Молекулярные механизмы участия в гемостазе протромбина и продуктов его активации

Тимербаев, Владимир Нуреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы участия в гемостазе протромбина и продуктов его активации
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы участия в гемостазе протромбина и продуктов его активации"

РГЬ ол

На правах рукописи

Тимербаев Владимир Нуреевич

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ УЧАСТИЯ В ГЕМОСТАЗЕ ПРОТРОМБИНА И ПРОДУКТОВ ЕГО АКТИВАЦИИ

03.00.04 - Биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Казанском Государственном медицинском университете

Научные консультант: академик РАЕН, доктор медицинских наук.

профессор Д.М. Зубаиров

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор С.М. Струкова,

доктор медицинских наук, профессор Н.А. Федоров

лауреат Государственной премии СССР, доктор биологических наук, профессор Е.Г.Зезеров

Ведущее учреждение: Санкт-Петербурский Государственный

медицинский университет им. академика И.П.Павлова

Защита состоится " " С&НяиядрА1997 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д.074. 05.10 при Московской медицинской академии И.М.Сеченова по адресу: Москва, Б.Пироговская ул., 2-6.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке ММА им. И.М.Сеченова по адресу: Москва, Зубовский бульвар, 37/1.

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.074.05.10 кандидат медицинских наук, доцент

А. Ю. Миронов

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время проблема свертывания крови имеет такое же юльшое значение для теории и клинической практики как и в начале ¡е изучения. Нарушения свертывания крови являются составным эле-[ентом патогенеза многих сердечно-сосудистых, инфекционных, иммунных заболеваний, хирургической и акушерской патологии. Необходи-гость предупреждения и лечения тромбозов и геморрагических состоя-ий, создание атромбогенных материалов требуют более глубокого юзнания механизма свертывания крови и его регуляции. В последние 'оды благодаря усилиям отечественных и зарубежных ученых удалось [риблизиться к пониманию некоторых молекулярных механизмов сосу-исто-тромбоцитарного гемостаза и уточнить последовательность [ревращений факторов свертывания в плазменном гемостазе (Д.М.Зу-¡аиров, 1982; С.М.Струкова 1983; 3.С.Баркаган, 1988; Б.И.Кузник и (р., 1989; А. Ш. Бышевский и др., 1993; Y.Nemerson, 1988; К. G.Mann и [р., 1990; R.F.A.Zwaal и др.. 1993; М.D.Rand и др., 1996). Вместе ; тем, несмотря на прогресс в понимании отдельных стадий, как и в [ачале изучения проблемы, остается неясным как и почему начинается ¡вертывание крови, какова физико-химическая природа исходного им-1ульса, включающего этот процесс в целом. Нерешенность этого воп-)оса тормозит дальнейшее развитие всей проблемы свертывания крови, юобенно в ее клиническом аспекте.

Анализ современных данных о свертывании крови показывает, что ¡ыяснить как инициируется этот процесс можно лишь при изучении мо-юкулярных механизмов сопряжения сосудието-тромбоцитарного и плаз-юнного гемостаза. Клинические наблюдения показывают, что контакт-1Ый механизм инциирования свертывания не является абсолютно обязательным. Он не может служить для сопряжения различных стадий ге-гастаза. В каскаде генерации тромбина абсолютно необходимы только :е реакции, в которых участвуют витамин K-зависимые факторы VII, X X и протромбин. Они последовательно активируются при участии юнов Са2+ в нескольких ферментных комплексах. Комплексы имеют од-ютипную организацию, включающую наряду с ферментом и субстратом )'елок-кофактор и каталитическую фосфолипидную поверхность. Необхо-дамые для свертывания фосфолипиды поступают из мембран клеток.

соприкасающихся с кровью. В норме, при отсутствии стимуляции повреждения мембраны клеток атромбогенны. Ясно, что превращен!' атромбогенной фосфолипопротеиновой поверхности клеточных мембран каталитически активную, способную связывать витамин К-зависимь факторы, является неотъемлемым элементом сопряжения разных стада гемостаза и его инициирования.

До начала настоящих исследований было установлено, что пр образовании ферментных комплексов витамин К-зависимых факторе происходит связывание их с кислыми фосфолипидами мембран, главнь образом, фосфатидилсерином. Связывание обеспечивается Са2+-опосре дованным взаимодействием отрицательно заряженных групп фосфолипи дов и остатков "у-карбоксиглутаминовой кислоты (Гла) в белке. Одна ко, ничего не известно о том как образуется каталитически активна фосфолипидная поверхность и как происходит формирование ферментнь комплексов витамин К-зависимых факторов. В коагулологии не усвоен новые данные о фазовых переходах в биологических мембранах и изме нениях их структуры для обеспечения различных клеточных функций секреции, фагоцитоза, движения и др. Это является, на наш взгляд причиной отсутствия каких бы то ни было представлений о значени структуры фосфолипопротеиновой поверхности для формирования и ра боты ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов и в цело в инициировании свертывания крови. Кроме того, инициирование этот процесса не может быть сведено только к образованию подходяще фосфолипидной поверхности для связывания витамин К-зависимых фак торов. В последовательной цепи их превращений есть реакции положи тельной обратной связи. Фактор Ха и тромбин активируют фактор УП а фактор УПа активирует фактор IX. Таким образом, каскад обяза тельных реакций генерации тромбина должен запускаться при появле нии первой активной молекулы любого из этих факторов. Каков основ ной механизм появления первой активной молекулы витамин К-зависи мых факторов остается неизвестным. Ясно, что образование каталити ческой фосфолипидной поверхности при инициировании свертывани связано и с первичной активацией одного из этих факторов. Таки образом, выяснение принципов организации и работы ферментных комп лексов витамин К-зависимых факторов является фундаментальной зада чей всей проблемы свертываемости крови.

Превращение протромбина в тромбин является ключевым звеном на котором замыкаются внутренний и внешний биохимические механизм

свертывания. Представлялось возможным выяснить основные черты работы ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов при изучении молекулярной структуры, активации и взаимодействия протромбина и его производных с фосфолипидной поверхностью и клетками. Это должно прояснить структурную основу каталитической активности фосфолипидной поверхности при свертывании и тем самым выяснить в основных чертах механизм приобретения клеточными мембранами тромбо-генных свойств и инициирования свертывания крови. В свете изложенного такое исследование представляется неизбежным этапом естественного развития проблемы свертываемости крови и является актуальным как в теоретическом так и в практическом отношении.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состояла в выяснении молекулярных механизмов формирования протромбиназного комплекса и превращения протромбина в тромбин.

Достижение цели работы требовало последовательного выполнения трех групп исследований - установления основных черт молекулярной структуры протромбина, характера взаимодействия его с фосфолипидной поверхностью и возможных вариантов его естественной активации. 3 соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и совершенствование методов очищения протромбина, продуктов его активации - фрагмента I, претромбина I и а-тром-зина, а также фактора X.

2. Установление основных физико-химических параметров молеку-ты протромбина (молекулярной массы, аминокислотного и углеводного состава, числа полипептидных и олигосахаридных цепей).

3. Выяснение характера связывания протромбина, продуктов его дативации и фактора X с тканевым тромбопластином.

4. Изучение спектра продуктов расщепления протромбина при со-¡евой активации и взаимодействии с фактором ХПа, с клетками Купфе-а и гепатоцитами.

5. Выявление в плазме крови продуктов активации протромбина -рагмента I и претромбина I.

6. Разработка представлений о механизме формирования фермент-ых комплексов витамин К-зависимых факторов и приобретения клеточ-ыми мембранами тромбогенных свойств.

_ 4 -Научная новизна

Разработаны новые методы очищения протромбина, отличающие* от существующих меньшей трудоемкостью при сравнимых выходе, чистс те и биологической активности препаратов. Автором одним из перв! установлены основные физико-химические параметры молекулы протро! бина - молекулярная масса, И- и С-концевые аминокислоты, аминокис лотный состав, число и состав углеводных цепей, соотношение фор пространственной структуры полипептидной цепи. Впервые для факте ров свертывания у протромбина выявлена микрогетерогенность по уг леводным цепям, что позволило разработать представление об участь их в стабилизации положения белка на фосфолипидной поверхности пр формировании протромбиназного комплекса. Впервые вывлены различнь типы фосфолипидных центров связывания витамин К-зависимых факторе на фосфолипопротеиновых частицах мезоморфной структуры (тканевс тромбопластине). Получены доказательства, что Са2+-опосредованнс связывание фвкторов с центрами обеспечивается в определенной мер непосредственно Са2+-независимым взаимодействием белка с фосфоли пидами. Установлено, что взаимодействие протромбина с центрам связывания обеспечивается 1*1-концевьм участком его молекулы. Обна ружено подавляющее действие ионов Са2+ на связывание ос-тромбина фосфолипопротеиновыми частицами, что должно обеспечивать быстро формирование фибринового сгустка при свертывании крови. Установле но отсутствие прямого активирующего действия фактора XI1а на прот ромбин, что свидетельствует о самостоятельном значении в механизм свертывания каскада активации витамин К-зависимых факторов как не делимого целого. Получены доказательства однотипности расщеплени протромбина при аутоактивации в растворах солей, спонтанном распа де и естественной активации фактором Ха и тромбином. Установлено что катаболизм протромбина протекает с расщеплением его в циркули рующей крови на фрагмент I и претромбин I, которые затем поглоща ются клетками фагоцитарно-макрофагальной системы.

Теоретическая ценность работы

На основе полученных экспериментальных данных автором разработан ряд теоретических положений и моделей, раскрывающих в общи: чертах механизмы формирования ферментных комплексов витамин К-за-

доимых факторов и инициирования свертывания крови. Впервые с уче-эм гидрофобного взаимодействия конкретизирован физический меха-<?зм Са2+-опосредованного связывания витамин К-зависимых факторов неоднородной поверхностью фосфолипопротеиновых частиц. Разрабо-ша модель "поверхностной массопередачи субстрата", объясняющая эханизм каталитического действия фосфолипидной поверхности при эрментативной активации факторов. Впервые разработано представле-*е о структурной основе развертывания каскада реакций образования эомбина в виде ансамбля ферментных комплексов витамин К-зависимых жторов на фосфолипидной поверхности с низкои высокоаффинными энтрами связывания. На основе достижения биоимитирующего катализа зкрыт механизм аутоактивации и распада протромбина и разработаны зедставления о неферментативном аргинилспецифичном протеолизе ви-шин К-зависимых факторов на поверхности фосфолипопротеиновых ютиц в циркулирующей крови, который ведет к запуску каскада их эрментативных превращений. Разработана функциональная концепция тациирования свертывания крови, в соответствии с которой тромбо-знность клеточных мембран обеспечивается индуцируемой через ре-эпторный аппарат перестройкой их бислойной структуры в мезоморф-/ю с формированием фосфолипидных центров связывания витамин К-за--юимых факторов. Обосновано положение о значении ионов Са2+ как зссенджера при свертывания крови.

Практическая значимость работы

Результаты работы позволяют непосредственно использовать их в эдико-биологических исследованиях. При изучении свертываемости зови оправдано использование разработанных методов очищения прот-змбина, отличающихся малой продолжительностью выделения белка, го существенно для достижения его высокой чистоты и активности. ж изучении действия тромбина, особенно на уровне организма, наи-злее предпочтительно применение изобретенного автором способа ме-зния его 1251, позволяющего полностью сохранить свертывающую ак~ явность радиоактивного фермента. Результаты исследования позволя-г предложить для изучения механизмов регуляции свертывания крови азработанный способ определения фрагмента I и претромбина I в чазме крови. Практическое значение работы состоит также в значи-эльном расширении возможностей перспективных исследований по соз-

данию новых средств предупреждения тромбозов и новых атромбогеннь материалов.

Положения, выносимые на защиту

1. Протромбин является плазменным гликопротеином с одной пс липептидной цепью преимущественно неупорядоченной структуры и 2-олигосахаридными цепями, которым присуща микрогетерогенность.

2. Протромбин и другие витамин К-зависимые факторы свертыва ния взаимодействуют на поверхности тканевого тромбопластина с дв;» мя типами фосфолипидных центров связывания, наличие которых обус ловлено мезоморфной структурой тромбопластина. Центры связывания различным сродством необходимы для формирования и поддержания кг талитической активности ферментных комплексов витамин К-зависимь факторов и их компактных ансамблей, обеспечивающих согласованное! реакций каскада генерации тромбина.Приобретение клеточными мембрг нами тромбогенных свойств связано с Са2+-опосредованной перестрой кой их бислойной структуры в мезоморфную.

3. Протромбин ввиду особенностей структуры (наличия остатке К-карбоксиглутаминовой кислоты) при контакте с отрицательно 3api женными поверхностями и хелатообразователями подвергаете Са2+-опосредованному аргинил-специфичному неферментативному проте олизу, имитирующему естественную активацию профермента. Биоимитк рующий протеолиз витамин К-зависимых факторов на трансформировав ной поверхности клеточных мембран является, по-видимому, неотъе^ лемым элементом инициирующего действия перестройки структуры плаз матических мембран на свертывание крови.

4. Катаболизм протромбина протекает с расщеплением свя; Арг155-Сер156 и появлением в кровотоке фрагмента I и претромбш I, которые могут участвовать в регуляции свертывания крови.

Связь исследований с научной программой

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом ш учных исследований КГМУ по теме:"Инициальные механизмы диссемию рованного внутрисосудистого свертывания крови", шифр 0.69.05, Гос. per. 01.84.0 039981, инв. N213.009-08.

- 7 -

Апробация работы

Материалы исследования доложены на II Всесоюзном биохимичес-ом съезде (Ташкент, 1969), Всесоюзном симпозиуме по химии протео-итических ферментов (Вильнюс, 1973), IV Всесоюзной конференции Система свертывания крови и фибринолиз" (Саратов, 1975), IV Все-оюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Ростов-на-Дону, 977), III Всесоюзной конференции "Противотромботическая терапия в линической практике. Новое в теории, диагностике, лечении" (Моск-а, 1985), Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы гемостаза в линической практике (Москва, 1987), Совещании Центрального совета сесоюзного биохимического общества АН СССР (Казань, 1988), Всесо-зной конференции "Физиология и патология гемостаза" (Полтава, Э91), Первом международном патофизиологическом конгрессе (Москва, 391), Российской конференции "Актуальные вопросы службы крови и эансфизиологии" (С.-Петербург, 1995).

Внедрение результатов исследования

Представления об инициировании свертывания крови фазовой пе-эстройкой клеточных мембран и биоимитирующим протеолизом витамин -зависимых факторов включены в новые переводные и отечественные тебники для высшей школы ("Гистология", "Терапия", "Педиатрия"), также в лекционные курсы на кафедрах биоорганической и биофизи-эской химии КГМУ и биологической химии Казанского университета, этод получения меченного 1251 а-тромбина с полностью сохраненной зертывающей активностью принят к реализации в исследованиях свер-¿ваемости крови на кафедре физиологии человека и животных биоло-1ческого факультета Московского университета.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе злучено авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания

методов исследований, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографии. Работа изложена на 241 странице машинописного текста, содержит 7 таблиц и 23 рисунка. Список литературы включает 298 источников, из них 252 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

В работе использовали протромбин человека, продукты его активации - фрагмент I, претромбин I и a-тромбин, a также фактор X человека и протромбин собаки. Исходные проферменты выделяли из плазмы крови. Протромбин человека адсорбировали на цитрате бария, сорбент промывали водой и непосредственно из суспензии белок высасывали сульфатом аммония. Протромбин обессоливали гель-фильтрацией и очищали далее хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А-50. Протромбина собаки очищали двукратной адсорбцией на цитрате бария с десорбцией при разрушении адсорбента путем ионного обмена и высаливанием сульфатом аммония. Белковый раствор диализовали против воды, после чего протромбин выделяли изоэлектрической преципитацией. Фактор X человека выделяли из фракций, полученных при хроматографии протромбина с помощью хроматографии на колонке с ДЭАЭ-аффигелем блю 15. Фрагмент I и претромбин I получали, расщепляя протромбин человека a-тромбином. Производные протромбина очищали далее хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А-50. ö-Тромбин выделяли хроматографией на SP-сефадексе по R.L.Lundblad и др. (1975) после биологической активации очищенного протромбина.

Чистоту белков исследовали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия {K.Weber, М. Osborn, 1969). Концентрацию белков определяли по O.H.Lowry и др. (1951), а также по оптической плотности раствора при 280 нм, используя известные удельные коэффициенты экстинкции и молекулярные массы. Биологическую активность протромбина и a-тромбина измеряли двухэтапным методом по S.Magnusson (1965). Активность факторов X и XII определяли по нормализации времени свертывания субстрат-дефицитных плазм человека. Спектрофотометрическими методами по инструкциям фирм-изготовителей определяли амидазную активность фактора X (на хромогенном субстрате S 2222) и эстеразную активность фактора XII (по гидроли-

- 9 -

у бензоиларгининэтилового эфира).

Молекулярную массу протромбина определяли методом скорости едиментации (H.K.Schachman, 1959). Коэффициенты седиментации и иффузии измеряли на аналитической ультрацентрифуге MOM G-120. дельный парциальный обьем определяли пикнометрическим методом, нализ N-концевой аминокислотной последовательности протромбина роводили фенилизотиоцианатным методом по Н.Fraenkel-Conrat 1954). ФТГ-производные аминокислот идентифицировали бумажной нис-одящей хроматографией по J.Sjoquist (1960). С-концевую аминокис-оту протромбина определяли методом гидразинолиза по Н.Fraen-el-Conrat и др. (1967) с анализом свободных аминокислот на амино-ислотном анализаторе ААА-881. При определении аминокислотного остава протромбин гидролизовали в растворе HCL В части экспери-ентов разделение аминокислот гидролизата осуществляли бумажной роматографией (Р.Блок, 1964). Количество аминокислот на хроматог-аммах определяли реакцией с нингидрином в прописи Т.С. Пасхиной 1964). В другой части экспериментов аминокислотный состав гидро-изатов белка определяли на аминокислотным анализаторе. При иссле-овании углеводного компонента протромбин расщепляли проназой комплекс протеаз Streptomyces griseus). Гликопептиды очищали ель-фильтрацией и ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. глеводный состав протромбина и его гликопептидов определяли после х дифференцированного гидролиза и последующего разделения свободах углеводов бумажной и ионообменной хроматографией. Нейтральные ахара определяли по Н. Hagedorn и В.N.Iensen (1923), аминосахара э L.A.Elson и W.T.J.Morgan (1933), сиаловые кислоты по реакции с soбарбитуровой кислотой (L.Warren, 1959) на бумажных хроматограм-3.x углеводы определяли по реакции восстановления хлористого три-знилтетразолия в жестких условиях (L.Szabados и др., 1968).

В исследовании использовали коммерческие и самостоятельно поученные препараты тканевого тромбопластина из мозга человека, заимодействие белков с ним изучали радиолигандным методом. Прот-змбин и фактор X человека метили 1251 хлораминовым методом О. Huter и F. С. Greenwood, 1962). Радиоактивные фрагмент I, прет-змбин I и а-тромбин получали из 1г51-протромбина путем биологи-зской активации профермента и хроматографического очищения меченого производного как указано выше, определяли уровень равновесно-з связывания меченных белков при различных концентрациях их в

присутствии 0, 005 M CaClg или ЭДТА с нативным тромбопластином тромбопластином подвергнутым частичному протеолизу папаином. Ради оактивность проб (расп/мин) измеряли на сцинтилляциокном счетчик Минигамма (KB "Wallac", Финляндия). Данные по связыванию белко представляли в координатах Скзтчарда (G.Scatchard, 1949). Расче параметров связывания - константы диссоциации (Kd) и числа центро связывания (Q) - проводили по специализированным программа (В. А.Пеккель. 1987).

Распад протромбина при инкубировании с эндотелиальными клет ками Купфера и гепатоцитами изучали с помощью электрофореза в по лиакриламидном геле. Клетки получали методом магнитного фракциони рования после нагружения печени собаки карбонильным железо: (Д.М.Зубаиров и др., 1970). Содержание фрагмента I и претромбина в плазме крови человека определяли методом перекрестного иммуноэ лектрофореза по Н.G.M.Clarke и Т.Freeman (1966).

Статистическую достоверность результатов определяли регресси онным и вариационным анализами по критерию Стьюдента при уровн значимости менее 0,05 (В.Ю.Урбах, 1975).

Результаты и их обсуждение

Физико-химические свойства протромбина. Витамин К-зависимы факторы свертывания отличаются низким содержанием в крови, больши сходством физико-химических свойств и значительной неустойчи востыо. Поэтому получение каждого белка в чистом виде достигаете с трудом. Простое воспроизведение известных методов выделения н гарантирует его полное очищение и достаточный выход. В связи этим мы разработали оригинальные процедуры получения протромбин человека и собаки, используя в наилучшем сочетании распротсранен ные приемы его выделения и поэтапно контролируя эффективность очи щения. Новыми приемами являются при выделении протромбина человек совмещение десорбции и высаливание белка, а при выделении протром бина собаки десорбция его путем разрушения адсорбента с помощь ионного обмена. Разработанные процедуры позволили сократить про должительность выделения протромбина по сравнению с известными на иболее эффективными методами его очищения (И.Hashimoto и др. 1985; R.Jenny и др., 1986) при сопоставимом выходе. Полученны препараты имели такую же свертывающую активность как и у други

¡сследователей С1400^1800 И1Н ед/мг). Они не содержали факторов X, ;а и тромбина. Протромбин был гомогенен при электрофорезе в ПААГ с Ю-Ма, равно как и использованные в исследованиях продукты его ак-'ивации фрагмент I, претромбин I и а-тромбин (рис. 1).

!ис. 1. Электрофорез протромбина человека и продуктов его активации в полиакриламидном геле с ВС-Ыа. 1 - протромбин, 2 -претромбин I, 3 - фрагмент I, 4 - а-тромбин.

Протромбин имел одну Ы-концевую аминокислоту (аланин) без римеси других. Распространенные критерии чистоты белков позволили ам признать получаемый протромбина соответствующим требованиям амеченных структурных и функциональных исследований.

Исследование структуры молекулы проводили на протромбине со-аки. При ультрацентрифугировании он седиментировал в виде симмет-ичного пика с коэффициентом седиментации Бго.и 5,07. Обнаружено озрастание скорости седиментации при увеличении концентрации бела выше 5 мг/мл. Этот факт был интерпретирован как свидетельство ссоциации молекул протромбина. Этот вывод был подтвержден другими сследователями. Выяснено, что молекулы протромбина могут образо-ывать димер, связываясь И-концевыми участками посредством кальци-вых мостиков между остатками "¡[-карбоксилутаминовой кислоты Р.С.Тагуегэ и др., 1986). Коэффициент диффузии протромбина 02о,«) составил 5,52-10"7 смг/сек. Определение удельного парци-льного объема (V) дало величину 0,683 мл/г. Относительная молеку-

лярная масса протромбина собаки (Мг), расчитанная по этим гидрода намическим константам, составляет 70900. Она оказалась близкой 72000 - молекулярной массе протромбина человека, установленной аналогичных экспериментах после наших исследований W. Klsiel и щ. (1973). Гидродинамические параметры протромбина обоих видов тага оказались близкими.

В протромбине собаки мы определили N-концевую аминокислоту последовательность Ала-Асп-Асп... . Она совпадает с чередование Ала-Асп... , выявленным позднее при установлении полной аминокис лотной последовательности протромбина быка (S.Magnusson и др. 1975) и человека (F.J.S.Degen и др., 1983). Мы обнаружили в прел ромбине собаки 1 М С-концевого глицина на 1 М белка. Наличие в мс лекуле только одного С-концевого аминокислотного остатка бьц подтверждено исследованиями на протромбине человека (K.Kasal др., 1971) и быка (J.Stenflo т др., 1972). Анализ Ш С-концевь аминокислот протромбина собаки позволил установить, что молекул его состоит из одной полипептидной цепи.

Был определен аминокислотный состав протромбина собаки. Дан ные приведены в таблице 1 вместе с соответствующими величинами дл протромбина человека, полученными G.F.Lanchantin и др. (1968) Аминокислотный состав протромбина обоих видов оказался очень близ ким. Наше исследование выявило необычно высокое содержание глута миновой кислоты в протромбине по сравнению с витамин К-независимы ми белками плазмы. Этот факт был оценен позднее, когда выяснилось что через карбоксилированные остатки глутаминовой кислоты протром бин связывается с фосфолипидной поверхностью при активации (G.IIel sestuen., 1976).

Все белковые факторы свертывания являются гликопротеинами. П современным представлениям углеводные цепи защищают плазменны гликопротеины от внутриклеточного протеолиза при выделении в плаз му и служат маркерами для опознания клетками-мишенями или клетка ми, контролирующими катаболизм данного белка (Р.Хьюз, 1985). Пр изучении механизма действия витамина К было выдвинуто предположе ние, что он обеспечивает гликозилирование соответствующих белко (H.V.Johnson и др., 1971; G.L.Nelsestuen и др., 1972). В связи этим установление структуры углеводного компонента протромбин представлялось нам необходимым для выяснения его роли в биосинте зе, формирование ферментных комплексов и активации витамин К-зави

Таблица 1

Аминокислотный и углеводный состав протромбина

I 1 Аминокислоты 1 Собака 1 1 Человек |

|и углеводы

1 1 Г/100 г г-М/70900 г-М/70000 г белка |

1 1Аспарагиновая 9, 45 52,96 55,6 |

IГлутаминовая 12,57 60,56 69,0 |

1 Глицин 4,95 46,71 43,2 |

1 Алании 3,56 28,40 34,3 |

1Валин 4,22 25,53 29,2 |

1 Лейцин |ю,95 1 37,8 |

1 Изолейцин >59 ,31 21.1 |

[Серин 6,65 44,85 37,5 |

I Треонин 4,74 28,14 38,2 |

Щистин/2 3,98 23,46 22,7 |

Метионин 1,48 7,02 6,9 |

Пролин 5,52 34, 01 30,9 |

Фенилаланин 4,62 19,84 20.2 |

Тирозин 4,29 16,78 21,0 |

Триптофан 3.36 11,66 20,1 |

Гистидин 2,10 9,61 9.0 |

Лизин 5,97 29,0 26,3 |

Аргинин 8,54 38,81 35,6 |

Сумма аминокислот 97,45 538 (60344)* 558 (63612)* |

Галактоза 1,47 5,79 }к,1 |

Манноза 1,96 7,72

Глюкозамин 1, 13 4,49 1 9 5 1

Галатозамин 0,95 3,74 / 9'5 1

Сиаловые кислоты 2,06 4,72 7,8 |

Сумма углеводов 7,57 27 (5014)* 33 (6623)* |

Общая сумма 105.02 565 (65358)* ..... 591 (70235)* | ........... . 1

* Число остатков, полученное при округлении содержания ами-окислот или углеводов до целых чисел. В скобках молекулярная а полипептидной или углеводной частей или же белка в целом.

симых факторов свертывания. Результаты определения углеводной состава протромбина собаки приведены в таблице 1. После расщепления протромбина проназой было выделено 4 гликопептида. Углеводны] состав их приведен в таблице 2. Во всех гликопептидах после гидроТаблица 2

Содержание углеводов (моль/моль обнаруженной аминокислоты) в гикопептидных протромбина

1 1 Углеводы 1 1 Гликопептиды 1

! ! 1 1 1 1 1 1 2 I 3 1 4 1

1 Гексозамины I Манноза 1 Галактоза 1 Сиаловые ксилоты 1 1 1 5,9 | 1 4,3 | 1 4.2 | 1 4,1 | 1 | 5,2 I 3,8 I 4,1 I 5.7 | 1,6 1,1 1,1 1,4 2,1 1 2,3 | 1,9 | 2,3 I

1 Молекулярная масса* 1 1 I 3559 | 1(3428) | | | 3980 I (3849) | | 1069 (938) 1684 | (1553)I 1

* Расчет по числу остатков аминокислоты и углеводов, в скобках - молекулярная масса углеводного компонента.

лиза обнаружена только аспарагиновая кислота. Состав гликопептидо! показывают, что протромбин является типичным плазменным гликопро-теином с углеводными цепями комплексного типа, присоединенным! Л-гликозидной связью к остаткам аспарагина в полипептидной цепи Разнообразие обнаруженных гликопептидов не означает, что в молекуле протромбина одновременно имеются углеводные цепи всех возможны: вариантов. Суммарная молекулярная масса углеводов гликопептидо] более чем в два раза превосходит массу углеводного компонент; протромбина. Сопоставление их молекулярных масс показывает, что 1 молекуле протромбина собаки имеется 2 или 3 углеводные цепи. В т> же время этот факт свидетельствует о микрогетерогенности углевод ных цепей протромбина.

Приведенные данные и сделанные по ним выводы были подтвержде^ ны в более поздних исследованиях. В протромбине быка (З.Маяшзоп :

др., 1975) и человека (D.А.Walz и др., 1977; R.J.Butkowski и др.. 1977) обнаружено по 3 углеводных цепи, присоединенных к остаткам аспарагина. Они имеют биантенную структуру с остатками сиаловых кислот на концах внешних ветвей (T.MizuocM и др., 1981), что характерно для цепей комплексного типа. Микрогетерогенность по углеводным цепям оказалась присущей также протромбину человека (S.P.Bajaj и др., 1981) и другими факторами свертывания, в частности, фибриногену (М.Meszaros и др., 1979) и фактору IX (В.Polack и др., 1986). Выявление микрогетерогенности углеводных цепей протромбина позволили нам отвергнуть представление о гликозилирующем действии витамина К при биосинтезе соответствующих белков. Он необходим только для участия в системе карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты. По данным рентгеноструктурного анализа две углеводные цепи протромбина находятся близко к Гла-домену, сопоставимы с ним по размеру и направлены в сторону от белка (M.Soria-no-Garcia и др., 1989). Можно полагать, что отрицательно заряженные остатки сиаловых кислот на концах углеводных цепей витамин K-зависимых факторов, непосредственно или Са2+-опосредованно, взаимодействуют с отрицательно заряженной фосфолипидной поверхностью. Типичность протромбина как плазменного гликопротеина и микрогетерогенность его углеводных цепей позволяют нам считать, что у витамин K-зависимых факторов они функционируют как неспецифические стабилизаторы положения молекул белка на фосфолипидной поверхности при образовании ими ферментных комплексов при свертывании крови.

Взаимодействие протромбина, продуктов его активации и фактора К с тканевым тромбопластином.

Для установления значения структуры фосфолипидной поверхности з инициировании свертывания наиболее подходящим представлялся тка-тевой тромбопластин. Мы решили использовать тканевой тромбопластин Зезотносительно к наличию в нем апопротеина Ш, просто как лрокоа-гулянт, обладающий оптимальной для свертывания фосфолипидной по-зерхностью. В исследованиях Д.М.Зубаирова с сотр. (1989) показано, 4TO тромбопластин представляет конгломерат липопротеиновых комплексов, в котором сохранено мало фрагментов клеточных мембран с типично бислойной структурой. По данным ЯМР-31Р и ЯМР-'Н фосфоли-1иды в водной суспензии тромбопластина организованы в гексагональ-1ую (Нп) лиотропную мезофазу, в водную среду экспонировано 10-20%

полярных головок фосфолипидов. Кажется несомненным, что организм ция фосфолипидов в тромбопластине воспроизводит все существеннь черты структуры, необходимой клеточным мембранам в организме д; инициирования свертывания. Предварительно с использованием ингиб* торов протеаз различных типов и аффинной хроматографии солюбилш рованного апопротеина III на протромбин-сефарозе мы установила что прокоагулянтный эффект апопротеина III обеспечивается ег структурной функцией и не связан со взаимодействием с протромбг ном. Это сделало возможным исследование связывания меченных 12£ протромбина человека, продуктов его активации и фактора X с ткане вым тромбопластином.

Связывание протромбина в основном ряде использованных ко& центраций (2-1СГ8-2,4'10"6 М) как в присутствии ионов Са2+, так в их отсутствие характеризовалось вогнутыми кривыми на графика Скэтчарда (рис. 2 А, Б). Форма кривой свидетельствует, что прот ромбин связывается с тромбопластином по двум типам независимь центров - высокоаффинным и низкоаффинным. В таблице 3 приведен наблюдаемые параметры связывания по каждому типу центров: Ка константа диссоциации, 0. - число центров. В условиях связывани наиболее близких к естественным (нативный тромбопластин, наличи ионов Са2 + ) сродство протромбина к высокоаффинным центра (Кд=7,5•10"8 М) почти на два порядка выше, чем к низкоаффиннь (Ка=4,5'10~6 М). Количество низкоаффинных центров значительно пре вышает (в 15-17 раз) число высокоаффинных центров. В таблице приведены также средние значения процентов общего связывания прот ромбина, выражающие совокупный итог изменений Ка и 0. для разнь условий связывания. Можно видеть, что относительный вклад в сум марное связывание протромбина для высокоаффинных центров всегд выше, чем для низкоаффинных. Все различия в параметрах связывани между высокоаффинными и низкоаффинными центрами статистически дос товерны.

Удаление свободных ионов Са2+ из системы не сказывалось дос товерным образом на Ка центров обоего типа. В то же время числ центров резко снижалось, особенно в случае модифицированного тром бопластина и для низкоаффинных центров. Это вело к уменьшению сум марного связывания протромбина с тромбопластином в 4-6 раз. рах различным образом. Сродство высокоаффинных центров к протром бину снижалось (увеличение Кй) как в присутствии ионов Са2+, так

Рис. 2. График Скэтчарда по данным связывания протромбина с тром-бопластином. А - связывание в присутствии СаС1г; Б - связывание в присутствии ЭДТА; 1 - тромбопластин, обработанный папаином; 2 - нативный тромбопластин.

[Связанный протромбин], нИ

Зис. з. График скэтчарда по данным связывания низких концентраций протромбина с тромбопластином. Обозначения такие же как и на рис. 2.

Таблица 3

Наблюдаемые параметры связывания протромбина с тромбопластином

Параметры связывания Состав смеси Высокоаффинные центры Низкоаффинные центры

Модифициров. тромбопластин Нативный тромбопластин Р Модифициров. тромбопластин Нативный тромбопластин Р

нМ СаС12 ЭДТА Р 338-64 210-2? >0,05 75*15 118*25 >0,05 <0,01 <0,05 5716*1800 4234*1875 >0,3 4474*17? 4529*189 >0,7 >0,2 >0,8

(} , нМ СаС12 ЭДТА Р 233-56 37-5 <0,01 104*23 24*6 <0,01 <0,02 >0,05 3646-Ц56 333*150 <0,01 1808*73 285*12 <0,001 <0,02 >0,6

% СаС12 ЭДТА Р 42,6*3,4 11,7-1,9 <0,001 44,8*10,8 11,2*4,1 <0,02 Х),7 >0,8 35,7*2,0 6,1*0,6 <0,001 24,5*1,3 4,6*0,3 <0,001 <0,01 <0,05

1—I

со I

Обработка тромбопластина папаином сказывалась на разных цент-з их отсутствие. Сродство низкоаффинных центров существенно не металось. В то же время число центров обоего типа увеличивалось, но цля проявления этого эффекта были необходимы ионы Саг+.

При низких концентрациях протромбина, порядка 1% и ниже от зго содержания в плазме крови, характер связывания в присутствии яонов Са2+ видоизменяется. Кривые образуют купол (рис. 3, А). Этот результат указывает на наличие положительных кооперативных эффектов при связывании протромбина с высокоаффинными центрами. В отсутствие ионов Са2+ они сменялись отрицательной кооперативностью связывания (рис. 3, Б).

При сопоставлении связывания основного ряда

(6,2-10"7-6,1'10"8 М) (рис. 4, А) и низких концентраций (1,2-10~7-1,2'10"9 М) (рис. 5, А) фрагмента I в присутствии ионов :аг+ можно видеть, что оно характеризуется двумя прямыми разного гаклона. Прямые можно рассматривать как две ветви вогнутой кривой, злизкой по форме кривым, характеризующим связывание с тромбоплас-гином протромбина (рис. 3. А и Б). Можно заключить, что фрагмент [, как и протромбин, связывается с тромбопластином по двум типам «зависимых центров - высокоаффинными (Ка=7,б-Ю"8 М) и низкоаф-Емнными (Кд=1,3'10"6 М). Параметры связывания по каждому типу 1ентров в различных условиях приведены в таблице 4.

При низких концентрациях фрагмента 1 (эквивалентных 0,5% и шже от содержания протромбина в плазме) связывание в присутствии гснов Саг+ характеризуется выпуклыми кривыми (Рис. 5, А). Они фактически воспроизводят кривые связывания протромбина при тех же сонцентрациях (Рис. 3, А). Это означает, что фрагменту I, как и фотромбину. свойственна положительная кооперативность связывания : высокоаффинными центрами. В отсутствие ионов Са2+ этот эффект ¡меняется отрицательной кооперативностью связывания (Рис. 5, Б), фоявляющейся более отчетливо чем для протромбина (Рис. 3, Б). гдаление ионов Са2+ сказывается на связывании фрагмента I в целом :ак же (Рис. 4, А, Б; таблица 4), как и на связывании протромбина. ;ак и у протромбина, эти изменения в итоге обеспечивают достовер-юе снижение суммарного связывания фрагмента I по каждому типу [ентров в 5-7 раз. Обработка тромбопластина папаином сказывалась [а сродстве центров связывания фрагмента I разного типа обратным >бразом, нежели при связывании протромбина. Происходило снижение

0,5

■в 0,4

1 0,3

0,2

ОД

0,1

0,08

0,06

0,04

0,02

50 100 150 200 ХО 20 30 40

[Связанный фрагмент I] , нМ

Рис. 4. График Скэтчарда по данным связывания фрагмента I с тpo^ бопластином. А - связывание в присутствии СаС12; Б - св* зывание в присутствии ЭДТА; 1 - тромбопластин, обработай ный палашом; 2 - нативный тромбопластин.

0,075

10 20 30 1 2 3 4

[Связанный фрагхел! у, н!1

41-

Рис. 5. График Скэтчарда по данным связывания низких концентраци фрагмента I с тромбопластином. Обозначения такие же ка на рис. 4.

ж V* VI* ** ЦМ «

Наблюдаемые параметры связывания фрагмента I протромбина с тромбопластином

Параметры связывания Состав смеси Высокоаффинные центры Низкоаффинные центры

Модифициров, тромбопластин Нативный тромбопластин Р Модифициров. тромбопластин Нативный тромбопластин Р

К^, нМ СаС12 ЭДТА Р 65*4 3£ 76-4 Я <0,01 4352*1163 2866*1116 >0,1 1302*234 9813*7929 >0,1 <0,01 >0,1

Ч , йМ СаС12 ЭДТА Р 50*4 X 49 ±3 X >0,4 1591*426 193*76 <0,01 699*128 551*445 >0,5 <0,02 >0,2

% СаС12 ЭДТА Р 35,4*6,5 4,9*0,3 <0,001 32,3*5,7 4,5*1,4 <0,001 <0,001 >0,4 26,1*1,4 6,0*0,8 <0,001 31,3*2,0 5,4*0,6 <0,001 <0,001 <0,02

го ы

Расчет некорректен ввиду отрицательной кооперативности связывания.

аффинитета низкоаффинных центров (увеличение На). без существенно го изменения его у высокоаффинных центров. Число же низкоаффинны центров, как и при связывании протромбина, возрастало. Эти измене ния проявлялись лишь при наличии ионов Са2+.

Связывание претромбина I и а-тромбина с тромбопластином н графиках Скэтчарда характеризовалось горизонтальными линиями дл, всего ряда концентраций каждого белка. Эти данные означают, что н поверхности тромбопластина отсутствуют независимые центры с зако номерно единообразным (специфическим) связыванием претромбина I ] а-тромбина. Привлекает внимание резкое отличие во влияний ионо] Са2 + на общее связывание этих белков по сравнению с протромбином ! фрагментом I. Общее связывание претромбина I не зависит от ионо) Са2 + , оно такое же как у протромбина и фрагмента I без ионов Са2' (таблица 5). В то же время для а-тромбина характерно достаточ» высокое связывание с тромбопластином в присутствии ионов Са2+. Однако оно обеспечивается не за счет ионов Са2+. Проявившаяся в ряд: протромбин (фрагмент I) - претромбин I тенденция к нивелированш эффекта удаления ионов Са2+ при связывании а-тромбина находи1: дальнейшее развитие - происходит обращение этого эффекта. Если I отсутствие ионов Са2+ общее связывание протромбина и фрагмента ; резко снижается, то связывание а-тромбина, наоборот, сменяется отрицательной кооперативностью связывания (рис. 5, Б), сказывается

Таблица 5

Общее связывание (%) претромбина I и а-тромбина с тромбопластином

1 1 Белок Состав смеси ..... Модифициров. тромбопластин 1 Нативный 1 тромбопластин! .......1 Р 1

1 Претромбин I СаС12 4. 2 ± 0,5 4,9 + 0,3 | < 0,01 |

ЭДТА 5.8 ± 1.0 4,6 + 0,3 | < 0,02 |

Р < 0,01 >0,05 |

1 а~Тромбин СаС1г 13,3 ± 1,0 12,0+1,1 | > 0,05 |

ЭДТА 17,8 ± 1,6 24,5 ± 3,3 | < 0,0011

1 ..... Р < 0,001 ........ < 0,001 | 1

0,3

0,2

0,1

0,3 Г

тэ-о—о I

0,2

0,1

0,5

1,0

0,5

1,0

[Сгязакныя фактор 2] , нИ

ис. 6. График Скэтчарда по данным связывания фактора X с тромбоп-ластином. А - связывание в присутствии СаС12; Б - связывание в присутствии ЭДТА; 1 - тромбопластин, обработанный папаином; 2 - нативный тромбопластин.

на общем связывании претромбина I. а на связывание а-тромбина влияет только в отсутствие ионов Саг+, снижая его.

Связывание фактора X с тромбопластином в основном ряде исследованных концентраций (5.4-Ю"10-5,4-10"9 М, что соответствует 3,54-5,4% от содержания в плазме) в координатах Скэтчарда характеризовалось прямыми линиями, параллельными оси абсцисс (рис. 6, А и з). При наиболее низких концентрациях белка (5.4-10""-б.4-10"10 И), кривые образовывали купол. Можно видеть, что имеется принципиальное сходство в кривых связывания протромбина и фактора X. Фактор X так же как и протромбин связывается по двум типам центров -¡ысокоаффинными и низкоаффинными. Связывание с низкоаффинными ¡ентрами в пределах использованных низких абсолютных концентраций )актора X (5,4'10"9-5,4'Ю"10 М) при наличии относительно большой юсфолипидной поверхности оказалось ненасьпцаемым (горизонтальные 'частки кривых). Оно не может быть корректно охарактеризовано :онстантой диссоциации и числом центров. Параметры связывания фак-

Таблица 6

Наблюдаемые параметры связывания фактора X с высокоаффинными центрами тромбопластина

г 1 Параметры 1 связывания . Состав смеси Модифициров. тромбопластин .........1 Нативный 1 тромбопластин | 1 1 Р 1

1 Ка, нМ СаС1г ЭДТА Р 5,2 ± 1,1 6,6 ± 0,6 < 0,01 1 1.8 ± 0,5 I 5.9 + 0,8 I < 0,001 | 1 < 0,001 1 >0,1 |

1 0, нМ СаС12 ЭДТА Р 0,9 + 0,2 0.5 + 0,05 < 0,001 1 0,6 ± 0,2 | 1,1 + 0,2 I < 0,001 | 1 <0,01 | < 0,001 1

1 % | СаС1г ЭДТА р 13,9 ±0,3 6,9 ± 0,2 < 0,001 1 20,6 + 0,3 | 14,3 + 0,2 | < 0,001 | | < 0,001 | < 0,001 | 1

тора X с высокоаффинными центрами приведены в таблице 6. Сродств фактора X к высокоаффинным центрам тромбопластина более чем в 4 раз выше сродства протромбина (Ка 1,8'10"9 М и 7,4'10~а М соот ветственно). Как и для протромбина связывание фактора X с высоко аффинными центрами характеризуется положительной кооперативностью Однако, в отличие от протромбина она сохранялась и в отсутстви ионов Саг+. В отличие от связывания протромбина, при удалении ио нов Са2+ уменьшается сродство фактора X к высокоаффинным центра (увеличение Ка) и нет значительного снижения их числа. У нативног тромбопластина число центров даже несколько возрастает. Эти изме нения в конечном счете также обеспечивают снижение общего связыва ния фактора X (с 20,6 до 14,3%), но выражено оно заметно меньше чем у протромбина (с 44,8 до 11.2%). Обработка тромбопластина па паином сказывалась на связывании фактора X с высокоаффинными цент рами в целом таким же образом как и на связывании протромбина.

Полученные данные показывают, протромбин и фрагмент I связы ваются на поверхности тромбопластина с одними и теми же центрами механизм связывания каждого белка в основных чертах одинаков. Вы

раженная зависимость специфического связывания обоих белков от наличия ионов Са£+ в сопоставлении с литературными данными свидетельствует о том, что оба типа центров связывания протромбина на тромбопластине имеют чисто фосфолипидную природу и ответственны за прокоагулянтные свойства тканевого фактора. Неоднозначность влияния белков тромбопластина на связывание протромбина и фрагмента I показывают, что они взаимодействуют с ними лишь неспецифически, то есть вследствие случайных множественных контактов молекулярных групп. Белки тромбопластина действуют как стерический фактор, влияющий на специфическое связывание протромбина и фрагмента I с фос-фолипидной поверхностью. Из результатов следует, что на поверхности тромбопластина отсутствуют центры с закономерно единообразным (специфическим) связыванием претромбина I и а-тромбина. связывание их происходит за счет множественных как прямых так и Са2+-олосре-дованных электростатических взаимодействий заряженных групп фосфо-липидов и белков. Совокупность данных позволяет заключить, что связывание протромбина обеспечивается И-концевым участком его молекулы, соответствующим области фрагмента I. Претромбиновая область непосредственно не участвует во взаимодействии протромбина с фосфолипидной поверхностью.

При изучении взаимодействия протромбина и фрагмента I с однородной поверхностью бислойных фосфолипидных везикул выявлен только один тип центров связывания (И. М. Незгпск и С. М. ИеХзввШеп, 1980; ].А.С^эГогШ и др., 1989). Аффинитет их соответствует аффинитету здзкоаффинных центров связывания протромбина на тромбопластине. Таким образом, взаимодействие протромбина с фрагментами естественен: клеточных мембран при свертывании крови должно иметь более сложный характер нежели с фосфолипидными везикулами.

Полученные данные в известной мере проясняют структуру цент-зов связывания и механизм Са2+-специфического взаимодействия прот-эомбина и других витамин К-зависимых факторов с фрагментами мемб->ан в организме. Сохранение остаточного связывания протромбина, фрагмента I и фактора X с тромбопластином при отсутствии сущест-¡енных изменений аффинитета центров связывания после удаления ио-[ов Са2+ свидетельствует о наличии определенного Са2+-независимого ¡клада в специфическое взаимодействие протромбина с этими центрам. Для объяснения этих результатов были привлечены современные [анные о фазовых переходах в смесях фосфолипидов и механизмах под-

держания устойчивости бислойной структуры нативных клеточных мемб ран (В.А.Твердислов и др., 1987; В.Ф.Антонов и др., 1992; J.M. Sed don, 1990; Ph.Devaux, 1991). Фрагменты мембран не могут сохранят устойчивую бислойную структуру. В них происходит Са2+-индуцирован ное фазовое разделение фосфолипидов. Образуются кластеры фосфата дилсерина и обращенные мицеллярные и цилиндрическая (гексагональ ная Нп) мезофазы фосфатидилэтаноламина. Мезофазы разрыхляют струк туру бислоя, создают в нем дефекты, облегчают транслокацию фосфо липидов между слоями и фрагментацию мембран. Такая гетерофазна структура свойственна и тканевому тромбопластину. Наши результат в свете указанных данных позволяют считать, что связывание прот ромбина с неоднородной фосфолипидной поверхностью клеточных мемб ран наряду с основным ранее известным Са2+-опосредованным элект ростатическим взаимодействием с молекулами фосфатидилсерина обес печивается дополнительным гидроофобным взаимодействием с молекула ми нейтральных фосфолипидов в ближайшем окружении. Последние дан ные подтверждают этот вывод. На примере витамин К-зависимого белк С показано, что строго консервативный остаток Лей-6, который нахо дится в пространственном окружении Фен-5 и Вал-6 критически важе: для обеспечения гидрофобного компонента связывания Гла-домена фосфолипидами (L.Zhang, F. J. Castellino, 1994). По-видимому, подоб ный гидрофобный узел протромбина взаимодействует с остатками жир ных кислот фосфатидилэтаноламина на границе его мезофаз и класте ров фосфатидилсерина. В этих местах гидрофильная но неоднородна фосфолипидная поверхность находится в напряженном состоянии, може1 иметь дефекты и разрыхления, облегчающие гиброфобные взаимодейС' твия. Таким образом, наличие низкоаффинных и высокоаффинных центров связывания фрагмента I и протромбина на тромбопластине является следствием его гетерофазной структуры. Фактическое совпадешь Ка для центров связывания на фосфолипидных везикулах и низкоаффинных центров тромбопластина позволяеет считать последние прост участками фосфолипидной поверхности, включающими молекулы как кислых так и нейтральных фосфолипидов. Высокоаффинные центры, по-видимому, представляют межфазные разрыхления модифицированной мембраны. Связывание протромбина происходит сначала за счет дально-действующих электростатических взаимодействий через ионы Са2+ i кластерами фосфатидилсерина. Затем становится возможным присоединение близкодействующих гидрофобных взаимодействий, благодаря ко-

орым достигается более прочное связывание белка по межфазным раз-ыхлениям мембраны.

Наличие положительной кооперативности связывания протромбина фрагмента I с высокоаффинными центрами в присутствии ионов Са2 + отрицательной кооперативности в их отсутствие, означает следую-ее. На высокоаффинных центрах кроме взаимодействия с фосфолипида-и происходит Саг+-опосредованное связывание белков по их Гла-до-енам. Мы считаем, что кооперативность процесса является отражени-м естественного взаимного связывания витамин К-зависимых факторов ак фермента и субстрата при формировании их активных ферментных омплексов. Известно, что протромбин, фрагмент I и фактор X спо-обны к образованию гомо- и гетеродимеров, которое обеспечивается озникновением кальциевых мостиков между Гла-доменами молекул C.M.Jackson и др., 1987; К.Harlos и др., 1987; R.C.Tarvers и др., 987).

Было разработано две концепции связывания витамин К-зависимых акторов с фосфолипидной поверхностью - модель кальциевых мостиков F.A.Dombrose и др., 1979; R.M.Resnick и G.L.Nelsestuen, 1980) и одель гидрофобного связывания (M.J.Rhee и др., 1982). Наши данные наличии Са2+-независимого взаимодействия и кооперативности свя-ывания белка с высокоаффинными центрами позволяют рассматривать ти концепции как взаимодополняющие. Связывание витамин К-зависи-ых факторов с фосфолипидными мембранами с мезоморфной структурой аиболее точно описывает предлагаемая нами интегральная модель, мысл ее состоит в том, что связывание происходит по высокоаффин-ым и низкоаффинным центрам за счет возникновения хелатных или онных кальциевых мостиков между Гла-доменами белка и фосфатидил-ерином мембраны с последующим присоединением гидрофобного взаи--одействия с высокоаффинными центрами и Са2+-опосредованной гомо-гетеродимеризацией на них молекул белка.

Выявленные закономерности универсальны для витамин К-зависи-ых факторов, о чем свидетельствует принципиальное сходство данных о связыванию протромбина, фрагмента I и фактора X. Из двух типов заимодействия - Саг+-опосредованного электростатического и гидро-обного относительный вклад первого из них при связывании фактора оказывается менее значимым чем при связывании протромбина. Это ледует из ненасыщаемости связывания по низкоаффинным центрам, бо-ее высокого остаточного связывания, нивелирования эффекта расщеп-

ления белков тромбопластина и сохранения положительной коопераги. ности связывания фактора X с высокоаффинными центрами в отсутств: ионов Са2 + . Мы считаем, что более сильное гидрофобное связывание высокоаффинными центрами обеспечивает более высокое сродство к н: фактора X по сравнению с протромбином. Это различие может бы1 следствием наличия у фактора X двух дополнительных остатков Гла : сравнению с протромбином. По данным рентгеноструктурного анали (М.БоПапо-Сагсха и др., 1992) эти остатки могут формировать толще Гла-домена дополнительный центр связывания ионов Са2+,конс' лидирующий Гла-домен и, по-видимому, косвенно усиливающий гидр1 фобное взаимодействие его с фосфолипидной поверхностью.

Обнаружение неоднородности связывания протромбина и фактора на тромбопластине позволяет конкретизировать молекулярный механи: формирования и работы ферментных комплексов витамин К-зависим] факторов в организме. По данным исследований активации протромби и фактора X на фосфолипидных везикулах создано две концепции, об: ясняющие механизм каталитического действия фосфолипидной повер; ности при свертывании крови - модель связанного субстра' (М.Е.Иезйе1т и др., 1981) и модель свободного субстрата (в.Ь.М Безгиеп, 1978). Выявление в наших исследованиях двух типов одно1 ременно функционирующих центров связывания протромбина и фактора на тромбопластине показывает, что работа ферментных комплексов вз тамин К-зависимых факторов на фрагментах клеточных мембран долж совмещать черты обоих моделей активации. Это отражено в предлага! мом нами матрично-каталитическом механизме функционирования фосф( липидной поверхности при свертывании. В организме фосфолипиднг поверхность фрагментов клеточных мембран, в отличие от фосфолипи) нымх везикул, неоднородна, имеет два типа центров связывания различным аффинитетом. Низкоаффинные центры необходимы для нако1 ления и транспортировки факторов на поверхности мембраны, без чез были бы крайне замедлены образование ферментных комплексов и I работа. Высокоаффинные центры нужны для самосборки 3-компонентш ферментных комплексов и активации факторов. Каталитическое дейс твие фосфолипидной поверхности обеспечивается, во-первых, сборс молекул активируемого фактора с большой площади в поток по напраЕ лению к ферментному комплексу (подобно своеобразной воронке) \ во-вторых, взаимодействием с факторами комплекса и субстрат обеспечивающим им необходимую конформацию и взаимную ориентацию.

¡ависимости от конкретных условий скорость активации фактора может >пределяться как скоростью диффузии его в растворе, так и интег-)альной величиной массопередачи его по фосфолипидной поверхности. )то обеспечивает в организме быстрое формирование ферментных комп-гексов и использование оптимальных количеств факторов, то есть гаксимальную эффективность свертывания в любых условиях.

Наличие функционально различных центров связывания на фосфо-шпидной мембране представляется также необходимым условием для )азвертывания каскада активации факторов VII, IX, X и протромбина. 1о настоящего времени оставалось- неясным чем обеспечивается согда-¡ованность реакций каскада. Наличие низкоаффинных центров связыва-шя, обеспечивающих подвижность белка на мембране, и высокоаффин-[ых каталитических центров кажется наиболее простой молекулярной >сновой самосборки супермолекулярной структуры для последователь-юй активации витамин К-зависимых факторов. Это ансамбль близко расположенных ферментных комплексов факторов VII, IX и X с соответствующими белками-кофакторами.

Таким образом, основной вывод, который следует из исследова-жй связывания протромбина, продуктов его активации и фактора X с громбопластином состоит в том, что приобретение клеточной мембра-юй тромбогенных свойств связано с утратой ею исключительно бис-юйной структуры и образованием мезоморфной структуры. Этот вывод тодтверждается последними исследованиями, показавшими, что способ-юсть тромбоцитов и эритроцитов стимулировать протромбиназную активность под действием ряда агонистов (в том числе естественных жтиваторов тромбоцитов) непосредственно определяется везикуляцией 1х мембран (И. Е. А. гтаа! и др., 1992).

Следует отметить также важное физиологическое значение обнаруженного характера взаимодействия а-тромбина с тромбопластином. 1одавление связывания а-громбина ионами Саг* обеспечивает быстрое зсвобождение фермента от протромбиназного комплекса в водную фазу, нто делает свертывание фибриногена массивным и обеспечивает наибо-тее прочное связывание сгустка с местом повреждения.

Исследование аутоактивации и распада протромбина. Мы нашли, нто в концентрированных растворах цитрата натрия и сульфата аммония происходит преращение протромбина в тромбин без добавления естественных активаторов (аутоактивация). Исчезновение активности

протромбина происходило задолго до появления эквивалентной акта, ности тромбина. Это означает, что превращение протромбина в тро: бин происходит через образование промежуточного производного претромбина. Этот результат был получен одновременно с данны: других исследователей (W.H.Seegera и E.Marclniak, 1965; G.F.Lan hantln и др., 1965) еще до выяснения последовательности расщепл ния протромбина при его естественной активации и характера образ ющихся продуктов. На высоте генерации тромбина ионообменной хром, тографией мы выделили три группы продуктов активации - нейтральн: тромбин, слабокислые и сильнокислые производные профермента. Э1 данные о типах продуктов активации были подтверждены позднее п; изучении возможных вариантов естественной активации протромби; (K.S.Stenn и E.R.Blout, 1972; M.R.Downing и др., 1975). Наши да: ные в сопоставлении с результатами других более поздних исследов; ний показывают, что солевая активация протромбина приводит к обр; зованию тех же продуктов, что и естественная активация его факт! ром X и тромбином.

Активация протромбина в растворах цитрата натрия и сульфа' аммония обычно рассматривалась как ферментативный процесс, обесга чиваемый примесями фактора Ха и тромбина в препаратах протромбин; Однако ингибиторы сериновых протеаз не влияют на скорость и xapai тер начального распада протромбина в солевых и бессолевых раств; pax а препятствуют только проявлению активности возникающего тро! бина (И.П.Баскова и др., 1970). До настоящего времени оставало< непонятным, что изначально запускает процесс аутоактивации прог ромбина, в чем состоит инициирующая роль соли. Не было должным oi разом оценено то обстоятельство, что быстрая аутоактивация прог ромбина и других витамин K-зависимых факторов возможна лишь растворах солей, способных к образованию хелатных комплексов с m нами Са2+ (цитраты, сульфаты, фосфаты и др.).

Мы исследовали далее спонтанную активацию протромбина в 6ei солевом растворе при хранении, анализируя N-концевые аминокисло' возникающих продуктов распада. С учетом того, что тромбин coctoi из двух полипептидных цепей, было обнаружено, что протромбин рас падается на 3 продукта. Самым важным оказалось то, что состав эт! продуктов, среди которых был и тромбин, совпал с составом проду! тов расщепления протромбина на третьем этапе определения ei N-концевой аминокислотной последовательности. При спонтанной аут<

активации протромбина в растворе появлялись фрагменты молекулы с J-концевыми аланином, валшом, фенилаланином и треонином. При слу-тйном расщеплении протромбина в условиях жесткого ФТГ-секвениро-!ания на бумажных полосках, когда заведомо ясно, что механизм его геферментативный, возникли фрагменты молекулы с N-концевыми аспа->агиновой кислотой, валином, фенилаланином и треонином. Еданствен-;.ое различие - аспарагиновая кислота вместо аланина - является ледствием отщепления аминокислот (аланина и аспарагиновой кисло-ы) с N-конца протромбина на двух предшествующих этапах его секве-ирования. Данный результат означает, что спонтанная аутоактивация ротромбина обеспечивается неферментативным но специфичным расщеп-ением тех же пептидных связей, что разрываются и при ферментатив-ой активации его.

Мы исследовали изменение активности протромбина и появление зертывающей и эстеразной активности тромбина при инкубации прот-змбина с фактором ХПа с целью выявления возможного активирующего зйствия фактора ХПа на протромбин, как это присуще ему в отноше-ш факторов VII (R.D.Radcllfle и др., 1977) и плазминогена ¡.Goldsmith т др., 1978). Протромбин независимо от присутствия жтора ХПа медленно спонтанно расщеплялся с образованием небольно количества тромбина. Выявленная в наших экспериментах неспо-'бность фактора ХПа к расщеплению протромбина свидетельствует об 'сутствии биохимического шунта реакций каскада активации витамин зависимых факторов. Каскад функционирует в организме как недели-е целое, а фактор ХПа является лишь одним из его активаторов, оме того этот результат еще раз подтвердил наши предшествующие иные о способности протромбина к аутоактивации. Позднее другими следователями в сходных экспериментах были получены подобные.же зультаты (И.П.Баскова и др., 1983). Они были интерпретированы i доказательство расщепления протромбина фактором ХПа, при этом то упущено из виду, что результаты могут быть следствием аутоак-¡ации протромбина.

Для выяснения возможности и значения аутоактивации протромби-в организме мы исследовали спонтанное расщепление протромбина в :сутствии клеток печени, которой принадлежит ведущая роль в ка-■олизме белков плазмы. Клетки Купфера и гепатоциты ускоряли нтанный распад протромбина (рис.7). Так, если время полураспада в контроле составляло 5ч, то в присутствии клеток оно умень-

Время инкубации, часы

Рис. 7. Изменение активности протромбина в присутствии клеток К фера и гепатоцитов. 1 - протромбин с клетками Купфера; протромбин с гепатоцитами; 3 - протромбин без клеток.

шалось до 1,3-1,5 ч. Свободный тромбин при этом не появлялся, нако воздействие клеток на протромбин было неспецифичным. Это с, дует из почти одинакового уменьшении времени полураспада протр бина и одинакового набора из 4 продуктов расщепления, возникаю в присутствии клеток независимо от их типа и выявленных электрс резом в ПААГ. В присутствии гепатоцитов продукты расщепления с ранялись в течение 24 ч, а в присутствии клеток Купфера они ис зали за 3-5 ч. Контрольные исследования показали, что набор п; дуктов расщепления протромбина в присутствии клеток такой же ка; при распаде его в отсутствие клеток и среди них есть фрагмент претромбин I, образующиеся при действии на протромбин тромби Известно, что гепатоциты удаляют из циркулирующей крови протео. тические ферменты, в том числе и факторы свертывания (Ь.БроХаг и др., 1989). Клетки Купфера, будучи макрофагами, удаляют из кр< конечные продукты различных физиологических и патологических п; цессов - старые и злокачественные клетки, иммунные комплексы, п. дукты распада белков (Д.Н.Маянский, 1981). Как следует из на: экспериментов клетки Купфера, в отличие от гепатоцитов, обеспе

ают клиренс нетромбиновых продуктов расщепления протромбина. В елом можно заключить, что катаболизм протромбина состоит во внек-еточном специфическом протеолизе белка с последующим поглощением родуктов расщепления клетками фагоцитарно-макрофагальной системы, аким образом, основным итогом экспериментов по изучению взаимо-ействия клеток Купфера и гепатоцитов с протромбином является то, то клетки могут неспецифическим образом стимулировать спонтанный аспад протромбина по связям, расщепляемым при его естественной ктивации. Следует отметить, что усиленный распад и аутоактивация присутствии клеток в экспериментах in vitro присущи не только ротромбину, но и другими витамин К-зависимым факторам. После на-их исследований установлено, что чистый фактор УП в течение нес-ольких дней самопроизвольно активируется в растворе при хранении А.Н.Pedersen и др., 1989). При инкубации очищенного фактора Vn с ультивируемыми клетками различных линий значительная часть его в ечение 2 ч превращалась в активный фактор УПа (T.Sakai и др., 989; L.M.Rao и др., 1995).

Рассмотренные выше опыты показали, что in vitro протромбин едленно распадается с образованием таких же продуктов как и при го естественной активации. Подходящим способом подтверждения неп-зрывного осуществления этого процесса и в организме нам представилось обнаружение в плазме крови продуктов спонтанного распада ротромбина, не обладающих ферментной активностью - фрагмента I и ретромбина I. Действительно, мы установили, что эти белки посто-ино присутствуют в плазме (рис. 8). Обнаружено (2,4 ±1,8)-Ю"8 М эагмента I, (3,9±1, 7) -Ю"8 М претромбина I при стандартном уровне эотромбина (1,39±0,22)•10"6 М на литр плазмы. Из продуктов акти-1ции протромбина по данным радиоиммунного анализа в норме при от-^тствии свертывания в плазме крови обнаружено 1-2'10"9 М фрагмен-1 1'2 (M.C.Rybak и др., 1981; K.A.Bauer и др., 1987). До насто-юследований не было получено прямых доказательств наличия фраг-знта I и претромбина I в плазме крови. По косвенным данным прет-жбин I появляется в крови в условиях патологии - при синдроме юсеминированного внутрисосудистого свертывания, по-видимому, следствие расщепления протромбина длительно генерируемым избытком зомбина (N. Sakuragawa и др., 1975). Сопоставление концентраций и >лупериодов клиренса свободного тромбина, фибринпептида А, фраг-знта I и претромбина I показывает, что возможное в крови в от-

--* +

Рис. 8. Перекрестный иммуноэлектрофорез плазмы человека. Последо вательность пиков от катода к аноду - претромбин I, про ромбин, фрагмент I.

сутствие свертывания количество тромбина недостаточно для расще ления количества протромбина, соответствующего обнаруженному на содержанию в плазме фрагмента I и претромбина I. Таким образом, полученных результатов следует, что в организме непрерывно ид изолированное расщепление тромбин-чувствительной связи протромби Арг155-Сер156, не связанное с действием тромбина и ведущее к н коплению в крови фрагмента I и претромбина I.

Совокупность наших данных по аутоактивации и распаду протро бина означает, что при этом происходит избирательное, но неферме тативное расщепление тех же пептидных связей, что и в ходе актив ции его при свертывании крови. Этот специфический неферментативн протеолиз протромбина стимулируется соединениями и поверхностя (стекла, целлюлозы, клеток) с отрицательно заряженными группам способными образовывать хелатные комплексы с ионами Са2*. При эт имитируются условия связывания протромбина с фосфолипидной повер ностью в протромбиназном ферментном комплексе. Ясно, что налич остатков Гла в N-концевой части молекул протромбина и других вит мин К-зависимых факторов должно обеспечивать особое сродство их отрицательно заряженным поверхностям и хелатобразующим соединен« In vitro, благодаря связыванию через ионы Саг\ Связывание про ромбина с кластерами отрицательно заряженных кислотных групп п верхностей и хелатобразующих соединений должно значительно увел чивать вероятность неферментативного протеолиза по остаткам арг

нина, находящимся на поверхности молекулы. Может быть зафиксирована положительно заряженная боковая цепь аргинина и осуществлена нуклеофильная атака на его карбонильный углерод оксионом одной из кислотных групп поверхности или хелатобразующего соединения при одновременном повышении электрофильности карбонильного углерода аргинина хедатированным ионом Саг+. Таким образом, создается своеобразный каталитический механизм, сочетающий основные черты действия активного центра сериновых протеаз, в частности, трипсина и яеталлопротеаз (например, карбоксипептидазы А с цинком в активном центре). Изложенное представление соответствует современному пониманию химии протеолиза (В.К.Антонов. 1991). Расщепление протромбина при естественной активации происходит по остаткам аргинина. Разрываются 1-2 наиболее доступные связи на поверхности.молекул Зелка. Поэтому аргинилспецифичный неферментативный протеолиз протромбина имитирует специфичное ферментативное расщепление его фактором Ха и тромбином. Этот процесс характерен для всех витамин {-зависимых факторов. Он является неизбежным следствием их уни-сальной молекулярной структуры - наличия группы остатков Гла, )беспечивающих Саг+-опосредованное взаимодействие белка с отрицательно заряженными кластерами фосфатидилсерина на фосфолипидной юверхности. Рассмотренный процесс является проявлением биоимити-)ующего катализа, значение которого для организма только начинает вскрываться (А.К.Яцимирский, 1990).

Аргининспецифичный неферментативный протеолиз обеспечивал на-гальное расщепление протромбина в наших опытах In vitro - при ау-'оактивации в растворах цитрата натрия и сульфата аммония, при Фонтанном распаде при хранении, в присутствии гепатоцитов и кле-'ок Купфера. Это воспроизводило суммарный итог возможных вариантов ютественной активации протромбина. В организме неферментативный ¡иоимнтирущий протеолиз на трансформированный фосфолипидной поверхности поврежденных и старых клеток и фосфолипидных микрочастиц .олжен обеспечивать появление в крови активных форм витамин К-за-исимых факторов. Действительно, в минимальных количествах продук-ы активации этих факторов обнаруживаются в крови в норме. Приме-ительно к проблеме инициирования свертывания крови выявление би-имтирующего каталитического расщепления витамин К-зависимых • фак-оров решает парадокс их первой активной молекулы. Биоимитирующий ротеолиз на образовавшейся при инициировании свертывания

тромбогениой фосфолилидной поверхности обеспечивает появление накопление активных витамин К-зависимых факторов, что запуск далее каскад их ферментативных превращений.

Функциональная концепция инициирования свертывания крови к. точными мембранами. Результаты наших исследований позволяют сф мулировать функциональную концепцию инициирования свертывания к; ви клеточными мембранами. Известно, что мембрана неповрежденны нестимулированных клеток атромбогенна и связывание неактивных ] тамин К-зависимых факторов с ней минимально. Необходимые для а зывания отрицательно заряженные фосфолипиды в норме находя' только во внутреннем монослое мембран (РЬ.Веуаих, 1991). Наши дг ные свидетельствуют, что свертывание крови инициируется функщ нальной Са2'-опосредованной перестройкой структуры клеточных ме{ ран. Индукторами тромбиногенеза и свертывания крови являются рг личные физические, химические и бактериальные воздействия на кле ки, обычно на тромбоциты и эндотелиальные клетки кровеносных сос дов. Информационные молекулы физиологического характера (тромб! тромбоксаны, адреналин, простациклины и др.) регулируют тромбоге ные свойства сосудистой стенки и тромбоцитов через специфичен рецепторы. Патологические воздействия (бактериальные токсины, 3 зическая травма) оказывают свое влияние грубо повреждая клеточь мембрану. Во всех случаях воздейвие тромбогенного сигнала ведет дозированному или недозированному поступлению Са2+ в цитоплазму внутриклеточных депо или внеклеточной жидкости и крови. Ионы Са блокируют ферментную систему, переносящую фосфатидилсерин и фосф тидилэтаноламин с наружной стороны мембраны на внутреннюю. О также активируют особые Саг+-зависимые протеазы - кальпаины. кот рые расщепляют белки цитоскелета. Таким образом, поступление ион Саг+ в цитоплазму клетки выключает механизмы поддержания асимме рии мембраны по фосфолипидному составу и ослабляет напрягающий каркас из белков цитоскелета. Это приводит к равновесному пер распределению фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина между вну ренним и внешним монослоями мембраны. При этом они соприкасаются межклеточной жидкостью или кровью, в которых содержание ионов Са более чем в 10000 раз превышает его концентрацию в цитоплазме. Ц такой высокой концентрации ионы Саг+ стабилизируют компакта группировки молекул фосфатидилсерина - кластеры за счет связывай;

Зис. 9. Ансамбль комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания крови на поверхности модифицированной клеточной мембраны.

Черные точки - ионы Са2+, связывающие Гла-содержащие факторы с кластерами фосфатидилсерина; ФС - фосфатидилсерин; ФЭ - фосфатидилэтаноламин; А-Ш - апопротеин тканевого фактора.

! ним в хелатные комплексы. Это ведет к относительному обогащению юседних участков мембраны фосфатидилзтаноламином. Но его молекулы :меют форму конуса, неподходящую для самостоятельного формирования 'стойчивого бислоя. Поэтому они склонны переворачиваться и образовывать свою собственную мезофазу с обращенной мицеллярной или ци-индрической структурой. Таким образом, ионы Са2+ индуцируют пе-есройку бислойной структуры мембран в гетерофазную, в которой частки бислоя чередуются с мезофазами. Это ведет к появлению меж-азных дефектов, понижению прочности мембраны. При нарастании труктурных изменений этот процесс приводит к везикуляции мембран, тшнуровыванию и отторжению в кровоток массы фосфолипопротеиновых астиц, обладающих выраженной тромбопластической активностью. Пе-естройка мембран, приобретение ими гетерофазной структуры превра-ает их в матрицы для взаимно ориентированного связывания и акти-ации витамин К-зависимых факторов. Возникновение низкоаффинных и ысокоаффинных центров связывания обеспечивает образование и рабо-

ту ферментных комплексов витамин Н-зависимых факторов по механи поверхностной массопередачи субстрата и далее формирование анса лей таких комплексов, обеспечивающих генерацию тромбина (рис. 3

Клинические наблюдения показывают, что контактный механ инициирования свертывания не является абсолютно обязательным, рестройка структуры клеточных мембран с неизбежностью должна п водить к развертыванию на модифицированной фосфолипидной пове ности биоимитирующего каталитического расщепления витамин К-за симых факторов. Появление в результате этого первой активной мо кулы одного из факторов запускает весь каскад их дальнейших ф ментативных превращений на той же поверхности.

Таким образом, индуцированная тромбогенными сигналами че рецепторзависимые механизмы функциональная перестройка бислойн структуры клеточных мембран в гетерофазную является достаточной исчерпывающей для инициирования свертывания крови как по внутр нему, так и по внешнему пути. Ионы Са2+ выполняют при свертыва. крови роль мессенджера, как это присуще им и во многих других б: логических процессах.

ВЫВОДЫ

1. Установлены основные физико-химические параметры протри бина собаки. Он имеет молекулярную массу 70900 Да, Ы-концевую ш

нокислотную последовательность - Ала.Асп.Асп____ , С-концевой г\

нокислотой является глицин. Протромбин является гликопротеином повышенным содержанием глутаминовой кислоты. Он имеет одну по. пептидную цепь преимущественно неупорядоченной пространствен! структуры, с которой через остатки аспарагина связаны 2-3 углез< ные цепи. Протромбину присуща микрогетерогенность по углевод} цепям, что делает наиболее вероятным их значение как неспецифич< ких стабилизаторов положения белка на фосфолипидной поверхнос при формировании протромбиназного комплекса.

2. Протромбин взаимодействует с тканевым тромбопластином двум типам независимых центров связывания - высокоаффинным I 7,4'10"8 М) и низкоаффинным (Ка 4,5"10"6 М). Центры связыва? протромбина на тромбопластине имеют чисто фосфолипидную приро; Связывание с центрами обоего типа осуществляется при участии йог Саг+. Вместе с тем оно обеспечивается и дополнительным Са2+-не:

¡исимым, наиболее вероятно гидрофобным, взаимодействием белка с юсфолипидами.

3. Протромбин взаимодействует с центрами связывания тромбоп-гастина N-концевым участком молекулы, соответствующим фрагменту I. фрагменту I присущи все специфические особенности связывания прот-юмбина с тромбопластином, тогда как взаимодействие претромбина I [ а-тромбина с тромбопластином является неспецифическим.

4. Ионы Са2+ подавляют электростатическое связывание тромбина : тромбопластином, что должно обеспечивать быстрое освобождение «рмента от протромбиназного комплекса в плазму для участия в последующих этапах свертывания крови.

5. Фактор X связывается с тромбопластином в целом с такими же акономерностями как и протромбин, только с более высоким сродс-'вом (Kd для высокоаффинных центров 1,8'10"9 М). Это позволяет читать выявленные закономерности связывания общими для всех вита-ин К-зависимых факторов.

6. Протромбин не расщепляется фактором ХПа, что свидетельст-ует о самостоятельном значении в механизме свертывания крови кас-ада активации витамин К-зависимых факторов как неделимого целого.

7. Протромбин склонен к распаду и аутоактивации в растворе в рисутствии солей и поверхностей с отрицательно заряженными трупами, способными образовывать хелатные комплексы с ионами Са2+. ри этом возникают такие же продукты расщепления протромбина как и ри ферментативной активации его фактором Ха и тромбином. Это сви-етельствует об индуцированном отрицательно заряженными поверхнос-ями и хелатообразователями Са2+-опосредованном неферментативном ротеолизе протромбина по остаткам аргинина на поверхности молеку-ы, имитирующем активацию профермента фактором Ха и тромбином.

8. В плазме крови человека в норме присутствуют фрагмент I ротромбина и претромбин I. In vitro они поглощаются эндотелиаль-ыми клетками Купфера. Из этого следует, что катаболизм протромби-з протекает с расщеплением в циркулирующей крови тромбин-чувстви-зльной связи Арг155-Сер156 (наиболее вероятно в ходе биоимитирую-зго протеолиза) с последующим поглощением продуктов расщепления петками фагоцитарно-макрофагальной системы. Наличие фрагмента I и эетромбина I в крови должно обеспечивать функционирование ряда 1охимических и физиологических механизмов регуляции свертывания

крови.

9. Результаты исследования позволяют сформулировать функци нальную концепцию инициирования свертьюания крови Са2+-опосред ванной перестройкой бислойной структуры клеточных мембран в ме морфную. Перестройка создает фосфолипидные центры связывания вит мин K-зависимых факторов, обеспечивающие формирование и работу ферментных комплексов. Перестройка мембран индуцирует также н чальный биоимитирующий неферментативный протеолиз факторов, вед щий к появлению первой активной молекулы одного из них и запус каскада их дальнейших ферментативных превращений. Ионы Са2+ выпо няют при свертывании крови роль мессенджера.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н., Меньшов В.М. Получен протромбина собаки и его свойства // Биохимия. - 1968. - Т. 33, 1. - С. 7-14.

2. Тимербаев В.Н., Беляев Л.А., Зубаиров Д.М. Исследован структуры протромбина собаки и механизма его аутоактивации // Би химия. - 1969. - Т. 34, Мб. - С. 1100-1106.

3. Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н. Исследование протромби собаки и механизма его превращения в тромбин // Второй Всесоюзн биохимический съезд. Тезисы секционных сообщений. Секция 3 - Хим и биохимия ферментов, регуляция. - Ташкент: Фан. - 1969. -89-90.

4. Тимербаев В.Н., Попова Л.Г. О взаимодействии протромби и контактного фактора при свертывания крови // Биохимия. - 1971. Т. 36, N 3. - С. 518-521.

5. Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н., Ченборисова Г.Ш. Углево ный состав и некоторые свойства протромбина собаки // Журнал эв люционной биохимии и физиологии. - 1972. - Т. 8, Н 5. -513-516.

6. Тимербаев В.Н., Ченборисова Г.Ш. Некоторые данные о со таве и конформации протромбина // Химия протеолитических ферме тов. Материалы всесоюзного симпозиума по химии протеолитическ ферментов. - Вильнюс: 1973. - С. 66-67.

7. Соболева И.В., Тимербаев В.Н., Анисимова В.Ф., Зубаир Д.М. О первичной структуре С-концевого участка молекулы протромб

i // Система свертывания крови и фибринолиз. IV Всесоюзная конфе-зндия. Тезисы научных сообщений. - Саратов: 1975. - Ч. 1. - С. >0-121.

8. Тимербаев В.Н., Ченборисова Г.Ш. Исследование углеводного шпонента протромбина // Система свертывания крови и фибринолиз. I Всесоюзная конференция. Тезисы научных сообщений. - Саратов: )75. - Ч. 1. - С. 125-126.

9. Тимербаев В.Н., Ченборисова Г.Ш., Зубаиров Д.М. Исследо-1ние гликопептидов протромбина собак // Биохимия. - 1977. - Т. !, N 5. - С. 839-842.

10. Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н., Ченборисова Г.Ш. Природа икопептидов протромбина и фибриногена // Тезисы докладов IV Все-1ЮЗН0Й конференции по химии и биохимии углеводов. - Москва: Нау-.. - 1977. - С. 50-51.

11. Тимербаев В.Н. Молекулярная структура и функция протром-на // Казанский медицинский журнал. - 1977. - Т. 58, N 6. - С. -25.

12. Соболева И. В., Тимербаев В.Н., Анисимова В.Ф., Зубаиров М. Определение содержания С-концевой аминокислоты в протромбине бак // Украинский биохимический журнал. - 1978. - Т. 50, К 6. -

25-26.

13. Зубаиров Д.М., Соболева И.В., Важинская 3.В., Ченборисова 1U., Тимербаев В.Н., Сторожев А.Л. Влияние модификации белковой сти тромбопластина (фактора Ш) на его активность // Биохимия. -81. - Т. 46, N 7. - С. 1210-1214.

14. Киселев C.B.,, Тимербаев В.Н. Одновременное определение отромбина и его производных фрагмента I и претромбина I в плазме

Лабораторная диагностика. Тезисы Ш Всесоюзного съезда вра-й-лаборантов. Клиническая биохимия. Коагулология. - Москва: 35. - С. 223-224.

15. Зубаиров Д.М., Байкеев Р.Ф., Киршин C.B., Свинтенок Г.Ю., ЭолеваИ.В., Тимербаев В.Н., Ченборисова Г.Ш. Механизм участия зневого тромбопластина в инициировании тромбообразования // Ш зсоюзная конференция "Противотромботическая терапия в клиничес-\ практике. Новое в теории, диагностике, лечении". - Москва: 35.

16. Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н., Киршин C.B., Соболева 3., Киселев С. В. Молекулярный механизм взаимодействия протромби-

на с тканевым тромбопластином // Всесоюзная конференция "Актуал ные проблемы гемостаза в клинической практике". Тезисы докладов. Москва: 1987. - С. 23-24.

17. Киселев С.В., Тимербаев В.Н., Давыдов B.C., Киршин C.I Зубаиров Д.М- 0 взаимодействии протромбина с клетками Купфера гепатоцитами // Всесоюзная конференция "Актаульные проблемы гемс таза в клинической практике". Тезисы докладов. - Москва: 1987. С. 144-145.

18. Зубаиров Д.М., Тимербаев В.Н., Киселев С. В., Киршин С.Е Соболева И.В. Взаимодействие протромбина человека с тканевым трс бопластином // Биохимия. - 1989. - Т. 54, N 6. - С. 1046-1054.

19. Зубаиров Д. М.. Тимербаев В.Н., Байкеев Р.Ф., Мое: С.В., Попова Л.Г., Соболева И.В., Ченборисова Г.Ш., Киршин С. Исследование внешнего пути свертывания крови // Биохимия живота и человека. - Киев: Наукова Думка. - 1989. - Вып. 13. - С. 1-Ю.

20. Тимербаев В.Н., Киселев С.В., Киршин С.В., Способ полу^ ния меченого 1251 а-тромбина // Авторское свидетельство на изобр тение СССР N 1474937, МКИ5 А 61 К 43/00. - Казанский мед. инст тут. - N заявки 4143946/28-14. - Заявлено 06.11.86. - Опубликовз 15.10.90. - Бюллетень "Открытия и изобретения". - 1990. - N 38. С. 273.

21. Zubairov D.M., Baikeev R.F., Kirshin S.V., Kiselev S. V Popova L. G., Soboleva I.V., Tlrnerbaev V. N., Chenborisova G.E Study of the Biochemical and Physiological Mechanisms of Blood С agulation via the Extrinsic Pathway // Biochemical Mechanisms the System Regulating the Aggregate State of Blood (Ed. O.K. Ga rilov). - London: Harwood Acad. Publ. - 1990. - V. 3. Pt. 1. -9-25.

22. Zubairov D.M., Timerbaev V.N,, Kiselev S.V., Khairutdir va A. I. Athrombogenety-thrombogenety transformation of cytoplasrr membrane // Constituent Congress Int. Soc. for Pathophysiol. Mc kow, May 28 - June 1, 1991: Abstracts. - Kuopio. - 1991. - P. 12

23. Зубаиров Д.М., Тимербаев В. H. Функциональная концепи инициирования свертывания крови клеточными мембранами // Гематом гия и трансфузиология. - 1991. - Т. 36, N 4. - С. 5-9.

24. Зубаиров Д.М., Тимербаев В. Н. Функциональная концепи инициирования свертывания крови клеточными мембранами // Физио^ гия и патология гемостаза. Тезисы рсесоюзной конференции. ПолтаЕ

91. - С. 7.

25. Тимербаев В.H., Зубаиров Д.М., Киселев C.B., Киршин C.B., болев И. В. Взаимодействие фрагмента I, протромбина, претромбина и а-тромбина человека с тканевым тромбопластином // Биохимия. -

92. - Т. 57, N 1. - С. 77-80.

26. Тимербаев В.Н., Киселев C.B., Соболева И.В., Зубаиров М. Взаимодействие фактора X с тканевым тромбопластином // Акту-ьные вопросы службы крови и трансфузиологии. Тезисы докладов ссийской конференции 6-8 июня 1995 г. - С.-Петербург. - 1995. -

131-132.

Информация о работе

Тимербаев, Владимир Нуреевич
доктора медицинских наук
Москва, 1997
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Молекулярные механизмы участия в гемостазе протромбина и продуктов его активации ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы участия в гемостазе протромбина и продуктов его активации"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы участия в гемостазе протромбина и продуктов его активации
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия