Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки

Гумеров, Вадим Мирбаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки"

ГУМЕРОВ ВАДИМ МИРБАЕВИЧ

Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ИЮН 2011

Москва-2011

4848756

Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Учреждения Российской академии наук Центра «Биоинженерия» РАН

Научные руководители: доктор биологических наук

Равин Николай Викторович

кандидат биологических наук Марданов Андрей Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Морозов Сергей Юрьевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится «24» июня 2011 г. в 7 7 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « яо » мая 2011г.

кандидат биологических наук Черных Николай Александрович

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Исследование структур микробных сообществ, ассоциированных с высокотемпературными экологическими нишами, представляет интерес для фундаментальной микробиологии, в том числе эволюционной, поскольку многие обитающие в этих условиях микроорганизмы относятся к эволюционно древним ветвям бактерий и архей. Анализ структуры сообществ термофильных микроорганизмов проводился с момента их обнаружения микробиологическими методами, предполагающими получение и характеристику чистых культур микроорганизмов. В последние 20 лет также применяются не требующие культивирования молекулярные методы, основанные на ПЦР-амплификации и секвенировании фрагментов генов 168 рибосомной РНК. Применение методов анализа 16Э рРНК показало, что, как правило, не более 0.1-1% микроорганизмов удается культивировать в лабораторных условиях. Эти работы позволили выявить новые филогенетические группы прокариот, в том числе таксоны высокого уровня, для многих из которых до настоящего времени не получено культивируемых представителей. Однако, применявшиеся до последнего времени методы анализа 168 РНК предполагали клонирование фрагментов генов 168 РНК и секвенирование отдельных клонов с помощью капиллярного электрофореза, что на практике позволяло проанализировать не более нескольких сот последо-вательностей 168 рРНК. Однако, многие природные сообщества могут содержать тысячи различных видов микроорганизмов (НиЬег е1 а1„ 2007).

За последние 30 лет из термальных источников Камчатки было выделено большое число новых термофильных бактерий и архей, в том числе представляющих обособленные филогенетические группы и характеризующихся различными типами метаболизма (Заварзин, 2004; Лебединский и др., 2007). Однако по сравнению с такими объектами, как гейзеры Исландии и Йеллоустонского парка США, биоразнообразие термофильных микроорганизмов Камчатки менее изучено. Помимо культуральных методов, для характеристики термофилов Камчатки использовались традиционные молекулярные методы анализа 16S рРНК, однако, число анализируемых независимых последовательностей в разных работах не превышало нескольких десятков. Таким образом, задача «глубокой» количественной характеристики сообществ термофильных микроорганизмов, в особенности горячих источников Камчатки, является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований в области микробиологии и молекулярной биологии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является определение структур сообществ микроорганизмов термальных источников кальдеры вулкана Узон, Камчатка. Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Отбор образцов и выделение препаратов метагеномной ДНК из термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся по температуре и кислотности.

2. Идентификация микроорганизмов на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рибосомной РНК, определенных методом пиросеквенирования.

3. Реконструкция путей метаболизма сообществ в целом на основе данных об их составе.

4. Определение полной нуклеотидной последовательности генома термофильной археи рода Vulcanisaeta, широко распространенного в кислых термальных источниках, анализ путей ее метаболизма и возможной экологической роли в термальных сообществах.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые проведена глубокая количественная характеристика состава сообществ микроорганизмов термальных источников Камчатки с помощью высокопроизводительного пиросеквенирования фрагментов генов 16S рРНК. Определена зависимость состава и степени разнообразия микробных сообществ от температуры и рН. Установлено, что в источниках с нейтральным рН разнообразие микроорганизмов максимально при умеренно высоких температурах (55-58°С), при этом в сообществе доминируют термофильные бактерии, а доля архей незначительна. В кислых источниках (рН 3.7-4.1) большинство микроорганизмов сообществ составляют археи, причем в источнике с температурой около 50°С доминируют различные линии архей, не имеющие культивируемых представителей, в источниках с температурой 60-90°С, - кренархеи порядка Sulfolobales и наноархеи.

Определена полная нуклеотидная последовательность генома термоацидофильной археи рода Vulcanisaeta, широко распространенного в кислых термальных источниках. Анализ генома и путей метаболизма этой археи показал, что представители рода Vulcanisaeta могут играть важную экологическую роль в кислых гидротермах, завершая анаэробный цикл углерода и осуществляя полное окисление органических веществ.

Практическая значимость работы обусловлена биотехнологическим потенциалом термофильных микроорганизмов. Идентифицированные в геноме Vulcanisaeta moutnovskia гидролитические ферменты могут быть использованы для разработки новых биотехнологий, основанных на применении термостабильных ферментов. Апробация работы

Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", (г. Петропавловск-Камчатский, 2010), "Extremophiles 2010" (Португалия, 2010), 15-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (г. Пущино, 2011), 11th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology "BAGECO-11" (Греция, 2011).

Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 141 странице машинописного текста и включают 36 рисунков и 19 таблиц. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Цель и задачи работы", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список публикаций по теме диссертации", "Список цитируемой литературы", который содержит 9 отечественных и 186 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Кальдера вулкана Узон располагается в центральной части Восточного вулканического пояса Камчатки, ее формирование закончилось около 40 тыс. лет назад. В кальдере располагается большое количество термальных источников, характеризующихся различными значениями температуры и рН, а также химическим составом воды. В качестве объектов исследования были выбраны источники, различающиеся двумя важнейшими показателями, - температурой и рН воды. Это три «кислых» источника «1805», «1810» и «1884», различающихся по температуре, а также «нейтральный» источник Заварзина (Табл. 1). Пробы биоматериала (воды с взвесью грунта) были отобраны в ходе экспедиций в кальдеру Узон в 2008 и 2009гг.

Таблица 1. Основные физико-химические характеристики источников.

Источник Заварзина «1884» «1805» «1810»

температура 55-58°С 50°С 60°С 89-91°С

РН 6.3 4.0 3.7 4.1

Микробное сообщество воды источника Заварзнна

Источник Заварзина представляет собой мелкий бассейн размером 4.5 х 2.3 метра, наполняемый многочисленными термальными выходами, благодаря которым вода в источнике активно перемешивается. В менее горячих участках, расположенных по краям, дно источника покрыто цианобактериальным матом. Отбор воды проводили в поверхностном слое, чтобы исключить попадание в пробу донных отложений.

Для проведения количественного анализа состава микробного сообщества использовали метод, основанный на пиросеквенировании вариабельного района V3 генов 16S рРНК. Для амплификации фрагментов генов 16S рРНК из препарата метагеномной ДНК были использованы «универсальные» праймеры U341F (5-CCTACGGGRSGCAGCAG) и U515R (5'-TTACCGCGGCKGCTGVCAC). Пиросеквенирование ПЦР фрагмента осуществляли на геномном анализаторе GS FLX (Roche). Данные анализировали с помощью пакета программ RDP Classifier (Cole et al., 2009). Сначала полученные последовательности разделяли на бактериальные и архейные с помощью RDP Naive Bayesian rRNA Classifier Version 2.0, в дальнейшем последовательности бактерий и архей анализировали отдельно. Анализ последовательностей V3 районов 16S рРНК архей и бактерий проводили с помощью Pyrosequencing pipeline, входящей в RDP Classifier. Для этого проводили выравнивание и кластерный анализ последовательностей. Кластеризацию проводили на разных уровнях, характеризующихся различными расстояниями между кластерами (от 0 до 0.3), соответствующих разным таксономическим уровням. Для каждого кластера была выбрана «репрезентативная» последовательность, соответствующая «центру» кластера. Состав сообществ определяли в результате таксономической классификации репрезентативных последовательностей кластеров.

В результате пиросеквенирования V3 района гена 16S рРНК микроорганизмов источника Заварзина было определено 37654 последовательности, из которых к бактериальным 16S рРНК было отнесено 35702, к архейным - 1666. Таким образом, архей составляют лишь около 4.5% микроорганизмов сообщества. Преобладание бактерий также характерно для

нейтральных и слабощелочных источников Йеллоустонского парка; археи могут являться доминирующим компонентом наиболее «экстремальных» местообитаний с температурами выше 80°С и низким рН.

Большая часть «репрезентативных» последовательностей кластеров имела гомологию на уровне выше 95% с 1рРНК известных микроорганизмов; в этом случае кластер относили к соответствующему роду. При отсутствии такого гомолога таксономическую классификацию кластера проводили в результате построения филогенетического дерева, включающего выборку последовательностей 16Э рРНК.

Наибольшую долю (Рис. 1) в сообществе (32.3% всех последовательностей) составляли хемолитоавтотрофные бактерии типа Aquificae, родов Suljurihydrogenibiiim (21.6%) и Thermosulfidibacter (10.7%). Sulfurihydrogenibium обычно встречаются в нейтральных источниках с температурой до 75°С (Reysenbach et al., 2005). Это микроаэрофильные микроорганизмы, среди которых встречаются как облигатные хемолитоавтотрофы, окисляющие серу и ее соединения с использованием кислорода в качестве акцептора электронов, так и факультативные гетеротрофы (O'Neill et al., 2008). В отличие от них представители Thermosulfidibacter являются анаэробами, окисляющими водород за счет восстановления серы (Nunoura et al. 2008). Также среди автотрофных микроорганизмов идентифицированы представители Thermodesulfobacteria (7.3%), гамма-протеобактерии Thiofaba (7.6%), дельта-протеобактерии Desulfurella (2.6%), и бета-протеобактерии Thiomonas (0.6%). Цианобактерии, образующие мат на дне

other/unassigned 6.3%

Рисунок 1. Состав

микробного сообщества источника Заварзина

Thermotogae 6.3%

источника, в водной фазе составляли менее 0.2% микроорганизмов.

Меньшая доля приходится на органотрофные организмы. К ним относятся представители рода Calditerrivibrio типа Deferribacteres (12.1%). Известные до сих пор представители этого рода - органотрофные анаэробы, использующие в качестве акцептора электронов нитрат, восстанавливая его до аммония (lino et al., 2008г). Распространенность Calditerrivibrio в источнике Заварзина может быть обусловлена одним из самых высоких на Узоне содержанием ионов нитрата в воде (0.5 мМ). Около 6.3% последовательностей отнесены к роду Fervidobacterium типа Thermotogae, представители которого анаэробно сбраживают органические вещества, в том числе гидролизуя различные белковые субстраты и полисахариды. Гетеротрофные бактерии также представлены бета-протеобактериями Tepidimonas (6.0%), представителями типов Deinococcus-Thermus (4.4%), Caldiserica (1.7%) и Dictyoglomi (1.6%). Около 1.9% микроорганизмов относились к типу BRC1, не имеющему культивируемых представителей. Еще около 0.2% бактерий образуют новую филогенетическую ветвь уровня типа, представители которого были обнаружены только в источнике Заварзина.

Среди архей были обнаружены представители типов Euryarchaeota (42% архейных последовательностей, в основном представители порядка Thermoplasmatales), Crenarchaeota (50%), Korarchaeota (7.5%) и Nanoarchaeota (0.5%).

Проведенный филогенетический анализ позволил классифицировать абсолютное большинство микроорганизмов сообщества на уровне рода или семейства. Хотя филогенетическая близость не всегда коррелирует со сходством путей метаболизма микроорганизмов, полученные данные позволяют выдвинуть гипотезы о природе экологических взаимосвязей между основными группами микроорганизмов. Поскольку температура источника ниже верхней границы, при которой возможен фотосинтез (около 70°С), первичная продукция органического вещества может осуществляться как фотосинтетически, покрывающим дно источника цианобактериальным матом, так и хемолитоавтотрофно, в результате окисления восстановленных субстратов вулканического происхождения, поставляемых геотермальным потоком.

Хемолитоавторофная продукция может осуществляться в аэробных или микроаэрофильных условиях за счет окисления серы и ее восстановленных соединений (Thiofaba, Sulfurihydrogenibium), а в анаэробной зоне, - за счет окисления водорода с использованием в качестве акцептора электронов серы {Caldimicrobium, Thermosulfidibacler, Thiomonas). Еще один потенциальный источник энергии, метан, по-видимому, не используется в условиях источника Заварзина, поскольку мы не обнаружили представителей известных метанотрофных бактерий.

Образуемая фотосинтетиками и хемолитоавтотрофами, а также поступающая с поверхностными водами из окружающих низкотемпературных зон органика может использоваться разнообразными органотрофными микроорганизмами, представленными в основном анаэробами. В их число входят как бактерии, сбраживающие органические субстраты (Fervidobacterium, Dictyoglomus, Cadldisericwn), так и осуществляющие ее полное окисление за счет использования в качестве акцептора электронов кислорода (Thermus), серы (Desulfurella) или нитрата (Calditerrivibrio).

В целом, источник Заварзина характеризуется разнообразием обитающих в нем термофильных прокариот. В нем представлены микроорганизмы различных таксонов высокого уровня, характеризующиеся разнообразными типами метаболизма. При этом не наблюдается абсолютное доминирование какой-либо одной группы микроорганизмов, например, Aquificae, которые составляли более 95% сообщества в высокотемпературных источниках Йеллоустонского парка (Spear et al, 2005). Вероятно, это обусловлено как сравнительно умеренными значениями температуры и рН, так и разнообразием процессов первичной продукции органических веществ.

Микробное сообщество источника «1884»

Участок, с которого производился отбор образцов, представляет собой место выноса на поверхность углеводородов термальными водами. Для отбора проб с этого участка была выкопана ямка размером 20x30 см и глубиной около 20 см., которая немедленно заполнилась грунтовой водой, имевшей температуру 50°С и рН 4.0. Особенностью химического состава воды является высокое содержание сульфатов (384 мг/л) при практически полном отсутствии ионов

нитрата и нитрита (менее 0.1 мг/л). Газовая фаза содержит С02 (91.2%), H2S (3.2%), N2 (2.1%), СН4 (2.0%), и Н2 (1.4%).

Для амплификации последовательностей V3 регионов были использованы две пары праймеров: «универсальные» праймсры U341F/ U515R и пара праймеров A333F (5' - TCCAGGCCCTACGGG)/ U534Rm (5'-GWATTACCGCGGCKGCTG) для детекции архейных 16S рРНК. Оба ПЦР-фрагмента были просеквенированы на GS FLX (Roche). Набор, полученный с помощью «универсальных» праймеров содержал 12234 бактериальных и 23037 архейных последовательностей V3 регионов 16S рРНК, таким образом, археи составляют как минимум 70% всех микроорганизмов. Поскольку с помощью «универсальных» праймеров нам не удалось детектировать некоторые некультивируемые линии кренархей, реальная доля архей в сообществе может быть даже выше. Набор данных, полученных с «архейными» праймерами, состоял из 35479 последовательностей, из которых 29837 представляли 16S рРНК архей, а остальные либо были бактериальными, либо не имели гомологии с 16S рРНК. Таким образом, 12234 бактериальные последовательности из «универсального» набора использовали для характеристики бактерий, а 29837 архейных последовательностей из «архейного» набора данных - для анализа архейного компонента сообщества источника «1884».

Микробное сообщество источника «1884» имело крайне необычный состав. В отсутствии фотосинтеза первичная продукция органических веществ может обеспечиваться за счет использования неорганических субстратов вулканического происхождения, к которым относятся метан, водород и восстановленные соединения серы, присутствующие в «1884». Наиболее многочисленная группа бактерий (41% всех бактериальных последовательностей, Рис. 2) относилась к типу Verrucornicrobia, однако большинство последовательностей имело низкий уровень гомологии с культивируемыми представителями этого типа. Поэтому для более точной таксономической идентификации этой группы было построено филогенетическое дерево (Рис. 3), включающее репрезентативную выборку последовательностей 16S рРНК представителей Verrucornicrobia и репрезентативные последовательности кластеров, отнесенные к Verrucornicrobia.

Структура этого филогенетического дерева показывает, что последовательности из источника «1884» относятся к недавно открытой линии УеггисоткгоЫа, объединяющей термоацидофильных метанотрофов.

Метанотрофные бактерии типа Verrucomicrobia были выделены практически одновременно в трех географически изолированных вулканических районах (Италия, Новая Зеландия и Камчатка); они растут, получая энергию за счет аэробного окисления метана при рН в диапазоне 0.8-6.0 и температурах 40-65°С (Dunfield et al. 2007; Pol et al. 2007; Islam et al. 2008). Метан используется и как источник углерода. Один из штаммов - Methylacidiphylum kamchatkensis -был выделен из горячего источника Восточного термального поля кальдеры Узон, имеющего температуру 52°С и рН 3.0 (Islam et al. 2008). Наши результаты показывают, что метанотрофные представители Verrucomicrobia составляют экологически-значимую часть микробного сообщества.

Proteobacteria составляют около четверти бактерий сообщества, к ним относится вторая по численности группа бактерий, - гамма-протеобактерии рода Acidithiobacillus (19% всех бактериальных последовательностей). Эти бактерии являются ацидофильными аэробными хемолитоавтотрофами, получающими энергию за счет окисления металлов и неорганических соединений серы, и фиксирующими С02 через цикл Кальвина (Valdes et al., 2008). Acidithiobacullus образуют сульфат в качестве продукта окисления серы и ее восстановленных соединений (напр. сероводорода), поэтому именно их активность может объяснять высокую концентрацию сульфатов в источнике и низкий рН (4.0), оптимальный для роста метанотрофов.

other/unassigned 3%

Рисунок 2. Состав бактериального компонента микробного сообщества источника «1884»

Verrucomicrobia 41 % ^¡¡¿ШШ*^ (unclassified) 1 %

0.1

22Г t'errucomicrobia done W4bMu6 56 П- KamMFB23 (9.6%) 83 I ' KamMFB22 (27.7%)

100

Vemicomicrobia clone LP2A KamMFB24 (2.8%) KamMFB26 (0.2%)

г KamMFB25 (0.3%) ■ Verrucotmcrobia dono SK140

99 г

47Ц Methvlacidlphilumfumarolicum 65^ Metkylacidiphilum kamchatkense

- Verrucomicrobia clone OPB35

— Verrucomicrobia clone Ellin 5102 * Xiphinematobacter americani

VTAM

100

- Chthoniobacterflavus

-Akkermansia mucimphila

-Venvcomicrubium apinosum

— Prosthecobacter vameervenii

— Prosthecobacterfusiformis

- Fttcophilus fucoidanolyticus

- Alterococcus agarolyticus -Opitutus terrae

621-

Рисунок 3. Филогенетическое дерево, построенное методом Neighbour-joining, включающее последовательности 16S рРНК клонов, отнесенных к Verrucomicrobia (KamMFB22 - KamMFB26) и различных представителей типа Verrucomicrobia. Доли кластеров в общем числе бактериальных последовательностей 16S рРНК указаны в процентах.. VTAM, - кластер термоацидофильных метанотрофов (Islam et al. 2008).

Около 12% бактериальных последовательностей относились к типу Пгт1си1ез. Большинство из них (9% всех бактерий) представляли род СеоЬасШт, представители которого осуществляют аэробную деградацию углеводородов (Кагта е1 а1. 2001).

В отличие от бактерий, менее чем 5% архейных последовательностей имели гомологию на уровне 95% и выше с 16Б рРНК с какого-либо известного микроорганизма и, следовательно, могли быть отнесены к определенному роду. Около 39% архей (Рис. 4) образуют несколько филогенетических линий, относящихся к порядку ТИегтор1аб'та1а/ет, включающему ацидофильные микроорганизмы, окисляющие органические вещества, используя в качестве акцептора электронов кислород или, в анаэробных условиях, серу. Клоны с близкими последовательностями РНК (97-99% идентичности) были найдены в кислых термальных источниках или грунте в различных вулканических районах.

other/unassigned 2%

"hermoplasmatales 39%

Рисунок 4. Состав архейного компонента микробного сообщества источника «1884»

L Thermoprateales 1%

Кренархеи порядка Fervidicoccales (Perevalova et al. 2010) составляют около 9.1% всех архей (Рис. 4). Эти микроорганизмы, растущие при умеренно высоких температурах и слабой кислотности (для F. fontis диапазон роста 55-85°С, диапазон рН 4.5-7.5), анаэробно сбраживают органические вещества с образованием ацетата и водорода. Среди кренархей были обнаружены представители известных «культивируемых» термофильных порядков Acidilobciles (род Acidilobus), Sulfolobales (род Sulfolobus) и Thermoproteales (роды Thermoprotens, Vidcanisaeta и Thermofilwri), но они составляли лишь незначительную часть сообщества.

Около 47% всех архейных последовательностей представляли различные линии кренархей, не имеющие культивируемых представителей и известные только по последовательностям 16S рРНК, выделенным из природных источников. Большая часть (33% всех архей) принадлежит к Miscellaneous crenarchaeal group 1 (MCG1) и кластеризуется с клоном pJP89, первоначально детектированном в термальном источнике Иеллоустонского парка США (Bams et al. 1996). Близкие к найденным в этой работе клоны были обнаружены в термальных источниках Иеллоустонского парка США, Исландии, Болгарии. Большинство из них, однако, были детектированы в высокотемпературных местообитаниях с нейтральным рН. Возможно, умеренно термоацидофильные условия оптимальны для роста этих организмов, обнаруживаемых в высокотемпературных условиях лишь как минорные компоненты сообщества.

Широкая распространенность р1Р89-подобных кренархей и некультивируемых линий порядка ТЬегтор1а8та1а1ев свидетельствует о том, что эти группы могут играть важную экологическую роль в термофильных сообществах. Дальнейшие исследования, предполагающие культивирование и/или мстагеномное секвенирование этих архей, могут прояснить пути их метаболизма и экологические роли.

В целом, литоавтотрофы составляют более половины бактериальной популяции, однако, их доля составляет всего лишь около 20% от всего сообщества, в котором 70% составляют архси. Другие микроорганизмы сообщества являются органотрофами (РетсИсоссакя, СеоЪасШгю, АсНпоЬаМепа), или их функциональная роль не может быть предсказана исходя из таксономической принадлежности (некультивируемые линии бактерий и архей). Поэтому можно предположить, что в сообществе присутствуют неизвестные группы термофильных литоавтотрофов, либо что сообщество зависит от притока органических веществ извне, с дождевыми водами, поступающими из окружающих районов.

Микробные сообщества кислых термальных источников «1805» и «1810»

Источники «1805» и «1810» представляли собой замкнутые бассейны размерами примерно 1 х 2 м, в которых, в отличие от источника Заварзина, не наблюдался постоянный приток воды из гидротермальных выходов. Источники располагаются на расстоянии около 20 метров друг от друга, имеют близкие значения рН (3.7 и 4.1), но отличаются по температуре, составляющей 60°С в «1805» и 89-91°С в «1810». Сравнение этих источников, а также «1884», должно было выявить зависимость состава термоацидофильных микробных сообществ от температуры.

Для амплификации последовательностей УЗ регионов была использована пара «универсальных» праймеров Ш41Р/ 1)51511. Для образца «1805» было идентифицировано 13675 бактериальных и 17965 архейных последовательностей 168 рРНК, для образца «1810», - 9246 и 10597 последовательностей, соответственно. Таким образом, в обоих источниках архей составляют более половины микробного сообщества.

В источнике «1805» наибольшую долю в сообществе (36% всех бактериальных последовательностей 16Э рРНК) составляли представители типа Адш/юае (Рис. 5) относящиеся к роду Hydrogenobaculum. Представители этого рода являются аэробными хемолитоавтотрофами, они широко распространены и часто являются доминирующими в кислых источниках Йеллоустонского парка с высоким содержанием серы. Однако, Адш/1са1ех отсутствовали в более горячем источнике «1810». Вероятно, в этом случае сочетание экстремально высокой температуры, кислотности и восстановленной анаэробной среды исключает развитие Aquifi.ca.les.

others/unassigned

v шт. ■--'':. >

V "■"■'' WSt ■ ■lipF

Aiphaproteobacteria "-—

31%

Рисунок 5. Состав бактериального компонента микробных сообществ источников «1805» (слева) и «1810» (справа).

Неожиданным оказалось обнаружение в обоих источниках различных групп бактерий, не описанных как гипертермофилы. За исключением Aquifi.ca.les в обоих источниках были обнаружены одни и те же группы бактерий, -Firmicutes (Bacillus sp.), Alphaproteobacteria (Sphingomonas sp. и Caulobacter sp.), Betaproteobacteria (Burkholderia sp.), Gammaproteobacteria (Acidithiobacillus sp. и Halomonas sp.) и др. Более того, если исключить из рассмотрения Aquificales, относительные доли основных групп бактерий в источниках «1805» и «1810» окажутся практически одинаковыми. Наиболее вероятным объяснением эти данных является то, что бактерии, за исключением Aquificales в источнике «1805», являются не естественными компонентами этих сообществ, а попали в источники извне, с дождевыми водами нз окружающих низкотемпературных районов. Оба источника расположены вблизи друг от друга, что объясняет

Alphaproteobacteria 18%

Firrricutes

29%

Gammaproteobacteria 14%

others/unassigned 1%

Betaproteobacteria 1%

Aquificae 36%

сходство состава «экзогенных» бактерий. Кроме того, в источниках «1805» и «1810» отсутствует постоянный приток воды из гидротермальных выходов, который мог бы постоянно обновлять воду источника, удаляя попавшие извне микроорганизмы. Таким образом, если сделанное нами предположение верно, единственной группой бактерий, обитающих в «1805», являются Ади1/к:а1ея, относящиеся к роду Hydrogenobacullm, а в источнике «1810» бактерии вообще отсутствуют.

В отличие от бактерий, большинство архей микробных сообществ источников «1805» и «1810» относятся к известным линиям термофилов (Рис. 6). Доминирующей группой в обоих источниках являются кренархеи порядка ЯиУоЬЬЫея, - типичные обитатели кислых горячих источников, например, сульфатар. Именно эти в основном аэробные археи, окисляющие водород и серу, являются первичными продуцентами в термоацидофильных сообществах.

Vulcanisaeta sp. 5% Thermoproteus sp. 1%

"Uncultured' crenarchaeal lineages 1%

Vulcanisaeta sp. Themnoprateus sp. 12%

Sulfofobales 46%

Рисунок 6. Составы архейного компонента микробных сообществ источников «1805»и «1810»

1805

Ttiermoplasmataies 2% Halobacieriates 5% Acidiiobaies 3%

other/unassigned 1% Nanoarciiaeota 5%

"Uncultured'' crenarcha lineages 17%

Tftermoplasmatates 2% HatobacteriaSes 1%

dilobales 13%

other/unassigned 4%

Nanoarchaeota 24%

В источнике «1805» около 13% архей относятся к порядку Acidilobales (РгокМеуа е1 а1, 2009), культвируемые представители которого являются термоацидофильными анаэробными гетеротрофами, осуществляющие полное окисление органических веществ в процессе серного дыхания (Магёапоу е1 а1., 2010). Порядок ТЪегторго1еа1е$ представляют кренархеи родов Ки/саииае/а (5% архей) и ТЪегторШеия (1%). Около 17% архейных последовательностей были представлены различными «некультивируемыми» линиями кренархей. Эти микроорганизмы отличались от «некультивируемых» кренархей источника «1884» и были филогенетически удалены от линии МСС1. Эуриархеи

составляли незначительную долю сообщества и были представлены порядками Thermoplasmatales (2.3% архей) и Halobacteriales (0.6%).

Наиболее интересным результатом является идентификация в источниках «1805» и «1810» наноархей, составлявших, соответственно, 5% и 24% архей. Тип Nanoarchaeota представлен единственным культивируемым видом Nanoarchaeum equitans (Huber et al. 2002), растущим в ассоциации с кренархеей Ignicoccus hospitalis в глубоководных гидротермах. Анализ генома N. equitans, -минимального по длине (490 т.п.н.) среди всех живых организмов, за исключением внутриклеточных паразитов, выявил потерю многих биосинтетических путей, что предполагает симбитический или паразитический образ жизни (Waters et al. 2003). Относящиеся к наноархеям последовательности 16S рРНК были идентифицированы в различных морских и наземных гидротермах, а также в мезофильных экологических нишах с высокой соленостью. Однако, во всех случаях наноархей не составляли значительной доли микробного сообщества. Ранее описанные симбионты наноархей, кренархеи порядка Desulfurococcales, не были обнаружены в исследованных нами кислых термальных источниках, что предполагает существование других хозяев. Большая доля наноархей в источнике «1810» по сравнению с «1805» коррелирует с увеличением долей кренархей рода Thermoproteus (12% / 1%) и эуриархей порядка Halobacteriales (5% / 1%), что позволяет предположить принадлежность симбионтов наноархей к одной из этих групп. Однако, многочисленность наноархей в экстремально термоацидофильных микробных сообществах может свидетельствовать и в пользу возможности того, что эти наноархей являются не симбиотическими, а свободноживущими организмами.

Оценка биоразнообразия микробных сообществ

Важнейшим преимуществом метода пиросеквенирования по сравнению с традиционными молекулярными методами анализа 16S рРНК, является возможность единовременного определения десятков тысяч независимых последовательностей, что позволяет описывать разнообразие «сложных» сообществ, включающих сотни видов организмов. Однако, частота ошибок при пиросеквенирования значительно выше, чем при использовании традиционного

Сэнжеровского метода, причем большая часть ошибок приходится на гомополимерные участки. Такие последовательности с ошибками, принимаемые за новые организмы, могут искажать истинную картину биоразнообразия, завышая реальное число филотипов в десятки раз, особенно на низких таксономических уровнях.

Для решения этой проблемы были использованы двд недавно разработанных метода. Во-первых, с помощью программы АтрПсопМпБе из анализа были исключены последовательности низкого качества, а последовательности, различающиеся числом нуклеотидов, прочтенных в гомополимерных участках, были сгруппированы в объединяющие их кластеры, в дальнейшем рассматривавшиеся как одна последовательность, повторенная соответствующее число раз. Затем были исключены последовательности, встречающиеся в полном наборе данных только один раз и с высокой вероятностью являющиеся следствием ошибок секвенирования, а не реальным редко встречающимся филотипом. В разных образцах их доля составляла 2-5% всех последовательностей. Прошедшие фильтрацию последовательности использовали для определения биоразнообразия микроорганизмов. Оценку таксономической сложности сообществ проводили с помощью построения кривых, иллюстрирующих зависимость числа детектированных филотипов (т.е. числа кластеров) от числа проанализированных последовательностей для различных уровней сходства нуклеотидных последовательностей.

Графики, представленные на Рис. 7 для источника Заварзина, показывают, что достигнутый объем секвенирования достаточен для полной характеристики биоразнообразия сообщества, поскольку при увеличении числа анализируемых последовательностей графики выходят на плато, т.е. дальнейшее увеличение числа просеквенированных последовательностей уже не приводит к обнаружению новых филотипов. В целом, микробное сообщество источника Заварзина включает более ста видов бактерий, другие исследованные сообщества также содержали десятки-сотни видов микроорганизмов.

Таким образом, применение пиросеквенирования позволило идентифицировать все основные группы микроорганизмов, количественно определить их доли в сообществах, и проанализировать пути метаболизма

сообществ в целом. Напротив, использование традиционных молекулярных

методов, предполагающих клонирование и секвенирование нескольких

десятков-сотен последовательностей, позволило бы выявить лишь небольшую

часть микроорганизмов (Рис. 7).

_______Рисунок 7. Зависимость

-—ггг-..:.........!.;,........0.03 числа филотипов разного

---! уровня (вертикальная

..........,........... 0 05 шкала; кластерные

—" А расстояния 0.03, 0.05 и 0.1)

-....... ,, . "Г.............0 1 от числа анализиРУемых

_______________________________Ц последовательностей УЗ

----11111] районов 16Б рРНК

-! (горизонтальная шкала) для

~1 бактерий источника

-----------------------------------------------------------1 Заварзина.

«ООО 10000 ' 16000 ¿0000 25000

Секвенирование и анализ генома тсрмоацидофилыюй археи Ки/саишгеСа тоШпоУБЫа

Представители рода встречаются во всех трех исследованных

кислых термальных источниках кальдеры Узона. На момент начала работы ни для одного представителя рода Ки/саяиае/а не была определена полная геномная последовательность, поэтому для определения экологической роли, которую могут играть эти археи в термоацидофильных сообществах, мы провели полный сиквенс генома Кн/сапиае/а тоиЫохБЫа 768-28. Эта архея может расти на белковых субстратах и некоторых сахарах, использую серу в качестве акцептора электрона (РгокоГеуа е1 а!., 2005).

Полная нуклеотидная последовательность генома V. тоиЫоУБИа была определена методом пиросеквенирования. Геном V. тоМпогзЫа является кольцевой хромосомой длиной 2.298.983 нт., внехромосомные элементы обнаружены не были. Поиск открытых рамок считывания выявил 2320 потенциальных белок-кодирующих генов, занимающих 88% хромосомы. В результате сравнения с базами данных белковых последовательностей функции 65% предполагаемых белков были предсказаны с различной степенью детализации и достоверности.

Анализ путей метаболизма V. тоШпоуяМа выявил различные

гликолитические ферменты, которые могут обеспечивать гидролиз белковых субстратов и полисахаридов. Окисление глюкозы может осуществляться через модифицированные пути Эмбдена-Мейергофа и Энтнера-Дудорова. Образовавшийся пируват может окисляться пируват: ферредоксин оксидоредуктазой до ацетил-СоА и далее до ацетата ацетил-СоА синтетазой с образование АТФ. Геном Vulcanisaeta moutnovskia кодирует полный набор ферментов пути бета-окисления жирных кислот, что предполагает возможность использования организмом длинноцепочечных жирных кислот. Образующийся ацетил-СоА затем может окисляться до ацетата с образованием АТФ.

V. moutnovskia может запасать энергию как в процессе субстратного фосфорилирования, так и в процессе анаэробного дыхания в присутствии внешнего акцептора электронов. В присутствии серы или сульфата ацетил-СоА, образующийся в результате метаболизм Сахаров, белков и жирных кислот может не только сбраживаться до ацетата, но и окисляться до С02 в окислительном цикле трикарбоновых кислот (ТСА), все ферменты которого кодируются геномом V. moutnovskia. В ходе анаэробного дыхания в присутствии соединений серы восстановленный ферредоксин и NAD(P)H, образованные в цикле трикарбоновых кислот, могут быть окислены в результате согласованной работы набора мембран-связанных белковых комплексов и цитоплазматических белков, приводящей к образованию трансмембранного протонного градиента. Анализ генома выявил мембран-связанный ферредоксин: NAD(P)+ оксидоредуктазный комплекс (FNOR), который может акцептировать электроны от восстановленного ферредоксина и передавать их на NAD(P) . В ходе этого процесса происходит перенос протонов через мембрану и формируется протонный градиент. Восстановленный NAD(P)H в дальнейшем может окисляться NAD(P)H:S оксидоредуктазой (NSR) с образованием H2S.

У многих термофильных архей, рост которых стимулируется в присутствии серы, восстановление серы осуществляется не только посредством комплекса FNOR и цитоплазматической NSR, но и посредством мембран-связанной сероредуктазы, осуществляющей реакцию 2Н+ + 2е" + S° = H2S. Однако, в геноме V. moutnovskia два из трех генов, кодирующих субъединицы сероредуктазы, делетированы. Акцептором электронов у некоторых кренархей

порядка ТИегторШеакя может служить нитрат, однако, гены мембран-связанной нитрат редуктазы у V. тоШпоуяМа также отсутствуют. Анализ генома V. тоииижк'ш выявил полный набор генов, кодирующих ферменты пути восстановления сульфатов, крайне редко встречающегося у архей и на сегодняшний день описанного только у эуриархеи Лгс}1аео§1оЬш /и^с1т и кренархеи СаЫМща тадиП^етгя.

Таким образом, дыхательная цепь, функционирующая в присутствии соединений серы, является разветвленной. Во-первых, электроны от восстановленного ферредоксина могут быть использованы системами РМСЖ и КБЯ, что сопряжено с трансмембранным транспортом протонов. Часть электронов от РККЖ, а также электроны от сукцинат:хинон оксидоредуктазы, являющейся мембранным компонентом ТСА, могут передаваться на хиноны в цитоплазматическую мембрану. Конечным акцептором электронов в этом случае могут являться сульфат и сульфит в процессе сульфат-редукции. Трансмембранный протонный градиент может также генерироваться в результате работы интегральной мембранной пирофосфотазы, транспортирующей протоны. Протонный градиент, являющийся результатом действия протонных насосов и пирофосфатазы, может использоваться АТФ-синтазой Л ¡Л,, типа для синтеза АТФ, сопряженного с переносом протонов внутрь клетки.

Таким образом, представители рода УикатБаМа могут играть важную экологическую роль в кислых горячих источниках, завершая анаэробный цикл углерода посредством анаэробного окисления органических веществ.

выводы

1. Методом пироееквенирования вариабельного участка V3 гена 16S рРНК определены составы микробных сообществ четырех термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся температурой и pH воды.

2. Наибольшее разнообразие микроорганизмов при отсутствии доминирования какой-либо одной группы обнаружено в источнике Заварзина, имеющего нейтральный pH (6.3) и умеренно-высокую температуру воды (55-58°С). Большую часть сообщества составляли бактерии Aquificae, Deferribacteres, Thermodesulfobacteria, Thermotogae, Deinococcus-Thermus, гамма- и бета-протеобактерии; археи составляли менее 5% всех микроорганизмов.

3. В кислых источниках (pH 3.7-4.1) археи составляли большинство микроорганизмов. В источнике с температурой около 50°С преобладали различные линии архей, не имеющие культивируемых представителей, а большую часть бактерий составляли Verrucomicrobia и гамма-протеобактерии рода Acidithiobacillus. В источниках с температурой 60-90°С доминировали кренархеи порядка SulfoJobales и наноархеи.

4. Определена полная нуклеотидная последовательность генома термоацидофильной археи Vulcanisaeta moutnovskia. Анализ генома и путей метаболизма этой археи показал, что помимо сбраживания органических субстратов, V. moutnovskia может осуществлять их полное окисление до СО2 и Н20 в окислительном цикле трикарбоновых кислот.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Марданов A.B., Гумеров В.М., Белецкий A.B., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Характеристика биоразнообразия термофильного микробного сообщества методом параллельного пироееквенирования // Доклады Академии наук. - 2010 - Т. 432 - С. 544-548.

2. Гумеров В.М., Марданов A.B., Белецкий A.B., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов в источнике Заварзина, кальдера Узон, Камчатка // Микробиология. - 2011 - Т. 80 - С. 258-265.

3. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Beletsky A.V., Perevalova A.A., Karpov G.A.,

Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Uncultured archaea dominate in the thermal groundwater of Uzon Caldera, Kamchatka // Extremophiles. - 2011 - V. 15-P. 365-372.

4. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Prokofeva M.I., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of "Vulcanisaeta moutnovskia" strain 768-28, a novel member of the hyperthermophilic crenarchaeal genus Vulcanisaeta II J. Bacteriol. - 2011 - V. 193 - P. 2355-2356.

5. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Molecular analysis of microbial communities of hydrothermal environments of Uzon Caldera // International Workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles". 12-18 August, 2010, Petropavlovask-Kamchatsky. Abstract book - P. 18.

6. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Microbial diversity of thermal springs of Uzon Caldera, Kamchatka, as revealed by 454 pyrosequencing // International conference "Extremophiles 2010". 12-16 September, 2010, Azores, Portugal. Abstract book - P. 250.

7. Гумеров B.M., Марданов A.B., Равин H.B. Молекулярный анализ микробных сообществ термальных источников кальдеры Узон методом параллельного пиросеквенирования // 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология-наука XXI века". 18-22 апреля 2011, г. Пущино. Сборник тезисов - С. 362.

8. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Bonch-Osmolovskaya Е.А., Ravin N.V. Microbial diversity in acidic hot springs of Uzon caldera, Kamchatka, as revealed by pyrosequencing of 16S RNA genes // 11th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology "BAGECO-11". 29 May-02 June, 2011, Corfu, Greece. Abstract book.

Подписано в печать 18 мая 2011 г. Объем 1,2 п. л. Тираж 80 экз. Заказ № 404 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гумеров, Вадим Мирбаевич

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Систематика термофильных прокариот

2. Методы геномного секвенирования

3. Методы анализа микробных сообществ 33 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48 РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Микробное сообщество воды источника Заварзина

2. Микробное сообщество источника «1884»

3. Микробные сообщества кислых термальных источников «1805» и «1810»

4. Оценка биоразнообразия микробных сообществ

5. Секвенирование и анализ генома термоацидофильной археи Vulcanisaeta moutnovskia 97 ОБСУЖДЕНИЕ 111 ВЫВОДЫ 121 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 122 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки"

Исследование структуры микробных сообществ, ассоциированных с высокотемпературными экологическими нишами, представляет интерес для фундаментальной микробиологии, в том числе эволюционной, поскольку многие обитающие в этих условиях микроорганизмы относятся к эволюционно древним ветвям бактерий и архей. Анализ структуры сообществ термофильных микроорганизмов проводился с момента их обнаружения около 40 лет назад микробиологическими методами, предполагающими получение и характеристику чистых культур микроорганизмов. В последние 20 лет также применяются не требующие культивирования микроорганизмов молекулярные методы, основанные на ПЦР-амплификации фрагментов генов 16S рРНК из природного образца, их клонировании и секвенировании независимых клонов. Сравнение полученных последовательностей с известными генами 16S РНК позволит определить, микроорганизмы каких групп присутствуют в сообществе и в каких соотношениях. Применение методов анализа 16S рРНК показало, что, как правило, не более 0.1-1% микроорганизмов удается культивировать в лабораторных условиях. Эти работы позволили выявить новые филогенетические группы прокариот, в том числе таксоны высокого уровня, для многих из которых до настоящего времени не получено культивируемых представителей. Однако, применявшиеся до последнего времени методы анализа 16S РНК предполагали клонирование фрагментов генов 16S РНК и независимое секвенирование отдельных клонов с помощью капиллярного электрофореза, что на практике позволяло проанализировать не более нескольких сот последовательностей 16S рРНК. В то же время, многие природные сообщества могут содержать тысячи различных видов микроорганизмов (Huber et al., 2007).

Развитие методов геномного секвенирования в последние несколько лет позволило совершить качественный скачок в их производительности, заключающийся в возможности проведения единовременного анализа не десятков-сотен, а нескольких сот тысяч нуклеотидных последовательностей. Применение методов пиросеквенирования позволяет проводить «глубокую» характеристику микробного сообщества, выявляя не только доминирующие микроорганизмы, но и минорные компоненты сообщества, которые, однако, могут играть важную экологическую роль (Sogin et al. 2006; Roesch et al. 2007; Krause et al. 2008). Появляется возможность достоверного количественного определения долей отдельных групп микроорганизмов, что необходимо для реконструкции путей метаболизма сообщества в целом. Микробные сообщества термальных местообитаний, в силу большого фундаментального и прикладного интереса к ним, стали одними из первых объектов молекулярного анализа биоразнообразия, основанного на высокопроизводительном анализе 16S рРНК методами пиросеквенирования (Miller et al., 2009). Однако, до настоящего времени опубликовано лишь несколько работ по изучению сообществ термофильных микроорганизмов Йеллоустонского парка (США) и Исландии с использованием пиросеквенирования.

В Российской Федерации исследования термофильных микроорганизмов были начаты в конце 1970-х годов в Институте микробиологии РАН. В значительной степени их успеху способствовало наличие в нашей стране уникального природного объекта, -многочисленных и разнообразных по своим физико-химическим характеристикам термальных источников Камчатского вулканического района, в первую очередь Долины гейзеров и кальдеры вулкана Узон.

За последние 30 лет из термальных источников Камчатки было выделено большое число новых термофильных бактерий и архей, в том числе представляющих обособленные филогенетические группы и характеризующихся различными типами метаболизма (Заварзин и др., 1989; Заварзин, 2004; Лебединский и др., 2007). Однако по сравнению с Иеллоустонским парком и Исландией, биоразнообразие термофильных микроорганизмов Камчатки изучено значительно менее глубоко. Помимо культуральных методов, для характеристики термофилов Камчатки использовались традиционные молекулярные методы анализа 16S рРНК, однако, число анализируемых независимых последовательностей в разных работах не превышало нескольких десятков.

Таким образом, задача «глубокой» количественной характеристики сообществ термофильных микроорганизмов, в особенности горячих источников Камчатки, является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований в области микробиологии и молекулярной биологии. Данная задача имеет и практическое значение, обусловленное биотехнологическим потенциалом термофильных микроорганизмов в качестве источника новых ферментов.

Предметом настоящей работы является молекулярный анализ микробных сообществ нескольких термальных источников кальдеры вулкана Узон с различными физико-химическими характеристиками.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью работы является определение структур сообществ микроорганизмов термальных источников кальдеры вулкана Узон, Камчатка.

При этом были поставлены следующие основные задачи:

2. Идентификация микроорганизмов на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 168 рибосомной РНК, определенных методом пиросеквенирования.

3. Реконструкция путей метаболизма сообществ в целом на основе данных об их составе.

4. Определение полной нуклеотидной последовательности генома термофильной археи рода ¥и1сат$ае(а, широко распространенного в кислых термальных источниках, анализ путей ее метаболизма и возможной экологической роли в термальных сообществах.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Гумеров, Вадим Мирбаевич

выводы

1. Методом пиросеквенирования вариабельного участка УЗ гена 16Б рРНК определены составы микробных сообществ четырех термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся температурой и рН воды.

2. Наибольшее разнообразие микроорганизмов при отсутствии доминирования какой-либо одной группы обнаружено в источнике Заварзина, имеющего нейтральный рН (6.3) и умеренно-высокую температуру воды (55-58°С). Большую часть сообщества составляли бактерии Адш/1сае, Ое/егпЬаМегея, Ткегтойе8и1/оЪас1ег1а, Т/гегто^ае, Вегуюсосст-Ткегтия, гамма- и бета-протеобактерии; археи составляли менее 5% всех микроорганизмов.

3. В кислых источниках (рН 3.7-4.1) археи составляли большинство микроорганизмов. В источнике с температурой около 50°С преобладали различные линии архей, не имеющие культивируемых представителей, а большую часть бактерий составляли Уеггисот'югоЫа и гамма-протеобактерии рода АсьйНЫоЬасШш. В источниках с температурой 60-90°С доминировали кренархеи порядка 8и1/о1оЪа1е$ и наноархеи.

4. Определена полная нуклеотидная последовательность генома термоацидофильной археи Уи1сат$ае1а тоШпоуяШа. Анализ генома и путей метаболизма этой археи показал, что помимо сбраживания органических субстратов, V. тоШпоуякга может осуществлять их полное окисление до С02 и Н20 в окислительном цикле трикарбоновых кислот.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Марданов А.В., Гумеров В.М., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Характеристика биоразнообразия термофильного микробного сообщества методом параллельного пиросеквенирования // Доклады Академии наук. - 2010 - Т. 432 - С. 544-548.

2. Гумеров В.М., Марданов А.В., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов в источнике Заварзина, кальдера Узон, Камчатка // Микробиология. - 2011 - Т. 80 - С. 258-265.

3. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Beletsky A.V., Perevalova A.A., Karpov G.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Uncultured archaea dominate in the thermal groundwater of Uzon Caldera, Kamchatka // Extremophiles. - 2011 - V. 15 - P. 365-372.

7. Гумеров B.M., Марданов А.В., Равин Н.В. Молекулярный анализ микробных сообществ термальных источников кальдеры Узон методом параллельного пиросеквенирования // 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология-наука XXI века". 18-22 апреля 2011, г. Пущино. Сборник тезисов - С. 362.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гумеров, Вадим Мирбаевич, Москва

1. Баев А.А., Венкстерн Т.В., Мирзабеков А.Д., Крутилина А.И., Ли Л., Акселърод В.Д. 1967. Первичная структура валиновой транспортной РНК1 пекарских дрожжей. Молекулярная биология, т. 1, вып. 5, с. 754

2. Заварзин Г.А. 1984. Бактерии и состав атмосферы. М.: Наука, 1984

3. Заварзин Г.А., Карпов Г.А., Горленко В.М., Головачева Р.С., Герасименко Л.М., Бонч-Осмоловская Е.А., Орлеанский В.К. 1989. Кальдерные микроорганизмы. М.: Наука, 1989. 120 с.

4. Заварзин Г.А. 2004. Изучение микробного разнообразия в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского. Микробиология, т. 73, № 5: 598-612

5. Запороженко Е.В., Слободова Н.В., Булыгина Е.С., Кравченко И.К., Кузнецов Б.Б. 2006. Экспресс-метод выделения ДНК из бактериальных сообществ различных почв. Микробиология, т. 75, № 1: 127-134

6. Лебединский А.В., Черных Н.А., Бонч-Осмоловская Е.А. 2007. Геносистематика микроорганизмов термальных местообитаний. Биохимия, т. 72, № 12: 1594-1609

7. Равин Н.В. 2009. Современные методы геномного секвенирования и их применение для расшифровки геномов микроорганизмов. Биотехнология, №5, с. 8-15.

8. Спирин А.С., Белозерский А.Н., Шугаева, Ванюшин Б.Ф. 1957. Изучение видовой специфичности нуклеиновых кислот у бактерий. Биохимия, т. 22: 744-754

9. Acinas S.G., Klepac-Ceraj V., Hunt D.E., Pharino С., Ceraj I., Distel D.L., Polz M.F. 2004. Fine-scale phylogenetic architecture of a complex bacterial community. Nature, 430:551-554

10. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., and Lipman, D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402

11. Andersson A.F., Lindberg M., Jakobsson H., Backhed F., Nyren P., Engstrand L. 2008. Comparative analysis of human gut microbiota by barcoded pyrosequencing. PLoS ONE 3:e2836

12. Andrews K.T., Patel B.K. 1996. Fervidobacterium gondwanense sp. nov., a new thermophilic anaerobic bacterium isolated from nonvolcanically heated geothermal waters of the Great Artesian Basin of Australia. Int. J. Syst. Bacteriol., 46: 265-269

13. Baker G.C, Cowan D.A. 2004. 16 S rDNA primers and the unbiased assessment of thermophile diversity. Biochem Soc Trans., 32: 218-221

14. Balk M., Weijma J., Stams A. J. 2002. Thermotoga lettingae sp. nov., a novel thermophilic, methanol-degrading bacterium isolated from a thermophilic anaerobic reactor. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 52: 1361-1368

15. Barns S.M., Fundyga R.E., Jeffries M.W., Pace N.R. 1994. Remarkable archaeal diversity detected in a Yellowstone National Park hot spring environment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1609-1613

16. Barns S.M., Delwiche, C. F., Palmer J. D., and Pace N. R. 1996. Perspectives on archaeal diversity, thermophily and monophyly from environmental rRNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9188-9193

17. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D.A., Horvath P. 2007. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 315: 1709-1712

18. Behnke A., Engel M., Christen R., Nebel M., Klein R.R., Stoeck T. 2011. Depicting more accurate pictures of protistan community complexity using pyrosequencing of hypervariable SSU rRNA gene regions. Environ Microbiol., 13: 340-349

19. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., and Brunak S.J. 2004. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol., 340: 783-95

20. Bertoldo C., Antranikian G. 2006. The Order Thermococcales. In "The Prokaryotes" (Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Scleifer, K.-H., and Stackebrandt, E., eds.) Vol. 3, Springer-Verlag, New York: 69-81

21. Bonch-Osmolovskaya E.A., Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Zavarzin G.A. 1990. Desulfurella acetivorans gen. nov. and sp. nov. — a new thermophilic sulfur-reducing eubacterium. Arch. Microbiol., 153: 151-155

22. Bonch-Osmolovskaya E. A. 1994. Bacterial sulfur reduction in hot vents. FEMS Microbiol. Rev., 15: 65-77

23. Brochier C., Forterre P., Gribaldo S. 2005. An emerging phylogenetic core of Archaea: phylogenies of transcription and translation machineries converge following addition of new genome sequences. BMC Evol. Biol., 5: 36

24. Brochier-Armanet C., Boussau B., Gribaldo S., Forterre P. 2008. A DNA topoisomerase IB in Thaumarchaeota testifies for the presence of this enzyme in the last common ancestor of Archaea and Eucarya. Biol Direct., 3: 54

25. Brock T. D., Freeze H. 1969. Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile. J. Bacteriol., 98: 289-297

26. Brock T. D., Brock K. M., Belly R. T., and Weiss R. L. 1972. Sulfolobus: a new genus of sulfur-oxidizing bacteria living at low pH and high temperature. Arch. Microbiol., 84, 5468

27. Brock T. D. 1978. Thermophilic microorganisms and life at high temperatures. SpringerVerlag, New York, 465 p.

28. Caldwell D.E., Caldwell S.J., Laycock J.P. 1976. Thermothrix thioparus gen. et sp. nov. a facultatively anaerobic facultative chemolithotroph living at neutral pH and high temperature. Can J Microbiol., 22: 1509-1517

29. Clingenpeel S.R., D'Imperio S., Oduro H., Druschel G.K., McDermott T.R. 2009. Cloning and in situ expression studies of the Hydrogenobaculum arsenite oxidase genes. Appl Environ Microbiol., 75: 3362-3365

30. Deicher A.L., Harmon D., Kasif S., White O., and Salzberg S.L. 1999. Improved microbial gene identification with GLIMMER. Nucleic Acids Res., 27: 4636-4641

31. Deicher A.L., Bratke K.A., Powers E.C., Salzberg S.L. 2007. Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with Glimmer. Bioinformatics, 23: 673-679

32. Dethlefsen L., Huse S., Sogin M.L., Relman D.A. 2008. The pervasive effects of an antibiotic on the human gut microbiota, as revealed by deep 16S rRNA sequencing. PLoS Biol., 6: e280

33. Di Giulio M. 2007. The tree of life might be rooted in the branch leading to Nanoarchaeota. Gene, 401: 108-113

34. Doemel W.N., Brock T.D. 1970. The upper temperature limit of Cyanidium caldarium. Arch Microbiol., 72: 326-332

35. Friedrich A.B., Antranikian G. 1996. Keratin degradation by Fervidobacterium pennavorans, a novel thermophilic anaerobic species of the order Thermotogales. Appl. Environ. Microbiol., 62: 2875-2882

36. Friedrich T., Scheide D. 2000. The respiratory complex I of bacteria, archaea and eukarya and its module common with membrane-bound multisubunit hydrogenases. FEBS Lett., 479: 1-5

37. Futterer O., Angelov A., Liesegang H., Gottschalk G., Schleper C., Schepers B., Dock C., Antranikian G, Liebl W. 2004. Genome sequence of Picrophilus torridus and its implications for life around pH 0. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 101: 9091-9096

38. Garrity G.M., Boone D.R., Castenholz R.W. (eds.). 2001, 2005. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Edn., Springer-Verlag, New York-Berlin-Heidelberg, Vols. 1,2.

39. Godon J.J., Zumstein E., Dabert P., Habouzit F., Moletta R. 1997. Molecular microbial diversity of an anaerobic digestor as determined by small-subunit rDNA sequence analysis. Appl. Environ. Microbiol., 63: 2802-2813

40. Greene A.C., Patel B.K.C., Sheehy A.J. 1997. Deferribacter thermophilus gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic manganese- and iron-reducing bacterium isolated from a petroleum reservoir. Int. J. Syst. Bacteriol., 47: 505-509

41. Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C. 2007. CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue): W52-57

42. Hohn M.J., Hedlund B.P., Huber H. 2002. Detection of 16S rDNA sequences representing the novel phylum "Nanoarchaeota": indication for a wide distribution in high temperature biotopes. Syst Appl Microbiol., 25: 551-554

43. Hu Y., Holdcn J.F. 2006. Citric acid cycle in the hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum islandicum grown autotrophically, heterotrophically, and mixotrophically with acetate. J. Bacteriol. 188:4350-4355

44. Huber H., Hohn M.J., Rachel R., Fuchs T., Wimmer V.C., Stetter K.O. 2002. A new phylum of Archaea represented by a nanosized hyperthermophilic symbiont. Nature, 417: 63-67

45. Huber J.A., Mark Welch D.B., Morrison H.G., Huse S.M., Neal P.R., Butterfield DA, Sogin ML. 2007. Microbial population structures in the deep marine biosphere. Science, 318: 97-100

46. Hugenholtz P., Pitulle C., Hershberger K. L., and Pace N. R. 1998. Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring. J. Bacteriol., 180: 366-376

47. Hugenholtz P. 2002. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol., 3(2): reviews 0003.1-0003.8

48. Huse S.M., Huber J.A., Morrison H.G., Sogin M.L., Welch DM. 2007. Accuracy and quality of massively parallel DNA pyrosequencing. Genome Biol., 8: R143

49. Huse S.M., Dethlefsen L., Huber J.A., Mark W. D., Relman D.A., Sogin M.L. 2008. Exploring microbial diversity and taxonomy using SSU rRNA hypervariable tag sequencing. PLoS Genet., 4: el000255

50. Islam T., Jensen S., Reigstad .LJ., Larsen O., Birkeland N.K. 2008. Methane oxidation at 55 degrees C and pH 2 by a thermoacidophilic bacterium belonging to the Verrucomicrobia phylum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105: 300-304

51. Itoh T., Suzuki K., Sanchez P.C., Nakase T. 1999. Caldivirga maquilingensis gen. nov., sp. nov., a new genus of rod-shaped crenarchaeote isolated from a hot spring in the Philippines. Int J Syst Bacteriol., 49: 1157-1163

52. Itoh T., Suzuki K. Nakase T. 2002. Vidcanisaeta distributa gen. nov., sp. nov., and Vulcanisaeta souniana sp. nov., novel hyperthermophilic, rod-shaped crenarchaeotes isolated from hot springs in Japan. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 52: 1097-1104

53. Itoh T., Nomura N., Sako Y. 2003. Distribution of 16S rRNA introns among the family Thermoproteaceae and their evolutionary implications. Extremophiles, 7: 229-233

54. Jackson T. J., Ramaley R. F., Meinschein W. G. 1973. Thermomicrobium, a new genus of extremely thermophilic bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol., 23, 28-36

55. Johnson J. L. 1973. Use of nucleic acid homologies in the taxonomy of anaerobic bacteria. Int. J. Syst. Bacteriol., 23, 308-315

56. Kashefi K., Lovely D.R. 2003. Extending the Upper Temperature Limit for Life. Science. 301:934

57. Keijser B.J., Zaura E., Huse S.M., van der Vossen J.M., Schuren F.H., Montijn R.C., ten Cate J.M., Crielaard W. 2008. Pyrosequencing analysis of the oral microflora of healthy adults. J. Dent. Res., 87: 1016-1020

58. Kersters K., De Vos P., Gillis M., Swings J., Vandamme P. and Stackebrandt E. 2006. Introduction to the Proteobacteria. In "The Prokaryotes". Martin Dworkin (Editor-in

59. Chief), Stanley Falkow, Eugene Rosenberg, Karl-Heinz Schleifer, Erko Stackebrandt (Editors). Springer, 5: 3-37

60. Kirchman D.L., Cottrell M.T., Lovejoy C. 2010. The structure of bacterial communities in the western Arctic Ocean as revealed by pyrosequencing of 16S rRNA genes. Environ. Microbiol., 12: 1132-1143

61. Kirk J.L., Beaudette L.A., Hart M., Moutoglis P., Klironomos J.N., Lee H., Trevors J.T.2004. Methods of studying soil microbial diversity. J. Microbiol. Methods, 58: 169-188

62. Kletzin A. 2007. General characteristics and important model organisms. In "Archaea: molecular and cellular biology". Ed. Cavicchioli R. Washington, USA: ASM Press, 2007: 14-93

63. Konneke M., Bernhard A.E., de la Torre J.R., Walker C.B., Waterbury J.B., Stahl D.A.2005. Isolation of an autotrophic ammonia-oxidizing marine archaeon. Nature, 437: 543546

64. Konstantinidis T. K., Tiedge J. M. 2005. Genomic insights that advance the species definition for prokaryotes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 2567-2572

65. Kunin V., Engelbrektson A., Ochman H., Hugenholtz P. 2010. Wrinkles in the rare biosphere: pyrosequencing errors can lead to artificial inflation of diversity estimates. Environ. Microbiol., 12: 118-123

66. Kvist T., Ahring B.K. and Westermann P. 2007. Archaeal diversity in Icelandic hot springs. FEMS Microbiology Ecology, 59: 71-80

67. Kysela D. T., Palacios C., Sogin M. L. 2005. Serial analysis of V6 ribosomal sequence tags (SARST-V6): a method for efficient, high-throughput analysis of microbial community composition. Environ. Microbiol., 7: 356-364

68. Laska S., Lottspeich F., Kletzin A. 2003. Membrane-bound hydrogenase and sulfur reductase of the hyperthermophilic and acidophilic archaeon Acidianus ambivalens. Microbiology, 149: 2357-2371

69. Lagesen K., Hallin P., Roland E.A., Staerfeldt H.H., Rognes T., Ussery D.W. 2007. RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal RNA genes. Nucleic Acids Res., 35: 3100-3108

70. Li Y., Mandelco L., Wiegel J. 1993. Isolation and characterization of a moderately thermophilic anaerobic alkaliphile, Clostridium paradoxum sp. nov. Int. J. Syst. Bacterid., 43: 450-460

71. Lillestel R.K., Redder P., Garrett R.A., Brügger K. 2006. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea, 2: 59-72

72. Ma K., Hutchins A., Sung S.J., Adams M.W. 1997. Pyruvate ferredoxin oxidoreductase from the hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus, functions as a CoA-dependent pyruvate decarboxylase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 9608-9613

73. Mai X., Adams M.W. 1996. Purification and characterization of two reversible and ADP-dependent acetyl coenzyme A synthetases from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus. J. Bacteriol., 178: 5897-5903

74. Makarova K.S., Koonin E. V. 2005. Evolutionary and functional genomics of the Archaea. Curr. Opin. Microbiol., 8: 586-594

75. Mathur J., Bizzoco R.W., Ellis D.G., Lipson D.A., Poole A.W., Levinc R., Kelley S.T. 2007. Effects of abiotic factors on the phylogenetic diversity of bacterial communities in acidic thermal springs. Appl Environ Microbiol., 73: 2612-2623

76. Maxam A.M., Gilbert W. 1977. A new method of sequencing DNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 560-564

77. McCliment E.A., Voglesonger K.M., O'Day P.A., Dunn E.E., Holloway J.R., Cary S.C. 2006. Colonization of nascent, deep-sea hydrothermal vents by a novel Archaeal and Nanoarchaeal assemblage. Environ Microbiol., 8: 114-125

78. Meyer-Dombard D. R., Shock E. L., Amend J. P. 2005. Archaeal and bacterial communities in geochemically diverse hot springs of Yellowstone National Park, USA. Geobiology, 3:211-227

79. Mori K., Suzuki K. 2008. Thiofaba tepidiphila gen. nov., sp. nov., a novel obligately chemolithoautotrophic, sulfur-oxidizing bacterium of the Gammaproteobacteria isolated from a hot spring. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 58: 1885-1891

80. Muyzer G., de Waal E.C., Uitterlinden A.G. 1993. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl. Environ. Microbiol., 59: 695-700

81. Nannipieri P., Ascher J., Ceccherini M.T., Landi L., Pietramellara G., Renella G. 2003. Microbial diversity and soil functions. Eur. J. Soil Sci., 54: 655-670

82. Pace N. R. 1997. A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276: 734-740

83. Paper W., Jahn U., Hohn M.J., Kronner M., Nather D.J., Burghardt T., Rachel R., Stetter K.O., Huber H. 2007. Ignicoccus hospitalis sp. nov., the host of Nanoarchaeum equitans. Int J Syst Evol Microbiol., 57: 803-808

84. Perevalova A.A., Bidzhieva S.Kh., Kublanov I.V., Hinrichs K.U., Liu X.L., Mardanov

85. Pol A., Heijmans K., Harhangi H.R., Tedesco D., Jetten M.S., Op den Camp H.J. 2007. Methanotrophy below pH 1 by a new Verrucomicrobia species. Nature, 450: 874-878

86. Prokofeva M. I., Miroshnichenko M. L., KostrikinaN. A., Chernyh N. A., Kuznetsov B.

87. B., Tourova T. P., and Bonch-Osmolovskaya E. A. 2000. Acidilobus aceticus gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic thermoacidophilic archaeon from continental hot vents in Kamchatka. Int. J. Syst. Bacterid., 50: 2001-2008

88. Prosser J.I. 2002. Molecular and functional diversity in soil microorganisms. Plant and Soil., 244: 9-17

89. Quince C., Lanzen A., Curtis T.P., Davenport R.J., Hall N., Head I.M., Read L.F., Sloan W.T. 2009. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat Methods., 6: 639-641

90. Quince C., Lanzen A., Davenport R.J., Turnbaugh P.J. 2011. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics, 12: 38

91. Rainey F. A., Ward N. L., Morgan H. W., Toalster R., and Stackebrandt E. 1993. Phylogenetic analysis of anaerobic thermophilic bacteria: aid for their reclassification. J. Bacterid., 175: 4772-4779

92. Ranjard L., Poly F., Nazaret S. 2000. Monitoring complex bacterial communities using culture-independent molecular techniques: application to soil environment. Res. Microbiol., 151: 167-177

93. Reysenbach A.-L., Ehringer M., and Hershberger K. 2000a. Microbial diversity at 83°C in Calcite Springs, Yellowstone National Park: another environment where the Aquificales and "Korarchaeota" coexist. Extremophiles, 4: 61-67

94. Reysenbach A.-L., Longnecker K., and Kirshtein J. 2000b. Novel bacterial and archaeal lineages from an in situ growth chamber deployed at a Mid-Atlantic Ridge hydrothermal vent. Appl. Environ. Microbiol., 66: 3798-3806

95. Reysenbach A.-L., Liu Y., Banta A.B., Beveridge T.J., Kirshtein J.D., Schouten S., Tivey M.K., Von Damm K.L., Voytek M.A. 2006. A ubiquitous thermoacidophilic archaeon from deep-sea hydrothermal vents. Nature. 442: 444-447

96. Reigstad L. J., Jorgensen S.L., Schleper C. 2010. Diversity and abundance of Korarchaeota in terrestrial hot springs of Iceland and Kamchatka. ISME J., 4: 346-356

97. Roesch L.F., Fulthorpe R.R., Riva A., Casella G., Hadwin A.K., Kent A.D., Daroub S.H., Camargo F.A., Farmerie W.G., Triplett E.W. 2007. Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity. ISME J., 1: 283-290

98. Ronaghi M., Uhlen M., and Nyren P. 1998. A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science, 281: 363-365

99. Ronaghi M., Pourmand N., Jain M., Willis T., and Davis R. 2000. Pyrosequencing for genome resequencing. In 12th International Genome Sequencing and Analysis Conference, Miami, FL

100. Rossello-Mora, R. 2005. DNA-DNA reassociation methods applied to microbial taxonomy and their critical evaluation. In Molecular Identification, Systematics, and Population Structure of Prokaryotes (Stackebrandt, E., ed.) Springer, Heidelberg: 23-50

101. Saiki T., Kobayashi Y., Kawagoe K., and Beppu T. 1985. Dictyoglomus thermophilum gen. nov., sp. nov., a chemoorganotrophic, anaerobic, thermophilic bacterium. Int. J. Syst. Bacterid., 35: 253-259

102. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.

103. Stackebrandt E. 2006. Defining taxonomic ranks. In "The Prokaryotes" (Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Scleifer, K.-H., and Stakebrandt, E., eds.) Vol. 1, SpringerVerlag, New York: 29-57

104. Stackebrandt E., Ebers J. 2006. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards Microbiol. Today, 10: 152-155

105. Stetter K. O. 1996. Hyperthermophilic procaryotes. FEMS Microbiol. Rev., 18: 149-158

106. Takai K., Horikoshi K. 1999. Genetic diversity of archaea in deep-sea hydrothermal vent environments. Genetics, 152: 1285-1297

107. Theron J., Cloete T.E. 2000. Molecular Techniques for Determining Microbial Diversity and Communiry Structure in Natural Environments. Critical Reviews in Microbiology, 26: 37-57

108. Turnbaugh P.J., Ley R.E., Mahowald M.A., Magrini V., Mardis E.R., Gordon J.I. 2006. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444: 1027-1031

109. Valdes J., Pedroso I., Quatrini R., Dodson R.J., Tettelin H., Blake R. 2nd, Eisen J.A., Holmes D.S. 2008. Acidithiobacillus ferrooxidans metabolism: from genome sequence to industrial applications., 9: 597

110. Van de Peer Y., De Wächter R. 1997. Construction of evolutionary distance trees with TREECON for Windows: accounting for variation in nucleotide substitution rate among sites. Comput Appl Biosci., 13: 227-230

111. Winker S., Woese C.R. 1991. A definition of the domains Archaea, Bacteria and Eucarya in terms of small subunit ribosomal RNA characteristics. Syst. Appl. Microbiol., 14: 305

112. Woese C.R., Sogin M.L., and Sutton L.A. 1974. Procaryote phylogeny. Concerning the relatedness of Aerobacter aerogenes to Escherichia coli. J. Mol. Evol., 3: 293-299

113. Woese C. R., Fox G. E. 1977. Phylogenetic structure of the prokaryotic domain: the primary kingdoms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5088-5090

114. Woese C. R„ Magrum L. J., and Fox G. E. 1978. Archaebacteria. J. Mol. Evol., 11, 245252

115. Woese C. R. 2006. How we do, don't and should look at bacteria and bacteriology. In "The Prokaryotes" (Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Scleifer, K.-H., and Stackebrandt, E., eds.) Vol. 1, Springer-Yerlag, New York: 3-23

116. Wolf Y.I., Rogozin I.B., Grishin N.Y., Tatusov R.L., Koonin E.V. 2001. Genome trees constructed using five different approaches suggest new major bacterial clades. BMC Evol. Biol., 1: 8

117. Zaparty M., Tjaden B., Hensel R., Siebers B. 2008. The central carbohydrate metabolism of the hyperthermophilic crenarchaeote Thermoproteus tenax: pathways and insights into their regulation. Arch. Microbiol., 190: 231-245

Информация о работе

Гумеров, Вадим Мирбаевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов термальных источников Камчатки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы