Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярный механизм действия морфина, коменовой и меконовой кислот на медленные натриевые каналы сенсорных нейронов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дербенев, Андрей Викторович, Санкт-Петербург

А 7 • и и -

и / ' ».,/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им. И. П. ПАВЛОВА

ДЕРБЕНЁВ Андрей Викторович

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ МОРФИНА, КОМЕНОВОЙ И МЕКОНОВОЙ КИСЛОТ НА МЕДЛЕННЫЕ НАТРИЕВЫЕ КАНАЛЫ СЕНСОРНЫХ НЕЙРОНОВ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.13 "Физиология человека и животных"

03.00.02 "Биофизика"

Научные руководители: д. б. н. Б. В. Крылов,

д. б. н., профессор А. Я. Шурыгин.

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

Введение 5

Глава 1. Обзор литературы 7

1. 1. Введение 7

1.2. Молекулярная организация и модели

опиоидного рецептора 10

1.3. Гетерогенность опиоидных рецепторов 20

1. 4. Эндогенные опиоидные пептиды.

Опиатная анальгезия 27

1. 5. Молекулярная структура натриевых каналов 30

1.6. Модель постоянного диполя с двумя состояниями 38

1.7. Потенциалочувствительность - фундаментальная характеристика электровозбудимого ионного

канала 46

1.8. Зависимость от напряжения времени

жизни канала в открытом состоянии 48

1.9. Натрий - калиевый насос 51 1. 10. Заключение 54

Глава 2. Материалы и методы исследования 56

Глава 3. Результаты экспериментов

3.1. Морфин уменьшает чувствительность

к потенциалу медленных натриевых каналов

68 68

3.2. Неспецифические антагонисты опиоидных рецепторов препятствуют вызываемому морфином снижению величины Zeff активационной воротной системы ТТХГ натриевых каналов 78

3.3. Модификаторы G-белков не влияют на

эффект морфина 80

3.4. Оуабаин блокирует эффект морфина 82

3. 5. Увеличение внутриклеточной концентрации ионов натрия ведет к увеличению эффективного заряда 84

3. 6. Роль ионов К+ в эффекте морфина 84

3. 7. ЭГТА блокирует эффект морфина 86

3. 8. Действие коменовой кислоты на эффективный заряд активационной воротной системы медленных натриевых каналов 87

3. 9. Действие меконовой кислоты на акгивационную

воротную систему медленных натриевых каналов 94

3. 10. Неспецифический антагонист опиоидных

рецепторов устраняет вызванное меконовой и коменовой кислотами уменьшение эффективного заряда 100

3. 11. Исследование влияния 2-кето-0-глюконовой* кислоты на потенциалочувствительность натриевого канала 101

3. 12. Действие ацетона на акгивационную воротную

систему медленных натриевых каналов 103

Глава 4. Обсуждение результатов 106

4. 1. Натриевый механизм мембранной сигнализации 108

4. 2. Возможные функциональные характеристики

исследуемого рецептора морфина 113

Заключение Выводы

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Исследования, направленные на выяснение молекулярных механизмов действия наркотических и обезболивающих веществ, особенно актуальны сегодня из-за большой значимости для медицины фундаментальных результатов, полученных в этой области.

Физиологический механизм клеточной сигнализации, связанный с активацией опиоидных рецепторов, G-белков и кальциевых и калиевых каналов (Крутецкая, Лебедев, 19926; Hescheler et al., 1987; Franks, Lieb, 1994; Connor, Christie, 1998; Ramnarine et al., 1998; Melliti et al., 1999), хорошо изучен. В мировой литературе, однако, отсутствуют данные о связи натриевых каналов с опиоидными рецепторами. Натриевые каналы являются важнейшей молекулярной структурой, обеспечивающей возбудимость живой ткани, они участвуют и в передаче сигналов от мембранных рецепторов. Сейчас начинают появляться первые работы, в которых обнаружена связь медленных натриевых каналов с рецепторами серотонина (Cardenas et al., 1997).

Медленные натриевые каналы также ответственны за генерацию потенциала действия в соме клетке и в терминалях ноцицептивных афферентов. Эти каналы модулируются гиперальгезивными воспалительными медиаторами таким образом, что, вероятно, усиливают возбудимость ноцицептора. (England et al., 1996; Gold et al., 1996; Cardenas et al., 1997).

Медленные натриевые каналы (Веселовский и др., 19796; 1980) могут взаимодействовать с лигандами непосредственно благодаря активации лигандом определенной части аминокислотной

последовательности канала в соответствии с гипотезой так называемого "модулированного рецептора" (Strichartz, 1973; Hille, 1977). По этому механизму происходит взаимодействие с натриевыми каналами молекул тетродотоксина и батрахотоксина (Ревенко, 1977; Можаева и др. 1984; Nöda et al., 1989). Альтернативная гипотеза заключается в следующем. Натриевый канал может быть включен в цепь клеточной сигнализации как последовательное звено, передающее сигнал от активированного лигандом специфического мембранного рецептора. Разработке именно этого альтернативного предположения и посвящена работа.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. 1. ВВЕДЕНИЕ

Концепция существования мембранных рецепторов была развита в конце прошлого века немецким биохимиком П. Эрлихом (Ehrlich, 1900). Можно считать, что уже с тех пор начался интенсивный поиск в организме различных структур или молекул, комплементарных морфину.

В 1971 г. было введено понятие о ненасьпцаемом и насыщаемом неспецифическом взаимодействии и насыщаемом

стереоспецифическом связывании (Goldstein, 1973). Неспецифическое ненасыщаемое взаимодействие характерно для частиц, окруженных мембранами с особыми осмотическими свойствами или имеющих губчатый матрикс, способный "захватывать" вещества из окружающей среды в растворенном виде. Подобное взаимодействие нельзя квалифицировать как связывание. Неспецифическое насыщаемое взаимодействие может осуществляться посредством ионных, водородных связей и гидрофобных взаимодействий. В частности, катионные группировки опиатов могут взаимодействовать с анионными группами белков, нуклеиновых кислот, фосфолипидов, мукополисахаридов. В этой работе Голдстейна (Goldstein, 1973), измерялась ассоциация радиоактивного леворфанола, D (-) агониста морфина, и его нерадиоактивного энантиомера - декстрорфана с тканью мозга мышей. Эксперименты показали, что около половины ассоциированного с тканью мозга леворфанола отражает ненасьпцаемый тип взаимодействия. Примерно столько же препарата задерживается в ткани головного мозга за счет неспецифического

ненасыщаемого связывания, и только 2% связавшегося соединения определяет специфическое взаимодействие с опиоидным рецептором (Goldstein, 1973).

Затем было показано специфическое связывание опиоидов в гомогенатах мозга крыс (Pert, Snyder, 1973). В этих экспериментах при

л

использовании в качестве лиганда [ Н]-налоксона было установлено, что леворфанол в концентрации 10"7 моль снижает связывание антагониста в гомогенатах головного мозга крыс, мышей и морских свинок на 70%. В то же время декстрофан (биологически неактивный изомер) практически не препятствует ассоциации метки. На основании этих данных можно было предположить, что он влияет лишь на неспецифическое связывание. В этой работе имеются указания на некоторую неравнозначность рецепторного связывания в головном мозге и тонком кишечнике. На основании этого был сделан важный вывод о гетерогенности опиоидных рецепторов. Было показано, что взаимодействие опиоидный рецептор - лиганд характеризуется как сложный бимолекулярный процесс.

Для изучения физиологической роли опиоидных рецепторов проводились исследования, направленные на выявление зависимости между степенью связывания соответствующих фармакологических препаратов и их эффективностью (Hollt et al., 1976; Snyder, Simantov, 1977; Hollt, Herz, 1978).

С помощью метода клонирования и анализа нуклеотидной последовательности ДНК удалось расшифровать первичную структуру и сделать первые шаги в исследовании эволюции опиоидных рецепторов (Zaki et al., 1996, Barrallo et al., 1998). Удалось показать, что структурно опиоидные рецепторы могут быть разбиты на три основных типа - х, М-, 8 (Loh, Smith, 1990; Monteillet-Agius et al. 1996).

Клонированные опиоидные рецепторы высоко гомологичны, они принадлежат к семейству белковых молекул, пронизывающих мембрану несколько раз (Ni et al., 1995, Zaki et al., 1996). Благодаря обнаружению новых агонистов опиоидных рецепторов были выявлены подтипы опиоидных рецепторов, молекулярная структура которых окончательно не изучена (Cha, 1995). В последнее время появляются работы, указывающие на то, что уже на уровне рецепторных структур может происходить формирование наркотической зависимости (Cha et al., 1995; Keith et al., 1996; Suzuki et al., 1997; Sharma, et al., 1997). Установлено, что агонисгы ц и 8 опиоидных рецепторов вызывают физическую и психическую зависимость. Активация % опиоидных рецепторов подавляет физическую и психическую зависимость от агонистов }х и 8 рецепторов, но активация 5 рецептора потенцирует зависимость от агонистов ц опиоидных рецепторов (Suzuki et al., 1997). Дальнейшее развитие зависимости происходит при активации jiii и \ха опиоидных рецепторов, затем происходит функциональное изменение Gj и G0 белков, аденилатциклазы (Cha et al., 1995; Sharma, et al., 1997; Cheng et al., 1997), протеинкиназы А и С (Terwilliger et al., 1991; Yu et al., 1997).

1.2 МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И МОДЕЛИ ОПИОИДНОГО РЕЦЕПТОРА

Первая модель опиоидного рецептора появилась в середине пятидесятых годов (Beckett, Casy, 1954). В этой модели основная роль по связыванию лиганда отводилась атому азота пиперидинового кольца, взаимодействующего с анионным центром рецептора (рис. 1. А). Бензольное кольцо за счет ван-дер-ваальсовых сил связывается с плоским участком поверхности рецептора. Эта модель явилась основой для экспериментального изучения различных функциональных групп в молекулах опиоидов, ответственных за проявление биологического эффекта.

Несколько позже было показано, что именно атом азота играет важную роль при взаимодействии исследуемых агонистов с активным участком рецептора (Portoghese, 1965). Цитируемый автор предположил, что либо опиоидные рецепторы имеют несколько степеней подвижности, либо существует несколько типов этих рецепторов, в различной степени комплементарных отдельным опиатам. Внутрижелудочковое введение неорганических катионов также подтвердило предположение о существовании анионного центра рецептора. Действие этих катионов блокировалось налоксоном (Harris et al., 1976 a, b). При первых попытках идентифицировать субстрат, ответственный за связывание опиатов в тканях мозга, внимание исследователей привлекли молекулы цереброзидов,

анионныи центр

фокус анионного заряда

углубление

плоским участок

Рис. 1. Модели опиоидных рецепторов

А - гипотетическая модель опиатного рецептора (по: Beckett and Casy, 1954).

Б - участки взаимодействия опиата с молекулярной моделью цериброзидсульфата (Lowney et al., 1979). 1-плоская поверхность; 2 - фенольный участок; 3 - впадина; 4 - плоский участок.

цереброзидсульфатов и ганглиозидов (ЬоЬ е1 а1., 1974). Была обнаружена структурная комплементарность некоторых гликолипидов к молекуле морфина. Указанные химические соединения (цереброзиды, цереброзидсульфаты и ганглиозиды) благодаря своей локализации в мембранах нервных клеток, в том числе и в нервных окончаниях, могли бы выполнять функцию "рецепторных молекул". Это предположение было развито в работах (ЬоЬ е1 а1., 1975, СЬо е1 а1., 1975, Ьо^еу 1979). Затем была построена теоретическая модель, показывающая возможность стереоспецифического взаимодействия опиатов с цереброзидсульфатом (рис 1. Б). Согласно этой модели, взаимодействие опиата с цереброзидсульфатом происходит следующим образом: фенильная группа, имеющая большой дипольный момент, реагирует с комплементарной частью церамидного хвоста, который благодаря наличию тг-связей также имеет большой дипольный момент. Это взаимодействие обеспечивается ван-дер-ваальсовыми связями, сила которых пропорциональна дипольному моменту химических группировок. Гидроксильная группа фенольного кольца посредством водородных связей притягивается к карбоксильной группе церамидного хвоста молекулы. Пиперединовое кольцо молекулы опиата, перпендикулярное плоскости этой молекулы, занимает пространство между церамидным концом и галактозной группой цереброзидсульфата. Оно может удерживаться в этом положении благодаря наличию гидрофобных взаимодействий и образованию электростатического взаимодействия между протонированным азотом и анионной сульфатной группой цереброзидсульфата (ЪоЬ е1 а1., 1978).

Очевидно, что рассмотренная модель является упрощенной. Представление об опиоидном рецепторе как о части мембранного

матрикса не позволяло объяснить гетерогенность рецепторов. Для объяснения механизмов, обеспечивающих различную чувствительность рецепторов к лигандам в зависимости от ионного состава среды, была сформулирована гипотеза о существовании опиатного рецептора в двух конформациях - агонистической и антагонистической (Snyder, 1975; Pasternak, Snyder, 1975) (рис. 2. А). Согласно этой модели, анальгезирующий эффект может возникать только тогда, когда рецептор находится в агонистической конформации. Именно это могло объяснить фармакологический эффект препаратов (Simon, Groth, 1975; Triggle, Triggle, 1976; Simon, 1978). Цитируемые авторы исследовали кинетику инактивации опиатного рецептора сульфгидрильными реагентами. Было показано, что рецепторы очень быстро теряют способность специфически взаимодействовать с опиатами при действии N-этилмалеимида, йод ацетата. Такая инактивация в значительной степени может быть устранена путем добавления в инкубационную систему специфического лиганда, например, налтрексона. Эти факты заставили предположить, что SH-группы, подвергаемые алкилированию, находятся вблизи специфического сайта связывания лиганда и экранируются при формировании рецепторного комплекса. Также было показано, что ионы натрия обладают свойством замедлять инактивацию опиатного рецептора сульфгидрильными реагентами. Но поскольку Na+ не влияет на процесс алкилирования SH-группы, то, по мнению цитируемых авторов, выявленные закономерности обеспечиваются конформационными изменениями опиатного рецептора под влиянием ионов натрия. Объясняя полученные данные, Симон и Гросс (Simon, Groth, 1975) предложили аллостерическую

Препарат со смешанным агонист-антагонистическими свойствами

Антагонист

Агонист

Na

б

Na4

УЧ_

Na4

Na+

Рис. 2. Модели опиоидных рецепторов

А - модель Шнайдера, антагонистическая (а) и агонистическая (б) конформация опиатного рецептора (Snyder, 1975).

Б - модель аллостерического влияния Na+ на конформацию опиоидного рецептора (Simon, Groth 1978).

модель опиатного рецептора (рис. 2. Б). Согласно их предположению, рецептор может иметь структуру олигомера или димера (Simon, Groth, 1975). В присутствии ионов натрия происходит взаимодействие олигомеров рецептора и связывание антагонистов. При отсутствии Na+ в среде димер может принимать конформацию, предпочтительную для связывания агонистов. Подобная пластичность опиатного рецептора может способствовать регуляции его чувствительности в изменяющихся физиологических условиях. Роль ионов натрия в этом случае оказывается ключевой. Рассматриваемая модель двух взаимопереходных форм опиатного рецептора с высокой чувствительностью к агонистам и антагонистам послужила основой для работ, моделирующих взаимодействие лигандов с опиатными рецепторами.

Авторы другой модели (Feinberg et al., 1976) взяли за основу существование в рецепторе опиатов несколько связывающих участков, включающих в себя область липофильного взаимодействия (Л), место посадки аминогруппы (А) и области специфической ассоциации агонистов (АГ) и антагонистов (АНТ) (рис. 3). Согласно их предположению, агонисты, в молекулах которых присутствует фенольное кольцо (F), такие как морфин, несколько иначе взаимодействуют с опиатным рецептором. В этом случае вначале происходит комплементарная ассоциация кольца А и азота аминогруппы. В результате рецептор переходит в агонистическую конформацию, и осуществляется дальнейшее взаимодействие опиата с рецептором. Молекулы агонистов, лишенные кольца F, фармакологически активны в значительно меньшей степени. При

Налорфин

ФЭТ 7-[ 1 -фенил-3 -гидроксибутил-3 ]

Антагонистическая форма

Налоксон

Ма.

Антагонистическая Форма

о 0

\ 0

нр ^

-и-

Морфин ^нт

Рис. 3. Молекулярная модель опиатного рецептора по Феинбергу (ТешЬе^ е1 а1., 1976)

Рецептор показан в двух взаимнопереходных конформациях, аллостерически изменяющихся под действием Ыа+.

связывании с агонистами специфическое для них место посадки реагирует с л-электронами 1Ч-алл ильной группы. Такое взаимодействие стабилизирует антагонистическую конформацию рецептора. Во взаимодействии с опиатным рецептором участвует и гидроксильная группа асимметрического углеродного атома, благодаря которой кислород ассоциируется с гидрофильной частью рецептора.

Еще одна модель опиатного рецептора была предложена В. М. Колб (Ко1Ь, 1978). Согласно этой модели (рис. 4. А), для связывания антагонистов и агонистов не обязательно изменение конформации самого рецептора. Допуская, что активная роль в этом связывании принадлежит положительно заряженным аминогруппам специфического участка опиатного рецептора. Молекула морфина при физиологических значениях рН протонируется на 80%. При взаимодействии налоксона с рецептором, находящимся в антагонистической конформации, н�