Моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку в оценке проницаемости гемаоэнцефалического барьера при экспериментальной глиоме С6

Юсубалиева, Гаухар Маратовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку в оценке проницаемости гемаоэнцефалического барьера при экспериментальной глиоме С6
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку в оценке проницаемости гемаоэнцефалического барьера при экспериментальной глиоме С6"

На правах рукописи

ЮСУБАЛИЕВА ГАУХАР МАРАТОВНА

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ГЛИАЛЬНОМУ ФИБРИЛЛЯРНОМУ КИСЛОМУ БЕЛКУ В ОЦЕНКЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЛИОМЕ Сб

03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008

' / Г I • П - - - о

I ¿1 I. Ь

003458763

Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им В.П. Сербского Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор • В.П. Чехонин

Официальные оппоненты:

Член - корр. РАМН

доктор медицинских наук, профессор A.A. Терентьев

Российский государственный медицинский университет

доктор медицинских наук, профессор Е.М. Трещалина

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГОУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Ведущее учреждение:

Московская медицинская академия им и.м. Сеченова

Защита состоится "_" _ 2008г. в 14-00 часов на заседании

Диссертационного Совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1.

Автореферат разослан "_"_2008г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор П.Х. Джанашия

АКТУАЛЬНО^ IЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

По данным Всемирной Организации Здравоохранения смертность от опухолей мозга составляет около 3% от смертности вследствие злокачественных новообразований. В структуре нейроонкологических заболеваний 40-45 % принадлежит низкодифференцированным глиомам. Самая злокачественная из них — мультиформная глиобластома характеризуется быстрым неконтролируемым ростом, высокой частотой послеоперационных рецидивов, отсутствием четких диагностических критериев динамики опухолевого процесса. Вследствие этих особенностей средняя выживаемость пациентов с глиобластомой составляет около года с момента постановки диагноза [Stewart L.A., 2002, Zalutsky M.R, 2005].

Послеоперационные рецидивы глиобластомы обусловлены инвазивным ростом, при котором опухоль быстро распространяется по перивазальным и пе-риневральным пространствам [Grobben В. et al., 2002, Sanson M et al, 2006]. Низкая эффективность стандартных химиотерапевтических методов связана с тем, что цитостатики, уничтожающие активно делящиеся клетки, не действуют на мобилизованные глиомные клетки. Такие опухолевые клетки после химиотерапии активируются и становятся источниками новых очагов глиомы [Stewart L. А., 2002]. Вследствие этого поиск эффективных методов диагностики и лечения низкодифференцированных глиом является социально - значимой проблемой.

В эпоху активного развития современной нейроонкологии большее значение приобретает направленная доставка диагностических и лекарственных агентов в опухоль, основу которой заложили в 1948 г. Pressman и Keighley.

В этой области было проведено большое количество исследований, и достигнуты несомненные успехи [Riva Р., 2000; Reardon D. A et al.,2002;Paganelli et al. 2006; Shapiro IV. R et al., 2006; Spaeth N.. 2006]. Однако до сих пор не созданы транспортные системы, способные селективно доставить лекарственный препарат в терапевтической концентрации к клеткам-мишеням в опухоли головного мозга при системном введении.

Моноклональные антитела (МАТ), способные преодолевать гематоэнце-фалический барьер (ГЭБ), должны специфически распознавать антиген-мишень и не терять иммунохимическую активность in vivo [Wolburg H. et al., 1994; Joo F., 1996; Petty MA, Lo EH., 2000; Sharkey R. M., Goldenberg D. M, 2005]. Для создания направленности MAT в опухоль, антиген-мишень в глиоме должен присутствовать в концентрации, намного превышающей его уровень в нормальных

тканях и при этом быть доступным для антител, циркулирующих в крови (в частности — находиться в структурах гематоэнцефалического барьера: эндотелио-цитах и астроцитах).

Известно, что опухоли головного мозга сопровождаются изменением проницаемости ГЭБ и реактивной астроглиальной реакцией, различные феномены которой подтверждены многими исследователями [Millauer В., et al., 1994; GrabbPA. eta!., 1995; Чехонин В.П. и др., 2007].

Показано, что изменение проницаемости ГЭБ характеризуется нарушением синтеза белков эндотелиоцитов опухолевых микрососудов, поддерживающих барьерные функции [Sîernberger N. H. et al., 1987; Schlingemann R. О. et al., 1999; Sanson M. et al., 2006] и увеличением экспрессии генов, нетипичных для барьерного эндотелия [Grobben В. et al., 2002].

Реактивная астроглиальная реакция проявляется повышенной пролиферацией фибриллярных астроцитов в зоне патологии, гипертрофией их клеточных тел и цитоплазматических отростков. При этом астроглиоз сопровождается усиленным синтезом глиофибриллярного кислого белка GFAP (glial fibrillar acidic protein), специфического для астроцитов [Nagano N. et al., 1993, Rutka J.T. et al., 1997, Whittle I. R. et al, 1998].

В проведенных ранее исследованиях [Чехонин В.П. и др., 2004] удалось показать селективное накопление моноклональных антител к нейроспецифиче-ским белкам (GFAP и нейроспецифическая енолаза) в зоне ишемии головного мозга крыс в результате окклюзии средней мозговой артерии. Эти данные свидетельствуют о перспективе применения антител к указанным нейроспецифиче-ским антигенам в качестве векторов для направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в опухоль головного мозга, в частности, экспериментальную глиому Сб.

Гибель глиальных клеток в процессе инвазии глиобластомы сопровождается разрушением их клеточных мембран и выходом внутриклеточных белков в межклеточное пространство, в том числе и GFAP. Из межклеточного пространства белки через дефектный ГЭБ выходят в ликворную систему и периферическую кровь [Rosenfeld R. G. 1987; Чехонин В.П. и др. 2007; C.S. Jung et al., 2007].

Большое количество данных, полученных в экспериментах in vitro и in vivo подтверждают, что мониторирование уровня GFAP в сыворотке крови и ли-кворе позволяет как охарактеризовать степень патологических изменений в ЦНС, так и оценить прогноз того или иного критического состояния [Reaz N. et al, 2005, Brommeland T. et al., 2007, C.S. Jung. 2007].

Поэтому количественный мониторинг GFAP в крови и динамический анализ астроглиального вала в процессе развития глиобластомы позволил бы выявить достоверную взаимосвязь реакции астроглии с выходом белка из паренхимы мозга, разработать диагностический тест для объективной оценки объёма и состояния опухоли. Решение подобной задачи позволит создать условия для разработки методов направленной высокоселективной диагностики и лечения глиобластомы.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Провести иммунохимическую оценку проницаемости ГЭБ у крыс с глиомой С6 и изучить перспективы визуализации опухоли с помощью меченых мо-ноклональных антител к GFAP.

ЗАДАЧИ:

1. Воспроизвести модель экспериментальной Сб-глиомы у крыс. Провести динамический гистологический и морфометрический анализ глиомы на срезах мозга; оценить проницаемость гематоглиомного барьера для высокомолекулярных веществ.

2. Охарактеризовать динамику роста глиомы С6 с помощью магнитно-резонансной томографии, количественно оценить объём глиомы на разных сроках развития опухоли.

3. Провести иммуногистохимический анализ экспрессии GFAP и других антигенов, ассоциированных с эндотелиоцитами, формирующих гематоэн-цефалический барьер {AMVB1, ЕВА) с помощью специфических к ним мо-ноклональных антител на срезах мозга крыс при экспериментальной глиоме Сб.

4. Провести мониторинг элиминации GFAP в системный кровоток в процессе развития экспериментальной глиомы С6 с помощью количественного иммуноферментного анализа. Провести корреляционный анализ сывороточной концентрации GFAP, объёма глиомы по данным МРТ и морфо-метрических показателей глиомы и астроцитарного вала.

5. Оценить накопление меченых 1251 антител к GFAP в мозге и в других органах крыс при экспериментальной глиоме С6 с помощью анализа радиоактивности в образцах органов и контактной радиоавтографии срезов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые проведено динамическое исследование развития астроглиально-го вала вокруг имплантированной глиомы Сб. Показано, что GFAP-положительные реактивные астроциты сопровождают инвазию глиомы на всех сроках ее роста.

2. Впервые продемонстрирован феномен селективного накопления меченых 1251 анти - GFAP антител в полушарии головного мозга с глиомой, более чем в 20 раз превышающий накопление этих же антител в нормальной ткани.

3. Впервые при экспериментальной глиоме С6 показана взаимосвязь уровня GFAP и объема астроцитарного вала.

4. Впервые разработан и применен для визуализации клеточных компонентов ГЭБ метод двойного иммунопероксидазного анализа с помощью антител различной специфичности.

5. Впервые с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии исследована ультраструктурная локализация AMVB1 эндотелиоцитах микрососудов, формирующих ГЭБ. Показано, что этот антиген локализуется на аблюминальной и/или базальной мембране эндотелиоцитов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Количественный мониторинг концентрации GFAP в сыворотке крови может быть использован в качестве диагностического критерия состояния внутримозговой глиомы.

2. Иммуногистохимический анализ эндотелиальных антигенов ЕВА и AMVB1 может применяться в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo для характеристики сосудистой системы глиом.

3. Селективность меченных 1251 анти-GFAP антител, обусловленная взаимодействием с антигеном-мишенью в области астроглиального вала вокруг глиомы, позволяет рекомендовать их в качестве векторов в системах направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в опухоль.

Апробация диссертационной работы была проведена на заседании Проблемного Совета по фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦ ССП Росздрава»(11.11.2008).

Основные положения диссертации были представлены в периодической печати, на межлабораторных конференциях ФГУ «ГНЦ ССП Росздрава» (20062008 гг.), международной конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007г.), конференции с международным участием по нейрохимическим механизмам формирования адаптивных и патологических состояний мозга (Санкт-Петербург, 2008 г.), международной конференции EUROMAR (Санкт - Петербург, 2008), международном конкурсе молодых ученых в области нанотехнологий Rusnanotech (Москва, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано десять печатных работ, из них пять — статьи в периодической печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Работа изложена на 150 машинописных страницах и содержит 35 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 40 отечественных и 250 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на 115 половозрелых самках крыс линии Вистар. Глиобластому моделировали с помощью внутримозговой стереотаксической имплантации в правый стриатум 5 х 105 клеток глиомной линии Сб. На этом этапе проводили гистологический, морфометрический и иммуногистохимический анализ GFAP, ЕВА, AMVB и динамическое МРТ исследование и флюоресцентное определение объёма астроцитарного вала.

Для оценки миграции опухолевых клеток несколько препаратов глиомных клеток перед имплантацией метили флюоресцентной меткой CFDA SE (диацетат сукцинилимидилового эфира карбоксифлюоресцеина) с помощью набора Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit (Invitrogen) по протоколу изготовителя. Для морфологического анализа срезы окрашивали по Нисслю, очаги некроза в опухоли визуализировали окрашиванием 0,1% ванадиевокислым фуксином (VAF) и 0,1% толуидином по методу И.В. Викторова [ Viclorov I. V. at all, 2000].

Моноклональные анти-GFAP, MAB 2mB6, IgG выделяли из асцита мышей линии Balb/C методом иммуноаффинной хроматографии на протеин-А-агарозе (Invitrogen). Гибридомы, продуцирующие необходимые моноклональные антитела были предоставлены рук.лаборатории нейрохимии ФГУ ГНЦ ССП Росздра-ва, д.м.н. О.И. Гуриной. Иммуногистохимический анализ проводили с использованием высокочувствительной иммунопероксидазной системы «ABC-Vectastain» (Vector Lab., USA). В качестве первых антител в иммуногистохимическом анализе использовали моноклональные SMI-71, 2тВ6 и анти- GFAP антитела. В качестве вторых — антивидовые биотинилированные антитела ВА2000 ( Vector Lab.), визуализацию проводили с помощью комплекса авидин - биотин-пероксидаза (ABC elite, Vector Lab.).

Для иммунофлюоресцентного анализа срезы мозга, экспонированные с первичными антителами, инкубировали с антителами козы к иммуноглобулинам мыши, меченными Alexa 488 или Alexa 594 (Goat antimouse IgG Alexa Fluor, Invitrogen). При выполнении двойного окрашивания применяли коктейль из первичных мышиных и кроличьих антител. Последние визуализировали с помощью антител козы к иммуноглобулинам кролика, меченных Alexa 488 или Alexa 594 (Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor, Invitrogen). Ядра клеток докрашивали с помощью DAPI (Invitrogen). Результаты исследования регистрировали на флюоресцентном микроскопе (Leica MS) и сканирующем лазерном конфокальном микро-

скопе TCS SP2 (Leica MS). Вычисление объёма астроцитарного вала проводили на микроскопе Leica DM с моторизованным предметным столиком с применением программы Leica Microsystems и пакета Photoshop CS (Adobe). Для динамического анализа роста опухоли дополнительной группе из 8 крыс с экспериментальной глиомой проводили МРТ-исследование на томографе BRUKER Biospec, 7Т на 7-8, 14-15 и 24-25 сутки после имплантации. С помощью программы 1т-ageJ 1.32. на полученных сканированных изображениях определяли объём опухоли, накопившей контрастное вещество Магневист

На следующем этапе проводилось внутривенное введение меченных |251 моноклональных антител крысам с глиомой С6 с последующим анализом их накопления в мозге и других органах. Исследовались три группы крыс в соответствие с вводимыми препаратами антител: анти- GFAP антитела (23 крысы), МАЬ2тВ6 (20 крыс) и неспецифические IgG мыши (20 крыс). Мечение антител 1251 (Ешах = 0,35 мэВ, Tj/2 = 60,1 суток) проводили с помощью Иодогена [Zalutsky М. R., et al., 1989]. Радиохимическую чистоту меченых антител определяли методами тонкослойной хроматографии и диск-электрофореза в полиакриламид-ном геле с ДСН (додецилсульфат натрия). После хроматографии пластинку высушивали и сканировали в сцинтилляционной камере Instant Imager (HP, USA). Перфузированные органы (правое и левое полушария головного мозга, мозжечок, легкие, печень, селезенка, почки) опытных и контрольных крыс, предварительно взвесив, помещали в контейнеры для счета, в сцинтиляционном счетчике (RackBeta. 1215 LKB-Wallac,. Sweden) регистрировали количество импульсов в минуту и рассчитывали удельную радиоактивность сырого вещества. Радиоавтографию проводили на рентгеновской пленке с экспозицией срезов головного мозга крыс с глиомой в течение 3-7 суток, в зависимости от уровня радиоактивности среза.

Определение GFAP в сыворотке крови осуществляли при помощи "сэндвич-варианта" твердофазного иммуноферментного анализа [А. Voller et al., 1976] в модификации [Чехонин В.П. и др., 2000]. Иммуноферментное определение проводилось в тест системе с рекомбинантным GFAP в качестве стандарта.

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы «MS Excel» из пакета приложений Microsoft Office ХР (Microsoft, США) с применением функций описательной статистики и корреляционного анализа.

Результаты собственных исследований

/. Гистологический и иммуногистохимический анализ экспериментальной глиомы С6

Экспериментальная интракраниальиая глиома С6 крысы по морфологии, паттерну генетической экспрессии и характеру инвазивного роста довольно близка мультиформной глиобластоме человека [СгоЬЬеп В.. 2002]. Продолжительность жизни крыс после имплантации глиомных клеток в стриатум почти никогда не превышала 30 суток. В первые 15 — 16 суток заболевание протекало бессимптомно, затем постепенно появлялась контралатеральная пирамидная симптоматика. Для качественной оценки неврологического дефицита при отборе животных в экспериментальные группы на этом сроке использовались тесты приведения задних конечностей [Буреш Я.и др., 1991]. Спустя 21 — 23 суток после имплантации клеток глиомы состояние крыс прогрессивно ухудшалось и к 25 — 28 суткам животные впадали в сопорозное состояние.

Миграцию клеток глиомы, предварительно меченых витальным трейсером CFD/l оценивали на третьи и восьмые сутки. Результаты исследования показали, что инвазия опухолевых клеток становится заметна уже на третьи сутки после имплантации (Рис. 1). На восьмые сутки после имплантации инвазия очень активна, определяются многочисленные перивазальные и периневральные тяжи, меченые СГОА Ж единичные глиомные клетки обнаруживаются на расстоянии до 500 мкм от основного очага, однако образование вторичных очагов не наблю-

Рис. 1. Флюоресценция имплантированных глиомных клеток меченных трейсером ( III I Л/'.

А. Глиома на третьи сутки после введения. х50;Б..В..Г. —8 сутки после введения. Голубые стрелки— перива-зальиая инфильтрация (В): красными стрелками — отдалённые единичные глиомные кетки (Г). Б..В. Х50; Г. Х400.

Окрашивание срезов мозга крыс с глиомой по Нисслю или толуидиновым синим позволило четко дифференцировать основной очаг опухоли, и тем самым продемонстрировать распространение опухоли по перивазальным и перинев-

далось.

* %

- % ь

в " * --- - —

ральным пространствам (Рис. 2 А, В, Г). Погибшие ацидофильные клетки избирательно окрашивались в гранатовый цвет ванадиевокислым фуксином (VAF), что позволяло обнаружить зону центрального некроза и многочисленные мелкие очаги, содержащие дегенерирующие опухолевые клетки (Рис. 2 Е).

Глиомные клетки характеризовались различной формой и размером, выраженным полиморфизмом ядер (Рис. 2 Б), что соответствовало гистологической картине мультиформной глиобластомы человека [Nagano N. et al, 1993; Grobben В. et al, 2002]. Проведенный гистологический анализ на срезах головного мозга подтвердил активную инвазию опухоли.

Р(1С. 2. Гис юло! нческаи кар I и на ин ваши 1 л номы С6 на препаратах, окрашенных крезнловым фиолетовым и толуиди-новым синим. А. Общий вид глиомы на восьмые сутки после имплантации х 100. Б. Полиморфизм ядер глиомных клеток. Масляная иммерсия х 1000. В.. Г. Иеривазалышя и пери-невральная инвазия глиомы (показано стрелками). Д. Зона центрального некроза х 100. Е. Мелкие очаги некроза опухолевых клеток, обнаруживаемые при окрашивании ванадиевокислым фуксином. Масляная иммерсия, х 1000.

Результаты сравнительного иммуногистохического анализа в норме и при экспериментальной глиоме С6 выявили существенные изменения в экспрессии исследуемых антигенов. Иммуногистохимический анализ (Ж4Р проводили с

Б, Г. — Иммунофлюоресцентная визуализация с помощью вторичных антител Goat antimouse Alcxa Fluor 488 (Б) и Goat antimouse Alexa Fluor 594 (Г) (Invitrogen). Увеличение x 50

Рис. 3. Иммуногистохимический анализ вГАР в клетках астроцнтарного вала (А, Б) и АМУВ1 в неопластических .микрососудах (В, Г) на замороженных срезах мозга экспериментальных крыс.

Восьмые сутки после имплантации глиомы.

А, В. — Иммунопсроксидазное окрашивание с помощью вторичных антител BA 2000 и набора Vectastain ABC elite (Vector Lab. USA) Увеличение x 50

третьих суток имплантации глиомы, и уже на этом сроке выявлялись признаки астроглиалыюй реакции; сформированный астроцитарный вал визуализировался на седьмой — восьмой день роста опухоли (Рис. 3, А). Последующий динамический иммуногистохимический анализ показал, что астроглиальный вал с момента его обнаружения сохраняется на всех исследованных сроках. В конце эксперимента (30 суток), когда опухоль прорастала почти все полушарие, интенсивная астроглиальная реакция отмечалась в узкой полосе интактной ткани по краю полушария (Рис. 5, А).

Рис. 4. Общий вид имплантированной в стриатум глиомы С6 спустя 2 часа (А), 3 (Б), 15 (В) и 28 (Г) суток после имплантации. Окрашивание 0.1% то-луидином с ванадиевокислш/ фуксином. Увеличение х ¡/4

Рис. 5. Двойная иммупофлшоресцентиая визуализация СГАР и ЕВА (зелёная и красная флюоресценция соответственно) {красная флюоресценция) па среза\ глиомы (25 сутки).

А. Общин вид. х 400. Б. Увеличенный фрагмент < 200. СИАР' астроциты вокруг участка инвазии (|)АР[| В. Нормальная нервная ткань (кора мозжечка) окрашенная с помощью антител к ОЯАР и ЕВА. х 1000

Сами глиомные клетки ни на одном из сроков своего развития не визуализировались анти - GFAP антителами. Этот факт соответствует общепринятой концепции, о том, что в клетках низкодифференцированных глиом не экспрес-сируются гены тканеспецифических белков промежуточных филаментов [Nagano N. et а!, 1993; Grobben В. etat. 2002].

В ходе эксперимента отмечены изменения в экспрессии эндотелиальных антигенов быстро растущих опухолевых микрососудов. Среди эндотелиальных антигенов мы исследовали эндотелиальный барьерный антиген (ЕВА) и антиген, распознаваемый моноклональными антителами 2тВ6, полученными в лаборатории иммунохимии ФГУ «ГНЦ ССП Росздрава» (AMVB1). Моноклональные ан-

титела 2п:В6 распознают зндотелнальнын антиге!! АМУВ1, экспрессирующийся в норме только в микроциркуляторном русле мозжечка, ствола мозга, селезенки и почки. При экспериментальной глиоме С6 было обнаружено значительное повышение экспрессии АМУВ1 в собственной сосудистой системе опухоли (Рис. 3 В, Г). Начиная с седьмого-восьмого дня после имплантации глиомных клеток, с помощью антител 2тВ6 в опухоли визуализировалась разветвленная сеть Л Л/КВ/-положительных микрососудов. Наоборот, с помощью моноклональных антител БМ1-71 мы обнаружили отсутствие экспрессии ЕВА в сосудах глиомы С6 и в прилежащей к ней глиальной ткани уже на ранних сроках её развития (Рис. 5).

Применение разработанного нами комбинированного иммунопероксидаз-ного, а также двойного иммунофлюоресцентного методов визуализации позволило ко - локализовать БРАР и эндотелиальные антигены (ЕВА и АМУВ1), в результате чего мы обнаружили, что в области астроцитарного вала, где происходит гиперэкспрессия йРАР, наблюдается повышенная экспрессия АМ¥В1 и уменьшение экспрессии ЕВА (Рис. 5 Б, В). Выявленные изменения могут свидетельствовать о молекулярных перестройках эндотелиалыюго барьера как в собственно неопластических микрососудах, так и в микрососудах в области астрог-лиального вала.

2. Результаты шшуноферментного анализа СРАР

Исследование БРАР в сыворотке крови крыс проводили с помощью им-муноферментной тест-системы на основе рекомбинантного СРЛР и высокоочи-щенных поли- и моноклональных анти - ОРАР антител, разработанной в лаборатории иммунохимии ФГУ «ГНЦ ССП Росздрава». Предел чувствительности тест-системы на основе рекомбинантного ОРАР в качестве стандарта равнялся 0,4 нг/мл (Рис. 6). Нормальный уровень йРАР в сыворотке крови крыс для данной тест-системы, определённый путём кратного тестирования 17 образцов сывороток нормальных крыс составил 1,8 ± 0,3 нг/мл.

Концентрацию ОРАР определяли в 83 образцах сыворотки крови крыс с экспериментальной глиомой из различных групп эксперимента. Результаты им-муноферментного анализа показали, что достоверное повышение концентрации ОРАР при глиоме С6 по сравнению с нормальным уровнем регистрируются на 7-8 сутки (Таблица 1). Максимального значения концентрация ОРАР достигала через три недели после имплантации глиомных клеток (15,2 ± 1,4* нг/мл). В дальнейшем, несмотря на увеличение размеров глиомы, мы наблюдали некото-

рое уменьшение сывороточной концентрации GFAP на 24-25-е и 29-30 сутки после имплантации (до 13,7 ± 0,6 нг/мл). Это уменьшение не достигало достоверного уровня, однако в той или иной степени наблюдалось почти у всех проана-

Таким образом, в результате динамического исследования концентрации GFAP в сыворотке крови крыс с экспериментальной глиомой было показано значительное (почти в десять раз на 21-е сутки) её повышение в процессе развития опухоли. Мы предположили, что сывороточная концентрация GFAP может отражать с одной стороны повышение проницаемости гематоэнцефаличе-ского барьера, с другой — степень гибели реактивных астроцитов по мере роста глиомы. Для проверки этих предположений был проведен корреляционный анализ концентрации GFAP с мор-фометрическими показателями глиомы, определенными на серийных гистологических срезах и сканах динамического МРТ исследования. Таблица 1 Результаты иммуноферментного анализа GFAP у крыс с глиомой

Параметры Интакт- Глиома Глиома, сутки после имплантации

ные (вся вы- 3 7-8 14-15 16-17 20-21 24-25 29-30

крысы борка)

Кол-во животных 17 83 6 17 17 и 11 13 8

GFAP (нг/мл), М±ш 1.8 ±0,1 12,1± 0.4* 6,8± 0.4 9,9 ± 0.6* 11.5± 1,3* 12,5 ± 0.6* 15,2 ± 1.4* 14.1± 0,4* 13,7 ± 0.6*

3. Изучение взаимосвязи мопфометричсских показателей глиомы С6 и концентрации С РА Р в сыворотке крови Морфометрический анализ глиомы С6 на серийных срезах. Объём глиомы в течение эксперимента неуклонно возрастал у всех исследованных крыс, достигая через четыре недели почти 1 мл (Таблица 2). Объём участков некроза в течение эксперимента возрастал в десять раз — с 0,6 мм3на третьи сутки, до 61 мм3 на 29 —30-е. При этом на 21-е сутки он достигал максимального относительного значения — 7% объёма глиомы. Достаточно высокое значение объёма некроза на

лизированных на этих сроках животных.

оо

Рис. 6. Калибровочная кривая пммунофермешно! о определен >[н GFAP: но ос» ординат — концентрация KjFAP нг/мл. по оси абсцисс — значения оптической плотности rGFAP

третьи сутки (3,1% объёма глиомы) с одной стороны, вероятно, связано с малым объёмом опухоли (лишь 14 мкл), а с другой с гибелью определенной части гли-омных клеток сразу после имплантации.

Важные на наш взгляд данные получены при количественном анализе развития астроглиального вала. Относительно объёма глиомы астроглиапьный вал достигал своего максимума на седьмые — восьмые сутки развития опухоли, составляя 36% её объёма. В дальнейшем, вероятно, вследствие значительного увеличения объёма глиомы, относительный размер астроглиального вала уменьшался до 19,2% и 13,5% на 14-15 и 20-21 сутки соответственно. На 30 сутки развития опухоли относительный объём астропитарного вала сокращался вообще до 4,5%. В абсолютных значениях максимальное развитие астроглиального вала наблюдалось на 20-21 сутки (56,6 мкл). На 30-е сутки абсолютный объём астроглиального вала составлял лишь 40,7 мкл.

Таблица 2. Результаты морфометрического анализа глиомы С6

Сутки после импланта- Значение морфометрических показателей, М - m (п = количество животных)

Объём глиомы (мм3) Объём участков некроза (мм'1) Отн. объём некроза (% от объёма глиомы) Объём астро-цитарного вала (мм3) Отн. объём астронн-тарного вала (% от объёма глиомы)

3 14,8 ± 1.2 п = 6 0.6± 0,4 н = 6 3.1± 1,7 п — 6 1.8±0,2 п = 4 13,7± 1,8 п-4

7-8 44,7 ± 1,4 п = 9 2,2± 0,9 л = 9 5,1 ±2,2 п = 9 15,5±0.6 п = 4 36,2± 1.6 п = 4

14-15 195,1 ± 12,9 п = 9 4,9 ± 1.5 п = 9 2.5 ± 0,8 п = 9 38,4 ±2,5 п = 4 19,2 ±0,9 п = 4

16-17 326,9 ± 10.0 п= 11 15.0 ±5,6 п = 11 4,6 ± 1,7 п = 11

20-21 426.8 ±21,3 п= 11 33.9 ±7.8 п = 11 7,1 ± 1,6 п= 11 56,6 ± 3,8 п = 4 13,5 ±0,9 п = 4

24-25 664,9 ± 13,9 п = 5 40,0 ± 10,5 п = 5 6,1 ± 1,6 п = 5

29-3« 883,3 ± 17.7 п = 8 61,8 ±9,0 п = 8 7,1 ±1.1 п = 8 40.7 ± 2.3 п = 5 4,5 ± 0,2 п = 5

МРТ исследование. Динамику роста экспериментальной глиомы С6 у одних и тех же крыс мы оценивали с помощью магнитно-резонансной томографии головного мозга крыс в ЦМТС МГУ им. М.В.Ломоносова (Таблица 3). Было обнаружено, что к 24-25-м суткам после имплантации глиома С6 достигала объёма 874.43±80.18 мм (15,2% объёма мозга в целом). Если учесть, что вводимый объём глиомных клеток составлял около 10 мм1, можно заключить, что в течение

трёх недель прогрессирования внутримозговой глиомы С6 её объём по данным МРТ увеличивается более чем в 80 раз.

Сравнивая данные морфометрии, полученные при МРТ и на гистологических срезах, обращают на себя внимание более высокие значения объёма глиомы на всех проанализированных сроках в первом случае. Вероятным объяснением этого феномена является дегидратация мозга во время фиксации параформальде-гидом, вследствие чего уменьшается его объём.

Взаимосвязь объёма глиомы по данным МРТ и концентрации GFAP в крови. После вычисления объёма опухоли и иммуноферментного определения GFAP в сыворотке крови крыс проводили корреляционный анализ этих двух показателей. Данное исследование позволило на достаточной выборке (24 пары значений) проанализировать взаимосвязь элиминации GFAP в периферический кровоток (отражающей, прежде всего, деструкцию нервной ткани и гибель реактивных астроцитов) с объёмом экспериментальной глиомы (Таблица 3).

Средние значения GFAP в группе крыс с МРТ были несколько ниже средних показателей во всей выборке на этих сроках (однако, находились в пределах ошибки среднего) несмотря на это, коэффициент корреляции Пирсона концентрации GFAP в этой группе и объёма глиомы составил 0,67. Полученные данные достоверно свидетельствуют о наличии положительной корреляции уровня элиминации GFAP в системный кровоток и объёма глиомы.

Таблица 3. Корреляционный анализ показателей МРТ исследования н концентрации GFAP у крыс с экспериментальной глиомой С6

'¡ЧП'Лйи!ВИ!Ш« '(¡¡«Ш» КМОШШПЙ!»

Объём глиомы в ммЗ, М ± ill, Относительный объём глиомы (% от объёма мозга) М ± т. Концентрация GFAP (нг/мл) М ± m Коэффициент корреляции Пирсона (11 = 24*, р< 0,05)

7-8 (п = 8*) 52.14±3,24 0,83±0,1 9,3±0,2 0,67

14-15(п = 8«) 234.71 ±20,54 3,76±0,46 10,7±0,5

24-25 (п = 8*) 874.43±80,18 15,2±1,88 13,7±0,6

Корреляционный анализ концентрации СРАР в крови и морфо,метрических показателей глиомы. Взаимосвязь морфометрических показателей и концентрации СРАР в сыворотке крови исследовали, используя функцию линейной корреляции Пирсона (Таблица 4). Как и следовало ожидать, срок глиомы значительно коррелировал с объёмом глиомы и объёмом некроза и в меньшей степени — с объёмом астроцитарного вала и концентрацией СРАР. Последнее, с нашей точки зрения, связано со снижением концентрации йРАР и объёма астро-

цитарного вала на позднем сроке развития глиомы. Вследствие этих же причин концентрация ОРАР наиболее всего коррелировала с объёмом астроцитарного вала.

Проведенный корреляционный анализ позволяет заключить, что размеры глиомы и выраженность в ней некротических изменений находятся в тесной взаимосвязи с уровнем астроглиальной реакции и элиминацией СРАР в периферический кровоток. Концентрация йРАР в сыворотке крови достаточно точно отражает объём глиомы (особенно — по данным МРТ-исследования) и может быть применена для мониторинга экспериментальной глиомы Сб. По данным морфометрического анализа, в наибольшей степени уровень элиминации СРАР в сыворотку крови определяется степенью астроглиальной реакции паренхимы на опухоль, и, вероятно, ассоциированным с ней повышением проницаемости эндо-телиального барьера в направлении глиома-кровь.

Таблица 4 Корреляционный анализ показателей морфометрического анализа и концентрации вГАР в сыворотке крови.

Параметры

Срок глиомы Объём глиомы Объём некроза

Объём астроцитарного вала

Срок глиомы

Объём глиомы

Объём некроза

Объём астроцитарного вала

Примечание. Достоверность корреляции: * — р<0,05, ** — р<0,01

4. Направленный транспорт меченных 7"'7 антител в область глиомы in vivo

Следующей задачей исследования была оценка селективности захвата опухолевой тканью анти - GFAP антител и других иммуноглобулинов при внутривенном введении крысам с экспериментальной глиомой Сб.

При оценке радиоактивности внутренних органов было отмечено, что распределение |251-анти- GFAP антител и l25I-IgG-m в них практически не отличается (Рис.7). Анализ радиоактивности органов в первые часы после внутривенного введения |2з1 -МАЬ2тВ6 показал, что накопление этих антител почти во всех ис-

следованных органах выше по сравнению с анти- йРАР антителами и \gGrn. В отличие от анти- антител и ^йт, которые к концу эксперимента (96 ча-

сов) сходным образом элиминируются из органов, МАЬ2тВ6, распознающие эн-дотелиальный антиген аблюминальной мембраны, накапливаются в тех органах, в которых наблюдается экспрессия этого антигена (селезенка и почка).

Печень 5 0.60 1 -«-IgOm I 0 S0 X . МА[»2В6 Селезенка IS i MO T -^»»P

* t 1 1.00 T f 0.80 0.60 0 40 020 dÄSa-L^

1 0.20 • * I 010 _____-Л

¡ 000 ' 0.00 ® Я 6h 24h 48h 72h 96h 6h 24h 4Sh 72h 96h

Почка g 5 120 1 —•—1Я&П1 Легкое 0.35 —•—IflO-m 030 - . мдьгвб 0 25 £ J, -^a-OFAP 015 * ^

|o» i i ' £ 0 60 i f

^ 6h 24h 48h 72h 96h 005 * а 000 6h 24h 4ßh 72h 96h

Рис. 7 Радиоактивность орунов после внутривенно!о введении меченных моноклональ-ных анимел к (,РДР. МАб2тВ6 п несисиифичсских иммуноию-булинов крысам с

экспериментальной ишомой. По оси ординат — радиоактивность в % от введенной дозы на 1 г сырого вещества; но оси абсцисс — время в часах с момента введения антител.

Накопление меченных моноклональных антител к СРАР и АМУВ1 в пораженном глиомой полушарии мозга. При оценке радиоактивности ткани мозга, было обнаружено, что в интактном полушарии (контралатеральном глиоме) вплоть до 96 часов после введения не наблюдалось достоверное накопление ни анти - (тРЛР антител, ни

В пораженном (ипсилатеральном) полушарии в первые часы и сутки после внутривенного введения препарата радиоактивных МАТ, отмечалось повышенное проникновение из кровотока всех трех видов антител, обусловленное, вероятно, дефектом гематоэнцефалического барьера. Однако спустя двое суток после введения в кровоток наблюдалась элиминация неспецифических антител из мозга, и к концу эксперимента (96 часов) их радиоактивность в ипсилатеральном полушарии составила 0,03±0,01% на грамм сырого вещества (Рис. 8). Наоборот, спустя 48 часов после введения анти - йБАР антител мы наблюдали достоверный рост показателя радиоактивности ипсилатеральной гемисферы мозга. Через 96 часов после введения накопление анти - ОРАР антител в пораженном глиомой полушарии достигало 0,17+0,01% от введенной дозы на грамм сырого вещества, что в 5,7 раза выше аналогичного показателя в контроле (^Ст). Такие по-

казатели радиоактивности, вероятно, обусловлены специфическим взаимодействием анти - ОРАР антител с антигеном, презентированном в зонах гибели реактивных астроцитов. В отличие от неспецифических иммуноглобулинов, анти -ОРАР антитела не только не элиминировались из мозга через 96 часов, но их накопление на этом сроке было выше, чем то, которое наблюдалось через 48 часов.

В. Коатралатвральное полушарие

Д. Ипсилатеральное полушарие

РИС. 8 Радиоактивность полушарим млн а после внутривенно! о введения меченных Ш1 моноклональных ангп - (.ТАР антител, МАб2тВ6 и неснснифнческнх иммуноглобулинов крысам с ткепернменгальной глиомой '* — р < 11.051. По оси ординат — радиоактивность в % от введенной дозы на 1 г сырого вещества: но оси абсцисс — время в часах с момента введения антител.

Накопление меченных '~51 анти - ОРАР антител почти полностью ингиби-ровалось предварительным введением десятикратного избытка "холодных" анти

- йРАР антител. Количество радиоактивно меченых антител в мозге в условиях конкурентного ингибирования составило 0,04% ± 0,02 от введенной дозы на 1 г (через 48 часов), что в 3 раза ниже значения в опытной группе ('"Ч-анти-ОРАР) и даже ниже уровня накопления неснецифических иммуноглобулинов на этом сроке (0,09% ± 0,02). Эти данные убедительно свидетельствуют о специфическом характере накопления анти - СРАР антител в пораженном глиомой полушарии.

Радиоактивность ипсилатеральной гемисферы мозга крыс, получивших инъекцию МАЬ2тВ6, до 48 часов наблюдения достоверно не отличалась от контроля. Однако через 72 и 96 часов отмечался рост показателя накопления МАЬ2тВ6, который составил 0,07% ±0,01 и 0,12% ± 0,01 на грамм сырого вещества соответственно. Последний показатель был в 4 раза выше, чем аналогичный в контроле (р<0,05) и в 24,0 раза выше, чем радиоактивность контралатерального полушария на этом же сроке.

Контактная авторадиография срезов мозга крыс, получивших 1: Т- анти

- ОРАР антитела (п=8) и 1Ь1 -МАЬ2тВ6 (п = 7) подтвердила накопление меченых специфических антител в области глиомы. Патологический очаг на рентгенов-

ской пленке одновременно хорошо визуализировали и анти - GFAP антитела, и МАЬ2тВ6. При этом первые МАТ, диффузно распределяясь в очаге глиомы, в большей степени засвечивали фотопленку по периферии опухоли, в то время как вторые в большей степени накапливались в самой опухоли в виде отдельных вкраплений в толще глиомы.

В отношении моноклональных анти - GFAP антител особенно ценным представляется то, что они в большей степени накапливаются по периферии глиомы, там, где реактивные астроциты окружают очаги перивазальной и пери-невральной инфильтрации. Это позволяет предполагать, что с помощью меченых анти - GFAP антител возможно с одной стороны — более точное определение границ глиомы, а с другой — разработка систем адресной доставки диагностических и терапевтических агентов в очаги инвазии опухоли.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенный гистологический и морфометрический анализ срезов мозга крыс с экспериментальной глиомой С6 показал, что имплантация клеток этой линии в мозг крысам позволяет получить адекватную экспериментальную модель мультиформной глиобластомы, вполне подходящую для исследований in vivo.

Следующим важным этапом наших исследований был анализ экспрессии GFAP реактивными астроцитами в процессе развития глиомы. Известно, что ас-троцитарная пролиферация сопровождает почти все патологические процессы в головном мозге и выполняет защитную функцию [Nagano N. et al., 1993; Rntka J. Т. et al., 1997; Whittle I. R. et al, 1998; Чехонин В.П. и др., 2007]. Впервые наличие вокруг имплантированной опухоли глиального вала, состоящего из GFAP положительных астроцитов обнаружили Нагано и соавторы [Nagano N. et al, 1993]\ они же показали, что сами глиомные клетки GFAP- негативны. Проведенный нами динамический анализ развития реактивного астроглиоза позволил дополнить эти данные. Было показано, что реактивный астроцитарный вал полностью формируется с седьмого-восьмого дня развития глиомы и наблюдается вплоть до гибели крыс (до 30 суток). Особенно ценным в этом аспекте представляется то, что реактивные астроциты обнаруживаются вокруг всех участков инвазии по периферии опухоли. Благодаря высокой разрешающей способности лазерной конфокальной микроскопии, нам удалось визуализировать и мелкие тяжи инвазии глиомы, которые также окружены реактивными С/\ЛР-положительными астроцитами. Таким образом, с помощью меченных радиоактивной меткой анти

- GFAP антител возможно более точное определение границ глиомы, что может иметь высокую диагностическую ценность как в оценке объёма предстоящей операции, так и в выборе комбинированного лечения.

Иммуногистохимический анализ эндотелиальных антигенов в процессе развития экспериментальной глиомы Сб показал исчезновение ЕВА-иммунореактивности в патологических эндотелиоцитах опухоли. Известно, что специфический маркер церебральных микрососудов ЕВА синтезируется только дефинитивными эндотелиоцитами, имеющими специфические для ГЭБ-образующих клеток морфологические и функциональные признаки [Sternberger N. Нeta!., ¡987]. Таким образом, отсутствие ЕВА+ микрососудов в очаге опухоли и в непосредственной близости от него свидетельствует о функциональной неполноценности гематоэнцефалического барьера в этих областях. Это объясняет крайне высокую, по сравнению с нормальными церебральными микрососудами, проницаемость неопластических капилляров для высокомолекулярных веществ.

Наряду с исчезновением ЕВА, в процессе неопластического ангиогенеза происходит существенное увеличение содержания белка аблюминальной мембраны эндотелиоцитов AMVB1. Повышенная иммуногистохимическая реакция на этот антиген в опухоли может быть обусловлена, вероятно, усилением экспрессии этого антигена вследствие воздействия факторов, ассоциированных с неопластическим ангиогенезом.

Как показали результаты предыдущих исследований, проведенных как в нашей лаборатории, так и за рубежом [Karkela I. et al, 1993; В.П. Чехонин и др., 2004], экспериментальное повреждение ГЭБ приводит к значительному повышению содержания нейроспецифических белков (НСБ) в кровотоке. Определение концентрации НСБ в сыворотке крови, как критерия целостности ГЭБ, позволяет охарактеризовать степень поражения мозга, а также прогнозировать дальнейшее развитие заболевания при целом ряде патологических состояний [Bernstein J.J. et al., 1985; Nagano N et al.,1993; Izumoto S, et al., 1996; Grobben B. et al., 2002]. Наиболее чувствительным маркером повреждения ГЭБ является GFAP, поскольку, будучи специфическим компонентом цитоскелета астроцитов, этот антиген одним из первых обнаруживается в крови при поражении нервной ткани.

Методом иммуноферментного анализа нами было выявлено достоверное повышение концентрации GFAP в сыворотке крови животных в процессе развития экспериментальной глиомы Сб. Достоверная положительная корреляция уровня GFAP и объёма глиомы, показанная в эксперименте с динамическим

MPT исследованием позволяет говорить о диагностической и прогностической ценности мониторирования GFAP в сыворотке крови пациентов с глиобласто-мой. При этом особое внимание должно уделяться случаям как с резким возрастанием концентрации GFAP, так и с резким её падением, поскольку последний вариант может наблюдаться при достижении глиобластомой очень больших размеров и определенном «истощении» компенсаторных возможностей реактивных астроцитов.

Проведенный корреляционный анализ показал взаимосвязь уровня элиминации GFAP и объёма астроглиального вала, что подтверждает первоначальное предположение, о том, что уровень GFAP в сыворотке крови характеризует степень выраженности глиальной реакции паренхимы мозга.

В эксперименте с введением в системный кровоток меченных 1251 МАТ было зарегистрировано достоверное накопление анти - GFAP антител и МаЬ2тВ6 в области экспериментальной глиомы С6, обусловленное высокой экспрессией и "доступностью" антигенов-мишеней: GFAP в промежуточных фи-ламентах деградировавших реактивных астроцитов и AMVB1 на аблюминальной поверхности эндотелиоцитов опухолевых микрососудов. Ценным преимуществом анти-GFAP антител перед антителами, применяемыми в других исследованиях (например, антитела к тенасцину или фибронектину) является их строгая специфичность к нервной ткани, содержащей реактивные астроциты. Вследствие этого их накопление в пораженном полушарии было достоверно выше, чем в нормальной ткани мозга.

С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии изучена субклеточная локализация мембранного антигена эндотелиоцитов AMVB1, распознающегося антителами 2тВб. Показано, что этот белок представлен только на аблюминальной и, вероятно, на базальной мембране эндотелиоцитов. К сожалению, несмотря на высокую степень экспрессии AMVB1 в очаге глиобластомы, селективность данных антител по отношению к очагу глиомы была гораздо ниже, что не позволяет рекомендовать данные антитела для клинического применения, вследствие высокого "фона" в органах, экспрессирующихЛЛ/К51.

Таким образом, проведенное экспериментальное иммунохимическое исследование показало перспективность применения анти - GFAP антител в качестве вектора систем адресной доставки диагностических и терапевтических агентов в очаг глиомы.

выводы

1. При стереотаксическом введении глиомных клеток С6 (5х105) в стриатум головного мозга крысы развивается хорошо воспроизводимая экспериментальная модель глиомы С6, пригодная для экспериментов /in vivo/.

2. Глиальный вал, образованный G/víP-положительными реактивными аст-роцитами обнаруживается через 3-й дня после имплантации глиомных клеток и сохраняется в течение всей жизни крысы (до 30 суток с момента имплантации). Реактивные астроциты окружают все участки инвазивного роста глиомы.

3. Иммуногистохимический анализ мембранных белков эндотелиоцитов, формирующих ГЭБ в растущей глиоме выявил отсутствие экспрессии маркера функциональной целостности гематоэнцефалического барьера — ЕВА и увеличение экспрессия AMVB1.

AMVB1 локализуется на аблюминальной поверхности эндотелиоцитов ГЭБ и может рассматриваться как маркер неопластического ангиогенеза при экспериментальной глиоме Сб.

4. Имплантация глиомных клеток в мозг с последующим развитием экспериментальной глиомы сопровождается достоверным повышением концентрации GFAP в сыворотке крови крыс. Концентрация GFAP в сыворотке крови крыс положительно коррелирует с объёмом глиомы в соответствии со сроками развития (верификация МРТ, гистологическая морфометрия), а также с объёмом астроглиального вала (коэф. корреляции 0,62).

5. Меченные >2Sl моноклональные анти - GFAP антитела, введенные в системный кровоток крыс с экспериментальной глиомой С6, достоверно накапливаются в поражённом глиомой полушарии, при этом максимальное количество (0,17% ± 0, 01 от введенной дозы на 1 г. сырого вещества ткани) обнаруживается через 96 часов после инъекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. В П Баклаушев, Г.М. Юсубалиева, О.И. Турина, В П. Чехонин Комбинированный иммуно-пероксидазный анализ в визуализации клеточных элементов гематоэнцефалического барьера // Кчеточные технологии в биологии и медицине, 2006 -4,- С. 198-201.

2 В П. Чехонин, В П Баклаушев, Г.М Юсубалиева, К.А. Павлов, О В. Ухова, О.И Гурииа Моделирование и иммуногистохимический анализ глиомы С6 // Клеточные техночогии в биологии и медицине, 2007. -2.- С 65-73

3. В П. Чехонин, В П. Баклаушев, К.А Буланов, Г М. Юсубалиева, Е.А. Цибулькина, О.И. Турина, Ю.С. Скоблов, В.И Швец Е.А, Ю А Жирков. Исследование биодеградации меченых мо-ноклонапьных антител при системном введении крысам с экспериментальной глиоме С6II Биомедицинская химия, 2007— том 53, вып 5,— с 532-540

4 В П Чехонин, В П Баклаушев, Г М Юсубалиева, О.И. Турина, Т Б. Дмитриева Направленный транспорт меченых |251 антител к белкам мишеням в очаге экспериментальной глиомы С6 II Докчады академии наук, 2008 — том 418 —№5 — с. 1-4

5. В П. Баклаушев, Г.М Юсубалиева, В.В Белопасов, Ю.С. Скоблов, К.А. Павлов, О В. Ухова, А.В. Семенова Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам в радиоиммунодиагностике и терапии нихзкодифференцированных глиом // Глава в книге: В П. Чехонин, О И. Турина, Т.Б. Дмитриева Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам. Москва ОАО «Издательство «Медицина» — 2007 — с.234 -254

6. V P. Chekhonin, V.P. Baklaushev, G М. Yusubalieva, O.I. Gurina Targeted Transport of L2!I-Labeled Antibody to GFAP and AMVB1 in an Experimental Rat Model of C6 Glioma // J Neuroim-mune Pharmacol 2008 Sep 4, —№9—p. 123-127

7. V P Chekhonin, G M. Yusubalieva V.P. Baklaushev, P.A Pavlov, O.I. Gurina Immunohisto-chenncal analysis of a model rat c6 glioma // Mat. of conference for young scientists on molecular biology and genetics, dedicated to I2(ih anniversary ofN. I. Vavilov, Kiev, 2007

8 Г.М. Юсубалиева, В.П Баклаушев, К.А. Павлов, В П. Чехонин Направленный транспорт моноклональных антител к GFAP и AMVB1 на экспериментальной модели глиомы С6 крысы // Материалы конференции с международным участием Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга, Санкт - Петербург, 2008

9. D Р Kupriyanov, V.P. Baklaushev, G M. Yusubalieva, A.A. Volkov, Yu.A. Pirogov, V.P.Chekhonin Contrast-enhanced MRI dynamics of experimental C6-glioma // Mat. of Magnetic Resonance Conference EUROMAR, S Petersburg, 2008

10. ГМ Юсубалиева, В.П Баклаушев, В.П. Чехонин Иммунолипосомальные наноконтейнеры в МРТ - диагностике глиомы С6 // Сборник тезисов докладов участников международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехно югий, Москва, 2008

Заказ №203/12/08 Подписано в печать 16.12.2008 Тираж 100 зкз Усл. п л 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.nt; е-таП:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Юсубалиева, Гаухар Маратовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ. ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

1.1. Общие аспекты применения моноклональных антител в онкологии.

1.1.1. Иммунохимический анализ в онкологии.

1.1.2. Диагностические и лекарственные препараты на основе МАТ в онкологии.

1.2. МАТ в диагностике и терапии опухолей головного мозга.

1.2.1. Молекулярные механизмы деструкции ГЭБ в процессе опухолевой инвазии глиобластом.

1.2.2. Потенциальные мишени для иммунодиагностики и иммунотерапии глиом.

1.2.3. Роль GFAP в реактивном глиозе в ответ на опухолевую инвазию.

1.2.5. Перспективы диагностики и терапии низкодифференцированных глиом с помощью меченых радионуклидом моноклональных антител.

1.3. Резюме.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика исследуемого материала.

2.2. Общая характеристика экспериментальной работы.

2.3. Моделирование интракраниальной глиобластомы.

2.3.1. Культивирование глиомных клеток С6.

2.3.2. Стереотаксическое введение глиомных клеток С6 в каудопутамен мозга крысы

2.3.3.Оценка развития имплантированной глиомы С6.

2.4. Гистологические методы.

2.4.1. Окрашивание срезов мозга крезиловым фиолетовым и толлуидиновым синим для оценки инвазии имплантированных глиомных клеток С6.

2.4.2. Окрашивание срезов мозга ванадиевым- кислым фуксином с последующим докрашиванием толуидином.т.

2.5. Иммунохимические методы.

2.5.1. Аффинная хроматография МАТ на протеин-А-агарозе.

2.5.2. Иммуногистохимический анализ антигенов, ассоциированных со структурами ГЭБ.

2.5.3. Иммунофлюоресцентное исследование методом световой и лазерной конфокальной микроскопии антигенов структур, формирующих ГЭБ, на срезах головного мозга крыс с глиомой С6.

2.5.4. Иммуноферментный анализ GFAP в сыворотке крови крыс.

2.6. Радиохимические методы.

2.6.1. Коньюгирование МАТ с радиоактивным I

2.6.2. Тонкослойная хроматография препарата 1251-МАТ. ч 2.6.3. Диск-электрофорез препарата 12 I-MAT. f 2.6.4. Анализ радиоактивности 1251-МАТ в органах крысы с глиомой С6.

2.6.5 Контактная радиоавтография срезов головного мозга крыс с глиомой С6.

2.6.5 Кислотная преципитация органов крыс с глиомой С6 после внутривенного введения 1251-меченных МАТ.

2.7. Схема эксперимента по оценке селективного накопления в органах 1251-MAT.

2.7.Статистическая обработка полученных результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГЛИОМЫ С6 КРЫСЫ.

3.1. Результаты оценки инвазии глиомы Сб по общему состоянию крыс и по неврологическому статусу.

3.2. Гистологический анализ инвазии глиомных клеток Сб.

3.3. Иммуногистохимический анализ AlvWBl, ЕВА и GFAP на срезах головного мозга крыс с глиомой Сб.

3.4. Оценка проницаемости ГЭБ с помощью высокомолекулярных агентов при развитии глиомы Сб.

ГЛАВА 4. ИФА GFAP В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС С ГЛИОМОЙ Сб С ПОСЛЕДУЮЩИМ ИЗУЧЕНИМ ВЗАИМОСВЯЗИ МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЛИОМЫ И КОНЦЕНТРАЦИИ GFAP В СЫВОРОТКЕ КРОВИ КРЫС В ДИНАМИКЕ ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА.

4.1. Характеристика иммуноферментной тест-системы и нормальные показатели GFAP в сыворотке крови крыс.

4.2. Динамика концентрации GFAP при экспериментальной глиоме Сб.

4.3. Морфометрический анализ глиомы Сб на серийных гистологических срезах мозга в разные сроки ее инвазии.

4.4. Морфометрический анализ астроглиального вала на серийных срезах мозга методом флюоресценции.

4.5. Динамика развития глиомы по данным МРТ-исследования.

4.6. Корреляционный анализ показателей морфометрии и концентрации GFAP в сыворотке крови.

ГЛАВА 5. НАПРАВЛЕННЫЙ ТРАНСПОРТ МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ К GFAP и AMVB1 В ОБЛАСТЬ ГЛИОМЫ Сб ПРИ ВВЕДЕНИИ В СИСТЕМНЫЙ КРОВОТОК КРЫСЫ.

5.1. Характеристика 1251-МАТ.

5.2. Распределение меченых антител к GFAP и AMVB1 в органах после внутривенного введения крысам с экспериментальной глиомой Сб.

5.2.1. Кинетика меченных 1251 МАТ в крови.

5.2.2. Распределение меченных 1251 МАТ во внутренних органах крыс с глиомой Сб

5.2.3. Накопление меченных 1251 МАТ к GFAP и AMVB1 и IgGm в полушариях мозга крыс с глиомой Сб.

5.2.4. Конкурентное ингибирование накопления меченных I антител к GFAP в пораженном полушарии мозга крыс.

5.3. Контактная авторадиография препаратов головного мозга крыс с глиомой Сб после введения меченных I антител.

5.4. Биодеградация йодированных МАТ в крови и органах после введения в системный кровоток крысам с глиомой Сб.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку в оценке проницаемости гемаоэнцефалического барьера при экспериментальной глиоме С6"

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Существенной проблемой современной нейроонкологии являются низкодифференцированные опухоли головного мозга (анапластическая астроцитома, мультиформная глиобласто-ма и медуллобластома). Актуальность исследования связана с быстрым неконтролируемым ростом опухоли, высокой частотой послеоперационных рецидивов, отсутствием четких критериев динамики опухолевого процесса. Средняя выживаемость таких пациентов без лечения составляет около года с момента постановки диагноза [221, 250].

Послеоперационные рецидивы возникают вследствие инвазивного роста глиобластомы [104, 207]. Современные исследования не позволяют точно определить границы инвазии глиобластомы. Низкая эффективность стандартных химитерапевтических методов связана с тем, что цитостатики, эффективные в отношении активно делящихся клеток, бессильны в отношении мобилизованных глиомных клеток, которые после химиотерапии активируются и становятся источниками новых очагов глиомы [3, 221].

Таким образом, поиск более эффективных методов диагностики низко-дифференцированных опухолей, в том числе и глиом, остается актуальным. Большую значимость в онкологической практике в эпоху активного развития молекулярной биологии и генетики начинает приобретать онкоиммунология.

Впервые идея использования специфических противоопухолевых антител для иммунотерапии новообразований была предложена в 1948 г. Pressman и Keighley. В 1975 году изобретение гибридомной технологии Kohler G., Milstein С. (Нобелевская премия 1984 года) позволило в дальнейшем получать моноклональные антитела (МАТ), селективно взаимодействующие с антигенами, в-частности, экспрессирующимися клетками злокачественной опухоли [10, 18]. Были получены МАТ, распознающие /in vitro! рецептор эпи-дермального фактора роста [58], рецептор фактора роста нервов [142], фиб-ронектин [166], тенасцин [114, 151, 190] и ряд других известных и неиденти-фицированных белков, представленных в экспериментальной глиоме животных и глиобластоме человека [75]. Препараты направленного действия на основе МАТ выгодно отличаются от классических химиотерапевтических лекарственных средств тем, что способны избирательно связываться с рецепторами, экспрессирующимися на опухолевых клетках [1, 18, 22, 39].

Несмотря на интенсивное развитие радиоиммунодиагностики и -терапии, в настоящее время отсутствует универсальная транспортная система, способная при введении в системный кровоток обеспечить терапевтическую концентрацию доставленного препарата без осложнений для пациента. В первую очередь необходимо преодолеть гематоэнцефалический барьер, сформированный церебральными эндотелиоцитами с их уникальными мор-фо-функциональными свойствами: наличие плотных контактов, связанных с Р-поверхностью цитолеммы [242, 187], высокое содержание митохондрий, низкий уровень пиноцитоза, отсутствие фенестр [131], высокое трансэндоте-лиальное сопротивление [161]. Эти особенности препятствуют пассивной диффузии любых гидрофильных высокомолекулярных веществ, не имеющих систем направленного транспорта [22, 25, 144, 224]. При паталогических состояниях ГЭБ условия проницаемости могут измениться, в том числе и для специфических антител к барьерным и забарьерным рецепторам [29,32, 101, 157,190].

Известно, опухоли головного мозга сопровождаются изменением проницаемости ГЭБ [22, 101, 157]. В эндотелиоцитах опухолевых микрососудов изменяется экспрессия белков, подерживающих барьерные функции [22, 101], отмечается увеличение экспрессии антигенов, нетипичных для барьерного эндотелия [104]. Одним из примеров нетипичной экспрессии является увеличение экспрессии антигена аблюминальной мембраны эндотелиоцитов (AMVB1). AMVB1 распознается моноклональными антителами 2тВ6, полученными в лаборатории иммунохимии ФГУ ГНЦССП Росздрава [22]. По результатам наших исследований уровень AMVB1 в опухолевых эндотелиоцитах достоверно выше чем в нормальном церебральном эндотелии [23]. Интерес к белкам, специфически экспрессирующимся в эндотелии неопластических микрососудов, обусловлен тем, что это ассоциированные с ангиогене-зом белки— рецепторы факторов роста, интегрины и другие молекулы клеточной адгезии. Применение МАТ к подобным белкам-мишеням, возможно, позволит селективно ингибировать неоангиогенез и, тем самым, замедлить или вообще остановить рост опухоли в послеоперационном периоде [216].

В проведенных ранее исследованиях [22, 31] удалось показать селективное накопление ати-GFAP антител и анти-NSE антител в зоне ишемии мозга крыс с поврежденным ГЭБ в результате окклюзии средней мозговой б артерии. Эти данные свидетельствуют о перспективности применения МАТ к указанным нейроспецифическим антигенам в качестве векторов для адресной доставки лекарственных и диагностических агентов в опухоль головного мозга.

Органические заболевания ЦНС (т.е. сопровождающиеся возникновением патологического очага в нервной ткани) сопровождаются реакцией аст-роглии [22]. Наличие реактивного астроглиоза при экспериментальных глиомах подтвержден многими исследователями [167, 239]. Астроглиоз сопровождается повышенной пролиферацией фибриллярных астроцитов в зоне патологии, выраженной гипертрофией их клеточных тел и цитоплазматических отростков, быстрым синтезом белков цитоскелета, в основном, высоким уровнем экспрессии GFAP "glial fibrillar acidic protein" — специфического для астроцитов белка промежуточных филаментов [6, 61, 167].

В выборе экспериментальной модели опухоли для наших исследований мы руководствовались данными других исследователий, которые свидетельствуют, что наибольшим морфологическим свойством и характером роста с мультиформной глиобластома человека обладает глиома С6, полученная на крысах Wistar-Furth с помощью канцерогенеза НД'-нитрометилмочевинои [67, 91, 104, 158,167, 232, 239, 257].

В процессе инвазии глиобластомы происходит гибель глиальных клеток, в результате чего происходит выход внутриклеточных белков в межклеточное пространство, в том числе и GFAP. Из межклеточного пространства через неполноценный ГЭБ GFAP элиминируется в биологические жидкости организма [22, 63,193].

В этом случае актуальным является определение уровня GFAP в биологических жидкостях как критерия состояния глиобластомы [22, 63, 193, 61]. Большое количество данных, полученных в экспериментах in vitro и in vivo подтверждают, что мониторирование уровня GFAP в сыворотке крови и ликворе позволяет как охарактеризовать степень патологических изменений в ЦНС, так и оценить прогноз того или иного критического состояния [12, 22, 61, 193].

В настоящее время имеются данные о взаимосвязи синтеза GFAP аст-роцитами со степенью выраженности патологических процессов в ЦНС [22, 23, 24, 145]. В свою очередь, количественный мониторинг GFAP в биологи7 ческих жидкостях в процессе развития глиобластомы позволил бы выявить достоверную взаимосвязь реакции астроглии с выходом белка из паренхимы мозга, разработать диагностическую систему для оценки размеров и состояния глиобластомы. Решение поставленной задачи позволит создать условия для разработки методов направленной высокоселективной диагностики и лечения глиобластом.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Провести иммунохимическую оценку проницаемости ГЭБ у крыс с глиомой С6 и изучить перспективы визуализации опухоли с помощью меченных 1251 моноклональных антител к GFAP.

ЗАДАЧИ:

1. Воспроизвести модель экспериментальной Сб-глиомы у крыс. Провести динамический гистологический и морфометрический анализ глиомы на срезах мозга; оценить проницаемость ГЭБ для высокомолекулярных веществ.

3. Провести иммуногистохимический анализ экспрессии GFAP и других антигенов, ассоциированных с эндотелиоцитами, формирующих гема-тоэнцефалический барьер (AMVB1, ЕВА) с помощью специфических к ним моноклональных антител на срезах мозга крыс при экспериментальной глиоме Сб.

4. Провести мониторинг элиминации GFAP в системный кровоток в процессе развития экспериментальной глиомы С6 с помощью количественного иммуноферментного анализа. Провести корреляционный анализ сывороточной концентрации GFAP, объёма глиомы по данным МРТ и морфометрических показателей глиомы и астроцитарного вала.

125

5. Оценить накопление меченых I антител к GFAP в мозге и в других органах крыс при экспериментальной глиоме С6 с помощью анализа радиоактивности в образцах органов и контактной радиоавтографии срезов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые проведено динамическое исследование развития астроглиаль-ного вала вокруг имплантированной глиомы Сб. Показано, что GFAP-положительные реактивные астроциты сопровождают инвазию глиомы на всех сроках ее развития.

3. Впервые при экспериментальной глиоме С6 показана взаимосвязь уровня GFAP и объема астроцитарного вала.

5. Впервые с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии исследована ультраструктурная локализация AMl^Bl эндотелиоци-тах микрососудов, формирующих ГЭБ. Показано, что этот антиген локализуется на аблюминальной и/или базальной мембране эндотелиоци-тов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

125

3. Селективность меченных I анти-GFAP антител антител, обусловленная взаимодействием с антигеном-мишенью в области астроглиального вала вокруг глиомы, позволяет рекомендовать их в качестве векторов в системах направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в опухоль.

Основные положения диссертации были представлены в периодической печати, на межлабораторных конференциях ФГУ «ГНЦ ССП Росздра-ва» (2006- 2008 гг.), международной конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007г.), конференции с международным участием по нейрохимическим механизмам формирования адаптивных и патологических состояний мозга (Санкт-Петербург, 2008 г.), международной конференции EUROMAR (Санкт - Петербург, 2008), международном конкурсе молодых ученых в области нанотехнологий Rusnanotech (Москва, 2008).

ОБЪЁМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Работа изложена на 133 машинописных страницах и содержит 39 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 33 отечественных и 224 иностранных источника.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Юсубалиева, Гаухар Маратовна

выводы

1. При стереотаксическом введении глиомных клеток Сб (5x105) в стриатум головного мозга крысы развивается хорошо воспроизводимая экспериментальная модель глиомы Сб, пригодная для экспериментов Un vivo/.

2. Глиальный вал, образованный GF/iP-положительными реактивными астро-цитами обнаруживается через 3-й дня после имплантации глиомных клеток и сохраняется в течение всей жизни крысы (до 30 суток с момента имплантации). Реактивные астроциты окружают все участки инвазивного роста глиомы.

3. Иммуногистохимический анализ мембранных белков эндотелиоцитов, формирующих ГЭБ в растущей глиоме выявил отсутствие экспрессии маркера функциональной целостности гематоэнцефалпческого барьера — ЕВА и увеличение экспрессия AMJ^l.

5. Меченные 1251 моноклональные анти - GFAP антитела, введенные в системный кровоток крыс с экспериментальной глиомой Сб, достоверно накапливаются в поражённом глиомой полушарии, при этом максимальное количество (0,17% ± 0, 01 от введенной дозы на 1 г. сырого вещества ткани) обнаруживается через 96 часов после инъекции

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Эспериментальная модель С6 может быть применена для исследований по разработке систем направленного транспорта в очаг опухоли и оценке проницаемости ГЭБ для высокомолекулярных соединений

2. Количественный мониторинг концентрации GFAP в сыворотке крови может быть использован в качестве диагностического и прогностического критерия выраженности деструктивных процессов в ЦНС.

3. Иммуногистохимический анализ эндотелиальных антигенов ЕВА и AMVB1 может применяться в экспериментальных исследованиях для характеристики сосудистой системы глиом.

4. Селективность меченных 12э1 гнт-GFAP антител, обусловленная взаимодействием с антигеном-мишенью в области астроглиального вала вокруг глиомы, позволяет рекомендовать их в качестве векторов в системах направленного транспорта диагностических и лекарственных препаратов в опухоль. о

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Юсубалиева, Гаухар Маратовна, Москва

1. Абелев Г. И. Моноклональные антитела. // Соросовский образовательный журнал. — 1998. № 1. — С. 16-20.

2. Абелев Г.И. Иммунология опухолей // Природа — 2000. №2. — С.20-25.

3. Аннин Е.А., Щеглов В.И., Осинский С.П. О целесообразности оперативного лечения злокачественных глиом и перспективности внутриартериальной химиотерапии. // Украинский журнал малоинвазивной и эндоскопической хирургии. — 1998. №2;4.— С. 50-53.

4. Артамонова Е.В, Роль иммунофенотипирования опухолевых клеток в диагностике и прогнозе рака молочной железы. // Автореферат диС. . д-ра мед. наук. — 2003 г.

5. Барышников А.Ю., Оборотов Н.А. . Иммунолипосомы новое средство доставки лекарственных препаратов. // Современная онкология. — 2001. № 3;2 —- с. 111-119.

6. Березин В.А., Велик Я.В. Специфические белки нервной ткани — Киев. 1990г. — С.340.

7. Березов Т. Т., Яглова Н. В., Дмитриева Т. Б. и др. Направленный транспорт лекарственных средств с помощью липосом // Вестн. РАМН. — 2004. № 5. —С. 42-47.

8. Бредбери М. Концепция гематоэнцефалического барьера.// (пер. с англ.) -1983.

9. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Д.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. — М. 1991. —С. 344.

10. Дмитриева Т.Б., Чехонин В П., Жирков Ю А. Направленный транспорт лекарств в ЦНС. // Аптека и больница 1993. №3 - С. 42-44.

11. B.М. Моисеенко. 2004. — С. 22.1 б.Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. — М."Наука" — 1985.

12. Петров С. В., Лебедев С. В., Гурина О. И., Чехонин В. 77. Иммунохимиче-ская верификация постинсультной хронизации нейродегенеративного процесса у крыс с окклюзией средней мозговой артерии. // Нейрохимия. — 2005. №. 2. —С. 38-44.

13. Роит А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. — М.: Мир. 2000. — 5921. C.

14. Рябухин И.А. Иммуноферментный анализ антител к нейроспецифическим белкам в оценке проницаемости гематоэнцефалического барьера при патологии, сопровождающейся его прорывом. //Автореф.диС.канд.мед.наук.— М,— 1993.

15. Чехонин В.П., Гурина О.И., Дмитриева Т.Б. Моноклональные антитела к нейроспецифическим белкам. — М. "Медицина", 2007.— 344 С.

16. Чехонин В.П., Баклаугиев В.П., Юсубалиева Г.М. и соавт. Моделирование и иммупогистохимический анализ глиомы Сб. // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2007 —№.2.—С.65-73.

17. Чехонин В.П., Гурина О.И., Дмитриева Т.Б. и др. Моноклональные анти-GFAP антитела: получение характеристика и иммуноферментный анализ. // БЭБМ- 2001. № 8 С.188-191.

18. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. —М.: 2000.— С. 416.2б.Фшъченков А.А. Цитокипы суперсемсйства ЭФР и онкогенез. //Эксперим. онкология.— 1998., Т. 20. — №2,—С.83-108.

19. Чехонин В. П., Дмитриева Т. Б., Жирков Ю. А. Направленная доставка лекарственных средств в мозг. // Вестн. РАМН — 2006 — № 8 — С. 30-37.

20. Чехонин В. П., Жирков Ю. А., Дмитриева Т. Б. Направленный транспорт психотропных средств через гематоэнцефалический барьер. // В кн.: Штарк М. Б., Старостина М.В. (Ред.) Моноклональные антитела в нейробиологии.1. Новосибирск: Офсет. 1995.

21. Чехонин В. П., Преображенская И .С., Яхно Н. Н. Проницаемость гематоэн-цефалического барьера при болезни Альцгеймера и паркинсонизме с когнитивными нарушениями. // Ж. Невропатол. Психиат. им. С. С. Корсакова. — 2001.—№5. —С. 30-33.

22. Чехонин В. П., Турина О .И., Дмитриева Т. Б. и др. Моноклональные анти-GFAP антитела: получение характеристика и иммуноферментный анализ. // БЭБМ. — 2001. № 8. — С. 188-191.

23. Чехонин В. П., Лебедев С. В., Рябухин И. А. и др. Селективное накопление моноклональных антител к нейроспецифической енолазе в ткани мозга крыс с окклюзией средней мозговой артерии. // БЭБМ. — 2004. № 10. — С. 388-392.

24. Чехонин В. П., Жирков Ю. А., Турина О. И. и др. ПЭГилированные иммуно-липосомы, специфичные к астроцитам. // Докл. РАН, Сер. Биофиз. Биохим.2003. № 391. — С. 236-239.

25. Чехонин В. П., Жирков Ю. А., Яглова Н. В. и др. Направленный транспорт лекарственных средств с помощью липосом. // Вести. РАМН —- 2004 Т. 51. С. 42-47.

26. Abbruzzese J.L. Phase 2 study of anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) antibody (IMC-C225), in combination with gemcitabine in patient with advanced pancreatic cancer//J. Ibid. -2001. V. 20.-P. 518.

27. Alinari L, Lapalombella R, Andritsos L, Baiocchi RA, Lin TS, Byrd JC. Alemtuzumab (Campath-IH) in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. // J.Oncogene. — 2007. — Vol. 26. — P. 3644-3653.

28. Andreasson P, Carlsson R. Targeting angiogenesis with antibodies for the treatment of cancer. // J.Drugs. — 2005. — Vol. 9. — P. 730-733.

29. Aschner J.L., Lum H., Fletcher P.W., Malik A.B. Bradykinin- and thrombin-induced increases in endothelial permeability occur independently of phospholi-pase С but require protein kinase С activation.// J. Cell Physiol. — 1997 —№173 — P.387-396.

30. Axworthy D. В., Fritzberg A. R., Hylarides M. D., et al. Preclinical evaluation of an anti-tumor monoclonal antibody/streptavidin conjugate for pretargeted 90Y radioimmunotherapy in a mouse xenograft model. // J. Immunother. — 1994. — Vol. 16.—P. 158.

31. Banks IV. A., Goulet M., Rusche J.R. et al. Differential transport of a secretin analog across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers of the mouse. // J. Pharmacol. Exper. Therap. — 2002. — Vol. 302. — P. 1062-1069.

32. Barth R. F., Yang W., Adams D. M. et al. Molecular targeting of the epidermal growth factor receptor for neutron capture therapy of gliomas. // Cancer Res. — 2002.—Vol. 62.—P. 3159-3166.

33. Beck LI., Acker Т., Wiessner C., et al. Expression of angiopoietin-1, angiopoietin-2, and tie receptors after middle cerebral artery occlusion in the rat. // Am. J. Pathol.—2000/—V. 157.—P. 1473-1483.

34. Al.Belien А. Т., Paganetti P. A., Schwab M. E. Membrane-type 1 matrix metallopro-tease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. // J. Cell Biol. — 1999. — Vol. 144. — P. 373-384.

35. Bellacosa A., Kumar С. C., Di Cristofano A., Testa J. R. Activation of АКТ kinases in cancer: implications for therapeutic targeting. // Adv Cancer Res. — 2005. — Vol. 94. —P. 29-86.

36. Bertelli E., Regoli M., Gambelli F. et al. GFAP is expressed as a major soluble pool associated with glucagon secretory granules in A-cells of mouse pancreas. // J Histochem Cytochem. 2000 - V. 48(9) - P. 1233-1242.

37. Bevacizumab. Anti-VEGR monoclonal antibody, avastin, rhumab — VEGR// Drugs. -2002.-P. 28-30.

38. Bhattacharya-Chatterjee M, Chatterjee SK, Foon KA. Anti-idiotype antibody vaccine therapy for cancer.// Expert Opin Biol Ther.— 2002— Dec;2(8):869-81.

39. Вigner D. D., Brown M. Т., Friedman A. H. et al Iodine-131-labeled antitenascin monoclonal antibody 81C6 treatment of patients with recurrent malignant gliomas: Phase 1 trial results. // J. Clin. Oncol. — 1998. — Vol. 16. — P. 22022212.

40. Bigner D.D., Bigner S.H., Ponten J., et al. Heterogeneity of genotypic and pheno-typic characteristics of fifteen permanent cell lines derived from human gliomas // J. Neuropathol. Exp. Neurol. — 1981. — V. 40. — P. 201 229.

41. Boer man О. C., van Schaijk F. G., Oven W. J., et al. Pretargeted radioimmuno-therapy of cancer: Progress step by step. // J. Nucl. Med. — 2003. — Vol. 44. — p. 400-441.

42. Bolton SJ, Anthony DC, Perry VH. Loss of the tight junction proteins occludin and zonula occludens-1 from cerebral vascular endothelium during neutrophil-induced blood-brain barrier breakdown in vivo. //J. Neuroscience. —1998 — V.86. —P.1245-1257.

43. Bonnin J.M., Rubinstein L.J. Immunohistochemistry of central nervous system tumors. Its contribution to neurosurgical diagnosis //J. Neurosurg. — 1984. — Vol. 60.—P. 1121-1133.

44. Breier G, Risau IV. Angiogenesis in the developing brain and in brain tumours. // Trends Exp Med. — 1996,—V.6. —P.362-376.

45. Вгеппег М. Structure and transcriptional regulation of GFAP gene // Brain Pathol. — 1994. Vol. 4. - P. 245 - 257.

46. Brommeland T, Rosengren L, Fridlund S, Hennig R, Jsaken V. Serum levels of glial fibrillary acidic protein correlate to tumor volume of high grade gliomas. // Acta Neurol. Scand.— 2007—V.l 16 —P. 380-384.

47. C. Foerch, I Curdt, B. Yan, F. Dvorak et al. Serum glial fibrillary acidic protein as a biomarker for intracerebral heamorrhage in patients whith acute stroke // J. Neurol.Neurosurg. Psychiatry —2006 —.V.77 — p. 181- 184.

48. C.S. Jung, C. Foerch, A. Schanzer, A.Heck, K.H. Plate, V. Seifert, H. Steinmetz, A. Raabe and M. Sitzer. Serum GFAP is a diagnostic marker for glioblastoma multiforme //Brain — 2007— Vol. 130 — p. 3336 3341.

49. Carson- Walter E. В., Hampton J., Shue E. et al. Plasmalemmal vesicle associated protein-1 is a novel marker implicated in brain tumor angiogenesis. // Clin. Cancer. Res. — 2005. — Vol. 11. — P. 7643—7650.

50. Chang С. H., Sharkey R. M., Rossi E. A., et al. Molecular advances in pretarget-ing radioimmunotherapy with bispecific antibodies. // Mol. Cancer Ther. — 2002. — Vol.1. — P. 553-563.

51. Cheung N. K., Modak S., Lin Y., et al. Single-chain Fv-streptavidin substantially improved therapeutic index in multistep targeting directed at disialoganglioside GD2. // J. Nucl. Med. — 2004. — Vol. 45. — P. 867-877.

52. Chicoine MR, SilbergeldDL. Invading C6 glioma cells maintaining tumorigenici-ty.//J Neurosurg. —1995 — V.83(4) — P. 665-671.

53. Ciariello F., Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor// Clin. Cane. Res. 2001. - V. 7. - P. 29582970.

54. Clark E.A., Brugge J.S. Integrins and signal transduction pathways the road taken //Science.— 1995,— V.268.— P.233—239.

55. Dassand C. R., Choong P. F.M. Targeting of small molecule anticancer drugs to the tumour and its vasculature using cationic liposomes: lessons from gene therapy. // Cancer Cell International —2006. —P. 6-17.

56. Davies A. G., Richardson R. В., Bourne S. P. et al. Immunolocalisation of human brain tumors. — In: Bleehen N. M. (Ed.) Tumors of the brain. — Berlin: Springer. 1989.—P.343

57. Davies AJ. Radioimmunotherapy for B-cell lymphoma: Y90 ibritumoMab tiux-etan and 1(131) tositumoMab. // Oncogene. — 2007. — Vol. 26 — P. 3614-28.

58. Demchik L., Sameni M., Nelson K., et al. Cathepsin В and glioma invasion. // Int. J. Dev. Neirosci.— 1999. — Vol. 17. — P. 483^194.

59. Douglas G.McNeel, Jens Eickhoff, FredT. Lee, DavidM. King, Dona Alberti, James P. Thomas,Andreas Friedl, Jill Kolesar, RebeccaMarnocha, Jennifer Volkman,Jianliang Zhang,Luz Hammershaimb James A. Zwiebe and George

60. Wilding. Phase I Trial of aMonoclonal Antibody Specific for AvB3 Integrin (MEDI-522)i n Patientswith AdvancedMalignancies, Includingan Assessment of Effect onTumor Perfusion// J.Clin Cancer Res. —2005. —V.l 1—P.234-242.

61. S5.Eddleston M., Mucke L. Molecular profile of reactive astrocytes; implications for their role in neurologic diseases. //Neurosci. — 1993. — Vol. 54. —P. 15 -36.

62. Esteve P. O., Tremblay P., Houde M. et al. In vitro expression of MMP-2 and MMP-9 in glioma cells following exposure to inflammatory mediators. // Bio-chim. Biophys. Acta. — 1998. — Vol. 1403. — P. 85-96.

63. Fietz T, Thiel E. Antibody therapy in non-ITodgkin's lymphoma: the role of ritux-iMab, 90Y-ibritumomab tiuxetan, and alemtuzumab // J. Recent Results Cancer Res —2007.—Vol. 176. —P. 153-163.

64. Finn P.E., Bjerkvig R., Pilkington G.I. The role of growth factors in the malignant and invasive progression of intrinsic brain tumours //Anticancer Res.— 1997.— V. 17.— P.4163—72.

65. Giordano G, Corradi D, Gnetti L, Melissari M. Intranodal myofibroblastoma: a case report and review of literature //J. Adv Clin Path. —2001—V.5(4)—P. 1559, 161.

66. Glick B.R., Pasternak J.J. Molecular Biotechnology. Principles and applications of recombinant DNA. II ed. ASM Press. —Washington. — 2002.

67. Goetz C., Riva P., Poepperl G., et al. Locoregional radioimmunotherapy in selected patients with malignant glioma: Experiences, side effects and survival times. // J. Neurooncol. — 2003. — Vol. 62. — P. 321-328.

68. Goldenberg D. M, Sharkey R. M., Paganelli G., BarbetJ., Chatal J.-F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. // J. Clin. Oncol. — 2006. — Vol. 24. — P. 824—834.

69. Goldman R.D., Zackroff R.V., Steinert P.M. Intermediate filaments: overview. — In: Goldman R.D., Steinert P.M. (eds). Cellular and molecular biology of intermediate filaments. —NY: Plenum, 1990. — P. 3 20.

70. Goodwin D. A., Meares C. F. Advances in pretargeting biotechnology. // Biotechnol. Adv. — 2001. —Vol. 19.—P. 435-450.

71. Grabb PA, Gilbert MR. Neoplastic and pharmacological influence on the permeability of an in vitro blood-brain barrier.// J Neurosurg. —1995.—V.82(6). —P. 1053-8.

72. Greenwood J, Amos CL, Walters CE et al. Intracellular domain of brain endothelial intercellular adhesion molecule-1 is essential for T lymphocyte-mediated signaling and migration. // J Immunol. —2003. —V.171(4). —P.2099-108.

73. Greenwood J, Etienne-Manneville S, Adamson P, Couraud PO. Lymphocyte migration into the central nervous system: implication of ICAM-1 signalling at the blood-brain barrier.// J. Vascul Pharmacol. — 2002, — V.38(6). —P.315-22.

74. Grobben В., De Deyn P .P., Siegers H. Rat C6 glioma as experimental model system for the study of glioblastoma growth and invasion. // Cell Tissue Res. — 2002.— Vol. 310. — P. 257-270.

75. Gross J. L., Morrison R. S., Eidsvoog K. et al. Basic fibroblast growth factor: A potential autocrine regulator of human glioma cell growth. // J. Neurosci. Res. — 1990. — Vol. 27. — P. 689-696.

76. Gschwind A, Fischer OM, Ullrich A. The discovery of receptor tyrosine kinases: targets for cancer therapy. // Nat Rev Cancer —2004. —V. 4. —P. 361— 70.

77. Gunners en J. M. , Spirkoska V., Smith P. E. Growth and migration markers of rat C6 glioma cells identified by serial analysis of gene expression. // J. Glia.2000.—Vol. 32.—P. 146-154.

78. Gupta T, Sarin R Poor-prognosis high-grade gliomas: evolving an evidence-based standard of care. // Lancet Oncol— 2002. —V. 3— P. 557-64,

79. Gutheil JC, Campbell TN, Pierce PR, Watkins JD, Huse WD, Bodkin DJ, Cheresh DA. Targeted antiangiogenic therapy for cancer using Vitaxin: a humanized monoclonal antibody to the integrm alphavbeta3 // Clin Cancer Res. — 2000. — Vol. 8. — P. 3056-3061.

80. Hallmann R., Mayer D. N., Berg E. L. et al. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. // J. Dev. Dyn. — 1995. — Vol. 202. — P. 325-332.

81. Harald Wajant. The FasL-Fas Signaling Network // Sci. STKE —2003— Vol. 194.—P. 5-7.

82. Hawkins В. Т., Egleton R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. // J. Neurosci. Meth. — 2006. — Vol. 151. — P. 262-267.

83. Hayslip J, Penning R. Safe administration of iodine-131 tositumomab after repeated infusion-related reactions to rituxiMab.// Oncologist. — 2007. — Vol. 3.1. P. 338-340.

84. Herold-Mende C., Mueller M. M., Bonsanto M. M. et al. Clinical impact and functional aspects of tenascin-C expression during glioma progression. // Int. J. Cancer.— 2002. — Vol. 98 — P. 362-369.

85. Herrmann M., Vos P., Wunderlich M. T. et al Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke; A comparative analysis of serum concentrations of protein S100B and glial fibrillary acidic protein. // Stroke. — 2000 — Vol.31 — P. 2670-2677.

86. Higley H.R., McNulty J. A., Row den G. Glial fibrillary acidic protein and SI00 protein in pineal supportive cells: an electron microscopic study //Brain Res. — 1984.—V. 304 —P. 117 120.

87. Hnasko R., Frank P. G., Ben-Jonathan N., Lisanti M. P. PV-1 is negatively regulated by VEGF in the lung of caveolin-1, but not caveolin-2, null mice. // J. Cell Cycle. — 2006. — Vol. 17. — P. 2012-2020.

88. Holland E. C. Glioblastoma multiforme: The terminator. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 2000. — Vol. 97. — P. 6242-6244.

89. Holt LJ, Herring C, Jespers LS, Woolven BP, Tomlinson IM. Domain antibodies: proteins for therapy // J. Trends Biotechnol. — 2003—V. 21(11)— P. 484-90.

90. Huang R, Lin Y, Wang CC, Gano J. et al. Connexin 43 suppresses human glioblastoma cell growth by down-regulation of monocyte chemotactic protein 1, as discovered using protein array technology. // Cancer Res. —2002. — V. 62. —P.2806-12.

91. Huang R. P., Hossain M. Z., Sehgal A., Boynton A. L. Reduced connexin43 expression in high-grade human brain glioma cells. // J Surg Oncol. — 1999 — Vol. 70(1).—P. 21-24.

92. Huhalov A., Chester K. A. Engineered single chain antibody fragments for radioimmunotherapy. // Q. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. — 2004. — Vol. 48. — P. 279-288.

93. Huynh II, Teo CC, Soo КС. Bevacizumab and rapamycin inhibit tumor growth in peritoneal model of human ovarian cancer// Mol Cancer Ther. —.2007. —V.6(ll).—P.2959-66.

94. Isner J.M., Asahara T. Therapeutic angiogenesis //Front Biosci.— 1998.— V.3.— P.49—69.

95. Jensen R.L. Growth factor-mediated angiogenesis in the malignant progression of glial tumors: a review//Surg. Neurol.— 1998.— V.49.— P.189—195.

96. Jones T.J., Coad N.A.G., Muir K.R., Parkes S.E., Evans C.D., Mann JR. Immunophenotypic analysis of childhood Burkitt's lymphoma in West Midlands 1957-1986.//J Clin Path. — 1995. —V. 48 —P. 22-5.

97. Joo F. Endothelial cells of the brain and other organ systems: some similarities and differences. // J. Prog Neurobiol. —1996. —V.48. —P.255-273.

98. Jordan VC. Tamoxifen: Catalyst for the change to targeted therapy.// Eur J Cancer. —2007 — V. 6. — P. 235-345.

99. Kasprzak A, Zabel M, Biczysko W. Selected markers (chromogranin A, neuron-specific enolase, synaptophysin, protein gene product 9.5) in diagnosis and prognosis of neuroendocrine pulmonary tumours.//Pol J Pathol.— 2007— V.58(l)—P. 23-33.

100. Kazan S, Gdksu E, Mihci E, Gokhan G, Keser I, Giirer I. Primary atypical teratoid/rhabdoid tumor of the clival region. Case report. // J Neurosurg . — 2007 — Vol. 106(4). — P. 308-311.

101. Kelloff G. J., Hoffman J. M., Johnson В., et al. Progress and promise of FDG-PET imaging for cancer patient management and oncologic drug development. // J. Clin. Cancer. Res. — 2005. — Vol. 11. — P. 2785-2808.

102. King G.R., Kraus M.H., Aaronson S.A. Amplification of novel v-erb B-related gene in a human mamary carcinoma //Science.— 1985.— V.229.— P. 974—6.

103. Kleihues P., Burger P., Scheithauer B. Histological Typing of the tumors of the Central Nervous System. —Berlin. 1993.

104. Kohn EC, Liotta LA. Invasion and metastasis: new approaches to an old problem. // Oncology (Williston Park). — 1993.—V.7— P.47-52.

105. Кока V, Potti A, For seen SE, Pervez H, Fraiman GN, Koch M, Levitt R. Role of Her-2/neu overexpression and clinical determinants of early mortality inglioblastoma multiforme. // J. Am J Clin Oncol . — 2003. — Vol. 26(4) — P. 332-335.

106. Krishnakumar S, Kandalam M, Mohan A, Iyer A, Venkatesan N, Biswas J, Shanmugam MP. Expression of Fas ligand in retinoblastoma.// J. Cancer. — 20041. Vol. 101 —P. 1672-6.

107. Kusuhara H., Sugiyama Y. Active efflux across the blood-brain barrier: Role of the solute carrier family. // J. NeuroRx. — 2005. — Vol. 2(1). — P. 7385.

108. Lamers К J. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients // Brain Res Bull. —2003. —V.61(3). —P.261-4.

109. Laping N.J., Teter В., Nichols N.R., et al. Glial fibrillary acidic protein: regulation by hormones, cytokines, and growth factors //Brain Pathol. — 1994.1. Vol. 1, —P. 259-275.

110. Lee G, Dallas S, Hong M, Bendayan R. Drug transporters in the central nervous system: brain barriers and brain parenchyma considerations. // J.Pharmacol Rev. —2001. —V.53(4). —P.569-96.

111. Lee G, Schlichter L, Bendayan M and Bendayan R. Functional expression of P-glycoprotein in rat brain microglia //. J Pharmacol Exp Ther—2001. — V.299. —P. 204-212.

112. Lee S., Jeon S.H., Kim B.-J., Han S. W., Jang H.G., Kim S.K Classification of CD and absoiption spectra in the Soret band of FI2TMPyP bound to various synthetic polynucleotides // Biophysical Chemistry —2001 — Vol.92 —.P. 3545.

113. Leenstra S., Troost D., Das P. K. et al. Endothelial cell marker 3reactivity in brain tumor, developing brain, and brain disease. // Cancer. — 1993. — Vol. 72. —P. 3061-3067.

114. Lews A, Riva P, Lindstedt R, Davidoff M. S., et al Expression of tenascin-C in various human brain tumors and its relevance for survival in patients with astrocytoma. // J. Cancer. — 2003. — Vol. 98. — P. 2430 -2439.

115. Levine A., Schmidek H. Molecular Genetics of Nervous System Tumors. — New York.— 1993. —P.245.

116. Lewis M. R., Wang M, Axworthy D. B. et al In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. // J. Nucl. Med. — 2003. — Vol. 44.1. P. 1284-1292.

117. Lin В., Ginsberg M. D. Quantitative assessment of the normal cerebral mi-crovasculature by endothelial barrier antigen (EBA) immunohistochemistry: application to focal cerebral ischemia. // Brain Res. — 2000. — Vol. 865. — P. 237-244.

118. Lin J. HTakano Т., Cotrina M. L. et al. Connexin 43 enhances the adhe-sivity and mediates the invasion of malignant glioma cells. // J Neurosci. — 2002.

119. Vol. 22(11). — P.4302-4311.

120. Lin T.N., Nian G.M., Chen S.F., et al. Induction of Tie-1 and Tie-2 receptor protein expression after cerebral ischemia-reperfusion. // J. Cereb. Blood Flow Metab. —2000.—V.21.—P.690-701.

121. Lossinsky AS, Mossakowski MJ, Pluta R, Wisniewski HM. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) upregulation in human brain tumors as an expression of increased blood-brain barrier permeability. // Brain Pathol. —1995 V.5(4) —P.339-44.

122. Malek-Hedayat S., Rome L. H. Expression of multiple integrins and extracellular matrix components by C6 glioma cells. // J. Neurosci. Res. — 1992. — Vol. 31. —P. 470-478.

123. Mareel M., Berx G., Van Roy F., Bracke M. Cadherin/catenin complex: a target for antiinvasive therapy? //J. Cell. Biochem.— 1996.— V.61.— P.524—30

124. Millauer В, Shawver LK, Plate KH, Risau W, Ullrich A. Glioblastoma growth inhibited in vivo by a dominant-negative Flk-1 mutant. // J.Nature. — 1994. V.367. —P.576-579.

125. Miller C. R., Williams C. R., Buchsbaum D. J., Gillespie G. Y. Intratumoral 5-fluorouracil produced by cytosine deaminase/5-fluorocytosine gene therapy is effective for experimental human glioblastomas. // Cancer Res. — 2002. — Vol. 62. —P. 773-780.

126. Mineo JF, Bordron A, Quintin-Roue I, Lois el S, Ster KL, Buhe V, Lagarde TV, Berthou C. Recombinant humanised anti-HER2/neu antibody (Herceptin) induces cellular death of glioblastomas. // Br J Cancer. — 2004. — Vol. 91(6) — P. 1195-1199.

127. Montet X., Montet-Abou K., Reynolds F. et al. Nanoparticle imaging of in-tegrins on tumor cells. // Neoplasia. — 2006. — Vol. 8. — P. 214-222.

128. Moosmayer D., Berndorff D. Chang С. H. Bispecific antibody pretargeting of tumor neovasculature for improved systemic radio-therapy of solid tumors. // Clin. Cancer Res. — 2006. — Vol. 12.—P. 5587-5595.

129. Nagano N., Sasaki H., Aoyagi M., Hirakawa K. Invasion of experimental rat brain tumor: Early morphological changes following microinjection of C6 glioma cells. // Acta. Neuropathol. — 1993. — Vol. 86. — P. 117-125.

130. Namilci A., Brogi E., Kearney M. et al. Hypoxia induces vascular endothelial growth factor in cultured human endothelial cells.// J.Biol.Chem. —1995. —V.270. —P. 31189 — 31195.

131. Nicholson R. I., Goe J.M., Harper M. E. EGFR and cancer prognosis// Eur. J. Cancer. 2001. - V. 37, № 4. - P. 9-15.

132. Niebroj-Dobosz I., Rafalowska J., Lukasiuk M., et al. Immunochemical analysis of some proteins in cerebrospinal fluid and serum of patients with ischemic strokes // Folia Neuropathol. 1994. - Vol. 34. - P. 182 - 186.

133. Nieder C., Adam M., Molls M., Grosu A. L. Therapeutic options for recurrent high-grade glioma in adult patients: Recent advances. // Crit. Rev. Oncol. Hematol. — 2006. — Vol. 60. — P. 181-193.

134. Nonaka D, Laser J, Tucker R, Melamed J. Immunohistochemical evaluation of necrotic malignant melanomas //Am J Clin Pathol.— 2007 —V.127(5)— P.787-91.

135. Omari Kl, Dorovini-Zis К CD40 expressed by human brain endothelial cells regulates CD4+ T cell adhesion to endothelium // J. Neuroimmunol. — 20003. — V. 134. —P. 166 — 178.

136. Omari KL, Dorovini-Zis К Expression and function of lymphocyte function associated antigen-3 (LFA-3) at the blood-brain barrier. // J.Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). —1999. —V.45(l). — P.25-35.

137. Paganelli G., Bartolomei M., Grana C. et al. Radioimmunotherapy of brain tumor. // Neurol. Res. — 2006. — Vol. 28. — P. 518-522.

138. Pagano L, Fianchi L, Caira M, Rutella S, Leone G. The role of Gemtuzu-Mab Ozogamicin in the treatment of acute myeloid leukemia patients. // Oncogene. — 2007. — Vol.26. — P. 3679-3690.

139. Pardridge W.M. Targeting neurotherapeutic agents through the blood-brain barrier. // Arch Neurol. 2002 - V. 59(1) - P. 35-40.

140. Pardridge WM. Neurotrophins, neuroprotection and the blood-brain barrier. // Curr Opin Investig Drugs. 2002 - V. 3(12) - P. 1753-1757.

141. Pardridge WM. Blood-brain barrier drug targeting: the future of brain drug development. // Mol Interv. 2003 - № 51 - V. 3(2) - P. 90-105

142. Pardridge W.M. The Blood-Brain Barrier: Bottleneck in Brain Drug Development. // NeuroRx. 2005 - V. 2( 1) - P. 3-14.

143. Pardridge W.M. Molecular Trojan horses for blood-brain barrier drug delivery. // Curr Opin Pharmacol. 2006 - V. 6(5) - P. 494-500.

144. Park SJ, Kim LIS, Hong EK, Kim A WH Expression of cytokeratins 7 and 20 in primary carcinomas of the stomach and colorectum and their value in the differential diagnosis of metastatic carcinomas to the ovary. // Hum Pathol— 2002.— Vol.33.—P. 1078-85.

145. Paulus W, Baur I, Beutler AS, Reeves SA. Diffuse brain invasion of glioma cells requires beta 1 integrins.// Lab Invest. —1996. —V.75(6). —P.819-26.

146. Petito C.K., Halaby I.A. Relationship between ischemia and ischemic neuronal nccrosis to astrocyte expression of glial fibrillary acidic protein // Int. J. Dev. Neurosci. — 1993. — Vol. 11, № 2. — P. 239 247.

147. Petty MA, Lo EH. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation.//Prog Neurobiol. —2002. —V.68(5). — P.311-23.

148. Prat A, Casado E, Cortes J. New approaches in angiogenic targeting for colorectal cancer// World J Gastroenterol. —2007. —V. 13(44). —P.5857-5866.

149. Puthillath A, Dunn KB, Rajput A, Smith J, Yang G, Wilding GE, Tan W, Gupta B, Fakih MG. Safety and efficacy of first-line chemotherapy in unresected metastatic colorectal cancer.// Clin Colorectal Cancer. —2007. —V.6(10). — P.710-5.

150. Rascher G, Fischmann A, Kroger S, Duffuer F, Grote EH, Wolburg H. Extracellular matrix and the blood-brain barrier in glioblastoma multiforme: spatial segregation of tenascin and agrin. // J. Clin. Oncol. —- 2003. — Vol. 15. —P. 1234-1238.

151. Reaz N, Tayyab M, Khan SA, Siddique T. Correlation of glial fibrillary acidic protein (GFAP) whith grading of the neurological tumors. // J Coll Physicians Surg Рак. —2005 — V.15 —p. 472 475.

152. Reddy G. R, Bhojani M. S., McConville P. et al Vascular targeted nano-particles for imaging and treatment of brain tumors. // Clin. Cancer. Res. — 2006.1. Vol. 12. —P. 6677-6686.

153. Rempel S. A., RosenbJum M. L., Mikkelsen T. et al. Cathepsin В expression and localization in glioma progression and invasion. // Cancer Res. — 1994. — Vol. 54.—P. 6027-6031.

154. Riva P., Franceschi G., Riva N. et al. Role of nuclear medicine in the treatment of malignant gliomas: The locoregional radioimmunotherapy approach. // Eur. J. Nucl. Med. — 2000. —Vol. 27. — P. 601-609.

155. Rosenberg G.A. Matrix metalloproteinases in neuroinflammation // GLIA 2002—V. 39:—p. 279 — 291.

156. Rosenstein J.M., Krum J.M., Sternberger L.A. et al. Immunocytochemical expression of the endothelial barrier antigen (EBA) during brain angiogenesis. // Dev. Brain Res. —1992. —V.66— p.47 54.

157. Rossi E. A., Sharkey R. M. . McBride W. et al. Development of new multi-valent-bispecific agents for pretargeting tumor localization and therapy. // Clin. Cancer. Res. — 2003. — Vol. 9. — P. 3886s-3896s.

158. Rubinstein L.J. Diagnostic markers in human neurooncology. A progress report. — In: Raine C.S. (ed.). Advances in neuroimmunology // Ann. NY Acad. Sci. — 1988. — Vol. 540. — P. 78 90.

159. Rutka J. Т., Murakami M., Dirks P.В., et al. Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review // J. Neurosurg. — 1997. — V. 87. — P. 420- 430.

160. Saltz Z., Rubin M. Cetuximab (IMC C225) plus irinotecan (CPT - 11) is active in CPT-11 refractory colorectal cancer that express EGFR// Ibid. - 2001. — V. 20.-P. 511.

161. Sameni M., Dosescu J., Sloane B.F. Imaging proteolysis by living human glioma cells. // Biol. Chem. — 2001.— Vol. 382. — P. 785-788.

162. Sampson J. H., Akabani G., Friedman A. H. et al. Comparison of intratu-moral bolus injection and convection-enhanced delivery of radiolabeled antitenascin monoclonal antibodies. //Neurosurg. Focus. — 2006. — Vol. 20. — P. E14.

163. Sampson J. H., Archer G. E., Bigner D. D. Use of experimental models in neuro-oncological research. — In: Clockard A., Flayward R., Hoff J. T. (Eds) Neurosurgery: The scientific basis of clinical practice. — Oxford: Blackwell Science, 1999.

164. Sanson M, Laigle-Donadey F., Ben о i iaich-Am iel A. Molecular changes in brain tumors: prognostic and therapeutic impact. // Curr. Opin. Oncol. — 2006. — Vol. 18. —P. 623-630.

165. Schlingemann <R. O., Hofman P., Vrensen G.F. et al. Increased expression of endothelial antigen PAL-E in human diabetic retinopathy correlates with microvascular leakage. // Diabetologia. — 1999. — Vol. 42. — P. 596-602.

166. Senner V, Sturm А, Ваиг I, Schrell UH, Distel L, Paulus W. CD24 promotes invasion of glioma cells in vivo. // J Neuropathol Exp Neurol. —1999. — V.58(8). — P.795-802.

167. Shapiro JR. Genetics of nervous system tumors. // Hematol. Oncol. Clin. North. Am. — 2001. — Vol. 15. — P. 961- 977.

168. Shapiro W. R., Carpenter S. P., Roberts K., Shan J.S. 131I-chTNT-l/B Mab: Tumour necrosis therapy for malignant astrocytic glioma. // Expert. Opin. Biol. Ther. — 2006. — Vol. 6. — 539-545.

169. Sharkey R. M, Cardillo Т. M., Rossi E. A., et al. Signal amplification in molecular imaging by pretargeting a multivalent, bispecific antibody. // Nature Med.—2005. —Vol. 11.—P. 1250-1255.

170. Sharkey R. M., Goldenberg D. M: Perspectives on cancer therapy with radiolabeled monoclonal antibodies. // J. Nucl. Med. — 2005. — Vol. 46. — P. 115S-127S.

171. Simberg D., Duza Т., Park J. H. et al. Biomimetic amplification of nano-particle homing to tumors. // Proc. Natl. Acad.Sci. USA. — 2007. — Vol. 104. -No. 3,—P. 932-936.

172. Sorial J.-C, Fayette 1 J., Armand J.-P. Molecular targeting: Targeting an-giogenesis in solid tumors. // Ann. Oncol. — 2004. — Vol. 15— P.223-227

173. Spaeth N., Wyss M. Т., Pahnke J. Radio immunotherapy targeting the extra domain В of fibronectin in C6 rat gliomas: A preliminary study about the therapeutic efficacy of iodine-131-labeled SIP(L19). // Nucl. Med. Biol. — 2006. — Vol. 33— P. 661—666.

174. Spaeth N., Wyss M. Т., Pahnke J. Radioimmunotherapy targeting the extra domain В of fibronectin in C6 rat gliomas: A preliminary study about the therapeutic efficacy of iodine-131-labeled SIP(L19). // Nucl. Med. Biol. — 2006. — Vol. 33.—P. 661—666.

175. Sternberger N. II. Sternberger L. A. Blood-brain barrier protein recognized by monoclonal antibody. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. — 1987. — Vol. 84. — P. 8169-8173.

176. Sternberger N. H, Sternberger L. A., Kies M. W, Shear C. R. Cell surface endothelial proteins altered in experimental allergic encephalomyelitis. // J. Neu-roimmunol. — 1989. —Vol. 21. —P. 241-248.

177. Stewart L. A. Chemotherapy in adult high-grade glioma: A systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomized trials. // Lancet. — 2002. — Vol. 359. — P. 1011-1018.(161)

178. Stewart M. Intermediate filament structure and assembly 11 Curr. Opin. Cell Biol.- 1993.-Vol. 5.-P. 3-11.

179. Suarez S., Ballmer-Hofer K. VEGF transiently disrupts gap junctional communication in endothelial cells. J.Cell Sci. —2001. —V. 114 — P.1229-1235.

180. Sugiyama D, Kusuhara H, Shitara Y. et al. Characterization of the efflux transport of 17beta-estradiol-D-17beta-glucuronide from the brain across the blood-brain barrier. // J. Pharmacol. Exp. — 2001. — V. 298. — P. 316-322.

181. Swanson L. W. Brain Maps: Structure of the Rat Brain. 2nd Edition. — 1998. —Amsterdam, Elsvier Science Publishers В. V.

182. Tai Y. F., Piccini P. Applications of positron emission tomography (PET) in neurology // J. Neurol. Neurosurg. Psych. — 2004. — Vol. 75. — P. 669-676.

183. Toi M., Kondo Sk, Suzuki II. et al. Quantitative analysis of vascular endothelial growth factor in primary breast cancer //Cancer.— 1996.— V.77.— P.l 101-1106.

184. Tran T, Engfeldt T, Orlova A, Widstrom C, Bruskin A, Tolmachev V, Karlstrom AE. In vivo evaluation of cysteine-based chelators for attachment of99mTc to tumor-targeting Affibody molecules // Bioconjug Chem.— 2007 — V. 18(2) — P.549-58.

185. Trojan J. Cloix J.-F. Ardourel M.-Y. Insulin-like growth factor type I biology and targeting in malignant gliomas // Neuroscience. — 2007. — Vol. 145. — P. 795-811.

186. Van der Geer P., Hunter Т., Lindberg R.A. Receptor protein-tyrosine kinases and their signal transduction pathways //Annu Rev. Cell. Biol.— 1994.— V.10.—P.251—337.

187. Verity A. N., Wyatt T. L., Hajos B. et al. Regulation of glial cell line-derived neurotrophic factor release from rat C6 glioblastoma cells. // J. Neuro-chem. — 1998. — Vol. 70. — P. 531-539.

188. Victorov I. V, Prass K., Dirnagl U. Improved selective, simple, and contrast staining of acidophilic neurons with vanadium acid fuchsin. // Brain Res. Protoc.—2000. —Vol. 5, —P. 135-139.

189. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. (1976)- Enzime immunoasseys in diagnostic medicine: Theory and practice. — Bull. WHO — V.53 — P.55-65.

190. Wang C.X., Yang Y.//Brain Res. Protocols~2001 -V.7—p. 115-120.

191. Wagner S, Fueller T, Hummel V, Rieckmann P, Tonn JC. Influence of VEGF-R2 inhibition on MMP secretion and motility of microvascular human cerebral endothelial cells (HCEC). // J Neurooncol. —2003. —V.62(3). —P.221-31

192. Wagnerova J, Cervenakova L, Balabanov R. et al. Cytokine regulation of E-selectin in rat CNS microvascular endothelial cells: differential response of CNS and non-CNS vessels. // J Neurol Sci —2002. — V. 195(1). — P.51-62.

193. Watanabe Т., Katayama Y., Kimura S., Yoshino A. Control of proliferation and survival of C6 glioma cells with modification of the nerve growth factor autocrine system. // J. Neurooncol. — 1999. — Vol. 41. — P. 121-128.

194. Whittle I. R., MacArthur D. C., Malcom G. P. et al. Can experimental models of rodent implantation glioma be improved? A study of pure and mixed glioma cell line tumors. // J. Neurooncol. — 1998. — Vol. 36. — P. 231-242.

195. Wikstrand C. J., Zalutsky M. R., Bigner D. D. Therapy of brain tumors with radiolabeled antibodies. In: Liau L. M., Becker D. P., Cloughsey T. F., Bigner D.

196. D., (Eds). — Brain tumor immunotherapy. — Totowa: Humana Press. — 2001.1. P. 205-229.

197. Witzig ТЕ. Yttrium-90-ibritumomab tiuxetan radioimmunotherapy: a new treatment approach for B-cell non-Hodgkin's lymphoma. // Drugs Today (Bare).2004.—Vol. 40. —P. 111-119.

198. Wolburg H., Neuhaus J., Kniesel U. et al. Modulation of tight junction structure in blood-brain barrier endothelial cells. Effects of tissue culture, second messengers and cocultured astrocytes.// J. of Cell Science —1994. —V.107. —P. 1347-1357.

199. Wolburg, H., Lippoldt. A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. // Vase. Pharmacol. — 2002. — Vol. 38.1. P. 323-337.

200. Wong E. T. Management of central nervous system lymphomas using monoclonal antibodies: challenges and opportunities. // Clin Cancer Res. —2005. — V.I. — P.7151s-7157s.

201. Yarden Y, Sliwkowski M. Untangling the ErbB signalling network. // Nat Rev Mol Cell Biol. —2001. — V.2. —P. 127-37.

202. Yarden Y. The EGFR family and its ligands in human cancer signaling mechanisms and therapeutic opportunities. // Eur J Cancer. — 2001. — Vol. 37.(Suppl. 4). — P. S3-8.

203. Zalutsky M. R. , Pozzi O. R. Radioimmunotherapy with alpha-particle emitting radionuclides. // Q. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. — 2004. — Vol. 48. — P. 289-296.

204. Zalutsky M. R. Current status of therapy of solid tumors: Brain tumor therapy // J. Nucl. Med. — 2005. — Vol. 46 (Suppl.). — P. 151S-156S.

205. Zalutskу M. R., Moseley R. P., Benjamin J. C. et al. Monoclonal antibody and F(ab')2 fragment delivery to tumor in patients with glioma: Comparison of intracarotid and intravenous administration. // Cancer Res. — 1990. — Vol. 50.1. P. 4105-4110.

206. Zhang GQ, Fang XZ, Wang ВQ, Sun W, Salai //DClmicopathological and immunohistochemical features of pulmonary blastoma: analysis of 4 cases and review of the literature.// Zhonghua Yi Xue Za Zhi — 2007.— V.87(15)— P. 1040-1042.

207. Zhang Z.G., Zhang L., Jiang Q. et al. VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain leakage in the ischemic brain.// J. clin. invest. —2000. — V.106. —P. 829-838.

208. Zhu C., Ghabriel M. N., Blumbergs P. C. et al Clostridium perfringens prototoxin-induced alteration of endothelial barrier antigen immunoreactivity at the blood-brain barrier. // Exp. Neurol. — 2001. — Vol. 169. — P. 72-82.

209. Zhu Y, Parada LF. The molecular and genetic basis of neurological tumors. // Nat. Rev. Cancer — 2002. — Vol. 2. — P. 616 626.

210. Zwijsen A. Identification of growth factors and inhibitors of neutrophic activities secreted by rat C6 glioma. // Ph. D. thesis. — 1994. — University of Antwerp, Belgium.

Информация о работе

Юсубалиева, Гаухар Маратовна
кандидата медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку в оценке проницаемости гемаоэнцефалического барьера при экспериментальной глиоме С6 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы