Молекулярные механизмы распространения вируса кори между нейронами мышей, экспрессирующими рецептор человека CD46+

Махортова, Нина Руслановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы распространения вируса кори между нейронами мышей, экспрессирующими рецептор человека CD46+
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы распространения вируса кори между нейронами мышей, экспрессирующими рецептор человека CD46+"

На правах рукописи

□0316S233

МАХОРТОВА НИНА РУСЛАНОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАСПРОСТРАНЕНИЯ

ВИРУСА КОРИ МЕЖДУ НЕЙРОНАМИ МЫШЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИМИ РЕЦЕПТОР ЧЕЛОВЕКА СБ46+

03 00 03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з МАР 2008

Москва - 2008

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Российского Государственного Медицинского Университета, г Москва и в Фокс-Чейзовском онкологическом центре, Филадельфия, США

Научный руководитель.

доктор биологических наук, профессор Прасолов Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты.

доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич

доктор биологических наук, профессор Чумаков Петр Михайлович

Ведущая opt анизацин Институт вирусологии им Ивановского РАМН

Защита сосюшся « 2008 года в часов на заседании совета

Д 501 001 76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ НИИ физико-химической биологии им А H Белозерского

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан « » февраля 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук чЗ Крашенинников И А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на существование вакцины, вирус кори (ВК) входит в первую десятку наиболее опасных инфекций и приводит к смерти около 1 миллиона человек ежегодно во всем мире в результате иммуносупрессии и по причине постинфекционных осложнений центральной нервной системы (ЦНС) Примерно у одного из десяти тысяч человек развиваются осложнения в виде заболеваний моз)а Наиболее хорошо изученным из таких осложнений ЦНС является подострый склерозирующий панэнцефалит (ПСПЭ) медленно текущее, прогрессирующее заболевание, которое может проявиться спустя месяцы или даже годы после излечения от острой коревой инфекции Оно характеризуется прогрессирующей деменцией с последующими моторными нарушениями и всегда приводит к смерти больного ПСПЭ обладает рядом особенностей, не характерных для продуктивной инфекции ВК, в мозге отсутствуют зрелые вирусные частицы, но присутствует большое количество нуклеокапсидов ВК и противовирусных ангител Инфекция не вызывает гибели нейронов, тем не менее заболевание смертельно для больного Все эти особенности указывают на то, что механизм патогенеза коревой инфекции в ЦНС отличается от инфекционного процесса в других тканях организма, и причиной смерти от ПСПЭ является, скорее, нарушение функции нервных клеток, а не их гибель Исходя из этого, изучение особенностей патогенеза коревой вирусной инфекции в ЦНС является важной задачей биомедицины и может облегчить понимание многих других персистирующих заболеваний мозга, вызываемых нейротропными вирусами

Первичный контакт ВК и клетки-мишени осуществляется за счег взаимодействия гликопротеина оболочки вируса - геммаглютинина (ГА) с одним из двух своих клеточных рецепторов CD46 или SLAM, после чего другой вирусный гликопротеин - белок слияния (БС) претерпевает конформационные изменения, инициирующие слияние мембраны вируса и клеточной мембраны Так происходит проникновение вирусного капсида в клетку Наряду с этим, распространение ВК происходит при слиянии зараженных клеток с незараженными клетками, при этом образуется характерный для коревой инфекции многоядерный синцитий Образование синцития происходит за счет взаимодействия вирусных гликопротеинов, экспрессированных на поверхности зараженных клеток с рецепторами на незараженных клетках Вирус кори способен заражать лишь клетки человека, содержащие поверхностные белки CD46 и SLAM, исполняющие роль рецепторов к этому вирусу Изучение механизмов патогенеза ПСПЭ in vivo в тканях мозга стало возможным благодаря созданию в 1997 году первой трансгенной мышиной модели

для вирусной инфекции клеток нервной системы Мыши линии HCE-CD46"1" экспрессируют молекулы CD46 человека, являющиеся рецепторами к ВК под контролем специфического для нейронов промотора — нейрон-специфической енолазы (НСЕ) Таким образом, только нейроны HCE-CD46+ трансгенных мышей являются восприимчивыми к заражению ВК Эксперименты m vitro показали, что в заражённой первичной культуре нейронов гиппокампа мышей линии HCE-CD46+ отсутствуют зрелые вирусные частицы в среде, тогда как нуклеокапсиды ВК интенсивно распространяются между клетками При этом нейроны не погибают, и монослой клеток сохраняет свою структуру при любых вирусных титрах и плотности посева клеток Также было показано, что рецептор CD46 необходим лишь для первичного проникновения ВК в нейроны, roi да как дальнейшее распространение вируса происходит через синапс независимо от наличия рецептора CD46 Таким образом, распространение вируса между нейронами протекает по особому механизму, отличному от пути его изначального проникновения в клетку

Межнейрональное распространение ВК в отсутствие рецептора CD46 может происходить за счет взаимодействия гликопротеинов оболочки вируса с дополнительными, ещё не идентифицированными рецепторами к ВК Также не исключено, что эти рецепторы могут связываться с поверхностным гликопротеином ВК, отличным от ГА, например с БС Считают, что процесс слияния частицы ВК с мембраной клетки требует затраты энергии, источниками которой могут являться конформационные изменения ГА, повышение температуры или взаимодействие БС со своим собственным рецептором на клетке Данные о транссинаптической и С046-независимой передаче ВК между нейронами указывают на то, что взаимодействие ГА с его рецептором в области синапса не требуется Это привело нас к постановке ряда задач по исследованию роли второго гликопротеина ВК - БС в нейротрансмиссии

Впервые на фибробластах было показано, что синтетические пептиды с последовательностью аминокислотных остатков Phe-X-Gly, сходной с последовательностью остатков аминокислот области N-конца БС парамиксовирусов, препятствуют как проникновению ВК в клетку, так и вирусиндуцированному слиянию и гемолизу клеток Синтетический трипептид Phe-X-Gly назвали слияние-ит ибирующим пептидом (СИП) По результатам этих работ предположили, что СИП взаимодействует с предполагаемыми рецепторами на клеточной мембране, и подавление заражения осущесшляегся за счет конкуренции с БС за эти рецепторы

Представители семейства нейротахикининовых пептидов (НТП) - субстанция П (СП), нейрокинин-А (НК-А) и нейрокинин-Б (НК-Б) в активном центре также имеют

аминокислотную последовательность Phe-X-Gly, присутствующую в пептидах СИП и на N-конце белка слияния ВК Впервые на фибробластах было показано, что СП обратимо подавляет инфекцию ВК в клеточной культуре, однако механизм этого феномена был не выяснен Объясняя механизм такой антивирусной активности основывались на том, что последовательность трех аминокислотных остатков активного центра субстанции П является гомологичной аминокислотной последовательности синтетического трипептида СИП и N-концу белка слияния ВК В силу того, что СП является природным нейропептидом, предположили, что молекулой, за связывание с которой идет конкуренция между синтетическим СИП, нейропептидом СП и белком слияния ВК является рецептор нейрокинин-1

Цель и задачи работы Целью данной работы является изучение роли молекулы НК-1 в процессе транссинаптической передачи ВК между нейронами ЦНС Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи

- установить, является ли способность к CD46 независимому распространению ВК уникальным свойством нейронов,

- подтвердить наличие экспрессии и изучить локализацию белка слияния вируса кори в нейронах,

- установить, происходит ли слияние мембран нейронов по типу синцития в синапсах при заражении вирусом кори

- определить влияние слияние-ингибирующего пептида и НТП на распространение ВК в нейронах in vitro,

- провести сравнительный анализ заражения ВК мышей линии CD46' и мышей линии CD46+/HK-1K0, полученных путем скрещивания мышей нокаутными но рецептору IIK-1 с трансгенными мышами по рецептору CD46,

- провести сравнительный анализ заражения ВК первичных нейронов полученных от мышей линии CD46+/HK-1K0, и контрольных нейронов, полученных от мышей линии CD46+,

- провести сравнительный анализ заражения ВК иммунодефицитных мышей линии CD46+/RAG КО в присутствии и в отсутствие синтетического антагониста рецептора НК-1 — апрепитант (Emend®)

Научная новизна и практическая ценность работы Впервые было показано, что способность ВК распространяться между клетками, независимо от наличия рецептора CD46, является уникальным процессом, происходящим только в нервных клеток

Впервые была исследована экспрессия БС-ВК в нейронах Было показано, что в CD46+ нейронах осуществляется синтез обоих фрагментов белка слияния БС) и БСг и что БС-ВК присутствует не только в теле нейронов, а также в отростках нейронов, и концентрируется в области синапса Используя метод оценки смешения цитоплазмы в области синаптических соединений, было выявлено, что в области синапсов клеточные мембраны заражённых ВК нейронов способны сливаться по типу синцития

Впервые было показано, что добавление в культуру нейронов синтетического пептида Phe-X-Gly, аналогичного последовательности аминокислотных остатков N-конца БС ВК, подавляет как первичное заражение, так и последующую передачу внутреннего капсида ВК от зараженных нейронов к незараженным Помимо эшю, нейротахикининовые пептиды (НТП) (субстанция П, НК-А и НК-Б), имеющие в активном центре последовательность Phe-X-Gly, также обладают блокирующим действием, тогда как нейропептиды, не имеющие такого мотива, распространению вирусной инфекции между нейронами не препятствуют

Исходя из того, что рецепторами НТП в организме являются молекулы НК-1, мы провели серию экспериментов по заражению вирусом кори генетически и фармакологически НК-1 нокаутных мышей Впервые было показано, что НК-1, рецептор для нейропептида СП, существенен для заражения ВК Можно полагать, что молекула НК-1 может служить дополнительным ко-рецептором для ВК, связываясь с БС вируса Это является важным результатом, так как на сегодняшний день не было обнаружено рецепторов к белкам слияния ни одного из РНК вирусов Следуя нашей гипотезе, при передаче ВК между нейронами, БС заражённой клетки взаимодействует с НК-1 незараженной клетки в области синапса и формирует микроканалы по-типу синцития, через которые вирусные нуклеокапсиды перемещаются между нейронами

Эти данные имеют значение для объяснения механизмов патогенеза ВК в ЦНС Поскольку у HCE-CD46+/RAG КО мышей заболевание ЦНС протекает в отсутствие гибели нейронов, мы полагаем, что его природу можно объяснить потерей функций нейронов

Наиболее важным практическим значением наших исследований является установление терапевтического эффекта высокоспецифического антагониста рецептора НК-1 — Аирепя'хан'1 (Emend®) у зараженных мышей Апрепитант недавно был внедрен в клинике в качестве антиэметика (противорвотного средства) при химиотерапии, наши результаты открывают возможность альтернативного использования этого препарата для противовирусной терапии у больных с ПСПЭ

Структура работы Диссертационная работа изложена на 42>Ь страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы Работа содержит ¿?¿ рисунков и 3_ таблиц Список литературы содержит Z ~Ю цитированных работ

Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах

Апробация работы. Презентация материалов диссертации была проведена на международных конференциях FASEB Summer Research Conference, "Neural-Immune Interactions Physiological and Pathological Relevance" (Tucson, Arizona August 7-12, 2004), 24th American Society of Virology Annual Meeting (Penn State University, PA, June 18-22, 2005), Keystone Symposia. "Cell Biology of Viral Entry, Replication and Pathogenesis" (Santa Fe, New Mexico February 24 - March 1, 2006), "Физико-химическая биология", в разделе "Вирусные патогенны человека" ( Новосибирск, Россия, Июль 30-Август 4, 2006), на научных семинарах в Институте молекулярной биологии им Энгельгардта РАН и на кафедре молекулярной биологии и медицинской биотехнологии Медико-биологического факультета РГМУ в 2006 и 2007 годах

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Безрецепторное распространение ВК является уникальным для нейронов В

фибробластах ВК является высоко цитопатогенным, и в результате продуктивного цикла, высвобождается большое количество вирусных частиц Напротив, в первичных культурах нейронов механизм распространения ВК иной - свободные вирусные частицы отсутствуют, и нейроны не погибают, несмотря на интенсивную вирусную репликацию и распространение в культуре При помощи электронной микроскопии ранее было подтверждено, что ВК не отпочковывается от мембраны нейронов, а вирусные нуклеокапсиды концентрируются в синапсах (Lawrence et al, 2000) Также было показано, что распространение ВК между нейронами не зависит от наличия рецептора CD46 (Lawrence et al, 2000) Оставалось неизвестным, является ли это свойство характерным только для нервных клеток, или же в других типах клеток, не нейронального происхождения вирус тоже может распространяться в отсутствие рецептора CD46 Для этого зараженные CD46* нейроны рассевали с CD46+ или CD46" нейронами-реципиентами, меченными красителем (CellTracker orange 594, Molecular Probes, USA), в

отношении 1 5 Параллельно, зараженные в суспензии фибробласты почек зеленой мартышки Vero рассевали в отношении 1 5, с мечеными красителями клетками-реципиентами - мышиными фибробластами CD46" линии МС67 или с трансфицированными фибробластами МС57, экспрессирующими рецептор CD46 человека Для выявления вирусных антигенов использовали иммунную сыворотку больного ПСПЭ и вторичные FITC-коньюгированные антитела Количественная оценка содержания одновременно CellTracker orange и FITC положительных клеток показала, что распространение вируса в CD46+ и CD46" нейронах происходит с одинаковой эффективностью (данные не представлены), передача вируса к MC57-CD46" фибробластам-реципиентам отсутствует, а в трансгенных MC57-CD46"1" фибробластах-мишенях способность ВК к межклеточному распространению восстанавливается Данные представлены в таблице 1

Реципиенты CD46+ CD46"

Нейроны + н

Фибробласты МС57 + Нет передачи вируса

Таблица 1 Передача ВК от зараженных пейронов-доооров различным видам клеток-реципиентов Безрецепторное распространение ВК по клеткам является уникальным свойством нейронов, так как передачи вируса от зараженных фибробластов к фибробластам, которые не продуцируют CD46, не происходит

Таким образом, С046-независимое распространение ВК является исключительным свойством нейронов, так как передачи вируса от зараженных фибробластов к фибробластам, которые не экспрессируют рецептор CD46, не происходит Эти данные указывают на то, чго в нейронах происходит изменение процессов вирусной передачи Такая модификация, возможно, является адаптацией нейронов для предотвращения их гибели вследствие массового выхода вирусных частиц или при иммунном повреждении

Экспрессия и распределение БС в нейронах, зараженных ВК. Ранее было показано, что распространение ВК между нейронами осуществляется через синапс и не зависит о г наличия рецептора CD46 (Lawrence et al, 2000), что является уникальным свойством нервных клеток (Махортова, 2007) Основываясь на том что, обычно оба гликопротеика ГА и БС участвуют в проникновении и распространении ВК, мы проверили наличие полноценного синтеза БС в культуре нейронов, зараженных ВК Оценку проводили методом Вестерн блот-гибридизации, образцы для которой готовили из заражённых и незараженных нейронов трансгенных мышей линии HCE-CD46T, а также из

фибробластов Vero в количестве 1x10 заражённых клеток. Для выявления антигена использовали кроличьи антитела против С-концевого участка БС (Cathomen, Т, 1998) В клетках БС синтезируется в виде предшественника БСо, который после трансляции расщепляется на две субъединицы, BCi и БСг. На Рис. 1 показано, что равное количество заражённых фибробластов Vero и CD46+ нейронов производят оба фрагмента BCi и БС2, хотя в нейронах их количество ниже. Важно отметить, что единственные существующие антитела, которые и были использованы в данном эксперименте, не распознают БСг.

50кДа

Vero фибробласты

БС, ( 35кДа

- +ВК - +ВК

Рисунок 1. Фрагменты БСо и БС, экпрессируются в заражённых нейронах Спустя 48 ч п.и. ВК (МИ=3) белковый лизат, состоящий из 1х105 заражённых первичных CD46+ нейронов или фибробластов Vero, анализировали методом Вестерн блот-гибридизации, используя антитела против БС-ВК. Параллельно процент заражённых клеток определяли методом ИГХ. Стандарты указаны справа. Рисунок является одним репрезентативным экспериментов из трёх.

Известно, что последовательность нуклеотидов генома ВК, выделенного из мозга больных, содержит множество точечных мутаций в генах, кодирующих белки, ассоциирующиеся с вирусной оболочкой, а именно в генах кодирующих ГА, БС и MA (Baczko К, 1986; Cattaneo R and ter Meulen V, 1986). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что несмотря на различия в уровнях экспрессии, расщепление предшественника БСо происходит в обоих клеточных типах, и белок БС эффективно экспрессируется.

♦ * к

/ V

Поликлональные анти-ВК Моноклональные анти-БС

Рисунок 2. Белок слияния ВК эспрессируется в зараженных нейронах наряду с другими вирусными белками. Спустя 48 ч.п.и. ВК (МИ=3) фиксированные на покровных стёклах первичные нейроны, окрашенные поликлональной сывороткой к ВК (левая панель) и моиоклональными анги-БС антителами (правая панель). Увеличение 100Х.

Для подтверждения того, что БС локализован во всех структурах нейрона наряду с другими вирусными гликопротеинами, методом двойной ИФ образцы окрашивали поликлональными антителами (красные) против антигенов ВК и моноклонапьными антителами против БС (зелёные). В клетках, заражённых ВК, наблюдали экспрессию вирусных антигенов (Рис. 2), при этом БС, как и другие вирусные гликопротеины, были распределены по всему нейрону, включая его отростки (указано стрелками на рис. 2).

Далее, для анализа присутствия БС в синапсах нервных клеток методом ИФ проверили наличие ко-локализации БС ВК (зелёный) и маркёра синапсов - белка синаптофизина (красный).

Синаптофшин Белок слияния ВК Наложение изображения

Рисунок 3. Белок слияния ВК колокализуется с белком синаптофизином в синапсах заражённых нейронов. Спустя 48 ч.п.и. ВК (МИ=3) фиксированные на покровных стёклах первичные нейроны окрашивали одновременно антителами против БС (зелёный) и синаптофизина (красный). Области интенсивных красных точек соответствуют синапсам. Стрелками указано присутствие БС в местах агрегации синаптофизина. Увеличение 400Х.

Из предварительных работ известно, что в заражённой культуре антигены ВК присутствуют в нейронах, соседствующих между собой, образуя кластеры инфекции. При этом известно, что свободные вирионы не продуцируются в культуре нейронов, и для распространения ВК требуется клеточный контакт, тем не менее, типичное формирование синцития между телами нейронов не происходит. Результаты данного эксперимента показали, что БС концентрируется в области синапса. Такое накопление БС в пресиналтической области может свидетельствовать о возможной миграции ВК из зараженного нейрона в соседний, ещё не заражённый нейрон, по отросткам через синапсы (Рисунок 3).

Слияние мембран у заражённых ВК нейронов по типу синцития в синапсах. Основываясь на предыдущих данных, очевидно, что распространение вируса между нейронами происходит по особому механизму, отличному от пути его изначального проникновения в клетку, и, скорее всего, происходит через синапс (Lawrence et al., 2000, Махортова и др, 2.007). Гипотетически возможны два варианта. Следуя первому, при высвобождении синаптических пузырьков, содержащих нейротрансмиттер, вирус

попадает в синапти чес куга щель, согласно второму - мембраны нейронов сливаются по типу синцития на участках ограниченных синапсами, что дает возможность нуклеокапсиду свободно перемещаться между клетками без необ> одимости отпочковываться Поскольку в предыдущих работах с помощью световой микроскопии формирование типичного синцития из тел нейронов не обнаруживали, (Lawrence et al, 2000), то, используя конфокальную микроскопию, проверили возможность слияния клеточных мембран в области синапсов С этой целью был разработан метод оценки смешения цитоплазмы в области синаптических соединений Нейроны метили флуоресцентными прижизненными красителями Cell Tracker Green 488 и Cell Tracker Orange 594 (Molecular Probes USA) и рассеивали в соотношении 1 1 После чего нейроны заражали ВК при МИ=3, а для контроля использовали незаряженные образцы Спустя 72 часа после инфекции на фотографиях случайных полей анализировали присутствие точечных жёлтых участков цитоплазмы, в которых происходило смешение красного и зеленого флуорофоров, что указывало на слияние мембран нейронов в районах синаптических контактов Конфокальные изображения участков слияния, снятые по х/у-осям, были подтверждены на Z-плане для достоверного заключения, что зоны флуоресцентного перекрытия занимают одни и те же пиксели В первом опыте при инфекции ВК смешивание цитоплазмы наблюдали в пяти просмотренных полях из 12 (42%), тогда как в отсутствие инфекции смешивания цитоплазмы не было ни в одном из 12 полей Во втором независимом опыте соотношение составляло 5/10 (50%) и 0/10 Результат о количестве полей, содержащих участки цитоплазматического смешивания, полученных из двух независимых экспериментов, представлен в виде (Таб 2)

Эксперимент №1 Эксперимен г №2

Нейроны зараженные ВК 5 из 12 (42%) 5 из 10 (50%)

Незараженные нейроны Оиз 12 (0%) 0 из 10 (0%)

Таблица 2 При распространении ВК между нейронами происходит смешивание цитоплазмы в области синапсов в результате их слияния

Важно отметить, что к 72ч обычно только треть нейронов оказывается зараженной (Rail GF, et all. 1997), поэтому наличие участков синаптического слияния не было обнаружено на фотографиях в 100% случаев Полученные нами данные свидетельствуют, что распространение ВК между нейронами происходит через слияние синапсов Поскольку рецептор CD46 не является обязательным участником этого процесса, существование такого слияния можно объяснить наличием дополнительных

поверхностных молекул в синапсах нейронов, которые могут взаимодействовать с вирусными гликопротеинами, присутствующими на пресинаптической мембране

СИП блокирует инфекцию ВК в культуре первичных нейронов Детальный механизм слияния мембраны ВК с мембраной заражаемой клетки не установлен Считается, что связывание ГА с клеточным рецептором является ключевым событием, запускающим изменение конформации БС, во время которой замас кированный гидрофобный домен слияния открывается, и вирус сливается с клеткой (Lamb, 1993) При этом, выбор специфичных клеток-мишеней контролируется взаимодействием белка ГА и клеточного рецептора CD46, а процесс слияния, опосредуемый БС, происходит не специфически Несмотря на то, что большинство работ свидетельствуют в пользу этого, существуют предпосылки, что слияние вирусной мембраны с мембраной заражаемой клетки может быть инициировано в отсутствие ГА Например, другой представитель семейства парамиксовирусов - обезьяний вирус SV5, проникает в клетку в отсутствие ГА нейраминидазы, используя исключительно белок слияния (Horvath СМ, et al 1992, Bagai S and Lamb 1995)

Ранее было показано, что синтетический трипептид СИП (-Phe-Phe-Gly) способен блокировать проникновение некоторых вирусов в клетки и особенно эффективен в отношении ВК СИП препятствуют как проникновению ВК в клетку, так и вирус-индуцированному слиянию и гемолизу клеток (Norrby, Е, et al„ Richardson CD, and Choppm PW, 1983, Richardson CD, et al, 1980) Обработка клеток при 4°C радиоактивно меченными синтетическими ингибиторами показала, что эти ингибиторы связываются с клеткой, а не с вирусными частицами, так как обработка пептидами вирусных частиц не вызывала ингибирования Исходя из того, что последовательность аминокислотных остатков СИП сходна с последовательностью аминокислотных остатков области N-конца БС полипептида парамиксовирусов, предположили, что подавление заражения осуществляется за счет конкуренции СИП и БС за какой-то рецептор (Richardson CD and Choppm PW, 1983) Для исследования блокирующего эффекта пептида СИП на заражение вирусом кори первичных нейронов, нейроны и контрольные фибробласты заражали ВК при МИ от 1 до 3 и спустя 6ч добавляли СИП в различных концентрациях Через 3 дня вирусные антигены в клетках анализировали методом иммуноцитохимии Репрезентативный эксперимент, проведенный при концентрации СИП 200мкМ и МИ=3, представлен на Рисунке 4 Показаны поля от одного эксперимента из пяти В фибробластах Vero, в отсутствии СИП, ВК вызывает формирование синцития и быстро распространяется, вызывая полную гибель клеток к 3 дню (4А) Как и ожидали,

добавление ингиби тора СИП после инкубирования культуры клеток с ВК предотвращает распространение вирусной инфекции и формирование синцития (4Б). Аналогично, в контрольной культуре нейронов, в отсутствии СИП, заражение клеток происходило интенсивно (Рис.4В), а добавление ингибитора блокировало распространение ВК (Рис. 4Г). Поскольку СИП добавляли после проведения инфекции, отдельные клетки успевали заразиться и поэтому содержат вирусный антиген.

Vero

Нейроны

. . . . * К •л - $ ;

в/ , ■ И _ ' - 'л, f ■: : 1 ' ..л;..,- '. ■ [У; Я A f

-СИП + СИП

Рисунок 4. СИП предотвращает распространение ВК между первичными нейронами.

Фибропласты Vero и С046*нейроны рассеивали на покровные стёкла и заражали ВК при МИ-3. Спустя 6 часов добавляли СИП в количестве 200 мкМ и через 2д проводили иммуноцитохимическое окрашивание антигенов ВК. (Л) и (Б) Фибробласты Vero; (В) и (Г) первичные CD46+ нейроны. (А) и (В) ДМСО контроль; (Б) и (Г) СИП. Увеличение^ ООХ.

Ингибирутощий эффект СИП для обоих типов клеток зависел от его дозы в культуре. Нейроны оказались более чувствительными клетками:

Концентрация СИП Клетки заражённые ВК Б

мкМ Фибробласты Vero Нейроны

200 12(+/-8) 4(+/-3)

100 17(+/-И) 9(+/-5)

50 42(+/-18) 14(+/-4)

5 92(+/-б) 15(+/-5)

DMSO 87(+/-11) 28(+/-10)

Таблица 3. Способность СИП ингибировать распространение ВК зависит от дозы. л

А. Фибробласты Vero и CD46+ первичные нейроны заражали ВК при MOi=3. СИП (в указанных концентрациях) или кот-рольный раствор ДМСО, добавляли 6 ч.п.и., образцы фиксировали через 2 дня, окрашивали и подсчитывали количество заражённых клеток.

Б. Числа представляют собой процент заражённых клеток на поле, рассматриваемом при 100Х увеличении. Числа в скобках показывают стандартные отклонения. Всего было обсчитано 10 случайных полей в каждом из 3 независимых экспериментов.

уже при концентрации 5мкМ вирусное распространение в культуре приостанавливалось, и заражение не наступало более чем 45% нейронов по сравнению с контрольными образцами, в которых СИП не был добавлен (Таблица 3) При такой же концентрации ингибитора СИП в культуре клеток Vero ингибирования не наступало Учитывая, что общая площадь поверхности синапов невелика, а поскольку BIC в нейронах распространяется транссинаптически, то количество ингибитора СИП, достаточного для блокирования процесса передачи, может быть более низким СИП не оказывал ингибирующего эффекта в идентичных экспериментах, проведенных с двумя другими нейротропными РНК вирусами других семейств - вирусом лимфоцитарного хориоменингита и вирусом полиомиелита, таким образом, ингибированис является специфичным для ВК инфекции (Таблица 4)

BK-Edm BJIXM-Arm ПВ-Mahoney

СИП 2 56 +/- 0 21й 24 34 +/- 0 62 37 8 +/-5 7

ДМСО 29 52 +/- 2 71 25 52 +/- 2 44 36 0 +/-5 3

Таблица 4 СИП специфически ингибирует распространение ВК в культуре чувствительных нейронов

А Первичные культуры нейронов заражали вирусом кори, вирусом лимфоцитарного хориоменингита при МИ=3 или вирусом полиомиелита при МИ=0 1 Для опытов с полиовирусом (ПВ), использовали первичные культуры нейронов, полученные от мышей трансгенных по рецептору человека к вирусу полиомиелита PVR (CD155) СИП или растворитель ДМСО добавляли через 6 часов после проведения заражения, образцы анализировали методом иммуноцитохимии через 2 дня Б Числа представляют собой процент зараженных клеток на поле, рассматриваемом при 100Х увеличении Числа в скобках показывают стандартное отклонение Всего было обсчитано по 10 случайных полей в каждом из 3 независимых экспериментов

Было показано, что ингибитор слияния мембраны ВК с мембраной клетки предотвращают как заражение de novo, так и последующее распространение вирусов между фибробластами (Norrby, Е, et al, 1971, Richardson CD, and Choppm PW, 1983, Richardson CD, et al, 1980) Нами было показано, что при различных МИ (1-3) ВК СИП не предотвращал заражения в фибробластах Vero При инкубации культуры с ингибитором непосредственно перед заражением, антигены ВК все равно обнаруживали в клетках (Рис 5Г), но при этом распространение вируса в культуре приостанавливалось (Рис 5Д, Е) При этом, ингибиторный эффект СИП является обратимым при его вымывании из культуры на 3 д п и распространение ВК быстро возобновляется, вызывая формирование синцития и характерного цитопатогенного эффекта, как и в контрольных культурах, не содержащих ингибитор (сравните рис 5Ж и SB, указано стрелками) Напротив, предварительная инкубация CD4ó+ нейронов с СИП полностью предотвращала заражение кутьтуры (Рис

5Л-М), и при последующем вымывании ингибитора из культуры инфекция не возобновлялась, поскольку изначально её там не было (Рис. 50).

Рисунок 5. СИП блокирует заражение ВК (le novo в первичных нейринах.

Фибробласты Vero (А-Ж) и первичные CD46f нейроны (З-О) рассеивали на стёкла, добавляли СИП (200мкМ) (Г-Ж; J1-0), а в контроли соответствующий объём DMSO (А-В; 3-К). После 1 часа инкубации клетки заражали ВК МИ=3. Образцы анализировали методом ИЦХ на 1-3 день. В образцах (Ж и О) на 3 день среду заменяли на свежую, без содержания СИП, и спустя 48 часов образцы анализировали. Репрезентативные поля одного из 4 экспериментов изображены на рисунке. Увеличение = ! ООх.

Подводя итоги экспериментов по ингибированию, можно сделать вывод, что в нейронах СИП предотвращает как заражение de novo, так и распространение инфекции. Возможно, такое ингибирование происходит за счёт конкурирования с БС ВК, благодаря сходству последовательности остатков аминокислот СИП и N-конца БС вируса кори. Нейротрансмиттеры ингибируют распространение ВК между нейронами. Нейротахикининовые пептиды (НТП) представляют собой одно из самых значимых семейств пейропептидов, они являются высоко консервативными в течение эволюции и представлены у большинства видов животных, начиная от беспозвоночных и заканчивая млекопитающими. Такой уровень консервативности в течение миллионов лет говорит о необычайно важной функции, которая исследована только частично.

Представители семейства НТП характеризуются сходной последовательностью аминокислотных остатков карбоксильного конца (С) Phe-X-Gly-, где X может быть представлен ароматической или алифатической аминокислотой. В это семейство входит

три нейропептнда субстанция П (СП), нейрокинин-А (НК-А) и нейрокинин-Б (НК-Б) Для СП второй остаток «X» представлен аминокислотой фенилаланином Phe, также как у СИП, тогда как НК-А и НК-Б содержат Валин (Val) (Таблица 5)

СИП ШЯЩу

Нейротахикиииньг Субстанция П Нейрокинин А Нейрокинин Б NH2-Arg-Pro-Lys-Pro-G]n-Gln-j3SI^PÉi;fjly-Leu-Met NH2-His-Lys-Thr-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-Met NH2-Asp-Met-His-Asp-Phe-I®|^®'&ly-Leu-Met

Контрольные пептиды: Брадикинин Опиоидный пептид Спантид NH2-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg H-Tyr-Tic-NH2 NH2-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-D-Trp-Phe-D-Trp-Leu-Leu

Таблица 5 Последовательности аминокислотных остатков использованных пептидов Серым цветом выделены их активные центры гомологичные последовательности СИП

Ранее высказывали предположения о том, что молекула, являющаяся рецептором СП, также может являться рецептором и для ВК Впервые на фибробластах было показано, что СП обратимо подавляет инфекцию ВК в клеточной культуре, однако механизм этого феномена был невыяснен В дальнейшем, на IM-9 лимфобластах человека было показано, что ВК и СП взаимодействуют с 52-58 кДа белком, в состав которого входит рецептор для СП Более того, ВК и субстанция П, связавшись с поверхностью клетки, способны взаимно вытеснять друг друга с рецепторных участков, и антитела к СП способны ингибировать распространение ВК между клетками Также, в этих работах было показано, что СП ингибирует изначальное заражение клеток ВК Объясняя механизм антивирусной активности, основывались на том, что последовательность аминокислотных остатков активного центра Phe-X-Gly субстанции П является гомологичной аминокислотной последовательности синтетического СИП и белка слияния ВК В силу того, что СП является природным нейропептидом, предположили, что молекулой, за связывание с которой идет конкуренция между синтетическим СИП, нейропептидом СП и белком слияния ВК, является рецептор НК-1, и предположили, что ВК может проникать в клетки, используя этот рецептор (Schroeder С, 1986, Harrowe and Payan, 1990)

Нейромедиатор субстанция П является наиболее изученным среди других нейротахикининов в ЦНС Нейрокинины А и Б (НК-А и НК-Б) являются менее изученными нейропептидами, но, известно, что функции НК-А тесным образом переплетаются с функциями СП Для проверки способности всех трех описанных нейротахикининов ингибировать межклеточное распространение ВК в нейронах, мы

добавляли эти НТП в культуры заражённых нейронов. В качестве контроля использовали вещества, не содержащие мотив РЬе-Х-С1у: два пептидных нейромедиатора - брадикинин и антагонист опиоидного рецептора, и антагонист НК-1 - спантид (Табл. 5). Все пептиды добавляли через 6 часов после инфицирования, через 3 дня образцы окрашивали методом ИЦХ на присутствие антигенов ВК. Число клеток культуры заражённых в присутствии не ингибирующего контроля ДМСО принимали за 100%. Поскольку тестируемые пептиды добавляли после проведения заражения, в образцах присутствует некоторое количество клеток с антигенами ВК, в которые вирус успевал проникнуть до воздействия пептидов. Все представители семейства НТП предотвращали распространение ВК между нейронами в зависимости от дозы, при этом СП проявила себя как более сильный ингибитор при одинаковой концентрации по сравнению с другими пептидами (Рис. 6). Показан один из 5 экспериментов. Пептиды, которые не являлись нейрогахикинипами, так же как и ДМСО, на распространение ВК не влияли. Антагонист НК-1 — спантид, связывающийся с участком рецептора НК-1, отличным от сайта связывания СП, также не оказывал ингибирующего влияния. Использование этих контролен показало важность присутствия мотива РЬе-Х-Иу для уменьшения числа заражённых клеток.

1)ДМСО

2) СИП (200 мкМ)

3) Субстанция П (200 мкМ)

4) Субстанция П (100 мкМ)

5) Субстанция П (50 мкМ)

6) Нейрокинин А

7) Нейрокинин Б

8) Опиоид

9)Брадикинин

10) Спантид

Рисунок 6. Эффект нейронепткдоо на распространение инфекции ВК. Б культуру нейронов после инкубации с ВК добавляли нейропептиды до конечной концентрации 200мкМ; для СП были протестированы 3 дозы: 200, 100 и 50мкМ. На 3 д.п.и. в образцах подсчитывали количество заражённых клеток окрашенных методом ИЦХ. Горизонтальная линия указывает изначальный уровень инфекции после первого раунда репликации (24 часа) и составляет приблизительно 20%.

Рецептор субстанции П — НК-1 участвует в распространении ВК между нейронами в первичной культуре и в мозге заражённых мышей. Для передачи сигнала клеткам-мишеням нейротахикинины связываются с ПК рецепторами плазматической

мембране клеток и через ассоциированные с ними G-белки запускают сигнальные пути (Gerard NP, 1991; Schaffer MX, 1998). НК-1 (рецептор СП) является высоко консервативным белком, который экспрессируется в различных клетках млекопитающих, включая нейроны, лимфоциты, гладкомышечные клетки и эндотелий капилляров (Pennefather JN, 2004, review). Рецептор НК-1 обнаружен не во всех анатомических областях ЦНС, но в наиболее функционально значимых структурах мозга он присутствует хотя бы в минимальном количестве (Mantyh PW, 2002). В нейронах рецептор НК-1 присутствует на всей поверхности плазматической мембраны, при этом, наибольшая концентрация отмечена в области синапсов (Bozic CR. 1996). Каждый из нейротахикининов - СП, НК-А и НК-Б преимущественно связывается со своим индивидуальным рецептором, соответственно НК-1, 2 и 3. При этом каждый из нейротахикининовых пептидов может связаться с более чем одним нейрокининовым рецептором, хотя такие взаимодействия менее предпочтительны. Поскольку все три нейротахикинина ингибируют распространение ВК в культуре нейронов, мы предположили, что НК рецепторы участвуют в этом процессе. Поскольку СП обладает наибольшим ингибирующим действием, мы предполагаем, что рецептор НК-1 играет основную роль в распространении ВК между нейронами. Для проверки этой гипотезы проводили сравнительный анализ заражения ВК мышей линии CD46+ и мышей линии CD46+/HK-lKO (Рис.8), получетгых путём скрещивания мышей нокаутными по рецептору НК-1 с трансгенными мышами по рецептору CD46.

Дни после инфекции

Рисунок 7. График выживании новорождённых мышей генотипов С046', СП46 /НК-1КО и дикого типа после заражения ВК. Мыши генотипа СБ46~ (чёрные треугольники); дикого типа+ (белые кружки); С0467НК-1 КО (чёрные кружки). Представлен один из трёх экспериментов.

Для этих опытов использовали восприимчивых к ВК С046+ новорождённых мышей, так как они погибают в 100% случаев на 6-8 день после заражения, что является удобным фенотипом для исследования (чёрные треугольники на рис.7). Было показано, что новорожденные мыши генотипа СБ46+/НК-1КО (чёрные кружки) либо вообще не

проявляют признаков заболевания, либо заболевают намного позже: лишь у 35% животных к 18 д.п.и. обнаруживали признаки болезни, по сравнению со 100% гибелью у CD46+ на 4-8 день. Мыши линии С046~/НК-Г, не имевшие рецептора CD46 (пустые кружки), были невосприимчивы к ВК инфекции и не проявляли никаких признаков заражения, что указывало на недостаточность экспрессии одного лишь НК-1 для заражения животных вирусом 'кори (Рис. 7). В образцах РНК, выделенной из мозга невосприимчивых CD467HK-1 КО мышей методом ОТ-ПЦР, вирусоспсцифических транскриптов не обнаруживали (данные не представлены). Для определения уровня заражения ВК у CD46+ и CD467HK-1KO мышей, образцы их мозга собирали на 6-ой д.п.и (обычно в это время наблюдается пик инфекции (Lawrence DM, 1999). Анализируя методом ОТ-ПЦР образцы на присутствие вирусоспсцифических транскриптов, кодирующих белок нуклеопротеина ВК, было показано, что репликация вируса происходит у 1Ü0% CD4b+ мышей, тогда как у CD46+/HK-1K0 мышей репликация была обнаружена лишь в 18% образцов (Рис.8).

CD46+/HK-1KO CD46+ ----+

5 ; ЯИ9Й5вр! ■ ■ - V * ~~ \ * -г ■ ы ш

—■ ■ '. - " - ■ ят

М 1234 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 М

Рисунок 8. Сравнительный анализ заражения ВК методом ОТ-ПЦР РНК выделенной из мозга СТ>46* (дорожки с 12 по16) или С1)467НК-1 КО (дорожки с 1 по 11) новорождённых мышей на 6-ой день после заражения ВК. Представлен 1 результат из 5.

Эти результаты показали, что рецептор НК-1 является важным компонентом для развития инфекции у большинства мышей. Несмотря на очевидное влияние НК-1 на количество заражённых мышей и кинетику инфекции, этот рецептор не является абсолютно необходимым, поскольку некоторые из НК1КО новорождённых мышей всё же были подвержены заражению и заболевали. Одним из вариантов интерпретации этого явления может служить присутствие у НК-1КО животных дополнительных нейрокининовых рецепторов - НК-2 и НК-3, которые также способны взаимодействовать с СП и как следствие БС вируса кори. Также не исключено, что отсутствие одного из нейрокининовых рецепторов при эмбриональном развитии уже заранее создаёт предпосылки для восполнения его функции двумя другими НК рецепторами.

В качестве следующего этапа инициировали опыты по заражению ВК культур первичных нейронов, выделенных из мозга мышей линии С046+/НК-1К0, для сравнения

использовали нейроны генотипа СБ46+. Полученные предварительные результаты показали, что первичные нейроны, выделенные из мозга мышей линии СО46+/НК-1К0, не могут быть заражены вирусом кори. См. рисунок 9.

* Í ' (

' ?

9- i к, ' ' f '•.. -f

i V . j

* f1' -• ..." . . >.• - - 4; 4 i

CD46+ нейроны CD46+/HK-lKO нейроны

Рисунок 9. Первичные нейроны, выделенные из мозга мышей линии С046+/НК-1К0, не могут быть заражены ВК. Нейроны рассеивали на покровные стекла и заражали ВК при МИ=3. Спустя 48 часов проводили иммуноцитохимическое окрашивание антигенов ВК. Увеличение=100Х. Изображён один репрезентативный эксперимент.

В образцах РНК выделенных из заражённых культур первичных нейронов генотипа С046+/НК-1К0 вирусоспецифических транскриптов, кодирующих белок нуклеопротеина ВК методом ОТ-ПЦР не обнаруживали. Тогда как в контрольных культурах первичных нейронов генотипа С046+ анализ образцов РНК показал, что ген нуклеопротеина ВК присутствует в 100% случаев, Рис. 10.

М + 1 23456789 10

Рисунок 10. Первичные нейроны, выделенные из мозга мышей линии CD46+/HK-1KO ВК, не могут быть заражены вирусом кори. Нейроны заражали при МИ=3 и анализировали спустя 48 часов. Образцы с 1-6 нейроны генотипа CD46+, образцы 7-10 нейроны генотипа CD46+/HK-1KO. Положительный контроль - РНК выделенная из культуры CD46+ нейронов через 96 часов после заражения ВК. Изображён один репрезентативный эксперимент из двух

Поскольку у НК-1КО животных присутствуют нейрокининовые рецепторы — НК-2 и НК-3, которые также способны взаимодействовать с СП, и как следствие с БС вируса кори, вероятно, что отсутствие одного из нейрокининовых рецепторов при эмбриональном развитии уже заранее создает предпосылки для восполнения его функции двумя другими НК рецепторами. Поэтому в качестве альтернативного подхода для подтверждения роли НК-1 в развитии инфекции ВК т vivo сравнивали исход заражения ВК иммунодефицитных мышей линии CD46VRAG КО в присутствии и в отсутствие синтетического антагониста рецептора НК-1 — апрепитант (Emend®), рис.11, 12 и табл.7.

Введение суспензии через ротовой зонд было возможно только для взрослых особей, поэтому использовали взрослых мышей линии CD46+/RAG-2KO Выбор этой модельной системы обусловлен тем, что после внутримозгового заражения ВК практически 100% таких животных заболевают и погибают на 10-14 дпи (Lawrence DM, 1999), и это является удобным фенотипом для исследований Используя мышей этой линии исследовали, может ли блокирование рецептора НК-1 апрепитантом предотвращать заражение и последующее развитие заболевания у восприимчивых мышей Было показано, что у 100% зараженных ВК мышей линии CD46+/RAG~2KO на 8-10 день развивались признаки заболевания со средним кодом тяжести 3 4 по шкале от 0 до 4 и средней потерей веса 19% Напротив, зараженные мыши линии CD46+/RAG-2KO, получавшие апрепитант, разделились на две популяции у одной из которых развилась невропатология, а у второй не развилась Показан один из 3 репрезентативных опытов У 60% мышей, которым вводили апрепитант, развилась более мягкая форма заболевания по сравнению с контрольными мышами, не получавшими апрепитант (сравнить 2 1 и 3 4), потеря веса также была намного меньше, 7% в среднем Важно отметить, что 40% заражённых ВК мышей, получивших апрепитант, не заболели, не потеряли в весе, и остались абсолютно здоровыми

Лечение Число, % Код тяжести болезни Б Вес % (разброс) в

Без апрепитанта Заболевшие 100% 34 19 2 (-35% до +3%)

Здоровые 0 - -

Апрепитант Заболевшие 60% 21 7 (-25% до+1%)

Здоровые 40% 0 0 (+1% до +5%)

Таблица 7 Влияние апрепитанта при лечении мышей зараженных ВК л

А За день до инфекции вводили перорально двукратную дозу апрепитанта, мышей заражали спустя день после инфекции и в последующем через день вводили однокра! ные дозы

Б Мышей осматривали ежедневно, и проводили оценку тяжести заболевания по шкале от 0 до 4, основываясь на критериях описанных в главе "материалы и методы" Показаны усреднённые значения, полученные между 6 и 10 днями

С Мышей взвешивали за день до заражения и ежедневно после инфекции Максимальное изменение веса показано в виде процента потери веса Положительные значения ука_зывают на набранный вес в течение эксперимента

Было показано, что без апрепитанта инфекция развивается интенсивно (Рисунок 11А-В), а у мышей, получивших апрепитант, заражение присутствует в значительно меньшей мере и концентрируется на небольших ограниченных участках паренхимы

(Рисунок 11Г-Е; указано стрелками). Антигенов ВК в мозге не обнаруживали у мышей, получавших апрепитант и выживших в результате эксперимента (11Ж-И).

Рисунок 11. Примеры заражения ВК С046+/11АСК0 мозга мышей в присутствии и отсутствии антагониста НК-1 - апрепитант. Мышей заражали и образцы их мозга собирали перед их гибелью. Срезы мозга, окрашенные методом ИГХ у мышей без апрепитанта (А-В), и мышей, получавших апрепитант (Г-И). Мыши (Г-Е): проявляли признаки заболевания ко дню сбора образцов (10-12); (Ж-И): животные были здоровы на 10-12 день. Увеличение=2Х.

Методом РНК блот-гибридизации исследовали присутствие вирусоспецифических транскриптов, кодирующих белок слияния ВК в образцах РНК, выделенной из мозга мышей, получавших и не получавших апрепитант. Было показано, что в отсутствие апрепитанта репликация вируса происходит у 100% С046+/ЯАСК0 мышей, тогда как у мышей получавших апрепитант, уровень экспрессии транскриптов БС ВК снижался (Рисунок 12).

• 9

+ 1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 12. Блот-гибридизация РНК. Анализ заражения ВК С046+/ИАС КО мышей в присутствие и в отсутствии НК-1 антагониста Апрепитант. Мышей заражали и образцы их мозга собирали через 10 дней. На рисунке показаны результаты РНК блот-гибридизации на присутствие вирусоспецифических транскриптов, кодирующих белок слияния ВК в мозге мышей, леченых апрепитантом и выздоровевших (1-2), без апрепитанта - погибающих (3-4) и мышей получивших апрепитант, но заболевших в более мягкой форме (5-7). В качестве положительного контроля (+) использовали РНК, выделенную из мозга зараженного ВК, инфекция в котором была подтверждена методом ИГХ.

На основании результатов, полученных в данной работе из серии опытов с использованием генетических и фармакологических нокаутов гена НК-1, сделали вывод

что НК-1, рецептор субстанции П, играет роль в развитии заражения ЦНС вирусом кори Мы считаем, что НК-1 может служить дополнительным ко-рецептором для ВК, связываясь с БС вируса

ВЫВОДЫ

1 С046-независимое распространение ВК является исключительным свойством нейронов, так как такой передачи вируса в клетках другой природы не происходит

2 В заражённых ВК нейронах синтез вирусоспецифического белка слияния (БС) осуществляется с эффективностью, достаточной для образования синцитиев в области синапсов

3 В культуре первичных С046+ нейронов синтетический пептид РЬе-РЬе-Му и природные нейротахикининовые пептиды (субстанция П, нейрокинин-А и нейрокинин-Б), содержащие последовательность РЬе-Х-Яу, подавляют как первичное заражение, так и передачу нуклеокапсида ВК между нейронами

4 На 6 день после заражения новорожденных мышей, с нокаутированным геном НК-1, линии СП46+/НК-1КО вирусом кори, слабовыраженная репликация ВК была обнаружена в мозге 18% мышей, по сравнению с контрольными мышами линии СР46+ у 100% которых обнаружена реплицикация этого вируса Лишь у 35% С04б+/НК-1К0 мышей к 18-му дню развивалось заболевание, тогда как 100% мышей генотипа СР46+ заболевали на 4-8 день

5 Первичные культуры нейронов, полученные от мышей линии СВ4б+/НК-1КО нечувствительны к ВК, тогда как все контрольные СВ46* нейроны могут быть заражены ВК

6 При пероральном введении антагониста НК-1 «Апрепитант» мышам линии С04б+/11А0К0 у 60% заражение ВК проявлялось в более легкой форме с кодом тяжести заболевания 2 1 и с потерей веса 7%, тогда как у 40% таких мышей заболевание не возникало вовсе Без введения апрепитанта 100% животных теряли 19% своего веса, код тяжести их заболевания соответствовал 3 4, и на десятый день эти животные погибали

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Nina Makhortova. Peter Askovieh, Catherine E Patterson, Lisa A Gechman, Norma P Gerard and Glenn F Rail Neurokinin-1 enables measles virus trans-synaptic spread m neurons Virology, 2007, 362(1) 235-244

2) Махортова HP. Ролл ГФ , Прасолов ВС Слияние синаптических мембран - новый путь безрецепторной передачи вируса кори между нейронами Молекулярная биология, 2007, 41,1, 186-188

1) Makhortova N , Gechman L , Patterson С , Rail GF Substance P inhibition of measles virus spread in neurons Poster presented at FASEB Summer Research Conference, Tucson, Arizona Neural-Immune Interactions Physiological and Pathological Relevance, August 7-12, 2004

2) Makhortova N , Gechman L, Patterson С, Rail GF The role of fusion m measles virus mter-neuronal spread Poster presented at American Society of Virology 24 Annual Meeting, Penn State University, PA, June 18-22,2005

3) Makhortova N, Gechman L , Patterson С , Rail GF Mechanism of measles virus mter-neuronal spread Poster presented at Annual Fox Chase Cancer Center Postdoctoral Research Conference, Philadelphia, June 3,2005

4) Makhortova N , Gechman L, Patterson С , Rail GF Neurokinin-1 interacts with the measles virus fusion protein to facilitate trans-synapic spread m neurons Oral presentation at Keystone Symposia, Santa Fe, New Mexico,"Cell Biology of Vtral Entry, Replication and Pathogenesis" February 24 - March 1,2006

5) Махортова HP, Ролл ГФ, Прасолов ВС Роль рецептора НК-1 в распространении инфекции вируса кори в мозге у трансгенных CD46+ мышей Тезисы представлены на международной конференции "Физико-химическая биология", в разделе "Вирусные патогенны человека" Новосибирск, Россия, Июль 30-Август 4, 2006

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stpnnt ru e-mail zakaz@stpnnt ru тел 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 21 02 2008 г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Махортова, Нина Руслановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Вирус кори как возбудитель нейротропной инфекции.

1.1 Корь, история и истоки заболевания.

1.2 Структурная организация частицы вируса кори и жизненный цикл.

1.3 Клеточные рецепторы вируса кори и пути заражения.

1.4 Вирусная персистенция в ЦНС и ассоциированные заболевания.

1.5 Заболевания ЦНС, ассоциированные с персистенцией ВК.

1.6 Особенности заболевания подострого склерозирующего панэнцефалита (ПСПЭ).

Глава 2. Модельная система заболевания ПСПЭ.

2.1 Трансгенные HCE-CD46+ мыши являются восприимчивыми к заражению ВК.

2.2 Заражение вирусом кори ЦНС in vivo и in vitro не приводит к гибели нейронов.

2.3 Отсутствие классического распространения ВК между нейронами, вирусные титры в культуре, проблемы почкования и формирования синцития.

2.4 Распространение ВК между нейронами происходит через синапс и является С046-независимым.

Глава 3. Ингибиторы слияния ВК с клетками.

3.1 Механизмы слияния вирусов использующих гликопротеин - белок слияния.

3.2 Особенности процесса слияния ВК с клеткой.

3.3 Слияние-ингибирующий пептид (СИП), воздействие на различные вирусы и предполагаемый механизм действия.

3.4 Представители семейства нейротахикининовых пептидов (НТП): субстанция П, нейрокинин-А, нейрокинин-Б ингибируют распространение ВК в нейронах.

Глава 4. Рецепторы нейротахикининовых пептидов (НТП).

Строение, экспрессия, сигнальная трансдукция и физиологические функции рецепторов семейства нейротахикининовых пептидов: НК-1, НК-2 и НК-3.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Вирусы.

2. Клетки.

3. Животные и их генотипирование.

4. Белковый электрофорез и вестерн блот-гибридизация.

5. Иммуноцитохимия и иммунофлуоресценция.

6. Мечение клеток прижизненными флуоресцентными красителями.

7. Иммуногистохимия срезов мозга мышей.

8. Метод оценки смешения цитоплазмы в области синаптических соединений.

9. Ингибиторный анализ инфекции ВК в клеточной культуре.

10. Эксперименты по заражению мышей.

11. Сбор образцов ткани/клеток для выделения РНК, выделение РНК.

12. Анализ РНК методом ОТ-ПЦР.

13. РНК дот-блот гибридизация.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Безрецепторное распространение ВК является уникальным для нейронов.

2. Экспрессия и распределение белка слияния (БС) в нейронах заражённых ВК.

Фрагменты БСо и БС/ экпрессируются в заражённых нейронах.

Белок слияния ВК экспрессируется в заражённых нейронах наряду с другими вирусными протеинами.

Белок слияния ВК локализуется в отростках и синапсах заражённых нейронов.

3. Слияние мембран у заражённых ВК нейронов по типу синцития в синапсах.

4. СИП блокирует заражение и распространение ВК в культуре первичных нейронов.

СИП предотвращает распространение ВК между первичными нейронами.

Способность СИП ингибироватъ распространение ВК является дозозависимой. 78 СИП специфически ингибирует распространение ВК в культуре чувствительных нейронов.

СИП предотвращает заражение BKde novo в первичных нейронах.

5. Нейротахикининовые пептиды (НТП) ингибируют распространение ВК между нейронами.

Последовательность аминокислотных остатков использованных пептидов.

Влияние нейропептидов на распространение инфекции ВК.

6. Рецептор субстанции П НК-1 участвует в распространении ВК между нейронами в первичной культуре и в мозге заражённых мышей.

График выживания новорождённых мышей трёх генотипов СИ46*, СИ46*/НК-1КО и дикого типа после заражения ВК.

Сравнительный анализ заражения ВК методом ОТ-ПЦР РНК выделенной из мозга С04б*/НК-1+ или С04б+/НК-1 КО новорождённых мышей на 6-ой день после заражения ВК.

Первичные нейроны, выделенные из мозга мышей линии СВ46+/НК-1КО ВК, не могут быть заражены вирусом кори (иммуногистохимия).

Первичные нейроны, выделенные из мозга мышей линии С046+/НК-1 КО В К, не могут быть заражены вирусом кори (ОТ-ПЦР).

Влияние апрепитанта на лечение мышей заражённых ВК.

Анализ заражения ВК СВ4б+/КАС КО мышей в присутствие и в отсутствии НК-1 антагониста Апрепитант (иммуногистохимия).

Анализ заражения ВК С046+/ЯАС КО мышей в присутствие и в отсутствии НК-1 антагониста Апрепитант (РНК дот блот-гибридизация).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы распространения вируса кори между нейронами мышей, экспрессирующими рецептор человека CD46+"

Несмотря на существование вакцины, вирус кори (ВК) входит в первую десятку наиболее опасных инфекций и приводит к смерти около 1 миллиона человек ежегодно во всём мире в результате иммуносупрессии и по причине постинфекционных осложнений центральной нервной системы (ЦНС). Из всех случаев заболеваний корью за год, примерно у одного из десяти тысяч пациентов развиваются осложнения в виде заболеваний мозга (обзор Rail GF., 2003, Takasu 2003). Наиболее хорошо изученным из таких осложнений ЦНС является подострый склерозирующий панэнцефалит (ПСПЭ): медленнотекущее, прогрессирующее заболевание, которое может проявиться спустя месяцы или даже годы после завершения острой коревой инфекции. Оно характеризуется прогрессирующей деменцией с последующими моторными нарушениями и всегда приводит к смерти больного (Manchester M. and Rail GF. 2001; Schneider-Schaulies S, ter Meulen V. 1999). ПСПЭ обладает рядом особенностей, не характерных для продуктивной инфекции ВК, в мозге отсутствуют зрелые вирусные частицы, но присутствует большое количество нуклеокапсидов ВК и противовирусных антител. Инфекция не вызывает гибели нейронов, тем не менее заболевание смертельно для больного (Anlar В, 2001). Все эти особенности указывают на то, что механизм патогенеза коревой инфекции в ЦНС отличается от инфекционного процесса в других тканях организма, и причиной смерти от ПСПЭ является, скорее, нарушение функции нервных клеток, а не их гибель. Исходя из этого, изучение особенностей патогенеза коревой вирусной инфекции в ЦНС является важной задачей биомедицины и может облегчить понимание многих других персистирующих заболеваний мозга, вызываемых нейротропными вирусами.

Первичный контакт ВК и клетки-мишени осуществляется за счёт взаимодействия гликопротеина оболочки вируса - геммаглютинина (ГА) с одним из двух своих клеточных рецепторов CD46 или SLAM, после чего другой вирусный гликопротеин - белок слияния (БС) претерпевает конформационные изменения, инициирующие слияние мембраны вируса и клеточной мембраны. Так происходит проникновение вирусного капсида в клетку. Наряду с этим, распространение ВК происходит при слиянии заражённых клеток с незаражёнными клетками, при этом образуется характерный для коревой инфекции многоядерный синцитий. Образование синцития происходит за счёт взаимодействия вирусных гликопротеинов, экспрессированных на поверхности заражённых клеток с рецепторами на незаражённых клетках (Lawrence DM, 2000). Вирус кори способен заражать лишь клетки человека, содержащие поверхностные белки CD46 и SLAM, исполняющие роль рецепторов к этому вирусу. Так как молекулы CD46 и SLAM есть лишь у клеток приматов и отсутствуют у других животных, то, до недавнего времени, только приматы могли быть использованы как экспериментальные животные для изучения-патогенеза ВК в ЦНС, включая редкое смертельное заболевание ЦНС - ПСПЭ (Dhiman N, 2004). Отсутствие достаточно дешёвых доступных животных моделей существенно затрудняло исследование заболеваний ЦНС, индуцируемых корью. Изучение механизмов патогенного действия ВК в тканях мозга стало возможным благодаря созданию трансгенных животных моделей! Поскольку в природе мыши не являются восприимчивыми к заражению ВК, то для изучения патогенеза ПСПЭ in vivo в 1997 году создали и охарактеризовали первую трансгенную мышиную модель вирусной инфекции клеток нервной системы. Мыши линии HCE-CD46+ экспрессируют молекулы CD46 человека, являющиеся рецепторами к ВК под контролем специфического для нейронов промотора — нейрон-специфической енолазы (НСЕ). Таким образом, только мозг HCE-CD46+ трансгенных мышей является восприимчивым к заражению ВК, поскольку рецептор CD46 экспрессируется исключительно в нейронах ЦНС (Rail GF, et al, 1997). Эксперименты in viti'o показали, что в заражённой первичной культуре нейронов гиппокампа мышей линии HCE-CD46+ отсутствуют зрелые вирусные частицы в среде, тогда как нуклеокапсиды ВК интенсивно распространяются между клетками. При этом нейроны не погибают, и монослой клеток сохраняет свою структуру при любых вирусных титрах и плотности посева клеток. Также было показано, что рецептор CD46 необходим лишь для первичного проникновения ВК в нейроны, тогда как дальнейшее распространение вируса происходит через синапс и не зависит от наличия рецепторов CD46 или SLAM (Lawrence DM, 2000). Таким образом, распространение вируса между нейронами протекает по особому механизму, отличному от пути его изначального проникновения в клетку.

Межнейрональное распространение ВК в отсутствие рецептора CD46 или SLAM может происходить за счёт взаимодействия гликопротеинов оболочки вируса с дополнительными поверхностными молекулами клетки, ещё не идентифицированными в качестве рецепторов к ВК (Hashimoto К et al, 2002* Manchester М et al, 2002). Также не исключено, что эти рецепторы могут связываться с поверхностным гликопротеином ВК, отличным от ГА, например с БС (Takeuchi К et al, 2002). Считают, что процесс слияния частицы ВК с мембраной клетки требует затраты энергии, источниками которой могут являться конформационные изменения ГА, повышение температуры, или взаимодействие БС со своим собственным рецептором на клетке (Dutch RE, et al 2001; Paterson RG, et al 2000). Данные о транссинаптической и CD46-независимой передаче ВК между нейронами, указывают на то, что взаимодействие ГА с его рецептором в области синапса не требуется (Lawrence DM, 2000). Это привело нас к постановке ряда задач по исследованию роли второго гликопротеина вируса кори — БС в нейротрансмиссии.

Впервые на фибробластах было показано, что синтетические пептиды, с последовательностью аминокислотных остатков Phe-X-Gly, сходной с последовательностью остатков аминокислот области N-конца БС парамиксовирусов, препятствуют как проникновению ВК в клетку, так и вирусиндуцированному слиянию и гемолизу клеток. Синтетический трипептид Phe-X-Gly назвали слияние-ингибирующим пептидом (СИП). По результатам этих работ предположили, что СИП взаимодействует с предполагаемыми рецепторами на клеточной мембране, и подавление заражения осуществляется за счёт конкуренции с БС за эти рецепторы (Richardson CD and Choppin PW, 1983).

Представители семейства нейротахикининовых пептидов (НТП) субстанция П (СП), нейрокинин-А (НК-А) и нейрокинин-Б (НК-Б) в активном центре также имеют аминокислотную последовательность Phe-X-Gly, присутствующую в пептидах СИП и на N-конце белка слияния ВК. В экспериментах проведённых на фибробластах, впервые было показано, что СП обратимо подавляет инфекцию ВК в клеточной культуре, однако механизм этого феномена был невыяснен. Объясняя механизм такой антивирусной активности основывались том, что последовательность трёх аминокислотных остатков активного центра субстанции П является гомологичной последовательности остатков аминокислот синтетического трипептида СИП и N-конца белка слияния ВК. В силу того, что СП является природным нейропептидом, предположили, что молекулой, за связывание с которой идёт конкуренция между синтетическим СИП, нейропептидом СП и белком слияния ВК является рецептор нейрокинин -1 (НК-1) (Schroeder С, 1986).

Цель и задачи работы. Целью данной работы является изучение роли молекулы НК-1 в процессе транссинаптической передачи ВК между нейронами ЦНС. Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи: установить, является ли способность к CD46 независимому распространению ВК уникальным свойством нейронов;

- подтвердить наличие экспрессии и изучить локализацию белка слияния вируса кори в нейронах;

- установить, происходит ли слияние мембран нейронов по типу синцития в синапсах при заражении вирусом кори

- определить влияние слияние-ингибирующего пептида и НТП на распространение ВК в нейронах in vitro

- провести сравнительный анализ заражения ВК мышей линии CD46+ и мышей линии CD46+/HK-1K0, полученных путём скрещивания мышей нокаутных по рецептору НК-1 с мышами, трансгенными по рецептору CD46;

- провести сравнительный анализ заражения ВК первичных нейронов полученных от мышей линии CD46+/HK-lKO и контрольных нейронов, полученных от мышей линии CD46+;

- провести сравнительный анализ заражения ВК иммунодефицитных мышей линии CD46+/RAG КО в присутствии и в отсутствие синтетического антагониста НК-1 рецептора - апрепитант (Emend®).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Махортова, Нина Руслановна

выводы

1. СБ46-независимое распространение ВК является исключительным свойством нейронов, так как такой передачи вируса в клетках другой природы не происходит.

2. В заражённых ВК нейронах синтез вирусспецифического белка слияния (БС) осуществляется с эффективностью достаточной для образования синцитиев в области синапсов.

3. В культуре первичных СБ46+ нейронов синтетический пептид РИе-РЬе-в1у и природные нейротахикининовые пептиды (субстанция П, нейрокинин-А и нейрокинин-Б), содержащие последовательность РИе-Х-Иу, подавляют как первичное заражение, так и передачу нуклеокапсида ВК между нейронами.

4. На 6 день после заражения новорождённых мышей, с нокаутированным геном НК-1, линии С0467НК-1К0 вирусом кори, слабовыраженная репликация ВК была обнаружена в мозге 18% мышей, по сравнению с контрольными мышами линии СЭ46+ у 100% которых обнаружена реплицикация этого вируса. Лишь у 35% С046+/НК-1К0 мышей к 18-му дню развивалось заболевание, тогда как 100% мышей генотипа СЭ46+ заболевали на 4-8 день.

5. Первичные культуры нейронов, полученные от мышей линии С046+/НК-1КО нечувствительны к ВК, тогда как все контрольные С046+ нейроны могут быть заражены ВК.

6. При пероральном введении антагониста НК-1 «Апрепитант» мышам линии С046+/ЯА0К0 у 60% заражение ВК проявлялось в более лёгкой форме с кодом тяжести заболевания 2.1 и с потерей веса 7%, тогда как у 40% таких мышей заболевание не возникало вовсе. Без введения апрепитанта 100% животных теряли 19% своего веса, код тяжести их заболевания соответствовал 3.4, и на десятый день эти животные погибали.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Махортова, Нина Руслановна, Москва

1. Махортова HP, Ролл ГФ, Прасолов ВС. Молекулярная Биология. 2007, Vol. 41, No. 1,рр. 186-188.

2. Чизмаджев Ю.А, 2003. Как вирус проникает в клетку, Юрий Александрович Чизмаджев, чл.-корр. РАН, д. х. н., проф. кафедры биофизики МГУ, зав. лаб. биоэлектрохимии Института электрохимии им.А.Н.Фрумкина РАН, Журнал Природа №4,А

3. Ahluwalia A, De Felipe С, O'Brien J, Hunt SP, Perretti M. 1998. Impaired IL-1 beta-induced neutrophil accumulation in tachykinin NK1 receptor knockout mice. Br J Pharmacol. Jul; 124(6): 1013-5.

4. Allison SL, Schalich J, Stiasny K., 1995. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced be an acidic pH. J Virol; 69:695-700

5. Almeida ТА., 2004. Tachykinins and tachykinin receptors: structure and activity relationships. Curr. Med. Chem. 11, 2045-2081.

6. Anlar B, Soylemezoglu F, Aysun S, Kose G, Belen D, Yalaz K. 2001. Tissue inflammatory response in subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). J. Child Neurol. 16: 895-900

7. Ayata M, Hirano A, Wong TC, 1989. Structural defect linked to nonrandom mutations in the matrix gene of Biken strain of subacute sclerosing panencephalitis virus defined by cDNA cloning and expression of chimeric genes. J Virol;63:l 162-1173.

8. Auwaerter PG, Rota PA, Elkins WR, et al, 1999. Measles virus infection in rhesus macaques: Altered immune responses and comparison of the virulence of six different virus strains. J Infect Dis; 180:950-958.В

9. Baczko K, Lampe J, Liebert UG, 1993. Clonal expansion of hypermutated measles virus in a SSPE brain. Virology, 197:188-195.

10. Baczko K, Liebert UG, Billeter M, Cattaneo R, Budka H, ter Meulen V, 1986. Expression of defective MV genes in brain tissues of patients with SSPE. J. Virology 59: 472-8

11. Bagai S, Lamb RA, 1995. Quantitative measurement of paramyxovirus fusion: differences in requirements of glycoproteins between simian virus 5 and human parainfluenza virus 3 or Newcastle disease virus. J Virol. Nov;69(l l):6712-9.

12. Bancker G, Goslin K, 1991. Culturing nerve cells. Cambridge: MIT Press.

13. Bannon MJ, Brownschidle LA, Tian Y, Whitty CJ, Poosch MS, D'sa C, 1995. Neurokinin-3 receptors modulate dopamine cell function and alter the effects of 6-hydroxydopamine. Brain Res; 695 (1): 19-24.

14. Bartz R, Firsching R, Rima B, ter Meulen V, Schneider-Schaulies J. 1998. Differential receptor usage by MV strains. J. Gen. Virol. 79: 1015-25

15. Bedows E, Rao KMK, Welsh MJ. Fate of microfilaments in Vero cells infected with measles virus and herpes simplex virus type 1. 1983. Mol Cell Biol;4:712-719.

16. Berger, M. M., N. Kopp, 2000. Detection and cellular localization of enterovirus RNA sequences in spinal cord of patients with ALS. Neurology 54: 20-25.

17. Binder, G. K. and Griffin D. E., 2001. Interferon-gamma mediated site specific clearance of alphavirus from CNS neurons. Science 293: 303-306.

18. Boyce S, Smith D, Carlson E, Hewson L, Rigby M, O'Donnell R, Harrison T, Rupniak NM. Intra-amygdala injection of the substance P (NK1 receptor) antagonist L-760735 inhibits neonatal vocalizations in guinea-pigs. 2001 .Neuropharmacology-, 41(l):130-7.

19. Bozic CR B. Lu, Hopken U. E., Gerard G., and Gerard N. P, 1996. Neurogenic amplification of immune complex inflammation. Science 273:1722-1725.

20. Brody JA, Detels R, Sever JL. 1972. Measles-antibody titres in sibships of patients with subacute sclerosing panencephalitis and controls. Lancet,\\YI1—Y1%.

21. Brown S, Lamberts D, Reid TW, Nishida T, Murphy C. 1997. Neurophilic and Anhidrotric Keratopathy Treated with Substance P and Insulinlike Growth Factor 1. Arch Ophthalmol; 115:926-927

22. Buchmeier MJ, Zajac A. 1999. Lymphocytic choriomeningitis virus. In: Ahmed R, Chen I, eds. Persistent viral infections Chichester, UK: JohnWiley&Sons,:575-605.C

23. Cantin E, Tanamachi B, Openshaw H. 1999. Role for gamma interferon in control of HSV-1 reactivation. J Virol-;73:3418-23.

24. Cao W., Oldstone M. B., 1997. Viral persistent infection affects both transcription and posttranscriptional regulation of the neuron-specific molecule, GAP43. Virology 230:147-154.

25. Cathomen, T., H. Y. Nairn, and R. Cattaneo. 1998. Measles virus with altered envelope protein cytoplasmic tails gain fusion competence. J. Virology 72:1224-1234.

26. Cattaneo R, Schmid A, Rebmann G, Baczko K, ter Meulen V, 1986. Accumulated measles virus mutation in a case of subacute sclerosing panencephalitis: interrupted matrix protein reading frame and transcription alteration. Virology, 154:97-107

27. Cattaneo R, Schmid A, Spielhofer P, et al, 1989. Mutated and hypermutated genes of persistent measles viruses which caused lethal human brain diseases. Virology-, 173:415-425.

28. Choppin PW, Scheid A, 1980. The role of viral glycoproteins in adsorption, penetration, and pathogenicity of viruses. Rev Infect Dis', 2:40-61.

29. Colman, P. M., and M. C. Lawrence. 2003. The structural biology of type I viral membrane fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 4:309-319.

30. Cosby SL. 2002. An immunohistochemical study of the distribution of the measles virus receptors, CD46 and SLAM, in normal human tissues and subacute sclerosing panencephalitis. Lab. Invest. 82: 403-9

31. Dhiman N., Jacobson R.M., Poland G.A, 2004. Measles virus receptors: SLAM and CD46. Rev. Med. Virol 14 217-229.

32. Doi Y, Kurita M, Matsumoto M, et al, 1998. Moesin is not a receptor for measles virus entry into mouse embryonic stem cells. J F/ro/;72:1586-1592.

33. Dorig RE, Marcil A, Chopra A, Richardson CD, 1993. The human CD4 molecule is a receptor for measles virus (Edmonston strain). Cell 75: 295-305

34. Dubois-Dalcq M, Coblentz JM, Pleet AB, 1974. Subacute sclerosing panencephalitis: Unusual nuclear inclusions and lengthy clinical course. Arch Neurol',3> 1:355-363.

35. Dutch RE, Hagglund RN, Nagel MA, Peterson RG and Lamb RA, 2001. Paramyxovirus fusion protein: a conformational change on cleavage activation. 14 Virology 281, 138-150.E

36. Eckert DM., and Kim PS., 2001. Mechanisms of viral membrane fusion and its inhibition. Annu. Rev. Biochem.

37. Ehrengruber, MU., Ehler E., et al., 2002. Measles virus spreads in rat hippocampal neurons by cell-to-cell contact in a polarized fashion. J. Virol 76: 5720-5728.

38. Emonds-Alt X, Bichon D, Ducoux JP, Heaulme M, Miloux B,Poncelet M, 1995. SR 142801, The first potent non-peptideantagonist of the tachykinin NK-3 receptor. Life Sci; 56 (1): PL27-PL32.

39. Emonds-Alt X, Proietto V, Steinberg R, Advenier C, Daoui S, Naline E, 2002. Biochemical and pharmacological activities of SSR 146977, a new potent nonpeptide tachykinin NK3 receptor antagonist. Can J Physiol Pharmacol; 80 (5): 482-8.

40. Enders J.F., Peebles T.C. Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles. 1954. Proc. Soc. Exp. Biol Med. Jun; 86 (2): 277-86.

41. Erlenhofer C, Duprex WP, Rima BK, ter Meulen V, Schneider-Schaulies J., 2002. Analysis of receptor (CD46, CD 150) usage by measles virus. J Gen Virol Jun;83(Pt 6): 1431-6.

42. Erlenhoefer C, Wurzer WJ, Loffler S, Schneider-Schaulies S, ter Meulen V, Schneider-Schaulies J. 2001. CD150 (SLAM) is a receptor for measles virus but is not involved in viral contact-mediated proliferation inhibition. J. Virol.l5:4499-505

43. Esolen LM, Park SW, Hardwick JM, Griffin DE. 1995.Apoptosis as a cause of death in measles virus-infected cells. J Virol',69:3955-3958.

44. Esolen LM, Takahashi K, Johnson RT, 1995. Brain endothelial cell infection in children with acute fatal measles. J Clin /rcv&si;96:2478-2481.

45. Etessami R, Conzelmann KK, Fadai-Ghotbi B, Natelson B, Tsiang H, Ceccaldi PE. 2000. Spread and pathogenic characteristics of a G-deficient rabies virus recombinant: an in vitro and in vivo study. J Gen Virol',& 1:2147-53.F

46. Fazakerley JK, Pathak S, Scallan M, Amor S, Dyson H. 1993. Replication of the A7(74) strain of Semliki forest virus is restricted in neurons. Virology, 195:627—37.

47. Fazakerley JK, Southern P, Bloom F, Buchmeier MJ. 1991. High resolution in situ hybridization to determine the cellular distribution of LCMV RNA in the tissues of persistently infected mice. J Gen Virol',12\\6\ 1-25.

48. Ferlenghi I, Gowen B, de Haas F, 1998. The first step: Activation of the Semliki Forest virus spike protein precursor causes a localized conformational change in the trimeric spike. J. Mol Biol,',283:71-81

49. Fiette L, Aubert C, Muller U, 1995. Theiler's virus infection of 129Sv mice that lack the IFN-alpha/beta or IFN-gamma receptors. J Exp Med; 181:2069-76.

50. Finke D, Brinckmann UG, ter Meulen V, Liebert UG. 1995. IFN-gamma is a major mediator of antiviral defense in experimental MV-induced encephalitis. J Virol',69:5469-74.

51. Flamand A, Gagner JP, Morrison LA, Fields BN. 1991. Penetration of the nervous systems of suckling mice by mammalian reoviruses. J Virol',65:123-31.

52. Forss-Petter S, Danielson PE, Catsicas S, Battenberg E, Price J, Nerenberg M, Sutcliffe JG. 1990. Transgenic mice expressing beta-galactosidase in mature neurons under neuron-specific enolase promoter control. Neuron. Aug;5(2): 187-97.G

53. Gallagher TM, Buchmeier MJ, Perlman S. 1992. Cell receptor-independent infection by a neurotropic murine coronavirus. Virology, Nov;191(l):517-22.

54. Geiger K, Gurushanthaiah D, Howes E. 1995. Cytokine-mediated survival from lethal HSV infection: role of programmed neuronal death. Proc Natl Acad Sci USA; 92:3411-5.

55. Gerard, N.P., Bao, L., Xiao-Ping, H., Gerard, C., 1993. Molecular aspects of the tachykinin receptors. Regulatory Peptides 43 (1-2), 21-35.

56. Gonzalez-Dunia D, Sauder C, de la Torre JC. 1997. Borna disease virus and the brain. BrainRes',44:641-664.

57. Grant, A.D., Akhtar, R., Gerard, N.P., Brain, S.D., 2002. Neurokinin B induces oedema formation in mouse lung via tachykinin receptor-independent mechanisms. Journal of Physiology 543 (3), 1007-1114.

58. Griffin DE, Bellini WJ. 1996. Measles virus. In Fields Virology, ed. D M Knipe, B N Fields, P MHowley, et.al., pp. 1267-1312. Philadelphia, PA: Lippincott-RavenH

59. Hagan RM, Beresford IJ, Stables J, Dupere J, Stubbs CM, Elliott PJ, 1993. Characterisation, CNS distribution and function of NK2 receptors studied using potent NK2 receptor antagonists. Reg. Peptides', 46 (1-2): 9-19

60. Hallensleben W, Staeheli P. 1999. Inhibition of Borna disease virus multiplication by interferon: cell line differences in susceptibility./irc/zF/ro/; 144:1209-16.

61. Halsey NA, Modlin JF, Jabbour JT., 1980. Risk factors in subacute sclerosing panencephalitis: A case-control study. Am J Epidemiol', 111:415-424.

62. Harrowe G, Mitsuhashi M, Payan DG, 1990. Measles virus-substance P receptor interactions: Possible novel mechanism of viral fusion. J Clin Invest', Vol. 85, April, 1324-1327.

63. Hashimoto K, Ono N, Tatsuo H, Minagawa H, Takeda M, et al. 2002. SLAM (CD150)-independent measles virus entry as revealed by recombinant virus expressing green fluorescent protein. J. Virol. 76: 6743-9

64. Hayse Y, Tobita K. 1997. Influenza virus and neurologic diseases. Psychol Clin Neurol',51:181—184.

65. Heinz, F. X., and S. L. Allison. 2000. Structures and mechanisms in flavivirus fusion. Adv. Virus Res. 55:231-269.

66. Helenius A, Kartenbeck J, Simons K, Fries E. 1980. On the entry of Semliki Forest virus into BHK-21 cells. J Cell Biol, \84:404-420

67. Hernandez, L. D., L. R. Hoffman, T. G. Wolfsberg, and J. M. White. 1996. Virus-cell and cell-cell fusion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:627-661.

68. Herndon RM, Rubinstein LJ. 1968. Light and electron microscopy observations on the development of viral particles in the inclusions of Dawson's encephalitis (subacute sclerosing panencephalitis). Neurology, 18:8-20.

69. Hershey, A.D., Dykema, P.E., Krause, J.E., 1991. Organization, structure, and expression of the gene encoding the rat substance P receptor. J Biol Chem 266 (7), 4366-4374.

70. Hickey WF, Hsu BL, Kimura H. 1991. T-lymphocyte entry into the CNS. J Neurosci Res; 28:254-60.

71. Ho, W.Z., Lai, J.P., Zhu, X.H., Uvaydova, M., Douglas, S.D., 1997. Human monocytes and macrophages express substance P and neurokinin-1 receptor. Journal of Immunolology 159 (11), 5654-5660.

72. Hong JS, Tilson HA, Yoshikawa K. 1983. Effects of lithium and haloperidol administration on the rat brain levels of substance P. JPharm Exp Ther, 224(3):590-3.

73. Hornby PJ. 2001. Central neurocircuitry associated with emesis. Am J Med\\ 11:106S-12S

74. Horvath, C. M., Paterson, R. G., Shaughnessy, M. A., Wood, R., and Lamb, R. A. 1992. Biological activity of paramyxovirus fusion proteins: factors influencing formation of syncytia. J. Virol. 66, 4564-4569.

75. Hsu EC, Iorio C, Sarangi F, Khine AA, Richardson CD. 2001. CDwl50(SLAM) is a receptor for a lymphotropic strain of measles virus and may account for the immunosuppressive properties of this virus. Virology 279: 9-21

76. Hsu EC, Sarangi F, Iorio C, Sidhu MS, Udem SA, 1998. A single amino acid change in the hemagglutinin protein of measles virus determines its ability to bind CD46 and reveals another receptor on marmoset B cells. J. Virol. 72: 2905-16

77. Jabbour JT, Duenas DA, Sever JL, 1972. Epidemiology of subacute sclerosing panencephalitis: A report of the SSPE registry. JAMA)220:959-962.

78. Jackson AC. 1991. Biological basis of rabies virus neurovirulence in mice: comparative pathogenesis study using the immunoperoxidase technique. J Virol; 65:537-40.

79. Jahn, R., T. Lang, and T. C. Sudhof. 2003. Membrane fusion. Cell 112:519-533.

80. Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M. 2001. Immunobiology. 5th ed. New York: Garland.

81. Johnson, R. T. 1998. Viral infections of the nervous system. Philadelphia, PA, Lippincott-Raven.K

82. Katayama Y, Kohso K, Nishimura A, Tatsuno Y, Homma M, Hotta H. 1998. Detection of measles virus mRNA from autopsied human tissues. J. Clin. Microbiol. 36: 299-301

83. Kingsbury D. W., Bratt M.A., Choppin P.W. 1978. Intervirology. Vol. 10. P. 13 7-152.

84. Kirk J, Zhou AL, McQuaid S. 1991 Cerebral endothelial cell infection by measles virus in subacute sclerosing panencephalitis: Ultrastructural and in situ hybridization evidence. Neuropathol Appl Neurobiol\ 17:289-297.

85. Komatsu T, Bi Z, Reiss CS. 1996. Interferon gamma-induced type I nitric oxide synthase activity inhibits viral replication in neurons. JNeuroimmunol; 68:101-8.

86. Komatsu T, Ireland DD, Chen N, Reiss CS. 1999. Neuronal expression of NOS-1 is required for host recovery from viral encephalitis. Virology,258:389-95.

87. Komatsu T, Srivastava N, Revzin M, Ireland DD, Chesler D, Reiss CS. 1999. Mechanisms of cytokine-mediated inhibition of viral replication. Virology,259:334-41.

88. Krause, J.E., Blount, P., Sachais, B.S., 1994. Molecular Biology of receptors. Structures, Expression and Regulatory Mechanisms. In: Buck, S.H. (Ed.), The tachykinin receptors, 165-218.

89. Kruse M, Meinl E, Henning G, Kuhnt C, Berchtold S, 2001. Signaling lymphocytic activation molecule is expressed on mature CD83+ dendritic cells and is up-regulated by IL-1 beta. J. Immunol. 167: 1989-95

90. Maisner A, Schneider-Schaulies J, Liszewski MK, Atkinson JP, Herrler G. 1994. Related binding of measles virus to membrane cofactor protein (CD46): importance of disulfide bonds andN-glycans for the receptor function. J Virol. 0ct;68(10):6299-304.

91. Maggi, C.A., Schwartz, T.W., 1997. The dual nature of the tachykinin NK1 receptor. Trends in Pharmacological Sciences 18 (10), 351—355.

92. Maggi, C.A., 1995. The mammalian tachykinin receptors. General Pharmacology 26 (5), 911-944.

93. Maggi, C.A., 2000. Principles of tachykininergic co-transmission in the peripheral and enteric nervous system. Regulatory Peptides 93 (1-3), 53-64.

94. Malek-Ahmadi, 1992 P. Malek-Ahmadi, Substance P and neuropsychiatric disorders: an overview, Neurosci. Biobehav. Rev. 16 (1992), pp. 365-369.

95. Manchester M, Eto DS, Oldstone MB. 1999. Characterization of the inflammatory response during acute measles encephalitis in NSE-CD46 transgenic mice. J. Neuroimmunol. 96:207-17

96. Manchester M, Eto DS, Perkin HB, Torbett BE. 2002. Targeting and hematopoietic suppression of human CD34+ cells by measles virus. J. Virol. 76: 6636-42

97. Manchester M, Gairin JE, Patterson JB, Alvarez J, Liszewski MK, Eto DS, Atkinson JP, Oldstone MB. 1997. Measles virus recognizes its receptor, CD46, via two distinct binding domains within SCR1-2. Virology. Jun 23;233(1): 174-84.

98. Manchester M, Naniche D, Stehle T. 2000. CD46 as a MV receptor: form follows function. Virology 21 A: 5-10

99. Manchester M, Rail GF. 2001. Model Systems: transgenic mouse models for measles pathogenesis. Trends Microbiol. Jan;9(l): 19-23. Review.

100. Mantyh PW, 2002. Neurobiology of substance P and the NK1 receptor. J. Clin.Psychiatry 63:6-10.

101. Massi, M., Panocka, I., de Caro, G., 2000. The psychopharmacology of tachykinin NK-3 receptors in laboratory animals. Peptides 21 (11), 1597-1609.

102. Masu Y, Nakayama K, Tamaki H, Harada Y, Kuno M, Nakanishi S. 1987. cDNA cloning of bovine substance-K receptor through oocyte expression system. Nature. Oct 29-Nov 4;329(6142):836-8.

103. Matsuda H., Kawakita K., Kiso Y., Nakano T. and Kitamura Y., 1989. Substance P induces granulocyte infiltration through degranulation of mast cells, J. Immunol. 142 (1989), pp. 927-931.

104. Maubach KA, Martin K, Smith DW, Hewson L, Frankshun RA, Harrison T, 2001. Substance P stimulates inhibitory synaptic transmission in the guinea pig basolateral amygdala in vitro. Neuropharmacology, 40 (6): 806-17.

105. McGavern DB, Homann D, Oldstone MB. 2002. T cells in the central nervous system: the delicate balance between viral clearance and disease. J Infect Dis. Dec 1; 186 Suppl 2:S 145-51. Review.

106. McGinnes LW., K. Gravel, and TG. Morrison. 2002. Newcastle disease virus HN protein alters the conformation of the F protein at cell surfaces. J Virol. 76: (24) 12622-12633.

107. McKendall R., Stroop W. 1994. Handbook o/Neurovirology. pp.7-25

108. McLean S., 2005, Do Substance P and the NK1 Receptor have a Role in Depression and Anxiety? Current Pharmaceutical Design, 11,1529-1547

109. McQuaid S, Campbell S, Wallace IJ, Kirk J, Cosby, SL. 1998. MV infection and replication in undifferentiated and differentiated human neuronal cells in culture. J. Virol. 72: 5245-50

110. McQuaid S, McMahon J, Herron B, Cosby SL. 1997. Apoptosis in measles virus-infected human central nervous system tissues. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 23:21824

111. Minneman, K.P., 2001. Splice variants of G protein-coupled receptors. Molecular Interventions 1 (1), 108-116.

112. Modlin JF, Jabbour JT, Witte JJ, Halsey NA. 1977. Epidemiologic studies of measles, measles vaccine, and subacute sclerosing encephalitis. Pediatrics',59:505-512.

113. Morrison T, McQuain C, McGinnes L. 1991. Complementation between avirulent Newcastle disease virus and a fusion protein gene expressed from a retrovirus vector: requirements for membrane fusion. J Virol. Feb;65(2):813-22.

114. Moscona A, Peluso RW. 1991.Fusion properties of cells persistently infected with human parainfluenza virus type 3: participation of hemagglutinin-neuraminidase in membrane fusion. J Virol. Jun;65(6):2773-7.

115. Moss WJ, Griffin DE. Griffin D., 2006. Global measles elimination, Nat Rev Microbiol, Dec 4(12):900-8.

116. Naline, E., Devillier, P., Drapeau, G., Toty, L., Bakdach, H., Regoli, D., Advenier, C., 1989. Characterization of neurokinin effects and receptor selectivity in human isolated bronchi. American Review of Respiratory Diseases 140 (3), 679-686.

117. Nalivaiko E, Michaud JC, Soubrie P, Le Fur G, Feltz P. 1997. Tachykinin neurokinin-1 and neurokinin-3 receptor-mediated responses in guinea-pig substantia nigra: an in vitro electrophysiological study. Neuroscience; 78 (3): 745-57.

118. Nishimori, K., Young, L.J., Guo, Q., Wang, Z., Insel, T.R., Matzuk, M.M., 1996. Oxytocin is required for nursing but is not essential for parturition or reproductive behavior. Procof the Nat Acad of SciUSA 93 (21), 11699-11704.

119. Norrby, E. 1971. The effect of a carbobenzoxy tripeptide on the biological activities of measles virus. Virology 44:599-608.o

120. Ogata A, Czub S, Cosby SL, 1997. Absence of measles virus receptor (CD46) in lesions of subacute sclerosing panencephalitis brains. Acta Neuropathol (Ber/j;94:444-449.

121. Oldstone MB, Blount P, Southern PJ, Lampert PW. 1986. Cytoimmunotherapy for persistent virus infection reveals a unique clearance pattern from the CNS. Nature;32l:239-43.

122. Oldstone MB, Lewicki H, Thomas D, 1999.MV infection in a transgenic model: virus-induced immunosuppression and CNS disease. Cell; 98:629-40.

123. Oliver KR, Scallan MF, Dyson H, Fazakerley JK. 1997. Susceptibility to a neurotropic virus and its changing distribution in the developing brain is a function of CNS maturity. J Neurovirol;3:38-48.

124. Ohuchi M, Ohuchi R, Homma M. 1981.Mode of subacute sclerosing panencephalitis (SSPE) virus infection in tissue culture cells. Microbiol Immunol,225:887-893.

125. Oyanagi S, Rorke LB, Katz M, Koprowski H. 1971. Histopathology and electron microscopy of three cases of subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). Acta Neuropathol; 18:58-73.P

126. Page, N.M., Bell, N.J., Gardiner, S.M., Manyonda, I.T., Brayley, K.J., Strange, P.G., Lowry, PJ., 2003. Characterization of the endokinins: human tachykinins with cardiovascular activity. Proc Nat Acad ofSci USA 100 (10), 6245-6250.

127. Page, N. M.; Woods, R. J.; Gardiner, S. M.; Lomthaisong, K.; Gladwell, R. T.; Butlin, D. J.; Manyonda, I. T.; Lowry, P. J. 2000Excessive placental secretion of neurokinin B during the third trimester causes pre-eclampsia. Nature 405: 797-800.

128. Pak CC, Puri A, Bluementhal R. 1997. Conformational changes and fusion activity of vesicular stomatitis virus glycoprotein: 125I.iodonapthyl azid photolabelig studies in biological membranes. Biochemistry,36:8890-8896

129. Parra, B., D. R. Hinton, et al. 1999. IFN-gamma is required for viral clearance from central nervous system oligodendroglia. Journal of Immunology 162:1641-1647.

130. Pasick JM, Kalicharran K, Dales S. 1994. Distribution and trafficking of JHM coronavirus structural proteins and virions in primary neurons and the OBL-21 neuronal cell line. J Virol;68:2915-28.

131. Patacchini, R., Maggi, C.A., 2001. Peripheral tachykinin receptors as targets for new drugs. Eur JPharm 429 (1-3), 13-21.

132. Patak, E., Candenas, M.L., Pennefather, J.N., Ziccone, S., Lilley, A., Martfn, J.D., Flores, C., Manteco'n, A.G., Pinto, F.M., 2003. Tachykinins and tachykinin receptors in human uterus. Br J Pharm 139 (3), 523-532.

133. Patak, E., Pennefather, J.N., Fleming, A., Story, M.E., 2002. Functional characterization of tachykinin NK1 receptors in the mouse uterus. Br J Pharm 137 (8), 1247-1254.

134. Patak, E.N., Ziccone, S., Story, M.E., Fleming, A.J., Lilley, A., Pennefather, J.N-.,-2000b. Activation of neurokinin NK(2) receptors by tachykinin peptides causes contraction of uterus in pregnant women near term. Mol Hum Reprod 6 (6), 549-554.

135. Paterson, R. G., Russell, C. J., and Lamb, R. A. 2000. Fusion protein of the paramyxovirus SV5: destabilizing and stabilizing mutants of fusion activation. Virology 270, 17-30.

136. Patterson CE, Lawrence DM, Echols LA, Rail GF. 2002. Immune-mediated'protection from measles virus-induced central nervous system disease is noncytolytic and gamma interferon dependent. J Virol. May;76(9):4497-506.

137. Patterson JB, Scheiflinger F, Manchester M, Yilma T, Oldstone MB. 1999. Structural and functional studies of the measles virus hemagglutinin: identification of a novel site required for CD46 interaction. Virology. Mar 30;256(1): 142-51.

138. Paula-Barbosa MM, Cruz C. 1981.Nerve cell fusion in a case of subacute sclerosing panencephalitis. Ann Afewro/;9:400-403.

139. Payan D.G., 1989.Neuropeptides and inflammation: the role of substance P, Annu. Rev. Med. 40, pp. 341-352.

140. Payne FE, Baublis JV, Itabashi HH. 1969. Isolation of measles virus from cell cultures of brain from a patient with subacute sclerosing panencephalitis. N Engl J Med;281:585.

141. Pearce BD, Hobbs MV, McGraw TS, Buchmeier MJ. 1994.Cytokine induction during T cell mediated clearance of MHV from neurons in vivo. J Virol;68:5483-95.

142. Pennefather, J.N., Zeng, X.P., Gould, D., Hall, S., Burcher, E., 1993. Mammalian tachykinins stimulate rat uterus by activating NK-2 receptors. Peptides 14 (2), 169174.

143. Pennefather JN, Lecci A, Candenas ML, Patak E, Pinto FM, Maggi CA. 2004. Tachykinins and tachykinin receptors: a growing family. Life Set Feb 6;74(12):1445-63. Review.

144. Phillips, J. J., Chua M. M., 2002. Murine coronavirus spike glycoprotein mediates degree of viral spread, inflammation and virus-induced immunopathology in the central nervous system. Virology 301:109-120.

145. Pottelsberghe C, Rammohan K, McFarland H, Dubois-Dalcq M. 1979! Selective neuronal, dendritic and post-synaptic localization of viral antigen in MVinfected mice. Lab Invest, 40:99-108.

146. Power C. 2001. Retroviral diseases of the nervous system: pathogenic host response or viral gene-mediated neurovirulence? Trends in Neurosciences, Vol. 24, No. 3, March:32.ij

147. Rajcani J, Vojvodova A. 1998. The role of herpes simplex virus glycoproteins in the virus replication cycle. Acta Virol;42:103-118

148. Rail GF., 1998. CNS neurons: the basis and benefits of low class I major histocompatibility complex expression. Curr Top Microbiol Immunol.;232:115-34. Review.

149. Rail GF., 2003. Measles virus 1998-2002: progress and controversy, Annu Rev Microbiol.\51'343-61. Review.

150. Rail GF, Manchester M, Daniels LR, Callhan EM, Belman AR, Oldstone MB. 1997. A transgenic mouse model for measles virus infection of the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4659-63

151. Rail GF, Oldstone MBA. 1997. Viral persistence in the CNS In: Peterson PK. Remington JS, eds. In defense of the brain. Cambridge, MA: Blackwell Press,:273~83

152. Rail GF, Oldstone MBA. 1995. Virus-neuron-CTL interactions. Curr Top Microbiol Immunol',202:261-73.

153. Regoli, D., Boudon, A., Fauchere, J.L., 1994. Receptors and antagonists for substance P and related peptides. Pharmacological Reviews 46 (4), 551-599.

154. Regoli D, Drapeau G, Dion S, D'Orleans-Juste P. 1987. Pharmacological receptors for substance P and neurokinins. Life Sci. Jan 12;40(2): 109-17. Review.

155. Ren, R., F. Costantini, et al. 1990. Transgenic mice expressing a human poliovirus receptor: anew model for poliomyelitis. Cell 63: 353-362.

156. Rey FA, Heinz FX, Madl C, 1995. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution. Nature',375:291-298 ■ •

157. Richardson, C. D., A. Scheid, and P. W. Choppin. 1980. Specific inhibition of paramyxovirus replication by oligopeptides with amino acid sequences simialr to those at the N-terminus of the F1 or HA2 viral polypeptides. Virology 105:205-222.

158. Richardson, C. D., and P. W. Choppin. 1983. Oligopeptides that specifically inhibit membrane fusion by paramyxoviruses. Virology. 131:518-532.

159. Richardson, C. D., A. Scheid, and P. W. Choppin. 1980. Specific inhibition of paramyxovirus replication by oligopeptides with amino acid sequences similar to those at the N-termini of the F I or HA2 viral polypeptides. Virology. 105:205-222.

160. Rodriguez M, Buchmeier M, Oldstone M, Lampert P. 1983. Ultrastructural localization of viral antigens in the CNS of mice persistently infected with LCMV. Am J Pathol', 110:95-100.

161. Russell CJ., Jardetzky TS., and Lamb RA. 2001. Membrane fusion machines of paramyxoviruses: Capture of intermediates of fusion. Embo J. 20: (15) 4024-4034.

162. Saffroy, M., Torrens, Y., Glowinski J. Beaujouan, J.C., 2001. Presence of NK2 binding sites in the rat brain. Journal ofNenrochemistry 79 (5), 985-996.

163. Saffroy, M., Torrens, Y., Glowinski, J., Beaujouan, J.C., 2003. Autoradiographic distribution of tachykinin NK2 binding sites in the rat brain: comparison with NK1 and NK3 binding sites. Neuroscience 116 (3), 761-773.

164. Schaffer, M., T. Beiter, H. D. Becker, and T. K. Hunt. 1998. Neuropeptides: mediators of inflammation and tissue repair? Archives of Surgery 133:1607-1116.

165. Schendler, J., Zimmer, G., Herrler, G., and Conzelmann, K. K. 2003. Respiratory syncytial virus (RSV) fusion protein subunit F2, not attachment protein G, determines the specificity of RSV infection. J. Virol. 77, 4609-4616.

166. Schmid A, Spielhofer P, Cattaneo R., 1992Subacute sclerosing panencephalitis is typically characterized by alterations in the fusion protein cytoplasmic domain of the persisting measles virus. Virology\\%%:9\Q-9\5.

167. Schneider-Schaulies J, Dunster LM, Schneider-Schaulies S, ter Meulen V. 1995. Pathogenetic aspects of measles virus infections. Vet Microbiol. May;44(2-4):113-25. Review. >

168. Schneider-Schaulies, J., S. Niewiesk, et al. 1999.Measles virus in the CNS: the role of viral and host factors for the establishment and maintenance of a persistent infection. Neuroimmunology 5: 613-622.

169. Schneider-Schaulies J, Schnorr J-J, Schlender J, et al. Receptor (CD46) modulation and complement-mediated lysis of uninfected cells after contact with measles virus-infected cells. J Virol 1996;70: 255- 263.

170. Schneider-Schaulies S, ter Meulen V. 1999. Measles virus in the CNS: the role of viral and host factors for the establishment and maintenance of a persistent infection. J. Neurovirol. 5: 613-22

171. Schrag, S.J.Rota P.A. Bellini. W.J 1999. Spontaneous Mutation Rate of Measles Virus: Direct Estimation Based on Mutations Conferring Monoclonal Antibody Resistance. J. of Virology, Vol. 73, No. 1, p.51-4.

172. Schroeder, C. 1986. Substance P, a neuropeptide, inhibits measles virus replication in cell culture. Acta Virologica 30:432-436.

173. Sidhu MS, Crowley J, Lowenthal A, 1994. Defective measles virus in human subacute sclerosing panencephalitis brain. Virology',202:631-641.

174. Skehel, J. J., and D. C. Wiley. 2000. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu. Rev. Biochem. 69:531-569.

175. Spooren W, Riemer C, Meltzer H. 2005. Opinion: NK3 receptor antagonists: the next generation of antipsychotics? Nat Rev Drug Discov. Dec;4(12):967-75. Review.

176. Stewart-Lee, A., Burnstock, G., 1989. Actions of tachykinins on the rabbit mesenteric artery: substance P and Glp6,L-Pro9.SP6-l 1 are potent agonists for endothelial neurokinin-1 receptors. BrJPharm 97 (4), 1218-1224.

177. Stratton SC, Beresford IJ, Harvey FJ, Turpin MP, Hagan RM, Tyers MB. 1993. Anxiolytic activity of tachykinin NK2 receptor antagonists in the mouse light-dark box. Eur J Pharmacol; 250(3): R11-2.

178. Steinberg R, Marco N, Voutsinos B, Bensaid M, Rodier D, Souilhac J, 1998. Expression and presence of septal neurokinin-2 receptors controlling hippocampal acetylcholine release during sensory stimulation in rat. Eur J Neurosci; 10 (7): 233745.

179. Streilein JW. 1993. Immune privilege as the result of local tissue barriers and immunosuppressive microenvironments. Curr Opin Immunol',5:428-32.T

180. Takeuchi K, Takeda M, Miyajima N. 2002. Toward understanding the pathogenicity of wild-type measles virus by reverse genetics. Jpn J. Infect. Dis. 55: 143-9

181. Tatsuo H, Ono N, Tanaka K, Yanagi Y. 2000. SLAM (CDwl50) is a cellular receptor for measles virus. Nature 406: 893-7

182. Techaarpornkul, S., Barretto, N., and Peeples, M. E. 2001. Functional analysis of recombinant respiratory syncytial virus deletion mutants lacking the small hydrophobic and/or attachment glycoprotein gene. J. Virol. 75, 6825-6834.

183. Tourtellotte WW, Parker JA, Herndon RM, Cuadros CV. 1968. Subacute sclerosing panencephalitis: Brain immunoglobulin-G, measles antibody and albumin. Neurology', 18:117-121.

184. Tripp R.A., Dakhama A., Jones L.P., Barskey A., Gelfand E.W. and Anderson L.J., 2003. The G glycoprotein of respiratory syncytial virus depresses respiratory rates through the CX3C motif and substance P. J. Virol. 77 (2003), pp. 6580-6584.

185. Tsuchida, K., Shigemoto, R., Yokota, Y., Nakanishi, S., 1990. Tissue distribution and quantitation of the mRNAs for three rat tachykinin receptors. Eur J Biochem 193 (3), 751-757.U

186. Urbanska E, Chambers B, Ljunggren H, Norrby E, Kristensson K. 1997. Spread of measles virus through axonal pathways into limbic structures in the brain of TAP-l/ mice. J Med Virol', 52:362-9.V

187. Vincent S, Gerlier D, Manie SN. 2000. Measles virus assembly within membrane rafts. J Virol Nov;74(21):9911-5.W

188. Wekerle H, Sun D, Oropeza-Wekerle RL, Meyermann R. 1987. Immune reactivity in the nervous system: modulation of T-lymphocyte activation by glial cells. J Exp Biol, 132:43-57.

189. Watson, S. and Arkinstall S., 1994. Tachykinins. G Protein-Linked Receptor Factsbook. Academic Press: 261-270.

190. Wray S, Hoffman GE. 1983. Organization and interrelationship of neuropeptides in the central amygdaloid nucleus of the rat. Peptides; 4 (4): 525-41.

191. Wong TC, Ayata M, Hirano A., 1989. Generalized and localized biased hypermutation affecting the matrix gene of a measles virus strain that causes subacute sclerosing panencephalitis. J Virol\63:5464-5468.

192. Wickipedia, free encyclopedia web-link http://en.wikipedia.org/wiki/Substance P

193. Yanagi Y, Takeda M, Ohno S. 2006. Measles virus: cellular receptors, tropism and pathogenesis. J Gen Virol. Oct;87(Pt 10):2767-79. Review.

194. Yin HS., Wen X., and. Paterson RG, 2006. Structure of the parainfluenza virus 5 F protein in its metastable, prefusion conformation. Nature. 439: (7072) 38-44.

195. Yokota Y, Sasai Y, Tanaka K, Fujiwara T, Tsuchida K, Shigemoto R, Kakizuka A, Ohkubo H, Nakanishi S. 1989. Molecular characterization of a functional cDNA for rat substance P receptor. J Biol Chem. Oct 25;264(30): 17649-52. f

196. Young JA, Chapter 4, Fundamental Virology, 4th edition, pp. 94-95

197. Zhang Y, Lu L, Furlonger C, Wu GE, Paige CJ, 2000. Hemokinin is a hematopoietic-specific tachykinin that regulates B lymphopoiesis. Nature Immunology 1 (5), 392

198. Zilber N, Rannon L, Alter M, Kahana E. 1983. Measles, measles vaccination and risk of subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). Neurology-,33:1558-1564.Y

Информация о работе

Махортова, Нина Руслановна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.03

Диссертация

Молекулярные механизмы распространения вируса кори между нейронами мышей, экспрессирующими рецептор человека CD46+ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы