження нових сорта та посадкового MaTepiany, отримання важливих речов!ш рослинного походження. Прояв морфогенних потенщй клгган при мжроклональному розмноженш сунтц залежить вщ багатьох фактор!п. Визначення цих фактор!в необхщно для з'ясування того, яким чином клшши, тканини та органи взаемодтоть у процеы онтогенезу. Це зумовлюе актуальшсть поглиблених дослшжень npouecis регуляци онтогенезу на тканинному, клггинному, 6ioxiMÎ4HOMy та молекулярному р1внях.

Найбшып ефективним заходом шдукцц р1зних форм морфогенезу е маншулювання i3 складом та концентрациями регулятор1в росту у поживному середовшщ (Murashige, 1974), яга визначають як морфогенш процеси, так i неоргашзовану прол1ферацш культивуемих юптин (Бутенко, 1984). Вщсутшсть комплексу фундаментальних знань про мехашзм шдукцц морфогенезу пщ впливом регулятор1в росту рослин ускладнюе практичне використання данного методу. Не менш важливим напрямком дослщжень у сучаснш ф!зюлоги рослин е вивчення npoiieciB утворення юитинно! стшки та ïï вплив на морфогенш потенци клтш i тканин in vitro. Актуальшсть цих дослщжень пов'язана з тим, що кл'иинна стшка являе собою ушкальну систему рослини, яка визначае форму клтши, захищае ïï вщ впливу зовниинього середовища (Roland, Vian, 1979), забезпечуе зв'язок i3 сусщтми клттами (Кунах, 1979), вцпграе багатогранну роль у процесах життед1яльносп та морфогенезу рослин (Лозовая, Сальников, Юмашев, 1990).

В свою чергу, вмкт i склад гормошв у поживному середовииц та надходження ïx кр1зь клтшну стшку до клггини, пов'язаний i3 синтезом бшку, що передуе морфогенним змшам кл1тюш (Шакирова и др., 1982). Однак, щентифкащя бшав, яга вщповщальш за здатшсть клшш до морфогенезу, е досить складним завданням, ос гальки тканинам притаманний широкий спектр битв. Визначити, який саме бшок вщповщае за певний етап морфогенних перетворень можливо за допомогою штучного введения культур у стресов1 умови (Блехман, 1987). В якосп стресових чинниюв можуть бути використаш селективш поживш середовища i3 пщвшценим bmîctom NaCl (Sinh et

al., 1985). Вивчення морфогенезу клшш in vitro в умовах засоления та визначення солешдукованих та стресових бшыв, надае можливкть отримувати солестшю клшшш клони та рослини. Акутальшсть ще! проблеми зростае з кожним роком, оскшьки на УкраМ, i взагай, на планей невпинно збшьшуеться площа грунтш з пщвищеним bmíctom сол1, яи людина змушена використовувати для вирощування сшьськогосподарсько! продукцц.

Однак, на сьогодшшнш день не ¡снуе едино! точки зору вщносно riepe6iry процеав морфогенезу та цитогенетичних i ф1зюлого-6íoxímí4hhx змш, що його супроводжують, у популяц1ях культивуемих клшш сунищ в норм! та шд час ди стресових факгор1в. Для сунищ тай робота з культурами in vitro практично не проводились.

Все вшценаведене визначило виб^р напрямку даного дослщження. Зв'язок робота з науковими програмами. планами, темами. Дослщження по тем1 дисертаци виконувались згщно програми кафедри ф1зюлоги та бютехнолош в рослинництв1 Нащонального аграрного уш верситету у рамках програми Мшстерства агропромислового комплексу Украши (N Держреестраци 0193U 025343).

Мета i задач! дослщження. Метою напшх дослщжень було визначення цитолопчних, морфолопчних та бюхМчних законом1рностей протЬсання процес1в м1кроклонального розмноження сунищ сорив PycaHiBKa i El Dorado (Fragaria grandiflora Ehrh.) та сорту Мускатна (Fragaria Moschata Duch.) в оптимальних та стресових умовах.

Для досягнення uiei мети були поставлет mam конкретш заедания:

• розробити склад калусогенного поживного середовшца;

• ввести в культуру первинш експлантати та отримати калуси сунищ;

• розробити склад регенерацШних поживних середовшц, визначити морфогенн1 потенци калусних культур та отримати рослини -регенеранти;

• проанал1зувати на цитолопчному píbhí змши у р1зних тишв калусних культур;

• визначити складов! компонента клггинних ctíhok, яга можуть слугувати маркерами морфогенних потенцш калусЬ;

• встановити змши в cneicrpi бшгав у калуЫв з р1зним морфогенним потенщалом в hopmí та в умовах сольового стресу.

Наукова новизна одержаних результата. Вперше для оцшки регенерацшних потенцш калусних культур сунищ був запроваджений комплексний щцхад, що базуеться на встановленш взаемозв'язку м1ж

морфолопчними i цитогенетичними показниками та штенсившстю перебку ф1зюлого - бкшм!чних реакцш та синтезуючих процеав у тканинах.

Встановлено, що процес калусоутворення сунищ залежить вщ вшсту регулятор1в росту та íx стввщношення у поживному середовшщ.

Визначено, що на процеси морфогенезу культур сунищ in vitro впливають природа первинного експлантату та склад поживних середовшц.

Розроблеш поживш середовища для калусоутворення та регенераци рослин сунищ сорпв Русашвка, Мускатна, El Dorado.

Показано, що морфогенш калуси сунищ вщр1зняються вщ неморфогенних за морфолопею, штенсившстю подшу клгаш, особливостями калусогенезу, складом компонента клтшног ctíhkh та кшыасним i ягасним bmíctom легкорозчинних бшав.

Вперше встановлено, що прояв морфогенних потенщй клгаш корелюе з ¡нтенсившстю бюхМчних реакцш та bmíctom фенольних сполук у клггиншй стшщ. Наявшсть ваншну i феруловоТ кислота та пщвищений bmíct уронових кислот у клтшшй стшщ е характерною ознакою калусних культур з високим морфогенним потенщалом.

Вищлено та охарактер1зовано трупу бшав, яю притаманш калусним культурам сунищ з р1зним морфогенним потенщалом.

Визначено, що склад бшав за фракциями у морфогенних калусних культур змшюеться в залежносп вщ штенсивносп до стресового фактору. Встановлено, що Í3 збшыпенням концентрацй NaCl у селекгивних поживних середовищах з 0,05 М до 0,3 М вщбуваеться шпбування бшав, як! притаманш морфогенним калусним культурам та поява нових, стресшдукованих бшав.

Практичне зпаченвя одержат* результата. Визначеш ф1зюлого-6ioxÍMÍ4m показники, яга вщр1зняють калусш культури за здатшстю до морфогенезу, що е основою для вщбору морфогенних калус!в в прочей промислового розмноження рослин in vitro.

Вщселекщйоваш солеспйы юшпнш клони сунищ можуть бути використаш в подальших дослщженнях, як1 спрямоваш на отримання солестшких рослин - регенеранпв.

Отримаш з ашкальних меристем рослини - регенеранти можуть використовуватись як супер-суперелшшй посадковий матер1ал для маточних насаджень.

MaiepianH дисертацц використовуються у загальному Kypci "Ф1зюлопя рослин" та "Бютехнолопя", яи викладаються на кафедр! ф1зюлога та бютехнологц в рослиннищ-bí Нащонального аграрного

ушверситету та стали основою для виконання студентами дипломних po6iT.

Особистий внесок здобувача. Особиста частка дисертанта в отриманн1 наукових результата, яю. опублжоваш у сшвавторств! в наукових статгях, складае 75%. Дисертантом особисто розроблена методика постановки дослшв, идабраний склад калусогенних та регенерацшних поживних середовиш, отримаш рослини-регенеранти, проведен! цитолопчш та ф1зюлого-бюх1м1чш дослщження та складен! висновки до опублшэваних наукових po6iT.

Апробашя результат дисертадП. Матер1али, викладеш у дисертацп, доповадались на наукових конференщях професорсько-викладацького складу та асшранпв Нахцонального аграрного ушверситету (1993-1994 рр.), на м1жнароднш науковш конференци "Генетическая инженерия и биотехнология" (Минск,. 1994 г.), на cyMicHOMy засщанш кафедри ф1зюлош та бютехнолот в рослинницга НАУ та вшдигу молекулярно! генетики 1нституту молекулярно! б1олога i генетики НАН Украши (1997 р.).

ПублжашТ. За матер1алами дисертацп опублжовано 9 po6ÍT (4 -стагп у наукових журналах, 5 - тези конференцш).

Структура та обсяг робота. Робота складаеться Í3 вступу, трьох роздшв, висновыв та списку використаних джерел. Дисерташя викладена на 157 сторшках машинописного тексту, з них 33 сторшки таблиш та рисунки (15 таблиць та 24 рисунки). Список використаних джерел включае 262 найменування.

ОСНОВНИЙ 3MÍCT РОБОТИ

Матер1али i методи дослшжень. Об'вктами наших досладжень були рослини сунищ coptíb Русашвка, El Dorado (Fragaria grandiflora Ehrh.) та Мускатна (Fragaria moschata Duch.).

Процес калусогенезу даних сорта сунищ вивчали при використаню в якостт. первинних експлантаив агакально! меристеми, листюв, черепшв та коршпш. Подготовку рослинного матер1алу проводили за методикою Р.Бутенко (1964). Експлантати висаджували у три вар1анти поживних середовищ, до складу яхих входили макро- i мЬфоелементи за T.Mypacire та Ф.Скугом (1962), вггамши за Ф.Уайтом (1949), гормони у розроблених нами кшькостях та стввщношеннях, сахароза та агар. Використовували пберелову кислоту, шдолшмасляну кислоту, шдолшоцтову кислоту та 6-бензиламшопурин у р1зних стввщношеннях. В процесс дослщжень визначали штенсивтсть калусогенезу, його залежшсть вад генотипу, складу поживних

середовищ та типу первинного експлантату.

МЬсроклональне розмноження сунищ проводили у п'яти BapiaHTax регенерацШних поживних середовищ, яю вщйзнялися Mix собою вмятом макроелеменпв, 6-БАП та NH4NO3.

В npoiieci культивування визначали цитогенетичш BinMiHHocri, що притаманш калусним культурам з pi3HHM морфогенним потенциалом. Калуст тканини ф!ксували темпорально: у день пересаджування, на 1, 3, 5, 10, 12, 15, 17, 21, 24, 26 та 30-у добу культивування. Фарбування тканин та визначення мистичного шдексу проводили за методиками З.Паушево! (1988).

Аналхз складу юитинних стшок проводили на 24 добу культивування за методикою К.Ншиташ та Дж.Масуди (1982). Розподал клггинних стшок за фракщями з вщцленням целюлози, гемгцелюлоз та пектинових речовин виконували за методикою Д.Апдеграффа (1969). Визначення яюсного та кзльюсного складу фракцШ шшсахаришв проводили толушновим методом (Nishitani, Masuda, 1982). Отримаш фракци пектинових речовин, та гемщелюлоз анайзували за вмгстом гексоз, пентоз та уронових кислот. Визначення даних сполук проводили шляхом встановлення ix оптично! пцльносш при 365, 383 та 630 нм (вщповщно для гексоз, пентоз та уронових кислот). Ix вм1ст визначали за кашбрувальними кривими для стандарт1в. Анатаз фенольних сполук кл!тинних стшок проводили шляхом ix окисления сульфатом мщ в лужному середовидп за методом Р.Хартлея (1971). ГИсля заюнчення реакци сумйд шдкислювали до рН=2,5 за допомогою НС1 та екстрагували фенольн1 сполуки етиловим еф1ром. Проби висушували, розчиняли в ацетош та анайзували методом газо-ршинно! хроматографи у склянШ колонц1 з 4 % СЕ52 за допомогою хромосорбу W (100-200 mesh) ("Sigma", США) та хроматографу Хром-5 ("Laboratomi pristroje", Praha).

Визначення вмюту ферулово! кислота проводили спектрофотометричним методом. Попередньо зразки готували за методом М.Вшьямса та А.Емонса (1991). Оптичну пцльшсть визначали скануванням вщ 500 до 670 нм спектрофотометром Hitachi-557. Стандартний спектр поглинання для ферулово! кислота визначали при П концентраци 4,65x10"^ моль/л. JlimiH видшяли за допомогою сумпш 72% H2S04 та 89% Н3РО4 (4:1 за об'емом).

Визначення вмюту быку у калусних культурах р!зного походження (ашкально! меристеми, листав та череипав) проводили за методом OJIoypi i3 сп1вавторами (1951). В отриманих калусах визначали змши у cnerapi легкорозчинних бшюв. Встановлення реакци калусних культур

сунищ на засоления проводили шляхом вирощування морфогенних калус1в у селективних поживних середовищах Í3 додаванням NaCl у концентращях: 0,05М; ОДМ; 0,ЗМ; 0,5М; 0,7М та 1,0М. Визначення молек. мае бтав проводили за допомогою електрофорезу у пол1акриламадному гел1 за методом У.Леммл1 (1970).

Молекулярну масу бшав визначали за допомогою сумиш бшав -стандарта ф1рми "Serva": b - галакгозидази (116кДа); фрукгозо - 6 -фосфаткшази (84кДа); гаруваткшази (58кДа); фумарази (48,5кДа); лактатдегщрогенази (36,5 кДа); трюзофосфа-лзомерази (26,6 кДа). Будували кашбрувальну шкалу залежносп логарифму молекулярно! маси маркерних бшгав вщ 1х електрофоретично! рухливосп (Rf) i за нею характеризували молекулярну масу бьнав калусних культур. Визначення розподшу бшк!в (%) прозодили за допомогою спектрофотометру "Ultroscan" (LKB).

Результата дослщв обробляли математично. Визначали середш значения, стандартш похибки, biporihhi р1знищ середшх значень. Рхзнидю míx показниками вважали достхжрною за KpurepieM Ст'юдента t, використовуючи 5% р1вень значущосп.

РЕЗУЛЬТАТЫ ДОСЛ1ДЖЕНБ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

Удосконалення умов мжроклонального розмноження сунищ. У cboíx дослщженнях ми провели пошук оптимальних умов введения в культуру in vitro сунищ сорта Русан1вка, Мускатна та El. Dorado, отримання калусних культур, рослин-регенеранпв та дорощування Тх до стандартних po3MipiB. Процес введения в культуру in vitro е першим етапом мжроклонального розмноження рсслин. Bíh включае виб1р первинного експлантату, умов його стершшацй та розробку складу поживних середовищ для данного виду та сорту сунищ.

Найкраиц результата стершизащ! первинних експлантата ми отримали при використант розчишв хлорамшу (1:3) та сулеми (0,1 % HgCl2 ). Вихад стерильних експлантата становив вщповщно 94,4+2,4% та 95,5*г2,6%. Слад зауважити, що даш результата не залежали вщ сорту сунищ.

Калусогенез вивчали у трьох вар!антах поживних середовищ, яи водизнялися за складом, bmíctom та концентращею регулятор1в росту. Haйкpaщi результата калусогенезу серед ycix сортов сунищ отримаш нами при використанш поживного середовища, до складу якого входили 1МК, 6-БАП та ГК у конценграц!ях вщповцдао 1,0 мг/л; 0,1 мг/л та 0,1 мг/л. У даному Bapiaini поживного середовища спостеркали бшьш швидкий (на 5-7 дшв раншге) та штенсивний процес

калусоутворення серед ycix дослщжуваних сортт У coptíb PycaHÍBKa та El Dorado максимальну калусогенну актившстъ спостерггали при використанш в якосп первинних екслантатш ашкальних меристем (вщповщно 98,2±1,4% та 97,3±1,6 %). Найвища калусогенна актившсть у сунищ сорту Мускатна вщм1чена при використанш листав та ашкальних меристем (93,0+0,7% та 91,6±0,2%).

У калуив меристематичного походження регенерацШна здатшсть серед ycix дослщжуваних сорта була доспшрно вшцою, шж у калусних культур шитого походження (Р<0,05).

Максимальш результата морфогенезу отримаш нами при використанш регенерацшного поживного середовгаца, до складу якого входили макро- i мжроелементи за T.Mypacire i Ф.Скугом (1962) Í3 додаванням 6-БАП та NH4NO3 у юлькосп вщповщно 0,2 мг/л i 250 мг/л. Пщвтцення вмкту 6-БАЛ (до 0,5 мг/л) та зменшення юлькосп макроелемента у склада морфогенних поживних середовищ призводило до зниження штенсивносп регенеращйних npouecin. Слщ зауважити, що у даному BapiaHTi регенерацшного поживного середовшца спостер1гали часткове вкоршення рослин-регенеранта.

В подальшому ми дослщжували вщмшносп, яи притаманш PL3HHM типам калусних культур на тканинному, клггинному, 6ioxÍMÍ4HOMy та молекулярному ршнях.

Цнтогеиетичний анал1з клпин калусних культур сунищ. Калусш тканини, яга виявилися здатними до морфогенезу, були твердими, бурувато-зеленого кольору, глобулярно! струкгури. Клггини даного типу калусу мали правильну форму та були мщно з'еднаш мгж собою. У таких клггинах спостер1гали невелику вакуоль, щшьну цитоплазму та одне ядро. Даному типу калусу також були притаманш лпшф1коваш та судинш елементи. ГТоды клтгн у цього калусу проходив без явних порушень мгготичного апарату.

У неморфогенних культур спостертали бшьш штенсивне збшьшення калусно! маси. Калус цього типу був пухкий, м'який, свгоюго кольору. При цитолопчних дослщженкях данного калусу ми спостерпали велик}' гетерогеншсть клшш за формою та роз.\прами, кгоши були майже не з'еднаш мок собою i, як правило, на препаратах розташоваш окремо. Зафжсоваш видовжеш пгантсыа юптини з двома та бшыпою кшыастю ядер. Ядра таких кл1тин мали два та бЬтыле ядерець. В цих тканинах виявлена значна юльгасть клши паренхимного типу. Судинш елементи у тканинах даного калусу були вщсутш. У неморфогенних калусних культурах нами зафпссована поява пол1площних та анеуплощних юптин. В nponeci подшу у клггинах цього

типу зростала частка аберантних анафаз. Основним типом порушень в анафаз! було нер1вном1рне розходження хромосом.

Ытенсивтсть подшу клггин у калуав з р1зним морфогенним потенщалом мала як загальш риси, так 1 певш вщмшносп. Вщразу теля пересадки в обох типах калусних культур спостер1гали лаг-фазу (рис.1).

2,5 т

Рис.1 Мгготичний ¡ндекс калусних культур сунищ

....................... неморфогенний калус;

- морфогенний калус.

У першу добу вщбувався подол юптин, яга розпочали цей цикл ще у вихвднШ тканин!. Поим подол практично припинявся ! мгготичний ¡ндекс знижувався майже до нульовог вщмтси. Починаючи з друто! -третьо! доби культивування спостерггали фазу експоненщального росту, яка була притаманна обом типам калусних культур ! харакгеризувалася першим пжом м!тотично! активность В подальшому динамгка розвитку клшшних популяцш двох тигав калуыв сутгево вццмзнялася: морфогенним калусним культурам була притаманна значно нижча м^отична актившсть, нж неморфогенним.

Морфолопчш вщмшносп та р!знищ в штенсивносп подшу клгган у калусгв з р!зним морфогенним потенщалом пов'язаш ¡з

складними ф1зюлого-бюх1м1чними реакц1ями, яга вщбуваються у юитиш (Roland, Vian, 1979). Вщомо, що пщ час подшу юптини, а саме на стада телофази, вщбуваеться формування клггинно! стшки, яка вшграе багатогранну роль у жгатедцяльноеп клггини. Тому, в подалыпих cboïx дослщженннях ми визначали вщмшностс у склавд компонента юитинно! стшки та штенсивноеп ф1зюлого-бюх1м1чних реакцш, що супроводжують процес iï формування у калусних культур з р1зним морфогенним потенщалом.

Впзначення ф!зшлого-б1ох1'м1члнх змм у клшшних сттках калусних культур сунищ з рвнпм морфогенним потенщалом. Нами встановлено, що маса клггинно1 стшки (К. С.) на 24-у добу культивування складае понад 40 % загальног маси клггини незалежно вщ морфогенних потенцш калусу. Bmîct целюлози, а також фракцш нецелюлозних залишюв полюахарщцв матриксу (гемщелюлоз та пектинових речовин), в бшьшосп свош, залежали вщ сорту сунищ, а не вщ морфогенних потенцш калус!в. В подальшому нами були виявлеш достовфш розниц! (Р<0,05) м¡ж р1зними типами KanyciB у BMicri гексоз серед пектинових речовин калус1в сунищ сорту Русашвка та у BMicri пентоз серед гемщелюлоз у сунищ сорту Мускатна (табл. 1).

Таблиця 1

Склад фракцш нецелюлозних полкахарцщв клптагаих стшок у калусних культур сунищ з р1зннм морфогенним потенщалом (% вщ маси фракцн)

Сорт Тип калусу Фракци нецелюлозних noAicaxapudie

гексози пентози 1 уроновг кислоти

пектинов! речовини

Мускатна морфогенний неморфогенний 37,0±7,0 38,5±3,5 30,8±1,2 32,1±1,2 31,9±0,1 29,4±2,4

Русашвка морфогенний неморфогенний 37,2+0,1 40,411,1* 35,9±0,2 41,7+3,7 23,2+1,4 18,2+1,5*

гемщелюлози

Мускатна морфогенний неморфогенний 28,5±0,1 33,8±3,2 52,4±0,9 7,8+1,4* 19,1±1,б 8,4±0,5*

Русашвка морфогенний неморфогенний 33,8±3,0 40,0+3,0 63,5±4,0 58,0±3,0 2,7±0,1 1,3±0,1*

Примака.

* - р1зниия .шж морфогенним та неморфогенним калусами статистично docmoeipHa за критер1ем Cm 'юдента при piem значущост1 Р < 0,05.

У морфогенних калусш, на вшмшу вщ неморфогенних, нами встановлено значне зростання вмету уронових кислот. Таке зростання встановлено у фракщях гемщелюлоз та пентинових речовин. Уронов1 кислота мають високу реакцшну спроможнють, 1м притаманш властивоеп кислот, альдегшв та спирта i тому вони здатш впливати на окислювально-вщновлювальш процеси (Blaschek et al., 1981). Отримаш результата свщчать, що вщмшносп Mix складовими компонентами К. С. у калус1в з р1зним морфогенним потенщалом, в першу чергу, стосуються окислювально-вщновлювальних процеав. До речовин, яю спроможн1 впливати на щ процеси вщносяться фенольш сполуки (Fry, 1988). Подалыш дослщження дозволили виявити значн1 вщмшност1 у склада фенольних продукт1в окисления К. С. у калус1в з pi3HHM морфогенним потенщалом (рис. 2).

10 20 30 40

Час утримування, хв.

Рис. 2 Спектр фенольних продукта окисления юитинних стшок калусних культур сунищ сорту Мускатна СиБ04

I - морфогенна калусна культура;

II - неморфогенна калусна культура.

1, 2, 5, 6, 8, 9 - нещентифковаш цппш, 3 - ваншн, 4 -ацетованшон, 7 - бузковий альдепд.

Значну частку (33,8%) серед фенольних продукта окисления К. С. у морфогенних калусних культур становив вашлш, який у неморфогенних калус!в взагал1 був вщсуттй (табл. 2).

Таблиця 2

Склад фенольних продукта окисления клггшших стшок калусних культур сунищ сорту Мускатна (%)

Тип калусно1 культури Фенольм a/ibdeeidu, № шпилю на хроматограм1

1 о л 3 4 5 6 7 8 9

Морфогенний 1,9 1,7 33,8 15,1 2,7 11,3 17,7 12,6 3,2

Неморфогенний - - - 14,4 43,0 3,6 26,2 9,0 3,6

Примггка.

1,2,5,6,8,9 - не1дентифковам uinwii; 3 - ваншн; 4 - ацетованшон; 7 - бузковий альдег1д.

Анал1з шших фенольних сполук дозволив встановити, що два тили Kaiycis мають серед продукпв окисления К. С. бузковий альдепд. Утворення бузкового альдегщу вщбуваеться в результат окисления синапового спирту, попередником якого е синапова кислота (Маргна, 1986). Вщомо, що синапова кислота може утворюватись тшьки через ферулову кислоту (Gibson, Speirs, 1984). Отримат результата дають шдставу говорити, що в обох типах дослщжуваних калусних культур функщонуе мехашзм утворення ферулово! кислота. Крш того, утворення ферулово! кислоти е одним з eTania бюсинтезу люпну, який вщноситься до трьоххпрних ппол1мер1в фенольноТ природа, що здатш розщеплюватися з утворенням ароматичних алъдегдав (Higuchi, 1985).

3 метою встановлення причин вщсутносп у К. С. неморфогенних калусних культур сунищ ваншну, ми провели визначення змисту личину та екстрахцго фенольних кислот, що пов'язат з гашсахаридами клшпшоТ стгнки. Отриман1 результата свщчать, що у неморфогенних калуав, на вшдпну вщ морфогенних, ферулова кислота в юптиннш стшщ була вщсутня (табл. 3).

Таблиця 3

Вм1ст ли-ншу та ферулово! кислота в клтганих стшках калусних культур сунищ сорту Мускатна (% вщ сухо! маси КС)

Тип калусноi культури Шгнт Ферулова кислота

Морфогенний калус 18,9 ± 0,8 0,170 ±0,009

Неморфогенний калус 21,4 ± 1,8 —

Слад зауважити, що лггнш був присутнш в обох типах калусних культур 1 його вмют достов1рно не вщр1знявся. 1снуе припущення, шо лншфгкащя являе собою спослб детоксикахш фенольних сполук у рослиш, в процеа яко! 1х надлишок шактивуеться у виглящ шертного лшншу (Маргна, 1986).

На нашу думку, вщсутшсть ванЫну у клнинних стшках неморфогенних калусних культур (при наявносп в них лигншу), може свщчити про модифЪсацШш змши у склавд мономер1в линшу, як! виникають внаслщок порушення механ1зму виведення надлиишв ферулово! ккслоти з кштини, де вона синтезуеться, до клгошно! стшки. Вадомо, що м1ж розчинними г пол1мерними формами фенольних сполук та бшковим обмшом кнують збалансоваш сшввщношення. Тому, в подалыпих сво!х дослигженнях ми визначали вм1ст бшав та 1х розподш за молекулярними масами у калуав з р1зним морфогенним потенщалом.

Вплив умов культивування на штенсившсть синтезу та полшептид-ний склад б1див. Нами встаноатено, що у морфогенних калус1в загаль-ний вм1ст легкорозчинних бшав був у 1,6 - 2,1 рази вшций, шж у неморфогенних (табл.4). Як видно з даних табл. 4, бшыя високий вм1ст бшку притаманний морфогенним калусам. Максимальний вмют бшсу спостер!гали у калуйв, що утворилися з ашкально! меристеми. В подальших дослщженнях було встановлено що калусш культури з р1зним морфогенним потенщалом значно вщр1зняються м!ж собою за галыасним та ягасним складом бшав.

Таблиця 4

Вмигг легкороэтинного бшку у морфогенного та неморфогенного калуов разного походження, мг/г евро! маси калусу

Сорт Тип первичного Тип калусу

сунищ екеппантату морфогенний неморфогенний

ашкальна меристема 61,5 ± 1,2 32,8 ±0,7*

Русашвка черешки 54,3 ± 1,1 27,4 ± 1,1*

листки 50,6 ± 0,6 24,3 ± 0,9*

ашкальна меристема 31,8 ±0,5 20,5 ± 0,4*

Мускатна черешки 26,2 ± 0,7 17,6 ± 0,8*

листки 24,6 ± 0,6 16,7 ± 0,7*

Примггка.

* - ршиця м!ж вмктом легкорозчинного быку у морфогенного та неморфогенного калусу статистично достоверна за критергем Ст'юдента при р1вт значущостг Р < 0,05.

Нами визначено, шо у морфогенних качуав основна гальгасть легкорозчинних бшав у сунищ сорту Русангвка (45,7 %) припадае на бшки з низькою молек. масою (до 34,4 кДа). У неморфогенних калуав частка низькомолекулярних бшав була значно меншою I складала 31,1 %. У морфогенних калус1в були виявлет бшки з молек. масою 53,7 кДа; 44,7 кДа та 26,3 кДа, яга. притаманш обом сортам сунищ.

Стад зауважити, шо клшшна стшка е струкгурним утворенням, яке значною м1рою вщповщае за надходження до клгоши КаС1 та визначае солестшгасть рослини. Тому, ми визнали за дошльне встановити змши у росподш бииав за фракщями, яга вадбуваються гад доею р1зних концентращй №С1 у поживному середовидц. Нами визначено, шо морфогенш калусш культури сунищ росли у селекгивних поживних середовищах ¡з вмктом КаС1 до 0,3 М (включно). Серед фракцш легкорозчинних бшав були вщм1чеш змши, яга стають пом1тними вже при кондентраци 0,05 М КаС1. Щд д1ею дано! кондентраци КаС1 спостердали появу електрофоретичних смут бшав з молек. масами 57,5 кДа; 42,7 кДа; 34,7 кДа 1 26,0 кДа та зникнення смут бшгав з молек. масами 33,9 кДа та 26,3 кДа. При збшыденш концентрацп №С1 до 0,1 М спостердали появу фракцй бшку з молек. масою 66,1 кДа, частка якого досягала 15,0 % загалъно! кшькосп бшав. Одночасно спостердали зникнення фракцй бшку з молек. масою 28,2 кДа. Збшыпення концентрацц №С1 до 0,3 М призвело до появи нових смут легкорозчинних бшав тшьки з малими молек. масами: 38,0 кДа; 26,6 кДа та 21,9 кДа. Необхщно вщмтгга, що бшки з молекулярною масою 53,7 кДа та 44,7 кДа спостердали при р1зних концентрац!ях МаС1, що може свщчити про 1х здатнють адаптуватися до дц несприятливого чинника.

висновки

1. Найкрадц результата калусогенезу сунищ отримаш при використанш в якосп первинних експлантатав ашкально! меристеми та листгав.

2. Вмют та сгаввщношення цитокшш!в, ауксишв та пберелшу вшшвають на процеси калусогенезу суншц. Максимальш результата калусогенезу отримаш при використанш 6-БАП в концентрацц ОД мг/л; !МК-1,0 мг/л та ГК - 0,1 мг/л. Найкрадц регенерацШт потенцп дослщжуваних сорив сунищ виявлеш при використанш поживного середовшца, до складу якого входили макро- та м^роелементи за Т. Мурасде та Ф. Скугом (1962), вггамши за Ф. Уайтом (1949), 6-БАП

(0,2 мг/л) та додаткова галыастъ NH4NO3 (250 мг/л).

3. Морфогенш калуси сунищ характеризуються вщносною цитогенетичною стабшьшстю, що проявляеться у вщсутносп хромосомних порушень. Морфогенш калуси вщлзняються вщ неморфогенних морфолопчно (за формою та розм1рами клтш) та вщсутшстю в них KapiojioriHHHX змгн (поль та анеуплоцщ). Даш калуси сунищ представлеш клшшами округло! форми з пцпьною цитоплазмою та мають судинш i лшифисоваш елементи. Морфогенним калусам сунищ, на вщмшу вщ неморфогенних, притаманний менш штенсивний подш клшш.

4. Морфогенш калусш культури сунищ в1др1зняються вщ неморфогенних складом компонентов клшшно! стшки. Пщвшцений BMicr уронових кислот, наявшсть значно! илькосп ваншну та ферулово! кислота у клггинних станках притаманн! морфогенним калусним культурам.

5. Морфогенш потенцц калусних культур сунищ залежать вщ кшькоеп бшав та ix яысного складу. Кшыасть легкорозчинних бшав у морфогенних калусних культур в 1,6 - 2,1 рази вшца, шж у неморфогенних. Спектр легкорозчинних бшав морфогенних калусних культур сутгево вщнзняеться вщ спектру неморфогенних калуыв. Майже половину всього спектру у морфогенних калусних культур складають бшки з низькою молекулярного масою (до 34,4 кДа). У неморфогенних калусга ця частка була значно меншою i складала 31,1% та 33,7% (вщповщно для сорпв Русашвка та Мускатна).

6. Використання селективного поживного середовшца 1з додаванням NaCl призводить до порушень морфогенних потенцш калусних культур сунищ. Результатом да данного стресового чинника е змши у спектр! бшав, яга мають свою специфику i залежать вщ концентрацц NaCl у поживному середовшщ. Пщ доею Nad у концентраций 0,05 М вщбуваеться утворення нових сгресшдукованих бшав як i3 значною (57,5 кДа та 42,7 кДа), так i з малою (34,7 кДа, 34,2 кДа та 26,0 кДа) молек. масою. При концентрацц 0,1 М NaCl утворюеться бшок з молек. масою 66,1 кДа. Збшынення концентрацц NaCl до 0,3 М призводило до появи бшав ткьки з малою молек. масою (38,0 кДа, 26,6 кДа та 21,9 кДа ).

7. Дм NaCl на калусш культури сунищ призводить до зменшення BMicry бшав з молек. масою 53,7 кДа та 44,7 кДа та зникнення фракцй бищу з молек. масою 26,3 кДа, яга характерш морфогенним калусним культурам. В той же час з'являються елегарофоретичш смути бшав, яга притаманш неморфогенним калусним культурам сунищ in

vitro (з молек. масою 34,7 кДа та 34,2 кДа).

8. Морфогенез калусних культур сунищ in vitro е складним процесом, який залежить вщ поеднання цигого комплексу фактор!в. Не Bci кл1тини первинних експлантатав спроможт до прояву своУх регенеращйних потенцш. Неморфогенш калусш культури, на вщмшу вщ морфогенних, мають пщвищену активтсть поди у клшш, \'м притаманш цитогенетичн1 змши та вщмшносп у перебггу ф!зюлого-6ioxiMi4HHx реакщй, i в тому числ1, зниження вмюту легкорозчинних бипав, яке супроводжуеться змшами у ix спектральному складу. Вщсутшсть ваншну та ферулово! кислота у клшшних стшках неморфогенних калуыв сунищ свщчить про модифкащйш змши у cioiaai MOHOMepiB л1ппну. В свою чергу дан1 змши викликають пору-шення механ1чних властивостей клшшних стгнок, що призводить до втрати здатност1 культур до морфогенезу.

СПИСОК О ПУБЛ i КО BAH \ LX ПРАЦЬ:

1. Яблокова Е.В., Киямова Р.Г., Тюленева Н.М., Колесниченко Е.В., Желтоножская JI.B. Состав клеточных стенок каллусных культур земляники с различной способностью к морфогенезу // Биополимеры и клетка. - 1996. - Т.12, N2. - С.56-61.

2. Колесшченко О.В., Малюта С.С., Желтоножська JI.B. Електрофорез водорозчинних бипав калусних культур сунищ в HopMi та при хлоридному засоленн1 // Наук, вюник Нац. аграр. ун-ту. - 1997.

- N2. - С.56-61.

3. Колесшченко О.В., Малюта С.С. Змши компонентного складу легкорозчинних бипав калусних культур сунищ з р1зним морфогенним потенщалом // Биополимеры и клетка. - 1998. - Т. 14, №1 - С.79 - 81.

4. Lozovaya V., GorshKOva Т., Yablokova Е., Zabotina О., Ageeva М., Kolesnichenko Е., Waranyuwat A., Widholm J. Callus cell wall phenolics and plant regeneration ability // J. Plant Physiology. - 1996. -Vol. 148, №6. - P.711-717.

5. Желтоножська JI.B., Колесшченко O.B. Мжроклональне розмноження сунищ сорту Русан1вка // Наук. конф. проф.- викл. складу та асгарантш. - КиТв: НАУ. - 1993. - С.38.

6. Колесшченко О.В. Отримання солестшких клп-инних клон1в сунищ // Наук. конф. проф.- викл. складу та асшрантш. - Киш: НАУ.

- 1994. - С.70.

7. Колесшченко О.В., Киямова Р.Г., Желтоножська JI.B. Бюх1м1чний та цитолопчний анал1з морфогенного та неморфогенного

калусу сунищ // Наук. конф. проф.- викл. складу та acnipamiB. - Кшв: НАУ. - 1994. - С.76.

8. Колесшченко О.В., Желтоножська JI.B. Деяй особливостс мк-роклонального розмноження сунищ сорту Мускатна // Наук, практ. конф. проф. - викл. складу та acnipamiB. - Rhib: НАУ. -1994. - С.74.

9. Колесниченко Е.В., Желтоножская JI.B. Некоторые особенности получения солеустойчивых клонов земляники // Тез. докл. науч. конф.'Тенетическая инженерия и биотехнология". -Минск. - 1994. - С.80.

Колесшченко О.В. Морфогенез у культур! юитин сунищ в норм1 i в умовах сольового стресу. - Рукопис.

Дисертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спещальшстю 03.00.12 - ф^зюлопя рослин. - 1нститут фшологи рослин i генетики HAH Украши, Кшв, 1998.

Дисертацто присвячено питаниям визначення чинниюв, вщповщальних за процес мжроклонального розмноження сунищ в культур1 in vitro. В дисертадц обгрунтоваш гццходи до вибору фiзioлoгo-бioxiмiчниx показниюв, притаманних калусним культурам з pi3hhm морфогенним потенщалом. На ochobi цих показниюв запроваджена методика визначення спроможноеп культур сунищ in vitro до морфогенезу в оптимальних та стресових умовах культивування.

Результата дослщжень використовуються МЬпстерством агропромислового комплексу Украши при розробщ концепцп отримання солест1йких рослин методом культури тканин, а також в учбовому nponeci на кафедр! ф1зюлот та бioтexнoлoш в рослинницта НАУ, при розробщ та викладанш курсу "Ф1з1олопя рослин" та "Бютехнолопя рослин".

Ключов1 слова: суниця, культура юитин, калу с, морфогенез, сольовий стрес.

Колесниченко Е.В. Морфогенез в культуре клеток земляники в норме и в условиях солевого стресса. - Рукопись.

Диссертациия на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Институт физиологии растений и генетики HAH Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена вопросам определения факторов, отвечающих за процесс микроклонального размножения земляники в культуре in vitro. В диссертации обоснованы подходы к выбору

физиолого-биохимических показателей, которые характерны для каллусных культур с различным- морфогенным потенциалом. На основе этих показателей предложена методика определения способности культур земляники in vitro к морфогенезу в оптимальных и стрессовых условиях культивирования.

Результаты исследований используются Министерством агропромышленного комплекса Украины при разработке концепции получения солеустойчивых растений методом культуры тканей, а также в учебном процессе на кафедре физиологии и биотехнологии в растениеводстве НАУ, при разработке и преподавании курсов "Физиология растений" и "Биотехнология растений".

Ключевые слова: земляника, культура клеток, каллус, морфогенез, солевой стресс.

Kolesnichenko O.V. The morphogenesis in the strawberry cells culture under normal and salt stress conditions. - Manuscript.

Thesis for a Ph. D. degree (Biology) by speciality 03.00.12. - Plant physiology. - The Institute of Plant Physiology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

The thesis is devoted to the problems of detecting the factors, which affect the process of microclonning of strawberries in vitro. The thesis contains approaches to the choice of the physiological and biochemical indexes which are characteristic for a calluses cultured which different morphogenesis potention. On the basis of this exponents is proposed the method of the determination quality of strawberries' culture in vitro for morphogenesis in optimal and stress conditions of cultivation.

The results of researches are used by the Agriculture and Food Ministry of Ukraine while developing a concept of getting salt tolerance plants as well as in the teaching process on the faculty of physiology and biotechnology in the plant growing at the National Agrarian University while developing and teaching the subjects "Physiology of Plants" and "Biotechnology of Plants".

Key words: strawberry, cells culture, callus, morphogenesis, salt stress.

Пщписано до друку 04.05.98 p. Формат 60x90/16. Ум. друк. арк. 1,0. Обл.-вид. арк. 0,8. Наклад 100. Зам. 125.

Вщдш оперативно! пол1графп Центру МЬкнародно! ocbîtm 252005, м.КиТв, вул. Червоноарм1йська, 57/3, к.101. 227-12-75, 227-37-86