Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому C6

Шеин, Сергей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому C6
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому C6"

На правах рукописи ^(¿ШлЛ.

005055656

ШЕИН Сергей Александрович

Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому С6

03.01.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 2 НОЯ 2012

Москва 2012

005055656

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии имени В.П. Сербского» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, Чехонин Владимир Павлович

доктор медицинских наук, Гурииа Ольга Ивановна

Официальные оппоненты:

Барышников Анатолий Юрьевич,

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, директор

Ипатова Ольга Михайловна,

доктор биологических наук, ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. отделом

Ведущее учреждение:

ФГБУН «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится « 13 » декабря 2012 г. в II00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.010.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д. 10, стр.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН Автореферат разослан «_б_» ноября 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

Карпова Е.А.

Актуальность

Мультиформная глиобластома - наиболее агрессивная из первичных злокачественных опухолей головного мозга, средняя выживаемость, при которой составляет около 1 года после постановки диагноза [Norden A.D. et al., 2009]. На сегодняшний день не существует эффективных методов лечения данного заболевания. В связи с чем, активно идет поиск и изучение опухоль-ассоциированных антигенов. Прогрессирование солидных опухолей во многом зависит от степени васкуляризации и ангиогенеза в малигнизированной ткани [Folkman J., 2006, Jain R.K. et al., 2007]. Из целого спектра проангиогенных факторов наиболее важным является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), который играет ключевую роль в физиологическом и патологическом ангиогенезе [Ferrara N. et al., 2003, Ferrara N, 2004]. Кроме того, повышенный уровень экспрессии VEGF выявлен в различных типах опухолей, в частности в глиомах III-IV степени злокачественности [Schmidt N.O. et al., 1999, Samoto К. et al., 1995, Plate K.H., 1999], поэтому этот фактор может рассматриваться как перспективная молекулярная мишень, для транспорта контейнерных систем в опухоли мозга. Кроме того, подавление функций VEGF приводит к регрессии неопластических сосудов [Jain R.K., 2001, Jain R.K., 2005] и может сдерживать рост опухоли [Borgstrom P. et al., 1999, Kim K.J. et al., 1993].

Тем не менее, на сегодняшний день существуют противоречивые данные относительно эффективности применения бевацизумаба при опухолях мозга, и целесообразность такого подхода остается спорной [Norden A.D. et al., 2009, Miletic H. et al., 2009, Bergers G., Hanahan D„ 2008, Keunen O. etal., 2011, Chi A.S. etal., 2009, Lakka S.S., Rao J.S., 2008]. Так продемонстрирована значительная активация инвазии и инфильтрации опухолевых клеток в паренхиму мозга при антиангиогенной терапии [Lucio-Eterovic A.K. et al, 2009, Paez-Ribes M. et al., 2009, Ebos J.M. et al., 2009, Sakariassen P.O. et al., 2006, Keunen O. et al., 2011, Bikfalvi A. et al., 2011]. Стоит отметить, что большинство исследований противоопухолевых эффектов бевацизумаба проводили на подкожных моделях, в то время как работ на интракраниальных моделях недостаточно. В связи с чем, есть очевидная необходимость изучить целесообразность антиангиогенной терапии на ортотопической (т.е. интра-краниальной) аллогенной модели высокоагрессивной глиомы С6 и продолжить разработку новых подходов направленного транспорта лекарств в опухолевую ткань. Один, из которых основывается на поиске привлекательной опухоль ассоциированной мишени и создании высокоселективной наноконтейнерной системы векторного типа, для доставки в опухоли мозга терапевтических и диагностических агентов.

Несмотря на то, что значительная часть злокачественных новообразований в высокой степени экспрессирует VEGF и этот белок является перспективной мишенью для ад-

ресной доставки контейнерных систем или наночастиц [Yortcheva К., Momekov G., 2011], возможность применения анти-VEGF антител в качестве молекулярного вектора изучена недостаточно. В 2010 г было показано, что бевацизумаб повышает клеточный захват и селективное накопление катионизированных липосом в культуре in vitro [Kuesters G.M., Campbell R.B., 2010]. Такой подход особенно перспективен для высокоселективной доставки контейнерных систем, с диагностическими и терапевтическими агентами, в очаги неконтролируемого ангиогенеза, в том числе в опухоли головного мозга через патологически измененный гемато-энцефалический барьер [Caraglia М. et al. 2012, Chekhonin V.P. et al., 2012]. Однако, вопрос о возможности применения VEGF в качестве мишени и моно-клональных анти-VEGF антител в роли вектора для направленного транспорта нанораз-мерных систем в опухоли мозга in vivo остается открытым. Таким образом, создание селективных векторных систем для адресной доставки на основе анти VEGF антител является актуальной задачей современной биохимии и нейроонкологии.

Цель работы: изучить перспективы применения и разработать высокоселективную наноконтейнерную систему на основе моноклональных анти-VEGF антител для направленного транспорта диагностических и терапевтических агентов в глиомы in vivo.

Задачи:

1. Изучить перспективу применения антигена VEGF, в качестве молекулярной мишени, и моноклональных анти-VEGF антител, в качестве вектора, для направленного транспорта наноразмерных систем в опухоли мозга.

2. Получить гибридому, продуцирующую моноклональные антитела к рекомби-нантному VEGF. Провести иммунохимическую характеристику полученных антител.

3. Оценить эффективность терапии моноклональными антителами к VEGF на ин-тракраниальной аллогенной модели С6 глиомы.

4. Исследовать накопление векторных наночастиц оксида железа на основе моноклональных анти-VEGF антител в глиоме методом МРТ при системном введении.

5. Оценить селективность накопления векторных липосомальных систем на основе моноклональных анти-VEGF антител в опухолевых клетках при системном введении.

Научная новизна:

1. Показано, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела при внутривенном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 накапливаются в опухолевой ткани.

2. Впервые in vivo на интракраниальной модели глиомы показано, что полученные анти-VEGF антитела, конъюгированные с липосомами и магнитными наночастицами значительно повышают уровень их накопления в опухолевой ткани.

3. Показано, что анти-VEGF антитела могут использоваться в качестве высокоселективного вектора для направленной доставки наноразмерных систем в злокачественные новообразования центральной нервной системы.

4. Впервые in vivo на интракраниальной модели глиомы показано, что липосомы конъюгированные с моноклональными анти-VEGF антителами при системном введении селективно накапливаются и захватываются опухолевыми клетками.

Практическая значимость.

Разработана векторная липосомальная контейнерная система на основе монокло-нальных анти-VEGF антител, которая способна селективно доставлять в глиомы диагностические и лекарственные препараты. Полученные результаты вносят реальный вклад в исследования направленной доставки контейнерных систем в клетки мишени, что позволит значительно повысить эффективность диагностики и терапии онкологических заболеваний, в том числе высокоагрессивных новообразований головного мозга.

Апробация диссертационной работы

Основные положения диссертационной работы были представлены на межлабораторных конференциях ФГБУ «ГНЦ ССП им. В.П. Сербского», Москва, 2010-2012; Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва, 2011-2012.

Первичная экспертиза диссертации произведена на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры и Отдела медицинских на-нобиотехнологий медико-биологического факультета ГБОУ ВПО Российского Национального Исследовательского Медицинского Университета имени Н.И. Пирогова Минздрава России и сотрудников Отдела фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ ГНЦ Социальной и Судебной Психиатрии имени В.П. Сербского Минздрава России 28 июня 2012 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них четыре - статьи в журналах рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 124 машинописных страницах, содержит 4 таблицы и 43 рисунка. Список литературы включает 6 отечественных и 221 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы.

Получение моноклональных анти-VEGF антител. Рекомбинантный VEGF-164 для иммунизации был получен и любезно предоставлен для исследований A.B. Леопольд [Леопольд A.B. и др., 2011]. Самок мышей линии Balb/C подкожно иммунизировали ре-комбинантным очищенным препаратом VEGF-164 крысы (25 мкг) с полным адъювантом Фрейнда («Difco laboratories», США). Иммунизация состояла из трех циклов: три подкожных иммунизации и заключительное бустерное введение препарата (100 мкг).

Получение гибридом проводили по методике Köhler G. и Milstein С. в нашей модификации [Чехонин В.П. и др., 2001]. Слияние спленоцитов иммунизированной мыши с клетками миеломной культуры Sp2/0-Agl4 осуществляли с помощью раствора полиэти-ленгликоль/диметилсульфоксид. Скрининг гибридных клеток продуцирующих анти-VEGF антитела проводили параллельно несколькими методами трехкратно: твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA), иммуноцитохимическим анализом (ИЦХ), иммуногистохимическим анализом (ИГХ) и иммуноблотингом. Для положительного контроля использовали коммерческие анти-VEGF антитела (10 мкг/мл, abl316 «Abcam», США). В качестве отрицательного контроля использовали неспецифические иммуноглобулины мыши в эквивалентной концентрации. Первичные антитела проявляли козьими антителами к F(ab)2 фрагментам иммуноглобулинов мыши, конъюгированными с перок-сидазой хрена и предабсорбированными сывороткой крысы (А3682, «Sigma», США). Им-мунофлуоресцентный анализ проводили с козьими антимьпциными антителами конъюгированными с Alexa Fluor 488 («Invitrogen», США) в разведении 1:1000, ядра клеток докрашивали DAPI («Invitrogen», США). Моноклональные антитела выделяли из асцита методом аффинной хроматографии на протеин А-агарозе («Invitrogen», США). Для получения первично меченных флуорохромом моноклональных анти-VEGF антител и неспецифических IgG использовали набор Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit («Invitrogen», США).

Константа аффинности. Аффинность полученных моноклональных антител к VEGF определяли методом ИФА, путем расчета константы гетерофазного равновесия образования комплексов антиген-антитело [BeattyJ.D. et al., 1987].

Wound-healing тест. Исследование биологической активности анти-VEGF антител in vitro проводили на клетках культуры Сб. Для этого нарушали клеточный монослой и добавляли анти-VEGF антитела (2 мкг/мл), в качестве контроля вносили неспецифические IgG (2 мкг/мл). Через 9 ч регистрировали степень восстановления монослоя в месте по-

вреждения. Площадь свободной области определяли в программе «Leica LAS AF» и рассчитывали процент оставшейся свободной области через 9 ч относительно первоначальной. Расчеты, построение диаграмм и статистический анализ проводили в программе «Microsoft Excel 2010».

Аитиангиогеиная терапия С6 глиомы. Интракраниальную опухоль моделировали на беспородных крысах с помощью внутримозговой стереотаксической имплантации клеток глиомы С6 [Чехонин В.П. и др., 2007]. Антиангиогенную терапию проводили очищенными моноклональными антителами на модели интракраниальной глиомы Сб. Первый этап эксперимента проводили на 9 животных с введением: анти-VEGF антител (п=4), неспецифических IgG (п=2) и PBS (п=3). Все препараты антител вводили в бедренную вену на 5, 12 и 19 сутки после имплантации глиомы в концентрации 3 мг/кг. Второй этап проводили на 14 животных с введением: анти-VEGF антител (п=4), препарата бевацизу-маб («Hoffmann-La Roche», Швейцария) (п=4), неспецифических IgG (п=3) и раствор PBS (п=3). Все препараты вводили в бедренную вену по следующей схеме: на 2, 9 и 16 сутки после имплантации в концентрации 10 мг/кг. Анализ выживания проводили по методу Каплана-Мейера, обрабатывали результаты в программе «Statistics 7.0».

Магнитно резонансная томография. Исследование накопления магнитных нано-частиц, которые были получены и любезно предоставлены для исследований М.А. Абакумовым [Абакумов М.А. и др., 2011, Абакумов М.А. и др., 2012] проводили на томографе Clinscan 7Т («Bruker», Германия) с постоянным магнитным полем 7 Тл. Для визуализации глиомы животным вводили внутривенно раствор наночастиц, конъюгированных с антителами к VEGF, а также с антителами к Сх43. Введённая доза наночастиц, в пересчёте на концентрацию железа, составляла 10 мг/кг. МРТ-сканирование проводили в режиме SWI (табл. 1).

Таблица 1. Параметры режима 8\У1, используемого для диагностики глиомы С6 с помощью магнитных наночастиц._

Время повтора импульса Время эхо Кол-во повторов Тип Толщина среза Параметры матрицы Параметры поля снимка Время исследования

33 мс 19 мс 1 3D 0,5 мм 320*230 пикселей 45*32 мм 2:58

Синтез липосом. В качестве контейнерной системы были использованы липосо-мы, которые готовили по следующей схеме: смешивали 3,75 мл пальмитоилолеилфосфа-тидилхолина (РС, 10 мг/мл), 10 мг холестерина, 210 мкл 1,2-дистеароил-8п-глицеро-3-

фосфоэтаноламин-М-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевой соли (DSPE-ПЭГ2000, 50 мг/мл), 40 мкл 1,2-дистеароил-5п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-М-[малеимид(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевой соли (DSPE-ПЭГ-малеимида, 10 мг/мл) и 37 мкл диметилдиоктодециламония бромида (DDAB, 10 мг/мл) в смеси хлороформа и метанола (3:1 по объему) [Perrie Y. et al., 2001, Shi N., Pardridge W.M., 2000]. Все липиды были приобретены в фирме «Avanti Polar Lipids», США. Полученную смесь помещали в роторный испаритель и сушили в течение 2 часов в атмосфере аргона при температуре 40°С и скорости вращения ротора 180 об/мин. Сухой остаток растворяли в 1 мл циклогек-сана, замораживали в жидком азоте и лиофилизировали в течение 5 часов. После лиофи-лизации к липидной пленке добавляли 2 мл PBS и образующуюся эмульсию обрабатывали ультразвуком, после чего подвергали 5 циклам замораживания (в жидком азоте) - размораживания (водяная баня, 40°С) и последовательно экструдировали через поликарбонатные мембраны с размерами пор 400 и 200 нм («Avanti Polar Lipids, Inc», США). В качестве флуоресцентной метки добавляли 0,1% Dil (1,1'-октадецил 3,3,3',3-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат).

Конъюгация антител с липосомами. Раствор антител (4 мг в 1 мл 0,1 М боратно-го буфера, содержащего 5 мМ ЭДТА) в течение часа инкубировали с 10-кратным молярным избытком 2-иминотиолана (реагент Траута, 40 мкг). Активированные антитела смешивали со свежеприготовленными липосомами в соотношении: 4 мг антител на 50 мкмоль PC (PBS, рН 7.4), полученную смесь инкубировали в течение ночи при 4°С. Им-мунолипосомы отделяли от остальных компонентов реакционной смеси и несвязанных моноклональных антител с помощью гель-фильтрационной хроматографии на колонке с сефарозой CL-4B, уравновешенной PBS буфером (0,5 мл/мин). Полученные векторные липосомы концентрировали на фильтрах с пределом пропускания 30 кДа («Millipore», США) при 1000 g до 4 мл.

Оценка накопления липосом in vitro. Эксперимент по захвату липосом in vitro проводили на фиксированных клетках глиомы С6 и глиобластомы U-87 MG человека. Готовили последовательные разведения анти-VEGF иммунолипосом (1:50-400) в полной ростовой среде RPMI-1640 и вносили к клеткам. В качестве контроля использовали немо-дифицированные липосомы и липосомы конъюгированные с неспецифическими IgG. Клетки инкубировали в течение 2-3 часов при 37°С, после чего трехкратно отмывали PBS без детергентов.

Оценка накопления липосом in vivo. Исследование проводили на крысах с интра-

краниальной глиомой Сб. Липосомы синтезировали за 3 дня до введения (50 мкмоль PC,

25 мкмоль холестерина на 6 животных). Перед введением препараты нормировали по по-

глощению флуорохрома Dil на спектрофотометре U-2800 («Hitachi», Япония) на длине волны 550 нм. Иммунохимическую активность подтверждали в ELISA. На 20 сутки развития опухоли векторные липосомы вводили в бедренную вену в объеме 500 мкл (на одно животное: 5 мкмоль пальмитоилолеилфосфатидилхолина, 2,5 мкмоль холестерина и 2,58 нмоль антител). Первой группе вводили липосомы конъюгированные с анти-VEGF антителами (п=3), второй - липосомы конъюгированные с неспецифическими IgG (п=2) и липосомы без векторных групп (п=2). Через двое суток проводили перфузию внутренних органов и извлекали головной мозг, который в течение суток выдерживали в 4% растворе параформальдегида. Срезы мозга докрашивали кроличьими поликлональными анти-GFAP антителами (1:400 в PBS без детергента). Визуализацию накопления проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе DMI 6000 («Leica», Германия) и лазерном конфокальном сканирующем микроскопе AIR MP («Nikon», Япония).

Результаты и обсуждения. Иммуноблотинг

Для подтверждения иммунохимической специфичности полученных антител по отношению к антигену VEGF, был проведен иммуноблотинг.

А ••-чаф t*4 60 45

< Ш1 m Mi 30 20

1 2 3 4 1 2 3 4 кДа

Рис. 1. Результаты иммуноблотинга антител к VEGF с рекомбинантным и на-тивным антигеном. А - проявление очищенным препаратом полученных моноклональ-ных анти-VEGF антител. Б - проявление коммерческими антителами к VEGF аЫ316 («Abcam», США). 1 - очищенный препарат рекомбинантного thioredoxin/VEGF-164 37 кДа. 2 - лизат клеток Е. coli без генетической конструкции с последовательностью VEGF. 3 - лизат клеток С6 глиомы крысы. 4 - лизат нормальных астроцитов крысы.

Референсные антитела интенсивно проявляли рекомбинантный VEGF 37 кДа (Б-1, рис. 1), в то время как нативный антиген распознавали значительно слабее: мономер VEGF ~24 кДа (Б-3, рис. 1) и димер VEGF -48 кДа (Б-4, рис. 1). Полученные монокло-нальные антитела, в данной постановке эксперимента, практически не проявляли бэнд ре-

комбинантного VEGF 37 кДа (А-1, рис. 1), но распознавали нативный мономер VEGF -24 кДа (А-3, рис. 1) и выраженно визуализировали нативный димер VEGF -48 кДа (А-3 и А-4, рис. 1). Результаты сравнительного анализа свидетельствуют о том, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела более аффинно связывают нативный димер VEGF. В то же время, коммерческие антитела в большей степени проявляли иммунохимическую

Рис. 2. Результаты иммуноблотинга антител к VEGF с рекомбинантным антигеном. 1 - маркер молекулярной массы. 2, 3 -очищенный рекомбинантный thioredoxin/VEGF-164 37 кДа, предварительно нагретый до 95°С. 4 и 5 - очищенный рекомбинантный thioredoxin/VEGF-164 37 кДа, внесенный в гель без нагревания. 2, 5 - проявление очищенным препаратом полученных моноклональных анти-VEGF антител. 3, 4 - проявление коммерческими антителами к VEGF («Sigma», США).

Дальнейшая иммунохимическая характеристика включала идентификацию связывания антител с рекомбинантным антигеном. Коммерческие антитела («Sigma», США) распознавали рекомбинантный VEGF с молекулярной массой 37 кДа, и в тоже время, проявляли бэнды с большей молекулярной массой -75 и 80 кДа (4, рис. 2). Что свидетельствует о присутствие в белковом препарате димерных форм рекомбинантного VEGF, которые связаны ковалентно через дисульфидный мостик. Анализируемые антитела визуализировали высокомолекулярные димеры VEGF -75 и 80 кДа (5, рис. 2) и мономер VEGF 37 кДа (2, рис. 2).

Серия иммуноблотингов позволила провести иммунохимическую идентификацию моноклональных антител. Эти результаты позволяют предполагать, что полученные нами моноклональные антитела к VEGF специфично распознают как рекомбинантный, так и нативный VEGF, но преимущественно взаимодействуют с нативным димером VEGF.

Константа аффинности антител

Константа диссоциации составила 6,99 ± 0,78x10"9 М и константа аффинности -1,37±0,15хЮ8 М"1. Однако, следует учитывать ряд важных факторов. Во-первых, аффинность определялась к рекомбинантному антигену VEGF. Во-вторых, вследствие возмож-

активность с рекомбинантным VEGF.

ных конформационных изменений, при сорбции УЕвР на поверхности полистирола, а также поверхностных эффектов, константа гетерофазного равновесия может отличаться от константы равновесия в растворе с нативным УЕОР. Кроме того, очищенные монокло-нальные антитела к УЕСИ содержат примесь эндогенных мышиных иммуноглобулинов в, что также искажает расчетную константу аффинности на 5-10%.

По результатам изотипирования, полученные моноклональные иммуноглобулины принадлежат к классу 02а.

Иммуноцитохимический анализ

О мт 25

Рис. 3. Иммунофлуоресцентный анализ моноклональных антител к VEGF на фиксированных клетках С6 глиомы крысы. А, В - визуализация полученными моно-клональными анти-VEGF антителами. С - отрицательный контроль, неспецифические иммуноглобулины мыши. D - коммерческие антитела к VEGF ab 1316 («Abcam», США). Анти-VEGF антитела проявляли антимышиными иммуноглобулинами конъюгированны-ми с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).

В иммуноцитохимическом анализе на клетках культуры С6 глиомы крысы полученные антитела к VEGF ярко окрашивали цитоплазму практически всех клеток (А и В

рис. 3). При этом наиболее интенсивно визуализировалась зона эндоплазмы (околоядерное пространство). Полученные результаты соответствуют общепринятым данным, поскольку УЕвР секретируемый белок, его синтез происходит в эндоплазматическом рети-кулуме, откуда в секреторных везикулах экспортные белки транспортируются в направлении цитоплазматической мембраны. Коммерческие антитела к УЕОР идентично окрашивали клетки: ярко визуализировали околоядерное пространство и слабее область эктоплазмы (Б, рис. 3). В отрицательном контроле специфической флуоресценции не наблюдалось (С, рис. 3).

А IB

О |jm 251

с Id

Рис. 4. Иммунофлуоресцентный анализ моноклональных антител к VEGF на фиксированных клетках культуры HUVEC человека. А, В - визуализация полученными моноклональными анти-VEGF антителами. С, D - коммерческие антитела к VEGF abl316 («Abcam», США). Анти-VEGF антитела проявляли антимышиными иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).

Сравнительный анализ полученных (А и В, рис. 4) и референсных антител (С и D, рис. 4) на клетках культуры человеческих эндотелиоцитов HUVEC показал полную идентичность субклеточной локализации. Анти-VEGF антитела интенсивно окрашивали ком-партменты ЭПР в зоне перинуклеарного пространства, в то время как по периферии цито-

плазмы визуализировались гранулярные структуры, выстраивающиеся вдоль тяжей цито-скелета. На представленных микрофотографиях хорошо видно, что для клеток НЦУЕС характерна своя уникальная картина окрашивания, которую воспроизвели полученные нами антитела.

По результатам комплексного иммуноцитохимического анализа и сопоставления иммунофлуоресцентной картины можно сделать вывод, что полученные антитела специфично визуализируют цитоплазматический пул нативного УЕвР на клеточных препаратах. Это подтверждает наши выводы, сделанные на основании анализа результатов имму-ноблот анализа, о том, что полученные антитела с большей аффинностью связывают на-тивный димер УЕОР. Это особенно важно для направленной терапии, поскольку антитела будут селективно распознавать и связывать биологически активный УЕОР. Кроме того, было убедительно продемонстрировано, что УЕОР экспрессируется глиомными клетками.

Иммуногистохимический анализ глиомы С6 крысы.

А 1 ' • ,0 . мт 250 со

С 0 М"" ^ 50 О 0 и" *5

Рис. 5. Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мозга крысы с глиомой С6 моноклональными анти-УЕСГ антителами. А - визуализация глиомных клеток и УЕОР-позитивных астроцитов в периопухолевом пространстве. В - визуализация клеток опухолевой ткани. С - визуализация УЕОР-позитивных реактивных астроцитов. О - отрицательный контроль, неспецифические иммуноглобулины. Анти-УЕОР антитела проявля-

ли антимышиными иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).

На следующем этапе был проведен иммуногистохимический анализ глиомных клеток С6 в процессе интракраниального развития опухоли. Полученные моноклональные антитела интенсивно окрашивали глиомные клетки (А и В, рис. 5). Локализация флуоресценции, соответствующая иммунофлуоресцентному окрашиванию анти-VEGF антителами, строго совпадала с опухолевым очагом, в то время как интактная ткань оставалась темной. Что свидетельствует о высоком уровне экспрессии VEGF глиомными клетками, не только в культуре in vitro, но и в процессе роста и развития опухоли in vivo.

На границе глиомы и паренхимы нервной ткани, в зоне астроглиоза, присутствуют ярко окрашенные клетки звездчатой морфологии - VEGF-позитивные реактивные астро-циты (С, рис. 5). Феномен реактивного астроглиоза при повреждениях нервной ткани хорошо известен [Salhia В. et al., 2000]. В отрицательном контроле, при окрашивании неспецифическими мышиными иммуноглобулинами, ни в опухолевой, ни в нормальной ткани флуоресценции не наблюдалось (D, рис. 5).

Результатам проведенного иммуногистохимического анализа позволяют сделать следующие выводы. Полученные моноклональные анти-VEGF антитела иммунохимиче-ски специфичны к VEGF, селективно визуализируя на срезах мозга VEGF-позитивные структуры. Выраженно окрашивается опухолевая ткань и отдельные реактивные астроци-ты в перитуморальном пространстве, а также микрососуды в паренхиме нервной ткани. Представленные результаты соответствуют существующим данным иммуногистохимического окрашивания нервной ткани антителами к VEGF [Ogunshola О.О. et al., 2000]. Стоит отметить, что большинство глиомных клеток были VEGF-позитивны. Это свидетельствует в пользу того, что VEGF является опухоль ассоциированным белком, синтез которого значительно повышается в малигнизированной ткани.

Исследование биологической активности антител in vitro

Хорошо известно, что антитела к VEGF предотвращают активацию рецепторов VEGFR и трансдукцию сигнала [Wedam S.B. et al., 2000], ингибируя пролиферацию и миграцию клеток. В связи с чем, целью нашего эксперимента было изучение влияния антител к VEGF на рост клеток глиомы С6 in vitro.

Моноклональные антитела к VEGF в концентрации 2 мкг/мл замедляли восстановления монослоя клеток глиомы Сб. В контроле с неспецифическими иммуноглобулинами

в эквивалентной концентрации зона повреждения монослоя заполнялась мигрирующими клетками.

ВО 70 60 50 40 30 20 10 О

1 68

Неспецифические иммуноглобулины, 2 мкг/мл

i Анти-VEGF антитела, 2 мкг/мл

Площадь п

овреж^

ения монослоя через часов

Рис. б. Площадь повреждения монослоя клеток С6 глиомы в процентах через 9 часов.

По оси ординат процент оставшейся площади повреждения относительно первоначальной площади повреждения. Синий столбец - неспецифические иммуноглобулины 2 мкг/мл, через 9 ч сохраняется только 37±2,9% свободной площади, повреждение практически зарастает (п=3, S=2,9). Красный столбец - моноклональные анти-VEGF антитела 2 мкг/мл, через 9 ч сохраняется 68±7,5% свободной площади, ингибирование восстановления монослоя в 1,8 раз (п=3, S=7,5, р<0,05).

В случае анти-VEGF антител монослой восстанавливался медленно, через 9 ч инкубации среднее значение площади, свободной от клеток глиомы, составило 68±7,5% от первоначальной площади (рис. 6). Тогда как с неспецифическими IgG площадь повреждения восстанавливалась и заполнялась клетками значительно быстрее: через 9 ч оставалось лишь 37±2,9% свободной площади. Таким образом, достоверно показано (р<0,05), что моноклональные анти-VEGF антитела ингибируют восстановление клеточного монослоя in vitro.

Оценка накопления меченных антител в опухоли in vivo

На следующем этапе важно было исследовать возможность использования полученных антител в направленной терапии опухолей мозга или адресной доставке лекарств. Для этого моноклональные антитела к VEGF, конъюгированные с флуорохромом, внутривенно вводили крысам с имплантированной глиомой Сб.

Рис. 7. Флуоресцентный анализ накопления меченных Alexa Fluor 488 антител при внутривенном введении крысам с интракраниальной глиомой С6 через 24 ч. А,

В - моиоклоиальные анти-VEGF антитела, визуализация накопления в опухолевой ткани. С - моноклональные анти-VEGF антитела, паренхима нервной ткани D- неспецифические иммуноглобулины, опухолевая ткань.

Через 24 ч после введения препарата, в опухоли было обнаружено накопление мо-ноклональных анти-VEGF антител (А и В, рис. 7). Визуализировались группы клеток в различных регионах опухоли, как в центре, так и по периферии. В паренхиме нервной ткани специфической флуоресценции не наблюдалось (С, рис. 7), что в первую очередь объясняется интактным гемато-энцефалическим барьером (ГЭБ), не пропускающим высокомолекулярные соединения из кровотока в мозг. При внутривенном введении меченных неспецифических иммуноглобулинов накопление в опухоли отсутствовало (D, рис. 7). Что подтверждает именно специфическое накопление моноклональных анти-VEGF антител в ткани с высокой концентрацией VEGF за счет селективного взаимодействия с антигеном, а не пассивную диффузию из плазмы в межклеточное пространство опухоли. Полученные данные дают основания сделать вывод о том, что при нарушении целостности гемато-энцефалического барьера, вследствие патологических процессов, анти-VEGF антитела могут быть использованы в качестве вектора для направленного транспорта в VEGF-позитивные клетки.

Антиангиогенная терапия

Мы показали, что полученные моноклональные анти-VEGF антитела распознают нативный димер VEGF, визуализируют в ИГХ опухолевые ткань, ингибируют рост клеток С6 in vitro и накапливаются в глиоме при системном введении. В связи с чем, была сформулирована задача: изучить эффективность анти-VEGF монотерапии на ортотопической аллогенной модели высокоагрессивной глиомы Сб.

Кривая выживаемости Каплана-Мейера о Гибель животного

20 21 22 23 24 25 26 27 Время после имплантации опухоли, сутки

— igG

— Анти-VEGF 29 Авастин

— - PBS

Рис. 8. Анализ выживаемости контрольных (IgG, PBS) и опытных групп (анти-VEGF антитела, авастин) животных с глиомой С6 по методу Каплана-Мейера.

Однако, антиангиогенная терапия, как моноклональными антителами, полученными нами, так и коммерческим бевацизумабом, не продлевала жизнь крысам с глиомой С6 (рис. 8). Достоверных различий по выживаемости между опытными и контрольными группами не обнаружено, все животные погибали между 22 и 28 сутками. Более того, моноклональные анти-VEGF антитела не влияли на объем и рост интракраниальной опухоли. Увеличение терапевтической дозы антител в 3,3 раза (с 3 до 10 мг/кг) и раннее начало лечения также не дали никакого эффекта. В связи с вышеизложенным можно предположить, что анти-VEGF монотерапия не эффективна при ортотопической глиоме Сб. Интересно, что в последнее время количество публикаций, в которых отмечается низкая эффективность антиангиогенной терапии опухолей мозга, значительно возросло. Так на интракраниальной ксеногенной модели глиобластомы бевацизумаб практически не влиял на скорость роста глиомы [Кеипеп О. et al., 2011]. Не смотря на успехи применения беваци-

зумаба при колоректальном раке и раке молочной железы, в случае глиом III-IV степени злокачаственности анти-VEGF терапия остается малоэффективным инструментом.

Векторные наночастицы для МРТ-визуализации

Установлено, что многие солидные опухоли, в том числе опухоли мозга, гиперэкс-прессируют VEGF [Schmidt N.O. étal., 1999, Samoto К. étal., 1995, Plate K.H.,. 1999]. Нами было показано, что клетки глиомы in vitro в культуре и при интракраниальном развитии in vivo характеризуются повышенным уровнем синтеза данного фактора. VEGF является секретируемым белком и его концентрация велика в межклеточном пространстве, кроме того, часть изоформ закреплена на мембране клеток и в межклеточном матриксе [Ferrara N.. 2004]. В связи с чем, есть основания полагать, что VEGF может использоваться как мишень в молекулярной визуализации патологической ткани. Целью эксперимента было продемонстрировать специфическое накопление векторных магнитных наночастиц (90±5 нм) на основе моноклональных анти-VEGF антител в опухолевой ткани методом MP томографии.

До введения Через 24 ч

IgG IgG

1 I V VEGF D VEGF

Рис. 9. МРТ-визуализация накопления векторных наночастиц в мозге крыс с интракраниальной глиомой Сб. А, С - до введения препаратов наночастиц. В, О - через 24 ч после введения магнитных наночастиц 10 мг/кг по железу. В - наночастицы конъю-гированные с неспецифическими иммуноглобулинами. О - наночастицы конъюгирован-ные с моноклональными анти-УЕСР антителами, накопление детектируется в очаге глиомы.

Через 24 часа, после введения наночастиц на основе моноклональных анти-VEGF антител, детектируется селективное накопление анти-VEGF наночастиц в опухолевой ткани (D, рис. 9). При в/в введении препаратов конъюгированных с неспецифическими иммуноглобулинами изменений в накоплении и интенсивности сигнала не наблюдалось (А и В, рис. 9), что объясняется отсутствием векторной специфичности у вводимого препарата.

Таким образом, было показано, что моноклональные антитела к VEGF позволяют селективно направлять в клетки мишени наноразмерные структуры, повышая уровень их накопления и тропность к опухолевой ткани. Применение контрастных направленных систем позволит проводить молекулярную визуализацию и неинвазивную диагностику солидных опухолей на ранних стадиях.

Накопление липосом in vitro

Одним из принципиально новых направлений повышения эффективности лечения опухолей мозга может оказаться адресная высокоселективная доставка наноразмерных контейнерных систем векторного типа на основе моноклональных антител [Yoncheva К., Momekov G., 2011, Kuesters G.M., Campbell R.B., 2010, Caraglia M. et al. 2012, Chekhonin V.P. et al., 2012]. Мы показали, что VEGF является опухолеспецифичной и гиперэкспрес-сируемой молекулярной мишенью, а моноклональные анти-VEGF антитела - потенциальным вектором для направленной доставки. Поэтому, следующей задачей была разработка контейнерной селективной транспортной системы на основе моноклональных анти-VEGF антител, способной доставлять вещества различной природы в опухоли мозга.

В качестве контейнера были использованы stealth-липосомы, модифицированные полиэтилен гликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 2000 Да. Такое внешнее покрытие липосом, состоящее из ПЭГ, продлевает время циркуляции липосом в кровотоке, замедляя системную элиминацию и захват фагоцитирующими клетками. Конъюгацию между липо-сомами и анти-VEGF антителами осуществляли через малеимидную группу липидов и сульфгидрильную группу активированного белка.

К.

'Я

Шп

О Мт 25 И В

Рис. 10. Флуоресцентный анализ накопления липосом на фиксированных клетках С6 глиомы. А, В - визуализация клеток после инкубации с анти-УЕОР иммуно-липосомами (красный). С - ПЭГилированные липосомы, без конъюгации с антителами. О - липосомы конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами. Ядра докрашены БАР1 (синий).

Анти-УЕвР иммунолипосомы связывали цитоплазматический пул УЕвР и визуализировали практически все клетки на фиксированном препарате С6 глиомы (А и В, рис. 10). В то время как, после инкубации ПЭГилированных липосом с клетками окрашивания не наблюдалось (С, рис. 10). В случае липосом конъюгированных с неспецифическими антителами флуоресцентный сигнал детектировался (О, рис. 10), однако значительно более слабый по сравнению с анти-УЕОР липосомами. Более выраженное накопление анти-УЕОР иммунолипосом (А и В, рис. 10), относительно липосом с неспецифическими (Б, рис. 10), свидетельствует о селективном накоплении векторной системы, за счет взаимодействия векторной группы липосом (моноклональные анти-УЕОР антитела) с антигеном.

Накопление векторных липосом в опухоли in vivo

Lipo

LipolgG

< -Р •i.

Lipo

MAbVEGF

,• -v:

Для исследования селективности накопления векторных липосом в условиях in vivo крысам с Сб глиомой в бедренную вену вводили препараты липосом (210±10 нм) в объеме 500 мкл, нормированные по липидам, белку и флуоресцентной метке (на одно животное по липидному составу ~5 мкмоль фосфатидилхолина и 2,5 мкмоль холестерина).

Рис. 11. Флуоресцентный анализ накопления липосом в опухолевой ткани при внутривенном введении крысам с интракраниалыюй глиомой С6 через 48 ч. А - ПЭГили-рованные липосомы. В - ПЭГи-лированные липосомы конъюги-рованные с неспецифическими иммуноглобулинами. С - селективное накопление ПЭГилиро-ванных липосом конъюгирован-ных с моноклональными анти-VEGF антителами в глиоме. Ядра докрашены DAPI (синий).

Сравнительный флуоресцентный анализ срезов мозга выявил значительные отличия в накоплении липосомальных препаратов разной конструкции (рис. 11). Так, ПЭГили-рованные липосомы, без модификации векторной молекулой, практически не накапливались в опухолевой ткани (А, рис. 11). Накопление липосом с неспецифическими иммуноглобулинами детектировалось в большей степени, наиболее яркие области, представляющие из себя вытянутые структуры, локализованные преимущественно в центральной части опухоли (В, рис. 11). Подобная визуализация, по-видимому, ассоциирована с накоплением иммунолипосом в патологических сосудах, вследствие нарушения их перфузии и застоя плазмы. А благодаря высокой проницаемости опухолевых сосудов и нарушения целостности ГЭБ происходит диффузия липосом из кровотока в межклеточное простран-

ство глиомы. На представленной микрофотографии хорошо видно, что основное накопление метки сконцентрировано вокруг отдельных очагов с интенсивной флуоресценцией (В, рис. 11).

Накопление анти-УЕОР липосом (С, рис. 11), у всех 3 животных, многократно превосходило аналогичное в контрольных группах (А и В, рис. 11). Стоит отметить, что интенсивно визуализировалась вся опухолевая ткань, как в центральной зоне, таки по периферии. Сопоставление уровня и картины флуоресценции трех проанализированных препаратов подтверждает селективность и специфичность разработанной липосомальной системы на основе анти-УЕОР антител. По-видимому, проникновение анти-УЕОР липосом происходило из патологических сосудов, подобно липосомам с неспецифическими иммуноглобулинами: хорошо заметны яркие области, с высокой концентрацией липосом (С, рис. 11). Таким образом, циркулируя в кровотоке, иммунолипосомы через патологические сосуды проникают в интерстициальное пространство. Однако, векторные анти-УЕОР ли-посомы селективно накапливаются в области локализации антигена по градиенту УЕОР. Видно более равномерное распределение флуоресцентной метки и накопление по всему объему глиомы, что подтверждает направленный транспорт из кровотока в малигнизиро-ванную ткань за счет векторной специфичности.

Г*

- ж . '« '■ V .у- • * \ v - 1 ■■■ 1л v ..-. V 1

иг1' . , н . ч ^ * / x

■ - v V V., ¿'М А ■ „г л . « \ 1в -

Рис. 12. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия накопления им-мунолипосом в опухолевой ткани при внутривенном введении крысам с интра-краниалыюй глиомой С6 через 48 ч. А - селективный захват анти-УЕОР липосом опухолевыми клетками. В - накопление неспецифических иммунолипосом в микрососудах. Ядра докрашены БАР1 (синий).

Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия позволила на клеточном уровне локализовать накопление липосом в глиоме. Хорошо видно, что анти-УЕОР липосомы ак-

тивно захватываются и интернализуются практически всеми опухолевыми клетками (А, рис. 12). Подтверждая вывод о селективности векторной системы и ее эффективном накоплении в опухолевой ткани. При этом, выделяются отдельные клетки накопившие значительно больше флуоресцентной метки. В то время как 1§0-липосомы визуализировали микрососуды (В, рис. 12), незначительно захватывая» глиомными клетками.

Рис. 13. Флуоресцентный анализ накопления липосом в перитуморальном пространстве. Для визуализации астроцитов срезы докрашены поликлональными анти-GFAP антителами. А, В - селективное накопление анти-VEGF липосом в глиомных клетках на границе опухоли и паренхимы мозга. С - ПЭГилированные липосомы. D - липосо-мы конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами. Ahth-GFAP антитела проявляли антикроличьими иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).

Иммунохимическая визуализация реактивных астроцитов (зеленый цвет) позволила достоверно разграничить перитуморальное пространство от глиомы, и утверждать о высокой селективности векторных иммунолипосом по отношению к опухолевой ткани. Так ПЭГилированные липосомы практически не визуализировали опухолевые клетки (С, рис. 13), как и неспецифические иммунолипосомы, которые накапливались преимущественно в сосудах (D, рис. 13). В то время как, селективное накопление векторных анти-

УЕОР липосом выраженно окрашивало опухолевую ткань, совпадая с границей астрогли-ального вала (А и В, рис. 13). Это свидетельствует о специфичности нашей контейнерной системы по отношению к глиоме и высокой степени ее захвата УЕОР-позитивными опухолевыми клетками. Однако, часть реактивных астроцитов также секретирует УЕйР, который регулирует репаративный ангиогенез. Интересно, что анти-УЕСР липосомы захватываются и отдельными астроцитами (А, рис. 14) в перитуморальном пространстве.

■'■ .г

- . / У' * х ' • . ... • / ! ** • if * -Г" ■ #

/ • 'Чл 'f. ' ■ ' ' Ф/

А ,л"т т В 11 и.„

Рис. 14. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия захвата анти-VEGF иммунолипосом мигрирующими опухолевыми клетками и реактивными астроцитами в перитуморальном пространстве. Для визуализации астроцитов проводили иммунофлуоресцентное окрашивание анти-GFAP антителами. А - захват векторных липосом астроцитами и опухолевыми клетками в перитуморальном пространстве. В - захват векторных липосом глиомной клеткой. Ahth-GFAP антитела проявляли антикроличьими иммуноглобулинами конъюгированными с Alexa Fluor 488 (зеленый), ядра докрашены DAPI (синий).

Сканирование перитуморального пространства подтвердило выраженное накопление иммунолипосом в мигрирующих глиомных клетках (А, рис. 14), а также в астроцитах, что свидетельствует об эффективной антиген-направленной доставке и создании высокой концентрации векторизованной системы в данной области опухоли. Возможно, такой подход окажется эффективным в отношении инвазивной популяции клеток, в том числе при терапии резистентных опухолевых фенотипов. Хорошо видно, что интернализованная флуоресцентная метка визуализируется в виде относительно крупной зернистости, которая вероятно является скоплением липосом в эндосомах (В, рис. 14).

Заключение.

Таким образом, на основании результатов флуоресцентного анализа и оценки накопления липосом можно сделать важные выводы. При системном введении векторные липосомы на основе моноклональных анти-VEGF антител селективно накапливаются в опухолевой ткани. Известно, что вследствие патологического строения сосудистой сети, высокого внутричерепного давления и развития отека, транспорт терапевтических агентов в опухоли мозга затруднен. Нами было показано, что иммунолипосомальные контейнерные системы, способны проникать из системного кровотока через измененный патологическим процессом ГЭБ в глиомную ткань. При таком подходе, высокая проницаемость сосудов и отсутствие полноценного гистогематического барьера, характерных для опухолей, способствуют накоплению липосом, в то время как в нормальной ткани, с интактным ГЭБ, подобного не происходит.

Сравнительный анализ показал значительные различия в накоплении ПЭГилиро-ванных липосом с неспецифическими и анти-VEGF антителами. В первом случае, визуализация опухолевых клеток обнаруживается вблизи отдельных очагов накопления, в то время как в большей части опухолевой ткани окрашивались только микрососуды. Что, свидетельствует о пассивной диффузии и неспецифической адгезии липосом. В то время как анти-VEGF липосомы накапливаются и распределяются по всем участкам опухоли, активно захватываясь и интернализуясь глиомными клетками. В перитуморальном пространстве визуализируются мигрирующие глиомные клетки и астроциты.

Разработанная нами липосомальная система на основе моноклональных антител к VEGF обладает селективностью по отношению к VEGF-позитивным клеткам и эффективно накапливается в патологической ткани при системном введении. Пролонгированная циркуляция контейнерной системы в кровотоке (за счет ПЭГилирования) и тропность к опухолевой ткани (за счет векторных антител) может обеспечить высокоэффективную направленную доставку лекарств в опухоли ЦНС. Подобный подход, основанный на высокоселективной доставке наноразмерных контейнерных систем, может существенно повысить эффективность терапии солидных опухолей, в том числе высокоагрессивных и резистентных глиом. Кроме того, результаты данной работы подтверждают, что VEGF является перспективной опухолеспецифичной мишенью, а моноклональные анти-VEGF антитела — селективным молекулярным вектором для направленной доставки наноконтейнеров и наночастиц в опухоли мозга in vivo.

Выводы.

1. Модифицированный способ иммунизации мышей рекомбинантным препаратом VEGF-164 позволил получить В-лимфоциты селезенки, способные при слиянии с клетками миеломной культуры Sp2/0-Agl4 образовывать гибридные клетки, продуцирующие моноклональные анти-VEGF антитела изотипа G2a, характеризующиеся константой аффинности - 1,37±0,15х108 М"1. Полученные моноклональные анти-VEGF антитела способны специфично распознавать рекомбинантный и нативный VEGF в иммуноблот анализе, а также визуализировать VEGF-позитивные клетки.

2. Препарат моноклональных анти-VEGF антител, меченных флуорохромом Alexa Fluor 488 и введенных внутривенно, способен захватываются клетками интракраниальной глиомы и накапливаться в опухолевой ткани, визуализируясь в иммунофлуоресцентном анализе.

3. Терапия препаратом моноклональных анти-VEGF антител крыс с ортотопиче-ской глиомой С6 в концентрации 3 и 10 мг/кг при внутривенном введении не оказывает влияния на выживаемость экспериментальных животных и объем опухоли.

4. Конъюгация моноклональных анти-VEGF антител с магнитными наночастицами оксида железа (гидродинамический диаметр 90±5 нм), и холестерин- фосфатидилхолино-выми липосомами (210±10 нм) объективно повышает уровень их накопления в опухолевой ткани при внутривенном введении и качество визуализации глиом методами МРТ исследования в режиме SWI и флуоресцентного анализа.

5. Внутривенное введение крысам с интракраниальной глиомой С6 ПЭГилирован-ных липосом, конъюгированных с моноклональными анти-VEGF антителами (2,58±0,17 нмоль антител), приводит к их специфичному захвату клетками глиомы и реактивными астроцитами, а также позволяет визуализировать накопление в опухолевой ткани.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Леопольд A.B., Баклаушев В.П., Корчагина A.A., Шеин С.А., Гриненко Н.Ф., Павлов К.А., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Лиганд-рецепторный анализ в оценке функциональной активности рекомбинантных VEGF и экстраклеточного фрагмента VEGFR-1 человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2011. Т.152(12). С. 647-

2. Шеин С.А., Турина О.И., Леопольд A.B., Баклаушев В.П., Корчагина A.A., Гриненко Н.Ф., Иванова Н.В., Волгина Н.Е., Рябухин И.А., Чехонин В.П. Получение моно-клональных антител к рекомбинантному фактору роста эндотелия сосудов. // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012. (1) С. 24-28.

3. Чехонин В.П., Шеин С.А., Корчагина A.A., Турина О.И. Роль VEGF в развитии неопластического ангиогенеза. //Вестник РАМН. 2012. (2) С. 23-34.

4. Абакумов М.А., Шеин С.А., Вишвасрао X., Нуколова Н.В., Сокольски-Папков М., Сандалова Т.О., Губский И.Л., Гриненко Н.Ф., Кабанов A.B., Чехонин В.П. Визуализация экспериментальной глиомы С6 методом МРТ с помощью магнитных наночастиц, конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012 Т. 154(8) С. 242-246.

5. Шеин С.А., Леопольд A.B. Получение моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов. // Материалы VI Международной (XV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2011 г. Вестник РГМУ. 2011. спец. выпуск (1). С. 230.

6. Шеин С.А. Получение моноклональных антител к фактору роста эндотелия сосудов. // Материалы VII Международной (XVI Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых, Москва 2012 г. Вестник РГМУ. 2012. спец. выпуск (1). С. 214.

651.

Заказ № 11 б-П/10/2012 Подписано в печать 31.10.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,25

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шеин, Сергей Александрович

Список сокращений.

Актуальность.

Глава I. Обзор литературы: Фактор роста эндотелия сосудов как мишень противоопухолевой терапии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому C6"

Функции VEGF.10

Роль VEGF в развитии опухолей.18

Бевацизумаб в клинических исследованиях.24

Механизмы резистентности.28

Опухолевые стволовые клетки.34

Иммунолипосомы для адресной доставки лекарств.35

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шеин, Сергей Александрович

Выводы.

Благодарности.

Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям Владимиру Павловичу Чехонину и Ольге Ивановне Гуриной за неоценимую помощь на протяжении всей работы и ценные советы, Наталье В. Нуколовой за помощь в работе с липосомами, Максиму А. Абакумову за помощь в работе с наночастицами, Анне В. Леопольд за помощь в наработке и очистке рекомбинантного VEGF, Надежде Е. Волгиной за помощь в работе к культурой HUVEC, Карине ТУТ. Кардашовой за помощь в работе с гибридными клетками, Владимиру Павловичу Баклаушеву и Гаухар Маратовне Юсубалиевой за помощь в освоении иммунохимических и хирургических методов, Надежде Филипповне Гриненко за помощь в работе с культурами клеток, Клавдии Павловне Ионовой и сотрудникам вивария за помощь в работе с животными, Кристине В. Новиковой и Анне А. Корчагиной за помощь в работе по исследованию биологической активности антител in vitro, Михаилу В. Гуляеву за помощь в МРТ сканировании животных при антиангиогенной терапии, Мельникову Павлу за помощь в лазерной конфокальной микроскопии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шеин, Сергей Александрович, Москва

1. Folkman J. Angiogenesis. Annu. Rev. Med. 2006; 57:1-18.

2. Ferrara N., Gerber H.P., LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003; 9(6):669-676.

3. Ferrara N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nat. Rev. Cancer 2002; 2(10):795-803.

4. Guiu S. et al. Bevacizumab/irinotecan. An active treatment for recurrent high grade gliomas: preliminary results of an ANOCEF Multicenter Study. Rev. Neurol. 2008; 164(6-7):588-594.

5. Norden A.D. et al. Bevacizumab for recurrent malignant gliomas: efficacy, toxicity, and patterns of recurrence. Neurology 2008; 70(10):779-787.

6. Pope W.B., Lai A., Nghiemphu P., Mischel P., Cloughesy T.F. MRI in patients with high-grade gliomas treated with bevacizumab and chemotherapy. Neurology 2006; 67(11): 1258— 1260.

7. Norden A.D., Drappatz J., Wen P.Y. Antiangiogenic therapies for high-grade glioma. Nat. Rev. Neurol. 2009; 5(11):610-620.

8. Narayana A. et al. Antiangiogenic therapy using bevacizumab in recurrent high-grade glioma: impact on local control and patient survival. J. Neurosurg. 2009; 110(1): 173-180.

9. Nghiemphu P.L. et al. Bevacizumab and chemotherapy for recurrent glioblastoma: a single-institution experience. Neurology 2009; 72(14): 1217—1222.

10. Poulsen H.S. et al. Bevacizumab plus irinotecan in the treatment patients with progressive recurrent malignant brain tumours. Acta. Oncol. 2009; 48(l):52-58.

11. Zuniga R.M. et al. Efficacy, safety and patterns of response and recurrence in patients with recurrent high-grade gliomas treated with bevacizumab plus irinotecan. J. Neurooncol. 2009; 91(3):329-336.

12. Stupp R. et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. Lancet Oncol. 2009; 10(5):459-466.

13. Vredenburgh J.J. et al. Bevacizumab plus irinotecan in recurrent glioblastoma multiforme. J. Clin. Oncol. 2007; 25(30):4722^1729.

14. Batchelor T.T. et al. AZD2171, a pan-VEGF receptor tyrosine kinase inhibitor, normalizes tumor vasculature and alleviates edema in glioblastoma patients. Cancer Cell 2007; 11(1):83-95.

15. Ferrara N., Carver-Moore K., Chen II. et al. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. Nature 1996; 380(6573):439-442.

16. Ferrara N. Vascular Endothelial Growth Factor as a target for anticancer therapy. The Oncologist 2004; 9:2-10.

17. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature 1997; 386(6626): 671-674.

18. Hanai J., Dhanabal M., Karumanchi S.A. et al. Endostatin causes Gl arrest of endothelial cells through inhibition of cyclin Dl. J Biol Chem. 2002; 277(19): 16464:16469.

19. Rosen L.S. Clinical experience with angiogenesis signaling inhibitors: focus on vascular endothelial growth factor (VEGF) blockers. Cancer Control 2002; 9:36-44.

20. Robinson C.J., Stringer S.E. The splicevariants of vascular endothelial growth factor (VEGF) and their receptors. J Cell Sei. 2001; 114(5):853 -865.

21. Miletic H. et al. Anti-VEGF therapies for malignant glioma: treatment effects and escape mechanisms. Expert Opin. 2009; 13(4):455-468.

22. Holmes K. et al. Vascular endothelial growth factor receptor-2: structure, function, intracellular signalling and therapeutic inhibition. Cell Signal. 2007; 19(10):2003-2012.

23. Ferrara N., Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr Rev. 1997; 18(l):4-25.

24. Greenberg D.A., Jin K. From angiogenesis to neuropathology. Nature 2005; 438(7070):954 -959.

25. Shibuya M. Vascular endothelial growth factor receptor-1 (VEGFRl/Flt-1): a dual regulator for angiogenesis. Angiogenesis 2006; 9(4):225-230.

26. Brown L.F., Detmar M., Claffey K. et al.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a multifunctional angiogenic. Cytokine Exs. 1997; 79:233 -269.

27. Dvorak H.F., Brown L.F., Detmar M. et al. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability, andangiogenesis. Am .J. Pathol. 1995; 146(5):1029 -1039.

28. Ferrara N. Molecular and biological properties of vascular endothelial growthfactor. J. Mol. Med. 1999; 77(7):527 -543.

29. Gerber H.P., Dixit V., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Al in vascular endothelial cells. J. Biol. Chem. 1998; 273(21):13313-13316.

30. Testa J.R., Bellacosa A. AKT plays a central role in tumorigenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98(20): 10983-10985.

31. Lefranc F., Brotchi J., Kiss R. Possible future issues in the treatment of glioblastomas: special emphasis on cell migration and the resistance of migrating glioblastoma cells to apopto-sis. Journal of clinical oncology 2005; 23(10):2411-2422.

32. Soung Y.H., Lee J.W., Nam S.W. et al. Mutational analysis of AKT1, AKT2 and AKT3 genes in common human carcinomas. Oncology 2006; 70(4):285-289.

33. Lamalice L., Houle F., Huot J. Phosphorylation of Tyrl214 within VEGFR-2 triggers the recruitment of Nek and activation of Fyn leading to SAPK2/p38 activation and endothelial cell migration in response to VEGF. J. Biol. Chem. 2006; 281(45):34009-34020.

34. Meadows K.N., Bryant P., Pumiglia K. Vascular endothelial growth factor induction of the angiogenic phenotype requires Ras activation. J. Biol. Chem. 2001; 276(52):49289-49298.

35. Takahashi T., Yamaguchi S., Chida K. et al. A single autophosphorylation site on KDR/Flk-1 is essential for VEGF-A-dependent activation of PLC-gamma and DNA synthesis in vascular endothelial cells. EMBO J. 2001; 20(11):2768-2778.

36. Shibuya M. Structure and function of VEGF/VEGF-receptor system involved in angio-genesis. Cell Struct. Funct. 2001; 26(l):25-35.

37. Rak J., Yu J.L., Klement G. et al. Oncogenes and angiogenesis: signaling three-dimensional tumor growth. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2000; 5(l):24-33.

38. Plate K.IL, Breier G., Weich H.A. et al W.Vascular endothelial growth factor is a potential tumour angiogenesis factor in human gliomas in vivo. Nature 1992; 359(6398):845 -848.

39. Shweiki D., Itin A., Neufeld G. et al. Patterns of expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptors in mice suggest a role in hormonally regulated angiogenesis. J. Clin. Invest. 1993; 91(5):2235-2243.

40. Weidner N., Semple J.P., Welch W.R. et al. Tumor angiogenesis and metastasis— correlation in invasive breast carcinoma. N. Engl. J. Med. 1991; 324(l):l-8.

41. Du R. et al. HIFla induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 2008; 13(3):206-220.

42. Jain R.K. Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: a new paradigm for combination therapy. Nat. Med. 2001; 7(9):987-989.

43. Jain R.K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science 2005; 307(5706):58-62.

44. I-Iolash J. et al. Vessel cooption, regression, and growth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF. Science 1999; 284(5422): 1994-1998.

45. Poon R.T., Fan S.T., Wong J. Clinical implications of circulating angiogenic factors in cancer patients. J. Clin. Oncol. 2001; 19(4):1207-1225.

46. Millauer B., Shawver L.K., Plate K.H. et al. Glioblastoma growth inhibited in vivo by a dominant-negative Flk-1 mutant. Nature 1994; 367(6463):576-579.

47. Abramsson A., Berlin O., Papayan H. et al. Analysis of mural cell recruitment to tumor vessels. Circulation 2002; 105(1):112-117.

48. Harmey J.H., Bouchier-Hayes D. Vascular endothelial growth factor (VEGF), a survival factor for tumour cells: implications for anti-angiogenic therapy. Bioessays. 2002; 24(3):280-283.

49. Tran J., Master Z., Yu J.L. et al. A role for survivin in chemoresistance of endothelial cells mediated by VEGF. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002; 99(7):4349-4354.

50. Toi M., Matsumoto T., Bando II. Vascular endothelial growth factor: its prognostic, predictive, and therapeutic implications. Lancet Oncol. 2001; 2(11):667-673.

51. Pegram M.D., Reese D.M. Combined biological therapy of breast cancer using monoclonal antibodies directed against HER2/neu protein and vascular endothelial growth factor. Semin. Oncol. 2002; 29:.29-37.

52. Nagy J.A., Benjamin L., Zeng IT. et al. Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis. Angiogenesis 2008; 11(2): 109 -119.

53. Bertolini F., Mingrone W., Alietti A. et al. Thalidomide in multiple myeloma, myelodysplastic syndromes and histiocytosis. Analysis of clinical results and of surrogate angiogenesis markers. Ann. Oncol. 2001; 12(7):987-990.

54. Iruela-Arispe M.L., Luque A., Lee N. Thrombospondin modules and angiogenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004; 36(6):1070-1078.

55. D'Amato R.J., Loughnan M.S., Flynn E. et al. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994; 91(9):4082-4085.

56. Chaux P., Moutet M., Faivre J. et al. Inflammatory cells infiltrating human colorectal carcinomas express HLA class II but not B7-1 and B7-2 costimulatory molecules of the T-cell activation. Lab. Invest. 1996; 74(5):975-983.

57. Yoncheva K, Momekov G. Antiangiogenic anticancer strategy based on nanoparticulate systems. Expert Opin Drug Deliv. 2011 Aug;8(8): 1041-56.190

58. Kuesters GM, Campbell RB. Conjugation of bevacizumab to cationic liposomes enhances their tumor-targeting potential. Nanomedicine (Lond). 2010 Feb;5(2): 181-92.191

59. Bergers G., Benjamin L.E. Tumorigenesis and the angiogenic switch. Nat. Rev. Cancer 2003; 3(6):401-410.

60. Lee C.G., Heijn M., di Tomaso E. et al. Anti-Vascular endothelial growth factor treatment augments tumor radiation response under normoxic or hypoxic conditions. Cancer Res. 2000; 60(19):5565-5570.

61. Pham C.D., Roberts T.P., van Bruggen N. et al. Magnetic resonance imaging detects suppression of tumor vascular permeability after administration of antibody to vascular endothelial growth factor. Cancer Invest. 1998; 16(4):225-230.

62. Brasch R., Pham C., Shames D. et al. Assessing tumor angiogenesis using macromolecu-lar MR imaging contrast media. J. Magn. Reson. Imaging. 1997; 7(l):68-74.

63. Caraglia M, De Rosa G, Salzano G, Santini D, Lamberti M, Sperlongano P, Lombardi A, Abbruzzese A, Addeo R. Nanotech revolution for the anti-cancer drug delivery through blood-brain-barrier. Curr Cancer Drug Targets. 2012 Mar; 12(3): 186-96.192

64. Zhou Q., Guo P., Gallo J. M. Impact of angiogenesis inhibition by sunitinib on tumor distribution of temozolomide. Clin. Cancer Res. 2008; 14(5): 1540-1549.

65. Bao S. et al. Stem cell-like glioma cells promote tumor angiogenesis through vascular endothelial growth factor. Cancer Res. 2006; 66(16):7843-7848.

66. Calabrese C. et al. A perivascular niche for brain tumor stem cells. Cancer Cell. 2007; 11(1):69—82.

67. Marx J. Cancer research. Obstacle for promising cancer therapy. Science 2002; 295(5559): 1444.

68. Yu J.L., Rak J.W., Coomber B.L. et al. Effect of p53 status on tumor response to antiangiogenic therapy. Science 2002; 295(5559): 1526-1528.

69. Wedam S.B., Low J.A., Yang S.X. et al. Antiangiogenic and antitumor effects of bevacizumab in patients with inflammatory and locally advanced breast cancer. J. Clin. Oncol. 2006; 24(5):769-777.

70. Hurwitz H., Fehrenbacher L., Novotny W. et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluoroura-cil, and leucovorin for the treatment of metastatic colorectal cancer. N. Engl. J. Med. 2004; 350(23):2335-2342.

71. Gomez-Manzano C., Holash J., Fueyo J. et al. VEGF Trap induces antiglioma effect at different stages of disease. Neuro Oncol. 2008; 10(6):940-945.

72. Samoto K., Ikezaki K., Ono M., et al.Expression of vascular endothelial growth factor and its possible relation with neovascularization in human brain tumors. Cancer Res. 1995; 55(5):1189 -1193.

73. Brown L.F., Berse B., Jackman R.W. et al. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and it sreceptors in breast cancer. Hum. Pathol. 1995; 26(1):86 -91.

74. Kunkel P. et al. Inhibition of glioma angiogenesis and growth in vivo by systemic treatment with a monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor receptor-2. Cancer Res. 2001; 61(18):6624-6628.

75. Lucio-Eterovic A.K., Piao Y., de Groot J.F. Mediators of glioblastoma resistance and invasion during antivascular endothelial growth factor therapy. Clin. Cancer Res. 2009; 15(14):4589-4599.

76. Paez-Ribes M. et al. Antiangiogenic therapy elicits malignant progression of tumors to increased local invasion and distant metastasis. Cancer Cell. 2009; 15(3):220—231.

77. Iwamoto F.M. et al. Patterns of relapse and prognosis after bevacizumab failure in recurrent glioblastoma. Neurology 2009; 73(15):1200-1206.

78. Ebos J.M. et al. Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis. Cancer Cell. 2009; 15(3):232-239.

79. Erber R. et al. Combined inhibition of VEGF and PDGF signaling enforces tumor vessel regression by interfering with pericyte-mediated endothelial cell survival mechanisms. FASEB J. 2004; 18(2):338—340.

80. Zagzag D. et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab. Invest. 2006; 86(12): 1221—1232.

81. Rubin J.B. et al. A small-molecule antagonist of CXCR4 inhibits intracranial growth of primary brain tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100(23): 13513-13518.

82. Singh S.K., Clarke I.D., Terasaki M. et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. Cancer Res. 2003; 63(18):5821 -5828.

83. Singh S.K., Hawkins C., Clarke I.D. et al. Identifi cation of human brain tumour initiating cells. Nature 2004; 432(7015):396 -401.

84. Galli R., Binda E., Orfanelli U. et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stemlike neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 2004; 64(19):7011 -7021.

85. Sakariassen P.O., Prestegarden L., Wang J. et al. Angiogenesis-independent tumor growth mediated by stem-like cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103(44): 16466 -16471.

86. Salhia B, Angelov L, Roncari L, Wu X, Shannon P, Guha A. Expression of vascular endothelial growth factor by reactive astrocytes and associated neoangiogenesis. Brain Res. 2000 Nov 10;883(l):87-97.

87. Bergers G, Hanahan D. Modes of resistance to anti-angiogenic therapy. Nat Rev Cancer. 2008 Aug;8(8):592-603.

88. Mizukami Y, et al. Induction of interleukin-8 preserves the angiogenic response in HIF-1 a-deficient colon cancer cells. Nature Med 2005;11:992-997.

89. Darland DC, et al. Pericyte production of cell-associated VEGF is differentiation-dependent and is associated with endothelial survival. Dev. Biol 2003;264:275-288.

90. Song S, Ewald AJ, Stallcup W, Werb Z, Bergers G. PDGFRP+ perivascular progenitor cells in tumours regulate pericyte differentiation and vascular survival. Nature Cell Biol 2005;7:870-879.

91. Soda Y, Marumoto T, Friedmann-Morvinski D et al. Transdifferentiation of glioblastoma cells into vascular endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Mar 15;108(11):4274-80.

92. Wu FT, Stefanini MO, Mac Gabhann F, Kontos CD, Annex BH, Popel AS. A systems biology perspective on sVEGFRl: its biological function, pathogenic role and therapeutic use. J Cell Mol Med. 2010 Mar;14(3):528-52.

93. Kamba T, Tarn BY, Hashizume H et al. VEGF-dependent plasticity of fenestrated capillaries in the normal adult microvasculature // Am J Physiol Heart Circulatory Physiol. 2006. -290.-P. 560-76.

94. Hicklin DJ, Ellis LM. Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis // J Clin Oncol. 2005. - 23. - P. 1011-27.

95. Ping YF, Yao XH, Jiang JY et al. The chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 promote glioma stem cell-mediated VEGF production and tumour angiogenesis via PI3K/AKT signalling. J Pathol. 2011 Jul;224(3):344-54.

96. Keunen O, Johansson M, Oudin A et al. Anti-VEGF treatment reduces blood supply and increases tumor cell invasion in glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Mar l;108(9):3749-54.

97. Jain RK, di Tomaso E, Duda DG et al. Angiogenesis in brain tumours. Nat Rev Neurosci. 2007 Aug;8(8):610-22.

98. Wang R, Chadalavada K, Wilshire J et al. Glioblastoma stem-like cells give rise to tumour endothelium. Nature. 2010 Dec 9;468(7325):829-33.

99. Ricci-Vitiani L, Pallini R, Biffoni M et al. Tumour vascularization via endothelial differentiation of glioblastoma stem-like cells. Nature. 2010 Dec 9;468(7325):824-8.

100. Ellis LM, Hicklin DJ. Pathways mediating resistance to vascular endothelial growth factor-targeted therapy. Clin Cancer Res. 2008 Oct 15;14(20):6371-5.

101. Robey RB, Hay N. Is Akt the "Warburg kinase"?-Akt-energy metabolism interactions and oncogenesis. Semin Cancer Biol. 2009 Feb;19(l):25-31.

102. Ali MM, Janic B, Babajani-Feremi A et al. Changes in vascular permeability and expression of different angiogenic factors following anti-angiogenic treatment in rat glioma. PLoS One. 2010 Jan 15;5(l):e8727.

103. Ferrara N., Kerbel R. Angiogenesis as a therapeutic target // Nature. 2005. - 438. - P. 967-74.

104. Wen P.Y., Kesari S. Malignant gliomas in adults // N. Engl. J. Med. 2008. - 359. - P. 492-507.

105. Yung W. et al. A phase II study of temozolomide vs. procarbazine in patients with glioblastoma multiforme at first relapse // Br. J. Cancer. 2000. - 83. - P. 588-93.

106. Taylor TE, Furnari FB, Cavenee WK. Targeting EGFR for treatment of glioblastoma: molecular basis to overcome resistance. Curr Cancer Drug Targets. 2012 Mar; 12(3): 197-209.196

107. Senger DR, Galli SJ, Dvorak AM et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid // Science. 1983. - 219. - P. 983-5.

108. Leung DW, Cachianes G, Kuang WJ, et al.Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen // Science. 1989. - 246. - P. 1306 -9.

109. Lambrechts D, Storkebaum E, Carmeliet P. VEGF: necessary to prevent motoneuron degeneration, suffi cient to treat ALS? // Trends Mol Med. 2004. - 10. - P. 275 -82.

110. Carmeliet P, Tessier-Lavigne M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring // Nature. 2005. - 436. - P. 193 -200.

111. Asahara T, Takahashi T, Masuda H et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells // EMBO J. 1999. - 18. -P. 3964-72.

112. Gabrilovich D, Ishida T, Oyama T et al. Vascular endothelial growth factor inhibits the development of dendritic cells and dramatically affects the differentiation of multiple hematopoietic lineages in vivo // Blood. 1998. - 92. - P.- 4150-66.

113. Pekala P, Marlow M, Heuvelman D et al. Regulation of hexose transport in aortic endothelial cells by vascular permeability factor and tumor necrosis factor-alpha, but not by insulin // J Biol Chem. 1990. - 265. - P. 18051 -4.

114. Mechtcheriakova D, Schabbauer G, Lucerna M et al. Specificity, diversity and convergence in VEGF and TNF-alpha signaling events leading to tissue factor up-regulation via EGR-1 in endothelial cells // FASEB J. 2001. - 15. - P. 230-42.

115. Barleon B, Sozzani S, Zhou D et al. Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1 // Blood. 1996. -87.-P. 3336-43.

116. Pepper MS, Ferrara N, Orci L et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor-1 in microvascular endothelial cells // Biochem Biophys Res Commun. 1991. - 181. - P. 902-6.

117. Mandriota SJ, Seghezzi G, Vassalli JD et al. Vascular endothelial growth factor increases urokinase receptor expression in vascular endothelial cells // J Biol Chem. 1995. - 270. - P. 9709-16.

118. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in regulation of physiological angi-ogenesis // Am J Physiol Cell Physiol. 2001. - 280. - P. 1358-66.

119. Zachary I. Signaling mechanisms mediating vascular protective actions of vascular endothelial growth factor//Am J Physiol Cell Physiol. -2001. -280. -P.1375-86.

120. Unemori EN, Ferrara N, Bauer EA et al. Vascular endothelial growth factor induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells // J Cell Physiol. 1992. - 153. - P. 557-62.

121. Pupa SM, Menard S, Forti S et al. New insights into the role of extracellular matrix during tumor onset and progression // J Cell Physiol. 2002. - 192. - P. 259-67.

122. Takahashi T, Ueno H, Shibuya M. VEGF activates protein kinase C-dependent, but Ras-independent Raf-MEK-MAP kinase pathway for DNA synthesis in primary endothelial cells. Oncogene. 1999 Apr l;18(13):2221-30.

123. Songyang Z, Shoelson SE, Chaudhuri M et al. SH2 domains recognize specific phosphopeptide sequences. Cell. 1993 Mar 12;72(5):767-78.

124. Hamerlik P, Lathia JD, Rasmussen R et al. Autocrine VEGF-VEGFR2-Neuropilin-l signaling promotes glioma stem-like cell viability and tumor growth. J Exp Med. 2012 Mar 12;209(3):507-20.

125. Cohen T, Nahari D, Cerem LW, et al. Interleukin 6 induces the expression of vascular endothelial growth factor // J Biol Chem. 1996. - 271. - P. 736-41.

126. Pertovaara L, Kaipainen A, Mustonen T, et al. Vascular endothelial growth factor is induced in response to transforming growth factor- ß in fi broblastic and epithelial cells // J Biol Chem. 1994. - 269. - P. 6271 -4.

127. Tsai JC, Goldman CK, Gillespie GY. Vascular endothelial growth factor in human glioma cell lines: induced secretion by EGF, PDGF-BB, and bFGF // J Neurosurg. 1995. - 82. -P. 864 -73.

128. Li CY, Shan S, Huang Q et al. Initial stages of tumor cell-induced angiogenesis: evaluation via skin window chambers in rodent models // J Natl Cancer Inst. 2000. - 92. - P. 143-7.

129. Stefanik D. F., Rizkalla L. R., Soi A., Goldblatt S. A., Rizkalla W. M. Acidic and basic fibroblast growth factors are present in glioblastoma multiforme // Cancer Res. 1991. - 51. - P. 5760-5.

130. Reiss Y., Machein M., Plate K. The role of angiopoietins during angiogenesis in gliomas //Brain Pathol.-2005,- 15.-P. 311-7.

131. Shih A. H., Holland E. C. Platelet-derived growth factor (PDGF) and glial tumorigenesis // Cancer Lett. 2006. - 232. - P. 139-47.

132. Charalambous C. et al. Interleukin-8 differentially regulates migration of tumorassociated and normal human brain endothelial cells // Cancer Res. 2005. - 65. - P. 10347-54.

133. Carmeliet P, Jain RK. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 2011 May 19;473(7347):298-307.

134. Brown JM. Tumor microenvironment and the response to anticancer therapy // Cancer Biol Ther. 2002. - 1. - P. 453-8.

135. List AF. Vascular endothelial growth factor signaling pathway as an emerging target in hematologic malignancies // The Oncologist. -2001. -6. P. 24-31.

136. Lee JC, Chow NH, Wang ST et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in colorectal cancer patients // Eur J Cancer. 2000. - 36. - P. 748-53.

137. Tokunaga T, Oshika Y, Abe Y et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA isoform expression pattern is correlated with liver metastasis and poor prognosis in colon cancer // Br J Cancer. 1998. - 77. - P. 998-1002.

138. Plate KH. Mechanisms of angiogenesis in the brain // J Neuropathol Exp Neurol. 1999. -58.-P. 313-20.

139. Shen BQ, Lee DY, Gerber HP et al. Homologous up-regulation of KDR/Flk-1 receptor expression by vascular endothelial growth factor in vitro // J Biol Chem. 1998. - 273. - P. 29979-85.

140. Saito H, Tsujitani S, Ikeguchi M et al. Relationship between the expression of vascular endothelial growth factor and the density of dendritic cells in gastric adenocarcinoma tissue // Br J Cancer. 1998. - 78. - P. 1573-7.

141. Gabrilovich DI, Chen HL, Girgis KR, Cunningham HT, Meny GM, Nadaf S, Kavanaugh D, Carbone DP. Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells // Nat Med. 1996. - 2. - P. 1096-103.

142. Kerbel RS. Clinical trials of antiangiogenic drugs: opportunities, problems, and assessment of initial results // J Clin Oncol. 2001. - 19. - P. 45-51.

143. Baluk P, Hashizume H, McDonald DM. Cellular abnormalities of blood vessels as targets in cancer // Curr Opin Genet Dev. 2005. - 15. - P. 102-11.

144. Willett CG, Boucher Y, di Tomaso E et al. Direct evidence that the VEGF-specific antibody bevaeizumab has antivascular effects in human rectal cancer // Nat Med. 2004. - 10. - P. 145-7.

145. Carmeliet P, Jain RK. Angiogenesis in cancer and other diseases // Nature. 2000. - 407. -P. 249-57.

146. Tong RT, Boucher Y, Kozin SV et al. Vascular normalization by vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade induces a pressure gradient across the vasculature and improves drug penetration in tumors // Cancer Res. 2004. - 64. - P. 3731-6.

147. Kim KJ, Li B,Winer J et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo // Nature. 1993. - 362. - P. 841-4.

148. Bao S. et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response // Nature. 2006. - 444. - P. 756-60.

149. Rich J. N. Cancer stem cells in radiation resistance // Cancer Res. 2007. - 67. - P. 8980^1.

150. Gilbertson R. J., Rich J. N. Making a tumour's bed: glioblastoma stem cells and the vascular niche // Nat. Rev. Cancer. 2007. - 7. - P. 733-6.

151. Folkins C. et al. Anticancer therapies combining antiangiogenic and tumor cell cytotoxic effects reduce the tumor stem-like cell fraction in glioma xenograft tumors // Cancer Res. -2007. 67. - P. 3560-4.

152. Eyler C. E., Rich J. N. Survival of the fittest: cancer stem cells in therapeutic resistance and angiogenesis // J. Clin. Oncol. 2008. - 26. - P. 2839^15.

153. Nagpal S, Harsh G, Recht L. Bevacizumab improves quality of life in patients with recurrent glioblastoma. Chemother Res Pract. 2011;2011:602812.140

154. Vredenburgh J. J. et al. Phase II trial of bevacizumab and irinotecan in recurrent malignant glioma // Clin. Cancer Res. 2007. - 13. - P. 1253-9.

155. Wagner S. A. et al. Update on survival from the original phase II trial of bevacizumab and irinotecan in recurrent malignant gliomas // J. Clin. Oncol. 26 (May 20 Suppl.), abstract 2021 (2008).

156. Wachsberger P. R. et al. VEGF trap in combination with radiotherapy improves tumor control in u87 glioblastoma // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2007. - 67. - P. 1526-37.

157. Cao Y. Positive and negative modulation of angiogenesis by VEGFR1 ligands // Sci. Signal.-2009.-2.-P. rel.

158. Lamszus K., Kunkel P., Westphal, M. Invasion as limitation to anti-angiogenic glioma therapy // Acta Neurochir. Suppl. 2003. - 88. - P. 169-77.

159. Chi A. S., Norden A. D., Wen P. Y. Antiangiogenic strategies for treatment of malignant gliomas // Neurotherapeutics. 2009. - 6. - P. 513-26.

160. Lakka SS, Rao JS. Antiangiogenic therapy in brain tumors. Expert Rev Neurother. 2008 0ct;8(10): 1457-73.

161. Hendriksen EM, Span PN, Schuuring J et al. Angiogenesis, hypoxia and VEGF expression during tumour growth in a human xenograft tumour model. Microvasc Res. 2009 Mar;77(2):96-103. Epub 2008 Dec 7.

162. Hadjipanayis CG, Van Meir EG. Brain cancer propagating cells: biology, genetics and targeted therapies. Trends Mol Med. 2009 Nov;15(l l):519-30.

163. Cina C, Maass K, Theis M et al. Involvement of the cytoplasmic C-terminal domain of connexin43 in neuronal migration. J Neurosci. 2009 Feb 18;29(7):2009-21.

164. Sciume G, Santoni A, Bernardini G. Chemokines and glioma: invasion and more. J Neuroimmunol. 2010 Jul 27;224(l-2):8-12.

165. Ignatova TN, Kukekov VG, Laywell ED,et al. Pluman cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglialand neuronal markers in vitro // Glia. 2002. - 39. - P. 193 -206.

166. Hemmati PID, Nakano I, Lazareff JA, et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors // Proc Natl Acad Sci USA. -2003. 100. - P. 15178 -83.

167. Fischer I, Cunliffe CII, Bollo RJ et al. High-grade glioma before and after treatment with radiation and Avastin: initial observations. Neuro Oncol. 2008 Oct;10(5):700-8.

168. Folkins C, Shaked Y, Man S et al. Glioma tumor stem-like cells promote tumor angio-genesis and vasculogenesis via vascular endothelial growth factor and stromal-derived factor 1. Cancer Res. 2009 Sep 15;69(18):7243-51.

169. Roodink I, Leenders WP. Targeted therapies of cancer: angiogenesis inhibition seems not enough. Cancer Lett. 2010 Dec 18;299(1):1-10.

170. Auf G, Jabouille A, Guerit S et al. Inositol-requiring enzyme lalpha is a key regulator of angiogenesis and invasion in malignant glioma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 31; 107(35): 15553-8.

171. Lee SL, Rouhi P, Dahl Jensen L et al. Hypoxia-induced pathological angiogenesis mediates tumor cell dissemination, invasion, and metastasis in a zebrafish tumor model. Proc Natl Acad Sci USA. 2009 Nov 17; 106(46): 19485-90.

172. Rapisarda A, Hollingshead M, Uranchimeg B et al. Increased antitumor activity of bevacizumab in combination with hypoxia inducible factor-1 inhibition. Mol Cancer Ther. 2009 Jul;8(7): 1867-77.

173. Wu X, Northcott PA, Dubuc A et al. Clonal selection drives genetic divergence of metastatic medulloblastoma. Nature. 2012 Feb 15;482(7386):529-33.

174. Chodobski A, Chung I, Kozniewska E et al. Early neutrophilic expression of vascular endothelial growth factor after traumatic brain injury. Neuroscience. 2003;122(4):853-67.

175. Narayana A, Gruber D, Kunnakkat S, Golfinos JG, Parker E, Raza S, Zagzag D, Eagan P, Gruber ML. A clinical trial of bevacizumab, temozolomide, and radiation for newly diagnosed glioblastoma. J Neurosurg. 2012 Feb;l 16(2):341-5.

176. Kuczynski EA, Patten SG, Coomber BL. VEGFR2 expression and TGF-(3 signaling in initial and recurrent high-grade human glioma. Oncology. 2011 ;81(2): 126-34.

177. Jakobsen JN, Hasselbalch B, Stockhausen MT, Lassen U, Poulsen HS. Irinotecan and bevacizumab in recurrent glioblastoma multiforme. Expert Opin Pharmacother. 2011 Apr;12(5):825-33.

178. Duda DG, Kozin SV, Kirkpatrick ND, Xu L, Fukumura D, Jain RK. CXCL12 (SDFlalpha)-CXCR4/CXCR7 pathway inhibition: an emerging sensitizer for anticancer therapies? Clin Cancer Res. 2011 Apr 15;17(8):2074-80. Epub 2011 Feb 24.

179. Liu W, Xu J, Wang M, Wang Q, Bi Y, Han M. Tumor-derived vascular endothelial growth factor (VEGF)-a facilitates tumor metastasis through the VEGF-VEGFR1 signaling pathway. Int J Oncol. 2011 Nov;39(5): 1213-20.

180. Fan F, Samuel S, Gaur P, Lu J, Dallas NA, Xia L, Bose D, Ramachandran V, Ellis LM. Chronic exposure of colorectal cancer cells to bevacizumab promotes compensatory pathways that mediate tumour cell migration. Br J Cancer. 2011 Apr 12; 104(8): 1270-7.

181. Bikfalvi A, Moenner M, Javerzat S, North S, Hagedorn M. Inhibition of angiogenesis and the angiogenesis/invasion shift. Biochem Soc Trans. 2011 Dec;39(6): 1560-4.

182. Mackey JR, Kerbel RS, Gelmon KA, McLeod DM, Chia SK, Rayson D, Verma S, Collins LL, Paterson AH, Robidoux A, Pritchard KI. Controlling angiogenesis in breast cancer: A systematic review of anti-angiogenic trials. Cancer Treat Rev. 2012 Feb 22.

183. Чехонин В.П., Баклаушев В.П., Юсубалиева Г.М., Павлов К.А., Ухова О.В., Турина О.И. Моделирование и иммуногистохимический анализ глиомы С6 in vivo. Клеточные технологии в биологии и медицине 2007, № 2, с. 65-73.

184. Ogunshola ОО, Stewart WB, Mihalcik V, Solli T, Madri JA, Ment LR. Neuronal VEGF expression correlates with angiogenesis in postnatal developing rat brain. Brain Res Dev Brain Res. 2000 Jan 3;119(l):139-53.

185. Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 1992 359(6398):843-5.

186. Parthymou A, Lampropoulou Е, Mikelis С, Drosou G, Papadimitriou Е. Heparin affin regulatory peptide/pleiotrophin negatively affects diverse biological activities in C6 glioma cells. Eur J Cell Biol. 2008 Jan;87(l): 17-29.

187. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(5259):680-5.

188. Perrie Y, Frederik PM, Gregoriadis G. Liposome-mediated DNA vaccination: the effect of vesicle composition. Vaccine. 2001 Apr 30;19(23-24):3301-10.

189. Shi N, Pardridge WM. Noninvasive gene targeting to the brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 20;97(13):7567-72.

190. Jo J, Schiff D, Purow B. Angiogenic inhibition in high-grade gliomas: past, present and future. Expert Rev Neurother. 2012 Jun;12(6):733-47.

191. Чехонин В.П., Рябухин И.А., Турина О.И., Дмитриева Т.Б., Шепелева И.И., Бабич Т.Н. Моноклональные анти-GFАР-антитела: получение, характеристика и иммунофер-ментный анализ. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001.-N 8.-С.188-191.

192. Renart J, Reiser J, Stark GR. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci USA. 1979 Jul;76(7):3116-20.

193. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976 May 7;72:248-54.

194. Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG. Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay. J Immunol Methods. 1987 Jun 26; 100(1-2): 173-9.

195. Yoncheva, K.; Momekov, G. Antiangiogenic anticancer strategy based on nanoparticulate systems. Expert Opin Drug Deliv. 2011, 8(8), 1041-1056.

196. Duggan, S. T.; Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi's sarcoma. Drugs. 2011, 71(18), 2531-2558.

197. Lingappa, M.; Song, H.; Thompson, S.; Bruchertseifer, F.; Morgenstern, A.; Sgouros, G. Immunoliposomal delivery of 213Bi for alpha-emitter targeting of metastatic breast cancer. Cancer Res. 2010 70(17), 6815-6823.

198. Kullberg, M.; Mann, K.; Anchordoquy, T. J. Targeting Her-2+ Breast Cancer Cells with Bleomycin Immunoliposomes Linked to LLO. Mol Pharm. 2012, Jun 4.

199. Feng, B.; Tomizawa, K.; Michiue, H.; Han, X. J.; Miyatake, S.; Matsui, H. Development of a bifunctional immunoliposome system for combined drug delivery and imaging in vivo. Biomaterials. 2010, 31(14), 4139-4145.

200. Nayak, T. K.; Garmestani, K.; Baidoo, K. E.; Milenic, D. E.; Brechbiel, M. W. PET imaging of tumor angiogenesis in mice with VEGF-A targeted 86Y-CHX-A"-DTPA-bevacizumab. Int J Cancer. 2011, 128(4), 920-926.

Информация о работе

Шеин, Сергей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому C6 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов как векторы для доставки контейнерных систем в интракраниальную глиому C6 - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы