Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофизиологический анализ механизмов регуляции объема клеток крови

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Морфофизиологический анализ механизмов регуляции объема клеток крови"

На правах рукописи

СКОРКИНА Марина Юрьевна

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ОБЪЕМА КЛЕТОК КРОВИ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

25 СЕН 2014

АСТРАХАНЬ - 2014

005552873

005552873

Работа выполнена в федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Муравьев Алексей Васильевич

Официальные оппоненты:

Катюхин Лев Николаевич, доктор биологических наук, ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова» РАН, лаборатория сравнительной биохимии ферментов, научный сотрудник

Кличханов Нисред Кадирович, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Дагестанский государственный университет», кафедра биохимии и биофизики, профессор

Ярошинская Алевтина Павловна, доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», кафедра спортивных игр и адаптивной физической культуры, доцент

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет», г. Волгоград.

Защита состоится « 28 » ноября 2014 г. в 10:00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет» по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1, ауд. 101.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет» по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева, 20а и на сайте: http://www.asu.edu.ru.

Автореферат разослан « /о » £Л{£7Ло/?А 2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Курьянова Евгения Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В клеточном гомеостазе большее значение имеет сохранение объема и формы клеток. Сущность этой стратегии живых клеток представляет собой комплекс фундаментальных физиологических механизмов, которые были эволюционно выработаны и закреплены в адаптивном поведении клеточных популяций. Существенное изменение объема клеток является важным критерием, указывающим на трансформацию функционального состояния ткани, органа и организма в целом. Так, например, увеличение клеточного объема в условиях гипоосмотической нагрузки сопровождается активацией механизмов регуляции клеточного деления (McManus M.J. et al., 1995), экспрессии генов (Yancey Р.Н., 1994; Burg M.B. et al., 1997), синтеза белков (Stoll В. et al., 1992; Low S.Y. et al., 1996), апоптоза (Широкова A.B., 2007; Замай Т.Н., 2011). Тесная взаимосвязь между морфологией клетки и ее функциональным состоянием прослеживается не только в высокоспециализированных клеточных популяциях, но и описана исследователями в опухолевых недодифференцированных клеточных линиях (Holt P.J.L et al., 1972; Замай Т.Н., 2011; Казарян П.А. с соавт., 2011). В связи с этим особую актуальность приобретает проблема изучения регуляции объема клеток на основе адекватной кооперации регуляторных подсистем, одним из звеньев которых выступают элементы цитоскелета, определяющие морфологию клетки и свойства ее мембранного аппарата.

Концепция работы основана на идее о привлечении в регуляцию объема клетки дополнительных мембранных структур, которые могут быть представлены образованиями плазмалеммы, например, в лимфоцитах (складками, филоподиями, ламелоподиями и т.д.) либо внутриклеточным резервным бассейном, например, в клетках (фибробластах), лишенных складчатости, но адгезирующих и перемещающихся на субстрате. Можно предполагать, что элементы цитоскелета выступают одновременно морфологической основой и центральным механизмом подсистемы регуляции объема на клеточном уровне. С одной стороны структуры цитоскелета участвуют в молекулярных механизмах передачи внутриклеточного сигнала и регуляции экспрессии генов (Percipalle P., Visa N., 2006; Fazal F. et al., 2007), контролируют работу мембранных каналов и транспортеров (Mazzocci С. et al., 2006), обеспечивают контакт клеток с субстратом и межклеточные контакты (Kellouche S. et al., 2010), движение (Leroy-Dudal J. et al., 2005), экто- и эндоцитоз, поддерживают форму клеток (Egea G. et al., 2006). С другой стороны определенная жесткость подмембранного каркаса позволяет клеткам использовать запасы мембранного материала с целью сохранения морфологической целостности, а, следовательно, и выживания как здоровой, так и опухолевой клетки при действии экстремальных факторов среды. Этот комплекс реакций клетки можно рассматривать как ее срочный адаптивный ответ, направленный на сохранение оптимального объёма и формы в данных условиях

функционирования. Таким образом, описанные клеточные события укладываются в рамки важнейшей концепции физиологии — концепции адаптации (Экхерт Дж. С соавт., 1989).

Степень разработанности темы исследования. В современной физиологии общепризнанной является модель ионной основы регуляции объема клеток в условиях гипотонии, которая лучше всего изучена на эритроцитах (Kregenow F.M. 1971; Cala P.M., 1980) и лимфоидных клетках (Roti-Roti L.W., Rothstein А., 1973). Клетки осуществляют регуляцию объема посредством мембранных переносчиков, изменяющих внутриклеточную концентрацию К+, Na\CP (Grinstein S., Foskett J.K., 1990; Okada Y. et al., 2009; Fahlke С., Ficher M., 2010), a также цитозольного Ca2+, запускающего полифосфатидилинозитный цикл (Орлов С.Н. с соавт., 1988; Авдонин П.В., Ткачук В.А., 1994). Показано, что работа ионных транспортеров.регулируется с участием молекулярных сигнальных путей - аденилаггциклазного (Эккерт Дж. с соавт., 1991; Tuvia S. et al., 1999; Kaloyianin M., Doukakis I., 2003) и Caf" сигнального (Ткачук B.A., 2001; Mohanty M.J. et al., 2001), которые реализуются с участием элементов цитоскелета.

Данные литературы об исследовании роли мембранного резерва в регуляции объема клеток разного типа фрагментарны и не оформлены в строгие теории и концепции. Имеются сведения об использовании мембранного резерва при образовании псевдоподий, миграции клеток (Чернявских С.Д. с соавт., 2012), формировании фагосом (Федорова М.З. с соавт., 2007), пассаже лейкоцитов через обменные капилляры, диаметр которых меньше размеров клетки (Федорова М.З., Левин В.Н., 2001; Тгап-Son-Tay R., Nash G., 2007). Было показано, что величина мембранного резерва варьирует в зависимости от типа клеток и метода измерения. Мембранный резерв фибробластов составляет около 1% (Raucher D., Sheetz M., 1999), лимфоцитов - 70% (Ross P.E., 1994), нейронов - в пределах от 50% до 300% (Wan X. et al., 1995), ооцитов Xenopus - более 500% (Zhang Y., Hamill O.P., 2000). В литературе имеются немногочисленные данные, свидетельствующие об участии микрофиламентов клетки в использовании ею мембранного резерва. В частности показано, что нарушение белковых взаимодействий цитоскелета увеличивает доступный мембранный резерв, используемый клетками, в то время как прирост плотности микротрубочек его снижает (Raucher D., Sheetz M., 1999).

Как было сказано выше, одним из механизмов управления объемом клеток является осморегуляция. Несмотря на проведенные многочисленные исследования осморегуляторных реакций разных типов клеток (Карагодина З.В., 1984; Федорова М.З., 2001; Шпаков А.О., 2007; Shindo M. et al., 2000; Mohanty M.J., 2001; BobakN. et al., 2011; Andronic J. et al., 2013), в настоящее время остаются не изученными точные механизмы поддержания клеточного объема и восстановления формы за счет использования поверхностных и внутриклеточных мембранных резервных бассейнов. Неясно, какая величина резерва заложена в складчатости клеточной

мембраны, например, лимфоцита, и как она может быть использована в физиологических реакциях отдельных клеток и скоординированной тканевой адаптации. Кроме того, не установлена связь между изменением упруго-эластических свойств и реализацией мембранного резерва в условиях адаптивного изменения объема и формы клеток. Остается не исследованным влияние особенностей морфологии клеточной поверхности на физиологические реакции клеток в процессе их адаптации к действию различных факторов. Особый интерес в этой связи представляет количественная оценка запаса мембранного материала в недодифференцированных опухолевых клетках крови, для которых установлена значительная осмотическая устойчивость в гипотонической среде (Holt P.J.L., 1972; Васильев A.A. с соавт., 1995). Кроме того, остается открытым эволюционный вопрос о том, участвует ли мембранный резерв клеток низших позвоночных в регуляции их объема. Так на эритроцитах лягушек хорошо изучены механизмы ионной регуляции объема (Cala М.Р., 1980; Gusev G.P.et al., 1997; 1999; Ziegler J.J., 2012). Однако известно, что в состоянии анабиоза (в зимний период жизненного цикла), при котором снижена функция выделительных органов, в организме накапливаются осмолиты и электролиты, что создает условия для изменения осмотического давления внеклеточной жидкости. Можно предположить, что эритроциты лягушек должны обладать механизмами регуляции, позволяющими им быстро реагировать на изменения осмолярности среды для адаптивного поддержания оптимального объема клеток и организма в целом.

Таким образом, актуальность исследования адаптивных реакций, направленных на оптимизацию клеточного объема и формы, обусловлена теоретическим и практическим интересом. Теоретическая значимость работы связана с изучением клеточных механизмов срочной адаптации, направленной на регуляцию объема дифференцированных и незрелых, например, опухолевых клеток крови, что является важным для понимания тканевых и органных изменений в условиях нормы и патологии. Практический аспект связан с выяснением роли элементов цитоскелета в механизмах использования дополнительных мембранных структур, что позволит расширить поиск физиологически активных веществ и химических соединений, которые могут быть основой для разработки лекарственных препаратов с целью диагностики и коррекции нарушений механизмов поддержания клеточного объема, а, следовательно, для нормализации функций тканей и органов.

С учетом вышесказанного была сформулирована цель исследования и поставлены основные задачи.

Цель работы: исследование морфофизиологических механизмов поддержания объема, как важного элемента клеточного гомеостаза, на моделях осмотической нагрузки клеток крови в норме и при патологии.

Задачи исследования:

1. Изучить морфофизиологические особенности изменения объема клеток на модели осмотической нагрузки субпопуляций лимфоцитов здоровых доноров и больных хроническим лимфобластным лейкозом.

2. Выявить морфофункциональные особенности клеточной поверхности лимфоцитов здоровых доноров и больных лейкозом.

3. Исследовать взаимосвязь между упруго-эластическими свойствами и морфологическими характеристиками лимфоцитов здоровых доноров и больных лейкозом.

4. Выявить механизмы, определяющие интенсивность использования дополнительных мембранных структур лимфоцитами здоровых доноров и больных лейкозом при увеличении и снижении жесткости клеточной поверхности.

5. Изучить особенности регуляции объема клеток крови низших позвоночных на модели осмотической нагрузки эритроцитов лягушки и оценить интенсивность использования ими мембранного резерва при изменениях жесткости клетки.

Научная новизна

С использованием метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) исследованы морфофизиологические особенности лимфоцитов здоровых доноров и больных хроническим лимфобластным лейкозом. Получены новые данные, которые свидетельствуют о том, что снижение жесткости клеточной поверхности в опухолевых клетках сопряжено с перестройками ее структуры и может быть использовано в качестве прогностического критерия при диагностике и лечении больных лейкозом.

Новизна исследования заключается в том, что при изучении морфофизиологических реакций форменных элементов крови, данные получены на специально разработанных клеточных моделях. В условиях приближенных к in vivo, за счет использования влажной камеры для клеток, во время приготовления препаратов для АСМ-сканирования удалось исключить их фиксации, что позволило получить новые данные и детально изучить морфологию мембраны нефиксированных клеток, выявить взаимосвязь между изменением упруго-эластических свойств мембранной поверхности и характером «рисунка» ее рельефа.

Впервые установлена зависимость между использованием мембранного резерва в механизмах регуляции объема и упруго-эластическими свойствами лимфоцитов человека. Показано, что основным фактором, регулирующим использование мембранного резерва лимфоцитами здоровых лиц, является жесткость клеточного каркаса. В тоже время, в субпопуляциях лимфоцитов больных ХЛЛ, а также эритроцитах низших позвоночных (лягушек) жесткость не является однозначным лимитирующим фактором, регулирующим использование мембранных структур в физиологических реакциях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выполненное исследование содержит новые сведения об использовании клетками мембранных резервных структур в механизмах поддержания объемного гомеостаза. Полученные данные имеют важное теоретическое и практическое значение в оценке клеточных реакций и прогнозировании течения адаптационного процесса при воздействии разных, в том числе и экстремальных, факторов среды.

Разработка и использование в качестве сенсоров модифицированных кантилеверов, созданных на основе полимерных микросфер, позволило получить новые объективные данные об упруго-эластических свойствах мягких биологических структур. Усовершенствованный и апробированный инструментарий на базе атомно-силовой микроскопии, дает возможность изучать морфофункциональные профили нативных клеток крови и может быть рекомендован к применению в специально оборудованных клинико-диагностических лабораториях. Получение объективных данных о свойствах клеточных систем стало возможным благодаря созданию влажной камеры (патент на полезную модель РФ 98248), позволяющей сканировать клеточные поверхности на воздухе в полуконтактном режиме, а также благодаря разработке «Способа исследования нативных клеток крови» (патент РФ 2398234) и «Способа определения упругости клеток крови» (патент РФ 2466401). Комплексное исследование особенностей рельефа поверхности и жесткости, как меры упругости лимфоцитов, позволяет на ранних стадиях диагностировать нарушение процессов дифференцировки и созревания форменных элементов крови, что дает возможность контролировать результаты терапевтических процедур, направленных на уничтожение аномальных клонов клеток. Перспективность использования разработанного подхода подтверждают результаты исследования крови больных ХЛЛ. Полученные данные о снижении упругости лимфоцитов больных лейкозом могут быть использованы в качестве диагностического и прогностического критерия при развитии опухолевых процессов в организме.

Ядерные эритроциты лягушек, как клеточные модели, можно использовать в медико-биологических экспериментах для изучения клеточных механизмов морфофизиологических реакций.

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре анатомии и физиологии живых организмов НИУ «БелГУ» при написании учебных и методических пособий по дисциплинам: «Цитология» для студентов направления подготовки 020201.65 - Биология-Химия; 020200.62 — Биология; «Цитология и гистология» для студентов направления подготовки 020208.65 - Биохимия; «Иммунология» для студентов направления подготовки 020201.65 — Биология; 020208.65 — Биохимия; «Физиология крови» для магистрантов по направлению 020200.68.01 - Физиология человека и животных.

Методология и методы исследования

Проведено 4 серии исследований, в двух из которых изучена кровь людей - здоровых доноров (200 обследованных) и больных хроническим лимфобластным лейкозом (XJIJI) (100 обследованных), в двух других - кровь лягушек Rana ridibunda Pall. (200 особей).

В первой серии экспериментов изучали динамику осморегуляторных реакций лимфоцитов здоровых доноров и больных ХЛЛ, а также зависимость между интенсивностью использования резервных бассейнов клетками в осмотических тестах in vitro и жесткостью клеточной поверхности. В экспериментальной части работы использовали венозную кровь здоровых доноров (100 человек) в возрасте от 25 до 45 лет, проходивших диспансеризацию на базе областной клинической больницы г. Белгорода. Исследована кровь больных ХЛЛ (50 человек) в возрасте от 17 до 46 лет, находящихся на лечении в гематологическом отделении областной клинической больницы г. Белгорода.

Во второй серии исследований изучали особенности рельефа поверхности лимфоцитов здоровых доноров и больных ХЛЛ в фазу регуляторного увеличения и уменьшения объема клеток при проведении осмотической нагрузки in vitro. В работе использована кровь 100 здоровых доноров в возрасте от 25 до 45 лет и кровь 50 больных ХЛЛ, в возрасте от 17 до 32 лет.

В третьей серии изучали осморегуляторные реакции эритроцитов лягушек при проведении осмотических тестов in vitro, а также зависимость между интенсивностью использования резервных мембранных структур и жесткостью клеточной поверхности. Экспериментальная часть работы выполнена на половозрелых самцах лягушек Rana Ridibunda Pall, массой 42±2,0 г (100 особей). Опыты проведены в период физиологического анабиоза (январь-февраль), животных содержали при температуре +2 - +3° С в стеклянных садках, наполненных водой на 3-5 см. Воду меняли ежедневно. Исследования выполнены с соблюдением всех требований Хельсинкской декларации по гуманному обращению с животными (Хельсинкская декларация этических принципов, 2008) и директивами Совета Европейского Сообщества по защите животных, используемых в экспериментальных и других научных целях.

В четвертой серии исследований изучали особенности цитоархитектоники эритроцитов лягушек в фазу регуляторного увеличения и уменьшения объема клеток при проведении осмотической нагрузки in vitro. Экспериментальная часть работы выполнена на половозрелых самцах Rana Ridibunda Pall., массой 46±2,0 г (100 особей), находящихся в состоянии физиологического анабиоза.

Методы изучения осморегуляторных реакций клеток крови

Взятие крови. Человеческую кровь получали методом венепункции при участии специализированного медперсонала. Кровь собирали в вакуумные пробирки Vacuette КЗЕ, содержащие сухую калиевую соль

этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА К3) в концентрации 2,0 мг на 1 мл крови (0,006843 моль/литр).

Кровь для исследований у лягушек Rana Ridibunda Pall, брали, используя технику пункции сердца. Стабилизацию крови проводили гепарином (5 Ед/мл).

Осмотические тесты in vitro. Динамику осморегуляторных реакций клеток крови изучали с использованием комплексного метода, разработанного рядом авторов (Федорова М.З., Левин В.Н., 1997) на основе известных методик (Зацепина Г.Н. с соавт.,1984; Тарасова И.М., 1985; Mela M.J., 1967).

Полученную кровь здоровых доноров и больных ХЛЛ центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин. Удаляли верхний слой плазмы. Собирали нижнюю часть плазмы, богатую лейкоцитами и лейкоцитарное кольцо. Примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония (Зиман Ю.И., Редышн А.П., 1987; Романова А.Ф., 2000; Карпищенко А.И., 2002). Клетки дважды отмывали изотоничным буферным раствором (раствор Дульбекко, рН=7,4). Эритроциты лягушек выделяли из цельной крови, путем центрифугирования 5 мин при 1500 об/мин и последующего ресуспен-дирования в среде Хенкса, получали 1 мл суспензии.

Полученную суспензию клеток делили на три пробы по 10 мкл в каждой. К первой пробе добавляли 50 мкл аутологичной плазмы, ко второй -50 мкл гипотонического раствора (0,4% раствор хлорида натрия для лимфоцитов человека и 0,2% раствор для эритроцитов лягушек), к третьей -50 мкл изотонического раствора (0,9% раствор хлорида натрия для лимфоцитов человека и 0,65% раствор для эритроцитов лягушек). Формировали однослойные суспензионные препараты из каждой пробы, в которых через каждые 30 секунд в течение 10 минут, а затем дополнительно через каждые 15, 30 и 60 минут регистрировали изображения клеток с помощью комплекса аппаратно-программной визуализации морфологических препаратов, анализа и регистрации оптических и морфологических показателей «ВидеоТесТ» (регистрационное удостоверение № 29/20010702/6102-04 от 16.02. 2004 г.). На полученных изображениях измеряли диаметр 100 клеток и ядер, используя значения которого вычисляли морфометрические индексы по соответствующим формулам:

1)для лимфоцитов (Выгодский МЛ., 1974; Головко С.И., 2010)

V=i(nr3) (1)

S = 4тгг2 (2)

где V — объем (мкм3),

S — площадь поверхности (мкм2), г — радиус (мкм).

2) для эритроцитов (Скоркина М.Ю. с соавт., 2004; Головко С.И., 2010)

V = - nab с (3)

S = i (л- ab + ас + be ) (4)

где V — объем (мкм3),

S — площадь поверхности (мкм2), а - большая полуось (мкм), b - средняя полуось (мкм), с - малая полуось (мкм).

Об осморегуляторных реакциях клеток судили по показателю использования ими запасов мембранного резерва. Рассчитывали потенциальный мембранный резерв для клеток, помещенных в аутологичную плазму:

MR = - (5)

V к '

где MR -потенциальный мембранный резерв (мкм-1); S — площадь поверхности клетки/ядра в аутологичной плазме (мкм2), V — объем клетки/ядра в аутологичной плазме (мкм3).

Относительный мембранный резерв рассчитывали для клетки и ядра, помещенных в гипо- или изотоническую среду:

5гип-

МДотн. = -Щ—2. (6)

р

где MRoro. — относительный мембранный резерв (мкм-1);

Syr/« - площадь поверхности клетки/ядра в гипотоническом/изотоническом растворах NaCl (мкм2),

Sp — площадь поверхности клетки/ядра в аутологичной плазме (мкм2), Vp — объем клетки/ядра в аутологичной плазме (мкм3).

Интенсивность использования относительного мембранного резерва в системе клетка-ядро оценивали, вычисляя процент относительного мембранного резерва, используемого клеткой от потенциального мембранного резерва, принимаемого за 100%.

Тесты с функциональными нагрузками. С целью выявления зависимости между упруго-эластическими свойствами и интенсивностью использования резервных бассейнов клетками в осмотических тестах in vitro, в проведенном исследовании использован метод функциональных нагрузок. Упруго-эластические свойства клеток изменяли в опытах с адреналином, обзиданом, Са2+ и верапамилом. Выбор адреналина и обзидана обусловлен их непосредственным влиянием на ß-адренорецепторы, которые участвуют в модуляции упруго-эластических свойств клеточной мембраны, посредством фосфорилирования белков цитоскелета (Tuvia S. et al., 1999; Johnson M.W. et al., 2012). Кроме того, a-1-адренорецепторы в клетках крови не вовлекаются в регуляцию цАМФ, концентрация которого прямо пропорциональна деформируемости эритроцитов и трансформированных лимфоцитов, обладающих различным метастатическим потенциалом (Mittelman L. et al.,

1994). Кроме того, ß-адренергические рецепторы признаны основными подтипами адренергических рецепторов, которые присутствуют на поверхности лимфоцитов (Landmann R., 1992). Плотность их на мембране лимфоцитов составляет 1000-3000 (Tuvia S. et al., 1999). Адреналиновую нагрузку осуществляли путем инкубации 30 мкл клеточной суспензии в 150 мкл среды Хенкса, содержащей 10'9ммоль/л адреналина в течение 15 мин. Пробу с обзиданом проводили путем инкубации 30 мкл суспензии в 150 мкл среды Хенкса, содержащей 10"9ммоль/л обзидана в течение 15 мин.

Использование модели кальциевой нагрузки in vitro связано с тем, что ионы Са2+ являются вторичным мессенджером и участвуют в регуляции активности элементов цитоскелета (Grinstein S. et al., 1982b; Grinstein S., Smith J.D., 1990). В качестве антагониста кальциевой нагрузки использовали функциональные пробы с верапамилом. Выбор верапамила, с одной стороны, связан с тем, что он выступает в качестве блокатора кальциевых каналов, взаимодействуя с сайтами связывания для ионов Са2+ и препятствуя их потоку в клетку из среды (Kaiin W. et al., 1982), а с другой стороны, верапамил in vitro действует как ингибитор ß-адренорецепторов аналогично обзидану (Feldman R.D., Park G.D., 1985). Кальциевую нагрузку осуществляли путем инкубации 30 мкл клеточной суспензии в 150 мкл среды Хенкса, содержащей 10"® ммоль/л Са2+ в течение 15 мин. Пробу с верапамилом проводили путем инкубации 30 мкл суспензии клеток в 150 мкл среды Хенкса, содержащей 10"® ммоль/л верапамила в течение 15 мин.

Лимфоциты человека инкубировали в термостате при температуре 37°С, эритроциты лягушек — при комнатной температуре. По окончании времени проведения функциональных нагрузок пробы центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость убирали и выполняли осмотические тесты in vitro.

Методы изучения цитоархитектоники клеток крови.

Подготовка фиксированных образцов клеток. Особенности цитоархитектоники мембран при проведении осмотических тестов изучали методом полуконтактной АСМ на фиксированных препаратах. В первой серии опытов исследовали ультраструктурные особенности мембран в условиях гипоосмотической нагрузки. По 10 мкл клеточной суспензии из каждой пробы разливали в 8 пластиковых пробирок Эппендорфа, в каждую из которых вносили по 50 мкл гипотонического раствора (0,2% для эритроцитов лягушек и 0,4% для лимфоцитов человека). Параллельно в следующие 8 пробирок разливали по 10 мкл клеточной суспензии, в каждую из которых добавляли по 50 мкл изотонического раствора (0,65% раствор NaCl для эритроцитов лягушек и 0,9% раствор NaCl для лимфоцитов человека). В каждую из пробирок последовательно через 30, 60, 90, 120, 150, 180, 300 и 900 секунд инкубации добавляли по 10 мкл 25% раствора глутарового альдегида (MERCK, Германия). Контролем являлась проба, состоящая из 10 мкл клеточной суспензии, в которую добавляли 50 мкл аутологичной плазмы и фиксировали 10 мкл 25% раствора глутарового

альдегида. Из каждой пробы делали мазки. Фиксация глутаровым альдегидом была использована для сохранения естественного состояния цитоскелета мембраны, а также уменьшения деформации АСМ-зонда (Swihard А.Н. et al., 2001).

Готовые препараты сканировали на атомно-силовом микроскопе ИНТЕГРА Вита (конфигурация на базе инвертированного оптического микроскопа Olympus IX-71; производитель NT MDT, Зеленоград, 2009). Сканировали по 20 клеток из каждой пробы. Сканирование осуществляли с частотой развертки 0,6-0,8 Hz, используя кантилеверы серии NSG03 жесткостью 1,1Н/м и радиусом закругления 10 нм. Строили кривые профиля участков поверхности размером 3,5X3,5 мкм, на которых измеряли высоту и подсчитывали количество глобулярных выступов, а также углублений, образовавшихся в мембране после нагрузок (рисунок 1).

Рисунок 1 - АСМ-изображение и вид профиля поверхности лимфоцита вдоль линии сканирования: 1- глобулярные выступы, 2 —углубления.

По оси абсцисс — длина участка (мкм), по оси ординат - высота структур (нм).

Дополнительно проведено 4 серии опытов, в которых изучали рельеф поверхности клеток крови под влиянием функциональных нагрузок с последующим наложением гипоосмотической нагрузки. Готовили пробы: по 200 мкл суспензии эритроцитов и лимфоцитов в каждой, которые инкубировали с 1000 мкл среды Хенкса, содержащей адреналин (10"9ммоль/л; 1 проба), обзидан (10"9ммоль/л; 2 проба), хлорид кальция (10 6 ммоль/л; 3 проба) и верапамил (10 6 ммоль/л; 4 проба). Инкубацию проб проводили в течение 15 мин при комнатной температуре (эритроциты лягушек) и при температуре 37°С (лимфоциты доноров и больных ХЛЛ). По истечении времени инкубации пробы центрифугировали, отбирали надосадочную жидкость, затем проводили тесты с гипоосмотичсокй нагрузкой in vitro. По окончании гипоосмотической нагрузки готовили фиксированные препараты, которые сканировали при тех же условиях и анализировали, как описано выше.

Подготовка нашивных образов клеток для атомно-саловой спектроскопии (АСС). Упруго-эластические свойства клеток крови изучали методом эластографии путем сканирования суспензий во влажной камере. В основе метода эластографии лежит измерение степени деформации поверхности образца при взаимодействии его с вершиной зонда АСМ (Alonso J.L., Goldman W.H., 2003). Для работы с клетками использовали модифицированные АСМ-зонды в виде полусфер с радиусом закругления 5 мкм (патент РФ № 2466401).

Лимфоциты здоровых доноров и больных ХЛЛ получали путем центрифугирования проб крови, которые дважды отмывали изотоничным буферным раствором Дульбеко (pH 7,4) и ресуспендировали в среде Хенкса 199. Кровь лягушки центрифугировали 5 мин при 2000 об/мин. Плазму отбирали, эритроциты отмывали и ресуспендировали в среде Хенкса (pH 7,4). Готовили суспензионные препараты клеток крови путем нанесения капли суспензии на обезжиренное предметное стекло (патент № 2398234). С целью сохранения жизнеспособности клеток перед сканированием их помещали во влажную камеру (патент РФ № 98248).

Алгоритм расчета модуля Юнга. В качестве экспериментальных данных для определения локальной упругости клеток были использованы силовые кривые, которые получали в широком диапазоне как до, так и после контакта кантилевера с поверхностью объекта. Силовые кривые использовали для вычисления силы взаимодействия зонда и образца. Полученные кривые преобразовывали из системы координат «ток рассогласования (DFL, пА) - высота (цгп)» (рисунок 2а) в систему координат «сила (DFL, nN) - высота (цш)» (рисунок 26).

а

Рисунок 2 - Силовые кривые лимфоцита больного ХЛЛ: а - первоначальный вид силовой кривой в системе координат «ток рассогласования фотодиода (DFL, нА) от высоты (мкм)»,

б - преобразованная кривая, с помощью скрипта DFLtoJForce программы «Nova», в системе координат «сила (DFL, нН) от высоты (мкм)»,

На силовой кривой указаны значения DX (нм), DY (нН), Y (нН), необходимые для вычисления глубины проникновения зонда в образец.

Процедуру преобразования осуществляли, используя скрипт DFL_to_Force программного обеспечения Nova (НТ-МДТ, Зеленоград, 2009). На преобразованных силовых кривых (рисунок 26) находили значения DX (nm), DY (nN), Y (nN) по которым рассчитывали глубину проникновения зонда в образец согласно известной формуле (Israelachvili J., 1992).

Силу прижатия зонда к образцу находили исходя из закона Гука: F — к*х (7)

где fc - жесткость зонда (Н/м),

х — глубина проникновения зонда в образец (нм).

Модуль Юнга системы образец-игла рассчитывали исходя из известной формулы (Capella В., Dieter G., 1999).

Статистическая обработка результатов. Результаты экспериментальных исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета анализа «Microsoft Excel 7.0» на персональном компьютере (Лапач С.Н. с соавт., 2001). Экспериментальные данные представлены в виде среднеарифметических значений с их средними стандартными ошибками. Статистический анализ результатов экспериментов проведен с применением критерия Стьюдента для 5%-го уровня значимости.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Регуляция объема лимфоцитов здоровых доноров в условиях осмотической нагрузки направлена на сохранение целостности клетки и связана с использованием запасов мембранного материала, заложенного в складчатости плазмалеммы.

2. Морфофизиологические свойства опухолевых клонов клеток тесно связаны с адаптивными реакциями, направленными на поддержание микрореологических свойств лимфоцитов для их эффективного пассажа через пути микроциркуляции крови.

3. Вовлечение поверхностных резервных структур плазмалеммы в регуляцию объема лимфоцитов здорового человека зависит от жесткости клетки.

4. Лимфоциты больных ХЛЛ регулируют свой объем без использования дополнительного резерва плазмалеммы, что подтверждено отсутствием взаимосвязи между изменением жесткости клетки и отсутствием осморегуляторных реакций в гипотонической среде.

5. Эритроциты лягушек имеют иной механизм сохранения клеточного объема, поскольку не обладают скоординированными реакциями, позволяющими использовать резервы плазмалеммы в регуляции объема.

Степень достоверности, полученных результатов обусловлена теоретическим анализом результатов и выводов, наличием репрезентативной выборки объектов, адекватной целям и задачам исследования, личным участием автора во всех сериях экспериментального исследования, проведенных с помощью современных методик и сертифицированного высокоточного отечественного оборудования в области микроскопии

(атомно-силовой микроскоп, система видеорегистрации и документирования изображений «ВидеоТест»), соответствующих компьютерных программ обработки и анализа изображений, большим объемом фактического материала, который обработан с использованием традиционных методов статистики, применяемых в биологических исследованиях, получением патентов на изобретения и полезные модели, публикацией данных диссертации в монографиях, статьях, докладах на международных конференциях и научных семинарах.

Апробация результатов работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены и обсуждены на международных конференциях «Биология — наука XXI века» (Пущино 2004, 2006, 2007, 2009), «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» (Белгород 2004), «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль 2005,. 2007, 2009, 2011, 2013), Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2005), съездах физиологов СНГ (Сочи, 2005, 2011), XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), Международном конгрессе ветеринарных фармакологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства» (Санкт-Петербург, 2008), IX конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008), X Международной научно-практической конференции «Живые объекты в условиях антропогенного пресса» (Белгород, 2008), VIII Молодежной научной конференции Коми УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2009), Международной научно-методической конференции, посвященной 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина «Современные проблемы эволюционной биологии» (Брянск, 2009), III Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010» (Москва, 2010), XVII Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2011), XIV Международном совещании и VII школы по эволюционной физиологии, посвященным памяти академика JI.A. Орбели (Санкт-Петербург, 2011), VII Сибирском съезде физиологов Сибири (Красноярск, 2012), региональном отраслевом форуме «Медицинская биотехнология. Биофармацевтическая промышленность» (Белгород, 2012), научном семинаре в рамках академического сотрудничества между НИУ «БелГУ» и лабораторией ERRMECE университета Сержи-Понтуаз (Франция, Париж, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 57 научных работ общим объемом 51,3 пл., авторский вклад - 28,2 п.л., в т.ч. изданы 3 монографии, 16 статей -в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для докторских диссертаций, 6 патентов на изобретения и 32 статьи - в материалах научных школ и международных научных конференциях. Цитируемость публикаций автора в РИНЦ составляет 46.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав с описанием полученных результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 391 странице машинописного текста, включает 106 таблиц и 100 рисунков. Список литературы включает в себя 744 наименования, из которых 111 отечественных и 633 иностранных источников.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Регуляция объема лимфоцитов доноров в тестах с осмотической нагрузкой in vitro

В тестах с осмотической нагрузкой in vitro наблюдали чередование периодов регуляторного увеличения и уменьшения объема лимфоцитов доноров. Изменение объема лимфоцитов доноров в гипотонической среде анализировали в сравнении с аналогичным показателем в изотоническом растворе. Длительность периода увеличения объема лимфоцитов в гипотонической среде составила 360 секунд. Длительность периода регуляторного уменьшения объема лимфоцитов была 60 секунд, который наблюдали в интервале с 390 по 450 секунды инкубации.

Лимфоциты использовали дополнительные мембранные структуры в регуляции объема как в гипо-, так и в изотонической средах. В гипотонической среде происходило постепенное увеличение использования резерва плазмалеммой, достигая максимума (=36%) на 240 секунде, а затем наблюдали чередование периодов увеличения и снижения использования резерва до конца инкубации (рисунок 3).

Рисунок 3 - Относительный мембранный резерв, используемый лимфоцитами доноров

В изотоническом растворе вовлечение дополнительных мембранных структур клетками в регуляцию объема наблюдали на протяжении первых 420 секунд. Максимальное использование резервных структур (=48%) в изотонической среде отмечали на 420 секунде, а затем происходило уменьшение процента резервных структур, задействованных в регуляции объема. Объем ядра лимфоцитов доноров был увеличен на протяжении всего времени инкубации. В интервале 30-300 секунды инкубации наблюдали увеличения использования дополнительных мембранных структур ядром в гипотонической среде. Максимальное использование резервной поверхности ядром (=33%) отмечали на 240-270 секундах. В изотонической среде ядро задействовало минимальные запасы резерва, максимум использования структур (=10,5%) отмечали на 150 секунде (рисунок 4).

Рисунок 4 - Относительный мембранный резерв, используемый ядром лимфоцита доноров

B0,2%NaCl i10,9%NaCl

30 60 120 150 180 240 270 300 360 390 420 450 510 3600 с

Наблюдаемое чередование фаз регуляторного увеличения объема и восстановления его до значений изотонической среды в системе клетка-ядро зависит от стратегий реагирования лимфоцита на изменение осмолярности среды. Одна из тактик реагирования связана с использованием мембранного резерва, а другая с работой ион-транспортных мембранных переносчиков. Учитывая, что значительная часть запасов поверхности мембраны, представленных в виде складчатости, может разворачиваться, в проведенном исследовании изучены особенности цитоархитектоники в различные фазы изменения объема клеток.

В фазу увеличения объема лимфоцитов доноров в первые 30 секунд воздействия гипотонической средой на поверхности клеток наблюдали снижение числа глобулярных образований на 78% (р<0,05), и увеличение их высоты на 37,5% (р<0,05) по сравнению с изотоническим раствором. В

последующие 60 секунд инкубации в гипотоническом растворе сохранилась тенденция к увеличению числа глобулярных выступов при уменьшении их высоты. Начиная со 180 секунды и до конца инкубации, количество глобул увеличилось, но их высота снизилась (таблица 1).

Таблица 1 - Размеры и количество глобулярных выступов на поверхности лимфоцитов доноров

Время инкубации, с Гипотонический раствор Изотонический раствор

высота, нм количество высота, нм количество

30 35,8±2,5* 47,0±1,2* 22,4±1,9 84,0±2,9

60 20,6±1,1* 130,0±3,1* 36,4±4,1 22,0±0,4

90 20,5±1,6* 71,0±2,5* 82,7±7,2 . 34,0±1,9

120 21,1±2,8* 48,0±0,9 44,4±4,5 49,0±1,0

150 41,7±3,3 32,0±1,4* 38,3±2,7 154,0±5,2

180 27,9±2,1* 61,0±2,8* 46,2±5,3 25,0±1,3

300 28,9±1,8* 71,0±3,7* 50,1±6,6 32,0±4,6

900 24,3±2,1 76,0±3,1* 29,3±4,9 23,0±1,7

*- Статистически достоверные различия между значениями в гипотоническом и изотоническом растворах по критерию Стьюдента при р<0,05.

Рельеф поверхности лимфоцитов в гипо- и изотонической средах представлен на рисунке 5.

Рисунок 5 - Рельеф поверхности лимфоцитов здоровых доноров в гипо-(/) и изотоническом (2) растворах на: а — 90, б - 120 с инкубации.

На сканнограммах видно, что в гипотонической среде на 90-120 секундах рельеф поверхности сглажен и представлен углублениями, в то

время как в изотонической среде на поверхности образуются бульбарные структуры.

Таким образом, в умеренно-гипотонической среде лимфоциты доноров используют поверхностные запасы плазмалеммы, представленные в виде складчатости, которые разворачиваются, изменяя рисунок рельефа. Фаза ретуляторного увеличения объема клеток сопровождается снижением числа глобулярных образований на поверхности мембран, что свидетельствует о реализации компенсаторной реакции, направленной на использование клеткой мембранного резерва для снятия литического напряжения. При этом увеличение высоты отдельных глобул может быть связано, по данным литературы, с образованием локальных областей дезагрегированного актинового кортекса (Ito Т. et al., 1992).

2. Морфофизиологические свойства лимфоцитов доноров под влиянием функциональных нагрузок

Основной целью выполнения опытов с функциональными нагрузками бьио установить взаимосвязь между упруго-эластическими свойствами клеток и интенсивностью использования ими мембранного резерва в тестах с осмотической нагрузкой in vitro.

Адреналиновая нагрузка. При инкубации лимфоцитов с адреналином жесткость клеток возросла на 36,4% (р<0,05). В рельефе поверхности увеличилось число глобулярных структур со сниженной высотой (таблица 2).

Таблица 2 — Свойства н рельеф лимфоцитов здоровых доноров под воздействием адреналина и обзидана

Пробы Модуль Юнга, цРа Глубина погружения кантилевера, нм Глобулярные выступы

высота, нм количество

Плазма 3,5±0,2 345,2±3,7 41,3±3,7 36,0±0,9

Адреналин 5,5±0,4* 155,1±23,5* 17,5±0,5* 46,0±1Д*

Обзидан 2,8±0,3* 468,5±15,5* 75,8±8,8* 35,0±1,6

*- Статистически достоверные различия между значениями в плазме и пробах

после инкубации их с адреналином по критерию Стьюдента при р<0,05.

В параллельных опытах с обзиданом жесткость клеток снизилась на 20% (р<0,05), при этом высота глобулярных структур увеличилась, а их количество практически не изменилось.

В условиях адреналиновой нагрузки длительность периода регуляторного увеличения объема лимфоцитов в гипотонической среде возросла до 450 секунд, что на 90 секунд больше, чем в клетках без нагрузки. В гипотонической среде клетка задействовала максимум мембранного резерва (=15%) на 60 секунде инкубации, в это же время в изотоническом растворе лимфоциты задействовали =2% резервной поверхности. Ядро использовало =16% резерва на 30 секунде инкубации в гипотоническом растворе, при этом в изотонической среде ядро не использовало дополнительные резервы внутриклеточного бассейна. Длительность и

реализация периодов регуляторного сокращения объема в системе клетка-ядро по времени не совпадали. Изменение объема ядра протекало на 90 секунд быстрее, чем клетки в целом. Рельеф поверхности в течение первых 60 секунд воздействия гипотонической среды был сглажен, количество глобулярных структур снижено. В период с 90 по 120 секунды инкубации глобулы укрупнились и появились кластеры, кроме того увеличилось количество углублений, габаритные размеры которых сократились по сравнению со структурами в изотоническом растворе.

Под влиянием обзидана фаза регуляторного увеличения объема лимфоцитов составила 240 секунд. В системе клетка-ядро изменения объема клетки протекали на 210 секунд быстрее по сравнению с ядром. Продолжительность периода регуляторного сокращения объема, как на уровне клетки, так и на уровне ядра составила .в среднем 30 секунд. Максимальное использование резерва плазмалеммы (=6%) клеткой наблюдали на 30 секунде инкубации в гипотонической среде. В пробах с обзиданом ядро не использовало дополнительные мембранные структуры, как при снижении осмолярности среды, так и в изотоническом растворе. В гипотонической среде рисунок рельефа поверхности в первые 90 секунд инкубации был сглажен, количество и высота глобулярных образований на поверхности мембраны - снижены. В интервале со 120 по150 секунды инкубации в гипотонической среде высота глобул возросла, но их количество оставалось сниженным, что указывает на .процессы укрупнения белковых структур в мембране и их перестройку. Число углублений в мембране и их габаритные размеры уменьшились. Снижение числа углублений на поверхности привело к ее расправлению и увеличению площади поверхности.

Таким образом, под влиянием адреналина жесткость мембраны возросла, вследствие этого в гипотонической среде клетка имела ограниченные ресурсы для вовлечения поверхностного бассейна плазмалеммы в осморегуляторные реакции. Снижение упругости клетки практически в 1,5 раза привело к увеличению длительности фазы регуляторного увеличения объема в 1,25 раза по сравнению с клетками без нагрузки, при этом объем задействованных дополнительных мембранных структур уменьшился практически в 2 раза. В условиях блокады 0-адренорецепторов жесткость мембраны снизилась в 1,25 раза, при этом длительность фазы регуляторного увеличения объема сократилась в 1,5 раза, однако процент дополнительных мембранных структур, задействованных в гипотонической среде, уменьшился в 6 раз по сравнению с клетками без нагрузки. Полученные данные свидетельствуют о том, что упруго-эластические свойства клеток определяют длительность реализации реакций регуляторного увеличения и уменьшения объема.

Кальциевая нагрузка. При инкубации лимфоцитов с хлоридом кальция их жесткость снизилась на 34,2% (р<0,05), в рельефе поверхности наблюдали обилие глобулярных выступов со сниженной высотой.

Под влиянием верапамила жесткость клеток снизилась на 25,7% (р<0,05) по сравнению с контролем. На поверхности возросло число глобулярных структур, присутствовали небольшие бульбарные выросты. Существенных различий в жесткости и «рисунке» рельефа поверхности клеток под влиянием кальциевой нагрузки и верапамила не выявлено (таблица 3).

Таблица 3 — Свойства и рельеф лимфоцитов доноров под воздействием Са2+ и верапамила

Параметры структур и упруго-эластических свойств поверхности Плазма (контроль) Кальциевая нагрузка Верапамил

Глобулярные выступы высота, нм 41,3±3,7 26,5±1,6* 28,1±2,1*

количество 36,0±0,9 86,0±2,8* 51,0±3,4*

Углубления в мембране диаметр, нм 221,8±24,0 194,4±1,2 163,6±1,8

глубина, нм 17,3±0,б 14,9±2,1 6,9±0,7*

количество 18,0±1,1 51,0±2,6* 8,0±0,7*

Жесткость модуль Юнга, цРа 3,5±0,2 2,3±0,3* 2,6±0,4*

глубина погружения кантилевера, нм 345,2±3,7 835,7±10,0* 120,2±12,0*

*- Статистически достоверные различия между значениями в плазме и пробах с

кальциевой нагрузкой/верапамилом по критерию Стъюдента при р<0,05.

В условиях кальциевой нагрузки длительность периода регуляторного увеличения объема лимфоцитов в гипотонической среде составила 210 секунд, т.е. протекала на 150 секунд быстрее по сравнению с пробами без нагрузки. Фаза регуляторного сокращения объема клетки протекала на 30 секунд быстрее по сравнению с контролем. В системе клетка-ядро выявлена асинхронность в длительности протекания реакций. На это указывают следующие данные: фаза увеличения объема ядра удлинилась на 210 секунд по сравнению с клеткой, длительность периода сокращения объема ядра возросла на 60 секунд по сравнению с клеткой.

Использование мембранного резерва лимфоцитами доноров под влиянием кальциевой нагрузки в гипотонической среде постепенно снижалось по мере увеличения времени инкубации. Максимальное использование относительного мембранного резерва клеткой (=23%) наблюдали на 30 и 450 секундах, в то время как ядром (=28%) - на 120 секунде инкубации в гипотонической среде. В изотонической среде максимальное использование мембранного резерва клеткой отмечали также на 30 секунде, однако процент вовлеченных структур не превышал =15%, при этом ядро использовало резервные структуры (=16%) на 450 секунде инкубации. В течение первых 30 секунд воздействия гипотонической средой на поверхности клетки возросло число и высота глобулярных выступов. По мере продолжения фазы увеличения объема клетки, число и высота глобулярных структур уменьшились. К окончанию инкубации число глобул

вновь увеличилось, а их высота была снижена по сравнению с изотоническим раствором.

Под влиянием верапамила периоды регуляторного увеличения объема лимфоцитов наблюдали в течение первых 450 секунд инкубации в гипотонической среде, который был представлен короткими чередующимися 30 и 60 секундными интервалами увеличения и возвращения объема клеток к значениям изотонического раствора. Увеличения объема ядра наблюдали в течение 150 секунд, затем в течение 60-ти секунд объем ядра достигал значений изотонического раствора и вновь возрастал к концу инкубации. Использование мембранного резерва лимфоцитами было незначительным (=2%) и отмечалось только на 30 секунде инкубации, при этом ядро не задействовало резервные структуры в регуляции объема. Рельф поверхности в гипотонической среде был сглажен в течение первых 60 секунд воздействия. Увеличение высоты глобулярных структур наблюдали в интервале 90-120 секунды инкубации, при этом на 120 секунде достоверно возросло количество глобул по сравнению с изотоническим раствором. К окончанию инкубации в интервале 300-900 секунды на поверхности лимфоцитов в гипотонической среде появились глобулярные выступы, в то время как в изотоническом растворе наблюдали сглаживание рельефа поверхности.

При сравнении картин рельефа клеточной поверхности под влиянием Са2+ и верапамила в фазу регуляторного увеличения объема установлено, что под влиянием Са2+ число морфологических образований на мембране возрастает (рисунок 6).

Рисунок 6 - Сканы рельефа поверхности лимфоцитов здоровых доноров под влиянием кальция (а) и верапамила (б) в гипотоническом растворе.

В целом под влиянием Са2+ жесткость мембраны лимфоцитов снижается, что позволяет клеткам задействовать в 1,5 раза больше запасов мембранного резерва в гипотонической среде по сравнению с адреналиновой нагрузкой.

Длительность развития фазы увеличения объема лимфоцитов сокращается на 240 секунд по сравнению с адреналиновой нагрузкой и на 150 секунд по сравнению с контролем. Под влиянием экзогенного Са"+ ядро активно участвует в осморегуляторных реакциях и задействует приблизительно такой же объем резервных структур, что и клетка, это

свидетельствует о ведущей роли ионов Са2+ в передаче сигнала в ядро при понижении осмолярности среды. Под влиянием верапамила, несмотря на снижение жесткости поверхности, клетка использует меньший процент резервных структур в поддержании объема. Длительность фазы регуляторного увеличения объема возрастает на 180 секунд по сравнению с кальциевой нагрузкой и 330 секунд по сравнению с контролем, при этом ядро не задействует резервные структуры в реакциях осморегуляции.

Снижение жесткости лимфоцитов под влиянием кальциевой нагрузки может указывать на изменение агрегатного состояния белков цитоскелета, которые при увеличении экзогенного Са2+ в среде, с участием актин фрагментирующих белков виллина и гельзолина, переходят из состояния геля в состояние золя (Фултон А., 1987). Обилие глобулярных выступов на поверхности в условиях, кальциевой нагрузки, вероятно, связано с формированием актинсвязывающих доменов в подмембранном пространстве, которые, по данным ряда авторов, способствуют формированию выпячиваний или выступов на плазмапемме (McMahon Н.Т., Gallop J.L., 2005; Insall R.H., Machesky L.M., 2009; Itoh Т., Takenawa Т., 2009).

Известно, что верапамил in vitro действует как ингибитор ß-адренорецепторов, причем р2-адренорецепторы более селективны к верапамилу (Feldman R.D., Park G.D., 1985). Сравнивая эффекты двух блокаторов обзидана и верапамила установили, что жесткость клеток под влиянием этих веществ находится примерно в одинаковых пределах 2,6-2,8 цРа. Однако длительность фазы регуляторного увеличения объема клетки под влиянием верапамила возрастает на 210 секунд, при этом использование мембранного резерва снижено в 3 раза по сравнению с обзиданом. Рельеф поверхности в фазу увеличения объема сглажен как под влиянием верапамила, так и обзидана. Выявленные эффекты верапамила могут быть вызваны его влиянием на биомембраны. Согласно данным литературы, верапамил встраивается в липидный бислой в непосредственной близости от полярно/неполярного интерфейса мембраны, вызывает анизотропию и расширение порядка в цепи полярных областей головки липидов (Suwalsky М. et al., 2010). Не исключено, что изменения в ацильной цепи липидов влияют на скорость реакции и объем мембранных структур задействованных при увеличении объема клетки.

3. Регуляция объема лимфоцитов больных XJIJI в осмотических тестах in vitro

Лимфоциты больных ХЛЛ характеризуются увеличенными размерами, крупным ядром, занимающим почти 85-90% от объема клетки. Рельеф поверхности представлен обилием глобулярных образований и углублений на поверхности мембраны, габаритные размеры которых снижены по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров, что придает поверхности клетки вид рифленности. Жесткость лимфоцитов больных ХЛЛ снижена на 94% (р<0,05) по сравнению с клетками здоровых доноров.

В условиях как гипо - так и изотонической среды объем клетки и ядра лимфоцитов больных ХЛЛ уменьшился при сравнении с лимфоцитами, помещенными в аутологичную плазму. Однако, сравнивая реакции клетки и ядра между гипо - и изотоническим растворами установлено чередование периодов изменения объема (большее или меньшее сжатие клетки и ядра). В ядре реакции изменения объема протекают интенсивнее, чем в клетке. В частности в первую фазу «увеличения» объема, которая на уровне клетки длилась 60 секунд, в ядре протекали две последовательно сменяющие друг друга фазы «увеличения» и «уменьшения» объема, длительностью по 30 секунд каждая. В дальнейшем по мере увеличения времени инкубации в момент прохождения фазы «уменьшения» объема клетки, в ядре регистрировали фазу «увеличения» объема и наоборот.

Изменение.объема лимфоцитов больных ХЛЛ в гипотонической среде сопровождалось увеличением высоты глобулярных выступов на поверхности клетки. При уменьшении объема клеток высота глобул снизилась, а их количество — возросло (таблица 4).

Таблица 4 - Размеры и количество глобулярных выступов на поверхности лимфоцитов больных ХЛЛ

Время инкубации, с Гипотонический раствор Изотонический раствор

высота, нм количество высота, нм количество

30. 51,5±5,б* 19±1,6 26,2±1,2 15±2,4

60 31,9±5,1* 23±1,8 20,3±2,0 17±2,1

90 23,6±1,3* 109±3,8* 31,9±1,5 20±2,3

120 26,2±3,3 41±2,6* 29,9±1,6 103±4,1

150 39,7±1,1* 38±1,3* 31,2±1,5 18±2,5

180 29,4±3,4 25±2,4 30,6±2,7 27±2,6

300 26,8±1,7* 21±2,1 48,4±3,8 23±2,1

900 71,8±5,6* 50±3,8 15,5±1,1 59±1,8

*- Статистически достоверные различия между значениями в гипо- и

изотоническом растворе по критерию Стьюдента при р<0,05.

Изменения объема лимфоцитов больных ХЛЛ при снижении осмолярности среды протекали без участия резервных бассейнов мембраны, что было подтверждено данными по изучению рельефа поверхности клеток. В течение первых 30 секунд инкубации на поверхности появились углубления (рисунок 8), при этом их диаметр увеличился.

В условиях гипоосмотической нагрузки на поверхности лимфоцитов больных ХЛЛ образовались агрегированные домены и выпячивания в виде пузырьковых образований. Изменения картины рельефа поверхности лимфоцитов больных ХЛЛ в гипотонической среде протекали на 60 секунд быстрее по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров.

Рисунок 8 - Сканы рельефа поверхности лимфоцитов больных ХЛЛ в условиях гипотонической нагрузки на 30 секунде инкубации: а) в гипотонической среде, б) в изотонической среде.

Таким образом, лимфоциты больных ХЛЛ в гипотонической среде уменьшаются в объеме, что подтверждает известный факт большей резистентности этих клеток к гипотоническому шоку по сравнению с лимфоцитами здоровых людей (Holt P.J.L., 1972). Тем не менее, при сравнении реакций на гипотоническое воздействие в сравнении с изотонической средой установлено чередование периодов изменения объема клеток. В регуляции объема лимфоциты больных ХЛЛ и их ядра не использовали дополнительные мембранные структуры. Возможно, установленный факт объясняется работой ряда мембранных переносчиков, что приводит к быстрому установлению водно-осмотического баланса без использования дополнительных резервных бассейнов плазмалеммы. Одним из таких переносчиков выступает Na/H-теплообменник (NHE1), который расположен на лидирующем крае мигрирующих клеток (Lagana A. et al., 2000; Denker S.P., Barber D.L., 2002; Chiang Y. et al., 2008). Механизмы, участвующие в активации NHE1, были детально изучены на моделях раковых клеток, в которых было показано вовлечение в этот процесс сАМР PKA-P0-ROCK-p38 МАРК сигнального пути (Cardone R.A. et al., 2005). Образование агрегированных доменов на плазмалемме опухолевых клеток, по данным литературы, может быть связано с локальными разрушениями, возникающими между кортикальным цитоскелетом и мембраной (Charras G., Paluch Е., 2008), вследствие потери клеткой F-актина и ERM протеинов (Raucher D. et al., 2000; Sheetz M.P., et al., 2006; Wang Y. et al., 2008). Агрегированные домены используются раковыми клетками при инвазии во внеклеточный матрикс (Sahai Е., 2005).

4. Морфофункциональные свойства лимфоцитов больных ХЛЛ под влиянием функциональных нагрузок

Адреналиновая нагрузка. При инкубации лимфоцитов больных ХЛЛ с адреналином жесткость клеток возросла на 233% (р<0,05) по сравнению с контролем, при этом число глобулярных структур на мембране снизилось, а их высота возросла. В пробах с обзиданом жесткость лимфоцитов возросла

на 143% (р<0,05), при этом число глобул на поверхности снизилось, а их высота находилась в пределах недостоверных различий с контролем (таблица

5).

Таблица 5 — Структурные особенности и механические свойства лимфоцитов больных ХЛЛ под влиянием адреналина и обзидана

Параметры структур и упруго-эластических свойств поверхности Плазма (контроль) Адреналин Обзидан

Глобулярны е выступы высота, нм 17,6±0,9 72,85±1,3* 15,72±0,9*

количество 125±1,1 26±0,9* 24±0,4*

Углубления в мембране диаметр, нм 149,4±12,9 9,29±1,89* 0,88±0,10**

глубина, нм 8,01±0,9 35,54±3,57* 14,88±2,93**

количество 40±2,3 12±1,36* 9±0,2**

Жесткость модуль Юнга, цРа 1,80±0,01 4,19±0,31* 2,58±0,41*

глубина погружения кантилевера, нм 1035,20±7,32 258,01±31,07* 973,76±16,45**

*- Статистически достоверные различия между значениями в пробах с адреналином и обзиданом по сравнению с плазмой, А с обзиданом по сравнению с адреналином по критерию Стьюдента при р<0,05.

В условиях адреналиновой нагрузки в течение первых 300 секунд инкубации в гипотонической среде наблюдали чередующиеся фазы увеличения и уменьшения объема лимфоцитов. Длительность фазы регуляторного увеличения объема клеток составила 30 секунд, снижения объема — 90 секунд. Начиная с 360 секунды объем клетки и ядра в гипотонической среде постепенно уменьшался с увеличением времени инкубации.

На 30 секунде инкубации в гипотонической среде клетка использовала =22%, а ядро — максимально вовлекало в регуляцию объема =36% резерва на 210 секунде. В изотонической среде увеличение объема клетки протекало медленнее, и лишь на 180 секунде она задействовала =14% мембранного резерва, в то время как ядро =36% использовало на 150 секунде.

Под влиянием обзидана в течение первых 30 секунд инкубации в гипотонической среде наблюдали увеличение объема клетки и ядра. Длительность периода регуляторного снижения объема составила 30 секунд. Причем при снижении осмолярности среды фазы регуляторного снижения объема на уровне клетки протекали на 210 секунд быстрее, чем на уровне ядра. Максимальное использование относительного мембранного резерва клеткой (=19%) и ядром (=21%) отмечали на 30 секунде инкубации в гипотонической среде. В изотоническом растворе клетка использовала =22% мембранного резерва на 60 секунде, а ядро =26% — на 30 секунде инкубации.

Таким образом, адреналиновая нагрузка способствовала увеличению жесткости лимфоцитов больных ХЛЛ также как, и в клетках здоровых, однако объем лимфоцитов больных возрастал в течение первых 30 секунд инкубации в отличие от здоровых (в течение 450 секунд). В условиях

блокады р-адренорецепторов жесткость клеток повышена по сравнению с контролем, но снижена практически в два раза по сравнению с адреналиновой нагрузкой, тем не менее, длительность увеличения объема клетки составляет также 30 секунд, процент используемого мембранного резерва практически одинаков с адреналиновой нагрузкой и составляет =20%.

Несмотря на то, что под влиянием адреналина жесткость мембран лимфоцитов больных ХЛЛ увеличилась так же, как и у здоровых доноров, в гипотонической среде в опухолевых клетках реакции увеличения объема протекали интенсивнее. Однако, при сравнении значений модуля Юнга лимфоцитов между группами больных и здоровых видно, что в условиях адреналиновой нагрузки жесткость лимфоцитов больных ХЛЛ ниже, чем здоровых. Выявленные особенности реакции опухолевых клеток могут быть связаны с аномально регулируемой в них фосфоинозитидной сигнализацией. В экспериментальных работах показано изменение качественного и количественного состава практически всех классов мембранных фосфолипидов, снижение уровня АТФ на фоне повышения нарушения синтеза цАМФ (\Vymann М.Р., БсЬпеЛег Л., 2008). В мембранах лимфоцитов больных ХЛЛ ингибируется активность фосфоинозит специфичной фосфодиэстеразы, катализирующей синтез полифосфоинозитидов (Казарян П.А. с соавт., 2011).

Кальциевая нагрузка. Под влиянием кальциевой нагрузки жесткость клеток увеличилась на 245% (р<0,05), а в пробах с верапамилом - на 167% (р<0,05) по сравнению с контролем (таблица 6).

Таблица 6 - Структурные особенности и механические свойства лимфоцитов больных ХЛЛ

Параметры структур и упруго-эластических свойств поверхности Плазма (контроль) Са2+ Верапамил

Глобулярные выступы высота, нм 17,6±0,9 157,8±14,3* 45,43±3,9*ж

количество 125±1,1 52±1,3* 23±0,3*а

Углубления в мембране диаметр, нм 149,4±12,9 3,65±0,66* 5,65±0,28*

глубина, нм 8,01 ±0,9 37,74±1,06* 23,37±0,15*

количество 40±2,3 20±0,6* 4±0,2*А

Жесткость модуль Юнга, цРа 1,80±0,01 4,42±0,78* 3,01±0,61*

глубина погружения кантилевера, нм 1035,20±7,32 508,58±13,95* 541,19±15,92 *

* Статистически достоверные различия между значениями в пробах с хлоридом кальция и верапамилом по сравнению с плазмой, А с верапамилом по сравнению с кальциевой нагрузкой по критерию Стьюдента прир<0,05.

В рельефе поверхности, как под влиянием кальция, так и верапамила обнаружены сходные реакции - уменьшение числа глобулярных образований и углублений в мембране на фоне увеличения их габаритных размеров.

В условиях Са2+"нагрузки в течение первых 90 секунд инкубации не выявлено реакций изменения объема. Непродолжительное увеличение

объема клетки в течение 30 секунд наблюдали на 120 секунде, а затем объем клетки вновь возвращался к значениям изотонического раствора. В системе клетка-ядро установлена асинхронность в развитии фаз увеличения и уменьшения объема. Реакция регуляторного увеличения объема ядра лимфоцитов больных XJIJI в гипотонической среде протекала на 60 секунд быстрее, чем клетки в целом. При этом длительность фазы уменьшения объема на уровне клетки увеличилась на 210 секунд по сравнению с ядром. Максимальное использование мембранного резерва клеткой (=12%) наблюдали на 510 секунде, при этом ядро задействовало максимум мембранного резерва (=4%) на 270 секунде инкубации в гипотонической среде.

Под влиянием верапамила изменения объема клеток не выявлено в течение первых 60 секунд. 30-ти секундный период увеличения объема клеток наблюдали на 90 секунде воздействия, который сменялся периодом уменьшения объема длительностью 240 секунд. Объем ядра в гипотонической среде уменьшился в течение первых 330 секунд воздействия. На 180 секунде воздействия объем ядра уменьшался, затем следовал 60-ти секундный период восстановления его значений до изотонической среды. В интервале 420-570 секунды объем ядра возрастал. Длительность периода увеличения объема в системе клетка - ядро была одинакова и составила 150 секунд, но реакция увеличения объема ядра реализовалась на 30 секунд позже, чем у клетки в целом. Периоды уменьшения объема ядра совпали по времени с фазами уменьшения объема клетки. Максимальное использование относительного мембранного резерва клеткой (-6%) в гипотонической среде наблюдали на 390 секунде инкубации, ядром (=1,4%) - на 420 секунде.

Таким образом, установленное увеличение жесткости лимфоцитов опухолевых клонов под влиянием экзогенного Са+ и формирование коротких глобулярных выступов в виде инвадоподий, указывает на приобретение ими локомоторного типа. Согласно данным ряда авторов малые ГТФазы из семейства Rho-NWASP-ARP 2/3 под влиянием Са + запускают полимеризацию актина, в результате чего на поверхности формируются инвадоподии (очень короткие выступы, заполненные актином), функциональная роль которых - разрушение экстрацеллюлярного матрикса и образование метастатических дорожек (Hall А., 2005; Kedrin D., 2007).

Длительность реакции регуляторного увеличения объема опухолевых лимфоцитов под влиянием выполненных функциональных нагрузок одинакова и составляет 30 секунд. Под влиянием адреналина, обзидана, Са и верапамила жесткость клеток повышается в 1,5 - 2,7 раза, однако величина вовлекаемого мембранного резерва в регуляцию объема, как в условиях блокады, так и активации элементов аденилатциклазных сигнальных путей составляет =20%, а в условиях активации и блокады Са + сигнальных путей соответственно =12% и =6%. Уменьшение использования мембранного резерва в условиях гипотонической среды под влиянием кальциевой нагрузки связано с наблюдаемым нами явлением сжатия клетки и ядра на

протяжении большего времени инкубации. В литературе представлены данные, что в опухолевых клетках механизм регуляторного уменьшения объема тесно связан с гипотонически индуцированным МЕК 1/2 сигнальным путем (Shen M.G. et al„ 2002).

5. Регуляция объема эритроцитов лягушек в тестах с гипоосмотической и функциональными нагрузками in vitro

Эритроциты лягушек имеют эллипсоидную форму с центрально расположенным ядром. Поверхность клеток в физиологических условиях характеризуется сглаженным рельефом, с преобладанием углублений в мембране. Модуль Юнга эритроцитов лягушек равен 2,37±0,15 рРа.

При инкубации клеток в гипоосмотической среде их объем был снижен на протяжении всего времени инкубации, периоды восстановления их размеров до значений изотонического раствора отсутствовали. Клетки не использовали дополнительные мембранные резервы в регуляции объема. Ядро увеличивалось в объеме практически на протяжении всего времени воздействия. Максимальное использование резерва ядром наблюдали на 270 (=55%) и 1800 (=89%) секундах инкубации.

Адреналиновая нагрузка. Под влиянием адреналина жесткость эритроцитов увеличилась на 64% (р<0,05) (таблица 7).

Таблица 7 - Особенности цнтоархнтектоники эритроцитов лягушек под влиянием адреналина н обзндана

Типы структур поверхности Контроль Адреналин Обзидан

Глобулярные выступы высота, нм 48,12±8,62 170,24±15,60* 34,69±3,70*

количество 24±2,56* 15±1,08* 21 ±2,04

Углубления в мембране диаметр, нм 171,62±12,25 786,12±10,29* 277,67±13,34*4

глубина, нм 16,85±1,25 26,98±2,23* 29,66±1,38*

количество 8±0.2 16±0,4* 9±0,15*А

Жесткость модуль Юнга, цРа 2,37±0,15 3,89±0,01* 2,16±0,05ж

глубина погружения кантилевера, нм 694,92±7,54 209,23±1,50* 693,11±4,14ж

*- Статистически достоверные различия между значениями в пробах с адреналином и обзиданом по сравнению с контролем, А - с обзиданом и адреналином по критерию Стьюдента прир<0,05.

Количество глобулярных выступов уменьшилось на 50% (р<0,05), а их высота возросла на 254% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. таблицу 7).

Под влиянием адреналина в гипоосмотической среде клетка задействовала менее 1% мембранного резерва на поддержание объема, и лишь к концу часовой инкубации около 19% резервных структур было использовано. В изотонической среде клетка задействовала мембранные структуры на протяжении всего времени инкубации. Максимум мембранного резерва (=17%) использован клеткой на 30, 180, 300 и 570 секундах

инкубации. Ядро не использовало мембранный резерв в осморегуляторных реакциях ни в гипо-, ни в изотонической средах.

При инкубации клеток с обзиданом достоверных различий в жесткости клеток между опытными и контрольными пробами не выявлено, однако, по сравнению с адреналином, жесткость эритроцитов снизилась на 80% (Р<0,05).

В условиях блокады р-адренорецепторов клетка не использует мембранные структуры в регуляции объема при снижении осмолярности среды. Объем ядра в гипотонической среде увеличился в интервале 120-300 секунды воздействия, в этот период в регуляцию объема было привлечено =57% мембранных резервных структур.

Кальциевая нагрузка. Под влиянием кальциевой нагрузки жесткость эритроцитов снизилась на 62% (р<0,05) по сравнению с контролем. На поверхности эритроцитарных мембран уменьшилось число глобулярных структур и их высота. Аналогичную картину наблюдали при инкубации клеток с верапамилом (таблица 8).

Таблица 8 — Цнтоархитектоника эритроцитов лягушек под влиянием ионов Са2+и верапамила

Типы структур поверхности Контроль Cai+ Верапамил

Глобулярны е выступы высота, им 48,12±8,62 22,38±2,46* 45,84±6,13

количество 24±2,56 ,18±0,37* 13±0,65*

Углубления в мембране диаметр, нм 171,62±12,25 222,80±17,94* 138,00±13,59

глубина, нм 16,85±1,25 6,13±1,02* 6,30±0,25*

количество 8±0,02 9±0,75 4±0,03*

Жесткость модуль Юнга, дРа 2,37±0,15 1,46±0,08* 1,77±0,12*

глубина погружения кантилевера, нм 694,92±7,54 1797,98±21,25* 1301,84±17,98*

* Достоверность различий между значениями в пробах с Са '/верапамилом и контролем по критерию Стьюдента (р<0,05).

В гипотонической среде объем клетки уменьшался на протяжении всего времени инкубации. В ядре наблюдали смены фаз регуляторного увеличения (длительностью 150 секунд) и уменьшения (длительностью 60 секунд) объема. Максимальное использование мембранного резерва ядром в гипотонической среде (==28%) наблюдали на 570 секунде, в изотоническом растворе (=28%) - на 420 секунде инкубации.

При инкубации эритроцитов с верапамилом с последующим наложением гипоосмотической нагрузки реакций изменения объема в системе клетка-ядро не выявлено.

Таким образом, в тестах с осмотической нагрузкой объем клетки уменьшился, а ядра — увеличился. Аналогичные реакции клеток наблюдали в опытах с функциональными нагрузками, за исключением пробы с адреналином. Под влиянием адреналина ядро не участвовало в реакциях осморегуляции, а клетки использовали дополнительные мембранные структуры. Вероятно, механизм изменения формы эритроцитов и

уменьшения их объема в пробах с гипотонической нагрузкой реализуется посредством влияния внутриклеточного Са2+, концентрация которого увеличивается при снижении тоничности среды (Light D.B. et al., 2002). На ядерных эритроцитах аллигатора показано, что сморщивание клеток в гипотонии сопровождается увеличением концентрации внутриклеточного Са2+ (Pore S., 2009). Посредством кальмодулина Са1 вызывает деполимеризацию маргинальных групп микротрубочек (Gambino G. et al., 1984), и, как следствие, мы наблюдали изменение количества и размеров глобулярных структур на поверхности клетки. Появление в рельефе поверхности мембраны крупных глобулярных образований может быть связано с их внутриклеточным происхождением, в виде эндомембранных пузырьков, которые используются клеткой в механизмах объемной регуляции.

Заключение

Использование клетками мембранного резерва в нагрузочных тестах отчасти зависит от упруго-эластических свойств клеточной мембраны и клетки в целом. Увеличение жесткости лимфоцитов доноров ограничивает скорость реализации реакций регуляторного увеличения и снижения объема, а также определяет величину мембранного резерва задействованного в поддержании объема. Вместе с тем в лимфоцитах больных лейкозом, а также в эритроцитах лягушек, такая зависимость отсутствует.

Использование мембранного резерва клеткой имеет важное компенсаторно-приспособительное значение, направленное на снижение литического напряжения в мембране. Не исключено, что возникновение в процессе эволюции поверхностного резервного бассейна плазмалеммы позволило клеткам высокоорганизованных животных совершать быстрые флуктуации объема в буферном растворе в условиях непродолжительного и незначительного снижения осмолярности среды без привлечения ион-транспортных мембранных переносчиков.

На схеме представлена концепция, обобщающая полученные экспериментальные данные в ходе выполненного исследования с известными научными фактами, представленными в литературных источниках.

Схема. Концепция, обобщающая полученные автором экспериментальные данные, с общеизвестными научными фактами.

ВЫВОДЫ

1. В физиологических условиях осмотической нагрузки лимфоциты реализуют адаптивный комплекс морфофизиологических реакций, направленных на снятие литического «напряжения» в мембране, который проявляется в увеличении высоты глобулярных структур на фоне сокращения их числа. Использование мембранного резерва лимфоцитами в нормальных физиологических условиях для регуляции клеточного объема зависит от жесткости клетки.

2. Установлена возможность регуляторного изменения использования мембранного резерва. Было показано, что повышение жесткости лимфоцитов на 36% под стимулирующим влиянием адреналиновой нагрузки, сопровождается уменьшением использования мембранного резерва, как

клеткой, так и ядром почти в 2 раза. Тогда как снижение жесткости лимфоцитов на 34% в условиях нагружения клеток Са2+ стимулирует увеличение использования мембранного резерва, как клеткой, так и ядром в 1,5 раза.

3. Установленные морфофункциональные свойства лимфоцитов больных хроническим лимфобластным лейкозом позволяют им осуществлять компенсаторно-приспособительные реакции, направленные на улучшение реологических свойств крови в условиях лейкоцитоза, характерного для данного типа заболевания. Поверхность лимфоцитов больных лейкозом имеет «рифленый» характер и представлена обилием глобулярных образований и углублений. Жесткость клеток снижена практически в два раза по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров. Это указывает на их потенциально более высокую деформируемость в путях микроциркуляции.

4. Установлена определенная взаимосвязь между жесткостью клетки и морфологией ее поверхности. Так с увеличением жесткости поверхности нормальных лимфоцитов существенно возрастает число глобулярных структур на фоне снижения их высоты, при снижении жесткости — увеличивается высота глобул при неизменном их количестве.

5. В лимфоцитах больных хроническим лимфобластным лейкозом не установлено тесной зависимости между использованием мембранного резерва в регуляции объема и жесткостью клеточной поверхности. С увеличением жесткости- клетки на 233% под влиянием адреналиновой нагрузки клетка включает только =22% мембранного резерва плазмалеммы и =32% резерва кариолеммы на поддержание своего объема при снижении осмолярности среды. В условиях кальциевой нагрузки жесткость лимфоцитов возрастает на 245%, при этом в регуляции объема используется не более =6% запаса плазмалеммы и =1,5% кариолеммы в условиях гипотонической нагрузки.

6. Морфофизиологические реакции эритроцитов лягушек в гипотонической среде связаны с увеличением числа и высоты глобулярных структур на фоне уменьшения объема клеток в условиях гипотонической нагрузки. Эритроциты лягушек не используют мембранный резерв в осморегуляторных реакциях. Ядро в эти клеточные ответы включает около 89% внутриклеточных резервных структур.

7. Установлена взаимосвязь между изменением упруго-эластических свойств эритроцитов со структурными перестройками поверхности. Увеличение жесткости клеток под влиянием адреналина в 1,8 раза сопровождается снижением числа глобулярных структур с увеличенной высотой, в то время как снижение жесткости поверхности под влиянием обзидана протекает на фоне неизменного числа и высоты глобул. Однако под влиянием верапамила и кальциевой нагрузки снижение жесткости клетки сопровождается уменьшением как числа, так и высоты глобулярных образований поверхности, что свидетельствует об участии элементов

кальциевых сигнальных путей в механизмах перестройки элементов цитоскелета.

8. В эритроцитах лягушек зависимость между жесткостью клетки и интенсивностью использования ею мембранного резерва в механизмах регуляции объема не выявлена. Увеличение жесткости клетки на 64% под влиянием адреналина сопровождается уменьшением объема клеток в гипотонической среде и отсутствием реакций регуляции объема в системе клетка-ядро. Снижение жесткости эритроцитов под влиянием кальциевой нагрузки на 62% сопровождается уменьшением объема клетки в гипотонической среде, при этом ядро задействует -29% резервных структур в регуляции объема.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный инструментарий на базе атомно-силовой микроскопии, позволяющий сканировать на воздухе в полуконтактном режиме («Способ исследования нативных клеток крови» патент РФ 2398234 и «Способ определения упругости клеток крови» патент РФ 2466401), может быть рекомендован для достижения оптимального уровня диагностического обследования больных лейкозом.

2. С целью ранней диагностики нарушения процесса дифференцировки клеточных элементов и прогноза дальнейшего течения лейкозов может быть рекомендован комплексный подход, заключающийся в исследовании рельефа поверхности, объемной морфометрии и упругости лимфобластных форм с использованием инструментария атомно-силовой микроскопии.

Список публикаций по теме диссертации. Монографии (3):

1. Липунова, Е.А. Система красной крови. Сравнительная физиология (монография) / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина // Издательство «БелГУ». - Белгород, 2004. - 216 с. - ISBN 5-9571-0113-3.

2. Липунова, Е.А. Физиология крови: Монографическое исследование / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина // Издательство «БелГУ». - Белгород, 2007. - 324 с. - ISBN 978-5-9571-0305-9.

3. Skorkina, M.Yu. Physiological features of blood's system of frogs Rana Ridibunda Pall.: In Frogs: Genetic Diversity, Neural Development and Ecological Implications. Ed. H. Lambert / M.Yu. Skorkina // Nova Publishers; - New York, USA, 2014. - pp. 137-178. - ISBN 978-1-63117626-5.

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для докторских диссертаций (16):

1. Липунова, Е.А. К методике оценки функционального состояния системы эритрона лягушек / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина // Бюллетень сибирской медицины.-2005.-Т. 4, прил. 1.-С.38.

2. Скоркина, М.Ю. Морфометрическая классификация эритроцитарной популяции лягушек / М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова // Бюллетень сибирской медицины. - 2005 - Т. 4, прил. 1. — С.38-39.

3. Скоркина, М.Ю. Система крови как скрининг-тест экологического состояния окружающей среды / М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова// Проблемы региональной экологии.-2009.-№ 1.-С. 141-146.

4. Скоркина, М.Ю. Сезонная активность эритроцитов лягушек по данным их электрофоретической подвижности / М.Ю. Скоркина, Р.В. Деркачев // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2010. — Т. 46. № 2. -С. 134-137.

5. Скоркина, М.Ю. Нанотехнологические подходы в изучении механических свойств клеточных поверхностей при стимуляции и блокаде адренорецепторов 1 М.Ю. Скоркина, М.З. Федорова, Е.А. Сладкова // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2010. - № 3.-С. 153-155.

6. Скоркина, М.Ю. Методика оценки морфометрических параметров нативных клеток крови с использованием АСМ / М.Ю. Скоркина, С.Д. Чернявских, М.З. Федорова, H.A. Забиняков, Е.А. Сладкова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2010. - Т. 150. №8.-С. 238-240.

7. Скоркина, М.Ю. Сравнительная оценка морфофункциональных характеристик нативных и фиксированных эритроцитов / М.Ю. Скоркина, М.З. Федорова, С.Д. Чернявских, H.A. Забиняков, Е.А. Сладкова//Цитология.-2011.-Т. 53,№1.-С. 17-21.

8. Скоркина, М.Ю. Цитоархитектоника лимфоцитов здоровых доноров в условиях активации и блокады ß-адренорецепторов / М.Ю. Скоркина, М.З. Федорова, A.B. Муравьев // Ярославский педагогический вестник. Серия естественные науки. - 2011.-№ 3.— T.III.-С. 104-109.

9. Скоркина, М.Ю. Осморегуляторные реакции эритроцитов лягушек в условиях активации и блокады Са2+ каналов / М.Ю. Скоркина // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2012. - Т. 48, № 2. — С. 126-129.

10.Скоркина, М.Ю. Динамические изменения рельефа поверхности лимфоцитов при снижении осмолярности среды / М.Ю. Скоркина, М.З. Федорова, Е.А. Сладкова, Л.А. Косьминова // Научные ведомости БелГУ. - 2012.-№ 9,-С. 95-103.

11.Скоркина, М.Ю. Мембранный резерв лимфоцитов в условиях кальциевой нагрузки / М.Ю. Скоркина, М.З. Федорова, A.B. Муравьев // Ярославский педагогический вестник. Серия естественные науки. — 2012. - Т. III, №2. - С. 109-114.

12.Скоркина, М.Ю. Использование наномеханического сенсора для изучения морфофункциональных свойств лимфоцитов здоровых доноров и больных хроническим лимфобластным лейкозом / М.Ю.

Скоркина, М.З. Федорова, A.B. Муравьев, Е.А. Сладкова // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012. - № 3. - С. 172-175.

13.Скоркина, М.Ю. Физиологические механизмы регуляции объема лимфоцитов в условиях гипотонической нагрузки / М.Ю. Скоркина, A.B. Муравьев // Ярославский педагогический вестник. Естественные науки. - 2013. - Т. III, № 1. - С. 79-85.

14.Сладкова, Е.А., Структурно-функциональные особенности лимфоцитов больных лимфобластным лейкозом / Е.А. Сладкова, М.Ю. Скоркина // Цитология. - 2013. - Т. 55, № 6. - С. 388-393.

15.Сладкова, Е.А., Морфофункциональные особенности клеток крови в условиях опухолевого роста / Е.А. Сладкова, М.Ю. Скоркина, H.A. Забиняков // Биомедицина, 2013. -№ 3. -С. 67-73.

16.Сладкова, Е.А. Оценка поверхностного потенциала лимфоцитов больных лейкозом методом зонда Кельвина / Е.А. Сладкова, М.Ю. Скоркина // Биофизика. - 2014. - Т. 59. Вып. 2. - с. 310-313.

Патенты на изобретения и полезные модели (6):

1. Патент на изобретение РФ № 22347 «Способ идентификации субпопуляций эритроцитарной системы», заявка № 2002134029, дата приоритета 17.12.02. Авторы: Липунова Е.А., Скоркина М.Ю., Никитин В.М., Чеканов В.А. // Бюллетень изобретения и полезные модели. - 2004. - Ч. III. № 23. - С. 573.

2. Патент на изобретение РФ № 2268463 «Способ оценки активности эритропоэза», заявка № 2004111098, дата приоритета 12.04.04. Авторы: Скоркина М.Ю., Липунова Е.А., Зеленцова A.C., Никитин В.М. // Бюллетень изобретения и полезные модели — 2006. - Ч. VII. № 2. - С. 1979.

3. Патент на изобретение РФ. № 2350952 «Способ определения реактивности эритроцитов крови», заявка №2007124991, дата приоритета 03.09.2007. Авторы: Скоркина М.Ю., Липунова Е.А., Никитин В.М.

4. Патент на изобретение РФ № 2398234 «Способ исследования нативных клеток», заявка № 2009125268, дата приоритета 01.07.2009. Авторы: Федорова М.З., Скоркина М.Ю., Чернявских С.Д., Сладкова Е.А., Забиняков H.A.

5. Патент на полезную модель РФ № 98248 «Влажная камера для исследования нативных клеток крови», заявка № 2010105541, дата приоритета 16.02.2010. Авторы: Скоркина М.Ю., Чернявских С.Д., Федорова М.З.

6. Патент на изобретение РФ № 2466401 «Способ определения упругости клеток крови», заявка № 2011109741 от 15.03.2011. Авторы: Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Сладкова Е.А., Забиняков H.A.

Статьи в журналах и материалы международных научных конференций (32):

1. Скоркина, М.Ю. Биометрические параметры эритроцитов амфибий при гипоосмотической нагрузке / М.Ю. Скоркина, A.C. Зеленцова, М.Н. Гончаренко, В.В. Чернышев // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. - Томск, 2004. -№ 1-3. - С. 180-182.

2. Скоркина, М.Ю. Разновозрастная гетерогенность эритроцитарной популяции лягушек в физиологических условиях / М.Ю. Скоркина // Материалы VIII Международной школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XIX века». - Пущино, 2004. - С. 129.

3. Скоркина, М.Ю. Влияние гипоосмотической нагрузки на устойчивость эритроцитарных мембран / М.Ю. Скоркина // Современные наукоемкие технологии. - 2004. - №.1. - С. 94-95.

4. Скоркина, М.Ю. Резистентность эритроцитов лягушки Rana ridibunda L. в физиологических условиях / М.Ю. Скоркина, A.C. Зеленцова, A.B. Проскурнин // Материалы VIII Междунар. науч. экол. конф. «Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем» — Белгород, 2004. - С. 67-68.

5. Скоркина, М.Ю. К методике оценки геометрических параметров эритроцитарной популяции у лягушек / М.Ю. Скоркина, A.C. Зеленцова // Фундаментальные исследования. — 2004. - № 4. - С. 100101.

6. Скоркина, М.Ю. Морфофункциональные особенности эритроцитов лягушек Rana ridibunda L. в физиологических условиях / М.Ю. Скоркина, A.C. Зеленцова // Успехи современного естествознания. -2004. —№ 8. — С.110.

7. Скоркина, М.Ю., Регуляторные возможности эритроцитов лягушек в условиях адреналиновой нагрузки in vitro / М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова, A.C. Зеленцова // Материалы международной конференции «Гемореология в микро- и макроциркуляции». — Ярославль: Изд-во ЯГПУ, 2005.-С. 209.

8. Скоркина, М.Ю. Оценка функционального состояния системы красной крови лягушек R. ridibunda L. в условиях естественного водоема / М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова, A.C. Зеленцова, М.С. Кузнецов, М.Н. Гончаренко // Материалы II Всероссийской научной конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием). - Москва: Научный центр сердечнососудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, 2005. — С. 302-303.

9. Липунова, Е.А. Сезонная активность эритрона лягушек рода Rana / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, A.C. Зеленцова // Научные труды I съезда физиологов СНГ / под ред. Г.И. Сепиашвили. - М.: Медицина-Здоровье. - 2005. - Т.2. - С.94.

10.Скоркина, М.Ю. Эколого-физиологические особенности гемопоэза лягушек / М.Ю. Скоркина, A.C. Зеленцова, М.С. Кузнецов, В.Н. Шишков // Материалы X Международной школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». — Пущино, 2006. — С. 163.

11 .Липунова, Е.А. Реологические свойства эритроцитов крови в условиях активации и блокады мембранных кальциевых каналов / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, A.C. Зеленцова // Материалы конференции «Гемореология и микроциркуляция (от молекулярных мишеней к органным и системным изменениям)». - Ярославль, 2007. - С. 163.

12.Скоркина, М.Ю. Физиологические механизмы регуляции устойчивости эритроцитарных мембран в условиях кальциевой нагрузки / М.Ю. Скоркина // Тезисы докладов XX.съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва, 2007. - С.418.

13.Липунова, Е.А. Функциональная морфология эритроцитов лягушек в условиях адреналиновой нагрузки / Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина, A.C. Зеленцова, Т.А. Резанова // Тезисы докладов XX съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва, 2007. — С.307.

14.Skorkina, М. Yu. The method determining the functional condition of erythropoesis in frogs / M.Yu. Skorkina, E.A. Lipunova, A.S. Zelencova // European Journal of natural history. — 2007. — № 2. — P. 64.

15.Скоркина, М.Ю. Структурная лабильность эритроцитарных мембран лягушек и регуляторные процессы при адреналиновой нагрузке in vitro / М.Ю. Скоркина, Е.А. Липунова, A.C. Зеленцова // Вестник БелГУ. — 2007. - С. 72-74.

16.Скоркина, М.Ю. ЭФПЭ лягушек рода Rana — гомеостатический параметр в период физиологического анабиоза / М.Ю. Скоркина, Р.В. Деркачев // Материалы 11-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». — Пущино, 2007. - С. 273.

17.Липунова, Е.А. Регуляция формы и объема эритроцитов в условиях гипоосмии при блокаде Са2+ каналов верапамилом /Е.А. Липунова, М.Ю. Скоркина // Материалы Международного конгресса ветеринарных фармакологов «Эффективные и безопасные лекарственные средства». - СПб, 2008. — С. 90-91.

18.Скоркина, М.Ю. Физиологический профиль эритроцитарной системы лягушек рода Rana / М.Ю. Скоркина, Е.А. Сладкова// Науки о человеке: материалы IX конгресса молодых ученых и специалистов / под ред. Л.М, Огородовой, Л.В. Капилевича. — Томск: СибГМУ, 2008. — С. 104-106.

19.Скоркина, М.Ю. Влияние адреналиновой нагрузки на параметры системы крови лягушек / М.Ю. Скоркина // Материалы VII Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция».— Ярославль: ЯГПУ, 2009. - С. 64.

20.Скоркина, М.Ю. Морфометрический профиль эритроцитов крови лягушек в условиях блокады ß-адренорецепторов / М.Ю. Скоркина II Тез. Докладов VIII Молодежной научной конференции Коми УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике». — Сыктывкар, 2009. — С. 182-184.

21.Скоркина, М.Ю. Влияние низких температур на активность системы эритрона лягушек / М.Ю. Скоркина, Е.А. Сладкова // Сб. ст. Международной научно-методической конференции, посвященной 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина «Современные проблемы эволюционной биологии». — Брянск, 2009. — С.228-234.

22.Скоркина, М.Ю. Морфология очагов гемопоэза лягушек в весенне-летний период / М.Ю. Скоркина, Е.А. Сладкова // Сборник тезисов 13-ой Международной школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». - Пущино, 2009. - С. 121.

23.Скоркина, М.Ю. Упругие свойства клеток крови больных лейкозом / М.Ю. Скоркина, М.З. Федорова, Е.А. Сладкова, H.A. Забиняков // Сб. мат. III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010». - Москва, 2010.-Т. 1.-С. 349-352.

24.Скоркина, М.Ю. Оценка адгезионных свойств клеток крови методом АСМ / М.Ю. Скоркина, Е.А. Сладкова, 3. Май Бить // Тезисы докладов XXI съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. - Москва -Калуга: типография ООО «БЭСТ-принт», 2010. - С. 562.

25 .Скоркина, М.Ю. Цитоархитектоника мембран лимфоцитов больных лимфобластным лейкозом при снижении осмолярности среды / М.Ю. Скоркина, В.В. Демченко, J1.X. Нгуен Тхи, 3. Май Бить // Тезисы докладов 8 Международной конференции «Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология». — Ярославль, 2011.-С.21.

26.Сладкова, Е.А. Оценка микрорельефа клеточной поверхности при стимуляции ß-адренорецепторов / Е.А. Сладкова Е.А., М.Ю. Скоркина М.Ю. // Материалы XVII Российского симпозиума по РЭМ и аналитическим методам исследования твердых тел. - Черноголовка, 2011.-С. 264.

27.Скоркина, М.Ю. Структурно-механические свойства эритроцитов лягушек в условиях адреналиновой нагрузки / М.Ю. Скоркина, В.В. Демченко, Л.Х. Нгуен Тхи, 3. Май Бить // Материалы XIV Международного совещания и VII школы по эволюционной физиологии, посвященные памяти академика Л.А. Орбели. - Санкт-Петербург, 2011. - С. 173.

28.Скоркина, М.Ю. Морфология мембран лимфоцитов здоровых доноров при снижении осмолярности среды / М.Ю. Скоркина, Е.А. Сладкова, В.В. Демченко, Л.Х. Нгуен Тхи, 3. Май Бить // Научные труды III съезда физиологов СНГ. - Ялта, 2011. — С. 82.

29.Скоркина, М.Ю. Влияние кальциевой нагрузки на морфофункциональные свойства лимфоцитов / М.Ю. Скоркина // Материалы VII Сибирского съезда физиологов. — Красноярск, 2012. — С. 480-482.

30.Скоркина, М.Ю. Участие элементов аденилатциклазных сигнальных путей в реакциях осморегуляции лимфоцитов здоровых доноров и больных XJIJI / М.Ю. Скоркина // Тезисы докладов IX Международной конференции «Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология». - Ярославль, 2013. — С. 46.

31. Скоркина, М.Ю. Влияние митогенов на миграционную активность лимфоцитов здоровых доноров и больных лейкозом / М.Ю. Скоркина, Е.А. Шамрай // Тезисы докладов XXII съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. — Волгоград: изд-во ВолГМУ, 2013. — С. 485.

32.Скоркина, М.Ю. Регуляция объема лимфоцитов больных лейкозом в тестах с осмотической нагрузкой in vitro / М.Ю. Скоркина, Г.Н. Клочкова, Е.А. Шамрай // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной памяти профессора Е.С. Ларина «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных функций в норме и при патологии». - Томск: СибГМУ, 2013. - С. 124127.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АСМ - атомно-силовая микроскопия

АСС — атомно-силовая спектросокпия

ХЛЛ — хронический лимфобластный лейкоз

ПКС — протеинкиназа С

ТФИ — трифосфоинозитид

ЭПС - эндоплазматическая сеть

DAG - диацилглицерол

Р1Р2 - инозитол - 4, 5- бифосфат

Р1Р3 — инозитол — 1,4,5-трифосфат

Подписано в печать 27.08.2014г. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Усл.печ.л.1,0.Уч.-изд. л. 2,5. Тираж 100 экз. Заказ № 20157 Отпечатано в типографии «ПринтМастер» 308012 г. Белгород, ул. Костюкова 16 а