Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы регуляции соматического гипермутирования иммуноглобулиновых генов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции соматического гипермутирования иммуноглобулиновых генов"

На правах рукописи

Благодатский Артем Сергеевич

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СОМАТИЧЕСКОГО ГИПЕРМУТИРОВАНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫХ ГЕНОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

?009

□0348608 1

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003486081

Работа выполнена в лаборатории биоинформатики и системной биологии Учреждения Российской Академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Научный руководитель

Доктор физико-математических наук, профессор Туманян В. Г. Официальные оппоненты

Доктор биологических наук Купраш Д.В.

Доктор биологических наук, профессор Миронов А.А.

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Г

Защита состоится « Ц» |щШг.

в | !■— час на заседании диссертационного совета л 002. * 235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии ИМ. В.А. Энгельгардта по адресу: 119991, г, Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разослан УС^^^Х/) ?С(?)г.

Ученый секретарь диссертационного Кандидат химических наук,

рицын А.М.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Уникальность регуляторной функции определённых элементов генома может отражаться в уникальности Фурье-спектров соответствующих нуклеотидных последовательностей. Ранее было показано, что периодичность в распределении нуклеотидов сама по себе, вне зависимости от конкретной последовательности нуклеотидов, может быть связана с функционированием регуляторых областей генома, так как именно периодичность в распределении нуклеотидов - важнейшая основа для формирования потенциала, определяющего взаимодействие ДНК-белок в различных областях генома. В работе Кравацкой и др., (2002 г.) показано, что на основе сходства Фурье-спектров различных негомологичных участков генома можно выявить несколько областей с аналогичной функцией, а именно областей, вовлеченных при определенных условиях в процесс инициации репликации.

В число наиболее сложных и интересных процессов, связвнных с перестраиванием генома, входят изменения, которые претерпевают в течение индивидуального развития организма гены, кодирующие иммуноглобулины. Генерация разнообразия иммуноглобулиновых генов была одной из фундаментальных проблем как иммунологии, так и молекулярной генетики на протяжении последних нескольких десятилетий. За эти десятилетия часть процессов, уникальных для перестраивания генов антител, была детально изучена, так, У(Б)1-рекомбинация, при помощи которой создаётся первичный репертуар иммуноглобулинов, является одним из хрестоматийных примеров в области молекулярной генетики. Однако, ряд явлений, связанных с более тонкой «настройкой» работы генов, отвечающих за иммунитет, остаётся загадкой и в нынешнее время. К таким процессам относятся, помимо

прочих, генная конверсия и соматическое гипермутирование иммуноглобулиновых генов. Соматическое гипермутирование является, по сути, уникальным явлением, воспроизводящим в ускоренном темпе процесс эволюции и направленного отбора для популяции В-лимфоцитов отдельно взятого организма. Исследование соматического гипермутирования помимо расширения области знаний о генетике иммуноглобулинов, поможет применить механизмы используемой организмами позвоночных «молекулярной эволюции» в области биотехнологии - получение белков с улучшенными свойствами при помощи соматического гипермутирования возможно уже сегодня (Arakawa et al, 2008). Однако, гипермутирование является потенциально опасным для организма процессом - нарушение его специфичности к иммуноглобулиновым генам может приводить к канцерогенезу, что делает исследование упомянутой специфичности вопросом, важным также и для медицины.

Начало XXI века было ознаменовано открытием дезаминазы AID -фермента, контролирующего целый ряд специфических изменений генов антител. Это открытие послужило мощным толчком, вызвавшим новую волну интереса к исследованиям в данной области.

Цель и задачи исследования.

Целью работы являлось установление природы выделенности локуса легкой цепи иммуноглобулинов на 15 хромосоме генома курицы в отношении индукции соматического гипермутирования методом анализа периодичностей распределения нуклеотидов в ДНК локуса, а также поиск и характеристика цис-действующих элементов, контролирующих соматическое гипермутирование. Были поставлены следующие задачи:

Анализировать периодичности в нуклеотидной последовательности локуса лег-

кой цепи иммуноглобулинов курицы, сравнить их с периодичностями распределения нуклеотидов в ДНК хромосомы 15 курицы на предмет обнаружения уникальных областей.

- Доказать зависимость соматического гипермутирования от цис-действующих элементов локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы, путём удаления и реинсерции локуса.

- Оценить расстояние, на котором цис-действующие элементы сохраняют своё влияние на соматическое гипермутирование.

- Показать способность цис-действующих элементов локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы активировать гипермутирование в неиммуноглобулиновых локусах, независимо от места на хромосоме.

- Провести делеционный анализ локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы, более точно картируя на нём регионы, контролирующие соматическое гипермутирование.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Исходя из того, что уникальность регуляторной функции может отражаться в уникальности Фурье-спектров соответствующих нуклеотидных последовательностей, мы провели исследование локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы детальным анализом периодичностей в его нуклеотидной последовательности и сравнили полученную периодичность с таковой в оставшейся последовательности хромосомы 15 курицы. Биоинформатическое исследование периодичностей распределения нуклеотидов способно дать характеристики нуклеотидной последовательности, ответственные за специфическую направленность гипермутирования.

В ходе исследований нами была показана уникальность периодичностей в нуклеотидной последовательности локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы. На основе биоинформатического анализа и

экспериментов на линии куриных В-лимфоцитов ВТ40 охарактеризована цис-действующая последовательность ДНК, необходимая для гипермутирования в локусе лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы и способная активировать гипермутирование, будучи встроенной в другие локусы. Эту последовательность мы назвали элементом В1УАС от англ. «активатор диверсификации». Элемент 01УАС располагается на протяжении 9,8 тыс.п.о, начиная от точки старта транскрипции гена лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы и заканчивая нижеследующим геном. 01УАС, вероятно, состоит из ряда участков, возможно, взаимодействующих между собой. Центральная последовательность элемента 01УАС, размером 4 тыс. п.о., способна активировать гипермутирование с интенсивностью более чем в 100 раз превышающую фоновый уровень. Фланкирующие регионы обладают на порядки меньшей активностью сами по себе, но способны стимулировать гипермутирование, будучи объединены с центральным участком. Элемент Б1УАС способен действовать, находясь по обе стороны от репортерной конструкции и на достаточно больших расстояниях.

Учитывая, что процесс АГО-опосредованного перестраивания иммуноглобулиновых генов достаточно консервативен в течение эволюции позвоночных, идентификация элемента И1УАС у курицы должна быть также значима и для млекопитающих. Поиски цис-действующих последовательностей, регулирующих гипермутирование, на примере трансгенных мышей показали, что регионы, окружающие иммуноглобулиновые энхансеры, влияют на гипермутационную активность. Характеристики и расположение этих участков напоминают таковые для центральной части элемента П1УАС курицы. Описанная в работе экспериментальная модель адекватна для изучения соматического гипермутирования. Биоинформатический анализ охарактеризованного элемента й!УАС может помочь в исследовании и нахождении

характеристик последовательностей, способных активировать аберрантное гипермутирование, таким образом, работа значима и для медицины. В области биотехнологии характеристика элемента, контролирующего соматическое гипермутирование, также имеет значимость, позволяя использовать описанный элемент для улучшения свойств белков методом «искуственной эволюции» (Агакау/а е1 а1, 2008).

Апробация работы и публикации

По мотивам диссертации опубликовано шесть печатных работ, в том числе три статьи в реферируемых журналах из списка ВАК и три в тезисах международных конференций.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 115 страницах печатного текста, содержит 31 рисунок и 4 таблицы; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 122 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение

Введение содержит обоснование актуальности темы диссертации.

Глава 1. Обзор литературы.

В главе 1 приводится обзор литературы по молекулярным механизмам регуляции соматического гипермутирования .

Глава 2. Методы

В главе 2 проводится обзор биоинформатических и экспериментальных методов, использованных в работе.

Глава 3. Результаты 3.1. Анализ распределения периодичностей в последовательностях

нуклеотидов локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы

Методом скользящего окна со сдвигом на десять нуклеотидов получен набор распределений Фурье-спектров нуклеотидных последовательностей вдоль 15-й хромосомы. Процедуру повторяли для размеров окон, соответствующих длине энхансера иммуноглобулинового локуса, длине вариабельной области, длине константной области, длине всего локуса легкой цепи иммуноглобулинов курицы и длинам ряда его фрагментов т.е. размер окна меняли от величин, порядка нескольких сотен нуклеотидов, до нескольких тысяч нуклеотидов. С помощью программы поиска тандемных повторов - atc3.biomath.mssm.edu/trf.html обнаружены два участка тандемных повторов длиной в два нуклеотида. Первый - с 1104 по 1222 нуклеотид (консенсус). Выяснено, что локус легкой цепи иммуноглобулинов Gallus gallus имеет сложное строение, где встречаются как участки с явным регулярным строением, так и участки со скрытыми периодичностями. Мы полагаем, что уникальность на 15-й хромосоме спектрального портрета локуса легкой цепи иммуноглобулинов курицы и её фрагментов (таких, как энхансер и области с Зй-конца от него, регуляторный участок 3'RR, фрагменты S и Р) определяет распознавание иммуноглобулинового локуса регуляторными белками и связана с процессом соматического гипермутирования. Уникальность спектрального портрета локуса объясняет, почему область гипермутирования не распространяет свои свойства на остальные районы хромосомы: отсутствие похожих по спектральному портрету областей вне иммуноглобулинового локуса свидетельствует о малой вероятности взаимодействия регуляторных комплексов, обеспечивающих гипермутирование, за его пределами, где периодичности распределения нуклеотидов в принципе другие.

3.2. Репортерная конструкция на базе GFP, позволяющая детектировать гипермутирование

Нами разработана новая репортерная генетическая конструкция, названная GFP2, состоящая из сильного промотора вируса саркомы Рауса (RSV), за которым следует ген, кодирующий GFP, сайт внутренней посадки рибосомы (IRES), ген устойчивости к антибиотику бластицидину и сигнал полиаденилирования вируса SV40. На базе GFP2 был создан вектор pIgLGFP2, где репортерная конструкция была фланкирована последовательностями, позволяющими провести направленную интеграцию в локус лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы. При этом GFP2 встраивалась в локус в направлении, противоположном направлению транскрипции иммуноглобулинового гена, дабы минимизировать взаимодействие между транскрипцией и посттранискрипционной регуляцией экспрессии трансгенного GFP и иммуноглобулинового гена (рис. 1).

Трансфекция вектора pIgLcm в стабильно экспрессирующую AID линию DT40 AIDR2 дала начало новой линии, названной IgLGFP2, в которой, в результате направленного встраивания, иммуноглобулиновый промотор был заменён трансгенной конструкцией GFP2. Анализ двух субклонированных первичных трансфектантов показал, что медианные значения процента численности популяции клеток с пониженной зеленой флуоресценцией от общего числа клеток составили 12,8% и 14,5%, соответственно (рис. 2). Этот результат ещё раз позволил подтвердить предположение о том, что трансгенная конструкция GFP2 мутирует с высокой частотой в иммуноглобулиновом локусе.

Рис.1 Схема репортерной конструкции GFP2 и её направленной интеграции в локус лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы. ¥V- псевдо-У-гены, IgL Pro — иммуноглобулиновый промотор, LVJ- область, кодирующая вариабельный сегмент иммуноглобуоинового гена, bsr - ген устойчивости к бластицидину, RSV pro - промотор вируса саркомы Рауса, SV40 polyA -сигнал полиаденилирования вируса SV40.

3.3. Гипермутирование в окрестностях иммуноглобулинового локуса

При помощи направленной интеграции репортерную конструкцию GFP2 вставили на различных расстояниях по обе стороны от локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов на 15 хромосоме. Анализ методом проточной цитометрии первичных трансфектантов и их субклонов (Рис. 2) показал, что медианные значения процента численности популяции клеток с пониженной зеленой флуоресценцией от общего числа клеток составили около 3% на позициях +26 тыс. п.о. и -15 тыс.п.о., около 0,5% на позиции +52 тыс. п.о. и около 0,05% на позиции -135 тыс.п.о. Для доказательства зависимости наблюдаемого снижения зеленой флуоресценции от активности AID аналогичные трансфекции в позиции +52, +26 и -135 тыс.п.о. произвели в линию DT40, дефектную по гену AICDA. Медианные значения снижения зелёной флуоресценции не превышали в этих случаях 0,001%, подтверждая связь с активностью AID.

Суммируя полученные результаты, можно подытожить, что гипермутирование репортерной конструкции было возможно детектировать на расстояниях до 52 тыс.п.о. от изучаемого локуса, однако при удваивании этого расстояния, гипермутирование уже практически не детектировалось.

Рис.2 Статистический анализ гипермутирования репортера СРР2 в окрестностях локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы после субклонирования. Каждая точка на графике отображает индивидуальное значение процента снижения флуоресценции для одиночного субклона; медианное значение для всех субклонов обозначено чертой.

Локус ЧТ!^-.......1-Й—

Карбак-идраза ......НвН—■■■

.....—НИ—-

Локус

УрвйЗ ......НИ—

-----В

ГПпчсЧФЩГ' .....-Ш-

р!д!_*-ерр2 -

иУ-(дС--оррг „...,-ЬЯ5-—

Карвангидргза

срр? -'■•'»' с

I " "Ш-К-

Карбангидраэа «1М---

-«Я.........

1 ГЫС.Е1.С.

вгрг

егл " —о-

ЧИК-+-

^-ИЕН

-гт-

са=ра

фи—щ--и-

-МГН-4-

Рис. 3 Схема делеций и инсерций репортерной конструкции в локус лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы. РигоК - ген устойчивости к пуромицину, ЕпИ -иммуноглобулиновый энхансер, УргеВЗ - соседний ген, лежащий выше исследуемого локуса.

3.4 Идентификация активатора диверсификации иммуноглобулияовых генов

Полученные результаты можно было объяснить наличием в изучаемом локусе цис-регуляторной последовательности, активирующей гипермутирование на некоторых расстояниях от локуса. Мы назвали эту предполагаемую регуляторную последовательность активатором диверсификации (01УАС) и попытались охарактеризовать её, сочетая

инсерции репортерной конструкции йРР2 с делегированием фрагментов изучаемого локуса.

Чтобы оценить роль псевдо-У-геяов, конструкцию СРР2 трансфицировали в дефектную по псевдогенам линию ОТ40 уУ АЮК1 (исходно описана у Агака\уа а1, 2008). Полученные трансфектанты \|ЛП§ЬСРР2 экспрессировали репортерный на месте

иммуноглобулинового промотора, при отсутствии псевдо-У-генов (рис. 3, рис.4).

v'V-lgL-

4y-tgLG"p2'AtOJ'-

Рис 4. Анализ интенсивности гипермутирования репортера GFP2 при делетировании и реконституции локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы методом проточной цитометрии.

Анализ субклонированных трансфектантов методом проточной цитометрии показал медианные значения процента в популяции клеток с пониженной интенсивностью зелёной флуоресценции 5,2% и 7,5% (Рис.5), что менее, чем в два раза ниже, чем аналогичные значения для трансфектантов IgLGFP2 с псевдогенами в наличии.

Поскольку разница между вышеупомянутыми линиями может основываться на флуктуациях или же на разных уровнях экспрессии AID в линиях-предшественниках (AID1*2 и \|/V"AIDR1), то влияние псевдо-У-генов на интенсивность гипермутирования конструкции GFP2 можно считать незначительным, если не отсутствующим.

Рис.5. Статистический анализ гипермутирования репортера вРР2 при делетировании и реконституции локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы после субклонирования.

Линия \|/У1£ЬСТР2 всё ещё содержала фрагмент перестроенного локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов длиной 9,8 тыс. п.о., протяженный от точки начала транскрипции иммуноглобулинового гена до границы следующего за иммуноглобулиновым локуса карбоангидразы. В последующих экспериментах этот фрагмент именуется фрагментом «\У». Для оценки значимости этого фрагмента для гипермутирования конструкцию вРР2 трансфицировали в линию ВТ40 в которой

перестроенный локус лёгкой цепи иммуноглобулинов был полностью заменён геном устойчивости к антибиотику пуромицину. У полученных в итоге трансфектантов \|ЛГ1§Ь"'0РР2 ген устойчивости к пуромицину, расположенный на месте изучаемого локуса, был заменён на конструкцию вРР2 (рис. 3). Анализ субклонов первичных трансфектантов линии \|ЛГ 1§Ь",0РР2 показал медианные значения процента в популяции клеток с пониженной интенсивностью зелёной флуоресценции всего лишь 0,01% и

0,02% (Рис.5). Это более чем в 100 раз ниже, чем аналогичные значения для линии \|/У1§Ь0РР2, где фрагмент в отличие от \|/\г1§Ь",СРР2

присутствует, что указывает на необходимость фрагмента для

гипермутирования конструкции СРР2.

Чтобы окончательно исключить возможность того, что снижение зеленой флуоресценции обусловлено не гипермутированием, а снижением уровня транскрипции в части популяции по той или иной причине, мы провели сортировку клеток линии \|/У1§Ь0РР2 на препаративном проточном цитометре. Были отсортированы друг от друга клетки основной популяции с высокой интенсивностью зеленой флуоресценции и клетки популяции с пониженной степенью зелёной флуоресценции (Рис.6а).

Рис.6. Сортировка популяций высокой и низкой экспрессией

А - схема отбора высоко- и низкоэкспрессирующих клеток; Ь - ОТ-ПЦР-анализ сортированных и несортированных популяций на интенсивность экспрессии генов СЕР и ЕР1а.

Затем клетки сортированных популяций и клетки линии \|ЛГ^Ь<ЗРР2, не подвергавшиеся сортировке, были проанализированы методом полуколичественной ПЦР с обратной транскрипцией . Уровни экспрессии С?РР были сопоставимы для всех трёх анализируемых популяций, что

свидетельствовало о независимости снижения зелёной флуоресценции от уровня экспрессии GFP(Pm. 6b).

Затем линия \|/V"IgL" была трансфицирована конструкцией, в состав которой входили репортер GFP2 и фрагмент «W» (рис. 3). Анализ субклонов полученной линии \)/V"IgLw,GFP2 позволил показать медианные значения процента в популяции клеток с пониженной интенсивностью зелёной флуоресценции, сходные с таковыми для yV"IgLGFP2 (рис. 5). Таким образом, фрагмент «W» способен полностью восстанавливать гипермутабельность при реинсерции его на место удалённого иммуноглобулинового локуса, что и предполагалось для гипотетического элемента DIVA С, каким фрагмент «W» и является.

Дополнительным контролем на способность элемента DIVAC активировать гипермутирование была трансфекция конструкции, содержащей репортер GFP2, в локус лёгкой цепи иммуноглобулинов дефектной по AID линии DT40 \yV"AID". Полученные трансфектанты \|/V" IgLGFK AID" продемонстрировали очень низкие медианные значения процента клеток со сниженной зеленой флуоресценцией - не более 0,001%. Это ещё раз показало связь снижения флуоресценции с действием AID, и, как следствие, доказало гипермутирование конструкции GFP2. Далее, мы амплифицировали и секвенировали последовательность, кодирующую GFP, из клеточных линий V|/V"IgLGFP2 и \|/V"IgL"'GFP2. Для первой линии, поели шестинедельного культивирования, количество мутаций в гене GFP длиной 723 п.о. составило в среднем 0,9 мутаций на ген (рис. 7). Учитывая, что время удвоения популяции DT40 - 10 часов, относительная частота мутаций в этом случае составила 1,3x10"5 мутаций/п.о./поколение, что сопоставимо с описанной частотой мутаций в иммуноглобулиновых генах линии человеческих В-лимфоцитов RAMOS, для которой она равняется 2,2х10"5 мутаций/п.о/поколение (Sale,Neuberger, 1998; Zhang et al, 2001).

Превалирующим типом мутаций были трансверсии С->0 и 0->С, что хорошо соотносится с данными по спектру мутаций в ОТ40 с удалёнными псевдо-У-генами (Arakawa й а1,2004). Для контрольной линии \|ЛП^Ь"'СТР2 с удалённым полностью иммуноглобулиновым локусом частота мутаций не превышала значения, характерного для ошибки ПЦР (рис.7).]

было А с в т было А С О Т

А \ г О А \ 0 3 1

С \ 73 33 С 1 \ 0 1

С 67 \ ■г С 7 0 \ 0

т ! а О \ т О 1 0 \

С.З мутаций на последовательность (224/250) 0.06 мутаций на последовательность (15/258)

Рис. 7 Спектры мутаций в генах GFP в присутствии и в отсутствии элемента ШУАС

3.5 Делеционный анализ элемента Р1УАС

Для более подробной характеристики элемента В7УАСпутём его пошагового делетирования, линию уХП^Ь'трансфицировали новой серией конструкций, несущих репортер и участки фрагмента «\У», несущие делеции разной длины, как с 5', так и с 3'-конца (рис. 8). Анализ полученных субклонов разных трансфектадтов методом проточной цитометрии показал варьирующую от клона к клону, но последовательную потерю гипермутационной активности, при пошаговом укорачивании на 1 тыс. п.о. с обоих концов (рис. 9). Фрагмент «Б» длиной 4 тыс. п.о., расположенный в середине фрагмента и включающий в себя ранее описанный иммуноглобулиновый энхансер (ВиНЬпе-РаиБ е1 а1, 1995), всё ещё был способен индуцировать снижение зелёной флуоресценции порядка 2,7%-1,7% от общей популяции. Напротив, вышележащий фрагмент «В» и нижележащий фрагмент «Р» сами по себе оказались не

способны поддерживать гипермутационную активность, индуцируя снижение зелёной флуоресценции лишь в 0,13%-0,05% клеток, что является крайне низким значением по сравнению с активностью элемента П1УАС, но всё же превышает фоновый уровень снижения флуоресценции

для линии уУ^Ь'

Локус Т\'-1Е1.-

УргеВЗ -КЩ-

р1диЕЛГ,г

р|д|_«»«

р1в1.етг

Каобанглдраэа

•Ч-В-

-евн

«ш

«и

5Е!! ИМ

те ки

-фа

-5311

-ган

-«И

-Ш1

ш<

Рис.8 Делеционный анализ фрагмента «\¥». Схема делений в локусе лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы.

Если любой из двух вышеупомянутых фрагментов был комбинирован с фрагментом «8», в составе фрагментов «Б» и «К», соответственно, то медианные значения снижения зелёной флуоресценции увеличивались примерно втрое. Всё это позволяет сделать вывод о том, что элемент В1УАС локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы состоит из центрального региона и частично избыточных фланкирующих его регионов, вносящих, однако, вклад в общую активность. Для более подробной характеристики последовательностей, обуславливающих функцию й!УАС, необходим дальнейший функциональный анализ.

е &

>> с

•ВО

а

о о. с:

40 т - ~

7.П

30-

20-

Ш* 0.0?%

ОЛМ МВ ЗЛ*

ш

ом

03%

т 1»

р.1» 10,4*

54%

5 О

9

Ш З.Я

о о

Ш

2»

9.0«

о о о в

М1%

2.7% ; 1Л

о 1 о '

о '

Рис.9 Статистический анализ гипермутирования репортера вРР2 при делегировании различных участков локуса лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы после субклоиирования.

Несмотря на небольшое снижение экспрессии гена бЕР в линии

№

,ОРР2

по сравнению с линией \izV~IgL

W,GFP2

возможно, в связи с

Т Г-Т Т ,?»,,ОРР2

дополнительным стимулированием экспрессии в \izVIgL за счет

присутствующего иммуноглобулинового промотора, разница в интенсивности транскрипции, вряд ли была столь велика, чтобы повлечь за собой более чем 300-кратное снижение интенсивности гипермутирования. Делеционный анализ фрагмента «№» также опровергает возможность того, что различия в гипермутабельности у разных линий серии обусловлена различием в транскрипции, поскольку первичные трансфектанты для всех серий показали сходные уровни экспрессии при анализе на

проточном цитометре. Также, для окончательного исключения влияния траникрипционного уровня, на всех 15 линиях серии был проведён полуколичественный ОТ-ПЦР анализ, выявивший сходные уровни транскрипции гена б/ГР для всех образцов.

3.6. Гипермутирование в неиммуноглобулиновых локусах

Для подтверждения отсутствия гипермутирования репортера GFP2 самого по себе, в отсутствие элемента DIVAC, в неиммуноглобулиновых локусах, мы трансфицировали вышеупомянутую конструкцию в шесть различных локусов на пяти различных хромосомах в линию \|/V"AIDri. Ни первичные трансфектанты, ни их субклоны (Рис. 10) не показали высоких уровней потери зелёной флуоресценции. В зависимости от эксперимента и от сайта инсерции, медианные значения потери зелёной флуоресценции варьировали для субклонов от 0,02% до 0,22%, показывая, что уровень гипермутирования во всех выбранных локусах был от 50 до 500 раз ниже, чем в нативном локусе лёгкой цепи иммуноглобулинов. Однако, эти значения были всё ещё в 2-10 раз выше, чем аналогичные для различных субклонов трансфектантов, дефектных по AID (рис. 5 и 12), подтверждая данные о небольшом увеличении фоновой частоты мутаций в AID-экспрессирующих В-лимфоцитах (Liu et al, 2008).

Также мы произвели инсерцию репортера GFP2 вместе с фрагментом «W» в три локуса линии \|/V"AIDR1, в которые ранее уже были трансфицированы контрольные репортеры GFP2 сами по себе.

Для всех трёх локусов (AID, ВАСН2 и RDM1) процент клеток со сниженной зелёной флуоресценцией после анализа субклонов составил от 4,0% до 9,4%, (рис. 11, рис.12), что сопоставимо с подобными значениями для линий \|/V'IgL'GFP2 и \j/V"IgLw'GFP2. Гипермутирование и в этом случае было AID-зависимым, поскольку субклоны дефектных по AID трансфектантов \|/VBACH2W'GFP2 AID", \|/VAIDW'GFP2 AID', v|/VRDM1w'GFP2 AID" показали очень низкие медианные значения снижения зелёной флуоресценции в пределах от 0,001% до 0,03%.

Рис.10 Статистический анализ гипермутирования репортера СРР2 при его инсерции в различные хромосомы курицы.

'-ВАСН-2тт цЛЛВАС AID"''"

FSC

Рис.11. Анализ интенсивности гипермутирования репортера GFP2 в локусе ВАСН2с элементом DIVAC и без него методом проточной цитометрии.

Эти результаты продемонстрировали, что элемент DIVAC способен активировать AID- опосредованную гипермутабельность в локусах, для которых последняя в природе не характерна.

ш rr о ш а

о §

о а С

Рис.12 Статистический анализ гииермутирования репортера GFP2 вместе с элементом DIVAC при инсерции в различные хромосомы курицы в линиях DT40, экспрессирующих и не экспрессирующих AID.

Глава 4. Обсуждение результатов.

В главе приведено общее обсуждение данных главы 3. Делаются выводы об уникальности периодичностей в нуклеотидной последовательности локуса легкой цепи иммуноглобулинов курицы относительно остальной последовательности хромосомы 15. и функциональной уникальности локуса относительно способности индуцировать соматическое гипермутирование.Обсуждается сложное строение элемента DIVAC, вероятная регуляция при помощи элемента DIVAC генной конверсии и реакции переключения изотипов. Высказывается гипотеза о сходстве механизмов действия элемента DIVAC и энхансеров, и о сходных принципах регуляции соматического гипермутирования у других позвоночных животных.

Выводы

1. Проведен анализ периодических характеристик распределения нуклеотидов в локусе лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы методом Фурье-спектроскопии. Показано сложное строение локуса, выявлены как участки с явным регулярным строением, так и участки со скрытыми периодичностями.

2. Показана уникальность набора периодичностей Фурье-спектров локуса легкой цепи иммуноглобулинов курицы и его фрагментов.

3. Показано, что отсутствие гипермутирования на хромосоме 15 курицы вне локуса легкой цепи иммуноглобулинов определяется отсутствием на хромосоме иных областей со сходной периодичностью

4. Создана репортерная конструкция на основе зелёного флуоресцентного белка, позволяющая количественно оценивать интенсивность соматического гипермутирования на модели линии куриных В-лимфоцитов БТ40.

5. С использованием конструкции ОРР2 охарактеризован элемент БР/АС, необходимый для соматического гипермутирования в локусе лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы.

6. Оценены расстояния, на которых элемент й1УАС способен активировать гипермутирование. Сделан вывод о постепенном ослабевании действия элемента 01УАС с увеличением расстояния.

7. Проведён делеционный анализ элемента В1УАС, позволивший охарактеризовать вклад различных участков элемента в активирование соматического гипермутирования.

8. Методом внедрения элемента DIVAC в неиммуноглобулиновые локусы доказано, что данный элемент является не только необходимым, но и достаточным для активирования соматического гипермутирования в любом геномном локусе курицы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи

1. Blagodatski A, Batrak V, Schmidl S, Schoetz U, Caldwell RB, Arakawa H., Buerstedde J.-M. 2009 A cis-Acting Diversification Activator Both Necessary and Sufficient for AID-Mediated Hypermutation. PLoS Genet 5(1): el000332. doi:10.1371/journal.pgen.l000332

2. Caldwell RB, Kierzek AM, Arakawa H, Bezzubov Y, Zaim J, Fiedler P, Kutter S, Blagodatski A, Kostovska D, Koter M, Plachy J, Caminci P, Hayashizaki Y, Buerstedde JM. Full-length cDNAs from chicken bursal lymphocytes to facilitate gene function analysis Genome Biol. 2005;6(1):R6. Epub 2004 Dec 23.

3. Г.И. Кравацкая, Ю.В. Кравацкий, A.C. Благодатский, В.Г. Туманян, Н.Г. Есипова Периодичности в организации нуклеотидиой последовательности локуса легкой цепи иммуноглобулинов Gallus gall us .Биофизика 2009, том 54, вып.4, с.1-6.

Тезисы

1. Jean-Marie Buerstedde, Artem Blagodatskiy, Vera Batrak, et al., 2007. Cis-acting sequences limit hypermutation to the immunoglobulin loci. 2nd International Gene Center /SFB 646 Symposium, October 12/13th, Munich.

2. Ulrike Sohotz, Sabine Schmidl, Artem Blagodatskiy, Vera Batrak Randy Caldwell, Hiroshi Arakawa and Jean-Marie Buerstedde. 2007. The Role of Transcription Factors and Cis-acting Regulatory Elements for Immunoglobulin Repertoire Development. 5th В Cell Forum,Bad Bevensen, Germany, April 30 - May 2,2007, Abstracts, p 46.

3. Hiroshi Arakawa, Artem Blagodatski, Vera Batrak, et al, 2008. A as-Acting Diversification Activator Both Necessary and Sufficient for AID-Mediated Hypermutation.6,h В Cell Forum, Eibsee-Hotel, Grainau, Germany, April 10-12, Abstracts, p 32

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 29.10.2009 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 590. Тел. 939-3890. ТелУФакс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Благодатский, Артем Сергеевич

Введение

Обзор литературы

Часть 1. Молекулярные механизмы соматического гипермутирования

Часть 2. Линия куриных В-лимфоцитов БТ40 как модель для изучения соматического гипермутирования

Экспериментальная часть

Обоснование работы и поставленные задачи

Материалы и методы

Результаты и их обсуждение

Выводы

Список публикаций

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы регуляции соматического гипермутирования иммуноглобулиновых генов"

Уникальность регуляторной функции определённых элементов генома может отражаться в уникальности Фурье-спектров соответствующих нуклеотидных последовательностей. Ранее было показано, что периодичность в распределении нуклеотидов сама по себе, вне зависимости от конкретной последовательности нуклеотидов, может быть связана с функционированием регуляторых областей генома, так как именно периодичность в распределении нуклеотидов - важнейшая основа для формирования потенциала, определяющего взаимодействие ДНК-белок в различных областях генома. В работе Кравацкой и др., (2002 г.) показано, что на основе сходства Фурье-спектров различных негомологичных участков генома можно выявить несколько областей с аналогичной функцией, а именно областей, вовлеченных при определенных условиях в процесс инициации репликации.В число наиболее сложных и интересных процессов, связвнных с перестраиванием генома, входят изменения, которые претерпевают в ходе индивидуального развития организма гены, кодирующие иммуноглобулины. Генерация разноообразия иммуноглобулиновых генов была одной из фундаментальных проблем как иммунологии, так и молекулярной генетики на протяжении последних нескольких десятилетий. За эти десятилетия часть процессов, уникальных для генов антител, была детально изучена, так, У(0).Г-рекомбинация, при помощи которой создаётся первичный репертуар иммуноглобулинов, является одним из хрестоматийных примеров в области молекулярной генетики. Однако, ряд явлений, связанных с более тонкой «настройкой» работы генов, отвечающих за иммунитет, остаётся загадкой и в нынешнее время. К таким процессам относятся, помимо прочих, генная конверсия и соматическое гипермутирование иммуноглобулиновых генов. Соматическое гипермутирование является, по сути, уникальным явлением, воспроизводящим в ускоренном темпе процесс эволюции и направленного отбора для популяции В-лимфоцитов отдельно взятого организма. Исследование соматического гипермутирования помимо расширения области знаний о генетике иммуноглобулинов, поможет применить механизмы используемой организмами позвоночных «молекулярной эволюции» в области биотехнологии - получение белков с улучшенными свойствами при помощи соматического гипермутирования возможно уже сегодня (Arakawa et al, 2008). Однако, гипермутирование является потенциально опасным для организма процессом нарушение его специфичности к иммуноглобулиновым генам может приводить к канцерогенезу - что делает исследование упомянутой специфичности вопросом, важным также и для медицины.Начало XXI века было ознаменовано открытием дезаминазы AID - фермента, контролирующего целый ряд специфических изменений генов антител. Это открытие послужило мощным толчком, вызвавшим новую волну интереса к исследованиям в данной области.Настоящая диссертационная работа посвящена изучению механизмов, обеспечивающих специфичность соматического гипермутирования к генам иммуноглобулинов на уровне цис-действующих ДНК-элементов.Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Благодатский, Артем Сергеевич

Выводы

1. Проведен анализ периодических характеристик распределения нуклеотидов в локусе лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы методом Фурье-спектроскопии. Показано сложное строение локуса, выявлены как участки с явным регулярным строением, так и участки со скрытыми периодичностями.

2. Показана уникальность Фурье-спектров локуса легкой цепи иммуноглобулинов курицы и его фрагментов

3. Показано, что отсутствие гипермутирования на хромосоме 15 курицы вне локуса легкой цепи иммуноглобулинов определяется отсутствием на хромосоме иных областей со сходной периодичностью

4. Создана репортерная конструкция GFP2 на основе зелёного флуоресцентного белка, позволяющая количественно оценивать интенсивность соматического гипермутирования на модели линии куриных В-лимфоцитов DT40.

5. С использованием конструкции GFP2 охарактеризован элемент DIVAC, необходимый для соматического гипермутирования в локусе лёгкой цепи иммуноглобулинов курицы.

6. Оценены расстояния, на которых элемент DIVAC способен активировать гипермутирование. Сделан вывод о постепенном ослабевании действия элемента DIVAC с увеличением расстояния.

7. Проведён делеционный анализ элемента DIVAC, позволивший охарактеризовать вклад различных участков элемента в активирование соматического гипермутирования.

8. Методом внедрения элемента DIVAC в неиммуноглобулиновые локусы доказано, что данный элемент является не только необходимым, но и достаточным для активирования соматического гипермутирования в любом геномном локусе курицы.

Публикации в рецензируемых журналах по теме работы:

Blagodatski A, Batrak V, SchmidI S, Schoetz U, Caldwell RB, et al. 2009 A cft-Acting Diversification Activator Both Necessary and Sufficient for AID-Mediated Hypermutation. PLoS Genet 5(1): el000332. doi: 10.1371/journal.pgen. 1000332

Caldwell RB, Kierzek AM, Arakawa H, Bezzubov Y, Zaim J, Fiedler P, Kutter S, Blagodatski A, Kostovska D, Koter M, Plachy J, Carninci P, Hayashizaki Y, Buerstedde JM. Full-length cDNAs from chicken bursal lymphocytes to facilitate gene function analysis Genome Biol. 2005;6(1):R6. Epub 2004 Dec 23.

Г.И. Кравацкая, Ю.В. Кравацкий, A.C. Благодатский, В.Г. Туманян, Н.Г. Есипова ПЕРИОДИЧНОСТИ В ОРГАНИЗАЦИИ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЛОКУСА ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ (j(iMus gullus БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып. 4, с. 6-1

Тезисы конференций, на которых была апробирована работа:

Jean-Marie Buerstedde, Artem Blagodatskiy, Vera Batrak, et al., 2007. Cis-acting sequences limit hypermutation to the immunoglobulin loci. 2nd International Gene Center /SFB 646 Symposium, October 12/13th, Munich.

Ulrike Schotz, Sabine Schmidl, Artem Blagodatskiy, Vera Batrak Randy Caldwell, Hiroshi Arakawa and JeanMarie Buerstedde. 2007. The Role of Transcription Factors and Cis-acting Regulatory Elements for Immunoglobulin Repertoire Development. 5 В Cell Forum,Bad Bevensen, Germany, April 30 - May 2,

2007, Abstracts, p 46.

Hiroshi Arakawa, Artem Blagodatski, Vera Batrak, et al, 2008. A c/'s-Acting Diversification Activator Both Necessary and Sufficient for AID-Mediated Hypermutation.6Ul В Cell Forum, Eibsee-Hotel, Grainau, Germany, April 10-12, Abstracts, p 32

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Владимиру Гайевичу Туманяну, а также Наталье Георгиевне Есиповой за чуткое руководство, заботу и готовность прийти на помощь в любой момент, и Галине Кравацкой за неоценимую помощь в выполнении биоинформатической части работы.

Автор также глубоко признателен коллегам из Института Молекулярной Радиобиологии (центр им. Гельмгольца, Мюнхен: Вере Батрак за огромный вклад в экспериментальную часть работы, Хироси Аракаве (Hiroshi Arakawa) и Рандольфу Калдуэллу (Randolph Caldwell) за методическую помощь в освоении методов работы с культурой DT40 и Жану-Мари Бурштедде (Jean-Marie Buerstedde) за неоценимый вклад в разработку экспериментов по идентификации элемента DIVAC.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Благодатский, Артем Сергеевич, Москва

1. Arakawa, Н. and J.M. Buerstedde, Immunoglobulin gene conversion: insights from bursal В cells and the DT40 cell line. Dev Dyn, 2004. 229(3): p. 458-64.

2. Arakawa, H., et al., Immunoglobulin gene hyperconversion ongoing in chicken splenic germinal centers. EMBO J, 1996. 15(10): p. 2540-6.

3. Arakawa, H., J. Hauschild, and J.M. Buerstedde, Requirement of the activation-induced deaminase (AID) gene for immunoglobulin gene conversion. Science, 2002. 295(5558): p. 1301-6.

4. Arakawa, H., et al., Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Res, 2008. 36(1): p. el.

5. Arakawa, H., et al., Oligoclonal development of B cells bearing discrete Ig chains in chicken single germinal centers. J Immunol, 1998. 160(9): p. 4232-41.

6. Arakawa, H., D. Lodygin, and J.M. Buerstedde, Mutant loxP vectors for selectable marker recycle and conditional knock-outs. BMC Biotechnol, 2001. 1: p. 7.

7. Arakawa, H., et al., A role for PCNA ubiquitination in immunoglobulin hypermutation. PLoS Biol, 2006. 4(11): p. e366.

8. Bachl, J., I. Ertongur, and B. Jungnickel, Involvement of Radl8 in somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(32): p. 12081-6.

9. Bain, G. and C. Murre, The role of E-proteins in B- and T-lymphocyte development. Semin Immunol, 1998. 10(2): p. 143-53.

10. Barreto, V., et al., C-terminal deletion of AID uncouples class switch recombination from somatic hypermutation and gene conversion. Mol Cell, 2003. 12(2): p. 501-8.

11. Basu, U., et al., The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature, 2005. 438(7067): p. 508-11.

12. Betz, A.G., et al., Elements regulating somatic hypermutation of an immunoglobulin kappa gene: critical role for the intron enhancer/matrix attachment region. Cell, 1994. 77(2): p. 239-48.

13. Bezzubova, O., et al., Reduced X-ray resistance and homologous recombination frequencies in a RAD54-/- mutant of the chicken DT40 cell line. Cell, 1997. 89(2): p. 185-93.

14. Brar, S.S., M. Watson, and M. Diaz, Activation-induced cytosine deaminase (AID) is actively exported out of the nucleus but retained by the induction of DNA breaks. J Biol Chem, 2004. 279(25): p. 26395-401.

15. Buerstedde, J.M., et al., Light chain gene conversion continues at high rate in an ALV-induced cell line. EMBO J, 1990. 9(3): p. 921-7.

16. Buerstedde, J.M. and S. Takeda, Increased ratio of targeted to random integration after transfection of chicken B cell lines. Cell, 1991. 67(1): p. 179-88.

17. Butler, J.E., Immunoglobulin diversity, B-cell and antibody repertoire development in large farm animals. Rev Sci Tech, 1998. 17(1): p. 43-70.

18. Cattoretti, G., et al., Nuclear and cytoplasmic AID in extrafollicular and germinal center B cells. Blood, 2006. 107(10): p. 3967-75.

19. Chaudhuri, J. and F.W. Alt, Class-switch recombination: interplay of transcription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol, 2004. 4(7): p. 541-52.

20. Chaudhuri, J., C. Khuong, and F.W. Alt, Replication protein A interacts with AID to promote deamination of somatic hypermutation targets. Nature, 2004. 430(7003): p. 992-8.

21. Chaudhuri, J., et al., Transcription-targeted DNA deamination by the AID antibody diversification enzyme. Nature, 2003. 422(6933): p. 726-30.

22. Chechetkin V. R. and Turigin A. Yu, J. Theor. Biol. 175, 477 (1995).

23. Conlon, T.M. and K.B. Meyer, The chicken Ig light chain 3'-enhancer is essential for gene expression and regulates gene conversion via the transcription factor E2A. Eur J Immunol, 2006. 36(1): p. 139-48.

24. Di Noia, J. and M.S. Neuberger, Altering the pathway of immunoglobulin hypermutation by inhibiting uracil-DNA glycosylase. Nature, 2002, 419(6902): p. 43-8.

25. Franco, S., et al., H2AX prevents DNA breaks from progressing to chromosome breaks and translocations. Mol Cell, 2006. 21(2): p. 201-14.

26. Fukita, Y.} H. Jacobs, and K. Rajewsky, Somatic hypermutation in the heavy chain locus correlates with transcription. Immunity, 1998. 9(1): p. 105-14.

27. Goossens, T., U. Klein, and R. Kuppers, Frequent occurrence of deletions and duplications during somatic hypermutation: implications for oncogene translocations and heavy chain disease. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(5): p. 2463-8.

28. Gopal, A.R. and S.D. Fugmann, AID-mediated diversification within the IgL locus of chicken DT40 cells is restricted to the transcribed IgL gene. Mol Immunol, 2008. 45(7): p. 2062-8.

29. Gordon, M.S., et al., Somatic hypermutation of the B cell receptor genes B29 (Igbeta, CD79b) and mbl (Igalpha, CD79a). Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(7): p. 4126-31.

30. Gorman, J.R., et al., The Ig(kappa) enhancer influences the ratio of Ig(kappa) versus Ig(lambda) B lymphocytes. Immunity, 1996. 5(3): p. 241-52.

31. Goyenechea, B., et al., Cells strongly expressing Ig(kappa) transgenes show clonal recruitment of hypermutation: a role for both MAR and the enhancers. EMBO J, 1997. 16(13): p. 3987-94.

32. Harris, R.S., et al., AID is essential for immunoglobulin V gene conversion in a cultured B cell line. Curr Biol, 2002. 12(5): p. 435-8.

33. Hatanaka, A., et al., Similar effects of Brca2 truncation and Rad51 paralog deficiency on immunoglobulin V gene diversification in DT40 cells support an early role for Rad51 paralogs in homologous recombination. Mol Cell Biol, 2005. 25(3): p. 1124-34.

34. Henderson, A. and K. Calame, Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol, 1998. 16: p. 163-200.

35. Henderson, A.J. and K.L. Calame, Lessons in transcriptional regulation learned from studies on immunoglobulin genes. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 1995. 5(3-4): p. 255-80.

36. Hesslein, D.G. and D.G. Schatz, Factors and forces controlling V(D)J recombination. Adv Immunol, 2001. 78: p. 169-232.

37. Hoege, C., et al., RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO. Nature, 2002. 419(6903): p. 135-41.

38. Inlay, M.A., et al., Roles of the Ig kappa light chain intronic and 3' enhancers in Igk somatic hypermutation. J Immunol, 2006. 177(2): p. 1146-51.

39. Ito, S., et al., Activation-induced cytidine deaminase shuttles between nucleus and cytoplasm like apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide 1. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(7): p. 1975-80.

40. Kim, S., et al., Ongoing diversification of the rearranged immunoglobulin light-chain gene in a bursal lymphoma cell line. Mol Cell Biol, 1990. 10(6): p. 3224-31.

41. Klix, N., et al., Multiple sequences from downstream of the J kappa cluster can combine to recruit somatic hypermutation to a heterologous, upstream mutation domain. Eur J Immunol, 1998. 28(1): p. 317-26.

42. Klotz, E.L. and U. Storb, Somatic hypermutation of a lambda 2 transgene under the control of the lambda enhancer or the heavy chain intron enhancer. J Immunol, 1996. 157(10): p. 4458-63.

43. Kong, Q., et al., A lambda 3' enhancer drives active and untemplated somatic hypermutation of a lambda 1 transgene. J Immunol, 1998. 161(1): p. 294-301.

44. Kotani, A., et al., A target selection of somatic hypermutations is regulated similarly between T and B cells upon activation-induced cytidine deaminase expression. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(12): p. 4506-11.

45. Kothapalli, N., D.D. Norton, and S.D. Fugmann, Cutting edge: a cis-acting DNA element targets AID-mediated sequence diversification to the chicken Ig light chain gene locus. J Immunol, 2008. 180(4): p. 2019-23.

46. Krokan, H.E., F. Drablos, and G. Slupphaug, Uracil in DNA—occurrence, consequences and repair. Oncogene, 2002. 21(58): p. 8935-48.

47. Kuo, M.H., et al., Gcn4 activator targets Gcn5 histone acetyltransferase to specific promoters independently of transcription. Mol Cell, 2000. 6(6): p. 130920.

48. Kurdistani, S.K. and M. Grunstein, Histone acetylation and deacetylation in yeast. Nat Rev Mol Cell Biol, 2003. 4(4): p. 276-84.

49. Langerak, P., et al., A/T mutagenesis in hypermutated immunoglobulin genes strongly depends on PCNAK164 modification. J Exp Med, 2007. 204(8): p. 198998.

50. Larson, E.D., et al., MRE11/RAD50 cleaves DNA in the AID/UNG-dependent pathway of immunoglobulin gene diversification. Mol Cell, 2005. 20(3): p. 36775.

51. Li, Z., Z. Luo, and M.D. Scharff, Differential regulation of histone acetylation and generation of mutations in switch regions is associated with Ig class switching. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(43): p. 15428-33.

52. Liang, G., et al., Distinct localization of histone H3 acetylation and H3-K4 methylation to the transcription start sites in the human genome. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(19): p. 7357-62.

53. Longerich, S., et al., Brcal in immunoglobulin gene conversion and somatic hypermutation. DNA Repair (Amst), 2008. 7(2): p. 253-66.

54. McBride, K.M., et al., Somatic hypermutation is limited by CRM 1-dependent nuclear export of activation-induced deaminase. J Exp Med, 2004. 199(9): p. 1235-44.

55. Meyer, K.B. and M.S. Neuberger, The immunoglobulin kappa locus contains a second, stronger B-cell-specific enhancer which is located downstream of the constant region. EMBO J, 1989. 8(7): p. 1959-64.

56. Michael, N., et al., Effects of sequence and structure on the hypermutability of immunoglobulin genes. Immunity, 2002. 16(1): p. 123-34.

57. Michael, N., et al., The E box motif CAGGTG enhances somatic hypermutation without enhancing transcription. Immunity, 2003. 19(2): p. 235-42.

58. Muramatsu, M., et al., Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell, 2000. 102(5): p. 553-63.

59. Muramatsu, M., et al., Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J Biol Chem, 1999. 274(26): p. 18470-6.

60. Muschen, M., et al., Somatic mutation of the CD95 gene in human B cells as a side-effect of the germinal center reaction. J Exp Med, 2000. 192(12): p. 1833-40.

61. Muto, T., et al., Negative regulation of activation-induced cytidine deaminase in B cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(8): p. 2752-7.

62. Nambu, Y., et al., Transcription-coupled events associating with immunoglobulin switch region chromatin. Science, 2003. 302(5653): p. 2137-40.

63. Neuberger, M.S., et al., Somatic hypermutation at A.T pairs: polymerase error versus dUTP incorporation. Nat Rev Immunol, 2005. 5(2): p. 171-8.

64. O'Brien, R.L., R.L. Brinster, and U. Storb, Somatic hypermutation of an immunoglobulin transgene in kappa transgenic mice. Nature, 1987. 326(6111): p. 405-9.

65. Odegard, V.H., et al., Histone modifications associated with somatic hypermutation. Immunity, 2005. 23(1): p. 101-10.

66. Odegard, V.H. and D.G. Schatz, Targeting of somatic hypermutation. Nat Rev Immunol, 2006. 6(8): p. 573-83.

67. Okazaki, I.M., et al., Constitutive expression of AID leads to tumorigenesis. J Exp Med, 2003. 197(9): p. 1173-81.

68. Pasqualucci, L., et al., PKA-mediated phosphorylation regulates the function of activation-induced deaminase (AID) in B cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2006. 103(2): p. 395-400.

69. Pasqualucci, L., et al., BCL-6 mutations in normal germinal center B cells: evidence of somatic hypermutation acting outside Ig loci. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998. 95(20): p. 11816-21.

70. Pasqualucci, L., et al., Hypermutation of multiple proto-oncogenes in B-cell diffuse large-cell lymphomas. Nature, 2001. 412(6844): p. 341-6.

71. Perlot, T., et al., Elucidation of IgH intronic enhancer functions via germ-line deletion. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(40): p. 14362-7.

72. Peters, A. and U. Storb, Somatic hypermutation of immunoglobulin genes is linked to transcription initiation. Immunity, 1996. 4(1): p. 57-65.

73. Petersen-Mahrt, S.K., R.S. Harris, and M.S. Neuberger, AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature, 2002.418(6893): p. 99-103.

74. Pham, P., et al., Processive AID-catalysed cytosine deamination on single-stranded DNA simulates somatic hypermutation. Nature, 2003. 424(6944): p. 1037.

75. Queen, C. and J. Stafford, Fine mapping of an immunoglobulin gene activator. Mol Cell Biol, 1984. 4(6): p. 1042-9.

76. Rada, C., J.M. Jarvis, and C. Milstein, AID-GFP chimeric protein increases hypermutation of Ig genes with no evidence of nuclear localization. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(10): p. 7003-8.

77. Rada, C. and C. Milstein, The intrinsic hypermutability of antibody heavy and light chain genes decays exponentially. EMBO J, 2001. 20(16): p. 4570-6.

78. Ramiro, A.R., et al., Role of genomic instability and p53 in AID-induced c-myc-Igh translocations. Nature, 2006. 440(7080): p. 105-9.

79. Ramiro, A.R., et al., AID is required for c-myc/IgH chromosome translocations in vivo. Cell, 2004. 118(4): p. 431-8.

80. Redon, C., et al., Histone H2A variants H2AX and H2AZ. Curr Opin Genet Dev, 2002. 12(2): p. 162-9.

81. Reina-San-Martin, B., et al., H2AX is required for recombination between immunoglobulin switch regions but not for intra-switch region recombination or somatic hypermutation. J Exp Med, 2003. 197(12): p. 1767-78.

82. Revy, P., et al., Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the autosomal recessive form of the Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell, 2000. 102(5): p. 565-75.

83. Reynaud, C.A., et al., A hyperconversion mechanism generates the chicken light chain preimmune repertoire. Cell, 1987. 48(3): p. 379-88.

84. Reynaud, C.A., et al., What role for AID: mutator, or assembler of the immunoglobulin mutasome? Nat Immunol, 2003. 4(7): p. 631-8.

85. Ronai, D., et al., Complex regulation of somatic hypermutation by cis-acting sequences in the endogenous IgH gene in hybridoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(33): p. 11829-34.

86. Ross, A.L. and J.E. Sale, The catalytic activity of REV1 is employed during immunoglobulin gene diversification in DT40. Mol Immunol, 2006. 43(10): p. 1587-94.

87. Sale, J.E., et al., In vivo and in vitro studies of immunoglobulin gene somatic hypermutation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2001. 356(1405): p. 21-8.

88. Sale, J.E., et al., Ablation of XRCC2/3 transforms immunoglobulin V gene conversion into somatic hypermutation. Nature, 2001. 412(6850): p. 921-6.

89. Sale, J.E. and M.S. Neuberger, TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line. Immunity, 1998. 9(6): p. 859-69.

90. Saribasak, H., et al., Uracil DNA glycosylase disruption blocks Ig gene conversion and induces transition mutations. J Immunol, 2006. 176(1): p. 365-71.

91. Schrader, C.E., et al., Inducible DNA breaks in Ig S regions are dependent on AID and UNG. J Exp Med, 2005. 202(4): p. 561-8.

92. Sharpe, M.J., et al., Somatic hypermutation of immunoglobulin kappa may depend on sequences 3' of C kappa and occurs on passenger transgenes. EMBO J, 1991. 10(8): p. 2139-45.

93. Shen, H.M., et al., The TATA binding protein, c-Myc and survivin genes are not somatically hypermutated, while Ig and BCL6 genes are hypermutated in human memory B cells. Int Immunol, 2000. 12(7): p. 1085-93.

94. Shen, H.M., et al., Mutation of BCL-6 gene in normal B cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes. Science, 1998. 280(5370): p. 1750-2.

95. Shen, H.M., S. Ratnam, and U. Storb, Targeting of the activation-induced cytosine deaminase is strongly influenced by the sequence and structure of the targeted DNA. Mol Cell Biol, 2005. 25(24): p. 10815-21.

96. Shinkura, R., et al., Separate domains of AID are required for somatic hypermutation and class-switch recombination. Nat Immunol, 2004. 5(7): p. 70712.

97. Shinkura, R., et al., The influence of transcriptional orientation on endogenous switch region function. Nat Immunol, 2003. 4(5): p. 435-41.

98. Simpson, L.J. and J.E. Sale, Revl is essential for DNA damage tolerance and non-templated immunoglobulin gene mutation in a vertebrate cell line. EMBO J, 2003. 22(7): p. 1654-64.

99. Sohn, J., et al., Somatic hypermutation of an immunoglobulin mu heavy chain transgene. J Exp Med, 1993. 177(2): p. 493-504.

100. Staudt, L.M. and M.J. Lenardo, Immunoglobulin gene transcription. Annu Rev Immunol, 1991. 9: p. 373-98.

101. Ta, V.T., et al., AID mutant analyses indicate requirement for class-switch-specific cofactors. Nat Immunol, 2003. 4(9): p. 843-8.

102. Takeda, S., et al., RAG-2 expression is not essential for chicken immunoglobulin gene conversion. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(9): p. 4023-7.

103. Wang, C.L., R.A. Harper, and M. Wabl, Genome-wide somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(19): p. 7352-6.

104. Wilson, T.M., et al., MSH2-MSH6 stimulates DNA polymerase eta, suggesting a role for A:T mutations in antibody genes. J Exp Med, 2005. 201(4): p. 637-45.

105. Woo, C.J., A. Martin, and M.D. Scharff, Induction of somatic hypermutation is associated with modifications in immunoglobulin variable region chromatin. Immunity, 2003. 19(4): p. 479-89.

106. Yamamoto, K., et al., Fanconi anemia protein FANCD2 promotes immunoglobulin gene conversion and DNA repair through a mechanism related to homologous recombination. Mol Cell Biol, 2005. 25(1): p. 34-43.

107. Yang, S.Y., S.D. Fugmann, and D.G. Schatz, Control of gene conversion and somatic hypermutation by immunoglobulin promoter and enhancer sequences. J Exp Med, 2006. 203(13): p. 2919-28.

108. Yelamos, J., et al., Targeting of non-Ig sequences in place of the V segment by somatic hypermutation. Nature, 1995. 376(6537): p. 225-9.

109. Yoshikawa, K., et al., AID enzyme-induced hypermutation in an actively transcribed gene in fibroblasts. Science, 2002. 296(5575): p. 2033-6.

110. Zeng, X., et al., DNA polymerase eta is an A-T mutator in somatic hypermutation of immunoglobulin variable genes. Nat Immunol, 2001. 2(6): p. 537-41.

111. H. Г. Есипова, Г. И. Кутузова, В. Ю. Макеев и др. Биофизика 45 (3), 432 (2000) Biophysics 3 (421), 45 (2000).

112. Г. И. Кравацкая, Г. К. Франк, В. Ю. Макеев и др. Биофизика 47, 595 (2002).

113. Г. И. Кравацкая, В. Ю. Кравацкий, В. Ю. Мильчевский и др. Биофизика 52 (6), 965 (2007).

114. Г. И. Кутузова, Г. К. Франк, В. Ю. Макеев и др. Биофизика 42 (2), 354 (1997).

115. Г. И. Кутузова, Г. К. Франк, В. Ю. Макеев и др. Биофизика 44 (2), 216 (1999).

116. В. Ю. Макеев, Г. К. Франк и В. Г. Туманян, Биофизика 41 (2), 241 (1995).