Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к кислотостабильному ингибитору протеиназ мочи человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к кислотостабильному ингибитору протеиназ мочи человека"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

БЕККЕРТ РАЛЬФ

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К КИСЛОТОСТАБИЛЬНОМУ ИНГИБИТОРУ ПРОТЕИНАЗ МОЧИ ЧЕЛОВЕКА

0 3.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученоя степени кандидата медицинских наук

Москва - 1991

Работа выполнена в группе специфической плазмосорбции проте-иназ и лаборатории клеточной инженерии Института экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Оглоблина О.Г.

Научный консультант: кандидат биологических наук,

Власик Т.Н.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, проф. Яровая Г.А. кандидат биологических наук, Ефремов Е.Е.

Ведущее учреждение; Научный-производственный центр

медицинской биотехнологии МЗ СССР.

Защита диссертации состоится " /.. ." ГТ^г-. 1 992 года

в ./У. часов на заседании специализированного ученого совета К 001.22.02 во Всесоюзном кардиологическом научном центре АМН СССР по адресу: Москва, 3-я Черепковская улица, д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР.

199*.!

Автореферат разослан ". .-г. " . 199Д^года

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Венгерова Т.Н.

ии зртаций ]

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Большое место а медицинской биохимии занимают фундаментальные исследования механизмов инициации жизненно важных процессов на молекулярном уровне, в которых важную роль играют протеолитические ферменты. Было показано их участие в таких биологических процессах как деление и рост клеток, злокачественная и вирусная трансформация клетки, реакции иммунного ответа, развитие ряда патологических состояний, в частности воспалительного характера. Знания о механизмах действия протеиназ и их ингибиторов используются при изучении патологических состояний, при исследовании механизмов и разработке новых методов их лечения.

Большую информативную ценность, как показали исследования последних лет, имеет определение концентрации и антипротеолити-ческой активности кислотостабильного ингибитора трипсина из мочи человека (мочевой трипсиновый ингибитор [МТИ]) - белка, по-видимому обладающего противовоспалительной функцией, а также являющегося маркером диссиминированных форм рака, септических состояний, болезней почек. В крови человека найдена молекула с идентичной первичной структурой, так называемый "сывороточный ингибитор трипсина" (СТИ). Концентрация СТИ и МТИ многократно возрастает в крови и моче при острых воспалительных состояниях, сепсисе, при нарушении функции почек (нефритах) и диссиминированных формах рака, что может быть результатом острофазного биосинтеза СТИ или ограниченного протеолиза молекул интер-альфа-ингибитора трипсина плазмы крови, в структуру которого входит МТИ. Высокие концентрации МТИ в моче при этих патологических состояниях, по-

видимому, являются следствием фильтрации СТИ почками. Высокие концентрации МТИ обнаружены также в моче беременных женщин.

В связи с вышесказанным достаточно актуальным является создание диагностикума для детектирования МТИ в биологических жидкостях, а также разработка методов получения МТИ с перспективой создания на их основе лекарственных средств.

Цель и задачи исследования. Получить моноклональные антитела (монАТ) против трипсинсвязываюиего домена кислотостабильного ингибитора трипсина из мочи человека (МТИ), разработать на основе этих монАТ лабораторный (макетный) вариант конкурентного иммуно-ферментного анализа содержания МТИ в моче доноров и больных нефритами в условиях стационара, а также разработать на основе этих монАТ иммуносорбент для количественного выделения из мочи человека МТИ, используемого в разработке новых лекарственных средств. Задачи исследования.

1) Получениз гибридом, производящих антитела к МТИ.

2) Характеристика монАТ. Отбор антител к трипсинсвязывающему домену МТИ.

3) Разработка лабораторного варианта конкурентного ИФА с использованием монАТ к трипсинсвязывающему домену МТИ для его определения в моче здоровых доноров и больных нефритами.

4) Разработка высокоэффективного иммуносорбента на основе монАТ М2 для препаративного выделения МТИ из мочи человека.

Научная новизна работы. Впервые получены монАТ к трипсин-связывающему домену МТИ. Впервые создан лабораторный вариант ИФА МТИ на базе монАТ против трипсинсвязывающего домена МТИ, позволяющий получить достоверные данные о содержании МТИ как в моче здоровых доноров, так и у больных без и с нарушениями функций по-

чек. Показано, что при помощи созданного лабораторного варианта ИФА МТИ возможно выявлять доклиническую стадию нарушения фунции почек, при которой традиционные биохимические методы еие не позволяют определить каких-либо сдвигов в фунционировании почек.

Разработан новый высокоэффективный иммуноаффиный сорбент для количественного выделения из мочи человека МТИ, используемого в разработке новых лекарственных форм на ЭПМБП при ВКНЦ АМН СССР. Новый сорбент позволяет сохранить нативную форму молекулы МТИ при выделении ее из мочи.

Практическая ценность работы. Разработан простоя . иммунофер-ментный метод определения МТИ в моче здоровых доноров и больных, позволяющий проводить широкий скрининг населения с целью раннего выявления нарушения функции почек. Использование разработанного лабораторного варианта ИФА позволяет достоверно различать концентрации МТИ у здоровых доноров, у больных нефритами как на доклинической, так и клинической стадиях заболевания.

Предложен новый более эффективный, чем существующие, способ выделения МТИ из мочи человека, способствующий сохранению в ходе выделения нативной структуры белка.

Апробация работы. Диссертация "апробирована на межлабораторном семинаре института экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР (Москва, 1991). Материалы работы доложены на II Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диаг-ностикумов" (Москва, 1990 ) .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Структура й объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результа-

ты", "Обсуждение результатов", "Выводы", "Приложение" и "Список литературы". Объем работы 142 страницы машинописного текста, она содержит 23 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает 159 ссылок на советских и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для получения монАТ мышей линии BALB/c иммунизировали препаратом МТИ внутрибрюшинно в течение 3 недель с интервалом в 7 дней. Слияние спленоцитов иммунизированных мышей с мышиной миело-мой P30-i и клонирование гибридных клеток проводили по Koehler и Milstein (1975). Для получения препаративных количеств монАТ гибридные клетки выращивали в брюшной полости мышей линии BALB/c. Антитела из асцитных жидкостей выделяли с помошью преципитации Na2so4 и последуюией анионообменноя хроматографии. Чистоту препаратов монАТ проверяли с помошью градиентного электрофореза в ПААГ ПО Laemml 1 ( 1970) .

Для определения содержания антител в сыворотке крови, куль-туральных средах и хроматографических фракциях использовали твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) с МТИ, адсорбированным на твердой фазе.

Определение изотипов полученных монАТ проводили методом им-мудиффузии по Ухтерлони, используя набор реактивов для определения изотипов мышиных иммуноглобулинов фирмы Miles (США). Все описываемые в настоящей работе монАТ принадлежали к подклассу IgGl.

Для использования в ИФА монАТ коньюгировали с активированной Naio^ пероксидазой хрена. Для выявления комплексов коньюгирован-ных с пероксидазой хрена монАТ с антигеном использовали субстрат ортофенилендиамин.

- о -

Способность антител, взаимодействовать с МТИ в жидкой фазе, с трипсинсвязываюиим доменом МТИ, а также с интер-альфа-ингибитором трипсина была определена методом конкуренции за одинаковый антитело-связываюиий эпитоп. Трипсинсвязываюыий домен МТИ получен к.б.н. Л.А.Беловой по методу Оглоблиноя и соавт. (1987).

МТИ в моче человека определяли конкурентным ИФА.

Исследовали образцы мочи 17 здоровых доноров (10 женщин 19-39 лет, 7 мужчин - 2 2-4 2 года), 7 беременных женшин (ill триместр беременности - 18-29 лет) без нарушений функций почек, б беременных женшин (ill триместр беременности - 20-31 лет) с нефропатиями, 8 больных нефритами (5 мужчин - 35-63 года, 3 женщины - 4 2-60 лет) с достаточной функцией почек и 9 больных нефритами (6 мужчин - 5 2-65 года, з женщины - 48-62 года) с недостаточной функцией почек. Функцию почек у больных нефритами оценивали по данным анализа мочи. Достаточная функция почек определялась значениями клубочковой фильтрации почек свыше 6 0 мл/час, удельной массой мочи свыше 1,018 , уровнем креатинина в крови ниже 150 мкМ. Недостаточная функция почек выражалась значениями клубочковой фильтрации почек ниже 6 0 мл/час, удельной массой мочи ниже 1,018 и уровнем креатинина в крови выше 150 мкМ. Гломерулонефрит и пиелонефрит диагностировались на основании ультразвуковых исследований и анализов биоптатов почки.

Антитриптическую активность мочи человека измеряли по ингибированию BzArgOEt-эстеразной активности трипсина.

При синтезе иммуносорбента для выделения МТИ из мочи человека препарат монАТ пришивали к ВrCN-активированной Sepharose 4В.

Выделение МТИ из мочи человека с помощью иммуносорбента

- g -

проводили двухстадийным способом с использованием предколонки Иммотин с целью предотврамения протеолиза лиганда протеиназами биологической жидкости. Полученный после иммуноаффиной очистки препарат МТИ исследовали в условиях SDS-ПААГ-электрофореза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полчение монАТ к МТИ.

В качестве антигена использовали препарат МТИ 97Х-ной чистоты. проявлявший в условиях электрофореза в sds-ПААГ характерный для МТИ полиморфизм по молекулярным массам (Gebhard, Hoch-strasser. 1986). При помощи денситографического анализа электро-фореграммы определяли среднюю молекулярную массу препарата (2870 0 да) .

Как известно, молекулярные формы МТИ функционально не различаются, так как представляют собой активный двухдоменный фрагмент плюс нефункциональный гликопептид различной протяженности (см.рис. 1) .

В результате гибридизации спленоцитов иммунизированной МТИ мыши линии вALB/с с клетками мышиной миеломы получали несколько гибридных клонов, синтезирующих антитела против МТИ, адсорбированного на пластике. Ориентируясь на уровень связывания культу-ральных сред клонов с МТИ, для дальнейших исследований были выбраны 3 гибридомных клона. Антитела, синтезируемые этими клонами, были получены в препаративных количествах (по 50-100 мг чистых монАТ). Чистота полученных антител контролировалась методом sds-ПААГ-электрофореза.

При анионнообменной хроматографии растворенного осадка после высаливания асцитов клонов В6 и PI получали типичные кривые элю-

ции; кривая элюции клона М2 сила нестандартна и состояла из трех пиков, причем активность в ИФА была обнаружена во 2 и 3 пике. Характер этой кривой сохранялся и при очистке асиитов после четвертого клонирования, что практически исключает возможность "немо -ноклонности" гибридомной культуры М2. При анализе электрофоре-граммы (БОБ-ПААГ) второго и третьего пиков элюции антител с колонки было обнаружено, что во втором пике содержатся два четко разделяющиеся компонента, соответствующих Мг около 25 кЛа, которые, по-видимому, представляют собой две различные легкие цепи имму-ноглобулинов. В третьем пике присутствует только один компонент, соответствующий М^ 2 5 кДа. Этот факт можно трактовать следующим образом,- при образовании генного состава гибридной клетки после слияния лимфоцита и клетки миеломы не срабатывает механизм нор-мального подавления одного из двух аллелей гена, отвечающего за образование легких цепей иммуноглобулинов (торможение аллель-ного исключения). В результате клетка производит две различные легкие цепи, одна из которых с образующейся тяжелой цепью собирается в специфическое антитело, а другая, собираясь с тяжелой цепью, формирует не активное антитело.

В дальнейшей работе использовали моноклональные антитела М2 , содержавшиеся в 3 пике.

Для выбора монАТ с целью разработки иммуноферментной системы для определения в моче человека МТИ важно было определить, какое из полученных монАТ с наименьшей константой диссоциации взаимодействует с молекулой МТИ. Для этого использовали косвенный метод - сравнение кривых связывания монАТ В6, М2 и Р1 в непрямом твердофазном ИФА, а также ряд последовательных разведений растворов меченных пероксидазой крена монАТ Вб, М2 и Р1 в прямом

твердофазном ИФА с МТИ.

Наибольшее сродство к твердофазному МТИ имели монАТ М2, для которых концентрация в точке полумаксимального связывания с антигеном в случае неконьюгированного моИАТ была в з, а в случае коньюгированного монАТ - в десятки раз ниже чем для монАТ Вб и Р1,

Обязательное требование к антителам, необходимым для разработки ИФА МТИ в моче - это связывание в районе трипсинсвязываю-щего ломена МТИ, так как в условиях in vivo в моче эта молекула может разлагаться до сохраняющего свои функции трипсинсвязываю-шего домена (см.рис. 1). В связи с этим иммуноферментное выявление трипсинсвязываюмего домена МТИ должно давать представление об истинном содержании МТИ в биологической жидкости.

При исследовании коньюгатов монАТ М2, В6 и Р1 с пероксидазои хрена в конкурентном ИФА с присутствующим в жидкой фазе трип-синсвязываюиим доменом МТИ сродство к этому домену проявляли только монАТ М2 (см.рис. 1). В дальнейшем в данной работе использовали антитела М2 как наиболее соответствующие решению поставленных задач.

Свойства монАТ М2

Результаты по конкуренции МТИ в растворе и МТИ, адсорбированного на плашке, за связывание с М2 представлены на рис. 2. Как видно из рис. 1 и 2, концентрация МТИ и трипсинсвязываюшего домена в жидкой фазе, соответствующие полумаксимальному связыванию антител с твердофазным МТИ, близки.

Таким образом, обнаруженное эффективное связывание монАТ М2 с МТИ, как сорбированным на твердой фазе, так и в жидкой фазе,

м

п ■и

и о г

. р с

1,2

е 0,6

0,0

- г ^

Л" {

л/ /

У А/?

_ г 1 . J, , 1

12,00 0,75 0,045

концентрация трипсннсвязывагщаго доаена, ИЕ/нл

рис.1 Схема структуры МТИ. Связывание коньюгата конАТ М2-перок-сидаза хрена с трипсинсвязывающим доменом МТИ С конкуренция трипсинсвязыэаюцего домена МТИ в растворе и МТИ, адсорбированного на плаыке, за связывание с коньюгатом монАТ М2-пероксидаза хрена С количество внесенного для адсорбции МТИ: 1 мкг/лунка; двукратные разведения трипсинсвязываю-щего домена),

1 о -

< и

N 3

с. в

г

2,88 0,18 0,011

концентрация ЫТИ, ИЕ/ил

I I_I_I I

8000 500 31

концентрация МТИ, нг/цл

1—1_1_I_1

280 17,4 1,09

концентрация ЫТИ, нЫ

рис.2 Связывание конюгата монАТ М2-пероксидаза хрена с МТИ в

жидкой фазе С конкуренция МТИ в растворе и МТИ, адсорбированного на плашке, за связывание с М2; количество внесенного для адсорбции МТИ: 1 мкг/лункаЭ.

позволило моделировать вариант конкурентного ИФА содержания МТИ в биологических жидкостях. Об эффективности связывания монАТ М2 с МТИ свидетельствует значение константы диссоциации их комплекса,

_ д

имеющей порядок 10 м, полученной методом с использованием координат Скэтчарда.и меченных 1251 монАТ М2.

Учитывая то, что МТИ присутствует в биологических жидкостях в свободном виде и в виде депо-формы, а именно интер-альфа-инги-битора трипсина (см. рис. 3), принципиальным вопросом в определении специфичности монАТ М2 явилось определение перекрестной реакции коньюгата монАТ М2-пероксидаза с интер-альфа-ингибитором трипсина.

Было обнаружено эффективное связывание монАТ М2 с интеральфа-ингибитором трипсина, причем точки полумаксимального связывания монАТ М2 с твердофазным МТИ для жидкофазных интеральфа-ингибитора трипсина и МТИ близки (см. рис. 3).

Эти результаты являются дополнительным подтверждением структурной общности МТИ и интер-альфа-ингибитора трипсина, и доказывают возможность определения МТИ с использованием монАТ М2 как в свободном виде, так и в виде депо-формы.

ИФА содержания МТИ в моче

Результаты, полученные на предыдущем этапе работы, послужили базой для разработки метода определения МТИ в моче на основе конкуренции МТИ в жидкой фазе и МТИ, адсорбированного на плашке, за связывание с коньюгатом монАТ М2 в растворе.

На рис. 4 представлена схема конкурентного ИФА содержания МТИ в моче.

На первом этапе МТИ адсорбировали на плашке и проводили

*

Г

х

N 0\

X

а с

<

с

к а и и о

У

с

о

480 7,5 0,12

концентрация И*И, ию-/ил

1—1.

-1_|

280. 41,7 0,6§

концентрация И*И, нМ

рис.3 Структура И И, в структуру которого за счет гликозаминогли-кановой сшивки входит МТИ.

Связывание конюгата монАТ М2-пероксидаза хрена с И И в жидкой фазе С конкуренция И.И в растворе и МТИ, адсорбированного на планке, за связывание о М2; количество внесенного для адсорбции МТИ; 1 ккг/лункаЭ.

КОНЫОГАТ

МОЧА

оо

Оч

чо

од

I I с: V ЕСТРАТ

-У

и

"Ж

3 ЭТАП

1 3

рнс.4 Схема определения в моче человека МТИ.

блокировку свободных мест связывания. На втором этапе проводилу инкубацию с растворами, содержащими МТИ (моча и стандартные растворы), и коньюгатом монАТ М2 с пероксидазой. На третьем этапе, используя хромогенный субстрат (о-фенилендиамин) , проводили количественное определение коныогата, связавшегося с МТИ на твердой фазе в результате конкуренции.

При ИФА содержания МТИ в пробах мочи в качестве стандартного использовали раствор, содержащий известное количество высокоочи-иенного препарата (97%) МТИ в буферном растворе. С этой целью простыми двухкратными разведениями прямо в рабочей плашке для ИФА готовили стандартные концентрации МТИ -0, 1,25, 2,5, 5,0 и 10,0 мкг/мл. В данном диапазоне концентраций был расположен линейный участок кривой титрования МТИ на плашке. Такая калибровочная кривая позволяет определять искомые концентрации антигена в пробах мочи.

Полученные калибровочные кривые отвечали важнейшему для диагностики патологии почек требованию - необходимости перекрывания линейным участком кривых (в линейных координатах) диапозона концентрации МТИ в моче здоровых людей и больных с почечной недостаточностью (от 0 до 10 мкг/мл).

Работа с неохарактеризованными пробами человеческой мочи делает необходимым исследование этих проб в широком диапазоне возможных концентраций. Важно, чтобы возможные эстинкции попали в ту область, в которой лежат экстинкции стандартных образцов. Мы выбрали трехкратные разведения проб мочи, начиная с половины от исходной концентрации. Опыт работы с пробами показал, что четыре разведения (в 2, б, 18, 5 4 раз) охватывают все встречающиеся в исследуемых образцах концентрации МТИ, как низкие (в случае проб

очи здоровых доноров), так и высокие (в случае проб мочи ольных).

Точность конкурентного ИФА для определения МТИ в моче чело-ека характеризовали коэффициентами внутридневной и междневной ариабельности, составившими Ю-13Х и 15-19* соответственно.

Такие коэффициенты вариабельности мы считали удовлетвори-ельными, так как при выявляемых данными методами почечных пато-огиях концентрация МТИ отличается от нормальной в 7 и более раз.

На рис. 5 представлены данные ИФА содержания МТИ в моче доровых доноров и больных. Исследовали образцы мочи 17 здоровых иц, 7 беременных женщин 3-его триместра без нарушений функций очек, 7 беременных женкин с нефропатиями, 8 больных нефритами ез нарушения концентрационной и азотовыделительной функции по-гк, 9 больных нефритами с нарушениями указанных функций почек.

Из рисунка видно, что достоверные превышения нормального эовня МТИ были выявлены в моче беременных с нефропатиями - в 7 аз, и больных нефритами с достаточной и недостаточной азотовыде-^тельной и концентрационной функцией почек - соответственно в 8 70 раз.

Известные в настоящее время биохимические маркеры раннего арушения функции почек, обусловленного деструкцией их паренхимы активность В-глюкуронидазы, арилсульфатазы А, лактатдегидрогена-,1, концентрация В2-микроглобулина), также выявляют различия гжду нормой и доклиническими нарушениями фунции, однако эти ззличия выражены не так ярко, как разница в содержании МТИ в эче.

Наиленные достоверные многократные различия в содержании МТИ

250

*

а а

о у

о а

23

н

и о. н

о

3

125

(р1>5 < 0,05)

0?1,4 < 0,01) (р1>3 < 0,05)

г-*

I 2 3 4 5

грутш;! больных здоровые ¿споры (п - 17) беременное третьего ар^остра беременности без нарушений почек (п = 7) беременн;.: третьего тркиостра бороцоцности с нефрспатия«;: (г. = 6) больные нефркте;«и

без поручений фуихций почек, (г, -.8) больные нефрктаии

с нарушениями функций почок (п = 9)

рис,5 Распределение данных иммунофарментного определения содер-содерхания МТИ у здоровых доноров, беременных третьего' триместра беременности и больных нефритами.

I моче для групп доноров и больных нефритами особенно существен-!Ы, т.к. свидетельствуют о перспективности детальной разработки

[редложенного метода с целью доклинического выявления нарушения

«

>ункции почек.

При сценке возможностей новых методов определения каких-либо биохимических параметров как правило проводят сравнение результатов, получаемым новым методом, и каким-либо известным ранее мето-ом. В данной работе методом сравнения явился предложенный ранее глоблиной и соавт. (1984-1989) метод спектрофотометрического пределения МТИ в моче, позволяющий определять суммарный пул олекул МТИ, как связанных в комплекс с какой-либо молекулой ротеазы, так и свободных.

На рис. 6 приведена корреляция данных спектрофотометрическо-о и ммуноферментного методов определению МТИ в моче человека, айденное значение коэффициента корреляции является достаточно

ЫСОКИМ: г = 0,84.

Следует подчеркнуть, что в обоих методах перед определением ТИ белки мочи преципитируют ацетоном. Однако в спектрофотометри-еском методе растворенный белковый осадок обрабатывают кислотой лп отделения МТИ - растворимого в кислой среде гликопротеида т всех остальных белков, а также для диссоциации комплексов МТИ-ротеиназа,- таким образом определяют полный пул МТИ в моче, дко из преимуществ ИФА-метода заключается в том, что он позво-яет избежать обработки белкового осадка кислотой.

Наличие высокой корреляции результатов двух методов позво-яет считать, что ИФА, также как и спектрофотометрический метод, ияаляет полный пул МТИ - как свободного, так и находящегося в

комплексе с протеиназами (возможно, тканевыми катепсинами).

Из результатов сравнения двух методов следует еще один существенный вывод. Тот факт, что в образцах мочи, где слектрофото-метрическим методом МТИ практически не выявляется, ИФА-метох также не обнаруживает МТИ (рис. 6), означает, что другие антигены, присутствующие в моче, не влияют на результаты анализа. Такик образом, предложенный макетный вариант ИФА МТИ в моче являете? достаточно специфичным.

Разработка метода очистки МТИ с помощью иммуносорбента

Необходимость синтеза иммуносорбента на основе монАТ м; продиктована тем, что МТИ используется в качестве биологическ1 активного лиганда в специфическом плазмосорбенте протеиназ "Иммо-тине", который производится Экспериментальным предприятием меди ко-биологических препаратов (ЭПМБП) при ВКНЦ АМН СССР и успешн< примеяеется в клинике при лечении острых воспалительных состоя ний. Иммуносорбент на основе монАТ М2 был необходим для усовер шенствования принципиальной в производстве "Иммотина" стади выделения МТИ из мочи человека. Использовавшийся ранее на ЭПМБ метод извлечения МТИ из мочи с помошью химотрипсин-сефарозы бы недостаточно технологичен.

Пришивку монАТ М2 к сромциан-активированной сефарозе 4 проводили в трех вариантах, исходя из соотношений 5, 8 и 10 м антител на 1 мл геля. Оказалось, что при всех выбранных концент рационных соотношениях происходила практически полная иммобилиза ция антител на сефарозе. Для дальнейшей работы было выбран соотношение 8 мг монАТ М2 на 1 мл бромциан-активированной сефг розы 4В, которое на основании положительного опыта использованк

250

о

«с

щ

Си

в о

к о н о 3

о а

а.

&

s-э

3 Э

я а. н

щ

о

С ю ~ 75 100 125 концентрация МТИ в ыоче, шсг/цл спектрофотонетрнческий ыетод определения

рис,6 Корреляция данных по спектрофотометрическому и икмунофер-ментному определению содержания МТИ в моче человека С представлены данные для здоровых доноров СN=17, 3, беременных женщин третьего триместра беременности без наруиений функций почек.СN=7, 3 и с нефропатияки СN=6, 3, больных нефритами с достаточной СN=8, 3 и с недостаточной функцией почек С N = 9 , 3.

иммуносорбентов на ЭПМБП является оптимальным.

После анализа профилей элюции МТИ с иммуносорбента различи ми элюирующими смесями в качестве элюента был выбран 0,2 М рас вор Nací в сантимолярной соляной кислоте, рН 2,5.

В табл. 1 представлены основные этапы выделения МТИ из мо' человека с использованием монАТ М2-сефарозы.

Таблица 1. Выделение МТИ из мочи человека с использованием монАТ М2-Сефарозы

Этап очистки Белок, Антитриптическая Выход, Степен]

опт.ед. активность Si очистк1

при удельная, обыая,

280 нм ИЕ/опт.ед. ИЕ

при 280 нм

Моча (Юл) 935400 2,4x1 О"3 2280 100 1

1 . QAE-сефадекс

а)фильтрат Б 31800

б)элюат 58400 3,8x1 о"2 2 190 96 1 6

2 . Диализ 301 0 7.2х10"1 2 165 95 30

3 . Предколонка "Иммотин"

Иммуносорбент

Элюат 33 , 2 65 2 160 95 2700

4 . Диализ 32 , 3 65 2 100 92 -

5 . Лиофилизация 5 8 мг 3 6 ИЕ/мг 2 1 00 92 -

Выход на стадии иммуносорбента практически равен 100\. Для предохранения иммуносорбента от протеолиза компонента» мочи перед ним в качестве предколонки ставили колонку с "Иммот( ном", что позволяло использовать иммуносорбент не менее, чем ДJ 18 выделений.

Разработанный метод превосходит ранее описанный метод выде-1ения МТИ с использованием хроматографии на химотрипсин-сефарозе, три использовании которого самый высокий выход МТИ из мочи ¡оставлял не более 7 5%. Именно этим методом получали антиген для 1ммунизации мышей с целью получения гибридом, продуцирующих монЛТ с МТИ. Данные электрофоретического анализа препарата, послужившего в качестве антигена в данной работе, и препарата, полученного : использованием разработанного в настоящем исследовании иммуно-;орбента, представлены на рис. 7.

Следует отметить, что в отличие от элюции с химотрипсин-:ефарозы, при элюции с монАТ М2-сефарозы не происходит деградации юлекулы МТИ. Это отчетливо видно при сравнении электрофоретичес-:их треков двух препаратов МТИ: с химотрипсин-сефарозы и с монАТ [2-сефарозы.

Таким образом, результатом данной работы явилось создание адяиего и высокоэффективного метода выделения МТИ из мочи чело-ека. Предложенная схема выделения МТИ внедрена на ЭПМБП при ВКНЦ МН СССР и используется при производстве плазмосорбента "Иммотин" противовоспалительным спектром действия.

- 2 2

94000 Да 67000 Да

43000 Да 30000 Да 20100 Да

14400 Да

"Ы

94000 Да фосфорилаза В 67000 Да бычий сывороточный альбумин 43000 Да овальбумин 30000 Да карбоангидраза 20100 Да соевый ингибитор трипсина 14400 Да й-лактальбухин

а стандартная смесь белков-

маркеров для электрофореза б препарат МТИ после химотрип-син-сефарозы * в препарат МТИ после монАТ К2-

сефарозы

.Рис. 7 Электрофоретическое разделение препарата МТИ в ПААГ после очистки из мочи на М2-сефарозе С градиент 5 -. 12,5 % ПААГ, . 0,1 ¡¡¡г-БОБ, образцы обработаны 0,1.$ мёркаптоэтанола, рН 6.6) .

1 МТИ44Кда

2 мти22кДа

3 МТИ14кДа

ВЫВОДЫ:

1. Получена панель гибридом М2, В6 и Р1 , проиизводящих антитела против кислотостабильного ингибитора протеиназ мочи человека (МТИ).

2. Выявлены и охарактеризованы монАТ к МТИ (клон М2), избирательно взаимодействуюыие с трипсинсвязывающим доменом МТИ.

3. В тесте конкурентного иммуноферментного анализа (И4>А) компонентов плазмы крови человека монАТ (клон М2) выявляют МТИ, интер-альфа-ингибитор трипсина и не взаимодействуют с тромбином, плазмином, протеином С и урокиназоИ человека.

4. Метод конкурентного ИФА содержания МТИ позволяет достоверно выявлять доклинические нарушения функции почек у больных нефритами.

5. Разработан высокоэффективный иммуносорбент на основе монАТ М2, позволяющий извлекать МТИ из мочи человека с 9 5^ выходом.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Беккерт Р., Бауер М. , Оглоблина О. Г. Белова Л. А-г^хСмирнов М. Патент СССР. Штамм гибридных клеток мыши Mus. musculus - прод цент монАТ к кислотостабильному ингибитору трипсина из мочи чел< века. Приоритет в СССР 02.02.1991, N приоритета 4879754. Да положительного решения Гос. ком. СССР по делам изобретении открытий 31.07.1991.

2. Беккерт Р., Бауер М., Оглоблина О.Г. Белова Л.А., Смирн< М.Д., Парфенкова Г.А. Моноклональные антитела для иммунофермен-ного анализа кислотостабильного ингибитора трипсина из мочи чел< века.- Тезисы II Всесоюзной конференции "Современные направлен! создания медицинских диагностикумов".- Москва, 1990.- Стр.6.

3. Белова Л.А., Оглоблина О.Г., Смирнов М.Д., Беккерт Р., Бау< И. Иммуноаффинное выделение кислотостабильного ингибитора трипа на из мочи человека,- Тезисы II Всесоюзной конференции "Совреме1 ные направления создания медицинских диагностикумов".- Москв; 19 9 0,- Стр.Z.