Молекулярные перестройки хроматина и их роль в регуляции дифференциальной экспрессии генов в ходе развития

Краевский, Владислав Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные перестройки хроматина и их роль в регуляции дифференциальной экспрессии генов в ходе развития
ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные перестройки хроматина и их роль в регуляции дифференциальной экспрессии генов в ходе развития"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 577.151.52+577.213/ .217

Краевский Владислав Александрович

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ ХРОМАТИНА И ИХ РОЛЬ В РЕГУЛЯЦИИ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Специальность: 03.00.30 - биология развития и эмбриология

и 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии Наук.

директор Института -доктор биологических наук,

профессор Николай Дмитриевич ОЗЕРНЮК

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук

Алексей Петрович РЫСКОВ доктор биологических наук Борис Александрович КУЗИН доктор биологических наук Николай Андреевич ЧУРИКОВ

Ведущая организация:

Институт экспериментальной кардиологии Всероссийского кардиологического научного центра.

Защита состоится 1 июня 2005 г. в 1400 на заседании Диссертационного совета Д002.238.01 при Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334. Москва, ул. Вавилова, д. 26.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии Наук.

Отзывы можно направлять по адресу:

119334. Москва, ул. Вавилова, д.26, Диссертационный совет.

Факс: (095) 135-80-12; E-mail: voIina@proxlma.idb.ac.ru

Автореферат разослан 25 апреля 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Характер упаковки ДНК в ядрах эукариотических клеток является критическим и, зачастую, доминирующим фактором уровня активности генов. Структурной единицей хроматина является нуклеосомная частица, состоящая из фрагмента ДНК длиной 145 п. н. "навитого" на октамер гистоновых белков. В ходе дальнейшей компактизации нить нуклеосом последовательно образует фибриллу диаметром 25-34 нм, филаменты 200-300 нм, петли хроматина и сверхспирали хроматид. Полностью упакованная ДНК имеет жесткую, статичную структуру несовместимую с ее функциональной активностью. Если структура хроматина как таковая, изучена достаточно подробно, то механизмы перестроек хроматина при активации генов остаются неясными. Практически неизвестны молекулярные основы возникновения, поддержания и наследуемости стабильного профиля экспрессии генов в ходе развития, что является центральной проблемой биологии развития, молекулярной биологии и молекулярной генетики. Изучение молекулярных механизмов упаковки хроматина необходимо и для направленного манипулирования дифференциальной экспрессией эукариотического генома. Предполагают, что при активации генов структура хроматина, сохраняясь как таковая, претерпевает существенные изменения. Природа этих перестроек, их молекулярный механизм и роль в регуляции генома еще неясны.

Цель работы и задачи исследования: Работа проводилось в попытке прояснить структурно-функциональные аспекты перестроек хроматина и их роль в регуляции дифференциальной экспрессии эукариотического генома. Непосредственными задачами являлось определить, а) базовые особенности молекулярной структуры активного хроматина; б) за счет каких факторов обусловливаются структурные перестройки хроматина, какую роль в их осуществлении играют модификации белков хроматина и специфические последовательности ДНК; в) каким образом создается, поддерживается и передается при митозе определенный профиль активности генов эукариотических клеток.

Научная новизна работы: В работе изучены и описаны неизвестные ранее структурные особенности доменов активного хроматина, механизмы перестроек хроматина при его активации, а также механизмы взаимодействия регуляторов клеточной дифференцировки со структурами активного хроматина Изучены конформационные характеристики модельного домена активного хроматина; структура и динамика фибрилл "нормального" и высокоацеггилированного хроматина; влияни : у ацетилированиЯ ^ ^стонов,

С 1.1- срвуг* -РК

последовательности и структур ДНК на локальные перестройки и транскрипционную активность хроматина; выявлен и изучен принципиально новый тип "энергонезависимых" перестроек протяженных участков хроматина; обнаружен и описан новый домен в факторах гомеотической регуляции, способный прочно связываться со специфическими структурами ДНК и нуклеосом. Предложена концепция взаимосвязи структурных перестроек разных уровней упаковки ДНК, как основе функциональной организации хроматина.

Практическая ценность работы: Основной проблемой генной терапии, создания трансгенных организмов и других приложений, требующих манипулирования генетической активностью эукариотических клеток, является подавление активности внедренной генетической конструкции за счет структуры хроматина. Здесь предложен способ активации генетической конструкции за счет локального разрушения структуры хроматина в районах инициации транскрипции с помощью последовательностей ДНК с "нестандартной" конформацией. Подход может послужить основой для конструирования гиперактивных генетических конструкций, обеспечивающих высокий уровень тканенеспецифичной экспрессии при внедрении в эукариотический геном. Также разработаны метод анализа наднуклеосомной организации хроматина с помощью интеркалируюгцих агентов, и метод электрофорегического анализа структуры и динамики фибрилл хроматина, представляющий эффективную альтернативу существующим более трудо- и капиталоемким методам.

Публикации: По теме работы опубликованы 56 статей в независимо рецензируемых журналах, из них 25 статьи - в международных зарубежных журналах.

Апробация работы: Результаты работы докладывались на международных и российских симпозиумах, общеинститутских советах и семинарах, в том числе в Имперском Центре Раковых Исследований, Лондон 1994г., Университете Виктории, Виктория 1994 г., Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии, Гейдельберг, 1996, 1997 гг., Институте ЯСМоно, Париж, 1999 г., Университете Джеффе рсона, Филадельфия 2001,2003 гг.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 245 страницах и содержит юб рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает 518 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Рассматриваются организация и механизмы структурных перестроек активного хроматина, регуляция этих процессов и роль, которую играют в их осуществлении посг-синтетические модификации гистонов и специфические структуры ДНК. Также рассматриваются механизмы взаимодействия факторов гомеостатической регуляции генов C'SET-domain' proteins) со структурами активного хроматина.

Отдельная глава посвящена взаимосвязи структурных перестроек разных иерархических уровней упаковки ДНК, чему не всегда уделяется внимание при рассмотрении совместимости функций ДНК с сохранением структуры хроматина.

В ядрах клеток выделяют несколько иерархических уровней компактизации ДНК. Единицей структуры является нуклеосомная частица, состоящая из 145 п.н. ДНК, уложенных в 1,8 левых сверхвитка вокруг гистоновой глобулы. На следующем уровне компактизации нить нуклеосом свивается в соленоидную структуру, образуя фибриллу диаметром 30 нм, содержащую 6-12 нуклеосом на один виток спирали. На третьем уровне компактизации, 30 нм фибрилла свивается с образованием петель хроматина, организованых в гексамерные «розетки», которые при дальнейшем сворачивании образуют сверхспирали 300 нм волокон и, далее - сверхспирали хроматид (рис. 1).

Рис. 1. Некоторые уровни структурной иерархии

хроматина: (А) - нуклеосомный уровень (показан димер нуклеосом с гистоном Hi); (В) -30 нм нуклеосомная фибрилла. Витки фибриллы и нуклеосом противоположны по знаку; (В)-гексамерная "розетка" Filipski et al„ (1990) EMBO J. 9,1319-1327.

Таким образом,

структура эукариотического хроматина представляет иерархическую систему сверхспиралей ДНК, в которой каждый последующий уровень организации основывается на предыдущем. Основания петель хроматина фиксированы за счет взаимодействия ДНК с белками ядерного матрикса, предотвращающими проворачивание концов ДНК, что придает хромосомной ДНК свойства, характерные для кольцевых замкнутых молекул ДНК. Изменение числа витков двойной спирали ДНК или оси двойной спирали ДНК должны быть скомпенсированы образованием противоположных по знаку витков (рис. 2). Благодаря этому, организация ДНК разных уровней компактизации оказывается взаимосвязанной - изменение организации ДНК на одном уровне должно приводить к изменению организации ДНК других уровней.

Рис. 2. Динамика топологически замкнутых молекул ДНК: (А) -ось двойной спирали ДНК в плоскости. Изменение числа витков оси двойной спирали (DWr,) должно быть скомпенсировано за счет противонаправленных витков: (Б) - возникающих в двойной спирали ДНК- DTw, или (В,Г) - образуемых осью двойной спирали ДНК- DWra. (В) - витки более низкого уровня иерархии, (Г) - витки равного уровня.

Так, например, при декомпактизации 30 нм фибриллы хроматина, число витков сверхспирали нуклеосомного соленоида возрастает более чем в четыре раза (рис. 3). В отсутствие разрывов в ДНК, возрастание числа витков нуклеосомного соленоида должно

бьггь скомпенсировано противоположными по знаку сверхвитками нуклеосом, с разворачиванием и дестабилизацией последних, или же за счет витков двойной спирали ДНК, что также приводит к нарушению ДНК-белковых взаимодействий в нуклеосомах (формирование противоположных витков осью соленоида энергетически невыгодно из-за его большой жесткости).

Рис. з. Топология декомпактизации 30 нм нуклеосомной фибриллы. В компактной фибрилле на один виток спирали приходится 6-12 нуклеосом, при декомпактизации фибриллы число нуклеосом уменьшается до двух и менее на виток спирали.

Безусловно, было бы привлекательно рассматривать приведенный выше механизм как основу функциональных перестроек в хроматине. Действительно, клеточный механизм,

обусловливающий дестабилизацию упаковки ДНК одних уровней структурной иерархии, обеспечивает тем самым также и дестабилизацию остальных структур хроматина. Измененная структура хроматина может быть в дальнейшем "зафиксирована" путем модификации гистоновых и негистоновых белков. Вероятно, что реализуется и и механизм, "обратный" рассмотренному: образование одних компактных структур способствует дальнейшей компактизации хроматина, например, при "упаковке" метафазных хромосом. По-крайней мере отдельные элементы этого механизма реализуются in vivo. Так, положительные сверхвитки, образующиеся впереди транскрипционного комплекса при "расплетании" им спирали ДНК, компенсируются сверхвитками нуклеосом, способствуя дестабилизации, и удалению нуклеосом с пути продвигающегося комплекса. И наоборот, отрицательные сверхвитки непосредственно за транскрипционным комплексом способствуют регенерации нуклеосом (Clark & Felsenfeld (1992) Cell 71. 1122; Studitsky et. al., (1995) Cell 83,19-27).

2. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. ВЗАИМОСВЯЗЬ АЦЕТИЛИРОВАИИЯ ГИСТОНОВ И ТОПОЛОГИИ ДНК.

Пространственная организация прокариотической ДНК регулируется ее сверхспирализацией, что поднимает вопрос, может ли изменяться in vivo сверхспирализация эукариотической ДНК, и за счет каких факторов. Здесь использовали автономно реплицирующуюся минихромосому в качестве пробы для оценки состояния клеточной ДНК В присутствии топоизомераз, изменения сверхспирализации ДНК минихромосомы будут сопровождаться изменением числа первичных витков спирали ДНК (см n.i и рис. 2), что можно измерить, поскольку топологические изомеры кольцевой ДНК, отличающиеся на i виток двойной спирали (топоизомеры), имеют разную электрофоретическую подвижность, прямо пропорциональную числу избыточных или недостающих витков (по сравнению с линейной ДНК того же размера).

Линия клеток с автономной минихромосомой была получена трансфекцией клонированного в плазмиде PBR322 раннего гена вируса бычьей папилломы в клетки мыши C127. При индукции гиперацетилирования гистонов масляной кислотой в культуре клеток in vivo (рис. 4А), уровень сверхспирализации минихромосомной ДНК увеличивался на 4-5 витков; причем распределении топоизомеров становилось более симметричным и компактным (рис. 4Б). После замены среды на среду без масляной кислоты, число сверхвитков ДНК минихромосомы и уровень ацетилирования гистонов изменялись во времени волнообразно (рис.5); транскрипция минихромосомы изменялась с тем же периодом, но с отличающейся фазой.

масляная к-та

контроль

масляная

Ы к"та

>S ii

электрофоретическая подвижность

Рис 4- Денситограммы рапределения (А) - аце-тилиро ванных форм гистонов и (Б) - топоизо-меров ДНК минихромо-сомы контрольных клеток (----) и клеток, 20 ч

обработанных масляной кислотой (—).

Рис. 5. Изменение числа сверхвитков ДНК минихромосомы и уров-0%|

ня ацетилировавия гистонов после удаления масляной кислоты, нулевое время соответствует 24 ч обработки клеток масляной кислотой.

Неэнзиматическое ацетилирова-ние гистонов в изолированных ядрах также приводило к увеличению отрицательной сверхспирализации ДНК

минихромосомы, вплоть до значений, характерных для индуцированного гп vivo гипер-ацетилирования гистонов (рис. 6). Это свидетельствует, что ацетилирование гистонов являлось непосредственной причиной изменения сверхспирализации ДНК.

Рис. 6. Денситограммы распределения то-поизомеров ДНК минихромосомы (слева) и ацетилированных форм гистонов Н4 и Н2В: (А) - контрольные изолированные ядра и (Б) - ядра обработанные 7 мМ ацетил адеиилата. Стрелками показаны положения линейной формы ДНК и центров распределения то-поизомеров.

2.2.1. КОНФОРМАЦИОННАЯ ПОДВИЖНОСТЬ ДНК И ДИНАМИКА ХРОМАТИНА.

Молекула ДНК гпособна изменять шаг двойной спирали при изменении температуры; это свойство в значительной степени утрачивается при образовании нуклеосом. Исключение составляли грапскрипционно-активные минихромосомы дрожжей, проявляющие до 70% коиформационной подвижности свободной ДНК.

7V / ,'37 4

/ií\ir ¡J 37 4 -W^

СО 1

2? о 5

о> 3

Ш1 _

S 0 10 20 30

температура релаксации

электрофоретическая подвижность

Рис. 7. Денситограммы распределения топоизомеров ДНК минихромосомы при 4 или 37°С: клетки: (АУ коптроля и (Б)- обработанные 5 мМ масляной к-ты; ядра: (В)- контроля и (Г)~ обработаяные 5 мМ ацетиладенилата. Суммарные графики: (Д) - клетки m vivo: 1 - контрольные, 2 - обработанные 5 мМ масляной к-ты; (Е) - ядра клеток в 3 - юо и 4 - 20 мМ NaCI.

Высокая конформационная свобода ДНК дрожжевого хроматина была первоначально приписана особенностям гистонов Нз дрожжей, содержащих, в отличие от высших эукариот, в позиции но остаток аланина вместо цистеина, вследствие чего нуклео-сомы дрожжей, по-видимому, не способны стабилизироваться за счет дисульфидной связи между гистонами Нз, подобно нуклеосомам высших эукариот.

Однако, здесь показано, что и ДНК транскрипционно-активной минихромосомы клеток высших эукариот может обладает весьма высокой конформационной подвижностью (рис. 7). При изменении температуры на 37 °С, изменение шага спирали ДНК достигало 6 витков, что для свободной ДНК той же длины (6,2 т.п.н.) составляет 7 витков, т.е. подвижность ДНК составляла 85% от возможной. Изолирование ядер только незначительно снижало свободу ДНК. Конформационная свобода ДНК минихромосомы существенно снижалась при индукции гиперацетилирования гистонов масляной кислотой in vivo (рис. 7А,Б) или после неэнзиматического ацетилирования гистонов в изолированных ядрах (рис. 7В,Г).

Высокая конформационная свобода ДНК вероятно, действительно обусловлена транскрипционной активностью минихромосомы, о чем свидетельствовала корреляция уровня транскрипции и конформационной подвижности минихромосомы, а также низкая экстрагируемость (не более Ю%) минихромосомной ДНК: согласно литературным данным, неэкстрагируемые минихромосомы являются транскрипционно-активными.

В литературе описана "развернутая" структура транскрибируемых нуклеосом ряда позвоночных, в которых SH-группы гистонов Нз свободны и экспонированы во-вне нук-леосомы. Это дало основания поставить вопрос, способна ли "развернутая" структура нуклеосом высших эукариот обеспечить повышенную конформационную подвижность нуклеосомной ДНК, как это, возможно, происходит в нуклеосомах дрожжей. "Развернутая" нуклеосома может представлять структуру, имеющую черты нуклеосомной организации, ДНК которой сохраняет свойства свободной ДНК.

Нуклеосомы с экспонированными SH-группами гистонов Нз изолировали сорбцией на Hg-агарозе с элюцией ю мМ меркаптоэтанола. С Hg- агарозой также связывалась популяция нуклеосом, ассоциированная с тиольными белками, элюируемая 0,5 М NaCl. Существуют и другие подходы изолирования транскрибируемых нуклеосом. При "мягком" гидролизе ядер микрококковой нуклеазой получают фракцию нуклеосом, обогащенных HMG-белками и РНК-полимеразными комплексами (Bloom & Anderson (1978) Cell 15,141-150).

Рис. 8. Нуклеосомы транскрипционно-активного хроматина. (AJS) - степень ацетилирования гистонов (трассировка гелей); (А) - хроматография на Hg-агарозе- 1-нуклеосомы, не связывающиеся с Hg-ara розой, 2,3- элюция, соответственно, 0,5м NaCl или ю мМ меркаптоэтанола; (Б) - фракционирование по Bloom Sr Anderson (1978). 1 - неактивная, 2 -активная фракция нуклеосом. (В) - анализ нуклеосом в 4% ПАА геле: 1-3 - соответствует: 13 в (А); 4 - соответствует 2 в (Б). (Г) - анализ ДНК нуклеосом в 1% геле агарозы - 2,3,4,6 соответствуют 1-4 в (В).

Обе фракции нуклеосом содержали высокоацеталированные гистоны (рис. 8А,Б) и обогащены транскрибируемыми последовательностями. Нуклеосомы с экспонированными SH-группами имели пониженную подвижность в нативном полиакриламидном геле; при этом размер ДНК "развернутых" нуклеосом не превышал размера ДНК нуклеосом других фракций (рис. 8В,Г). Повышенный размер ДНК нуклеосом, элюируемых с Hg-агарозы 0,5 M NaCl, объясняют ассоциацией с HMG-белками.

Конформационную свободу ДНК нуклеосом оценивали по способности ДНК ит-менять конформацию при изменении температуры, учитывая: i) изменение температуры на iK раскручивает спираль ДНК на 0,012° на i п.н., 2) нуклеосома защищает от кон-формационных изменений 175-180 п.н. ДНК, 3) шаг спирали ДНК кор-частицы (145 п.н.)

А Б

--- --

_ = = -нз-

-Н2В = =

----- - Н4- — 3

12 3 12

12 3 4

1 2 3 4 5 6

- ю.о п.н.; остальной ДНК - 10,4 п.н., 4) молярный дихроизм (275 нм): для ДНК с niai-ом спирали Ю п.н. - 0,1 М'см1, для ДНК с шагом спирали 10,4 п.н. (свободная ДНК) - 2,5 М 'см-1; суммарный молярный дихроизм ДНК нуклеосомы - 0,5 М 'см1 и 5) изменение температуры на 1 К сопровождается изменением КД275 на 0,012 и одгМ-'см1 для ДНК с шагом спирали 10,4 и ю п.н., соответственно.

Повышенную свободу ДНК нуклеосом можно объяснить моделями:

1. Часть ДНК (65%) утрачивает связь с гистонами. Молярный КД275 ДНК кор-частицы -о,1 М-'см1, высвободившейся ДНК - М'см1. Следует ожидать увеличения КД275 ДНК нуклеосомы (рис. 21, кривые 4,4').

2. Часть ДНК (65%) приобретает способность изменять шаг спирали при изменении температуры. Изменение амплитуды КД275 для ДНК кора - 0,12 М'см-'К"1, для остальной ДНК - 0,012 М-Чаи-'К-' (рис. 21, кривые 2,2").

3. С ростом температуры ДНК-гистоновые взаимодействия деегабилизи-руются, у части ДНК кора шаг спирали меняется с ю до 10,4 п.н., сопровождаясь 25х ростом КД 275. В этом случае, при росте температуры на юК, 8 п.н.ДНК кора должны приобретать шаг спирали 10,4 п.н. (рис. 21,3 и 3%

Иными словами, нуклеосома с высокой конформационной подвижностью ДНК должна отличаться повышенным значением КД при 275 нм. Однако конформационный потенциал всех структур оказался примерно одинаков (рис. 9).

Рис. 9. Температурная зависимость амплитуды КД275 для ДНК вуклеосом (1-4) и кор-частиц (1-41)- ij' - экспериментально полученные значения; 2-4, г'- 4' - теоретически ожидаемые значения.

Схожее ограничения свободы ДНК активных и неактивных нуклеосом предполагает, что "температурное" изменение числа витков ДНК транскрипционно-активной минихромосомы может отражать повышенную конфор-мационную подвижность "активной" нуклеосомной фибриллы, изменение параметров которой, в случае кольцевой ДНК, может фиксироваться тороизомеразами как изменение числа витков ДНК (рис. 2,3). Здесь попробовали оценить, способны ли параметры нуклеосомного соленоида меняться при изменении температуры среды.

Был разработан метод анализа фибрилл хроматина в гелях агарозы низкой плотности. Фрагменты хроматина (12-15 нуклеосом) получали гидролизом ядер печени крыс микрококковой нуклеазой, доводили до требуемой степени конденсации диализом при разных концентрациях NaCl, фиксировали глкггаровым альдегидом и анализировали в 0,3% гелях агарозы (рис. мА). Повышенная электрофоретическая подвижность хроматина, фиксированного при более высоких концентрациях NaCl, свидетельствует о ионной конденсации фибрилл хроматина.

Рис. ю. Электрофореграммы фрагментов хроматина (А) - содержащего и (В) - не содержащего гистоны Нг, на разных стадиях конденсации Хроматин фиксировали при концентрациях ЫаС1 (мМ). 1 - о; 2 - ю; 3 - '¿о, 4 - ЗО; 5 - 6о; 6 - 120. (Б) - Состав хроматина (1) - интактного и (2) -обработанного смолой Л(.50У,Х2 М ДНК фа! л X, ВдПI, размер в т п.н

Гистоны Н1 удаляли смолой АС50\У-Х2 при невысокой ионной силе (юо мМ №С1), что позволяет количественно удалять гистоны Ш, избежав диссоциации нуклеосом (рис. юБ). После удаления гистона Ш, нуклеосомная фибрилла теряет структуру упорядоченной сверхспирали и приобретает

Г 10 20 °С ТЕМПЕРАТУРА

М123456

Н1

НЗ |Н2А Н2В ' Н4

Hull

1 2345 6М

вид хаотического клубка, параметры которого лишь незначительно зависят от ионной силы. Действительно, электрофоретическая подвижность такого хроматина не зависела от ионной силы среды (рис. юВ,пВ), подтверждая, что изменения подвижности хроматина отражают его конденсацию.

Рис. и. Денситограммы распределений фрагментов хроматина при электрофорезе в 0,3% геле агарозы: (А) - интактный хроматин; (Б) - хроматин, не содержащий гистоны Н1 Хроматин фиксировали глютаровым альдегидом при концентрации №С1 в 5 мМ (/) и 6о мМ (2). Размер фрагментов указан в т.п.н. Стрелками показаны центры электрофорети-ческого распределения. Справа - относительная электрофоретическая подвижность образцов хроматина в геле агарозы в зависимости от ионной силы при фиксации.

О 10 20 30 60

№С1 [тМ]

Хорошее соответствие результатов с данными других методов, дает основание предложить этот подход как альтернативу другим методам исследования хроматина.

Динамику нуклеосомной фибриллы на разных стадиях конденсации изучали с помощью описанного подхода, с фиксацией хроматина при 4° или 240 С (рис. 12,13). Хроматин, фиксированный при 24°С имел существенно большую электрофоретическую подвижность, чем фиксированный при 4°С. Различие было более выражено для хроматина с низкой степенью конденсации. При удалении гистона Н1, подвижность хроматина не зависела от температуры. Таким образом, изменение электрофоретической подвижности при изменении температуры действительно отражает изменение степени конденсации нуклеосомной фибриллы.

10,3

_ 2,5

424 4 244_244_244_24 4_24 [°С] О 10 20 30 60 120 №С1

424 424 4_24 4_24 4_24 4_24 0 10 20 30 60 120

Рис. 12. Электрофоре-

[раммьг фрагментов хроматина на разных стадиях конденсации при 4 или 24°С Хроматин содержащий (слева) и не содержащий (справа) гистоны Н1 фиксировали глютаровым альдегидом при 4 или 24 "С при указанной конценттрации ЫаС1 (мМ). Размер маркерной ДНК указан в т.п.н.

1 2

10.1ЕМ 1 2

010 20 30 60 №С1 [тМ1

Рис. 13. Денситограммы распределения фрагментов хроматина при электрофорезе в 0,3% геле агарозы. Хроматин переводили диализом в раствор, содержащий ЫаС1 в концентрации: (Л) - 5 мМ и (Б) - 6о мМ. Фиксацию проводили: 1 - при 4°С и 2 - при 24°С. Размеры указаны в т.п.н. Стрелками показаны центры электрофоретических распределений Справа - относительная (к 2,5 т.п.н. ДНК) электрофоретическая подвижность: 1,2 - хроматин, фиксированный при 24 или 4°С, соответственно; 3 - хроматин без гистона Ш.

Таким обзом, в то время как структура активных и неактивных нуклеосом как таковая, накладывает схожие ограничения на свободу ДНК, деконденсированный нуклеосомный соленоид является достаточно подвижной структурой. Повышенную конформационную подвижность ДНК транскрипционно-активных минихромосом следует, очевидно, искать не только на уровне нуклеосомной структуры - причем скорее как результат ее перестроек белковыми факторами (см ниже), но также на уровне наднуклеосомной структуры - как результат повышенной конформационной подвижности "развернутой" нуклеосомной фибриллы, по сравнению с компактной.

2.2.2. ПЕРЕСТРОЙКИ НУКЛЕОСОМНОЙ ФИБРИЛЛЫ ПРИ АЦЕТИЛ ИРОВАН ИИ ГИСТОНОВ.

Высокие уровни ацетилирования гистонов (рис. 14А) препятствовали конденсации хроматина в растворах с высокой ионной силой. Более того, высокоацетилированный хроматин, фиксированный при высокой (120 мМ \аС1) ионной силе, имел меньшую электрофоретическую подвижность по сравнению с нормальным хроматином, фиксированным при низкой (5 мМ №С1) ионной силе. Ацетилирование гистонов не сказывалось существенно на параметрах "хаотического клубка" хроматина без гистонов Н1. Таким образом, уменьшение электрофоретической подвижности фрагментов высокоацетилированного хроматина, отражает, вероятнее всего, упорядоченное "разворачивание" наднуклеосомных структур.

гА —т 13.4 Л^И Б

Н2А1

НЗ-1|

Н2А-11 Н11

нз!

Н2В| Н4

12 34

АсАМР [мМ]

Рис. 14. (А) - Электрофореграмма (трассировка) гистонов ацетилиро-ванного хроматина. Концентрации ацетиладенилата: 1 - о, 2-5, 3-10 и 4 - 20 мМ. (Б,В) - Электрофоре-граммы ацетилированного хроматина (Б) - содержащего и (В) - не содержащего гистоны Ш, фиксированного при указанных концентрациях №С1. Также указаны концентрации ацетиладенилата в реакционной смеси. М - размер указан в т.п.н.

5 120 №С1[мМ]5 120 _

Это согласуется с данными о

высоком уровне ацетилирования гистонов активного хроматина, где с другой стороны,

отмечается несовместимость генетических процессов со структурой компактной

фибриллы хроматина.

Нить нуклеосом компактизуется за счет свивания в упорядоченную спиральную структуру диамегром 30 нм, стабилизированную I истонами Н1. При понижении ионной силы среды, 30 нм фибрилла "разворачивается" до филамента диаметром ю нм. При удалении гистонов Н1 нить нуклеосом образует неупорядоченный клубок, электрофоретическая подвижность которого существенно выше подвижности "развернутой" ю нм фибриллы (рис :цБ,В). Ацетилирование гистонов, наоборот, вызывало значительное уменьшение электрофоретической подвижности фрагментов хроматина, как и при деконденсации хроматина при низкой ионной силе. Это предполагает, что декомпактизация высокоацетилироваанной 30 нм фибриллы протекает по механизму "разворачивания" нуклеосомного соленоида в растворах с низкой ионной силой, а не по пути образования структуры типа "хаотического клубка".

При деконденсации нуклеосомного соленоида число его витков значительно возрастает (рис. 2,3,15), что должно сопровождаться возрастанием энергии сверхспирализации домена хроматина. Энергия может бьггь скомпенсирована за счет частичного высвобождения сверхвитков нуклеосом. Согласно оценкам (методика Сатепт-СЛего & Рекеп/еШ (1977) Nucleic.Acids.Res. 4, 1159-1181), избыточная энергия сверхспирализации может становиться сравнимой с энергией образования нуклеосом.

Напряжения в домене могут быть скомпенсированы топоизомеразами, но даже при кратковременном воздействии, увеличение энергии сверхспирализации может привести к дестабилизации нуклеосомной структуры. В соответствии с данной моделью,

ацетилирование гистонов, вызывая реорганизацию упаковки нуклеосомной фибриллы, тем самым обусловливает дестабилизацию и нуклеосомных структур.

Рис. 15. Представление деконден-сации 30 им фибриллы хроматина в составе топологического домена. Увеличении уровня ацетилирова-ния гистонов вызывает изменение пространственной ориентации экс-трануклеосомной ДНК и реорганизацию связей гистона Hi (А) - компактная 30 нм фибрилла (6-12 нук-леосом на виток), (Б) - разворачивается до состояния спирали с 2 и менее нуклеосомами на виток. Число витков нуклеосомного соленоида значшельно увеличивается Справа - изменение энергии сверхспирали-зации (на моль хроматосом - 200 п.н ДНК) при увеличении числа сверхвитков ДНК возникающих при "разворачивании" нуклеосомного соленоида. Возникающие напряжения (/)-концентрируются на межнуклеосомных линкерах (г)- распределяются по всей хроматосоме.

2.3. ПЕРЕСТРОЙКИ ХРОМАТИНА В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ ЭМБРИОНОВ ДРОЗОФИЛЫ.

Сборка хроматина в экстракте эмбрионов дрозофилы включает преформирование ДНК-гистоновых комплексов переносчиками гистонов (NAP-i, CAF-i), и формирование и поддержание упорядоченных нуклеосомных массивов "ремоделирующими" активностями (ACF, CHRAC), использующими энергию АТР. Здесь показано, что при удалении АТР, массивы нуклеосом могут подвергаться перестройке неизвестными ранее дестабилизирующими факторами, воздействие которых уже не скомпенсировано АТР-зависимыми системами поддержания структуры хроматина.

Хроматин собирали из кольцевой плазмидной ДНК и гистонов клеток CVi; степень реконструкции контролировали измепяя количество гистонов (обычно 2:1). По завершении реконструкции, АТР удаляли апиразой (АТР/АДР-фосфатаза) или гель-фильтрацией на сефакриле S-300; в последнем случае перестройку хроматина инициировали добавлением диализованного экстракта эмбрионов дрозофилы.

Перестройка хроматина приводила к диффузному профилю гидролиза микрококковой нуклеазой (рис. 16,17). Эта нуклеаза расщепляет преимущественно межнуклеосомную ДНК, поэтому частичный гидролиз регулярных массивов нуклеосом приводит к дискретной "лесенке" одигонуклеосомных фрагментов ДНК Диффузность профиля указывает на нарушение упорядоченности нуклеосомных массивов.

Рис. 16 Хроматин реконструировали в стандартных условиях, после чего АТР удаляли обработкой апиразой Слева -анализ хроматина с помощью микрококковой нуклеазы (2-4 и 6-8 - три увеличивающиеся концентрации

нуклеазы). 1, 5, 9 - мультимеры Х23 п.н ДНК Справа - анализ с помощью ДНКазы I (1-3, 4-6, 7-9, ю-12 - три увеличивающиеся концентрации

нуклеазы) JI - линейная, РФ релаксированная и Св сверхспиральная формы плачмиднои ДНК

Структурная перестройка приводила к высокой чувствительности хроматина к гидролизу ДНКазой I (рис. 16, 17); что является характерным свойством активного хроматина: Эффект был более выражен при менее плотно упакованных массивах нуклеосом. Примечательно, что в то время как чувствительность хроматина к ДНКзе I

123456789 123456789101112

возрастала, чувствительность к микрококковой нуклеазе уменьшалась. Прогретый при 70°С экстракт не изменял чувствительность хроматина к ДНКазе I, что означает ни РНК, ни нуклеоплазмин не участвуют в описываемой перестройке хроматина. Удаление АТР не вызывало нарушение целостности гистонов, таким образом перестройка хроматина

Рис. 17. Хроматин реконструировали в стандартных условиях, после чего очищали центрифугированием на колонке с сефакрилом S-300, инкубировали 30 мин в присутствии экстракта эмбрионов дрозофилы и анализировали с помощью микококковой нуклеазы (слева) или ДНКазы I (справа). (Л) - линейная, (РФ) - релаксированная и (Св) - сверхспиральная формы плазмидной ДНК.

Очевидно, удаление АТР лишает источника энергии систему поддержания регулярной структуры хроматина. Добавление АТР, но не его негидроли-зуемых аналогов, уменьшало индуцируемую чувствительность хроматина к ДНКазе I (рис. 18). Так, именно гидролиз АТР необходим для обращения перестройки хроматина.

Рис. 18. Анализ структуры хроматина с помощью ДНКазы I присутствии или отсутствие i мМ АТР или его негидроли^емых аналогов (ИМБ-2/5) Реконструированный хроматин очищали с помощью центрифугирования на колонке с сефакрилом S 300, инкубировали 30 мин в присутствии экстракта эмбрионов дрозофилы и анализировали с помощью ДНКазы I. (Л) - линейная, (РФ) -релаксированная и (Св) - сверхспиральная формы плазмидной ДНК.

В отличие от известных ранее модуляторов структуры хроматина, обнаруженная активность не требовала энергии АТР, но скорее основывалась на разнице энтроний начального и конечного состояния нуклео-сомной частицы. Для протекания молекулярной перестройки не требовалось дополнительного взаимодействия нуклеосом с факторами транскрипции. Перестройка не ограничивалась локальными участками, но затрагивала протяженные массивы нуклеосом.

Увеличение чувствительности хроматина к ДНКазе I, наиболее вероятно, свидетельствует о дестабилизации ДНК-гистоновых взаимодействий. Более объемная, "диффузная" структура нуклеосомной частицы может защищать линкерную ДНК, обусловливая пониженную чувствительность хроматина к микрококковой нуклеазе и эндонуклеа-зам рестрикции, расщепляющих преимущественно межнуклеосомную ДНК. В тесно реконструированных массивах нуклеосом, перестройка нуклеосом может быть лимитирована пространственными ограничениями со стороны соседних нуклеосом, что объясняет зависимость структурной перестройки от количества реконструированных нуклеосом. Нельзя исключить и пониженную доступность плотно упакованных нуклеоеомных массивов для факторов перестройки хроматина.

Влияние структурной перестройки на транскрипционный потенциал хроматина исследовали с помощью транскрипции in vitro в экстракте ядер эмбрионов дрозофилы, выявляя РНК-транскрипты реакцией "наращивания" отожженного праймера (primer extension). В случае праймеров, соответствующих участкам ДНК на 90, 220 и 440 п. н. "ниже" точки инициации, транскрипция хроматина после перестройки составляла, соответственно, о 3-0.5,1.5-2 и 2-3 от контроля (рис 19А). Это свидетельствует, что структурная перестройка хроматина имеет более выраженный положи гельный эффект на элонгацию, чем на инициацию транскрипции

не являлась следствием деградации гистонов.

Рис. 19. Эффект структурной перестройки на транскрипционный потенциал (А) и "динамичность" хроматина (Б). Реконструированный хроматин очищали гель-фильтрацией и 30 мин инкубировали в присутствии экстракта эмбрионов дрозофилы, после чего проводили: (А) -реакцию транскрипции, длительность 7-15 мин, ДНК - свободная ДНК (контроль), или (Б) -гидролиз эндонуклеазой Hincll в присутствии 1 мМ АТР. (Л) - линейная, (Св) - сверхспиральная формы плазмидной ДНК; (Фр) - фрагмент расщепления Яте II.

праймер Б -экстракт хроматин матрица АТР.

- | + экстракт

эндоген РНК I - транскрипт

)п.н.

хроматин

+220 п.н.

хроматин

+440 п.н.

НК

+ экстракт

ДТР

АТР-завиеимые "ремоделирующие" активности экстракта существенно увеличивают мобильность нуклеосом реконструированного хроматина, и, как следствие, доступность нуклеосомной ДНК для нуклеаз рестрикции (рис 19Б). Использовали повышенные концентрации Hinс И при сокращенном времени рестрикции. Структурная перестройка уменьшала доступность хроматина для рестриктаз в целом, при этом АТР-зависимая активация рестрикции становилась более выражена (i,5-2x vs 1,о-1,зх).

Перестройка реконструированного хроматина при удалении АТР с помощью апиразы (рис. 20) или гель-фильтрации (рис. 21) приводила и к значительному увеличению уровня сверхспирализации и повышению конформационной подвижности нуклеосомной ДНК - до 90% от подвижности свободной ДНК (пп.2.1 и 2.2.1) В зависимости от плотности расположения нуклеосом, разница числа витков ДНК контрольного хроматина, релаксиро ванного при 5 и 35°С, составляла 1.5-2.5 витка; для "перестроенного" хроматина соответствующая разница составляла 4-6 витков.

1.25:1 ll.75.li 2.5:1 0

- + г: и - | +

I I

—

— — —

А * HII Mill

1.5:1

- - - + + + М

к 5 ЗЙ к 5 35

гисганы.ДНК

апираза температура

I ДНК I

I 2:1 I I

I- I - I -l + l +| +1M

III III 1 lit III ilia 1

mi r =

[■^уууМЛ/ШДЛАД.

L^c/ШШм._

1 .ладА/Wtyyi ,

\ vi

12 3 4 5 6

!________________jMhh.

1 2 3 4 5 6 М

Я1

^М

_2 2

3 3

L—^A/OU . . 5 5

L_____...^iMV^. 6 б

ШШи

I л/Гл л,

лйь

лит

L__jlMJL.

Рис. 20. Изменения топологии (А) и конформационной подвижности (БД) ДНК при перестройке хроматина. После сборки хроматина, АТР удаляли обработкой апиразой. (А) - ДНК изолировали и анализировали в геле агарозы, содержащем 5 мкМ дифосфата хлороквина. Приведены денситограммы треков геля. (Б,В) - К - хроматин, непосредственно после обработки апиразой; 5 и 35- хроматин после релаксации топоизомеразой при 5 или 35°С. На вставке показана конфор-мационная подвижность свободной ДНК в аналогичных условиях. М - ДНК илазмиды (6150 п.н.), используемая при реконструкции, сверхспирализации соответствует 30-31 нуклеосоме.

ДНК совершает 1,7 отрицательных сверхвитка вокруг нуклеосомного кора, при этом нуклеосома вносит только 1 отрицательный виток в кольцевую ДНК, что обьясняют компенсацией за счет "перекручивания" двойной спирали при взаимодействии с гисто-иовой глобулой. Увеличение уровня сверхспирализации ДНК при перестройке хроматина может свидетельствовать об уменьшении такой компенсации, а следовательно, о дестабилизации ДНК-гистоновых взаимодействии. На дестабилизацию нуклеосомной структуры указывает и значительное увеличение конформационной подвижности ДНК (см п. 2.2.1).

Рис. 21 Конформационная подвижность ДНК при обработке изолированного хроматина экстрактом эмбрионов дрозофилы. Реконструированный хроматин очищали гель-центрифугированием на колонке с оефакрилом S-300 и инкубировали 30 мин в присутствии диа-лизованного экстракта и 1 мМ АТР Далее анализировали кон-формационную подвижность ДНК хроматина -см рис. аоБ,В.

Гистоны Н1 стабилизируют нуклеосомы в участках входа-выхода линкерной ДНК и обусловливают упаковку нуклеосомной фибриллы в структуры высших порядков. Включении гистонов Н1 при реконструкции вызывало увеличение межнуклеосомного расстояния до 200-210 п.н. (рис. 22), но на эффективность перестройки хроматина заметным образом не влияло.

Рис. 22. Структурные перестройки хроматина содержащего гистоны Н1. Хроматин реконструировали в присутствии гистонов III, очищали гель-фильтрацией на колонке с се-факрилом Я-зоо и обрабатывали экстрактом эмбрионов дрозофилы. (А) - анализ с помощью микрококковой нуклеазы. (Б) - анализ конформационной подвижности хроматина. Условия и обозначения см рис. 2оБ,В и рис. 21.

Высокоацетилированный хроматин реконструировали используя гиперацетилированные изоформы гистонов, индуцируемые при обработке клеток СУ 1 ингибитором деацетилаз трикостатином А (рис. 23А). Экстракт иостбластодерм-ных эмбрионов содержит сравнительно немного эндогенных гистонов и при дополнительной очистке от гистонов, сборка хроматина практически полностью зависит от добавленных извне гистонов (рис. 23Б). Анализ массивов нуклеосом с помощью микрококковой нуклеазы не выявил заметных различий между контрольным и гипер-ацетилированным хроматином, реконструированном при разной ионной силе (рис. 23Б), подтверждая, что ацетилирование гистонов как таковое, лишь незначительно влияет на структуру нуклеосом.

Ранее было предположение, что ацетилирование гистонов влияет на конформа-цию хроматина модулируя его взаимодействие с гистонами Ш: считалось, что гистоны Н1 способны связываться с нормальным, но не гиперацетилированным хроматином. Добавление гистонов Нг при реконструкции хроматина приводило к увеличению межнуклеосомного расстояния и длины последовательностей нуклеосом (рис. 24). Таким образом, гиперацетилирование гистонов не только не препятствовало, но способствовало образованию упорядоченных массивов нуклеосом.

экстракт

АТР

+ экстракт

АТР I - АТР I + АТР

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

лШАЕ

olOjj

■шш.

JLjffiZ

...... „.ШЛ>.

jiliL

аШ

1 2

6 7

1Шк9 10 .11 .12

Шк.

гистоны

КС1 ДЩ

Рис. 23. (А) - кинетика ацетилировдния гистонов в клетках СУ1, обработанных трикостатином А: электрофореграммы гистонов Н4 и Н2В. (Б,В) - хроматин реконструировали при указанных концентрациях КС1 (мМ), используя нормальные (к) и гиперацетилированные (ац.) гистоны. (Б) электрофореграммы (трассировка) гистонов, ре-экстрагированных из реконструированного хроматина, (В) анализ хроматина с помощью микрококковой, нуклеазы (гидролиз 0,5 и 1 мин). Маркер массы ДНК- мультимеры 123 п.н. ДНК.

. I,

. .«».. .» ,

Рис. 24. Влияние гистонов Н1 на сборку высокоацетилированного хроматина. Хроматин реконструи-[ММ ровали используя нормальные (контр.) и гиперацетилированные (ацетил.) гистоны клеток СТ1. (А) - реконструкция в присутствии или отсутствие стехиометрических количеств гистонов Н1. (Б) - реконструкция в присутствии стехиометрических количеств гистонов Н1 при указанной концентрации КС1. Хроматин анализировали с помощью микрококковой нуклеазы.

В случае высокоацетилированного хроматина структурная перестройка протекала более эффективно и при значительно более плотном расположении массивов нуклео-сом, чем в случае нормального хроматина. Так, при 8о% заполнении ДНК нуклео-сомами, в гиперацетилированном хроматине высвобождалось 2-3 сверхвитка ДНК, в то время как в нормальном хроматине сверхспирализация ДНК не менялась (рис. 25А).

К -апираза +апираза |кoнтpJ ацет. М контр.ГацётТ

и^иьаиикаиш

1А

АЖ

2А

цмк

ЗА.

Мк

1к

4А

Рис. 25. Изменения топологии (А) и кон-формационной подвижности (Б) ДНК высокоацетилированного (ацет.) и контрольного (контр ) хроматина при удалении АТР из бесклеточной системы эмбрионов дрозофилы. (А) - реконструированный хроматин инкубировали 30 мин в присутствии апиразы (ап.). (Б) - после обработки апиразой, хроматин делили на 2 части, одну из которых релаксировали хо-поизомеразой I при 5°С, другую - при 35°С. ДНК анализировали в геле агарозы, содержащем 5 мкМ дифосфата хлороквина Приведены денситограммы геля. М -см рис.20.

Высокоацетилированньгй хроматин легче приобретал и повышенную конформа-ционную подвижность ДНК, чем равноценно реконструированный немодифицирован-ный хроматин. Так, при 8о% заполнении ДНК нуклеосомами, в случае нормального хроматина, релаксированного при 5 и 35°С, число витков ДНК различалось на 1. В ги-перацетилированном хроматине, эта разница составляла 2 витка в интактном хроматине, и 4 витка в хроматине, обработанном апиразой (рис. 25Б).

При оценке числа реконструированных нуклеосом предполагалось, что одна "не-модифицированная" нуклеосома вносит один сверхвиток в ДНК. По литературным данным, высокоацетилированная нуклеосома вносит такое же (Norton et al (1989) Cell 57,449457), или меньшее (Krajewski & Becker (1998) PNAS 95,1540-1545) количество сверхвитков, т.е. при равной сверхспирализации ДНК, гиперацетилированный хроматин содержит равное или большее количество нуклеосом, чем "немодифицированный". Это означает, что эффект ацетилирования гистонов скорее преуменьшен, чем преувеличен.

Инкубация нормального хроматина в отсутствие экстракта эмбрионов дрозофилы не вызывало существенных изменений характеристик хроматина - резкое возрастание конформационной подвижности ДНК и чувствительности к ДНКзе I происходило только в присутствии экстракта (рис. 26). В высокоацетилированном же хроматине, уже после 1 ч инкубации в отсутствие экстракта, чувствительность к ДНКзе I и подвижность ДНК возрастали до значений, наблюдаемых при добавлении экстракта. Высокоацетилиро-ванный хроматин, даже после фильтрации на крупнопористом носителе, ассоциирован с факторами перестройки хроматина, что свидетельствует о его повышенном сродстве к этим факторам.

Рис. гб. Нормальный (контр ) и высокоацетилированный (ацет) хроматин реконструировали до 50% заполнения ДНК нуклеосомами и очищали гель-фильтрацией (Л,Я): к - хроматин после гель-фильтрации; 1ч и 1ч+экст. -хроматин после 1 ч инкубации в отсутствие или присутствии диализованного экстракта эмбрионов дрозофилы: (А) - анализ конформационной подвижности хроматина - см рис. 20,21 и (Б) - анализ хроматина с помощью ДНКазы I. (В) - анализ хроматина с помощью Hinc II в присутствии 1 мМ ATP . Л - линейная, Рф - релаксированная, Св - сверхспиральная формы плазмидной ДНК, Фр - рестриктный фрагмент.

Структурная перестройка как нормального, так и гиперацетилированного хроматина сиижала его доступность для нуклеаз рестрикции (рис 26В). При этом АТР-зависимая активация рестрикции была более выражена для высокоацетилированного хроматина, означая что такой хроматин обладает более динамичной структурой.

Высокоацетилированный хроматин во многих случаях отличался более диффузной структурой непосредственно после 5-6 ч реконструкции в бесклеточной системе дрозофилы, т.е. в уже бесклеточной системе эмбрионов существует баланс между АТР- зави-

симыми и независимыми системами перестроек хроматина, способный обусловить более диффузную структуру высокоацетилированного хроматина. Гиперацетилирование гис-тонов может вызывать исходную реорганизацию ДНК-белковых взаимодействий, способствующую перестройке нуклеосом белковыми факторами, и/ или эффективность перестроек гиперацетилированного хроматина обусловливается высоким сродством факторов перестройки к ацетилированным гистонам.

Изолированные "природные" нуклеосомы также могли подвергаться структурной перестройке компонентами экстракта эмбрионов дрозофилы, что приводило к гиперчувствительности нуклеосом к ДНКазе I (рис 27). В этом случае перестройка инициировалась при дефосфоригафомнии белковых компонент экстракта. Таким образом, регуляция перестроек хроматина может включать белковое фосфорилирование. контроль ^ + фоссратаза

— — - - Рис 27. Структурная перестройка

изолированных мононуклеосом в присутствии экстракта эмбрионов дрозофилы и кислой /щелочной фосфатазы (то же при отдельном предварительном дефосформировании экстракта).

2.4 ВЛИЯНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК И АЦЕТИЛИРО В А Н И Я ГИСТОНОВ НА

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОСОМ В »ДИНАМИЧЕСКОМ» ХРОМАТИНЕ.

Хроматин, реконструированный в экстракте эмбрионов дрозофилы (см п. 2.3), ассоциирован с активностями, придающими ему повышенную динамичность. Здесь сравняли доступность различных нуклеотидных последовательностей в "статичном" и "динамичном" хроматине.

Хроматин реконструировали на 6,2 т.п.н. плазмиде , содержащей 2 участка узнавания Яше II (GTTAAC и GTCGAC) и 4 участка Dral (ТТТААА). Количество нуклеосом оценивали по уровню сверхспирализации ДНК. Доступность рестриктных последовательностей Dral и ffinc II оценивали по эффективности их гидролиза. Взаимодействие ДНК с октамерами гистонов предотвращает доступ нуютеаз к участкам узнавания. АТР-зависимые осциляторные движения нуклеосом вызывают периодическое "открывание" защищенных последовательностей ДНК, повышая уровень расщепления ДНК.

Реконструированный хроматин очищали гель-фильтрацией, удаляя АТР и большую часть белков экстракта. В отсутствие АТР, расщепление ДНК было подавлено для обоих рестриктаз (рис 28, табл. l). Добавление АТР приводило к увеличению степени расщепления ДНК Эффект бьи различен для Hindi и Dral, и зависел от количества реконструированы»: нуклеосом. Так, для плазмиды с 21-22 нуклеосомами, расщепление 5 ед Яг'псП увеличивало долю линейной формы плазмиды до 50-60 %, в то время как гидролиз Dral приводил к практически полному расщеплению плазмиды. Различие в уровне расщепления наиболее вероятно возникает вследствие различной эффективности АТР-зависимого "открывания" последовательностей ДНК, поскольку в отсутствие АТР (рис. 28 Б) и в случае свободной плазмиды (рис. 28В) расщепление Dra I было не более эффективно, чем Hindi.

Hinell + + -Dral - - + ATP - + -

□ ffinc II - ATP ■ Hinc II + ATP О Dra I - ATP • Dra I + ATP

10 20 30 1 3 10 20

количество нуклеазы рестрикции (ед) Рис 28. Влияние последовательности ДНК на перегруппировки нуклеосом. (А) - хроматин, очищенный гель-фильтрацией, расщепляли 5 ед. Hinc II или Dra I в присутствии i мМ АТР (минимальный фрагмент гидролиза Dral не показан). (Б,В) - Суммарные графики результатов.

При высоких уровнях "хроматинизации" ДНК, различие в степени щдрочиза между ТУгаХ and Hindi было менее выражено, вероятно вследствии сгерических ограничений подвижности нуклеосом, а также ограниченной доступности ремоделирующих комплексов в плотно упакованные массивы нуклеосом.

Высокоацетилированный хроматин реконструировали как описано п. 2.3 (см рис 23). Ацетилирование гистонов значительно активировало АТР-зависимую перегруппировку нуклеосом (рис. 29; табл. 1): эффект был более заметен при повышенном уровне реконструкции - до 27-30 нуклеосом на 6200 п.н. ДНК. Стимуляция была более выражена для последовательности ТТТААА, чем для вырожденной последовательности GT(T:C)(A:G)AC. В отсутствие АТР, расщепление гиперацетилированного хроматина нуклеазой Dral происходило с той же эффективностью, что и Hindi, свидетельствуя, что повышенный гидролиз Dral гиперацетилированного хроматина не обусловлен сродством этой нуклеазы к высокоацетилированым нуклеосомам.

контр. + + - -ацетил. - - + + АТР - + - +

Hinc II

Oral

норм, гистоны

□ Hinc II - АТР ■ Hindi + АТР О Dral - АТР • Dral + АТР

ацетил.гистоны Д Hinc II - АТР A Hinc II + АТР О Dral -АТР ♦Dra I + АТР

13 10 20

количество нуклеазы рестрикции (ед) Рис 29. Влияние последовательности ДНК и ацетилирования гистонов на перегруппировки нуклеосом (А) - хроматин, очищенный гель-фильтрацией, расщепляли 5 ед. Hindi или Dral в присутствии i мМ АТР (минимальный фрагмент Dral не показан). (Б) Суммарный график.

Включение конкурентных олигонуклеотидов, соответствующих сайтам рестрикции, не уменьшало егимуляторных эффектов ацетилирования на перегруппировки нуклеосом, предполагая, что стимуляция не является результатом связывания специфичных белков. Электрофоретический анализ не выявил отличий стехиометрии гистонов нормального и ацетилированного хроматина как в отсутствие или присутствии АТР, т.е. различия доступности нормального и ацетилированного хроматина являлись результатом перегруппировок нуклеосом, но не диссоциации гистонов.

Таблица 1. Влияние последовательности ДНК и уровня ацетилирования гистонов на А'ГР-зависимые перегруппировки нуклеосом.

гистоны нормальные высокоацетилированные Число нуклеосом 20-22 27-29 27-29 АТР+/-_:_+_-_+_-_+

Я/исП

кол-во [ед.]/ время [час] 30/1 30/1 10/0.5 10/0.5 10/0.5 10/0.5

разрывов на плазмиду 0 0.65-0.8 0 0 0 0.25-0.3

разрывов на сайт рестр. 0 0.33-0.4 0 0 0 0.12-0.15

Рга\

кол-во [ед.]/ время [час] 30/1 30/1 10/0.5 10/0.5 10/0.5 10/0.5

разрывов на плазмиду 0 3.6-4.0 0 0.13-0.2 0 3.6-4.0

разрывов на сайт рестр. 0 0.9-1.0 0 0.03-0.05 0 0.9-1.0

Последовательности ДНК с различной геометрией обладают различной способностью формировать нуклеосомные структуры. Чередующиеся олигопуриновые -пирими-диновые участки длиной в несколько нуклеотидов вызывают искривления оси спирали ДНК, и должны в большей или меньшей степени способствовать нуклеосомной организации. Так, тринуклеотид ААА/ТТТ искажает ДНК-гистоновые взаимодействия и обычно исключается из нуклеосомного кора (Drew & Travers (1985) J.Mol.Bio!. 186, 773790). Чем более энергетически невыгодным является образование нуклеосомы на какой-либо последовательности ДНК, тем более эффективно октамер гистонов будет "соскальзывать" ("slide") с этой последовательности. Таким образом, "механические" свойства спирали ДНК, задаваемые нуклеотидной последовательностью, могут определять расположение нуклеосом вдоль нити ДНК. Выигрыш энергии может быть недостаточен для перегруппировки "статичных" нуклеосом, однако инициация мобильности нуклеосом может сместить равновесное распределение нуклеосом вплоть до полного открывания таких последовательностей ДНК. Здесь показано, что даже сравнительно короткие последовательности с отличной геометрией вызывали АТР-зависимые передислокации нуклеосом, в то время как в отсутствие АТР, "фазирующее" влияние этих последовательностей практически не проявлялось. Наиболее вероятно этот эффект объясняется повышенной "ненаправленной" подвижностью "динамических" нуклеосом, способствующей преодолению энтропийного барьера и, таким образом, способствующей выбору нуклеосомами наиболее энергетически выгодных положений на ДНК. АТР-зависимые перегруппировки нуклеосом значительно стимулировались ацетилированием гистонов; причем ацетилирование гистонов и последовательность ДНК имели скорее кооперативный, нежели аддитивный, эффект. Не ясно, насколько перегруппировки нуклеосом осуществляются отдельным фактором или набором ремоделирующих комплексов, однако подобная система распределения нуклеосом может лежать в основе механизма регуляции доступности хроматина in vivo.

2.5. ВЛИЯНИЕ НЕКАНОНИЧЕСКИХ СТРУКТУР ДНК НА ПЕРЕСТРОЙКИ ХРОМАТИНА И

ЭКСПРЕССИЮ ХИМЕРНОГО ГЕНА IN VIVO.

Короткие блоки последовательностей чередующихся пурино-пиримидиновых нуклеотидов часто встречаются в геноме эукариот. При напряжениях в двойной спирали ДНК, эти последовательности способны образовывать структурные изомеры, наиболее изученными из которых являются фрагменты левоспиральной ДНК и "крестообразные" структуры. Здесь попытались определить, способны ли подобные "нестандартные" структуры оказывать какой-либо эффект на транскрипцию in vivo, будучи помещенными в регуляторные области эукариотических генов.

В качестве маркерного гена использовали ген бактериальной хлорамфеникол-аце-тилтрансферазы, соединенной с химерным промотором, содержащим "ТАТА"-блок вируса саркомы Рауса и два участка связывания активатерного белка BSAP-CREB (рис. 30), который был сконструирован посредством соединения каталитической субъединицы фактора CREB с участком ДНК-связывания белка BSAP. Связывание двух мономеров BSAP-CREB необходимо для эффективной активации химерного промотора (см п.2.5.1). Ацетилирование хлорамфеникола оценивали с помощью ТС хроматографии.

« j в jasAPtiSsAPl CCTCGAGGAGCT —.-TTÂTÂT- 12/0 S

Q § § § S S 5 Ш^рЦвё^ CCQCGCGGAGCT—-HÂTA! 12/6

л ем JísapUbsÁpI cgcgcgcgagct-~.-T¡ataT- 12/8

ф^РФ JfóAPrfBSÁplCTCGGACTCGAGAAGTAGAGCTTATAV 22/0 # ф § fi^PtiesÁpl CTTCGca;sass6iasAAGAGCT^-[^} 22/12

AAA _ _ _ filSAPHBSAPl CTCGCGCGCGCGCGCGAGAGCT«"! TATA !■ 22/14_ ^

WWW Щ W * W -I aSAPH BSAP i- CCGCCCGCGCGCGCGCGGAGCT^ TATA t 22/1fi^ I 100

Рис. зо. Активность хлорамфеникол-ацетилтрансферазы в экстрактах клеток JEG3, трансфи-цированных соответствующими промоторными конструкциями совместно с плазмидой, экс-прессирующей активатор BSAP-CREB. Экстракты приготовляли через 48 ч после трансфекции клеток. Черные участки диаграмм показывают уровень активности хлорамфеникол-ацетил-трансферазы в клетках, трансфицированных только промоторной конструкцией. Обозначение конструкций: L/N: где L - полная длина инсерции (п.н.), N - длина олигомеров (CG) (п.н.)

активность I хлорамфениюл j ацвштрансфераэы (%)

В экстрактах клетках, трансфицированных промоторной конструкцией, содержащей блок (С<3) длиной 12-16 п.н., активность хлорамфеникол-ацетилтрансферазы была в 50-70 раз выше, чем при трансфекции конструкцией с инсерцией "случайной" последовательности (рис. 30Б). Инсерции блоков (СС) длиной до 8 п.н. па активность промотора не влияли. Промоторные конструкции, содержащие блок СС длиной 12-16 п.н., индуцировали значительный уровень хлорамфеникол-ацетилтрансферазы также в отсутствие активатора В8АР-СЯЕВ.

Эффективность связывание активатора с промотором при "торможении в геле" была одинаковой для конструкций с инсерциями "случайной" последовательности или 14 п.н. блока Св (рис. 31). Схожее формирование двух нуклеопротеиновых комплексов соответствовало наличию двух участков связывания ВвАР-СЯЕВ. Сверхспиральные формы плазмид 22/14 и 22/0 не отличались по способности конкурировать за связывание ВвАР-СКЕВ, что свидетельствует об отсутствии различий, связанных с напряжениями в ДНК. Не было выявлено и дополнительных комплексов с Св-специфичными белками. Таким образом, наличие блока СС-нуклеотидов не влияло на связывание промотора с активатором ВвАР-СЯЕВ.

экстракт £ ^ комплекс I

^ комплекс II

„ай

сверхспиральная форма конструкта L/N

(конкурент)

------<

22/0

22/14

олигонукл проба

комплекс

i олигонукл

" проба

22/0

22/14

Рис. 31. Связывания активатора ВвАР-СЯЕВ с химерным промотором. Взаимодействие в присутствии экстракта клеток ЛЕСз трансфицированных плазмидой, кодирующей ВвАР-СЯЕВ. Комплексы анализировали в 5% ПААГ (А) - "торможение в геле" фрагментов промотора плазмид рВ8о:22/о и рВЯо:22/14. (Б) - связывание активатора в присутствии конкурента - сверхспиральных плазмид рВЭо:22/о и рВЭоггг/14.

Последовательности чередующихся ССг-нуклеотидов способны приобретать лево-спиральную, крестообразную или изогнутую структуры в ответ на напряжения в ДНК. Такие изоформы ДНК могут изменять ориентацию элементов промотора по отношению к оси двойной спирали, влияя на взаимодействия связанных с ДНК белков, что, в свою очередь, должно влиять на транскрипции. В плазмиде рВ8о:12/о участок связывания белка ВвАР-СЯЕВ и "ТАТА"-блок разделены целым числом витков ДНК и находятся па одной стороне двойной спирали. Добавление дополнительных 0,5 и 1,5 витка спирали (рВ$5:12/о и рВ85:22/о) снижало активность промотора более чем в 4 раза, тогда как разделение этих участков на 1 виток спирали (рВво'.гг/о) не сказывалось на активности промотора (рис. 32А). Добавление 0.5 витка двойной спирали в район промотора плазмид рВ8о:22/К приводило к существенному снижению активности этих плазмид, при ^ ^ ^ ,{з этом сохранялись относительные различия активности плазмидам

лтщ;w*

♦♦♦♦

"Г

активность хлорамфеникол ацетилтрансфеоазы (%)

(рис. 32Б).

Рис. за. Стерические условия активации промотора фактором BSAP-CREB. (А) - влияние расстояния между участком связывания BSAP-CREB и "TATA" блоком на активность промотора. (Б) -Влияние "обращенной" ориентации активатора (инсерция в 5 п.н.) на активность промотора в плазмидах pBSo:22/N и pBS5:22/N. Черные участки диаграмм - активность хлорамфе-иикол-ацетилтрансферазы при трансфекции только промоторной конструкцией.

Это подтверждает, что гиперактивность плазмид, содержащих СС-блок длиной 12-16 п.н., не является следствием более благоприятного взаимного расположения белковых факторов на поверхности спирали ДНК, в каковом случае наличие СО-тракта должно подавлять транскрипцию при инвертировании фазы участков связывания этих белков.

Профиль нуклеазного расщепления промоторной области, выявленный с помощью -гибридизации (рис. 33), свидетельствует, что содержание нуклеосом в области связывания активатора ВвАР-СЯЕВ в случае плазмид содержащих 14 п.н. СС-блок, было в 5-7 раз меньше, чем в случае плазмид, содержащих инсерцию случайной последовательности.

Рис. 33. (А) - анализ хроматина в области химерного промотора с помощью микрококковой нуклеа-зы (гидролиз до мономерных нуклеосом). Результаты "точковой" гибридизации ДНК расщепленного хроматина. Проба соответствует участку связывания белка ВвАР-СЯЕВ. (Б,В) - сборка транскрипционного комплекса в присутствии фрагмента левоспираль-ной ДНК (г-ДНК). (Б) - нуклеосомная частица в области промотора препятствует связыванию активатора. (В) - образование 2гДНК вызывает вытеснение

_ нуклеосомы из области промотора, свободный дос-

/Зтата} туп белков инициирует сборку транскрипционного

22/0

22/12

22/14

22/16

комплекса.

Ранее идентифицированы три элемента, необходимых для транскрипции in vivo: 1) "ТАТА"-блок в сайте инициации, 2) активирующие последовательности юо п.н. "выше" блока "TATA" и 3) энхансер, действующий независимо от ориентации и расстояния. Их молекулярные механизмы объединяют в две группы: i) модулирование перестроек хроматина для формирования "доступных" регуляторных областей и 2) формирование самих транскрипционных комплексов на ДНК. В этом связи интересны "длинные концевые повторы" (LTR, "long terminal repeats") ретровирусов птиц, являющиеся сильными промоторами при введении в эукариотические клетки. Так, в LTR вируса саркомы Рауса, промотор и энхансер располагаются в 200 п.н. области выше сайта инициации транскрипции (рис. 36Б). Удаление этих элементов приводит к потере транскрипционной активности LTR. однако, если недостающие элементы энхан-сера и промотора заменяли фрагментом ДНК "нестандартной" структуры, активность LTR восстановливалась (рис. 34).

Плазмиды pZ+ и pZ- (рис. 34А) - производные pRSVAECAT, модифицированной (см выше), содержащей последовательность хлорамфеникол-ацетшгтрансферазы, соединенную с участком инициации транскрипции вируса саркомы Рауса (51 пн s'-фланки-рующей и 39 п.н. транскрибируемой последовательностей). Плазмида pZ- включала 14 п.н. вставку "случайной" последовательности, pZ+ содержала вставку из у чередующихся CG-nap. При трансфекции в клетки, плазмида pZ+ индуцировала в 50-100 раз больший уровень активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, чем pZ- (рис. 34Б).

Б Pz" Pz+

1 pZ- :5'-cggactcgagaagt-3' J pZ+ : 5' -cgcgcgcgcgcgcg-3' Щ

MO ---

•учхзтсаооосгсасгоссс catrctcgoogt ootcacocctcaotoccc олост-MWXt-t-

Рис. 34. (А)- структура клонов области контроля транскрипции 1ЛИ вируса саркомы Рауса (Б)-Активность (%) хлорамфеникол ацетилтрансферазы ЛЕвз клетках, трансфицированных р2- и р2.+ плазмидами; активность определяли через 48 ч после введения плазмидной ДНК.

Ситуацию моделировали in vitro в сопряженной системе сборки нуклеосом транскрипции в экстрактах ядер клеток HeLa (рис. 35).

д релакс. сверхсп. 5 сверхсп._____релакс.

pZ* pZ" pZ+ pZ" гибридиз. проба

Щ) Щ) ^ специфическая

flb ЩЬ/ плазмида

^^ ^^ ^^ целиком

pz+ pz- pz+ pz- : pz+ pz- pz+ pz-

пре-сборка нуклеосом (+I-)

эфективность гибридизации (%) эффективность транскрипции (%)

Рис. 35. Нуклеосомы реконструировали диализом на сверхспиральных и релаксированных плаз-мидах pZ+ и pZ-. (А)- анализ хроматина с помощью микрококковой нуклеазы (гидролиз до моно-нуклеосом). Защищенные нуклеосомами фрагменты выявляли "дот-гибридизацией" с пробой, соответствующей району инициации транскрипции или плазмиде целиком. (Б)- репрессия транскрипции при сборке нуклеосом в области инициации транскрипции. РНК разделяли в 896 ПААГ и выявляли гибридизацией с ДНК гена хлорамфениксш-ацетилтрансферазы.

Степень реконструкции нуклеосом выдерживали низкой, чтобы избежать значительного снижения сверхспирализации плазмид за счет "титрования" отрицательных сверхвитков нуклеосомами. В то время как в сверхспиральной плазмиде pZ- область инициации транскрипции была ассоциирована с нуклеосомами, в сверхспиралыюй плазмиде pZ+ содержание нуклеосом на этом участке было уменьшено в 4-5 раз (рис. 34А). В релаксированных плазмидах pZ+ и pZ распределение нуклеосом было идентичным. Сборка нуклеосом приводила к подавлению транскрипции всех используемых конструкций, за исключением сверхспиральной формы плазмиды pZ+ (рис. 34Б). Различий в уровнях транскрипции свободных плазмид pZ+ и pZ- не наблюдалось, означая, что отличия транскрипционной активности pZ+ pZ- обусловлены особенностями их ассоциации с нуклеосомами (рис.36).

Рис. 36. Сборка инициаторного комплекса в области контроля транскрипции LTR вируса саркомы Рауса. (А) - неактивная структура в присутствии нуклеосом; (Б) - формирование транскрипционного комплекса в интактной области контроля транскрипции вируса саркомы Рауса. RNA pol II - РНК-полимераза II; (В) - формирование транскрипционного комплекса в результате связывания химерного активаторного белка BSAP-CREB (см рис. 33). BSAP - участки связывания активаторного белка; (Г) - формирование транскрипционного комплекса в результате конформационного перехода в ДНК (локальное вытеснение нуклеосом).

Относительно короткие (более 8-ю п.н.) последовательности чередующихся CG-нуклеотидов способны образовывать структурные изомеры (ле-возакрученные (Z-ДНК) и крестообразные структуры) под воздействием сравнительно небольшого уровня напряжений в спирали ДНК. Хотя большая часть эукариотической ДНК релаксирована, ряд данных свидетельствует, что отдельные районы хромосом находятся под воздействием напряжений. Напряжения в хроматине могут индуцироваться in vivo как под воздействием мигрирующих полимеразных комплексов, так существовать и в инициатор отсутствии транскрипции.

инициатор

Z-ДНК и крестообразные структуры не мотуг быть упакованы в нуклеосомный "кор" (.Garner & Felsenfeld (1987) 196 581-590, Nobile et al.(. 1986) Mol.Cell Biol. 6, 29162922), что должно приводить к вытеснению нуклеосомных частиц из области этих структур. Действительно, блок (CG)7 препятствовал образованию нуклеосом в составе промотора in vivo (рис. 33А), и на сверхспиральной, но не релаксированной, ДНК при диализе нуклеосом in vitro (рис. 35А). Наиболее вероятно, что активация промотора блоками чередующихся CG-пуклеотидов и обусловлена образованием фрагментов Z-ДНК, вытесняющих нуклеосом из этого района. Области связывания активаторных белков освобождаются от нуклеосомных частиц (рис. 33, 36), что обеспечивает доступ активаторов к их участкам связывания, инициируя механизм транскрипции. Инсерция блока (CG)7 также существенно повышала базовую (неиндуцируемую) транскрипцию минимального промотора вируса саркомы Раусса. Это поддерживает гипотезу, что свободный доступ транскрипционных компонент к ДНК может быть необходимой и достаточной причиной для образование инициаторного комплекса, даже при отсутствии остальных функциональных элементов области контроля транскрипции.

Минимальная область контроля транскрипции LTR вируса саркомы Рауса со вставкой 14 CG пар обеспечивала высокий уровень активности при интродукции в клетки разного типа (рис. 37). Уровень экспрессии был сравним с экспрессией гена хлор-

1-4: ген CAT под контролем промотора на основе вируса саркомы Раусса, перед которым встроена последовательность 22 нуклеотидов, содержащая:

1 -12 CG нуклеотидов

2 -14 CG нуклеотидов

3 -16 CG нуклеотидов

4 - о CG нуклеотидов

5 - ген CAT под контролем промотора гена тимидинкиназы.

6 - ген CAT под контролем промотора с регуляторными элементами гена р5з.

7- контроль

1 - ген CAT под контролем промотора вируса SV40

с энхансером SV40 (рСАТз-control; Promega).

2 - ген CAT под контролем промотора &-D глоби-нового гена кур (240 п.н.), клонированного в плазмиде рСАТз-basic; Promega.

3-6: ген CAT под контролем промотора на основе вируса саркомы Раусса, перед которым встроена последовательность 22 нуклеотидов, содержащая:

3 - о CG нуклеотидов

4 -12 CG нуклеотидов

5 -14 CG нуклеотидов

6 -16 CG иуклеотццов

1 - ген CAT под контролем промотора вируса SV40

с энхансером SV40 (рСАТз-control; Promega).

2 - ген CAT под контролем промотора 4-D глоби-нового гена кур (240 п.н.), клонированного в плазмиде рСАТз-basic; Promega.

3 -12 CG нуклеотидов

4 -14 CG нуклеощдов

ч-ift СО hvk пепггилпя

Рис. 37

А клетки COS активность хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CAT) (% от максимальной) 5 100 5 7 10 95 2

1 2 3 4 5 6 7

В клетки К562

активность хлорамфеникол ацетил трансферазы (CAT) (% от максимальной)

85 15 6 4 100 3

•Iff??

1 2 3 4 5> б

клетки HeLa активность хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CAT) (% от максимальной)

3 34 7 100 12

• •• • f

Л *> Ъ А С

амфеникол ацетилтрансферазы под контролем р53 зависимого промотора (рис.зуА), промотора вируса SV40 с энхансером SV40 (рис.37Б,В), или же превосходил их. Промотор вируса саркомы Рауса со вставкой 14 чередующихся CG нуклеотидов был и менее специфичен к типу клеток. Так, эта конструкция имела значительный уровень экспрессии в клетках HeLa, в то время как промышленный конструкт рСАТз фирмы Promega (геи CAT под контролем промотора вируса SV40 с энхансером SV40) в эта* клетках имел лишь незначительный уровень экспрессии (рис. 37Б,В). Описанный подход может представлять интерес для дальнейшего конструирования неспецифичного гиперэкспресси-руемого эукариотического плазмидного вектора, для практического применения, например, в генной терапии, приложениях генной инженерии, конструировании трансгенов и других подобных применениях.

2.5.1. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ МОДЕЛИ. КОНСТИТУТИВНАЯ АКТИВАЦИЯ ПРОМОТОРА НА ОСНОВЕ LTR ВИРУСА САРКОМЫ РАУСА МОНОМЕРНЫМ ФАКТОРОМ CREB.

К белкам с "лейциновой застежкой" ("В-ZIP proteins") относится ряд модуляторов транскрипции, построенных по сходному принципу. В этих белках различают i) функциональный домен, отвечающий за активацию или репрессию транскрипции, 2) участок связывания с ДНК и 3) лейциновую структуру ("застежка"), посредством которой эти белки способны димеризоваться. Участки связывания этих белков на ДНК также существуют в виде димерных последовательностей. В норме, мономерные белки группы "В-ZIP proteins" димеризуются через "лейциновую застёжку" и связываются со своими учалками на ДНК уже в виде димеров. Бьшо неясно, необходима ли димеризация для выполнения белками своих функций или же димеризация необходима лишь для корректного связывания с ДНК

Для изучения активация генов белками с "лейциновой застежкой" разработан ряд модельных промоторов на основе промотора LTR вируса саркомы Рауса (51- п.н. 5-фланкирующей и 39 п.н. транскрибируемой последовательностей), в который можно было встраивать участки связывания активаторных белков. Как маркер транскрипции использовали ген хлорамфенюсол-ацетилтрансферазы. Был сконструирован химерный активаторный белок BSAP-CREB, состоящий из функционального домена белка CREB соединенного с ДНК-связывакмцейся последовательностью белка BSAP (B-cell Specific Activator Protein; BSAP, Adams et al. (1992) Genes Dev. 6,1589-1607). Встраивая в исследуемый промотор один или несколько участков связывания BSAP, можно достигать связывания с промотором любого числа мономерных функциональных доменов CREB, и так определить, необходимо для активация промотора присутствии двух функциональных доменов CREB, или же достаточно одной функциональной группы (рис. 38).

fiBSI-fCÂfl 8S1CAT (851)

BS2CAT (BS2) 9S4CAT (ÍS4) GAL4CAT (64)

BS2 M • • •

• • • •ttt

..........GAU/СШ - - + +

+ +- + + -+ + -- BW/CXEB + + - -

........+ + BSAP - - - -

-+--+. -+.+PKA - + - +

—ICÂF

BS1

BS2

__HD

feÂul—ГсаП

BS2

BS4

•••••НИМ

Рис. 38.1-4 участка связывания белка BSAP (BBS) или 1 участок связывания GAL4 встроены перед участком инициации транскрипции. Конструкты травсфицировали в клетки JEG3 совместно с плазмидами зкспресснрующими активатор BSAP-CREB (или OAL4-CREB), и РКА проггеинкиназу. Через 48 часов сравнивали активность хлорам-феникол-ацетилтрансферазы в экстрактах клеток.

Связывание с промотором двух и более функциональных групп CREB обеспечивало такой же уровень транскрипции как и при активации промотора интактным димером CREB. Более того, при связывании функциональных групп CREB через домен BSAP отпадала необходимость в специфическом фосфорилировании CREB (рис. 38, 39Г). Варьирование положения мономерного участка связывания BSAP в составе промотора не приводило к заметной активации промотора (рис. 39А.Б), несмотря на то что такой мономерный участок был способен эффективно конкурировать с димерным участком за связывание с белком BSAP-CREB (рис. 39В), что свидетельствует о некооперативном связывании BSAP-CREB с димером сайта связывания.

А -г™э-ПЗТ~1 DERSVCAT (DE)

1иПшНшЬШП BS2CAT (BS2)

fieTr- x-----(ТуЩ-ГСДП NMCAT (NM)

-К—tjjp—MNCAT (MN) В5МНШНМЗ BS2+5CAT (BS2+5) [ЖНО-ИгЕНШКЖЭ BS2+10CAT (BS2+10) füüTIgn-1 о -ШЖ] BS2DCAT (BS2D)

СМ см со со m m

о см см со со m m

• •

ш 8 о со

NM MN BS2

Рис 39. Активации химерного промотора функциональной группой CREB. (А) -обозначения как рис 38. Указаны 5- и 10 п.н. инсерции. (Б) - анализ активности как рис 38, но без РКА. (В) - "торможение в геле" димера участка связывания белка BSAP-CREB как рис 31, в присутствии конкурента - фрагментов MN и NM. (Г) - Специфическое фосфорилирование и активность BSAP-CREB. Конструкты NM, MN, BS2 и совместно с плазмидой BSAP/CREB трансфшщровали в клетки в присутствии или отсутствии плазмиды экспрессирующей протеинкиназу РКА.

Однако изменение относительного расположения двух функциональных групп CREB вдоль оси ДНК существенно сказывалось на активности промотора. Транскрипция почти полностью подавлялась при разнесении сайтов связывания BSAP-CREB и ТАТА-блок по разные стороны дуплекса ДНК (инсерция 5 п.н.). Уровень транскрипции, однако, восстанавливался при возвращении этих участков на одну сторону дуплекса ДНК (инсерция ю п.н.) (рис. 32,39)- Более того, разнесение мономерных сайтов связывания BSAP- на 5 и ю п.н. резко подавляло активность промотора. Это свидетельствует о кооперативностном функционировании активаторных доменов CREB. Мутационный анализ функционального домена CREB (рис.40) подтвердил, что активация химерного промотора действительно определяется действием функциональных групп CREB.

WT | D140N

[цЗЭКЯШ! I тш 1 1 <*2 1

ieSAPl OI 1 i лиг 1 1 q? 1

Ibsap I Qi 1 mmr 1 1 Q2 1

IbsapIOI ItaH Ml 02 1

Ibsap I Qi 1 ! n.U.XJ 1 1 Q2 1

[bsap| Ibsap I Qi 1

kid II Q2 1

IBSAPI QI II KID 1 ] 1 1

Ibsap 1 (Л I! KID 1 э M

(bsapI qi II KID i ] □ ]

Ibsap | qi |! KID 1

I__^

§ О 5 Q И

а см о 1-

Et ? ; о S сз о

• • • • %

активность (%) Z ' ïoo

ggoqran

•••••%»•••• •• <

Рис 40. Влияние мутаций в функциональном домене CREB на активность химерного промотора (А,Б) и его взаимодействие с димером участка связывания белка BSAP-CREB при "торможении в геле" (В). Условия и обозначения см рис. 38,39 (обозначения доменов CREB приведены в соответствии с Krajewski & Lee (1994) Mol.CeU Biol. 14.7204-7210).

2 6. РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК В УЧАСТКЕ НАЧАЛА РЕПЛИКАЦИИ ДОМЕНА Л-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР.

Выше показало, что специфические последовательное™ ДНК способны участвовать в ряде структурных перегруппировок хроматина. Регуляторные элементы транскрипции могут выполнять и функции регуляторных элементов участков начала репликации. Участки начала репликации ДНК высших эукариот состоят из необходимых и вспомогательных элементов. В свете обсуждавшихся выше особенностей организации и функционирования специфических последовательностей ДНК, представлялось актуальным изучить, имеются ли в хорошо изученной области домена 6-глобиновых генов кур, включающего участок начала репликации и участок перманентного прикрепления ДНК к ядерному матриксу, структуры ДНК со специфической конформацией.

Стабильно изогнутые последовательности ДНК ранее обнаружены в ряде про- и эукариотических участков начала репликации. При двумерном разделении в гелях агарозы и полиакриламида, фрагменты ДНК со среднестатистической конформацией образуют правильную арку, так как в обеих направлениях разделение происходит в соответствии с размерами фрагментов. Фрагменты ДНК, содержащие стабильно изогнутые последовательности, имеют пониженную подвижность при электрофорезе в плотном полиакриламидном геле и будут выпадать из арки. Исследуемая область ¿6Н2,9 была разделена на и фрагментов (рис. 41). Изучаемые группы фрагментов смешивали с маркерной ДНК (гидролизат рТС19 нуклеазы Мвр1) для визуализации положения арки.

Рис 41. Положение фрагмента а6Н2,9 в домене ¿1-глобиновых генов; способ фрагментации вставки а6Н2,д. Справа показаны обозначения участков расщепления ДНК реегриигазами. 1-и - номера субфрагментов &6Н2,9. Прямоугольники на карте домена указывают позиции глобиновых генов.

Были выявлены две стабильно изогнутые последовательности ДНК, располагающиеся во фрагментах N1 (рис. 42 ) и N9. При электрофорезе в первом направлении при 5°С эти фрагменты имели подвижность, соответствующую их размерам, однако во втором направлении они двигались существенно медленнее, в силу чего эти фрагменты располагались над аркой. Аномальная подвижность утрачивалась, когда разделение во втором направлении проводилось при повышенной температуре, что и следует ожидать, если замедленная подвижность обусловлена стабильно изогнутыми последовательностями ДНК, так как из-за увеличения конформа-ционной гибкости ДНК изгиб утрачивается.

Рис 42. Двумерный элек-тро-форетический анализ фрагментов N1, N2. Справа - разделение в первом направлении. Для остальных фрагментов анализ аналогичен.

Легкоплавкие последовательности ДНК выявляли посредством двумерного электрофореза в нативном и денатурирующем гелях 6% полиакриламида. Частично денатурированные фрагменты ДНК имеют меньшую электрофоретическую подвижность, чем двунитевые фрагменты той же длины. В первом направлении фрагменты ДНК разде-

15 т.п.н.

и и и

66Н2,9

1±$

1 т.п.н.

й6Н2,9„

шо

| нм III

-м ♦"*"

V ФТ Ъ™

А Х/77Э1 ^Крп I

2 т.п.н.

а6Н2,9г

й6Н2,9.

м! !

НшП

43« 453

ляли при 2о"С; во втором - при 53°С в присутствии мочевины и формамида. Рис 43. Двумерный электрофоретический анализ нативных и частично денатурированных суб-

7 1

329 5 48 6

. .0

ЗМ мочевина, |10% формами;

сайты

связывания ряда специфичных в отношении последовательности ДНК белковых факторов.

Рис. 44. Позиции функциональных и структурных элементов авН'2,д. Отмечены последовательности CRI типа, транскрипционный энхан-сср, участки связывания специфичных для про-лиферирующих клеток белковых факторов, участки связывания с ядерным матриксом и изогнутые последовательности ДНК.

фрагментов а6Н2,9. Сверху - разделение в первом направлении (полиакриламидный гель без денатурирантов, 20°С) полной смеси суб-фрагментов СМьКп) и их отдельных групп. Разделение во втором направлении проводили при 53"С в присутствии различных концентраций формамида и мочевины. Номера фрагментов показаны в соответствии с рис. 41. Частично денатурированные фрагменты, замедленно движущиеся во втором направлении, указаны стрелками с номерами.

Все и фрагментов а6Я2,9 сохраняли двуни-тевую структуру при 53°С в отсутствие денатурирующих агентов. Об этом свидетельствовала их алектрофоретическая подвижность, соответствующая их размерам (рис. 43). В геле, содержащем 2М мочевину и 5% формамида, появлялись два замедленно двигающихся фрагмента, идентифицированные как N11 и N10 (используя смесь, не содержащую N1 и N2 - не показано) С увеличением концентрации денатурирующих агентов, расплавленные участки последовательно появлялись во фраг ментах N1, N9, N8, N2. Фрагменты N3^7 сохраняли двунитевую структуру при высоких концентрациях мочевины и формамида, что соответствует высокому содержанию (СС)-пар.

Результаты экспериментов суммированы на рис. 44. Две стабильно изогнутые последовательности ДНК располагаются по краям исследуемого фрагмента ДНК и разделены спейсерным районом (фрагменты 3-7), в котором располагается транскрипционный энхансер, неспецифичный в отношении типа клеток [441]. Фрагменты ДНК, содержащие стабильно изогнутые последовательности, являются относительно богатыми АТ-парами (54% АТ-пар находится во фрагменте N1, 55% АТ-пар - во фрагменте N9). Одна из стабильно изогнутых последовательностей ДНК совпадает с ранее обнаруженным участком связывания специфичного для пролиферирующих клеток белкового фактора. Следует отметить сходство в организации специфических последовательностей ДНК в участках начала репликации ОНИ* гена китайского хомячка и домена а-глобиновых генов кур. Оба участка содержат сходное распределение изогнутых и легкоплавких последовательностей ДНК, а также

О СИ п.н. энхансер2 т.п.н.

MAR Щ

/\ изогнутая ДНК

порядок плавления (снизу вверх)

3 , 4 , 5 ,6, 7

JMi

Наряду с рядом других эукариотических участков начала репликации, участок домена á-глобиновых генов кур содержит также транскрипционный энхансер. Это предполагает, что для инициации репликации ДНК высших эукариот необходим сложный комплекс разных функциональных элементов ДНКСтабильно-изогнутые последовательности ДНК могут обеспечивать условия для связывания специфичных белковых факторов. Создавая благоприятные позиции для посадки нуклеосом, две изогнутые последовательности ДНК могут способствовать возникновению двух противоположных "волн" фазированного расположения нуклеосом, причем в месте встречи этих волн (между изогнутыми последовательностями) возможны нарушения нуклеосомной организации. Это может быть одной из причин возникновения участка гиперчувствительности к ДНКазе I, ранее обнаруженого в области домена á-глобиновых генов кур.

2.7. СТРУКТУРА И ПЕРЕСТРОЙКИ ХРОМАТИНА ПРИ ИЗМЕНЕНИИ КОНФОРМАЦИИ МЕЖНУКЛ ЕОСОМНОЙ ДНК.

Характер упаковки нуклеосомных фибрилл критичен для экспрессии генов Эти структуры представляют состояние, в котором хроматин находится большую часть клеточного цикла. Фибриллы должны быть "развернуты" чтобы обеспечить транскрипцию и репликацию клеточной ДНК и, далее, опять компактизованы, чтобы обеспечить деление клеток. Значительным достижением в понимании основ перестроек хроматина,

явилось теоретическое построение (Woodcock et al. (1993) PNAS 90, 9021-9025), согласно которому, характер упаковки нуклеосомных фибрилл может определяться длиной межну-клесомных линкеров, а более конкретно, относительным углом вращения между соседними нуклеосомами (рис. 45). Спиральные структуры, образующиеся при последовательном изменении длины межнуклеосомных линкеров, характеризуются симметричной организацией, периодически изменяющейся от полностью развернутой "зигзагообразной" конфигурации нуклеосомной фибриллы (при относительных углах вращения i8o°), до сложных структур с наиболее плотно упакованными нуклеосомами (при относительных углах вращения 250-280°). Подобный "циклический" характер перестройки фибрилл хроматина обусловливается свойствами системы "нуклео-сома-межнуклеосомный линкер*. Изменения этой системы при модификации гистонов, должны существенно сказываться на характере упаковки нуклеосомной фибриллы.

Взаимосвязь организации фибрилл хроматина и конформации нуклеосомных линкеров в клетках in vivo исследовали используя интеркаляцию дифосфата хлороквина для изменения осевой закрутки межнуклеосомной ДНК. Молекулы хлороквина интеркалируют в двойную спираль ДНК с разворачиванием спирали на 28o. Хлороквин связывается с ДНК, но не хромосомными белками и, при низких уровнях интеркаляции, не влияет на гибкость и торзионную жесткость ДНК. Связывание с ДНК происходит в участках межнуклеосомных линкеров без диссоциации нуклеосом. Короткая обработка хлороквином (при концентрациях до то мг/мл) не вызывает цитотоксичных эффектов и его воздействие на клетки ограничивается интеркаляцией в ДНК

Суспензию клеток К562 эритролейкемии человека делили на ряд порций, к каждой из которых добавляли раствор дифосфата хлороквина в требуемой концентрации. Клетки фиксировали глютаровым альдегидом, чтобы стабилизировать структурные переходы в хроматине. Хроматин фиксированных ядер изучали с помощью микрококковой нуклеазы, затрагивающей, в основном, районы линкерной ДНК. При ограниченном гидролизе, чувствительность хроматина к нуклеазе отражает, главным образом, структурные отличия наднуклеосомной организации. Увеличение концентраций хлороквина

до 0,01-0,03 мг/мл, вызывало монотонное увеличение среднего размера фрагментов расщепленной ДНК (рис. 46). Дальнейшее увеличение интеркаляции приводило к последовательному уменьшению размера фрагментов ДНК. При концентрациях хлорокви-на от 1 до ю мг/мл, средний размер фрагментов ДНК увеличивался опять, вплоть до значений, сравнимых с размером ДНК из клеток, не обработанных хлороквином. Исчерпывающий нуклеазный гидролиз приводил к типичной картине нуклеосомной "лесенки" для всех исследуемых образцов хроматина, свидетельствуя, что используемые концентрации хлороквина не приводят к деградации нуклеосом.

§7

й (>U х

¡4-

L.I

Концентрация нуклеазы: CD 0 1 мкг/мл ЕЭ 0.3 мкг/мл Н 1 0 мкг/мл

К 1

логарифм концентрации хлороквина (мкг/мл)

Рис. 46. Перестрйки хроматина при титровании клеток дифосфатом хлороквина. Клетки обрабатывали хлороквином и фиксировали. Ядра клеток изолировали и расщепляли микрококковой нуклеазой. ДНК экстрагировали протеиназой К и аналилизировали в геле агарозы. Показаны профили ограниченного (о,1-1 мкг/мл) гидролиза ядер нуклеазой.

Описываемый профиль нук-леазного расщепления сохранялся и при нарушении топологической целостности клеточной ДНК дозами УФ излучения до 30-50 кДж/м2 или Ю мМ перекиси водорода, указывая, что эффект интеркаляции хлороквина не являлся результатом генерируемых напряжений в ДНК, но, более вероятно, отражал перестройки хроматина, соответствующие периодическому "завиванию" (folding) нитей нуклеосом при изменении осевой закрутки межнуклеосомной ДНК.

Взаимосвязь организации фибрилл хроматина и конформации нуклеосомных линкеров в ядрах in vitro исследовали используя интеркаляцию бромистого этидия для изменения осевой закрутки межнуклеосомной ДНК (рис. 47). Молекулы бромистого этидия интеркалируют преимущественно в межнуклеосомную ДНК, разворачивая спираль ДНК на 0,07 витка с эффективностью юох превышающей интеркаляцию хлороквина. В используемых условиях, связывание этидия не нарушает структуру и состав хроматина.

Рис. 47. Профили расщепления (А) я распределение транскрибируемых последовательностей (Б) ДНК при яуклеазном гидролизе ядер после титрования бромистым этиди-ем. Ядра клеток делили на ряд порций, титровали этцдием, фиксировали, и расщепляли микрококковой нуклеазой. Суммарную ДНК экстрагировали и анализировали в геле агарозы.

(А) - концентрации нуклеазы: • -ю, ■ -30, О- 100, О- 0.4 и □ - 0.25 ед/мл. ♦ - ядра этидием не обрабатывали. (Б) - образцы ДНК, полученные при низкой (0.3 ед/мл) и высокой (30 ед/мл) степени расщепления нуклеазой, но при одинаковой обработке этидием, попарно смешивали и разделяли в геле. Распределение транскрибируемых последовательностей выявляли гибридизацией с радиоактивной суммарной клеточной РНК Показана трассировка гелей и радиограммы.

, * 1 2 3 4 £ Логарифм концентрации этидия (мкг/мл xlOO)

бр. этидий 6р. этидий

бр. этидий

- 30 ед/мл - - 0,3 ед/мл -

гибридизация со спешкЬич. пробой

Суспензию ядер клеток НеЬа делили на порции, к каждой из которых добавляли требуемое количество бромистого этидия с последующей фиксацией и гидролизом микрококковой нуклеазой. При сравнительно высоких количествах нуклеазы (10-30 ед/мл), по-вышение концентрации этидия (до 5-10 мкг/мл) приводило к уменьшению среднего размера фрагментов расщепленной ДНК, наиболее вероятно, отражая постепенную де-компактизацию нуклеосомных фибрилл. При дальнейшем повышении концентрации этидия (до 200-300 мг/мл), средний размер расщепленной ДНК увеличивался опять, предположительно, как результат образования компактных структур хроматина. Наконец, при дальнейшем увеличении интеркаляции этидия, декомпактизация хроматина наблюдалась опять. При юо-2оох уменьшении количества нуклеазы, "волнообразное" распределение размеров фрагментов ДНК сохранялось, однако "фаза" его менялась на противоположную. При промежуточных концентрациях нуклеазы, профиль расщепления соответствовал наличию популяций ДНК, наблюдаемых при "низкой" и "высокой" концентрациях нуклеазы. Транскрибируемые последовательности были ассоциированы преимущественно с популяцией ДНК, наблюдаемой при "низком" уровне расщепления нуклеазой. Эксперименты без добавления бромистого этидия показывают, что вариации степени расщепления нуклеазой не вносили существенного вклада в профили расщепления ДНК.

Интеркаляция бромистого этидия не вызывала заметной диссоциации гистонов и НМ(3-14/17. Наличие типичной нуклеосомной "лесенки" для всех анализируемых образцов хроматина свидетельствовало, что структура нуклеосом принципиально не наруша-лалась.

С помощью приведенного выше подхода, оценили особенности организации хроматина при удалении или при неэнзиматическом ацетилировании концевых доменов гасгонов Ш, Нз и Н4. Концевые домены гистонов обогащены лизином и аргинином, и их трипсинолиз протекает с повышенной эффективностью, позволяя избирательно удалять эти участки. Низкие концентрации трипсина (1-2 мкг/мл) избирательно удаляли концевые домены гистонов Ш, оставляя гистоны нуклеосомного кора интактными. Более интенсивный трипсинолиз (ю мкг/мл) удалял концевые домены гистонов Н3/Н4, уменьшая размер нуклеосомной ДНК на 4-7 п.н. В последнюю очередь отщеплялись концевые доменов гистонов Н2А/2В. Интеркаляция бромистого этидия не вызывала ни

диссоциации трипсинизиро ванных остатков гистонов, ни деградации трипсинизиро ванных нуклеосомных частиц.

Профиль нуклеазного расщепления хроматина, при удалении концевых доменов гистонов Н1 (рис. 48Б), был практически неотличим от профиля расщепления интактного хроматина (рис. 48А), за исключением пониженной чувствительности к нук-леазе, на что указывало общее увеличение размера фрагментов ДНК. При удалении концевых доменов гистонов Н3/Н4 (рис.48В) "волнообразное" распределение размеров фрагментов ДНК сохранялось, но фаза распределения была сдвинута по сравнению с контрольным хроматином, наиболее вероятно отражая перестройку хроматина при удалении концевых доменов гистонов Н3/Н4. Удаление концевых доменов гистонов Н2А/Н2В профиля гидролиза практически не меняло (не показано).

Рис. 48. Анализ перестроек трипсинизированного хроматина при титровании изолированных ядер бромистым зтидием. Интактные ядра клеток (А), или ядра, обработанные трипсином до удаления концевых доменов гистонов Н1 (Б) или Н1/Н3/Н4 (В), делили на К15 2 2 5 3 35445 порции, титровали этидием, фиксировали и расщепляли Логарифм концентрации' микрококковой нуклеазой. ДНК экстрагировали и бр. ЭТИДИЯ (мкг/мл хЮО) анализировали в геле агарозы.

Концевые домены гисгонов нуклеосом модифицируются ацетиладенилатом в 4-5 раз более эффективно, нежели глобулярные области; ацетилирование протекает исключительно по остаткам лизина и, с меньшей эффективностью, по остаткам аргинина, что сходно с профилем ацетилирования гисгонов т гяио и позволяет рассматривать неэнзиматическое ацетилирование гисгонов как адекватную имитацию природного ацетилирования гисгонов.

Обработка ядер 3-10 мМ ацетиладенилата приводила к резкому увеличению степени ацетилирования гисгонов нуклеосомного кора (рис 49А), причем интеркаляция этидия не вызывала их диссоциации (не показано). В случае ацетилированного хроматина, специфическое "волнообразное" распределение размеров фрагментов расщепленной ДНК имело измененную фазу по сравнению с контрольным хроматином. Это, наиболее вероятно, отражает декомпактизацию упаковки нуклеосомных филаментов при ацетилировании гисгонов.

Концентрация ацетиладенилата: □ ОмМ

И змМ ■I10 мМ

Рис. 49. Перестройки высокоаце-тилированнош хроматина при титровании ядер бромистым этидием. Изолированные ядра клеток НеЬа обрабатывали о, з, ю мМ ацетиладенилата, делили на ряд порций, титровали этидием, фиксировали и расщепляли микрококковой нукле-азой. Суммарную ДНК ядер экстрагировали и анализировали в геле агарозы. Показаны диаграммы профилей нуклеазного гидролиза

При исследовании фибрилл высокоацетилированного хроматина in vivo (рис. 50) ис-

К 1.5 2 2.5 3 3.5

Логарифм концентрации этидия, мкг/мл хЮО пользовал и культуру клегок СУ1, которую отличает быстрая реакция на обработку ингибитором деацетилаз I истонов - трикостатииомом А (в течение 30 мин - см. рис. 23А) - и высокие уровни индуцированного гиперацетилировапия хроматина Индуцируемые трикостатином морфологические изменения клеток и экспрессию дополнительных белков подавляли циклогексимидом (1-3 мкг/мл), который добавляли одновременно с трикостатином А. Д

хлороквин хлороквин

Рис. 50. (А) - типичные профили нуклеазного гидролиза ядер клеток, титрованных хлороквином. Концентрации нуклеазы -0,25 и 0,5 мкг/мл (верхняя и нижняя панели). £ - /ЫЕ II рестрикт ДНК фага А, 5 - олигомеры 123 п.н. ДНК. (Б) - суммарные диаграммы профилей нуклеазного расщепления контрольного и гиперацетилирован-ного хроматина Черные, заштрихованные и белые участки соответствуют 0,2, о,35 и 0,6 мкг/мл нуклеазы.

контроль хлороквин

ацетилиров. хлороквин

контроль

л% !

'и

контроль ацетилиров.

о>

Е'

я а.

га I а

iiiuLiil

ацетилиров.

К 1 2 3 4

логарифм концентрации хлороквина (мг/мл х1000)

Суспензию клеток делили на порции и титровали дифосфатом хлороквина с последующей фиксацией глютаровым альдегидом и частичным гидролизом ядер микрококковой нуклеазой. В случае ядер клеток, обработанных трикостатином, вместо специфического "волнообразного" распределения размера фрагментов расщепленой ДНК, во всем диапазоне концентрации хлороквина наблюдалось монотонное уменьшение размера фрагментов ДНК (рис. 50). Наблюдаемый эффект наиболее вероятно отражает реорганизацию уровней упаковки нуклеосомных филаментов при гиперцетилированиии клеточных гистонов. Интенсивный нуклеазный гидролиз приводил к картине типичной "нуклеосомной" лесенки для всех исследуемых образцов хроматина (не показано), свидетельствуя, что интеркаляция хлороквина не приводит к нарушению целостности ги-перацетилированных нуклеосомных частиц. Анализ белкового состава хроматина (фиксирование было исключено) не выявил хлороквинзависимого высвобождения отдельных ацетилированных изоформ гистонов.

Пост-синтетическое ацетилирование терминальных областей гистонов предполагается одной из основных детерминант характера упаковки нуклеосомных фибрилл. Наиболее вероятнее, что гиперацетилирование вызывает перегруппировку подвижных концевых доменов гистонов, изменения пространственную ориентацию межнуклеосом-ной ДНК. Структуру нуклеосом исследовали с помощью "мягкого" трипсинолиза изолированных ядер (рис. 51). Гидролиз начинался с селективного удаления N- и С-концевых доменов гистонов, чувствительность к трипсину которых обусловлена повышенным содержанием лизина и аргинина. Профиль ограниченного трипсинолиза ядер in situ был практически идентичен профилю расщепления изолированных фрагментов хроматина in vitro.

А / * Б В АХ трипсин_ трипсин

Н2А-Н2А-

Н4-—,

-HJ -ШАЛ

-Н4

контроль

lg__sSSS-

ацетил.

Рис. 51. Протеолиз нормального и гиперацетилированного хроматина. Для гиперацетнлирова-ния гистонов клетки CVi 3 ч индуцировали трикостатином А. Ядра изолировали и подвергали "мягкому" расщеплению трипсином. Гистоны экстрагировали 0.5М HCl и анализировали в 15% полиакриламидных гелях содержащих додецилсульфат натрия. (А) - нерасщепленные образцы гистонов контрольного и гиперацетилированного хроматина. (В) - денситотраммы треков гелей (J5) с наибольшим уровнем расщепления гистонов. Идентификация фрагментов соответствует Böhm & Crane-Robinson (1984) Biosci Rep. 4.365-386

Гидролиз хроматина приводил к набору полипептидов (81—65) гистонов нуклео-сомного "кора" (рис 51), но относительные количества этих фрагментов отличались для гиперацетилированного и контрольного хроматина. Фрагмент 83 (гистон НгВ с удаленной N-концевой областью) представлял основной продукт трипсинолиза контрольных ядер (рис. 51Б; слева), но присутствовал только незначительно при расщеплении гиперацетилированного хроматина (рис. 51Б; справа). Фрагмент 61 (гистон Н3 с удаленными К,С-концевыми доменами) присутствовал в большом удельном количестве только при расщеплении гиперацетилированного хроматина. Отличия профиля трипсинолиза контрольного и гиперацетилированного хроматина отражают отличия кинетики расщепления терминальных доменов гистонов, что наиболее вероятно, является результатом раз-

U v »"»С—- - . * '' " ' 1 ' 'С Ч

--------------------------------------------- .— -----------^-----------конце-

личной доступности (различной пространственной

Чифигурации) ЦОД^Щ! Ь- ' ' f'lt-KA г сс&як

■т ^

вых доменов гистонов.

Данные по хромосомной интеркаляции хлороквина и бромистого этидия поддерживают модель, согласно которой пространственная организация фибрилл хроматина может контролироваться за счет изменения угла вращения между прилежащими нуклеосомами (рис. 45). Действительно, последовательное изменение осевой закрутки межнуклеосомной ДНК вызывало периодическое изменение компактности фибрилл хроматина.

В клетках высших эукариот декомпактизована и активна лишь небольшая часть хромосомной ДНК; остальная ДНК находится в неактивном, высококомпактном состоянии. Действительно, в изолированных ядрах были выявлены две фракции хроматина, различающиеся по чувствительности к микрококковой нуклеазе. Транскрибируемые последовательности были ассоциированы с фракцией, расщепляющейся при "низкой" концентрации нуклеазы, что согласуется с высокой чувствительностью активного хроматина к этой нуклеазе. Интеркаляция бромистого этидия приводила к сходному, но измененному по фазе профилю "закручивания" ("folding") нуклеосомных филаментов этих фракций хроматина, свидетельствуя о различной степени их упаковки, но схожему механизму компактизации.

Удаление концевых доменов гистонов Hi не изменяло заметным образом упаковки хроматина, что согласуется с данными, согласно которым именно глобулярный домен гистона определяет топологию ДНК на "входе-выходе" нуклеосомы. Подвижные концевые домены гистонов нуклеосомного "кора" также являются значимыми детерминантами внутри- и межмолекулярных взаимодействий в хроматине: реорганизация этих доменов, может иметь доминирующий эффект на упаковку нуклеосомных филаментов. Действительно, неэнзиматическое ацетилирование или удаление концевых доменов гистонов Н3/Н4, изменяющие ориентацию линкерной ДНК, сдвигали фазу профиля периодического "закручивания" нуклеосомных филаментов к образованию менее компактных структур.

Интеркаляция in vivo, при индукции гиперацетилирования гистонов трикостати-ном А, приводила к только монотонному уменьшению компактности хроматина. Объясняться это может гетерогенностью такого искуственно индуцированного ацетилирова-ния, что обусловливает неравномерность осевой закрутки межнуклеосомной ДНК и нерегулярную организацию фибрилл хроматина. Образующиеся структуры менее стабильны и не способны поддерживать "периодичный" характер перестройки нуклеосомных филаментов. "Раскручивание" нуклеосомных линкеров приводит к их дальнейшей дестабилизации и декомпактизации. Неэнзиматическое ацетилирование или удаление концевых доменов гистонов не приводили к утере периодичности перестройки нуклеосомных фибрилл. Однако модификации хроматина in vitro существенно более гомогенны, вследствии чего не должны приводить к утере регулярности упаковки нуклеосомных филаментов. Неясно, какой из упомянутых механизмов более адекватно отражает процессы в in vivo; наиболее же вероятно, что в различных функциональных популяциях хроматина реализуются оба описываемых механизмах, в зависимости характера ацети-лирования гистонов в конкретной популяции.

2.8. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ "SET" ОБЛАСТИ ФАКТОРОВ ГОМЕОСГАТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНОВ СО СТРУКТУРАМИ АКТИВНОГО ХРОМАТИНА.

Белки групп поликомба и триторакса (названные так по наиболее изученным представителям) - высококонсервативные компоненты хроматина, отвечающие за поддержание требуемого статуса активности генов. Большинство белков этой группы содержат метилтрансферазный домен SET (130-150 а.к.), способный "кодировать" метальными группами гистоны активного и неактивного хроматина; сигналы далее распознаются системой транскрипции клетки. Домен SET обычно расположен в амино- или кар-боксиконцевой области белков. Исключением является Ashi (регулятор группы триторакса), в котром SET расположен практически в центре белка. В дополнение к высококонсервативному домену SET, различают менее консервативные "Pre-SET" и "Post-SET" области (30-50 а.к.), расположенные, соответственно, на амино- и карбоксиконцевых границах домена SET. Часто Pre-SET и Post-SET включают в понятие домена SET. Неясно, как SET белки распознают первоначальный статус активности генов, как информация, содержащаяся в модификациях гистонов сохраняется и передается при репликации

хроматина. Здесь показано, что к области SET примыкает участок, прочно связывающий однонитевые структуры ДНК. Более того, SET область прочно связывала гистоны Н3/Н4 в виде свободного димера, но не в составе нуклеосом (показано для SET триторакса).

В работе были использованы химерные полипептиды, содержащие интересующие фрагменты областей SET (здесь область SET определена включая Pre-SET и Post-SET подобласти), связанные с минимальным функциональным фрагментом глютатион S-трансферазы (GST). В качестве контроля использовали 178 а.к. фрагмент SSB белка E.coli (id: NP290692.1), способный прочно связывать одноцепочечную ДНК в широком диапазоне условий. В качестве двух- и однонитевых субстратов ДНК использовали олигомеры хоо п.н. ДНК (Fisher), денатурированные при 98° С в буфере ТЕ. Также сравнивали связывание SET области со сверхспиралыюй, линейной и релаксированными формами ДНК. Отрицательно сверхспирализованная ДНК релаксирует напряжения за счет частичного раскручивания двойной спирали (рис. 2) или за счет образования нестандартных структур, содержащих одноцепочечные области ДНК (п. 2.5).

Химерные фрагменты GST-SET и GST-SSB получали экспрессией в клетках Е.coli и связывали с матрицей сефарозы, модифицированной остатками восстановленного глютатиона (Pierce). Иммобилизованные фрагменты SET и SSB тестировали на связывание с субстратами ДНК, при жестких условия отмывки матрицы в буфере, содержащем о,6 М NaCl и 0.1% NP-40. Связавшуюся ДНК анализировали в гелях агарозы с окрашиванием бромистым этидием. Однонитевая ДНК окрашивается менее эффективно, чем двухнитевая: при равных исходных количествах, треки гелей, соответствующие однонитевой ДНК, часто окрашены менее интенсивно из-за неполной ренатурации в ходе эксперимента.

MLL (Mixed Lineage Leukemia) является человеческим гомологом триторакса дрозофилы, действующего в эмбрионах дрозофилы как активатор ряда кластеров гомеоти-ческих генов. Область SET MLL прочно связывалась с одно-, но не двухнитевыми фрагментами ДНК, аналогично белку SSB E.coli (рис. 53А). В отличие от SSB, С-концевые фрагменты MLL также прочно связывались и со сверхспиральной, но не линейной, формами плазмид, свидетельствуя, что SET область MIX способна более селективно различать локальные однонитевые участки в ДНК Глютатион-сефароза или иммобилизованный остаток GST не связывались ни с одно-, ни с двунитевой ДНК (не показано).

'MLL

Ш Ю Ю

Я ИСХОДИ Н ню О " и ш

о ДНК о ц

дц оцдцоц дц оц дц оц

Í* ¿ о

н°

ИСХОДИ ДНК матрица

8 Э 1011 12 1314 1516 17 1819 Рис. 53. Фрагменты SET (SET/Pre-SET область) белка MLL прочно связывают одноцепочечную ДНК и РНК, и сверхспиральную и транскрибируемую ДНК. (А) - электрофореграммы GST-MIX и GST-SSB в ю% ПАА геле. (Б)- С-концевые фрагменты MLL прочно связываются с однонитевой и сверхспиральной ДНК. Иммобилизованные С-концевые фрагменты MIX (151 и 400 а.к.) и SSB белок E.coli, инкубировали с равными количествами двух-(дц) или одноцепочечных (оц) олигомеров юо п.н. ДНК (верхняя панель), и сверхспиральной (се) или линейной (л) формами 6 т.п.н.плазмиды (нижняя панель), в буфере, содержащем 0.05% NP40 и юо мМ NaCl. После отмывки в буфере, содержащем 0.1% NP40 и о.б М NaCl, связавшуюся ДНК изолировали и анализировали в геле агарозы. (В) - С-концевые фрагменты MI L прочно связываются с транскрибируемой ДНК. Матрицу ДНК инкубировали с иммобилизованным GST-MLL (а.к.: 3749-3969) в присутствии смеси рибонуклеозид трифосфатов (NTPs, 3, 8-19), РНК-полимераз Т3, Ту, SP6 (как указано), рибонуклеаз А и Н (12-15), ДНКазы I (16-19). Связавшуюся ДНК изолировали и анализировали в геле агарозы.

Расплетание спирали ДНК полимераяами при транскрипции in vitro также индуцировало прочное связывание ДНК с SET областью MLL (рис. 53В). В качестве ДНК-матрицы использовали линеаризованную нуклеазой Sea I плазмиду pGEMEX-l (Promega), при считывании которой полимеразами Т3, Ту и SP6 продуцируются транскрипты 250 и 1525,1065 и 2346,1787 и 2566 н., соответственно. В отсутствие транскрипции, связывание ДНК и С-концевого фрагмента MLL практически не наблюдалось. При добавлении полного набора компонент транскрипции, SET область MLL прочно связывалась с матрицей ДНК и синтезированной РНК. ДНК и РНК связывались независимо друг от друга, что было показано при избирательном гидролизе ДНК или РНК, соответственно ДНКазой I или смесью рибопуклеаз А и Н (РНКаза Н селективно расщепляет ДНК-РНК гибриды). Поскольку базовые принципы про- и эукариотической транскрипции одинаковы, можно ожидать что SET область будет также связываться и с транскрибируемыми эукариотическими генами.

Сверхспирализация ДНК была необходима не только для первоначального связывания с GST-MLL, но и для поддержания этого связывания. Если напряжения сверхспи-рализации в связанной ДНК релаксировали топоизомеразой I или нуклеазой рестрикции, связанная ДНК переходила в раствор (рис. 54). Это говорит о том, что связывание SET области со сверспиральной ДНК обратимо и стабильные ДНК-белковые комплексы диссоциируют при релаксации напряжений в ДНК

исходи ДНК W связанная с GST-MLL. w линеаризация или релаксация ДНК, отмывка

сверхспираль линейн релакс

+ EcoR1 + Topo I

_ р2 РЗ

р1 р2 рЗ pi р2 рЗ р1 р2 рЗ р1 р2 рЗ р1 р2 рЗ р1 р2 рЗ ь el b el b el

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 Рис 54. Сверхспиральные (l-З), релаксированные (.4-6) и линейные (7-9) формы плазмид Pi (3 т.п.н.), Рг (4.5 т.п.н.) и Р3 (6 т.п.н.) инкубировали с иммобилизованным GST-MLL (а.к.: 37493969) с последующей отмывкой в буфере, содержащим 0.1% NP40 и 0.5 М NaCl (10-18). Связанные сверхспиральныс плазмиды, отмытые от несвязавшейся ДНК, были оставлены интактными (19-24), линеаризованы EcoRl (25-30) или релаксированы топоизомеразой I (31-36), далее алюи-рованы буфером, содержащим 0.1% NP40 и 0.5 М NaCl. Ь - ДНК, оставшуюся связанной с GST-MLL сефарозой (19-36, нечетн. номера), и el - ДНК, перешедшую в раствор (19-36, четн. номера) анализировали в 1% геле агарозы

С SET областью MLL была способна связываться отрицательно, но не положительно, сверхспирализованная ДНК (рис. 55). Отрицательную и положительную сверхспирализацию вносили в плазмидную ДНК релаксацией топоизомеразой I в присутствии бромистого этидия или нетропсина, соответственно. Количество внесенных сверхвитков оценивали с помощью электрофореза, поскольку относительная подвижность плазмид в геле агарозы пропорциональна их уровню сверхспирализации

+ топоизомераза I (Рис 54, верхняя панель).

бр этидий нетропсин

19 5 fi 7 8

Рис. 55. С-концевые фрагменты MLL прочно связываются с отрицательно, но не с положительно, сверхспирализованной ДНК Наборы топоизомеров плазмиды (4,5 т.п.н.) инкубировали с иммобилизованным GST-MLL (а.к.: 3749-3969). После отмывки, связавшуюся ДНК изолировали и анализировали в геле агарозы. Условия связывания и отмывки - см рис. 53. Верхняя панель - внесенная ДНК, нижняя -связавшаяся ДНК.

При высоких концентрациях бромистого этидия или нетропсина, индуцированная сверхспирализация была сопоставима с природной сверхспирализацией бактериальных плазмид. Только высокие уровни отрицательной сверхспирализации - природной или индуцированной in vitro - обеспечивали прочное связывание

ДНК с SET областью MLL. Это предполагает, что именно локальное расплетание спирали ДНК напряжениями сверхспирализации, не не формирование третичных витков ДНК, обусловливает прочное взаимодействие ДНК с SETT областью MLL.

Фрагменты SET области ряда других факторов гомеостатической регуляции генов (триторакс, ALRl и ASHi) также прочно связывались с раскрытыми участки двойной спирали ДНК (рис. 56). Примечательно, однако, что область SET фактора Su(var)3~g (фактор отрицательной регуляции экспрессии) не связывалась с однонитевыми субстратами ДНК.

Рис. 56

А ^ х " X со С я

ИСХОДИ С£т- _JO

ДНК t-jg дц оц дц ом

ir®

<cs

Su(var) 212a.к.

RNAses

NTPs, T3/T7/SP6

ДМ оц дм 04 ДЦ 0Ц

сумм

Я T- Я CD

XKliXEliXirXi реакция h<<wi-<<wh<<co

Взаимодействие SET фрагментов TRX (3575-3726), ALR (5093-5262), ASH1 (13)8-1597), Su(var)3-g (424635) с (А) - одно-нитевои и сверхспиральной и (Б) транскрибируемой ДНК Условия см рис. 53.

Белки, прочно связывающиеся с однонитевыми участками ДНК - т.н. SSB (single-stranded DNA-binding) белки - необходимы для репликации и репарации ДНК, транскрипции и рекомбинации, поддержании структуры теяомер и многих других процессов. Чтобы оценить потенциальную роль связывания однонитевой ДНК для функционирования SET белков in vivo, здесь сравнили характер ДНК-взаимодействий SET области MLL/триторакса с хорошо изученным SSB белком Е. co/i (EcSSB). Как и в случае SSB белка, взаимодействие С-концевых фрагментов MLL и триторакса с одноцепочечной ДНК сохранялось при промывке комплексов 2М NaCl и 0.1% NP40, тогда как двухцепо-чечная ДНК удалялась уже при промывке 0.15М NaCl (рис. 57А).

А ОЦДНК i дц ДНК Б

исх ДНК

15 25 50 1 2

исх.

ДНК 15 25 NaCl [М]

шшги

пш

Ш1Ш

GST-TRX (а к 3527-3726)

GST-MLL ^ (а к 3749-3969)

GST-MLL (а к 3916-3969)

GST-SSB

Рис. 57. С-концевые фрагменты М1Х и триторакса связываются с одноцепочечной ДНК со схожей эффективностью как и ввВ белок Е.соН. (А) иммобилизованные ОвТ-МИ. (220 и 350 а.к. С-концевые фрагменты), СвТ-ТЯХ (200 а.к. фрагмент) и СвТ-ЗЭК инкубировали с равными количествами двух-0ц) или одноце-почечных (оц) олигомеров юо п.н. ДНК в буфере, содержащем 0.05% №40 и юо мМ ЫаС1 и промывали буфером, содержащим 0.1% №40 и ИаС1 в указанной концентрации. Связанную ДНК анализировали в геле ага-розы. (Б) - анализ ОЙ'Г-МЬЬ/ТЮС и СЙТ-ЗЭБ полипептидов в ю% ПАА геле. (В) При ничкой ионной силе С-копцевые фрагменты МЬЬ и триторакса способны незначительно связывать двухцепочечную ДНК Иммобилизованные озт-ввв, оэт-М1Х (220 а к. С-концевой фрагмент) и СвТ-ТЯХ (151 а.к. фрагмент) инкубировали с двух-0!() или одноцепочечными (оц) олигомерами юо п.н. ДНК в буфере, содержащем 0.05% №>40 и №С1 в указанной концентрации и промывали буфером, содержащим о 1% №40 и N30 в той же концентрации, как при связывании. Связанную ДНК анализировали в геле агарозы.

GST-SSB

GST-TRX

GST-MLL

'100 125 150 100 125 150

исх ДНК

дц оц дц од дц оц дц оц дц оц дц оц дц оц дц оц дц оц дц оц

100 125 150 NaCL-[mM]

При низкой ионной силе среды (<юо мМ №0) С-концевые фрагменты тритора-кса и М1Х были способны незначительно связывать также и двунитевую ДНК (рис 57В). Следует отметить, что хоть ЕсЭЗВ белок и был, в целом, несколько более избирателен к однонитевой ДНК, некоторые препараты этого белка также были способны связывать сравнимое количество двунитевой ДНК при низкой ионной силе среды.

Взаимодействие С-концевых фрагментов триторакса и М1Х с однонитевой ДНК сохранялось при концентрации N801 до 3,5 М (до 5 М ЫаС1 - не показано) я мочевины

промывочный | кониенгоаиия мочевины (М) | концентрация &аС1 (М) до 4,5 М (рис 58). буфер 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

сверхсгшр.1 плазмвда

фрагмен Pvu II

11 12 13 14 15 16

Рис. 58. SET область MLL поддерживает прочное связывание с

однонитевой ДНК при высоких концентрациях хаотропных агентов. Иммобилизованный С-концевой фрагмент

MLL (350 а.к.) связывали со сверхспиральной 6 т.п.н. плазмидой или однонитевой формой Pvu II фрагментов плазмиды. ДНК-белковые комплексы промывали буфером, содержащим 0.1% NP40 и 0,5 М NaCl (i) или этим же буфером, содержащим мочевину (2-10) или NaCl (11-16). Связанную ДНК изолировали и анализировали в геле агарозы. Также показано (верхняя панель) количество GST-MI.L (ю% ПАА гель) остающееся связанным с глютатион-сефарозой после промывок мочевиной и NaCl.

Таким образом, область SET факторов гомеостатической регуляции генов способна связывать одноцепочечную ДНК со схожей селективностью и с не меньшей эффективностью как и мажорный SSB белок E.eoli. Это предполагает, что взаимодействие SET белков с одноцепочечной ДНК может происходить in vivo по-крайней мере в ряде тех же процессов, в которых участвуют и SSB белки.

В ядрах клеток ДНК образует прочные комплексы со многими клеточными факторами. Большая часть эукариотической ДНК организована в структуры хроматина, полностью разрушающиеся только при высоких концентрациях NaCl или ионных детергентов. Однако образование массивов "динамических" нуклеосом не было способно вытеснить с ДНК связанные фрагменты SET области MLL, свидетельствуя, что взаимодействие SET с однонитевой ДНК может конкурировать с наиболее прочными ДНК-белковыми взаимодействиями (рис. 59).

интакгная ДНК

— GST

I предв. прогретая ДНК

GST-MLL GST-MLL I GST-MLL GST-MLL

220 а.к. 350 а.к. — . GST 220 а.к. 350 а.к. М

10 11 12 13 14 15 16 17 18

Рис. 59. Взаимодействие SET области MLL с однонитевой ДНК сохраняется при реконструкции массивов динамических нуклеосом. Нуклеосомы собирали на линейной 6 т.п н. нлазмиде, интактной дву-цепочечной (3-9), или предварительно прогретой при 82-87°С для генерирования одноните-

вых участков (10-17). GST или GST-MLL С-концевые фрагменты (220/350 а.к.) преинкубировали с ДНК ю мин перед реконструкцией. Хроматин расщепляли микрококковой нуклеазой (30 е или 5 мин). ДНК изолировали и анализировали в геле агарозы. 1,18 - олигомеры юо п.н. ДНК.

Однонитевые участки на матрице ДНК генерировали прогреванием ДНК цри температурах, достаточно высоких для локального плавления участков ДНК, но не всей ДНК в целом (см п. 2.6). Участки одноцепочечной ДНК быстро ренатурируют и не влияют существенно на сборку нуклеосом (рис. 59, треки 2и 10,11). SET область MLL связывали с локально расплавленными участками ДНК, после чего на ДНК проводили реконструкцию массивов нуклеосом, используя экстракт эмбрионов дрозофилы и АТР (см п. 2.3). Нуклеазный гидролиз хроматина, реконструированного на интактной двухцепочечной ДНК, приводил к набору хорошо разделенных фрагментов ДНК (рис.

59). свидетельствуя что, ни остаток GST, ни фрагменты GST-SET не влияют на сборку нуклеосом. Однако, если исходная матрица ДНК была частично расплавлена, нреинкубация с фрагментами GST-MLL, но не остатками GST, приводила к значительно более диффузной нуклеосомной "лесенке", предполагая, что взаимодействие между SET и однонитевой ДНК сохранялось при сборке хроматина, тем самым предотвращая формирование регулярных массивов нуклеосом.

Для SET триторакса известна мутация trxZn - замена высококонсервативного глицина G3601 на серин - приводящая к гомеотическим трансформациям в

SET 3595 3726 а к

область связывания одноцепочечной ДНК

гомология метилазам

область, богатая цистеином

^область связывания

Z11 (Gmoi>S) ™етанов w.t. Z11

3726 а к

гетерозиготных линиях дрозофилы или летальности на стадии куколки в гомозиготных линиях.

Рис. бо. Связывание однонитевой ДНК нормальной (ш i.) и мутантной (Z11) SET областью при разной ионной силе среды. Иммобилизованные С-концевые фрагменты триторакса (151 и 385 а.к.) и 81 а.к. фрагмент npe-SET области (а.к. 3527-3607) инкубировали с равными количествами двух-(дц) или

Z11

125 150 175 I 125

дц оц дц ou дц оц дц оц

150 175 NaCI

дц оц дц оц

125 150 175 125 150 175 NaCL

а к 3527-3607

одноцепочечной (оц) ДНК при указанной концентрации №С1 (мМ). Связанную ДНК промывали при 0,5М КаС1, изолировали и анализировали в 1еле агарозы. Справа показана электрофоре-грамма ОвТ-ТИХ"1 и ОвТ-тах2" в ю% по-лиакриламидном геле.

По сравнению с нормальным

фенотипом, мутация

Zll, в целом, приводила к пониженной способности SET области прочно связываться с однонитевой ДНК при повышенной ионной силе среда (рис. 6о), что при 150-175 мМ NaCI практически утрачивала способность к прочному взаимодействию с однонитевой ДНК Примечательно, что для некоторых фрагментов SET (напр. а.к.- 3527 to 3607), мутация Zii приводила к утере способности связывать ДНК уже при юо мМ NaCI. Это подтверждает, что связывание однонитевой ДНК может являться важным элементом функционирования SET-содержащих белков in vivo. Количественный, но не качественный, эффект мутации согласуется с наблюдаемым in vivo дозовым эффектом этой мутации на степень выраженности фенотипа.

Было изучено расположение участков связывания однонитевой ДНК для типичных представителей четырех групп SET-содержащих белков: группы триторакса: MLL, триторакс (рис 61), группа E(z) (enhancer of Zeste): E(z), CLF и группа Su(var) (supressor of variegation): Su(var)3-g, G9a (рис. 62) и Ashi - группа ASHi (absent, small, or homeotic 1) (рис.63). Относительное расположение области связывания однонитевой ДНК сохранялось в составе каждой взятой группы белков, изменяясь от границы SET и Pre-SET областей для белков группы триторакса до "верхней" границы Pre-SET области для белков группы E(z). Белки группы Su(var) с однонитевой ДНК не связывались. Белок Ashi содержал два участка связывания однонитевой ДНК - на Рге-и Post-SET границах SET области. Эти особенности могут отражать различия механизмов функционирования разных групп SET белков. Области связывания однонитевой ДНК были также обнаружены в Pre-SET и SET областях белков SETi, SET2 и ALRi (рис. 64), хотя подробное картирование не проводилось. В любом случае, способность связывать однонитевые ДНК представляется скорее общим свойством SET белков, чем частными

свойствами отдельных белков.

"Минимальные" участки связывания однонитевой ДНК (черные отметки на схемах - рис. 60-62) зачастую протяженнее, чем следует из "перекрывающихся" областей участков связывания однонитевой ДНК. Это, вероятнее, объясняется тем, что такие "дополнительные" последовательности необходимы для корректного восстановления третичной структуры подипептидных участков, непосредственно взаимодействующих с однонитевой ДНК. Также представляется вероятным, что связывание с ДНК обеспечивается кооперативным действием набора олигонуклеотидных блоков; каждый блок в таком кластере вносит непосредственный вклад в связывание с ДНК, аналогично тому, как это происходит в "ОВ-структурах" ("OB-fold": oligonucleotide-oligosaccharide binding) - ДНК-связывающих участках большинства белков, прочно связывающихся с однонитевой ДНК

2 4 6 8 13 5 7

10 12 14 16 18 20 22 11 13 15 17 19 21 23

2 4 6 8 10 12 14 16 1 3 5 7 9 11 13 15 17

~~ GST-TRX химерные белки*-»

А1

А2

А4

А5

А6

А7

А8

А9

А10

А11

А12

А13

А14

А15

А16

А17

А18

А19

А20

А21

А22 3620Ц

А23 35701

3785I I SET I3969 + 37851 П3867 + 37851 П 3850 +

3785I 13841 3785 □ 3831 3795 ЩО3867 3795 Г~П 3850 3795 Q 3841 3805 Г

SET

+ + + + +

3805Ш3867 3805 О 3850 3805 Щ 3841 3805 □ 3831 381911 8ET 13969 + 3819Ш3867 + 3819QJ3850 +

3819 0 3841 38511 SET 13969 -3841f SET I3969 + 3832 Г 8ЕТ 13969 + 37501 I SET 13969 +

TRX -3726 а.к. —

1 SET 1

Т1 3625ISET 13726 -

Т2 36071 SET ¡3726 -

ТЗ 35971 8ЕТ 13726 -

Т4 3607 ГШ3680 -

Т5 357511 S6T 13726 +

Т6 35511 1 SET 13726 +

Т7 35261 1 SET J3726 +

TR 3342Щ 1 SET 13726 +

Т9 35751 1 SET 3680 -

Т10 35511 1 «3624

Т11 35271 1 S3624

Т12 35271 Ц3607 +

Т13 3342 С 13575 +/-

Т14 3342 С 13551

Т15 3589П SET 13726 -

Т16 3562 П 8E13680 -

Т17 3562 Q13607

ИСХ. I

ДНК (

I SET 13969 + 13969 +

SET

ИСХ. I

ДНК A1

Д . О Д '

XL Л. 22. .11 те. _Г7_ T8

додододододододо

Т9_ Т10 ТП Ш Ш Ш. 111Цб ш о д о д о д о д о д о д од о л о

Рис. 61. Определение участка взаимодействия с одноцепочечной ДНК в составе области SET MLL и триторакса. Фрагменты SET области были экспрессированы в Е. coli как химерные полипептиды, ассоциированные с остатком GST (показаны схемы используемых конструкций). верняя панель - анализ GST-MLL полипептидов в ю% ПАА геле, нижняя панель - анализ связывания с ДНК (условия как на рис 53Б, 56Б).

¡ 8 10 12 14 16 18 20 22 7 9 11 13 15 17 19 21

1 2 3 4 5 6 7 8

E(Z) -760а.к.

I «т I

F1 6ЮСГ ЗЕТ i 760 -

F? 601 ЦП «ЕТ 1760 -

F3 591| | 8ЕТ 1760 -

F4 5811 1 Set |760 -

F5 571| 1 set 1760 +

FR 5591 1 «ЕТ 1 /60 +

F7 5461 1 SET |760 -

F8 5101 1 SET 1760 +

Е9 4801 1 SET 1760 +

ЕЮ Е11 Е12 Е13 Е14 Е15 Е16 Е17 Е18 Е19 Е20 Е21 Е22

ИСХ I

днк1

д о д о

510L 510 П

3610 ]600

5101 1590 5101 1580 510[Щ570 510ЦЦ 560 510П560 480 [

480СП! 550 560 Г

]610

8П710

+ + + + + + + +

Е1

560 □ 600 560 П 590 546ЦЦ 580

Е2 ЕЗ Е4 Е5 Е6 Е7 д о д о" додододо

GST-CLF химерные белки

CLF - 902 а к..

I SET ■

С1 С2 СЗ С4 С5 С6

С7 543 С8

7391 I SET I 889 -730LIC

еюП

720 С 710Ц 675 ПЦ

ЗЕТ I 889 -889 -

SET

~Г~8ЕТ~

SET

3 889 -1889 +

I SET 1889 +

ДНК I CI C2 СЗ C4 C5 C6 C7 C8 д о додододододододо

6ЮС

СЗ

8feT 1902 +

1719 С5 ев

GST-Su(var)39/ г GST-G9a химерные белки

S1 S2 S3 S4 S5 G1 G2 G3

Su(var) 3-9 -635 а к..

E8 E9 ЕЮ E11 E12 E13 E14 E15 д о д о додододододо

Е16 Е17 Е18 Е19 Е20 Е21 Е22 д о д о д о додододо

54 181Г

I SET [ I

485[ SBT П 635 1635 -

~8ET I 1635 -

rG9a -1001 а.к..

424Г

I SÉt I i 635 -

TI1001

G2 G3

751С

I 8ЕТ I "11001 •

801 i I SET П1001 -8511 ЗЕТ П1001 -

ДНК '_Sl__S2 S3 S4 SS G1 G2 СЗ

д о д о додододо до д о д о

Рис. 62. Участки связывания однонитевой ДНК в SET E(z), CI.F, Su(var)39, G9a - см рис. 6l.

12 3 4 5 6 7 8

GST-AsH1 химерные белки

ASH1 -2217 а.к

cz-zz

TsETT

1318C

SET

A2 A3 A4

A5 A6 A7 A8

13181 П1420 13181 I SET 11518

U1597 +

1368 □ 1420 13680

SET

1368 [ГЖ

Ц1518

Z11596

ИСХ I

днк '_A1_ _A2_ jA3_ _A4_ _A5_ A6___

ДЦ 0ЦДЦ0Ц ДЦ ОЦ ДЦ ОЦ ДЦ ОЦ ДЦ оц дц оц дм ом ДЦ ОЦ

1447ЁП1518 1447ЕТ I 11596

Рис. 63. Участок связывания однонитевой ДНК в области SET Ashl. Условия см. рис. 61.

исходи. ДНК

ЯМ ОЦ

S1-1 S1-2

дц оц дц оц

S2-1 S2-2

дц ом дм оц

S7-1 S7-2 S7-2

ДЦ ОЦ дц ОЦ дц оц

SET1 1080 а.к.

I ЗЕТ

S1-1

S1-2 844 SET2 -733 а.к.

930 I SET 11080 +

I SET 11080 +

SET

7Е

110|I SET 1260 I SET П280

ALR1 -5262 а.к.

S2-1 S2-2

nz-

SET

AI-1 AI-2 AI-3 AI-4

дц оц дц оц дц оц дц оц

AI-1 AI-2 AI-3 AI-4

5093О 5077) f

5009£

SET

SET7 -366 а.к.

I SET

S7-1 S7-2 S7-3 1С

1381

Рис. 64. Участки связывания одно-нитевой ДНК в области SET ряда представителей белков группы "SET Domain Proteins". Условия см. рис. 61.

511311 SET 15262 + SET 15262 + SET 15262 4 ]5262 +

2031 ___I SET .1366 -

I SET 1366 -I SET 1366 -

Поскольку не наблюдалось значимой гомологии аминокислотных последовательностей участков связывания однонитевой ДНК различных групп SET-белков, была произведена приблизительная оценка трехмерной структуры этих последовательностей.

Структурное моделирование проводили с помощью соответствующих программ сервера expasy.ch, позволяющих анализировать структурное сходство двух или более белков одновременно. Изучаемые структуры могут быть "наложены" друг на друга для сравнения их активных центров или других интересующих участков. Как матрицы для моделирования использовали белки Clr4 (NCBI# lmvxA, lmvhA), Dims (NCBI# ipegA,ipegB, lmlgA) и SET7 (lMUF, 1N6A, 1N6C), для которых трехмерная конфигурация была установлена ранее с помощью кристаллографии и рентгеноструктурного анализа. Во всех случаях такое моделирование приводило к сходным структурам, как при использовании одной, так и более матриц одновременно. Участки прочного связывания однонитевой ДНК триторакса, MLL, E(z), CLF и Ashi (а.к.: 1368-1429) весьма схожи и показывают наличие специфической конфигурации двух антипараллельных бета-слоев и альфа-спирали (Рис. 65). Сходство полученных структур предполагает, что несмотря на низкий уровень первичной гомологии, пространственная конфигурация ДНК-связывающих областей различных SET-содержащих белков может быть принципиально схожей. Полученные структуры схожи и со структурными элементами аспартил-синтетазы и SSB белка E.coli - двух представителей белков с высокой аффинностью к однонитевой ДНК.

Недавно было показано, что область SET триторакса способна избирательно

связываться с N-концевыми доменами гистонов Нз и такое связывание может модулироваться ковалентными модификациями концевых доменов гистонов. Однако, в настоящей работе было обнаружено, что в случае нативных нуклеосом (рис. 66) и олигонуклеосомных фрагментов (не показано) взаимодействие SET области триторакса с гистонами Нз практически не проявляется. Это предполагает необходимость некоей структурной реорганизации нуклеосомных частиц, чтобы такое связывание могло осуществляться in vivo.

Рис. 66. Область SET триторакса эффективно связывает свободные тетрамеры гистонов Нз и

Н4, но не в составе нуклеосом.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 смесь олигомеров 123 н н. ДНК.

В целом, можно предположить, что SET-содержащие белки могут участвовать in vivo в непосредственном узнавании структур активного хроматина, в которых повышенная доступность отдельных цепей ДНК и концевых доменов гистонов обусловливается функциональной активностью хроматина. Такой механизм может лежать в основе первоначального распознавания статуса активности генов. Связывание SET-области с однонитевой ДНК активных областей хроматина может сохраняется при репликации ДНК и последущей сборке хроматина. Это может объяснить, как информация о статусе активности генов передается по наследству.

2.9- ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В работе проведено комплексное исследование структурно-функциональных зависимостей, лежащих в основе формирования активной структуры хроматина. Совокупность полученных данных предполагает, что транскрипционно-активное состояние хроматина, сохраняющее черты организации хроматина как таковой, но в то же время приобретающее ряд свойств свободной ДНК, формируется в ходе ряда молекулярных перестроек хроматина, осуществляемых за счет "структурного" эффекта ацетилирования гистонов и АТР-зависимых и АТР-независимых факторов перестройки хроматина, действие которых модулируется локальной конформацией ДНК и "сигнальным" эффектом ацетилирования гистонов. Последовательности ДНК, способные принимать "нестандартную" конфигурацию, могут модулировать активность генов за счет перераспределения нуклеосом в регуляторных участках. Факторы гомеотической регуляции генов могут непосредственно узнавать активные локусы хромосом, и, предположительно, прочно связываясь с нитями ДНК, сохранять информацию о статусе активности гена при репликации ДНК

исходные связанные S ГИСГ. +нукл.

Иммобилизованные GST и 151 а.к. С-концевой фрагмент триторакса (GST-SET) инкубировали с равными количествами гистонов (6,7) или изолированных мононуклеосом

эритроцитов кур (8,9), в буфере, содержащем 0.05Ж NP40 и o,iM NaCl. Связанные белки (6-9) промывали буфером, содержащим 0,1% NP40 и 0,6 М NaCl, изолировали и анализировали в 13% ПАА геле. 2,3,4,5 - белковый состав исходных образцов GST, GST-SET, гистонов и нуклеосом, соответственно. Справа

соответственно.

электрофореграммы нуклеосомной ДНК (и) и нативных нуклеосом (12) в 1% геле агарозы. i - смесь маркерных белков (BioRad Broad Range), 10,12-

з. ВЫВОДЫ

1. ДНК транскрипционно-акгавных генов, при сохранении структуры хроматина как таковой, приобретает ряд топологических свойств свободной ДНК. Повышенная конформационная подвижность ДНК активного хроматина - до 8о% от подвижности ДНК в растворе - частично обусловлена повышенной конформационной свободой декомпактизованных нуклеосомных фибрилл. Конформационный потенциал ДНК нуклеосом как таковых, в активном и неактивном хроматине примерно одинаков.

2. Ацетилирование гистонов может регулировать топологию и степень сверхспи-рализации ДНК, модулируя сверхвитки нуклеосом и спирали нуклеосомных волокон за счет изменения пространственной ориентации концевых доменов гистонов. Это предполагает принципиально новый механизм изменения уровня сверхспирализации, а следовательно, и пространственной структуры, ДНК эукариот.

3. При увеличении уровня ацетилировапия гистонов, нуклеосомные волокна декомпактизируются по механизму, сходному с их декомпактизацией при низкой ионной силе среды. "Развернутая" нуклеосомная фибрилла, по сравнению с компактной, обладает существенно более высокой конформационной свободой.

4- Сформулирована концепция взаимосвязи структурных перестроек разных иерархических уровней упаковки ДНК, предполагающая что изменение организации ДНК на одном уровне компактизации должны приводить к изменению организации ДНК других уровней компактизации.

5. Используя хромосомную интеркаляцию in vivo и in vitro, показано (в границах адекватности подхода), что степень компактизации фибрилл хроматина может контролироваться за счет изменения угла вращения между прилежащими нуклеосомами; при этом модификации концевых доменов гистонов являются определяющим фактором пространственной организации нуклеосомной фибриллы. Выявлено две популяции хроматина - предположительно, активная и неактивная, - с разной степенью компактизации, осуществляемой согласно приведенному механизму.

6. С помощью модельной системы на основе минимального промотора вируса саркомы Рауса и химерного белка-активатора á-CREB-типа, показано, что димеризация регуляторных белков с "лейциновой застежкой" ("B-ZIP" proteins) необходима для осуществления кооперативного функционирования (активации или репрессии), но не для кооперативного связывания с ДНК

7. С помощью модельной системы п. 6 показано, что конформационные переходы в ДНК in vivo и in vitro способны "вытеснять" нуклеосомные частицы из района инициации транскрипции, что может быть достаточным для активации гена в отсутствие других регуляторных последовательностей ДНК.

8. Изучена структурная организация и документровано распределение специфических (изогнутых и легкоплавких) фрагментов ДНК в районе инициации репликации á-D глобинового гена кур.

9. Используя бесклеточную систему реконструкции хроматина на основе экстракта эмбрионов дрозофилы, показано, что в "динамическом" хроматине, по сравнению со "статичным", распределение нуклеосом может определяться даже незначительными отличиями конформации ДНК; причем распределение нуклеосом может модулироваться степенью ацетилирования концевых доменов гистонов.

ю. Используя систему п.9 обнаружен принципиально новый тип "энергонезависимых" перестроек протяженных областей хроматина, приводящий к диффузной структуре нуклеосом, высокой конформационной свободе ДНК и увеличению транскрипционного потенциала. Ацетилирование гистонов стимулировало перестройку хроматина - в т. ч. за счет повышенного сродства факторов перестройки к высокоацетилированным гистонам. Механизм инициации структурной перестройки включает дефосфорилирование белковых факторов перестройки хроматина. Представляется вероятным, что описываемая перестройка хроматина является одним из этапов активации хроматина. Прямая связь ацетилирования гистонов и перестроек хроматина может обусловливать детерминацию молекулярной гетерогенности доменов хроматина in vivo.

11. В области SET факторов гомеостатической регуляции генов обнаружен домен,

способный прочно, но обратимо, связываться со структурами активного хроматина -однонитевыми структурами ДНК и РНК, транскрибируемой и сверхспиральной ДНК. SET область факторов гомеотической регуляции генов также способна прочно связывать гистоны Н3/Н4 в виде свободного тетрамера, но не в составе нуклеосом, что указывает на необходимость структурных перестроек нуклеосом для прочного связывания с SET-содержащими белками. Это предполагает, что SET-содержащие факторы гомеотической регуляции генов могут непосредственно узнавать активные локусы хромосом, и, предположительно, прочно связываясь с нитями ДНК, сохранять информацию о статусе активности гена при репликации ДНК.

12. Разработана простая и легковоспроизводимая методика анализа структуры и динамики фибрилл хроматина с помощью электрофореза в гелях агарозы низкой плотности. Методика может служить альтернативой существенно более трудо- и капиталоемкому методу высокоскоростного центрифугирования в градиентах плотности /вязкости.

13. Для применения в генной терапии, создании трансгенов, предложен способ активации внедренных генетических конструкций за счет локального разрушения структуры хроматина с помощью олигонуклеотидных инсерций, способных принимать нестандартную конформацию. Подход может послужить основой для конструирования гиперактивных генетических конструкций, способных обусловливать высокий уровень тканене-специфичной экспрессии при внедрении в геном эукариотических клеток.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

МЕЖДУНАРОДНЫЕ РЕЦЕНЗИРУЕМЫЕ ЖУРНАЛЫ.

1. Krajewski, W.A and Luchnik, A.N. "Relationship of histone acetylation to DNA topology and transcription.* (1991), Mol. Gen. Genet., 230,442-448.

2. Krajewski, W.A and Luchnik, A.N. "High rotational mobility of DNA in animal cells and its modulation by histone acetylation." (1991), Mol. Gen. Genet., 231,17-21.

3. Krajewski, W.A and Razin, S.V. (1992) "Organization of specific DNA sequence elements in the region of the replication origin and matrix attachment site in the chicken alpha- globin gene domain." Mol. Gen. Genet., 235,381-388.

4. Krajewski, W.A, Panin, V.M., Krylov, D.Yu. and Razin, S.V. (1993) "Flexibility of DNA within transcriptionally active nucleosomes: analysis by circular dichroism measurements." Biomol. Struct Dyn., 10,1001-1012.

5. Krajewski, W.A, Panin, V.M. and Razin, S.V. (1993) "A simple and reproducible method for analysis of chromatin condensation." Biochem. Biophys. Res. Comm., 193,113-118.

6. Krajewski, W.A., Panin, V.M and Razin, S.V. (1993) "Dynamics of unfolded nucleosomal fiber." J. Biomol. Struct Dyn., 10,1013-1022.

7. Krajewski, W.A., Panin, V.M. and Razin, S.V. (1993) "Acetylation of core histones causes the unfolding of 30 nm chromatin fiber: analysis by agarose gel-electrophoresis." Biochem. Biophys.Res. Comm., 196,455-460.

8. Krajewski, W.A. and Razin, S.V. (1993) "REVIEW:DNA-protein interactions and spatial organization of DNA "Mol. Biol. Reports, 18,167-175.

9. Krajewski, W.A and Lee, K.A.W. (1994) "A monomelic derivative of the cellular transcription factor CREB functions as a constitutive activator." Mol. Cell. Biol. 14,7204-7210.

10. Krajewski, W.A. (1995) "Alterations in the internucleosomal DNA helical twist in chromatin of human eiythroleukemia cells in vivo influences the chromatin higher-order folding." FEBS Lett. 361,149-152.

11. Krajewski, W.A. (1995) "Alternating purine-pyrimidine tract activates transcription from the Rous sarcoma virus LTR lacking promoter and enhancer elements. FEBS Lett. 358,13-16.

12. Krajewski, W.A. (1996) "Effect of nonenzymatic histone acetylation on chromatin highorder folding." Biochem. Biophys. Res. Comm., 221, 295-299.

13. Krajewski, W.A. (1996) "Enhancement of transcription by short alternating C.G tracts incorporated within a Rous sarcoma virus-based chimeric promoter: in vivo studies." Mol. Gen. Genet. 252, 249-254.

14- Krajewski, W.A and Ausio, J. (1996) "Modulation of the higher-order folding of chromatin by deletion of histone H3 and H4 terminal domains." Biochem. J. 316,395-400.

15. Krajewski, W.A. and Ausio, J. (i997)"Relationship between chromatin high-order folding

and nucleosomal linker twist in nuclei of human HeLa cells." J. Biomol. Struct Dyn., 14, 64164916. Krajewski, W.A. and Becker, P.B. (1998) "Reeonstitution of hyperacetylated, DNase I-sensitive chromatin characterised by high conformational flexibility of nucleosomal DNA." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,1540-1545.

17. Krajewski, W.A. and Becker, P.B. (1999) "Reeonstitution and analysis of hyperacetylated chromatin." Chromatin Protocols (Ed P.B.Becker) PP207-217, Methods in Molecular Biology 119, Humana Press.

18. Krajewski, W.A. (1999) "Effect of in vivo histone hyperacetylation on the state of chromatin fibers." J. Biomol. Struct. Dyn., 16,1097-1106

19. Krajewski, W.A. (1999) "Chromatin structural transitions in Drosophila embiyo cell-free extract result in a high conformational flexibility of nucleosomal DNA." FEBS Lett. 452, 215218.

20. Krajewski, W.A. (2000) "Histone hyperacetylation facilitates chromatin remodelling in Drosophila embryo cell-free system." Mol. Gen. Genet. 263,38-47.

21. Krajewski, W.A. (2002) "Histone acetylation status and DNA sequence modulate ATP-dependent nucleosome repositioning". J. Biol. Chem. 277,14509-14513.

22. Krajewski, W.A. Nakamura, Т., Mazo, A., Canaani, E. (2005) "A motif within SET-domain proteins binds single stranded nucleic acids, transcribed and supercoiled DNAs, and can interfere with assembly of nucleosomes." Mol.Cell.Biol. 25,1891-1899.

РОССИЙСКИЕ РЕЦЕНЗИРУЕМЫЕ ЖУРНАЛЫ

23. B.A. Краевский, A.H. Лучник, Г.П. Георгиев "Колебательные изменения транскрипции и сверхспирализации минихромосомной ДНК после удаления масляной кислоты из культуры клеток мыши." Докл. Акад. Наук СССР (1989) 309(4), 1008-1011

24. В.А. Краевский, А.Н. Лучник "Высокая свобода вращения ДНК в хроматине животных клеток и ее подавление при ацетилировании гистонов." Докл. Акад. Наук СССР (1991) 318(4), 1002-1006

25. В .А. Краевский, А.И. Кварцхава, В.Михайлов, С.В.Разин "Изгиб ДНК в области участка начала репликации домена ¿-глобиновых генов кур" Докл. Акад. Наук (1992) 322,780-782

26. В.А. Краевский, А.Н. Лучник, Г.П. Георгиев "Связь топологии ДНК и ацетилирования гистонов." Докл. Акад. Наук (1992) 322(4), 783-785

27. В.А. Краевский, Д.Ю. Крылов, С.В. Разин, B.C. Михайлов "Ограничение конформационной подвижности ДНК сохраняется в составе транскрипционно-активных нуклеосом." Докл. Акад. Наук (1992) 326(2), 380-383

28. В.А. Краевский, B.C. Михайлов, С.В. Разин "ОБЗОР: Пространственная организация и конформационная подвижность ДНК в составе нуклеопротеидных комплексов." Молекулярная Биология (1992) 26(4), 745-756

29. В.А. Краевский, B.C. Михайлов, С.В. Разин "Стабильно изогнутые и легкоплавкие последовательности ДНК в участке начала репликации доменов а-глобиновых генов кур." Молекулярная Биология (1992) 26(5), 1011-1021

30. В.А. Краевский, В.Панин, С.Разин "Метод электрофореза в гелях агарозы низкой плот-ности для анализа процесса конденсации хроматина." Докл. Акад. Наук (1993) 331, 366-368

31. В А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин "Конденсация нуклеосомной фибриллы при повышении температуры." Докл. Акад. Наук (1993) 332(3). 375"377

32. В .А. Краевский, Д.Ю. Крылов, С.В. Разин, B.C. Михайлов "Анализ конформационной подвижности ДНК в транскрипционно-активном хроматине."Биофизика (1993) 38,108-116

33. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин "Увеличение степени ацетилирования гистонов нуклеосомного кора приводит к "разворачиванию"зо-нм нуклеосомной фибриллы." Докл. Акад. Наук (1994) 334(1), 109-111

34. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин "Изучение процесса деконденсации хроматина с помощью электрофореза в гелях агарозы низкой плотности. Молекулярная Биология (1994) 28(1), 76-81

35. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин "Ацетилирование гистонов in vitro вызывает декомпактизацию хроматина." Биофизика (iq<m) 39(4). 613-618

36. ВА. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин "Зависимость процесса конденсации хроматина от температуры и ионной силы среды: исследование с помощью гель-электрофореза в агарозе низкой плотности." Биофизика (1994) 39(4). 619-627

37. В .А. Краевский, МА Гращук "Влияние специфической последовательности промотора на фазирование нуклеосом" Докл. Акад. Наук (1996) 346(3) 403-406.

38. В А. Краевский, В.М. Панин, НА. Веретенников "Пурино-пиримидиновый тракт активирует транскрипцию минимального ретровирусного промотора" Докл. Акад. Наук (1996) 346(4), 555-55739. В .А. Краевский, B.C. Прасолов "Влияние специфических олигонуклеотидных

инсерций на активность химерного ретровирусного промотора in vivo." Докл. Акад. Наук (1996) 351(5), 695-621.

40. ВА. Краевский, В.М. Панин, НА Веретенников "Влияние специфических нуклеотидных последовательностей на транскрипционную активность длинных концевых повторов ретровирусов птиц." Генетика (1996) 32(3), 341-347

41. В А Краевский "Влияние неканонических структур ДНК на экспрессию химерного гена в клетках эукариот: исследование in vivo. Молекулярная Биология (1996) 30,1086-Ю95

42. В.А Краевский, В.М. Панин "Взаимосвязь иерархических уровней компактизации как основа функциональной организации хроматина." Биофизика (1997) 42,864-873

43. ВА Краевский "Стабильность хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы. Молекулярная Биология (1998) 32 (6), 1044-1049.

44. ВА. Краевский "Топологические характеристики хроматина в бесклеточной системе эмбрионов Дрозофилы. Молекулярная Биология (1998) 32 (6), 1049-1055.

45. В.А Краевский, B.C. Прасолов "Исследование структурных перестроек хроматина в бесклеточной системе эмбрионов Дрозофилы." Докл. Акад. Наук (1999) 365,547-550.

46. В.А. Краевский, B.C. Прасолов "Исследование конформационной подвижности хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы." Докл. Акад. Наук (1999) 365, 693-696.

47. В.А Краевский, B.C. Прасолов "Влияние ацетилирования гистонов на топологические характеристики хроматина в бесклеточной системе эмбрионов Дрозофилы." Докл. Акад. Наук (1999) 366 (2) 258-261.

48. ВА Краевский, B.C. Прасолов "Сравнительный анализ высших уровней организации нормального и гиперацетилированного хроматина." Докл. Акад. Наук (1999) 366(4) 557-560.

49. В.А Краевский "Стабильность нормального и гиперацетилированного хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы. Молекулярная Биология(1999) 33,750-757.

50. В.А Краевский "Исследование структурной организации фибрилл нормального и гиперацетилированного хроматина Биофизика (1999) 44(5) 842-851.

51. ВА. Краевский, М.А Лагарькова, Н.П. Шарова, С.Д.Оголяров, Аузио, X. "Исследование влияния концевых доменов гистонов на структурные перестройки хроматина." Докл. Акад. Наук (2001) 377(6) 828-830.

52. В.А Краевский, МА Лагарькова, Н.П. Шарова, С.Д.Столяров, Аузио, X. "Исследование структурных перестроек хроматина с помощью интеркалирующих красителей." Докл. Акад. Наук (2001) 378(1) 108-110.

53. В.А Краевский, МЛагарькова, Аузио, X. "Исследование перестроек фибрилл хроматина с помощью интеркаляции этидия и дифосфата хлороквина." Биофизика (2004), 49(3), 457-467.

А ТАКЖЕ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ В СОТРУДНИЧЕСТВЕ:

54. Petruk,S., Sedkov,Y., Smith,S., TiUib.S., Kraevski.V., Nakamura,T., Canaani,E., Croce.C.M., and MazoA- (2001) Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. Science 294,1331-1334

55. Nakamura,T., Mori,Т., Tada,S., Krajewski,W., Rozovskaia.T., Wassell,R., MazoA., Croce, C. and Canaani,E. (2002) "The ALL-i protein is a histone methyltransferase and assembles a supercomplex of proteins involved in transcriptional regulation" Mol. Cell, 10,1119-1128.

56. S. Petruk, Y.Sedkov, S.Smith, W.Krajewsld, T.Nakamura, E.Canaani, C.M.Croce and A Mazo. (2003) Purification and Biochemical. Properties of the Drosophila TACi Complex. Methods in EnzymoloRy, 377, 255-266.

РНБ Русский фонд

2007^4 6567

Подписано в печать 13.04.2005 Объем 3.0 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 60 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992, г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

09 ИЮЙ 2005

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Краевский, Владислав Александрович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Пространственная организация ДНК в нуклеопротеидных комплексах.:.

2.1.1. Пространственная организация ДНК в ядрах клеток.

2.1.2. Пространственная структура ДНК и регуляция работы генома.

• 2.1.3. Значение пространственной организации ДНК для функционирования регуляторных систем.

2.1.4. Конформация ДНК и строение хроматина.

2.2. Структура, динамика, молекулярные перестройки хроматина.

2.2.1. Конформационная подвижность ДНК в хроматине.

2.2.2. Молекулярные механизмы, повышенной конформационной подвижности ДНК в хроматине.

2.2.3. Влияние ацетилирования гистонов на организацию и молекулярные перестройки хроматина.

2.2.4. Перестройки структуры хроматина макромолекулярными белковыми комплексами.

2.3. "Нестандартные" структуры ДНК и их роль в функционировании ДНК эукариот.

2.4. Взаимосвязь структурных перестроек разных уровней упаковки

ДНК, как основа функциональной организации хроматина.

2.4.1. Иерархическая структура организации хроматина.

2.4.2. Динамика ковалентно замкнутой молекулы ДНК.

2.4.3. Молекулярный механизм взаимосвязанных структурных перестроек нуклеосомной фибриллы.

2.4.4. Структурная иерархия хроматина и функционирование регуляторных систем.

2.4.5. Перестройки структуры хроматина при изменении осевой закрутки межнуклеосомных линкеров.

2.5. Контроль перестроек хроматина 'SET' белками гомеостатической регуляции активности генов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Анализ топологии минихромосомной ДНК.

3.2. Неэнзиматическое ацетилирование гистонов; электро-форетический анализ уровня ацетилирования гистонов.

3.3. Изолирование"транскрипционно-активных" нуклеосом, анализ спектров кругового дихроизма (КД) ДНК.

3.4. Анализ конформации фибрилл хроматина с помощью электрофореза в гелях агарозы низкой плотности.

3.5. Исследование молекулярных перестроек хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы.

3.5.1. Приготовления цитоплазматического экстракта эмбрионов дрозофилы.

3.5.2. Приготовление гистонов и реконструкция хроматина.

3.5.3. Анализ реконструированного хроматина.

3.5.4. Упрощенная методика получения нуклеосомных частиц.

3.5.5. Структурные перестройки реконструированного и изолированного хроматина.

3.6. Исследование влияния структур ДНК на экспрессию модельного гена и локальные перестройки хроматина.

3.6.1. Приготовление плазмидных ДНК, фрагментов ДНК.

3.6.2. Трансфекция эукариотических клеток, анализ активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы.

3.6.3. Приготовление экстрактов ядер и проб для белка-активатора.

3.6.4. Реконструкция нуклеосом на промоторе модельного гена и in vitro транскрипция полученных матриц.

3.6.5. Анализ структуры хроматина химерных промоторов.

3.7. Выявление изогнутых и легкоплавких последовательностей ДНК.

3.8. Исследование фибрилл хроматина с помощью интеркаляторов.

3.8.1. Культуры клеток и индукция гиперацетилирования гистонов.

3.8.2. Интеркаляции дифосфата хлороквина в клетках культуры.

3.8.3. Трипсинолиз концевых доменов гистонов изолированных ядер.

3.8.4. Интеркаляция бромистого этидия в изолированных ядрах.

3.8.5. Анализ хроматина фиксированных ядер.

3.9. Исследование ДНК-белковых взаимодействие области SET факторов гомеостатической регуляции генов.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Взаимосвязь ацетилирования гистонов, топологии и конфор-мационной подвижности ДНК модельной минихромосомы.

4.1.1. Координированное изменение ацетилирования гистонов и сверхспирализации минихромосомной ДНК in vivo.

4.1.2. Неэнзиматическая модификация гистонов in vitro.;.

4.1.3. Высокая конформационная подвижность ДНК транскрип ционно-активной минихромосомы высших эукариот.

4.2. Конформационная подвижность ДНК в нуклеосомах транскрйпционно-активного хроматина.

4.2.1. Изолирование "транскрипционно-активных нуклеосом".'.

4.2.2. Спектры кругового дихроизма нуклеосом.

4.3. Конформационная подвижность и перестройки фибрилл хроматина. Электрофорез в гелях агарозы низкой плотности.

4.3.1. Электрофоретический анализ фибрилл хроматина.

4.3.2. Конформационная подвижность нуклеосомных фибрилл.

4.3.3. Реорганизация фибрилл при ацетилировании гистонов.

4.4. Структура и молекулярные перестройки хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы.

4.4.1. Структурные перестройки реконструированного хроматина.

4.4.2. Топологические перестройки реконструирован, хроматина.

4.4.3. Перестройки высокоацетилированного хроматина.

4.4.4. Структурные перестройки изолированных мононуклеосом.

4.4.5. Включение гистонов HI в высокоацетилированый хроматин.

4.5. Влияние последовательности ДНК на локальные перестройки и транскрипционную активность хроматина.

4.5.1. Влияние последовательности ДНК,ацетилирования гистонов на перегруппировки нуклеосом в "динамичном" хроматине.

4.5.2. Влияние неканонических структур ДНК на перестройки хроматина и экспрессию химерного гена in vivo.

4.5.3. Влияние неканонических структур ДНК на конститутивную активность LTR вируса саркомы Рауса.

4.5.4. Влияние олигомеров (CG) на эффективность промотора вируса саркомы Рауса в клетках различных типов.

4.5.5. Краткое описание модели. Конститутивная активация промотора на основе LTR вируса саркомы Рауса мономерным фактором CREB.

4.5.6. Распределение специфических последовательностей ДНК в участке начала репликации домена á-глобиновых генов кур.

4.6. Исследование хроматина с помощью интеркаляторов.

4.6.1. Интеркаляция дифосфата хлороквина в клетках in vivo.

4.6.2. Интеркаляция бромистого этидия в ядрах клеток in vitro.

4.6.3. Исследование хроматина с модификациями гистонов.

4.6.4. Исследование фибрилл высокоацетилированного хроматина in vivo при интеркаляции дифосфата хлороквина.

4.6.5. Исследование пространственной организации концевых доменов гистонов высокоацетилированного хроматина.

4.7. Взаимодействие "SET" области факторов гомеостатической регуляции генов со структурами активного хроматина.

4.7.1 .Область SET прочно связывает однонитевые субстраты ДНК.

4.7.2. Область SET поддерживает связывание с однонитевой ДНК при высокой концентрации NaCl и хаотропных агентов.

4.7.3. Область SET MLL поддерживает взаимодействие с однонитевой ДНК при сборке "динамического" хроматина.

4.7.4. Мутация ZI 1 в области SET триторакса препятствует прочному связыванию с однонитевой ДНК.

4.7.5. Определение участков связывания однонитевой

ДНК в SET области ряда белков 'SET'-группы.

4.7.6. Оценка пространственной структуры участков связывания однонитевой ДНК в 'SET' области.

4.7.7. Область SET триторакса прочно связывается с свободными тетрамерами гистонов НЗ-Н4, но не нуклеосомами.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Взаимосвязь ацетилирования гистонов, топологии и конфор-мационной подвижности ДНК эндогенной минихромосомы.

5.2. Конформационная подвижности ДНК "транскрипционно-активных" нуклеосом и нуклеосомных фибрилл.

5.3.Перестройки фибриллы хроматина при ацетилировании гистонов.

5.4. Структура и молекулярные перестройки высокоацетилированного хроматина в бесклеточной системе эмбрионов дрозофилы.

5.5. Влияние последовательности ДНК и ацетилирования гистонов на распределение нуклеосом в "динамическом" хроматине.

5.6. Распределения специфических последовательностей ДНК в участке начала репликации домена а-глобиновых генов кур.

5.7. Влияние неканонических структур ДНК на локальные перестройки и транскрипционную активность хроматина.

5.8. Структура и перестройки хроматина при изменении конформации межнуклеосомной ДНК.

5.9. Взаимодействие специфических структур активного хроматина с "SET" областью белков гомеостатической регуляции генов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные перестройки хроматина и их роль в регуляции дифференциальной экспрессии генов в ходе развития"

Характер упаковки ДНК в ядрах эукариотических клеток является критическим и, зачастую, доминирующим фактором уровня активности генов. Структурной единицей хроматина является нуклеосомная частица, состоящая из фрагмента ДНК длиной 145 п. н. "навитого" на октамер гисто-новых белков. В ходе дальнейшей компактизации нить нуклеосом последовательно образует фибриллу диаметром 25-34 нм, филаменты 200-300 нм, петли хроматина и сверхспирали хроматид. Полностью упакованная ДНК имеет жесткую, статичную структуру несовместимую с ее функциональной активностью. Если структура хроматина как таковая, изучена достаточно подробно, то механизмы перестроек хроматина при активации генов остаются неясными. Практически неизвестны молекулярные основы возникновения, поддержания и наследуемости стабильного профиля экспрессии генов в ходе развития, что является центральной проблемой биологии развития, молекулярной биологии и молекулярной генетики. Изучение молекулярных механизмов упаковки хроматина необходимо и для направленного манипулирования дифференциальной экспрессией эукариотического генома. В целом, предполагается, что в ходе активации генов структура хроматина, сохраняясь как таковая, претерпевает существенные изменения. Однако природа этих структурных перестроек, их молекулярный механизм и непосредственная роль в регуляции генома, остаются неясными. Предлагаемая работа проводилось в попытке прояснить некоторые структурно-функциональные аспекты перестроек хроматина и их роли в регуляции дифференциальной экспрессии генома эукариотических клеток в ходе развития.

Работа была поддержана грантами РФФИ #98-04-48138, 01-04-48469. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения и списка литературы. Работа изложена на 245 страницах и содержит 106 рисунков и 1 таблицу. Список литературы включает 518 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Краевский, Владислав Александрович

6. ВЫВОДЫ

1. ДНК транскрипционно-активных генов, при сохранении структуры хроматина как таковой, приобретает ряд топологических свойств свободной ДНК. Повышенная конформационная подвижность ДНК активного хроматина - до 80% от подвижности ДНК в растворе - частично обусловлена повышенной конформационной свободой декомпактизованных нуклеосомных фибрилл. Конформационный потенциал ДНК нуклеосом как таковых, в активном и неактивном хроматине примерно одинаков.

2. Ацетилирование гистонов может регулировать топологию и степень сверхспирализации ДНК, модулируя сверхвитки нуклеосом и спирали нуклеосомных волокон за счет пространственной ориентации концевых доменов гистонов. Это предполагает принципиально новый механизм изменения уровня сверхспирализации, а следовательно, и пространственной структуры, ДНК эукариот.

3. При увеличении уровня ацетилировании гистонов, нуклеосомные волокна декомпактизируются по механизму, сходному с их декомпактизацией при низкой ионной силе среды. "Развернутая" нуклеосомная фибрилла, по сравнению с компактной, обладает существенно более высокой конформационной свободой.

4. Сформулирована концепция взаимосвязи структурных перестроек разных иерархических уровней упаковки ДНК, предполагающая что изменение организации ДНК на одном уровне компактизации должны приводить к изменению организации ДНК других уровней компактизации.

- предположительно, активная и неактивная, - с разной степенью компактизации, осуществляемой согласно приведенному механизму.

6. С помощью модельной системы на основе минимального промотора вируса саркомы Рауса и химерного белка-активатора á-CREB-типа, показано, что: димеризация регуляторных белков с "лейциновой застежкой" ("B-ZIP" proteins) необходима для осуществления кооперативного функционирования (активации или репрессии), но не для кооперативного связывания с ДНК.

7. С помощью модельной системы п. 6 показано, что конформационные переходы в ДНК in vivo и in vitro способны "вытеснять" нуклеосомные частицы из района инициации транскрипции, что может быть S достаточным для активации гена в отсутствие других регуляторных последовательностей ДНК.

10. Используя систему п.9 обнаружен принципиально новый тип "энергонезависимых" перестроек протяженных областей хроматина, приводящий к диффузной структуре нуклеосом, высокой конформационной свободе ДНК и увеличению транскрипционного потенциала. Ацетилирование гистонов стимулировало перестройку хроматина - в т. ч. за счет повышенного сродства факторов перестройки к высокоацетилированным гистонам. MexáHH3M инициации структурной перестройки включает дефосфорилирование белковых факторов перестройки хроматина. Представляется вероятным, что описываемая перестройка хроматина является одним из этапов активации хроматина. Прямая связь ацетилирования гистонов и перестроек хроматина может обусловливать детерминацию молекулярной гетерогенности доменов хроматина in vivo.

11. В области SET факторов гомеостатической регуляции генов обнаружен домен, способный прочно, но обратимо, связываться со структурами активного хроматина - однонитевыми структурами ДНК и РНК, транскрибируемой и сверхспиральной ДНК. SET область факторов гомеотической регуляции генов также способна прочно связывать гистоны НЗ/Н4 в виде свободного димера, но не в составе нуклеосом, что предполагает необходимость структурных перестроек нуклеосом для прочного связывания с SET-содержащими белками. Это предполагает, что SET-содержащие факторы гомеотической регуляции генов могут непосредственно узнавать активные локусы хромосом, и, предположительно, прочно связываясь с нитями ДНК, сохранять информацию о статусе активности гена при репликации ДНК.

13. Для применения в генной терапии, создании трансгенов, предложен способ активации внедренных генетических конструкций за счет локального разрушения структуры хроматина с помощью олигонуклеотидных инсерций, способных принимать нестандартную конформацию. Подход может послужить основой для конструирования гиперактивных генетических конструкций, способных обусловливать высокий уровень тканенеспецифичной экспрессии при внедрении в геном эукариотических клеток.

5.10. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В работе проведено комплексное исследование структурно-функциональных зависимостей, лежащих в основе формирования активной структуры хроматина. Совокупность полученных данных предполагает, что транскрипционно-активное состояние хроматина, сохраняющее черты организации хроматина как таковой, но в то же время приобретающее ряд свойств свободной ДНК, формируется в ходе ряда молекулярных перестроек хроматина, осуществляемых за счет "структурного" эффекта ацети-лирования гистонов и АТР-зависимых и АТР-независимых факторов перестройки хроматина, действие которых модулируется локальной конформа-цией ДНК и "сигнальным" эффектом ацетилирования гистонов. Последовательности ДНК, способные принимать "нестандартную" конфигурацию, могут модулировать активность генов за счет перераспределения нуклео-сом в регуляторных участках. Факторы гомеотической регуляции генов могут непосредственно узнавать активные локусы хромосом, и, пред-положительно, прочно связываясь с нитями ДНК, сохранять информацию о статусе активности гена при репликации ДНК.

Основные публикации:

1. Krajewski, W.A., Luchnik, A.N. (1991), Mol. Gen. Genet., 230,442-448.

2. Krajewski, W.A., Luchnik, A.N. (1991), Mol. Gen. Genet., 231, 17-21.

3. Krajewski, W.A., Razin, S.V. (1992) Mol. Gen. Genet., 235, 381-388.

4.Kjajewski,W.A.,Panin,V.M.,Krylov,DY.,R^

5. Krajewski, W.A., Panin,VM., Razin,SV. (1993) Biochem. Biophys.Res Comm., 193,113-118.

6. Krajewski, W.A., Panin, V.M., Razin, S.V. (1993) J. Biomol. Struct. Dyn., 10,1013-1022.

7. Krajewski, W.A., Panin,VM., Razin,S.V. (1993) Biochem.Biophys.Res.Comm.,\96,455-460.

8. Krajewski, W.A., Razin, S.V. (1993) Mol. Biol. Reports, 18,167-175.

9. Krajewski, W.A., Lee, K.A.W. (1994) Mol. Cell. Biol. 14, 7204-7210.

10. Krajewski, W.A. (1995) FEBS Lett. 358,13-16.

11. Krajewski, W.A. (1995) FEBS Lett. 361, 149-152.

12. Krajewski, W.A. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm., 221,295-299.

13. Krajewski, W.A. (1996) Mol. Gen. Genet. 252,249-254.

14. Krajewski, W.A., Ausio, J. (1996) Biochem. J. 316,395-400.

15. Krajewski, W.A., Ausio, J. (1997) J. Biomol. Struct. Dyn., 14, 641-649.

16. Krajewski, W.A., Becker, P.B. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 95, 1540-1545.

17. Krajewski, W.A. and Becker, P.B. (1999) Chromatin Protocols (Ed P.B.Becker) pp207-217, Methods in Molecular Biology 119, Humana Press.

18. Krajewski, W.A. (1999) J. Biomol. Struct. Dyn., 16,1097-1106

19. Krajewski, W.A. (1999) FEBS Lett. 452,215-218.

20. Krajewski, W.A. (2000) Mol. Gen. Genet. 263,38-47.

21. Krajewski, W.A. (2002) J. Я/о/. СЛе/я. 277, 14509-14513

22. Krajewski, W.A. Nakamura, Т., Mazo, A., Canaani, E. (2005) Mol.Cell.Biol. 25,1891-1899

23.В.А.Краевский, АН.Лучник,Г.П.Георгиев Докл.Акад.Наук СССР (1989)309,1008-1011

24. В.А. Краевский, А.Н. Лучник "Докл. Акад. Наук СССР (1991) 318,1002-1006

25. В.А.Краевский,А.Кварцхава,В.Михайлов,СВ.?гвикДокл.Акад.Наук(\992)322,780-782

26. В. А. Краевский, А.Н. Лучник, Г.П. Георгиев Докл. Акад. Наук (1992) 322,783-785

27. В.А.Краевский, Д.Ю.Крылов,С.Разин,В .Михайлов Докл. Акад. Наук(1992) 326,380-383

28. В.А. Краевский, B.C. Михайлов, С.В. Разин Молекулярная Биология (1992)26,745-756

29. В.А. Краевский, В. Михайлов, С. Разин Молекулярная Биология (1992) 26,1011-1021

30. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин Докл. Акад. Наук (1993) 331, 366-368

31. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин Докл. Акад. Наук (1993) 332, 375-377

32. В.А. Краевский, Д.Ю. Крылов, СВ. Разин,В.С Михайлов Биофизика (1993)38,108-116

33. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин Докл. Акад. Наук (1994) 334,109-111

34. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин Молекулярная Биология (1994) 28, 76-81

35. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин Биофизика (1994) 39, 613-618

36. В.А. Краевский, В.М. Панин, С.В. Разин Биофизика (1994) 39, 619-627

37. В.А. Краевский, М.А. Гращук Докл. Акад. Наук (1996) 346, 403-406.

38. В .А. Краевский, В.М. Панин, Н.А. Веретенников Докл. Акад. Наук (1996)346,555-557.

39. В.А. Краевский, B.C. Прасолов Докл. Акад. Наук (1996) 351, 695-621.

40. В.А. Краевский, В.М. Панин, Н.А. Веретенников Генетика (1996) 32, 341-347

41. В.А. Краевский Молекулярная Биология (1996) 30,1086-1095

42. В.А. Краевский, В.М. Панин Биофизика (1997) 42, 864-873

43. В.А. Краевский Молекулярная Биология (1998) 32,1044-1049.

44. В.А. Краевский Молекулярная Биология (1998) 32,1049-1055.

45. В.А. Краевский, B.C. Прасолов Докл. Акад. Наук (1999) 365, 547-550.

46. В.А. Краевский, B.C. Прасолов Докл. Акад. Наук (1999) 365, 693-696.

47. В.А. Краевский, B.C. Прасолов Докл. Акад. Наук (1999) 366, 258-261.

48. В.А. Краевский, B.C. Прасолов Докл. Акад. Наук (1999) 366, 557-560.

49. В.А. Краевский Молекулярная Биология (1999) 33, 750-757.

50. В.А. Краевский Биофизика (1999) 44. 842-851.

51. В.А. Краевский, М.А. Лагарькова, X. Аузио. Докл. Акад. Наук (2001) 377, 828-830.

52. В.А. Краевский, М.А. Лагарькова, X. Аузио. Докл. Акад. Наук (2001) 378,108-110.

53. В.А. Краевский, М.А. Лагарькова, X. Аузио. Биофизика (2004) 49,457-467. а также следующие работы в сотрудничестве:

1. Petruk,S., Sedkov,Y., Smith,S., Tillib,S., Kraevsk^V^ Nakamura,Т., Canaani,E., Croce,C.M., and Mazo,A. (2001) Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene. Science 294,1331-1334

2. Nakamura,Т., Mori,Т., Tada,S., Krajewski,W., Rozovskaia,T., Wassell,R., Mazo,A., Croce, C. and Canaani,E. (2002) "The ALL-1 protein is a histone methyltransferase and assembles a supercomplex of proteins involved in transcriptional regulation" Mol. Cell, 10,1119-1128.

3. S. Petruk, Y.Sedkov, S.Smith, W.Krajewski, T.Nakamura, E.Canaani, C.M.Croce and A. Mazo. (2003) Purification and Biochemical Properties of the Drosophila TAC1 Complex. Methods in Enzymology, 377,255-266.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Краевский, Владислав Александрович, Москва

1. Hahn, S., Hendrickson, W., Schleif, R. Transcription of Escherichia coli ara in vitro. The cyclic AMP receptor protein requirement for PBAD induction that depends on the presence and orientation of the ara02 site // J.Mol.Biol.-1986.-V.188.-P.355-367.

2. Lobell, Я В., Schleif, R. F. DNA looping and unlooping by AraC protein // Science -1990. -V. 250. -P. 528-532.

3. Choy, H. E, Adhya, S. Control of gal transcription through DNA looping: inhibition of the initial transcribing complex // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1992. -1989. -V. -P. 11264-11268.

4. Eismann, E. R., Muller Hill, B. lac repressor forms stable loops in vitro with supercoiled wild- type lac DNA containing all three natural lac operators // J.Mol.Biol. -1990.-V. 213.-P. 763-775.

5. Kramer, H., Amouyal, M., Nordheim, A., Muller Hill, B. DNA supercoiling changes the spacing requirement of two lac operators for DNA loop formation with lac repressor//EMBO J. -1988. -V. 7. -P. 547-556.

6. Benham, C. J., Savitt, A. G., Bauer, W. R. Extrusion of an Imperfect Palin-drome to a Cruciform in Superhelical DNA: Complete Determination of Energetics Using a Statistical Mechanical Model //J.Mol.Biol. -2002. -V. 316. -P. 563-581.

7. Greenstein, D., Horiuchi, K. Double-strand cleavage and strand joining by the replication initiator protein of filamentous phage fl // J.Biol.Chem. -1989. -V. 264. -P. 12627-12632.

8. Jongstra, J., Reudelhuber, T. L., Oudet, P., Benoist, C., Jeltsch, J. M., Mathis, D. J., Chambon, P. Induction of altered chromatin structures by simian virus 40 enhancer and promoter elements //Nature -1984. -V. 307. -P. 708-714.

9. Dailey, L„ Caddie, M. S., Heintz, N., Heintz, N. H. Purification of RIP60 and RIP 100, mammalian proteins with origin- specific DNA-binding and ATP-dependent

10. DNA helicase activities // Mol.Cell Biol. -1990. -V. 10. -P. 6225-6235.

11. Abbotts, A. P., Stow, N. D. The origin-binding domain of the herpes simplex virus type 1 UL9 protein is not required for DNA helicase activity // J.Gen.Virol. -1995. -V. 76.-P. 3125-3130.

12. Calder, J. M., Stow, N. D. Herpes simplex virus helicase-primase: the UL8 protein is not required for DNA-dependent ATPase and DNA helicase activities // Nucleic.Acids.Res. -1990. -V. 18. -P. 3573-3578.

13. Bell, P. C., Dutta, A. DNA replication in eukaryotic cells // Annu.Rev.Biochem. -2002. -V. 71. -P. 333-374.

14. McKnight, S. L., Miller, O. L. J. Electron microscopic analysis of chromatin replication in the cellular blastoderm Drosophila melanogaster embryo // Cell -1977. -V. 12. -P. 795-804.

15. McKnight, S.L., Chao, M., Sweet, R.W., Silverstein, S., Axel, R. Trans-criptional control of transformed genes // Oncodev.Biol.Med. -1982.-V.4.-P.81-95.

16. Jantzen, H. M., Strahle, U., Gloss, B., Schmid, W., Boshart, M., Miksicek, R., Schutz, G. Cooperativity of glucocorticoid response elements located far upstream of the tyrosine aminotransferase gene // Cell -1987. -V. 49. -P. 29-38.

17. Nitsch, D., Stewart, A. F., Boshart, M., Mestril, R., Weih, F., Schutz, G. Chromatin structures of the rat tyrosine aminotransferase gene relate to the function of its cis-acting elements // Mol.Cell Biol. -1990. -V. 10. -P. 3334-3342.

18. Stewart, A. F., Reik, A., Schutz, G. A simpler and better method to cleave chromatin with DNase 1 for hypersensitive site analyses // Nucleic.Acids.Res. -1991. -V. 19.-P. 3157-3157.

19. Hatfield, G. W., Benham, C. J. DNA topology-mediated control of global gene expression in Escherichia coli. I I Annu.Rev.Genet. -2002. -V. 36.-P. 175-203.

20. Travers, A., Schneider, R., Muskhelishvili, G. DNA supercoiling and transcription in E. coli: The FIS connection // Biochimie -2001. -V. 83. -P. 213-217.

21. Ptashne, M. Gene regulation by proteins acting nearby and at a distance // Nature -1986. -V. 322. -P. 697-701.

22. Kirkegaard, K., Wang, J. C. Mapping the topography of DNA wrapped around gyrase by nucleolytic and chemical probing of complexes of unique DNA sequences // Cell -1981. -V. 23. -P. 721-729.

23. Morrison, A., Cozzarelli, N. R. Contacts between DNA gyrase and its binding site on DNA: features of symmetry and asymmetry revealed by protection from nucleases //Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1981. -V. 78. -P. 1416-1420.

24. Sive, H. L., Roeder, R. G. Interaction of a common factor with conserved promoter and enhancer sequences in histone H2B, immunoglobulin, and U2 small nuclear RNA genes //Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1986. -V. 83. -P. 6382-6386.

25. Reeves, R. Transcriptionally active chromatin // Biochim.Biophys.Acta -1984. -V. 782. -P. 343-393.

26. Reeves, R. Chromatin changes during the cell cycle // Curr.Opin.Cell Biol. -1992. -V. 4. -P. 413-423.

27. Hogan, M. E., Rooney, T. F., Austin, R. H. Evidence for kinks in DNA folding in the nucleosome // Nature -1987. -V. 328. -P. 554-557.

28. Abate, C., Baker, S. J., Lees Miller, S. P., Anderson, C. W., Marshak, D. R., Curran, T. Dimerization and DNA binding alter phosphorylation of Fos and Jun // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1993. -V. 90. -P. 6766-6770.

29. Lewis, D.E., Geanacopoulos, M., Adhya, S. Role of HU and DNA supercoiling in transcription repression: nucleoprotein repression complex at gal promoters in Escherichia coli // Mol.Microbiol. -1999. -V. 31. -P. 451-461.

30. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aid, 71, Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU // Nucleic.Acids.Res. -1997. -V. 25. -P. 873-876.

31. Kraevskii, V. A., Mikhailov, V. S., Razin, S. V. Stably bent and low-melting

32. DNA sequences at the origin of replication of chicken alpha-globulin gene domains. // Mol.Biol.(Mosk) -1992. -V. 26. -P. 1011-1021.

33. Krajewski, W. A., Razin, S. V. Organization of specific DNA sequence elements in the region of the replication origin and matrix attachment site in the chicken alpha-globin gene domain//Mol.Gen.Genet. -1992. -V. 235. -P. 381-388.

34. Koff, A., Schwedes, J. F., Tegtmeyer, P. Herpes simplex virus origin-binding protein (UL9) loops and distorts the viral replication origin // J.Virol. -1991. -V. 65. -P. 3284-3292.

35. Tsui, S., Anderson, M. E., Tegtmeyer, P. Topoisomerase I sites cluster asymmetrically at the ends of the simian virus 40 core origin of replication // J.Virol. -1989.-V. 63.-P. 5175-5183.

36. Struhl, K. Chromatin structure and RNA polymerase II connection: implications for transcription//Cell -1996. -V. 84. -P. 179-182.

37. Chatterjee, S., Struhl, K. Connecting a promoter-bound protein to TBP bypasses the need for a transcriptional activation domain // Nature -1995. -V. 374. -P. 820-822.

38. Oettinger, M. A., Struhl, K. Suppressors of S. cerevisiae his3 promoter mutations lacking the upstream element//Mol.Cell Biol.-1985.-V. 5. -P. 1901-1909.

39. Ohyama, T. Intrinsic DNA bends: an organizer of local chromatin structure for transcription // Bioessays -2001. -V. 23. -P. 708-715.

40. Kraevskii, V. A., Luchnik, A. N., Georgiev, G. P. Oscillatory changes in the transcription and supercoiling of minichromosomal DNA after the withdrawal of butyric acid from a mouse cell culture. //Dokl.Akad.Nauk SSSR -1989. -V.309. -P. 1008-1011.

41. Krajewski, W. A., Luchnik A. N. Relationship of histone acetylation to DNA topology and transcription // Mol.Gen.Genet. -1991. -V. 230. -P. 442-448.

42. Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism // Annu.Rev.Biochem. -2001. -V. 70. -P. 369-413.

43. Lee, T. L, Young, R. A. Transcription of eukaryotic protein-coding genes // Annu.Rev.Genet. -2000. -V. 34. -P. 77-137.

44. Wallis, J. W, Chrebet, G., Brodsky, G., Rolfe, M, Rothstein, R. A hyper-recombination mutation in S. cerevisiae identifies a novel eukaryotic topoisomerase // Cell -1989. -V. 58. -P. 409-419.

45. Hirose, S., Suzuki, Y. In vitro transcription of eukaryotic genes is affected differently by the degree of DNA supercoiling // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1988. -V. 85.-P. 718-722.

46. Kmiec, E. B., Worcel, A. The positive transcription factor of the 5S RNA gene induces a 5S DNA-specific gyration in Xenopus oocyte extracts // Cell -1985. -V. 41. -P.945-953.

47. Georgel, P. T., Hansen, J. C. Linker histone function in chromatin: dual mechanisms of action// Biochem.Cell Biol. -2001. -V. 79. -P. 313-316.

48. Hayes, J. J., Hansen, J. C. Nucleosomes and the chromatin fiber // Curr.Opin.Genet.Dev. -2001.-V. 11.-P. 124-129.

49. Norton, V. G., Imai, B. S., Bradbury, E. M. Histone acetylation reduces nucleosome particle linking number change // Cell -1989. -V. 57. -P. 449-457.

50. Boffa, L. C., Vidali, G., Mann, R. S., Allfi-ey, V. G. Suppression of histone deacetylation in vivo and in vitro by sodium butyrate // J.Biol.Chem. -1978. -V. 253. -P. 3364-3366.

51. Covault, J., Chalkley, R. The identification of distinct populations of acetylated histone // J.Biol.Chem. -1980. -V. 255. -P. 9110-9116.

52. Covault, J., Perry, M., Chalkley, R. Effects of histone hyperacetylation and hypoacetylation on RNA synthesis in HTC cells // J.Biol.Chem. -1982. -V. 257. -P. 13433-13440.

53. Covault, J., Sealy, L., Schnell, R., Shires, A., Chalkley, R. Histone hypoacetylation following release of HTC cells from butyrate // J.Biol.Chem. -1982. -V. 257.-P. 5809-5815.

54. Ryoji, M., Worcel, A. Chromatin assembly in Xenopus oocytes: in vivo studies // Cell -1984. -V. 37. -P. 21-32.

55. Ryoji, M., Worcel, A. Structure of the two distinct types of minichromosomesthat are assembled on DNA injected in Xenopus oocytes // Cell -1985.-V.40.-P.923-932.

56. Esposito, F., Sinden, R. R. DNA supercoiling and eukaryotic gene expression // Oxf.Surv.Eukaiyot.Genes -1988. -V. 5. -P. 1-50.

57. Drlica, K. Biology of bacterial deoxyribonucleic acid topoisomerases // Microbiol.Rev. -1984. -V. 48. -P. 273-289.

58. Drlica, K. Bacterial topoisomerases and the control of DNA supercoiling // Trends.Genet. -1990. -V. 6. -P. 433-437.

59. Drlica, K. Control of bacterial DNA supercoiling // Mol.Microbiol. -1992. -V. 6. -P. 425-433.

60. Cantor, C. R., Morse, R. H., Benezra, R. Torsional properties of DNA in chromatin//Prog.Clin.Biol.Res. -1985. -V. 172A. -P. 3-18.

61. Morse, R. H., Cantor, C. R. Nucleosome core particles suppress the thermal untwisting of core DNA and adjacent linker DNA // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1985. -V. 82. -P. 4653-4657.

62. Morse, R. H., Cantor, C. R. Effect of trypsinization and histone H5 addition on DNA twist and topology in reconstituted minichromosomes // Nucleic.Acids.Res. -1986. -V. 14. -P. 3293-3310.

63. Ambrose,C., McLaughlin,R., Bina,M. The flexibility and topology of SV40 DNA in minichromosomes//Nucleic.Acids.Res.-1987.-V. 15.-P. 3703-3721.

64. Esposito, F., Sinden, R. R. Supercoiling in pro- and eukaryotic DNA: changes in response to topological perturbation of plasmids in E. coli and SV40 in vitro, in nuclei and in CV-1 cells //Nucleic.Acids.Res.-1987. -V.15. -P.5105-5124.

65. Lutter, L. C. Thermal unwinding of simian virus 40 transcription complex DNA // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A -1989. -V. 86. -P. 8712-8716.

66. Petryniak, B., Lutter, L. C. Topological characterization of the simian virus 40 transcription complex // Cell -1987. -V. 48. -P. 289-295.

67. Morse, R. H., Pederson, D. S., Dean, A., Simpson, R. T. Yeast nucleosomes allow thermal untwisting of DNA //Nucleic. Acids.Res. -1987. -V. 15. -P. 10311-10330.

68. Pederson, D. S., Morse, R. H. Effect of transcription of yeast chromatin on DNA topology in vivo // EMBO J. -1990. -V. 9. -P. 1873-1881.

69. Saavedra, R, A., Huberman, J. A. Both DNA topoisomerases I and II relax 2micron plasmid DNA in living yeast cells // Cell -1986. -V. 45. -P. 65-70.

70. Luger, K„ Mader, A. W., Richmond, R. K„ Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution // Nature -1997. -V. 389.-P. 251-260.

71. Richmond, T. J., Finch, J. T., Rushton, B., Rhodes, D., Klug, A. Structure of the nucleosome particle at 7 A resolution // Nature -1984. -V. 311. -P. 532-537.

72. Saavedra, R. A. Environmental stimuli and transcriptional activity genera-te transient changes in DNA torsional tension// Bioessays -1990.-V.12.-P.125-128.

73. Kraevskii, V. A., Mikhailov, V. S., Razin, S. V. Spatial organization and conformational mobility of DNA complexed with nucleoproteins. // MoLBiol.(Mosk) -1992. -V. 26. -P. 745-756.

74. Kraevskii, V. A., Luchnik, A. N. High rotational mobility of DNA in the chromatin of animal cells and its suppression during histone acetylation. // Dokl.Akad.Nauk.SSSR. -1991. -V. 318. -P. 1002-1006.

75. Krajewski, W. A., Luchnik, A. N. High rotational mobility of DNA in animal cells and its modulation by histone acetylation // Mol.Gen.Genet.-1991 .-V.231 .-P. 17-21.

76. Harada, Y., Ohara, O., Takatsuki, A., Itoh, H., Shimamoto, N., Kinosita, K., Jr. Direct observation of DNA rotation during transcription by Escherichia coli RNA polymerase // Nature -2001. -V. 409. -P. 113-115.

77. Gartenberg, M. R., Wang, J. C. Positive supercoiling of DNA greatly diminishes mRNA synthesis in yeast // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1992. -V. 89 . -P. 11461-11465.

78. Giaever, G. N., Snyder, L., Wang J. C. DNA supercoiling in vivo // Biophys.Chem. -1988. -V. 29. -P. 7-15.

79. Choder, M., Bratosin, S., Aloni, Y. A direct analysis of transcribed minichromosomes: all transcribed SV40 minichromosomes have a nuclease-hypersen-sitive region within a nucleosome-free domain//EMBO J.-1984.-V.3.-P.2929-2936.

80. Choder, M., Aloni, Y. In vitro transcribed SV40 minichromosomes, as the bulk minichromosomes, have a low level of unconstrained negative supercoils // Nucleic.Acids.Res. -1988. -V. 16. -P. 895-905.

81. Llopis, R., Perrin, F., Bellard, F., Gariglio, P. Quantitation of transcribingnative simian virus 40 minichromosomes extracted from CV1 cells late in infection // J.Virol. -1981. -V. 38. -P. 82-90.

82. Llopis, R., Stark, G. R. Two deletions within genes for simian virus 40 structural proteins VP2 and VP3 lead to formation of abnormal transcriptional complexes // J.ViroL -1981. -V. 38. -P. 91-103.

83. Allfrey, V. G., Chen, T. A. Nucleosomes of transcriptionally active chromatin: isolation of template-active nucleosomes by affinity chromatography // Methods Cell Biol.-1991.-V. 35.-P. 315-335.

84. Bazett Jones, D. P., Mendez, E., Czarnota, G. J., Ottensmeyer, F. P., Allfrey, V. G. Visualization and analysis of unfolded nucleosomes associated with transcribing chromatin//Nucleic. Acids.Res. -1996. -V. 24. -P. 321-329.

85. Johnson, E. M., Sterner, R., Alljrey, V. G. Altered nucleosomes of active nucleolar chromatin contain accessible histone H3 in its hyperacetylated forms // J.Biol.Chem. -1987. -V. 262. -P. 6943-6946.

86. Sterner, R., Boffa, L. C, Chen, T. A., Alljrey, V. G. Cell cycle-dependent changes in conformation and composition of nucleosomes containing human histone gene sequences//Nucleic.Acids.Res. -1987. -V. 15. -P. 4375-4391.

87. Chen, T. A., Sterner, R., Cozzolino, A., Alljrey, V. G. Reversible and irreversible changes in nucleosome structure along the c-fos and c-myc oncogenes following inhibition of transcription// J.Mol.Biol. -1990. -V. 212. -P. 481-493.

88. Mirzabekov, A. D. Chromatin structure: mapping proteins associated with genomic DNA using crosslinking // Gene -1993. -V. 135. -P. 111-118.

89. Bavykin, S. G., Usachenko, S. I., Zalensky, A. O., Mirzabekov, A. D. Structure of nucleosomes and organization of internucleosomal DNA in chromatin // J.Mol.Biol. -1990.-V. 212.-P. 495-511.

90. Mirzabekov, A. D., Pruss, D. V., Ebralidse, K. K. Chromatin superstructure-dependent crosslinking with DNA of the histone H5 residues Thrl, His25 and His62 // J.MoLBiol. -1990. -V. 211. -P. 479-491.

91. Nacheva, G. A., Guschin, D. Y., Preobrazhenskaya, O. V., Karpov, V. L., Ebralidse, K. K., Mirzabekov, A. D. Change in the pattern of histone binding to DNA upon transcriptional activation // Cell -1989. -V. 58. -P. 27-36.

92. Walter, W., Studitsky, V. M. Facilitated transcription through the nucleosome at high ionic strength occurs via a histone octamer transfer mechanism // J.Biol.Chem. -2001. -V. 276. -P. 29104-29110.

93. Felsenfeld, G., Clark, D., Studitsky, V. Transcription through nucleosomes li Biophys.Chem. -2000. -V. 86. -P. 231-237.

94. Studitsky, V. M. Preparation and analysis of positioned nucleosomes // Methods MoLBiol. -1999. -V. 119. -P. 17-26.

95. Studitsky, V. M., Clark, D. J., Felsenfeld, G. Overcoming a nucleosomal barrier to transcription // Cell -1995. -V. 83. -P. 19-27.

96. Studitsky, V., Clark, D. J., Felsenfeld, G, A histone octamer can step around a transcribing polymerase without leaving the template // Cell -1994. -V. 76. -P. 371-382.

97. Nelson, D., Perry, M. E„ Chalkley, R. A correlation between nucleosome spacer region susceptibility to DNase I and histone acetylation // Nucleic.Acids.Res. -1979. -V. 6. -P. 561-574.

98. Hebbes, T. R, Thorne, A. W., Crane Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin // EMBO J. -1988. -V. 7. -P. 1395-1402.

99. Hebbes,T., Thome, A., Clayton, AL., Crane-Robinson, C. Histone acetyla-tion and globin gene switching//Nucleic Acids Res. -1992. -V. 20. -P. 1017-1022.

100. Hebbes, T. R., Clayton, A. L., Thorne, A. W., Crane Robinson, C. Core histone hyperacetylation co-maps with generalized DNase I sensitivity in the chi-cken beta-globin chromosomal domain // EMBO J. -1994. -V. 13. -P. 1823-1830.

101. Bode, J., Henco, K, Wingender, E. Modulation of the nucleosome structure by histone acetylation // Eur.J.Biochem. -1980. -V. 110. -P. 143-152.

102. Bode,J., Gomez Lira, M., Schroter,H. Nucleosomal particles open as the histone core becomes hyperacetylated//Eur.J.Biochem.-1983.-V.130.-P.437-445.

103. Bode, J., Schlake, T., Rios-Ramirez, M., Mielke, C., Stengert, M., Kay, V., Klehr-Wirth, D. Scaffold/matrix-attached regions: structural properties creating transcriptionally active loci // Int.Rev.Cytol. -1995. -V. 162A. -P. 389-454.

104. Francis, N. J., Kingston, R. E. Mechanisms of transcriptional memory // Nat.Rev.Mol.Cell Biol. -2001. -V. 2. -P. 409-421.

105. Sterner, D. E, Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors // Microbiol.Mol.Biol.Rev. -2000. -V. 64. -P. 435-459.

106. Vignali, M., Hassan, A. H., Neely, K. E., Workman, J. L. ATP-dependent chromatin-remodeling complexes // Mol.Cell Biol. -2000. -V. 20. -P. 1899-1910.

107. Garcea, R. L., Alberts, B. M. Comparative studies of histone acetylation in nucleosomes, nuclei, and intact cells. Evidence for special factors which modify acetylase action //J.Biol.Chem. -1980. -V. 255. -P. 11454-11463.

108. Shewmaker, C. K, Cohen, B. N., Wagner, T. E. Chemically induced gene activation: selective increase DNAase I susceptibility in chromatin acetylated with acetyl adenylate //Biochem.Biophys.Res.Commun. -1978. -V. 84. -P. 342-349.

109. Bartsch, J., Truss, M., Bode, J., Beato, M. Moderate increase in histone acetylation activates the mouse mammary tumor virus promoter and remodels its nucleosome structure //Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A -1996. -V. 93. -P. 10741-10746.

110. Ansio, J. Analytical ultracentrifugation and the characterization of chromatin structure // Biophys.Chem. -2000. -V. 86. -P. 141-153.

111. Garcia-Ramirez, M, Rocchini, C., Ausio, J. Modulation of chromatin folding by histone acetylation // J.Biol.Chem. -1995. -V. 270. -P. 17923-17928.

112. Libertini, L. J., Ausio, J., Van Holde, K. E., Small, E. W. Histone hyperacetylation. Its effects on nucleosome core particle transitions // Biophys.J. -1988. -V. 53. -P. 477-487.

113. Zlatanova, J., Leuba, S. H, van Holde, K. Chromatin structure revisited // Crit Rev.Eukaiyot.Gene Expr. -1999. -V. 9. -P. 245-255.

114. Annunziato, A. T., Hansen, J. C. Role of histone acetylation in the assem-bly and modulation of chromatin structures // Gene Expr. -2000. -V. 9 . -P. 37-61.

115. Forsberg,E., Bresnick,E. Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in chromatin world//Bioessays-2001.-V.23.-P.820-830.

116. Gregory, P. D., Wagner, K., Horz, W. Histone acetylation and chromatin remodeling // Exp.Cell Res. -2001. -V. 265. -P. 195-202.

117. Lusser, A., Kolle, D., Loidl, P. Histone acetylation: lessons from the plant kingdom // Trends Plant Sci. -2001. -V. 6. -P. 59-65.

118. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation? //EMBO J. -2000. -V. 19. -P. 1176-1179.

119. Turner, B. M. Decoding the nucleosome // Cell -1993. -V. 75. -P. 5-8.

120. Varga-Weisz, P. ATP-dependent chromatin remodeling factors: nucleo-some shufflers with many missions // Oncogene -2001. -V. 20. -P. 3076-3085.

121. Luchnik, A. N. Long-distance signal transfer in transcriptionally active chromatin~how does it occur? // Bioessays -1985. -V. 3. -P. 249-252.

122. Glikin, G. C., Gargiulo, G., Rena Descalzi, L., Worcel, A. Escherichia coli single-strand binding protein stabilizes specific denatured sites in superhelical DNA // Nature -1983. -V. 303. -P. 770-774.

123. Kmiec, E. B., Razvi, F., Worcel, A. The role of DNA-mediated transfer of TFTTTA in the concerted gyration and differential activation of the Xenopus 5S RNA genes // Cell -1986. -V. 45. -P. 209-218.

124. Ruberti, I., Worcel, A. Mechanism of chromatin assembly in Xenopus oocytes // J.Mol.Biol. -1986. -V. 189. -P. 457-476.

125. Luchnik, A. N. Bakayev, V. V., Zbarsky, I. B., Georgiev, G. P. Elastic torsional strain in DNA within a fraction of SV40 minichromosomes: relation to transcriptionally active chromatin // EMBO J. -1982. -V. 1. -P. 1353-1358.

126. Clark, D. J., Wolffe, A. P. Superhelical stress and nucleosome-mediated repression of 5S RNA gene transcription in vitro // EMBO J. -1991.-V.10.-P.3419-3428.

127. Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription // Nature -1997. -V. 389. -P. 349-352.

128. Imhof, A., Wolffe, A. P. Transcription: gene control by targeted histone acetylation// Curr.Biol. -1998. -V. 8. -P. R422-R424.

129. Nightingale, K. P., Wellinger, R. E., Sogo, J. M., Becker, P. B. Histone acetylation facilitates RNA polymerase II transcription of the Drosophila hsp26 gene in chromatin // EMBO J. -1998. -V. 17. -P. 2865-2876.

130. Tse, C., Sera, T., Wolffe, A. P., Hansen, J. C. Disruption of higher-order folding by core histone acetylation enhances transcription of nucleosomal arrays by RNA polymerase ID // Mol.Cell.Biol. -1998. -V. 18. -P. 4629-4638.

131. Vettese Dadey, M, Grant, P. A., Hebbes, T. R, Crane, R., Allis, C. D., Workman, J. L. Acetylation of histone H4 plays a primary role in enhancing transcription factor binding to nucleosomal DNA in vitro // EMBO J. -1996. -V. 15. -P. 2508-2518.

132. Wong, J., Patterton, D., Imhof, A., Guschin, D., Wolffe, A. P. Distinct requirements for chromatin assembly in transcriptional repression by thyroid hormonereceptor and histone deacetylase // EMBO J. -1998. -V. 17. -P. 520-534.

133. Brownell, J E., Zhou, J., Ranalli, 7!, Kobayashi, R, Roth, S. Y., Allis, C. D. Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation // Cell -1996. -V. 84. -P. 843-851.

134. Brownell, J. E., Allis, C. D. Special HATs for special occasions: linking histone acetylation to chromatin assembly and gene activation // Curr.Opin.Genet.Dev. -1996. -V. 6. -P. 176-184.

135. Kuo, M. H., Zhou, J., Jambeck, P., Churchill, M. E., Allis, C. D. Histone acetyltransferase activity of yeast Gcn5p is required for the activation of target genes in vivo // Genes .Dev. -1998. -V. 12. -P. 627-639.

136. Kuo, M. H., Allis, C. D. Roles of histone acetyltransferases and deacetylases in gene regulation // Bioessays. -1998. -V. 20. -P. 615-626.

137. Ogryzko, V. V., Schiltz, R. L., Russanova, V., Howard, B. H., Nakatani, Y. The transcriptional coactivators p300 and CBP are histone acetyltransferases // Cell -1996. -V. 87. -P. 953-959.

138. Utley, R. T., Ikeda, K., Grant, P. A., Cote, J., Steger, D. J., Eberharter, A., John, S., Workman, J. L. Transcriptional activators direct histone acetyltransferase complexes to nucleosomes //Nature. -1998. -V. 394. -P. 498-502.

139. Alland, L., Muhle, R, Hon, H., Jr., Potes, J., Chin, L., Schreiber Agus, N., DePinho, R. A, Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression //Nature -1997. -V. 387. -P. 49-55.

140. Hassig, C. A., Fleischer, T. C., Billin, A. N., Schreiber, S. L., Ayer, D. E. Histone deacetylase activity is required for full transcriptional repression by mSin3A // Cell -1997. -V. 89. -P. 341 -347.

141. Hassig, C. A., Tong, J. K., Fleischer, T. C., Grable, P. G., Ayer, D. E., Schreiber, S. L. A role for histone deacetylase activity in HDAC1-mediated transcriptional repression // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1998. -V. 95. -P. 3519-3524.

142. Nagy, L., Kao, H. Y., Lin, R. J., Hassig, C. A., Ayer, D. E., Schreiber, S. L., Evans, R. M. Nuclear receptor repression mediated by a complex containing SMRT, mSin3A, and histone deacetylase // Cell -1997. -V. 89. -P. 373-380 .

143. Taunton, J., Hassig, C. A., Schreiber, S. L. A mammalian histone deacetylaserelated to the yeast transcriptional regulator Rpd3p see comments. // Science -1996. -V. 272.-P. 408-411.

144. Krajewski, W A., Panin, V. M., Razin, S. V. Acetylation of core histones causes the unfolding of 30 nm chromatin fiber: analysis by agarose gel electrophoresis // Biochem.Biophys.Res.Commun. -1993. -V. 196. -P. 455-460.

145. Krajewski, W A. Effect of in vivo histone hyperacetylation on the state of chromatin fibers // J.Biomol.Struct.Dyn. -1999. -V. 16. -P. 1097-1106.

146. Simpson, R. T. Structure of chromatin containing extensively acetylated H3 andH4 // Cell -1978. -V. 13. -P. 691-699.

147. Bauer, W R, Hayes, J. J., White, J. H., Wolffe, A. P. Nucleosome structural changes due to acetylation // J.Mol.Biol. -1994. -V. 236. -P. 685-690.

148. Turner, B. M. Histone acetylation and control of gene expression // J.Cell Sci. -1991.-V. 99.-P. 13-20.

149. Turner, B. M., O'Neill, L. P. Histone acetylation in chromatin and chromosomes // Semin.Cell Biol. -1995. -V. 6. -P. 229 -236.

150. Kingston, R E., Narlikar, G. J. ATP-dependent remodeling and acetyla-tion as regulators of chromatin fluidity // Genes.Dev. -1999. -V. 13. -P. 2339-2352.

151. Krajewski, W. Histone hyperacetylation facilitates chromatin remodeling in Drosophila embiyo cell-free system//Mol.Gen.Genet.-2000.-V.263.-P.38-47.

152. Wolffe, A. P. Packaging principle: how DNA methylation and histone acetylation control the transcriptional activity of chromatin // J.Exp.Zool. -1998. -V. 282. -P. 239-244.

153. Wolffe, A. P., Hayes, J. J. Chromatin disruption and modification // Nucleic.Acids.Res. -1999. -V. 27. -P. 711-720.

154. Van Holde, K. E. 1989. Chromatin. Springer-Verlag, New York.

155. Allegra, P., Sterner, R., Clayton, D. F., Alljrey, V. G. Affinity chromatographic purification of nucleosomes containing transcriptionally active DNA sequences // J.Mol.Biol. -1987. -V. 196. -P. 379-388.

156. Curcio, M. J., Morse, R. H. Tying together integration and chromatin // Trends.Genet. -1996. -V. 12. -P. 436-438.

157. Morse, R. Transcribed chromatin//Trends.Biochem.Sci.-1992.-V.17.-P. 23-26.

158. Van Holde, K. E., Lohr, D. E., Robert, C. What happens to nucleosomes during transcription? // J.Biol.Chem. -1992. -V. 267. -P. 2837-2840.

159. Edmondson, D. G., Roth, S. Y Chromatin and transcription // FASEB J. -1996.-V. 10.-P. 1173-1182.

160. Krude, T., Elgin, S. C. R. Pushing nucleosomes around. Chromatin I I CurrJBiol. -1996. -V. 6. -P. 511-515.

161. Peterson, C. L. Multiple Switches to turn on chromatin? // Curr.Opin.Genet.Dev. -1996. -V. 6. -P. 171-175.

162. Steger, D.J., Workman, J. L. Remodeling chromatin structures for transcription: what happens to the histones? // Bioessays -1996. -V. 18. -P. 875-884.

163. Wilson, C, J., Chao, D. M., Imbalzano, A. N., Schnitzler, G. R., Kingston, R. E., Young, R. A. RNA polymerase II holoenzyme contains SWI/SNF regulators involved in chromatin remodeling // Cell -1996. -V. 84. -P. 235-244 .

164. Luo, R. X., Dean, D. C. Chromatin Remodeling and Transcriptional Regulation//J.Natl.Cancer.Inst. -1999. -V. 91. -P. 1288-1294.

165. Kornberg, R. D., Lorch, Y Chromatin-modifying and -remodeling complexes // Curr.Opin.Genet.Dev. -1999. -V. 9. -P. 148-151.

166. Hirose, S. Chromatin remodeling and transcription // J.Biochem.(Tokyo). -1998. -V. 124. -P. 1060-1064.

167. Cairns, B. R. Chromatin remodeling machines: similar motors, ulterior motives //Trends.Biochem.Sci. -1998. -V. 23. -P. 20-25.

168. Corona, D. F., Langst, G., Clapier, C. R., Bonte, E. J., Ferrari, S., Tamkun, J.

169. W., Becker, P. B. ISWI is an ATP-dependent nucleosome remodeling factor // Mol.Cell. -1999.-V. 3.-P. 239-245.

170. Langst, G., Bonte, E. J., Corona, D. F., Becker, P. B. Nucleosome movement by CHRAC and ISWI without disruption or trans- displacement of the histone octamer // Cell. -1999. -V. 97. -P. 843-852.

171. Georgel, P. T., Tsukiyama, T., Wu, C. Role of histone tails in nucleosome remodeling by DrosophilaNURF // EMBO J. -1997. -V. 16. -P. 4717-4726.

172. Thompson, J. S., Ling, X., Grunstein, M. Histone H3 amino terminus is required for telomeric and silent mating locus repression in yeast // Nature -1994. -V. 369. -P. 245-247.

173. Logie, C., Tse, G, Hansen, J. C., Peterson, C. L. The core histone N-terminal domains are required for catalytic chromatin remodeling by the SWI/SNF and RSC complexes // Biochemistry -1999. -V. 38. -P. 2514-2522.

174. Syntichaki, P., Topalidou, I., Thireos, G. The Gcn5 bromodomain coordinates nucleosome remodelling //Nature -2000. -V. 404. -P. 414-417.

175. Fisher Adams, G., Grunstein, M. Yeast histone H4 and H3 N-termini have different effects on the chromatin structure of the GAL1 promoter // EMBO J. -1995. -V. 14. -P. 1468-1477.

176. Hecht,A., Laroche,T., StrahlBolsinger,S., Gasser,S.M., Grunstein,M. His-tone H3 and H4 N-termini interact with SIR3 and SIR4 proteins: a molecular mo-del for the formation of heterochromatin in yeast // Cell -1995. -V. 80. -P. 583-592.

177. Wan, J. S., Mann, R. K, Grunstein, M. Yeast histone H3 and H4 N termini function through different GAL1 regulatory elements to repress and activate transcription//Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1995. -V. 92. -P. 5664-5668.

178. Cosma, M. P., Tanaka, T., Nasmyth, K Ordered recruitment of transcription and chromatin remodeling factors to a cell cycle- and developmentally regulated promoter //Cell. -1999. -V. 97.-P.299-311.

179. Krebs, J. E., Kuo, M. H., Allis, C. D., Peterson, C. L. Cell cycle-regulated histone acetylation required for expression of the yeast HO gene // Genes.Dev. -1999. -V. 13.-P. 1412-1421.

180. Imbalzano, A. N., Kwon, H., Green, M. R, Kingston, R. E. Facilitated bindingof TATA-binding protein to nucleosomal DNA //Nature -1994. -V. 370. -P. 481-485.

181. Tong, J. K., Hassig, C. A., Schnitzler, G. R., Kingston, R. K, Schreiber, S. L. Chromatin deacetylation by an ATP-dependent nucleosome remodelling complex // Nature. -1998. -V. 395. -P. 917-921.

182. Wang, J. C. Appendix. I: An introduction to DNA supercoiling and DNA topoisomerase-catalyzed linking number changes of supercoiled DNA // Adv.Pharmacol. -1994. -V. 29B. -P. 257-270.

183. Wang, J. C, Lynch, A. S. Transcription and DNA supercoiling // Curr.Opin.Genet.Dev. -1993. -V. 3. -P. 764-768.

184. Peck, L. J., Wang, J. C., Nordheim, A., Rich, A. Rate of B to Z structural transition of supercoiled DNA // J.Mol.Biol. -1986. -V. 190. -P. 125-127.

185. Hsieh, T. S., Wang, J. C. Thermodynamic properties of superhelical DNAs // Biochemistry -1975. -V. 14. -P. 527-535.

186. Benham, C. J. The role of the stress resultant in determining mechanical equilibria of superhelical DNA // Biopolymers -1987. -V. 26. -P. 9-15.

187. Gough, G. W, Sullivan, K M., Lilley, D. M. The structure of cruciforms in supercoiled DNA: probing the single-stranded character of nucleotide bases with bisulphite // EMBO J. -1986. -V. 5. -P. 191-196.

188. Lilley, D.M. The inverted repeat as a recognizable structural feature supercoiled DNA molecules//Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.-1980.-V.77.-P.6468-6472.

189. Lilley, D. M. DNA supercoiling and DNA structure // Biochem.Soc.Trans. -1986.-V. 14.-P. 211-213.

190. Lilley, D. DNA supercoiling // Biochem.Soc.Trans. -1986. -V.14. -P.489-493.

191. Mizuuchi, K, Mizuuchi, M., Geliert, M. Cruciform structures in palindro-mic DNA are favored by DNA supercoiling //J.Mol.Biol.-1982.-V.156.-P.229-243.

192. Sullivan, K. M., Lilley, D.M. A dominant influence of flanking sequen-ces on a local structural transition in DNA // Cell -1986. -V. 47. -P. 817-827.

193. Zheng, G. X., Sinden, R. R. Effect of base composition at the center of inverted repeated DNA sequences on cruciform transitions in DNA // J.Biol.Chem. -1988. -V. 263. -P. 5356-5361.

194. Lockshon, D., Galloway, D. A. Cloning and characterization of oriL2, a largepalindromic DNA replication origin of herpes simplex virus type 2 // J.Virol. -1986. -V. 58.-P. 513-521.

195. Lockshon, D., Galloway, DA. Sequence and structural requirements of a herpes simplex viral DNA replication origin // Mol.Cell Biol. -1988. -V. 8. -P. 4018-4027.

196. Hardwicke, M. A., Schaffer, P. A. Cloning and characterization of herpes simplex virus type 1 oriL: comparison of replication and protein-DNA complex formation by oriL and oriS // J.Virol. -1995. -V. 69. -P. 1377-1388.

197. Benham, C. J. Stress-induced DNA duplex destabilization in transcriptional initiation // Pac.Symp.Biocomput. -2001. -V. -P. 103-114.

198. Wolfl, S., Martinez, C., Rich, A., Majzoub, J. A. Transcription of the human corticotropin-releasing hormone gene in NPLC cells is correlated with Z-DNA formation //Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1996. -V. 93. -P. 3664-3668.

199. Herbert, A., Lowenhaupt, K, Spitzner, J., Rich, A. Chicken double-stranded RNA adenosine deaminase has apparent specificity for Z-DNA // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1995. -V. 92. -P. 7550-7554.

200. Wolfl, S., Wittig, B., Rich, A. Identification of transcriptionally induced Z-DNA segments in the human c-myc gene // Biochim.Biophys.Acta -1995. -V. 1264. -P. 294-302.

201. Rich, A. Speculation on the biological roles of left-handed Z-DNA // Ann.N.Y.Acad.Sci. -1994. -V. 726. -P. 1-16.

202. Feigon, J., Wang, A. H., van der Marel, G. A., van Boom, J. H., Rich, A. Z-DNA forms without an alternating purine-pyrimidine sequence in solution // Science -1985. -V. 230. -P. 82-84.

203. Azorin,F., Hahn,R., Rich,A. Restriction endonucleases can be used to study BZ junctions in supercoiled DNA//Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.-1984.-V.81.-P.5714-5718.

204. Azorin, F., Nordheim, A., Rich, A. Formation of Z-DNA in negatively supercoiled plasmids is sensitive to small changes in salt concentration within the physiological range // EMBO J. -1983. -V. 2. -P. 649-655.

205. Rosl, F., Waldeck, W., Sauer, G. Isolation of episomal bovine papillomavirus chromatin and identification of a DNase I-hypersensitive region // J. Virol. -1983. -V. 46. -P. 567-574.

206. Sanford, D. G., Stollar, B. D. Characterization of anti-Z-DNA antibody binding sites on Z-DNA by nuclear magnetic resonance spectroscopy // J.Biol.Chem. -1990. -V. 265. -P. 18608-18614.

207. Pardue, M. L., Nordheim, A., Lafer, E. M, Stollar, B. D., Rich, A. Z-DNA and the polytene chromosome // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. -1983. -V. 47 Pt 1. -P. 171-176.

208. Moller, A, Gabriels, J. E., Lafer, E. M., Nordheim, A., Rich, A., Stollar, B. D. Monoclonal antibodies recognize different parts of Z-DNA // J.Biol.Chem. -1982. -V. 257. -P. 12081-12085.

209. Polymenis, M., Brigido, M., Sanford, D., Stollar, B.D. The targets and genes for antibodies to Z-DNA // Biotechnol.Appl.Biochem. -1993. -V. 18. -P. 175-183.

210. Hill, R. J., Watt, F., Stollar, B. D. Z-DNA immunoreactivity of Drosophila polytene chromosomes. Effects of the fixatives 45% acetic acid and 95% ethanol and of DNase I nicking // Exp.Cell Res. -1984. -V. 153. -P. 469-482.

211. Fishel, R, Anziano, P., Rich, A. Z-DNA affinity chromatography // Methods Enzymol. -1990. -V. 184. -P. 328-340.

212. Ellison, M. J., Feigon, J., Kelleher, R. J., Wang, A. H., Habener, J. F., Rich, A. An assessment of the Z-DNA forming potential of alternating dA- dT stretches in supercoiled plasmids // Biochemistry -1986. -V. 25. -P. 3648-3655.

213. Azorin, F„ Rich, A. Isolation of Z-DNA binding proteins from SV40 minichromosomes: evidence for binding to the viral control region // Cell -1985. -V. 41. -P. 365-374.

214. Nordheim, A., Lafer, E. M„ Peck, L. J., Wang, J. C., Stollar, B. D., Rich, A. Negatively supercoiled plasmids contain left-handed Z-DNA segments as detected by specific antibody binding // Cell -1982. -V. 31. -P. 309-318 .

215. Nordheim, A., Pardue, M. L., Lafer, E. M„ Moller, A., Stollar, B. D., Rich, A. Antibodies to left-handed Z-DNA bind to interband regions of Drosophila polytenechromosomes //Nature -1981. -V. 294. -P. 417-422.

216. Lilley, D. M. DNA opens up~supercoiling and heavy breathing // Trends.Genet. -1988. -V. 4. -P. 111-114.

217. Pulleyblank, D. E., Haniford, D. B., Morgan, A. R. A structural basis for SI nuclease sensitivity of double- stranded DNA // Cell -1985. -V. 42. -P. 271-280.

218. Anselmi, C., Bocchinfuso, G., De Santis, P., Savino, M., Scipioni, A. A theoretical model for the prediction of sequence-dependent nucleosome thermodynamic stability // BiophysJ. -2000. -V. 79. -P. 601-613.

219. Filesi, I., Cacchione, S., De Santis, P., Rossetti, L., Savino, M. The main role of the sequence-dependent DNA elasticity determining free energy of nucleo-some formation on telomeric DNAs // Biophys.Chem. -2000. -V. 83. -P. 223-237.

220. Wells, R D. Biological and chemical properties of left handed Z-DNA // Nucleic.Acids.Symp.Ser.-1984.-V. -P. 165-167.

221. Wells, R. D. Biophysics of left-handed Z-DNA // Adv.Biophys. -1985. -V. 20. -P. 31-38.

222. Wells, R D. Biological and chemical properties of left handed Z-DNA // Prog.Clin.Biol.Res. -1985. -V. 172A. -P. 47-53.

223. Nordheim, A., Peck, L. J., Lafer, E. M., Stollar, B. D., Wang, J. C., Rich, A. Supercoiling and left-handed Z-DNA // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. -1983. -V. 47 Pt 1. -P. 93-100.

224. Nordheim, A., Rich, A. Negatively supercoiled simian virus 40 DNA contains Z-DNA segments within transcriptional enhancer sequences // Nature -1983. -V. 303. -P. 674-679.

225. Plon, S. E., Wang, J. C. Transcription of the human beta-globin gene is stimulated by an SV40 enhancer to which it is physically linked but topologically uncoupled// Cell -1986. -V. 45. -P. 575-580.

226. Zhurkin, V. B. Sequence-dependent bending of DNA and phasing of nucleosomes // J.Biomol.Struct.Dyn. -1985. -V. 2. -P. 785-804.

227. Freeman, L. A., Garrard, W. T. DNA supercoiling in chromatin structure and gene expression // Crit Rev.Eukaryot.Gene Expr. -1992. -V. 2. -P. 165-209.

228. Gross, D. S., Huang, S. Y., Garrard, W. T. Chromatin structure of the potential

229. Z-forming sequence (dT-dG)n X (dC-dA)n. Evidence for an "alternating-B" conformation // J.Mol.Biol. -1985. -V. 183. -P. 251-265.

230. Sinden, R. R., Carlson, J. O., Pettijohn, D. E. Torsional tension in the DNA double helix measured with trimethylpsoralen in living E. coli cells: analo-gous measurements in insect and human cells // Cell -1980.-V. 21. P. 773-783.

231. Giaever, G. N., Wang, J. C. Supercoiling of intracellular DNA can occur in eukaryotic cells // Cell -1988. -V. 55. -P. 849-856.

232. Liu, L. F., Wang, J. C. Supercoiling of the DNA template during transcription // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1987. -V. 84. -P. 7024-7027.

233. Osborne, B. I., Guarente, L. Transcription by RNA polymerase II indu-ces changes of DNA topology in yeast // Genes Dev. -1988. -V. 2. -P. 766-772.

234. Hayes, J. J., Tullius, T. D., Wolffe, A. P. The structure of DNA in a nucleosome // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1990. -V. 87. -P. 7405-7409.

235. Morse, R H., Simpson, R T. DNA in the nucleosome // Cell -1988. -V. 54. -P. 285-287.

236. Richmond, T. J. Protein~DNA interaction. Another folding problem? // Nature -1987. -V. 326. -P. 18-19.

237. Zlatanova, J., van Holde, K. Linker histones versus HMG1/2: a struggle for dominance?//Bioessays. -1998. -V. 20. -P. 584-588.

238. Walker, P. R., Sikorska, M. Chromatin structure. Further evidence against the existence of a beaded subunit for the 30-nm fiber // J.Biol.Chem. -1987. -V. 262. -P. 12218-12222.

239. Walker, P. R., Sikorska, M. Chromatin structure. Evidence that the 30-nm fiber is a helical coil with 12 nucleosomes/turn // J.Biol.Chem. -1987. -V. 262. -P. 12223-12227.

240. Zlatanova, J., Leuba, S. H., van Holde, K. Chromatin fiber structure:morphology, molecular determinants, structural transitions // Biophys J. -1998. -V. 74. -P. 2554-2566.

241. Walker, P. R., Sikorska, M., Whitfield, J. F. Chromatin structure. Nuclea-se digestion profiles reflect intermediate stages in the folding of the 30-nm fiber rather than existence of subunit beads // J.Biol.Chem.-1986.-V.261. -P. 7044-7051.

242. Paro, R. Chromatin regulation. Formatting genetic text // Nature -2000. -V. 406. -P. 579-580.

243. Heng, H. H„ Krawetz, S. A., Lu, W., Liu, G., Ye, C. J. Re-defining the chromatin loop domain // Cytogenet.Cell Genet. -2001. -V. 93. -P. 155-161.

244. Filipski, J., LeBlanc, J., Youdale.T., Sikorska,M., Walker,P. Periodicity of DNA folding in higher order chromatin structures // EMBO J. -1990. -V. 9. -P. 1319-1327.

245. Camerini Otero, R. D., Felsenfeld, G. Supercoiling energy and nucleosome formation: the role of the arginine-rich histone kernel //Nucleic. Acids.Res. -1977. -V. 4. -P. 1159-1181.

246. Camerini Otero, R. D., Felsenfeld, G. A simple model of DNA superhe-lices in solution // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1978. -V. 75. -P. 1708-1712.

247. Crick, F. H. Linking numbers and nucleosomes // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1976. -V. 73 . -P. 2639-2643.

248. White, J. H., Cozzarelli, N. R., Bauer, W. R. Helical repeat and linking number of surface-wrapped DNA // Science -1988. -V. 241. -P. 323-327.

249. Crick, F. H., Wang, J. C., Bauer, W. R. Is DNA really a double helix? // J.Mol.Biol. -1979. -V. 129. -P. 449-457.

250. White, J. H., Bauer, W. R. Calculation of the twist and the writhe for representative models of DNA // J.MoLBiol. -1986. -V. 189. -P. 329-341.

251. White, J. H., Bauer, W. R. Superhelical DNA with local substructures. A generalization of the topological constraint in terms of the intersection number and the ladder-like correspondence surface // J.Mol.Biol. -1987. -V. 195. -P. 205-213.

252. Laemmli, U. K., Cheng, S. M., Adolph, K. W., Paulson, J. R., Brown, J. A., Baumbach, W. R. Metaphase chromosome structure: the role of nonhistone proteins // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. -1978. -V. 42 Pt 1. -P. 351-360.

253. Adolphs, K. W., Cheng, S. M., Paulson, J. R., Laemmli, U. K. Isolation of aprotein scaffold from mitotic HeLa cell chromosomes // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1977. -V. 74. -P. 4937-4941.

254. Paulson, J. R., Laemmli, U. K. The structure of histone-depleted metaphase chromosomes // Cell -1977. -V. 12. -P. 817-828.

255. Cook, P. R., Brazell, I. A., Jost, E. Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA // J.Cell Sci. -1976. -V. 22. -P. 303-324 .

256. Cook, P., Brazell, I. Spectrofluorometric measurement of the binding of ethi-dium to superhelical DNA from cell nuclei // Eur.J.Biochem.-1978. -V.84. -P.465-477.

257. Jackson, D. A., Yuan, J., Cook, P. R. A gentle method for preparing cyto- and nucleo-skeletons associated chromatin // J.Cell Sci. -1988. -V. 90. -P. 365-378.

258. Jackson, D. A., Dickinson, P., Cook, P. R. Attachment of DNA to the nucleoskeleton of HeLa cells examined using physiological conditions // Nucleic.Acids.Res. -1990. -V. 18. -P. 4385-4393.

259. Cook, P. R. A chromomeric model for nuclear and chromosome structure // J.Cell Sci. -1995. -V. 108. -P. 2927-2935.

260. Jackson, D. A., Bartlett, J., Cook, P. R. Sequences attaching loops of nuclear and mitochondrial DNA to underlying structures in human cells: the role of transcription units//Nucleic.Acids.Res. -1996. -V. 24. -P. 1212-1219.

261. Thoma, F., Koller, T., Klug, A. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin // J.Cell Biol. -1979. -V. 83. -P. 403-427.

262. Felsenfeld, G. Chromatin //Nature -1978. -V. 271. -P. 115-122.

263. Felsenfeld, G., McGhee, J. D. Structure of the 30 nm chromatin fiber // Cell -1986.-V. 44.-P. 375-377.

264. Kraevskii, V. A., Panin, V. M., Razin, S. V. Condensation of nucleosome fibrils at increased temperature. // Dokl.Akad.Nauk. -1993. -V. 332. -P. 375-377.

265. Krajewski, W. A., Panin, V. M., Razin, S. V. Dynamics of unfolded nucleosomal fiber // J.Biomol.Struct.Dyn. -1993. -V. 10. -P. 1013-1022.

266. Clark, D. J., Felsenfeld, G. Formation of nucleosomes on positively supercoiled DNA // EMBO J. -1991. -V. 10. -P. 387 -395.

267. Clark, D. J., Ghirlando, R., Felsenfeld, G., Eisenberg, H. Effect of positivesupercoiling on DNA compaction by nucleosome cores // J.MoLBiol. -1993. -V. 234. -P. 297-301.

268. Pfqffle, P., Gerlach, V., Bunzel, L., Jackson, V. In vitro evidence that transcription-induced stress causes nucleosome dissolution and regeneration // J.Biol.Chem. -1990. -V. 265. -P. 16830-16840.

269. Pfaffle, P., Jackson, V. Studies on rates of nucleosome formation with DNA under stress // J.Biol.Chem. -1990. -V. 265. -P. 16821-16829.

270. Garner, M. M., Felsenfeld, G., O'Dea, M. H., Gellert, M. Effects of DNA supercoiling on the topological properties of nucleosomes // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1987. -V. 84. -P. 2620-2623.

271. Norton, V. G., Marvin, K. W, Yau, P., Bradbury, E. M. Nucleosome linking number change controlled by acetylation of histones H3 and H4 // J.Biol.Chem. -1990. -V. 265. -P. 19848-19852.

272. Marvin, K. W, Yau, P., Bradbury, E. M. Isolation and characterization of acetylated histones H3 and H4 and their assembly into nucleosomes // J.Biol.Chem. -1990. -V. 265. -P. 19839-19847.

273. Ausio, J., Sasi, R., Fasman, G. D. Biochemical and physiochemical characterization of chromatin fractions with different degrees of solubility isolated from chicken erythrocyte nuclei // Biochemistry -1986. -V. 25. -P. 1981-1988.

274. Bednar, J., Horowitz, R. A., Dubochet, J., Woodcock, C. L. Chromatin conformation and salt-induced compaction: three- dimensional structural infor-mation from ciyoelectron microscopy //J.Cell Biol. -1995. -V. 131. -P. 1365-1376.

275. Dubochet, J.,Adrian,M.,Schultz,P. Oudet,P. Cryo-electron microscopy of vitrified SV40 minichromosomes: the liquid drop model //EMBO J. -1986.-V.5.-P.519-528.

276. Sartori Blanc, N., Studer, £>., Dubochet, J. Electron beam-induced changes in vitreous sections of biological samples // J.Microsc. -1998. -V. 192. -P. 194-201.

277. Clark, D. J., Felsenfeld, G. A nucleosome core is transferred out of the path of a transcribing polymerase // Cell -1992. -V. 71. -P. 11-22.

278. Widom, J\ A relationship between the helical twist of DNA and the ordered positioning of nucleosomes in all eukaryotic cells // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1992. -V. 89. -P. 1095-1099.

279. Yao, J., Lowary, P. T., Widom, J. Twist constraints on linker DNA in the 30-nm chromatin fiber: implications for nucleosome phasing // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1993. -V. 90. -P. 9364-9368.

280. Krajewski, W. A. Alterations in the internucleosomal DNA helical twist in chromatin of human erythroleukemia cells in vivo influences the chromatin higher-order folding // FEBS Lett. -1995. -V. 361. -P. 149-152.

281. Simon, J. A., Tamkun, J. W. Programming off and on states in chromatin: mechanisms of Polycomb and trithorax group complexes // Curr.Opin.Genet.Dev. -2002.-V. 12. -P. 210-218.

282. Jones, R. S., Gelbart, W. M. The Drosophila Polycomb-group gene Enhancer of zeste contains a region with sequence similarity to trithorax // Mol.Cell Biol. -1993. -V. 13. -P. 6357-6366.

283. Tripoulas, N., LaJeunesse, D., Gildea, JShearn, A. The Drosophila ashl gene product, which is localized at specific sites on polytene chromosomes, contains a SET domain and a PHD finger // Genetics -1996. -V. 143. -P. 913-928.

284. Jenicwein,T., Laible,G., Reuter, G. SET domain proteins modulate chromatin domains in eu- and heterochromatin // Cell MoLLife Sci. -1998. -V. 54. -P. 80-93.

285. Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. SET-domain proteins of the Su(var)3-9, E(z) and trithorax families // Gene -2002. -V. 285. -P. 25-37.

286. Cui, X., De, V., I, Slany, R., Miyamoto, A., Firestein, R, Cleary, M. L. Association of SET domain and myotubularin-related proteins modulates growth control //NatGenet. -1998. -V. 18. -P. 331-337.

287. Corda, K, Schramke, V., Longhese, M. P., Smokvina, T., Brevet, V., Gilson, E., Geli, V. Interaction between Setlp and checkpoint protein Mec3p in DNA repair and telomere functions //Nat.Genet. -1999. -V. 21. -P. 204-208.

288. Nislow, C., Ray, E., Pillus, L. SET1, a yeast member of the trithorax family, functions in transcriptional silencing and diverse cellular processes // Mol.Biol.Cell-1997. -V. 8. -P. 2421-2436.

289. Lachner, M., Jenuwein, T. The many faces of histone lysine methylation // Curr.Opin.Cell Biol. -2002. -V. 14. -P. 286 -298.

290. Bannister, A. J., Zegerman, P., Partridge, J. F, Miska, E. A., Thomas, J. O., Allshire, R G, Kouzarides, T. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain // Nature -2001. -V. 410. -P. 120-124.

291. Lachner, M., O'Carroll, D., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP 1 proteins // Nature -2001. -V. 410. -P. 116-120.

292. Balhom, R, Jackson, V., Chalkey, R Phosphorylation of the lysine-rich histones through the cell cycle//Biochemistiy -1975. -V.14. -P. 2504 -2511.

293. Jackson, V., Granner, D., Chalkley, R. Deposition of histone onto thereplicating chromosome: newly synthesized histone is not found near the replication fork // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1976. -V. 73. -P. 2266-2269.

294. Alfageme, C. R., Zweidler, A., Mahowald, A., Cohen, L. H. Histones of Drosophila embryos. Electrophoretic isolation and structural studies // J.Biol.Chem. -1974. -V. 249. -P. 3729-3736.

295. Spiker, S., Key, J. L., Wakim, B. Identification and fractionation of plant histones //Arch.Biochem.Biophys. -1976. -V. 176. -P. 510-518.

296. Spiker, S. Histone variants in plants. Evidence for primary structure vari-ants differing in molecular weight // J.Biol.Chem. -1982. -V. 257. -P.14250-14255.

297. Ramponi, G., Grisolia, S. Acylation of lysine and of arginine-rich histones with carbamyl phosphate and 1,3 diphosphoglycerate // Biochem.Biophys.Res.Commun. -1970. -V. 38. -P. 1056-1063.

298. Ramponi, G., Manao,G., Camici,G. Nonenzymatic acetylation of histones with acetylphosphate and acetyladenylate//Biochemistry-1975.-V. 14.-P.2681-2685

299. Bloom, K. S., Anderson, J. N. Fractionation of hen oviduct chromatin into transcriptionally active and inactive regions after selective micrococcal nuclease digestion//Cell -1978. -V. 15. -P. 141 -150.

300. Bloom, K. S., Anderson, J. N. Conformation of ovalbumin and globin genes in chromatin during differential gene expression// J.Biol.Chem. -1979. -V. 254. -P. 1053210539.

301. Nelson, D., Covault, J., Chalkley, R. Segregation of rapidly acetylated histones into a chromatin fraction released from intact nuclei by the action of micrococcal nuclease //Nucleic.Acids.Res. -1980. -V. 8. -P. 1745-1763.

302. Nelson, D. A., Perry, M., Sealy, L., Chalkley, R. DNAse I preferentially digests chromatin containing hyperacetylated histones // Biochem.Biophys.Res.Commun. -1978. -V. 82. -P. 1346-1353.

303. Chen, T. A, Smith, M. M., Le, S. Y, Sternglanz, R., Allfrey, V. G. Nucleosome fractionation by mercury affinity chromatography. // J.Biol.Chem. -1991. -V. 266. -P. 6489-6498.

304. Sandeen, G., Wood, W I., Felsenfeld, G. The interaction of high mobility proteins HMG14 -17 with nucleosomes //Nucleic.Acids.Res. -1980.-V.8.-P.3757- 3778.

305. Krylov, D. Y., Makarov, V. L., Ivanov, V. I. The B-A transition in superhelical DNA//Nucleic.Acids.Res. -1990. -V. 18. -P. 759-761.

306. Smirnov, I. V., D. Y. Kiylov, and V. L. Makarov. 1989. 1989. Moscow. June 19-24. Abstract H-l 1 in Molecular Organisation of Biological Structures 287.

307. Renz, M., Nehls, P., Hozier, J. Involvement of histone HI in the organization of the chromosome fiber // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1977. -V. 74. -P. 1879-1883.

308. Renz, M., Nehls, P., Hozier, J. Histone HI involvement in the structure of the chromosome fiber// Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. -1978.-V.42 Pt 1. -P. 245-252.

309. Becker, P. B., Wu, C. Cell-free system for assembly of transcriptionally repressed chromatin from Drosophila embiyos //Mol.Cell Biol.-1992.-V.12.-P. 2241-2249.

310. Krajewski, W. A., Becker, P. B. Reconstitution of hyperacetylated, DNase I-sensitive chromatin characterised by high conformational flexibility of nucleosomal DNA // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1998. -V. 95. -P. 1540-1545.

311. Krajewski, W. A. and P. B. Becker. Reconstitution and analysis of hyperacetylated chromatin. Becker, P. B. Chromatin Protocols (119), 195-206. 1999. Totowa, New Jersey, Humana Press. Methods in Molecular Biology.

312. Blank, T. A., Becker, P. B. Electrostatic mechanism of nucleosome spacing // J.Mol.Biol. -1995. -V. 252. -P. 305-313.

313. Sandaltzopoulos, R., Blank, T., Becker, P. B. Transcriptional repression by nucleosomes but not HI in reconstituted preblastoderm Drosophila chromatin // EMBO J. -1994. -V. 13. -P. 373-379.

314. Varga-Weisz, P. D., Blank, T. A., Becker, P. B. Energy-dependent chromatin accessibility and nucleosome mobility in a cell-free system I I EMBO J. -1995. -V. 14. -P. 2209-2216.

315. Tsukada, T., Fink, J. S., Mandel, G., Goodman, R. H. Identification of a region in the human vasoactive intestinal polypeptide gene responsible for regulation by cyclic

316. AMP // J.Biol.Chem. -1987. -V. 262. -P. 8743-8747.

317. Lee, C. Q., Yun, Y., Hoeffler, J. P., Habener, J. P. Cyclic-AMP-responsive transcriptional activation of CREB-327 involves interdependent phosphorylated subdomains // EMBO.J. -1990. -V. 9. -P. 4455-4465.

318. Krajewski, W., Lee, K. A. W. A monomeric derivative of the cellular transcription factor CREB functions as a constitutive activator // Mol.Cell Biol. -1994. -V. -P. 7204-7210.

319. Farache, G., Razin, S. V., Targa, F. R., Scherrer, K. Organization of the 3'-boundary of the chicken alpha globin gene domain and characterization of a CR 1-specific protein binding site //Nucleic.Acids.Res. -1990. -V. 18. -P. 401-409.

320. Razin, S. V., Moura Gallo, C, V., Scherrer, K. Characterization of the chromatin structure in the upstream region of the chicken alpha-globin gene domain If Mol.Gen.Genet. -1994. -V. 242. -P. 649-652.

321. Andrews, N. C., Faller, D. V. A rapid micropreparation technique for extraction of DNA-binding proteins from limited number of mammalian cells I I Nucleic Acids Res. -1991. -V. 19. -P. 2499-.

322. Hansen, J. C., Atisio, J., Stanik, V. H., Van Holde, K. E. Homogeneous reconstituted oligonucleosomes, evidence for salt- dependent folding in the absence of histone HI // Biochemistry -1989. -V. 28. -P. 9129-9136.

323. Mel'nikova, A. F., Kolchinskii, A. M., Golovonov, E. I., Mirzabekov, A. D. Length of nucleosomal DNA repeat in whole cells, fixed by freezing in the presence of formaldehyde. //Mol.Biol.Mosk. -1980. -V. 14. -P. 549-557.

324. Anderson, J. N. Detection, sequence patterns and function of unusual DNA structures //Nucleic.Acids.Res. -1986. -V. 14. -P. 8513-8533.

325. Georgiev, G. P., Vassetzky, Y. S., Jr., Luchnik, A. N., Razin, S. V. A. E. Braunstein Plenary Lecture. Nuclear skeleton, DNA domains and control of replication and transcription//Eur.J.Biochem. -1991. -V. 200. -P. 613-624.

326. Glaser, V. M., Luchnik, A. N. Decrease in the density of DNA topological turns during aging of Syrian hamster cells//Exp.Cell Res.-1982.-V.139.-P.249-255.

327. Luchnik, A. N. Conformational transitions in closed circular DNA molecules. H. Biological implications // Mol.Biol.Rep. -1980. -V. 6. -P. 11-15.

328. Luchnik, A. N. Conformational transitions in closed circular DNA mole-cules. Topological and energetical considerations//Mol.Biol.Rep.-1980.V.6.-P. 3-9.

329. Lee, C.H., Mizusawa, H., Kakefuda, T. Unwinding of double-stranded DNA helix by dehydration// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.-1981.-V.78.-P.2838-2842.

330. Smirnov, I. V., Krylov, D. Y., Makarov, V. L. The structure and dynamics of HI-depleted chromatin // J.Biomol.Struct.Dyn. -1991. -V. 8. -P. 1251-1266.

331. Depew, D. E., Wang, J. C. Conformational fluctuations of DNA helix // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1975. -V. 72. -P. 4275-4279.

332. Germond, J. E., Hirt, B., Oudet, P., Gross Bellark, M., Chambon, P. Folding of the DNA double helix in chromatin-like structures from simian virus 40 // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1975. -V. 72. -P. 1843-1847.

333. Germond, J. E., Bellard, M., Oudet, P., Chambon, P. Stability of nucleosomes in native and reconstituted chromatins//Nucleic.Acids.Res. -1976.-V. 3. -P. 3173-3192.

334. Finch, J. T., Klug, A. Solenoidal model for superstructure in chromatin // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1976. -V. 73. -P. 1897-1901.

335. Wittig, B., Wittig, S. Nucleosome mono, di, tri-, and tetramers from chicken embryo chromatin//Nucleic.Acids.Res. -1977. -V. 4. -P. 3901-3917.

336. Kondo, T., Nakajima, Y., Kawakami, M. Effect of salts and chromatin concentrations on the buoyant density of chromatin in metrizamide gradient // Biochim.Biophys.Acta-1979. -V. 561. -P. 526-534.

337. Murphy, R. F., Wallace, R. B., Bonner, J. Altered nucleosome spacing in newly replicated chromatin from Friend leukemia cells // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1978. -V. 75. -P. 5903-5907.

338. Murphy, R. F., Wallace, R. B., Bonner, J. Isolation of newly replicated chromatin by using shallow metrizamide gradients // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1980. -V. 77. -P. 3336-3340.

339. Birnie, G. D. Fractionation of chromatin by buoyant density-gradientsedimentation in metrizamide // Methods Cell Biol. -1978. -V. 18. -P. 23-39.

340. Rickwood, D., Hell, A., Birnie, G. D. Isopycnic centrifugation of sheared chromatin in metrizamide gradients //FEBS Lett. -1973. -V. 33. -P. 221-224.

341. Itzhaki, R. F., Hell, A., Birnie, G. D. Fractionation of chromatin by differential solubility in dilute salt //Nucleic.Acids.Res. -1978. -V. 5. -P. 739-750.

342. Rickwood, D., Hell, A., Malcolm, S., Birnie, G. D., MacGillivray, A. J., Paul, J. Fractionation of unfixed chromatin by buoyant-density centrifugation // Biochim.Biophys.Acta-1974. -V. 353 . -P. 353-361.

343. Rickwood, D., Birnie, G. D., MacGillivray, A. J. A study of the interaction of histones with DNA using isopycnic centrifugation in metrizamide gradients // Nucleic.Acids.Res. -1975. -V. 2. -P. 723-733.

344. Charney, E. Electric linear dichroism and birefringence of biological polyelectrolytes // Q.Rev.Biophys. -1988. -V. 21. -P. 1 -60.

345. McGhee, J.D., Charney, E., Felsenfeld, G. Orientation of the nucleo-some within the higher order structure of chromatin//Cell-1980.-V.22.-P. 87-96.

346. Rill, R., Van Holde, K. E. Electric dichroism of chromatin // J.Mol.Biol. -1974. -V. 83. -P. 459-471.

347. Bradbury, E. M., Baldwin, J. P., Carpenter, B. G„ Hjelm, R. P., Hancock, R„ Ibel, K. Neutron-scattering studies of chromatin // Brookhaven.Symp.Biol. -1976. -V. -P. IV97-IV117.

348. Bradbury, E. M., Hjelm, R. P., Jr., Carpenter, B. G., Baldwin, J. P., Kneale, G. G. Histone interactions and chromatin structure, pp. 117-37 // In:.Vogel.HJ,.ed. -1977. -V.

349. Braddock, G. W., Baldwin, J., Bradbury, E. Neutron-scattering studies of the structure of chromatin core particles in solution // Biopolymers -1981.-V.20.-P.327-343.

350. Kneale, G. G., Baldwin, J. P., Bradbury, E. M. Neutron scattering studies of biological macromolecules in solution//Q.Rev.Biophys.-1977.-V.10.-P.485-527.

351. Lasters, I., Wyns, L., Muyldermans, S., Baldwin, J. P., Poland, G. A., Nave, C. Scatter analysis of discrete-sized chromatin fragments favours a cylindrical organization // Eur.J.Biochem. -1985. -V. 151. -P. 283-289.

352. Suau, P., Bradbury, E. M., Baldwin, J. P. Higher-order structures of chromatinin solution // Eur J.Biochem. -1979. -V. 97. -P. 593-602.

353. Spirin, K. S., Grigor'ev, S. A., Krashennikov, I. A. The effect of differences in the structure of transcription- active and inactive chromatin by a DNP electrophoresis method. // Dokl.Akad.Nauk.SSSR.-1988.-V. 300.-P.490-493.

354. Spirin, K. S., Grigor'ev, S. A., Krasheninnikov, I. A. Mechanism of formation of associated oligonucleosomes during electrophoresis. //Mol.Biol.Mosk. -1988. -V. 22. -P. 1530-1538.

355. Weintraub, H. Histone-Hl-dependent chromatin superstructures and the suppression of gene activity // Cell -1984. -V. 38. -P. 17-27.

356. Wu, R. S., Panusz, H. T., Hatch, C. L., Bonner, W. M. Histones and their modifications // CRC Crit.Rev.Biochem. -1986. -V. 20. -P. 201-263.

357. Vermaak, D., Wolffe, A. P. Chromatin and chromosomal controls in development//Dev.Genet. -1998. -V. 22. -P. 1-6.

358. Wolffe, A. P., Kurumizaka, H. The nucleosome: a powerful regulator of transcription // Prog.Nucleic.Acid.Res.Mol.Biol.-1998.-V.61:379-422. -P. 379-422.

359. Doenecke, D., Gallwitz, D. Acetylation of histones in nucleosomes // Mol.Cell Biochem. -1982. -V. 44. -P. 113-128.

360. Doenecke, D., Albig, W, Bode, C., Drabent, B., Franke, K., Gavenis, K, Witt, O. Histones: genetic diversity and tissue-specific gene expression // Histochem.Cell

361. Biol.-1997.-V. 107.-P. 1-10.

362. Ajiro, K. Histone H2B phosphorylation in mammalian apoptotic cells. An association with DNA fragmentation // J.Biol.Chem.2000.Jan.7;275(l):439-43. -1999. -V. 275. -P. 439-443.

363. Mazen, A., Hacques, M. F., Marion, C. H3 phosphorylation-dependent structural changes in chromatin. Implications for the role of very lysine-rich histones // J.Mol.Biol. -1987. -V. 194. -P. 741-745.

364. Ajiro, K, Nishimoto, T. Specific site of histone H3 phosphorylation rela-ted to the maintenance of premature chromosome condensation. Catalytically in-duced interchange of the subunits // J.Biol.Chem. -1985. -V. 260. -P. 15379-15381.

365. Sogo, J. M., Thoma, F. Electron microscopy of chromatin // Methods Enzymol. -1989. -V. 170. -P. 142-165.

366. Thoma, F., Roller, T. Unravelled nucleosomes, nucleosome beads and higher order structures of chromatin: influence of non-histone components and histone HI // J.Mol.Biol. -1981. -V. 149. -P. 709-733.

367. Thoma, F., Koller, T. Influence of histone HI on chromatin structure I I Cell -1977.-V. 12.-P. 101-107.

368. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays // Mol.Cell Biol. -1996. -V. 16. -P. 3112-3124.

369. Ito, T., Tyler, J. K, Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. ATP-facilitated chromatin assembly with a nucleoplasmin-like protein from Drosophila melanogaster // J.Biol.Chem. -1996. -V. 271. -P. 25041-25048.

370. Ito, T., Bulger, M., Pazin, M. J., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. ACF, an ISWI-containing and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor // Cell -1997. -V. 90. -P. 145- 155.

371. Varga Weisz, P. D., Wilm, M., Bonte, K, Dumas, K, Mann, M., Becker, P. B. Chromatin-remodelling factor CHRAC contains the ATPases ISWI and topoisomerase D//Nature-1997. -V. 388. -P. 598-602.

372. Mathis, D. J., Oudet, P., Wasylyk, B., Chambon, P. Effect of histone acetylation on structure and in vitro transcription of chromatin // Nucleic.Acids.Res.1978.-V. 5.-P. 3523-3547.

373. Weisbrod, S. Active chromatin //Nature -1982. -V. 297. -P. 289-295.

374. Dingwall, C., Laskey, R. A. Nucleoplasmin: the archetypal molecular chaperone // Semin.Cell Biol. -1990. -V. 1. -P. 11-17.

375. Chen, H., Li, B., Workman, J. L. A histone-binding protein, nucleoplasmin, stimulates transcription factor binding to nucleosomes and factor-induced nucleosome disassembly // EMBO J. -1994. -V. 13. -P. 380-390.

376. Leuba, S. H, Zlatanova, J., van Holde, K. On the location of histones HI and H5 in the chromatin fiber. Studies with immobilized trypsin and chymotrypsin // J.Mol.Biol. -1993. -V. 229. -P. 917-929.

377. Zlatanova, J., van Holde, K. The linker histones and chromatin structure: new twists // Prog.Nucleic.Acid.Res.Mol.Biol. -1996. -V. 52. -P. 217-259.

378. Krajewski, W A. Chromatin structural transitions in Drosophila embryo cellfree extract result in a high conformational flexibility of nucleosomal DNA // FEBS Lett. -1999. -V. 452. -P. 215-218.

379. Csordas, A. On the biological role of histone acetylation // Biochem.J. -1990. -V. 265. -P. 23-38.

380. Yoshida, M., Horinouchi, S., Beppu, T. Trichostatin A and trapoxin: novel chemical probes for the role of histone acetylation in chromatin structure and function // Bioessays -1995. -V. 17. -P. 423-430.

381. Kamakaka, R. T., Bulger, M., Kadonaga, JT. Potentiation of RNA polymerase II transcription by Gal4-VP16 during but not after DNA replication and chromatin assembly // Genes Dev. -1993. -V. 7. -P. 1779-1795.

382. Munks, R. J., Turner, B. M. Suppression of heat-shock protein synthesis by fatty acids and alcohols // Biochim.Biophys.Acta -1994. -V. 1223.-P. 23-28.

383. Perry, C. A., Annunziato, A. T. Influence of histone acetylation on the solubility, HI content and DNase I sensitivity of newly assembled chromatin // Nucleic.Acids.Res. -1989. -V. 17. -P. 4275-4291.

384. Perry, C., Annunziato, A. Histone acetylation reduces HI-mediated nucleo-some interactions during chromatin assembly // Exp.Cell Res. -1991.-V.196.-P.337-345.

385. Davie, J. R., Hendzel, M. J. Multiple functions of dynamic histone acetylation // J.Cell Biochem. -1994. -V. 55. -P. 98 -105.

386. Ridsdale, J. A., Hendzel, M J., Delcuve, G. P., Davie, J. R. Histone acetylation alters the capacity of the HI histones to condense transcriptionally active/competent chromatin // J.Biol.Chem. -1990. -V. 265. -P. 5150-5156.

387. Pederson,D.S., Thoma,F., Simpson,R.T. Core particle, fiber, transcriptionally active chromatin structure // Annu.Rev.Cell.Biol.-1986.-V.2.-P.l 17-147.

388. Krajewski, W. A., Razin, S. V. DNA-protein interactions and spatial organization of DNA // Mol.Biol.Rep. -1993. -V. 18. -P. 167-175.

389. Travers, A. A., Muyldermans, S. V. A DNA sequence for positioning chromatosomes // J.Mol.Biol. -1996. -V. 257. -P. 486-491.

390. Muyldermans, S., Travers, A. A. DNA sequence organization in chromatosomes //J.Mol.Biol. -1994. -V. 235. -P. 855-870.

391. Ito, T., Ikehara, T., Nakagawa, T., Kraus, W. L,, Muramatsu, M. p300-mediated acetylation facilitates the transfer of histone H2A-H2B dimers from nucleosomes to a histone chaperone // Genes Dev. -2000. -V. 14. -P. 1899-1907.

392. McLean, M. J., Lee, J. W„ Wells, R. D. Characteristics of Z-DNA helices formed by imperfect (purine- pyrimidine) sequences in plasmids // J.Biol.Chem. -1988. -V. 263. -P. 7378-7385.

393. McLean, M.J., Wells, R.D. The role of DNA sequence in the formation of Z-DNA versus cruciforms in plasmids //J.Biol.Chem.-1988.-V.263.-P.7370-7377.

394. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Irresistible force meets immovable object: transcription and the nucleosome // Cell -1991. -V. 67. -P. 833-836.

395. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome // Cell.-1999.-V. 98. -P. 285-294.

396. Lorch, Y., LaPointe, J. W, Kornberg, R. D. On the displacement of histones from DNA by transcription // Cell -1988. -V. 55. -P. 743-744.

397. Batson, S. C., Sundseth, R., Heath, C. V., Samuels, M., Hansen, U. In vitro initiation of transcription by RNA polymerase II on in vivo-assembled chromatin templates //Mol.Cell Biol. -1992. -V. 12. -P. 1639-1651.

398. Batson, S.C., Rimsky, S., Sundseth, R., Hansen, U. Association of nucleo-some-free regions and basal transcription factors with in vivo-assembled chromatin templates active in vitro //Nucleic.Acids.Res. -1993. -V. 21. -P. 3459-3468.

399. Adams, C. C., Workman, J. L. Nucleosome displacement in transcription // Cell -1993. -V. 72. -P. 305-308.

400. Workman, J. L., Buchman, A. R. Multiple functions of nucleosomes and regulatory factors in transcription // Trends.Biochem.Sci. -1993. -V. 18. -P. 90-95.

401. Gruss,C.,Sogo,J.M. Chromatin replication//Bioessays-1992.-V.14.-P.l-8.

402. Gruss, C., Wu, J., Koller, T., Sogo, J. M. Disruption of the nucleosomes at the replication fork//EMBO J. -1993. -V. 12. -P. 4533-4545.

403. Cullen, B. R., Raymond, K., Grace, J. Functional analysis of the transcription control region located within the avian retroviral long terminal repeat // Mol.Cell Biol. -1985. -V. 5. -P. 438-447.

404. Wells, R. D., Brennan, R., Chapman, K. A., Goodman, T. C., Hart, P. A., u dp. Left-handed DNA helices, supercoiling, and the B-Z junction // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. -1983. -V. 47 Pt 1. -P. 77-84.

405. Wells, R. D. Unusual DNA structures // J.Biol.Chem. -1988. -V. 263. -P. 1095-1098.

406. DePamphilis, M. L. Replication origins in metazoan chromosomes: fact or fiction? //Bioessays. -1999. -V. 21. -P. 5-16.

407. DePamphilis, M. L. Origins of DNA replication in metazoan chromosomes // J.Biol.Chem. -1993. -V. 268. -P. 1-4.

408. Berezney,R., Dubey,D, HubermanJ. Heterogeneity of eukaryotic repli-cons,replicon clusters,and replication foci//Chromosoma.-1999.-V.108.-P.471-484.

409. Santocanale, C., Diffley, J. F. Genomic footprinting of yeast replicationorigins during the cell cycle // Methods Enzymol. -1997. -V. 283. -P. 377-390.

410. Donovan, S., Diffley, J. F. Replication origins in eukaroytes // Curr.Opin.Genet.Dev. -1996. -V. 6. -P. 203-207.

411. Deb, S., Doelberg, M. A 67-bp segment from the Ori-S region of herpes simplex virus encodes origin function // J.Virol. -1988. -V. 62. -P. 2516-2519.

412. DeLucia, A. L., Deb, S., Partin, K, Tegtmeyer, P. Functional interactions of the simian virus 40 core origin of replication with flanking regulatory sequences // J.Virol. -1986. -V. 57. -P. 138-144 .

413. Schnos, M., Zahn, K., Inman, R. B., Blattner, F. R. Initiation protein induced helix destabilization at the lambda origin: a preprinting step in DNA replication // Cell -1988. -V. 52. -P. 385-395.

414. Snyder, M, Buchman, A. R., Davis; R. W. Bent DNA at a yeast autonomously replicating sequence //Nature -1986. -V. 324. -P. 87-89.

415. Razin, S. V., Vassetzky, Y S., Hancock, R. Nuclear matrix attachment regions and topoisomerase II binding and reaction sites in the vicinity of a chicken DNA replication origin//Biochem.Biophys.Res.Commun.-1991 .-V. 177.-P.265-270.

416. Cohen, S. N., Yielding, K. L. Interaction of chloroquine diphospate with DNA duplex//J.Biol.Chem. -1965. -V. 240. -P. 3123-3131.

417. Waring, M. Variation of the supercoils in closed circular DNA by binding // J.Mol.Biol. -1970. -V. 54. -P. 247-249.

418. Wu, P., Schurr, J. M. Effects of chloroquine on the torsional dynamics and rigidities of linear and supercoiled DNAs at low ionic strength // Biopolymers -1989. -V. 28.-P. 1695-1703.

419. Cech, T., Potter, D., Pardue, M L. Electron microscopy of DNA cross-linked with trimethylpsoralen: a probe for chromatin structure // Biochemistry -1977. -V. 16. -P.5313-5321.

420. Cech, T., Pardue, M. L. Cross-linking of DNA with trimethylpsoralen is a probe for chromatin structure // Cell -1977. -V. 11. -P. 631-640.

421. Sogo, J. M., Ness, P. J., Widmer, R. M., Parish, R. W., Koller, T. Psoralen-crosslinking of DNA as a probe for the structure of active nucleolar chromatin // J.Mol.Biol. -1984. -V. 178. -P. 897-919.

422. Krajewski, W. A., Panin, V. M., Razin, S. V. A simple and reproducible method for analysis of chromatin condensation // Biochem.Biophys.Res.Commun. -1993.-V. 193.-P. 113-118.

423. Krajewski, W. A., Ausio, J. Modulation of the higher-order folding of chromatin by deletion of histone H3 and H4 terminal domains // BiochemJ. -1996. -V. 316.-P. 395-400.

424. Krajewski, W. A., Ausio, J. Relationship between chromatin high-order folding and nucleosomal linker twist in nuclei of human HeLa s3 cells // J.Biomol.Struct.Dyn. -1997. -V. 14. -P. 641-649.

425. Lang, H., Vengerov, Y Y., Popenko, V. I., Zimmer, C. Structural transi-tions of chromatin induced by netropsin//Acta Biol.Med.Ger.-1979.-V.38.-P.33-40.

426. Masnyk, T., Minton, K. Formation of single and double strand breaks in DNA ultraviolet irradiated at high intensity // Photochem.Photobiol. -1991. -V. 54. -P. 99-107.

427. Hieda, K., Hayakawa, Y., Ito, A., Kobayashi, K, Ito, T. Wavelength dependence of the formation of single-strand breaks and base changes in DNA by the ultraviolet radiation above 150 nm// Photochem.Photobiol.-1986.-V.44.-P.379-383.

428. Fernandez, J. L., Gosalvez, J., Goyanes, V. J. Detection of DNA strand breaks induced by hydroxyl radicals in nuclear and chromosomal chromatin by electron microscopy // Cytobios -1993. -V. 73. -P. 189-195.

429. Allan, I. M., Vaughan, A. T., Milner, A. E., Lunec, J., Bacon, P. A. Structural damage to lymphocyte nuclei by H202 or irradiation is dependent on the mechanism of OH. radical production // Br.J.Cancer -1988. -V. 58. -P. 34-37.

430. Vendrely, R. Recent data on histones //Pathol.Biol.-1967.-V. 15.-P.71-77.

431. Sinden, R. R., Ussery, D. W. Analysis of DNA structure in vivo using psoralen1photobinding: measurement of supercoiling, topological domains, and DNA-protein interactions // Methods Enzymol. -1992. -V. 212. -P. 319-335.

432. Lerman, L. S. Torsional motion and elasticity of the deoxyribonucleic acid double helix// J.MoLBiol. -1961. -V. 3. -P. 18-26.

433. Yao, J., Lowary, P. T., Widom, J. Direct detection of linker DNA bending in defmed-length oligomers of chromatin // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1990. -V. 87. -P. 7603-7607.

434. McMurray, C. T., Van Holde, K. E. Binding of ethidium bromide causes dissociation of the nucleosome core particle // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1986. -V. 83. -P. 8472-8476.

435. McMurray, C. T., Small, E. W., Van Holde, K. E. Binding of ethidium to the nucleosome core particle. 2. Internal and external binding modes // Biochemistry -1991. -V. 30. -P. 5644-5652.

436. McMurray, C. T., Van Holde, K. E. Binding of ethidium to the nucleosome core particle. 1. Binding and dissociation reactions // Biochemistry -1991. -V. 30. -P. 5631-5643.

437. Pani, B., Plossi, P., Russo, E. HMG proteins released from the chromatin following incubation of mammalian nuclei with ethidium bromide // Exp.Cell Res.1989. -V. 180. -P. 557-562.

438. Schroter, H, Maier, G., Ponstingl, H, Nordheim, A. DNA intercalators induce specific release of HMG 14, HMG 17 and other DNA-binding proteins from chicken erythrocyte chromatin // EMBO J. -1985. -V. 4. -P. 3867-3872.

439. Ausio, J., Dong, F., Van Holde, K. E. Use of selectively trypsinized nucleosome core particles to analyze the role of the histone "tails" in the stabilization of the nucleosome//J.Mol.BioI. -1989. -V. 206. -P. 451-463.

440. Hacques, M. F., Muller, S., de Murcia, G., van Regenmortel, M. H., Marion,

441. C. Accessibility and structural role of histone domains in chromatin, biophysical and immunochemical studies of progressive digestion with immobilized proteases // J.Biomol.Struct.Dyn. -1990. -V. 8. -P. 619-641.

442. Marion, C., Roux, B., Coulet, P. R. Role of histones HI and H3 in the maintenance of chromatin in a compact conformation. Study with an immobilized enzyme // FEBS Lett. -1983. -V. 157. -P. 317-321.

443. Bohm, L., Crane Robinson, C. Proteases as structural probes for chromatin: the domain structure of histones // Biosci.Rep. -1984.-V. 4.-P. 365-386.

444. Girardot, V., Rabilloud, T., Yoshida, M., Beppu, T., Lawrence, J. J., Khochbin, S. Relationship between core histone acetylation and histone H1(0) gene activity // EurJ.Biochem. -1994. -V. 224. -P. 885-892.

445. Hoshikawa,Y., Kwon, H., Yoshida,M., Horinouchi,S., Beppu,T. Trichostatin A induces morphological changes and gelsolin expression by inhibiting histone deace-tylase in human carcinoma cell lines // Exp.Cell Res. -1994. -V. 214. -P. 189-197.

446. Garcia Ramirez, M., Dong, F., Ausio, J. Role of the histone "tails" in the folding of oligonucleosomes depleted of histone HI // J.Biol.Chem. -1992. -V. 267. -P. 19587-19595.

447. Moore, S. C., Ausio, J. Major role of the histones H3-H4 in the folding of the chromatin fiber // Biochem.Biophys.Res.Commun. -1997.-V. 230. -P. 136-139.

448. Usachenko, S. I., Bavykin, S. G., Gavin, I. M., Bradbury, E. M. Rearrangement of the histone H2A C-terminal domain in the nucleosome // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1994. -V. 91. -P. 6845-6849.

449. All. Ausio, J. Structure and dynamics of transcriptionally active chromatin // J.Cell Sci. -1992. -V. 102. -P. 1-5.

450. Bradbury, E. M Reversible histone modifications and the chromosome cell cycle // Bioessays -1992. -V. 14. -P. 9-16.

451. Onishchenko, G. E., Chentsov, I. Granular layer of peripheral chromatin in the interphase nucleus. I. Ultrastructure. //Tsitologiia.-1974.-V. 16. -P. 675-678.

452. Bohm, L., Crane Robinson, C., Sautiere, P. Proteolytic digestion studies of chromatin core-histone structure. Identification of a limit peptide of histone H2A // Eur.J.Biochem. -1980. -V. 106. -P. 525-530.

453. Böhm, L., Briand, G., Sautiere, P., Crane Robinson, C. Proteolytic digestion studies of chromatin core-histone structure. Identification of the limit peptides of histones H3 and H4 // EurJ.Biochem. -1981. -V. 119. -P. 67 -74.

454. Böhm, L., Briand, G., Sautiere, PCrane Robinson, C. Proteolytic digestion studies of chromatin core-histone structure. Identification of limit peptides from histone H2B // EurJ.Biochem. -1982. -V. 123. -P. 299-303.

455. Theobald, D. L., Mitton-Fry, R. M, Wuttke, D. S. Nucleic Acid Recognition by OB-Fold Proteins // Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct. -2003. -V. 32. -P. 115-133.

456. Lohman, T. M., Ferrari, M. E. Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein: multiple DNA-binding modes and cooperativities. // Annu.Rev.Biochem. -1994. -V. 63. -P. 527-570.

457. Combet, C, Jambón, G., Geourjon, C. Geno3D: automatic comparative molecular modelling of protein // Bioinformatics -2002. -V. 18. -P. 213-214.

458. Katsani, K. R., Arredondo, J. J., Kal, A. J., Verrijzer, C. P. A homeotic mutation in the trithorax SET domain impedes histone binding // Genes Dev. -2001. -V. 15.-P. 2197-2202.

459. Krajewski, W. A., Panin, V. M., Krylov, D. Y., Razin, S. V. Flexibility of DNA within transcriptionally active nucleosomes: analysis by circular dichroism measurements //J.Biomol.StructDyn. -1993. -V. 10. -P. 1001-1011.

460. Hozak, P., Hassan, A. B., Jackson, D. A., Cook, P. R. Visualization of replication factories attached to nucleoskeleton // Cell -1993. -V. 73. -P. 361-373.

461. Jackson, D. A,, Cook, P. R, Patel, S. B. Attachment of repeated sequences to the nuclear cage //Nucleic.Acids.Res. -1984. -V. 12. -P. 6709-6726.

462. Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication occurs at a nucleoskeleton // EMBO J. -1986. -V. 5. -P. 1403-1410.

463. Jackson, D. A. Structure-function relationships in eukaiyotic nuclei // Bioessays -1991. -V. 13. -P. 1-10.

464. Jackson, D. A., Do lie, A., Robertson, G, Cook, P. R. The attachments of chromatin loops to the nucleoskeleton // Cell Biol.Int.Rep.-1992.-V.16.-P.687-696.

465. Paulson, J. R. Scaffold morphology in histone-depleted HeLa metaphase chromosomes // Chromosoma -1989. -V. 97. -P. 289-295 .

466. Collins, L, Weber, A., Levens, D. Transcriptional consequences of topoisomerase inhibition//Mol.Cell Biol. -2001. -V. 21. -P. 8437-8451.

467. Pazin, M. J., Kadonaga, J. T. SWI2/SNF2 and related proteins: ATP-driven motors that disrupt protein-DNA interactions?//Cell-1997.-V.88.-P.737-740.

468. Lutter, L. C., Judis, L., Paretti, R. F. Effects of histone acetylation on chromatin topology in vivo // Mol.Cell Biol. -1992. -V. 12. -P. 5004-5014.

469. Krajewski, W. A. Enhancement of transcription by short alternating C.G tracts incorporated within a Rous sarcoma virus-based chimeric promoter: in vivo studies // Mol.Gen.Genet. -1996. -V. 252. -P. 249-254.

470. Sarkar, A., Marko, J. F. Removal of DNA-bound proteins by DNA twisting // Phys.Rev.E.Stat.Nonlin.Soft.MatterPhys. -2001. -V. 64. -P. 061909-.

471. Schiessel, H., Widom, J., Bruinsma, R, Gelbart, W. M. Polymer reptation and nucleosome repositioning // Phys.Rev.Lett. -2001. -V. 86. -P. 4414-4417.

472. Luger, K., Richmond, T. J. DNA binding within the nucleosome core // Curr.Opin.Struct.Biol. -1998. -V. 8. -P. 33-40.

473. Lancillotti, F., Lopez, M. C., Alonso, C., Stollar, B. D. Locations of Z-DNA in polytene chromosomes//J.CellBiol. -1985. -V. 100. -P. 1759-1766.

474. Lancillotti, F., Lopez, M. C., Arias, P., Alonso, C. Z-DNA in transcriptio-nally active chromosomes // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1987.-V.84.-P. 1560-1564.

475. Muller, V., Takeya, M., Brendel, S.,, Rich, A. Z-DNA-forming sites within the human beta-globin gene cluster// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1996. -V. 93. -P. 780-784.

476. Wittig, B., Dorbic, T., Rich, A. Transcription is associated with Z-DNA formation in metabolically active permeabilized mammalian cell nuclei // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. -1991. -V. 88. -P. 2259-2263.

477. Wittig, B., Wolfl, S., Dorbic, T., Vahrson, W, Rich, A. Transcription of human c-myc in permeabilized nuclei is associated with formation of Z-DNA in three discrete regions of the gene // EMBO J. -1992. -V. 11. -P. 4653-4663.

478. Leonard, M. W., Patient, R. K. Evidence for torsional stress in transcriptionally activated chromatin//Mol.Cell Biol. -1991.-V.il. -P. 6128-6138.

479. Garner, M. M, Felsenfeld, G. Effect of Z-DNA on nucleosome placement // J.Mol.Biol. -1987. -V. 196. -P. 581-590.

480. Nobile, C., Nickol, J., Martin, R. G. Nucleosome phasing on a DNA fragment from the replication origin of simian virus 40 and rephasing upon cruciform formation of the DNA // Mol.Cell Biol. -1986. -V. 6. -P. 2916-2922.

481. Drew, H. R., Trovers, A. A. DNA bending and its relation to nucleosome positioning//J.Mol.Biol. -1985. -V. 186. -P. 773-790.

482. Satchwell, S. C., Drew, H. R., Trovers, A. A. Sequence periodicities in chicken nucleosome core DNA // J.Mol.Biol. -1986. -V. 191. -P. 659-675.

483. Hoshikawa, Y., Kwon,H., Yoshida,M., Horinouchi, S., Beppu, T. Trichostatin A induces morphological changes and gelsolin expression by inhibiting histone deacetylase in human carcinoma cell lines // Exp.Cell Res. -1994.-V.214. -P. 189-197.

484. Tikoo, K., Gupta, S., Hamid, Q. A., Shah, V., Chatterjee, B., Ali, Z. Structure of active chromatin: isolation and characterization of transcriptionally active chromatin from rat liver // BiochemJ. -1997. -V. 322. -P. 273-279.

485. Tikoo, K., Hamid, Q. A., Ali, Z Structure of active chromatin: higher-order folding of transcriptionally active chromatin in control and hypothyroid rat liver // BiochemJ. -1997. -V. 322. -P. 289-296.

486. Allan, J., Cowling, G. J., Harborne, N., Cattini, P., Craigie, R., Gould, H. Regulation of the higher-order structure of chromatin by histones HI and H5 // J.Cell Biol.-1981.-V. 90.-P. 279-288.

487. Allan, J., Harborne, N., Gould, H. Participation of histone "tails" in the stabilization of the chromatin solenoid //J.Cell Biol.-1982.-V.93.-P.285-297.

488. Allan, J., Mitchell, T., Harborne, N., Bohm, L., Crane Robinson, C. Roles of HI domains in determining higher order chromatin structure and HI location // J.Mol.Biol. -1986. -V. 187. -P. 591-601.

489. Breen, T. R Mutant alleles of the Drosophila trithorax gene produce common and unusual homeotic and other developmental phenotypes // Genetics -1999. -V. 152. -P. 319-344.

Информация о работе

Краевский, Владислав Александрович
доктора биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.30

Диссертация

Молекулярные перестройки хроматина и их роль в регуляции дифференциальной экспрессии генов в ходе развития - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы