Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия рецепторов нейротрофинов в раннем эмбриональном развитии млекопитающих

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия рецепторов нейротрофинов в раннем эмбриональном развитии млекопитающих"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

ИМ. М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

Р Г Б ОД Г 7 ОКТ №6

МОШНЯКОВ Максим Викторович

ЭКСПРЕССИЯ РЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОТРОФИНОВ В РАННЕМ ЭМБРИОНАЛЬНОМ РАЗВИТИИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.00.03 -молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и в Институте биотехнологии Университета Хельсинки

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор М.Ю. Саарма

доктор химических наук, профессор В.М. Липкин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е.С. Северин

кандидат биологических ьаул, доцент Б.Л. Боейков

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 1996 г. в ^2_часов

на заседании специализированного ученого совета Д.053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан "_"_ 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

В.Н. Каграманов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В развитии и функционировании нервной системы важную роль играют белки, известные как семейство нейротрофических факторов (нейротрофины, N7). Нейротрофины отвечают за дифференцировку и выживание нейронов. Хотя первый белок этой группы - фактор роста нервов (ИОИ), был обнаружен более 40 лет тому назад, другие нейротрофины (ВБ^, ЫТ-З и ЫТ-4/5), а также их рецепторы, ТгкА, ТгкВ и ТгкС были открыты только в начале 90-х. Семейство ик рецепторов представляет собой группу трансмембранных тирозин-протеинкиназ, ответственных за связывание лиганда-нейротрофина и проведение сигнала внутрь нервной клетки. Все нейротрофины также связываются с низкоаффинным рецептором р75, но биологическая роль этого рецептора пока не ясна. Несмотря на достигнутый в последние годы прогресс в этом направлении, получены некоторые противоречивые данные, и многие вопросы продолжают оставаться открытыми. Исследование тонких молекулярных механизмов функционирования нейротрофинов, их взаимодействия с рецепторами, детальное изучение локализации !гк рецепторов проясняет всю картину в целом, а также открывает возможности терапевтического применения нейротрофинов. В связи с этим не возникает сомнений в необходимости исследований, а также в разработке новых подходов для изучения локализации ик рецепторов на уровне индивидуальных нейронов, что и явилось главной целью настоящей работы.

Цель и задачи работы

Цель данного исследования состояла в изучении эспрессии рецепторов нейротрофинов в периферической нервной системе млекопитающих (тройничный

ганглий) на ранних стадиях эмбрионального развития. Для этого предстояло выполнотъ следующие экспериментальные задачи:

1. Изолировать кДНК, кодирующие ик рецепторы, создать арсенал проб кДНК, необходимых для анализа экспрессии рецепторов.

2. Исследовать экспрессию и* рецепторов и низкоаффинного рецептора нейротрофинов (р75/1_/ШК) в тройничном ганглии на ранних стадиях эмбрионального развития. —..... . .. .

3. Детально исследовать паттерны экспрессии 1гк рецепторов на уровне одного, отдельно взятого нейрона.

Научная новизна и практическое значение работы

В настоящей работе была впервые исследована экспрессия ик рецепторов в тройничиом ганглии крысы на ранних эмбриональных стадиях. Также впервые проанализирована экспрессия более чем двух рецепторов нейротрофинов одновременно на уровне одного, отдельно изолированного нейрона. Разработанная чувствительная ЯТ-РСЯ методика открыла возможность для дифференцированного анализа каждой изолированной нервной клетки. Впервые продемонстрировано, что отдельный нейрон может экспрессировать как один, так и коэкспрессировать два или три типа 1гк рецепторов одновременно, практически во всех возможных комбинациях. Результаты работы могут найти практическое применение в медицине, при терапии нейродегенеративных заболеваний. Разработанная методика множественного анализа экспрессии генов на уровне одной клетки может быть использована практически в любой молекулярнобиологической лаборатории.

Апробация работы

Работа была апробирована на следующих конференциях: Международны« ЕМ ВО школы по молекулярной и клеточной биологии "Белки - структура, функция I

дизайн" (сентябрь 1993, о-в Спетсай, Греция) и "Посттранскрипционный контроль экспрессии у эукариот" (сентябрь 1995, о-в Спетсай, Греция), конференция по новым методам в ДНК. и РНК диагностике (апрель 1994, Сан-Франциско, США).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано и находится в печати 5 работ. Объем н структура работы

Диссертация изложена на ?уУ страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, список литературы.

Библиография включает \ 2-3 источников. Работа проиллюстрирована

-7

рисунками и -Д таблицами.

Результаты и обсуждение

1. Поиск клонов, содержащих кДНК 1гк рецепторов крысы (гк А

Для поиска кДНК икА крысы был использован фрагмент хДНК мыши длиной 464 п.н., соответствующий внеклеточному домену рецептора. Анализ 1 х 106 рекомбинантных клонов библиотеки кДНК гиппокампа крысы в ХдПО позволил выделить несколько положительных клонов. Клон, содержащий наиболее длинный фрагмент кДНК (2.3 т.п.н.), обозначенный как АЗ, был выбран для дальнейшего анализа. Вставка кДНК была выделена из X вектора и переклонирована в фагмиду ВШевспрс БК+ (5(га1а§епе, США).

Определение нуклеотидной последовательности кДНК клона A3 показало, что этот клон содержит 2371 п.н. и высокогомологичен последовательностям кДНК trk А мыши и человека. Сравнение выведенной аминокислотной последовательности с известными структурами ТгкА, а также TrkB крысы показало, что клон A3 не содержит четырех остатков цистенна, являющихся консервативными в N-концевой части молекулы, т.е. не является полноразмерным. Вскоре после определения нуклеотидной последовательности trWA вышла пубдкхгцкя (Msskin к si., 1592), откуда выяснилось, что клон A3 содержит 94% кодирующей области кДНК trkA крысы, и в нем отсутсвуют 157 п.н. в 5* участке кДНК. Схеща клона A3 показана на рисунке 1. trk В

Для поиска кДНК trkB рецептора был проведен скриниг 2x10s рекомбинантных клонов библиотеки кДНК гиппокампа крысы в ¿.ZAP (Stratagene, США) с радиоактивно меченым фрагментом кДНК мыши длиной 483 п.н. Клоны, содержащие наиболее длинные вставки кДНК (около 4 т.п.н.), были подвергнуты рестриктному анализу и просеквенированы. Проведенный анализ нуклеотидной последовательности клонов

Рис- 1 Клонированный фрагмент кДНК ¡гкА крысы. А) структура опубликованная в работе (Меакт а а1., 1992), Б) участок последовательности клонированный в данной работе.

В5 и BI показал, что они содержат вставки кДНК, кодирующие соответственно каталитическую (ТК+) и транкированную (Т1) формы trkB. В случае кДНК кодирующей каталитическую форму trkB, была обнаружена единственная точечная нуклеотидная замена (Т вместо С) в положении 527 (в координатах Middleman et al., 1991), приводящая к аминокислотной замене аланина на валин. Остается неизвестным, представлен ли выявленный вариант в геноме, либо это является артефактом, полученным в процессе клонирования. Стратегия сиквенса" клонов содержащих кДНК trkB ТК+ и trkB TI представлена на Рис. 3. trkC

Анализ 1 х 106 рекомбинантных клонов библиотеки кДНК гиппокампа крысы в XgtlO позволил выделить несколько клонов, наиболее длинный из которых, 1.2 т.п.н., был изолирован и секвенирован. Анализ нуклеотидной последовательности данного клона показал, что он кодирует большую часть внеклеточного и часть тирозинкиназного домена trkC крысы.

2. Синтез проб кДНК для ¡л situ гибридизации и анализа экспрессии trk рецепторов на уровне индивидуальных нейронов

Наиболее специфичные и достоверные результаты в радиоактивном варианте гибридизации in situ удается получить лишь при использовании антисенс мРНК. 2.1. trk А

Опыт показывает, что наиболее оптимальный размер проб для радиоактивной in situ гибридизации находится в пределах 200-500 п.н. Для этого из клона A3 в вектор pGEM4Z был субклонирован Pst \/Hird HI фрагмент из внеклеточного домена длиной 266 п.н., (нуклеотиды 325-580). Очевидно, что данная проба гибридизуется также и с мРНК Trk А изоформы, содержащей вставку из 6-ти аминокислот, поэтому она является пан-пробой.

А.)

I latg I I

О 600 1200 1800

pR —> r8419

р5947 -> с 8411

р2409 <-г8520

р2408 -->г8529

р5945 <-[8391

р5948 -> г8412

р51059->г8582

р3284 <■

I

2400

I tag 3000

I

3600

I

4200

I

4600

г8415

р51058Р<---г8581

р3285 —> Г8413

р51058 <-Г8694

р51060Р-->гв555

pSIOöO

-> r8695

р594б <----г8392

р51095<--8612

pU<----г8418

Б)

I augl 225 450

I

675

I

900

I

1125

1

1350

I

1575

I tag I 1800 2025

I

2250

I

2475

pU---> гЕ0049

р 5748F------------->г8640

p2605-

СЕ0065

p51054F

->г 8628

р511165 -

-> г8750

Рис. 3. Стратегия сиквенса клонов содержащих кДНК А) trkB ТК+ и Б) trkB Tl. "Р" -праймеры, использованные при сиквенсе. "г" - прогоны на секвенаторе ALF.

2.2. trk В

Пробы для изучения экспрессии Trk В были синтезированы с учетом того, что этот рецептор содержит несколько изоформ. Наid III/Pst I фрагмент кДНК длиной 306 п.н. (нуклеотиды 230-536), соответствующий внеклеточному участку молекулы рецептора, был субклонирован в pGEM4Z вектор. Данная проба распознает как каталитический

вариант рецептора, так и его транкированные формы и является, таким образом, пан-пробой. С целью различить, с каким именно транскриптом trk В гибридизуется наша проба, с помощью RT-PCR был синтезирован фрагмент кДНК длиной 150 п.н., соответствующий нуклеотидам 1357-1507 (Middlemas et al., 1991), комплементарный участку последовательности, кодирующей внутриклеточный тирозинкиназный домен. Синтезированная проба гибридизуется только с ТК.+- -формой trk В. Также с помощью RT-PCR были синтезированы фрагменты к ДНК trkB Т1 длиной 201 пар нуклеотидов и trkB Т2 (167 п.н.) изоформ, представляющие фрагменты 1343-1545 и 1343-1509 Т1 и Т2 форм, соответственно. Данные пробы были .затем клонированы в PCR-II вектор (Invitrogen, США). 2.3. trk С

Фрагмент к ДНК длиной 200 пар нуклеотидов, соответствующий положениям 562762 trk С крысы (Merlio et al., 1992), (пан-проба, соответствующая внеклеточному домену рецептора) был синтезирован с помощью RT-PCR. С целью детектировать каталитические формы trk С, 245 п.н. фрагмент к ДНК (2308-2552 , Merlio et al., 1992) был RT-PCR амшшфицирован и клонирован в PC Ri I вектор. Схема trk проб представлена на Рнс.4. Синтезированные пробы кДНК рецепторов нейротрофинов соответствуют тем районам молекул, где уровень гомологии между trkA, trkB и trkC находится на достаточно низком уровне (55-60%) и, соответственно, отсутствует риск кросс-гибридизации. Тем не менее, специфичность проб была проверена методом Нозерн-блотгинга, и сигналов кросс-реактивности обнаружено не было. 3. Изучение локализации trk рецепторов методом ш situ гибридизации в тройничном ганглии

Тройничный ганглий является удобной и хорошо изученной моделью для изучения роли нейротрофинов и их рецепторов при раннем нейрогенезе. В нашей лаборатории

установлено, что на стадии десятого эмбрионального дня (ЕЮ) первые аксоны начинают свой рост в сторону иннервируемой ткани, которой в данном случае является максиллярный эпителий. Во время Е10-Е11 аксоны растут в сторону

500

1000

1500

2000

2500

3000 bp _J_

trkA

tifcB-рап

tricB-TK+

trkB-Tl

trkB-T2

trkC-

pan

tricC-TK+

0

Рис. 4. Схема синтезированных кДНК проб к trk рецепторам. Прокпонированные фрагменты выделены черными прямоугольниками.

максилпы, и в конце Е12 первые аксоны достигают максиллярного эпителия. После этого начинается массивный синаптогенез. Этот процесс сопровождается апоптотической гибелью значительного количества нейронов. Нас интересовало, какие рецепторы нейротрофинов экспрессируюгся нейронами тройничного ганглия до, во время и после иннервации клеток-мишеней. Это особенно важно потому, что рецепторы нейротрофинов определяют специфичность действия NT. Для решения этой задачи мы использовали методы in situ гибридизации и RT-PCR на уровне индивидуальных нейронов. В то же время в лаборатории исследовалась экспрессия

ЫТ в этой же системе, а также эффект разных нейротрофинов на вырост нейритов у нейронов эмбрионального тройничного ганглия.

Тгк А Сильная экспрессия 1гк А транскриптов обнаружена в тройничном ганглии на стадии (ЕЮ), (Рис. 5,0. Е11 (данные не показаны на рисунке), а также на стадии 12-го эмбрионального дня (Рис. б, Ь).

ТгкВ На стадии ЕЮ детектирована экспрессия 1гкВ мРНК при использовании пан-пробы (Рис. 5,Ь). Видно, что позитивными являются отдельные небольшие группы нейронов ганглия. На Е11 и Е12 стадиях видна сильная экспрессия транскриптов №кВ в тройничном ганглии. (Рис. 6,с).

С целью различить, какие конкретно формы транскриптов ц-кВ экспрессируются, Е12 срезы были прогибридизованы с сответствующими специфическими пробами. Результаты показаны на рисунке 7ЬД Уровень экспрессии каталитической формы икВ в тройничном ганглии является гораздо болеее сильным, чем уровень экспрессии транкированной (Т1) формы.

ТгкС Слабый уровень экспрессии транскриптов 1гкС был детектирован на ЕЮ и Е11 стадиях в отдельных группах нейронов. На стадии 12-го эмбрионального дня отмечен высокий уровень экспрессии мРНК 1гкС (Рис. 6, (1).

р75 Экспрессиия р75 была детектирована в тройничном ганглии и в макссиллярной мезенхиме на стадиях ЕЮ-Е12 (Рис. 5с, бе, 7е).

Обобщенные результаты анализа экспрессии мРНК всех Кк рецепторов и р75 в тройничном ганглии представлены в Таблице 1.

Присутствие всех трех ик рецепторов в тройничном ганглии, а также всех четырех нейротрофинов (Агитае е1 а1., 1993; ЕгпГоге е1 а!.. 1992; 1Ьапез е1 а1„ 1993) в иннервируемых тканях предполагает, что отдельные нейроны могут функционально

Рис. 5. Экспрессия мРНК рец«тгоров нейротрофинов на стадии ЕЮ в тройничном ганглии. Сагиттальные срезы были прогибркдизованы с кРНК пробами к пан-икВ (Ь), ЬАНЯ/р75 (<1) и ИкА (0. Микрографии а, с, и е соответствуют микрографиям в темном поле Ь, Л и Г, соответственно. Транскрипты 1гкВ экспрессируются в нескольких участках мезенхимы, но только небольшие группы клеток детектированы в тройничном ганглии (показано стрелкой), тх - первая жаберная дуга, оу - слуховой пузырек.

Рис. 6. Экспрессия м PH fC рецепторов нейротрофинов в тройничном ганглии на стадии Е12. Сагиттальные срезы тройничного ганглия были прогибридизованы с кРНК пробами к trJcA (Ь), пан-trkB (с), trkC (d) и LANR/p75 (е). Микрография а соответствует микрографиям в темном поле (Ь - е). Срез проходящий через голову крысы на стадии Ell прогибридизован с сенс рибопробой trkC (0- Экспрессия LANR/p75 в области максиллярного и мандибуллярного нерва (е), показано стрелками.

Рис. 7. Экспрессия мРНК (гкВ и р75 (ЬАЫЯ) в тройничном ганглии на стадии Е12. Сагиттальные срезы тройничного ганглия и первой жаберной дуги были прогибридизованы с кРНК пробами к каталитической форме икВ (КкВ-саО (Ь), Т1-транкированной формы О-кВ (й) и 1АЫЯ/р75 (0- Микрографии а, с, и е соответствуют микрографиям в темном поле Ь, (1 и Г, соответственно. Экспрессия 1_АЫЯ/р75 в области максиллярного и мандибуллярного нерва (0, показано стрелками. Детектирована экспрессия 1гкВ-Т1 транскриптов в мезенхиме головной части среза (с1). tg - тройничный ганглий, шй - вторая жаберная дуга.

ЕЮ

Ell

Е12

Тройничный ганглий

trkA

pan-trkB

trkB-Tl

trkB-catalytic

trkC

LANR

+ 4-+ + + +

4- + +

ND ND

ND ND

+ + +

+ + +

+ + + + + +

+ + + + + + + + +

+

Таблица 1. Экспрессия мРНК trkA, trkB, trkC и p75 (LANR) в тройничном ганглии на стадии Е10-Е12. Степени экспрессии: +, слабый сигнал экспрессии; ++, умеренный; +++, сильный. ND - экспрессию на данной стадии не анализировали.

отвечать на более чем один нейротрофин, и соответственно экспрессировать более чем один Trk рецептор.

Как было сказано выше, данные гибридизации in situ говорят о том, что индивидуальные нейроны могут экспрессировать несколько рецепторов одновременно. Этот вопрос является принципихпьно важным, так как экспрессия одного или нескольких рецепторов в одном нейроне предопределяет их биологический ответ на нейротрофины. Кроме того, данные о том, могут ли отдельные нейроны экспрессировать один или несколько рецепторов нейротрофинов, полностью отсутствовали. В следствие этого, экспрессию мРНК trk рецепторов изучали на уровне отдельных клеток более детально.

4. Исследование экспрессии trk рецепторов на уровне индивидуальных тройничных нейронов

4.1. Разработка RT-PCR методики, позволяющей анализировать экспрессию нескольких генов одновременно в одном нейроне

Методы in situ гибридизации и иммуногисгохимии не позволяют одновременно анализировать экспрессию нескольких NT-рецепторов в отдельных индивидуальных нейронах: локализация мРНК. в отдельных клетках в случае радиоактивной in situ гибридизации затруднена из-за большого размера гранул фотоэмульсии, что приводит к расплыванию сигнала на соседние нейроны; в настоящее время отсутствуют антитела, способные удовлетворительно распознать все три Trk рецептора методом иммуногисгохимии. Однако, нейрон может экспрессировать мРНК трех trk рецепторов, а также и р75. С целью решения этой проблемы в данной работе была разработана чувствительная RT-PCR методика, позволяющая анализировать экспрессию всех рецепторов нейротрофинов одновременно в изолированных отдельных нейронах. Схема методики представлена на рисунке 8. Цитоплазму культивируемых нейронов с помощью микроманипулятора под микроскопом всасывхи! в микрокапилляр, и вслед за этим немедленно проводили реакцию обратной транскрипции и PCR. Первая цепь кДНК должна пропорционально соответствовать исходному пулу всех мРНК клетки. Было определено, что оптимальным, если не единственно возможным способом достижения этого, является использование рассеянной затравки (был использован гексамер), тогда как использование специфических и олиго-(сГГ) прай.меров приводит к предпочтительной обратной транскрипции определенных мРНК, в то время как другие остаются неревертированны.чи в полной мере. Во многих случаях, особенно в начальных опытах, не было зарегистрировано никаких продуктов амплификации - видимо, из-за

потери мРНК в процессе экстракции цитоплазмы. Поэтому до анализа рецепторов нейротрофинов образцы кДНК проверяли на присутствие мРНК легкой цепи нейрофиламента (NF-L) с целью исключения возможности потери нейрональной мРНК на начальных стадиях анализа. PCR праймеры были синтезированы таким образом, что они попадали в различные экзоны, с целью распознать или вовсе исключить амплификацию геномной ДНК. В случае NF-L праймеры были синтезированы на экзоны 1 и 2 (Reeben et al., 1995). Для генов trk рецепторов экзон-интронная организация пока не определена, поэтому в каждом отдельном случае праймеры предварительно тестировали на амплификации геномной ДНК. В качестве положительного контроля использовали кДНК из мозга, а также кДНК тотального тройничного ганглия на стадии Еж2 и Е16. Во всех тестах с кДНК были получены продукты амплификации ожидаемой длины, при этом с геномной ДНК амплификация не происходила. Особое внимание было уделено исключению возможности получения ложных положительных сигналов. В качестве положительного контроля во всех экспериментах была использована кДНК мозга крысы, содержащая кДНК всех рецепторов нейротрофинов. Во всех экспериментах были получены фрагменты амплификации правильной длины (Рис. 10,"Вг";Рис. 11,"Вг"). кДНК клеток РС12, экспрессирующих trk А, но не экспрессируюших trkB и trkC, также была включена в каждом опыте (Рис. 11,"PC"). Во всех случаях амплификации кДНК материала клеток РС12 были получены положительные результаты, тогда как в случаях trkB и trkC амплификация не была детектирована. Во всех случаях не наблюдалось продуктов амплификации при использовании в качестве отрицательного контроля воды либо культурапьной среды клеток вместо кДНК (Рнс. 10,"\V; Рис. 7,"Г).

В качестве дополнительного контроля были протестированы также SCG (superior cervical ganglion) симпатические нейроны, экспрессирующие преимущественно TrkA, и в некоторых случаях небольшие количества ТгкВ и TrkC (Dixon & Kinnon, 1994;

Aspiration of Reverse Amplification Amplification

the cytoplasm transcription by PCR by PCR

Neuronal culture Southern blotting Southern blotting

Рис. 8. Схематическое представление ЯТ-РСЯ анализа мРНК 1гк рецепторов в индивидуальных тройничных нейронах. Только те образцы, с которыми были получены положительные сигналы в тесте на присутствие ЫИ-Ц были отобраны для дальнейшего анализа

КоЬауазЫ е1 а1., 1994). Одиннадцать симпатических нейронов были отобраны и проанализированы в тел же условиях, что и тройничные нейроны. Все образцы были »кА положительными, тогда как сигнал 1гкВ был детектирован только в одном нейроне (иейрок 2, Рис. 9); и ни в одном случае не было обнаружено нейронов, экспрессируюших икС. В качесте отрицательного контроля были протестированы отдельные клетки ЗТЗ фибробластов, и ни в одном случае экспрессия Сгк рецепторов

не проявлялась (Рис. 9). Таким образом, разработанная методика является достоверной и позволяет специфически выявить транскрипты рецепторов нейротрофинов в одиночных нейронах.

4.2. Анализ экспрессии и коэкспрессии рецепторов иейротрофинов в отдельных нейронах

На рисунке (Рис. 10) показан типичный пример отбора позитивных образцов. В данном случае 5 из 10 взятых образцов являются ИБ-Ь положительными, они и были использованы для дальнейшего анализа. В среднем, половина взятых образцов нейронов давала положительный результат при анализе экспрессии N^1-

SCG 1 2 3 4

ЗТЗ . 12 3 4

trkA

"'■l'^Wi-

trkB4

trkC 'ШШ^

Рис. 9. Детекция trVA, WkB, и trkC мРНК. в отдельных SCG симпатических нейронах к а стадии Р2, к в отдельных ЗТЗ фибробластах. Под номерами 1, 2, 3, 4 показаны отдельные SCG симпатические нейроны и отдельные ЗТЗ клетки.

NF-L положительные образцы анализировали с помощью PCR на наличие мРНК рецепторов нейротрофинов. Типичный результат такого анализа представлен на

рисунке 11. В этом случае 13 нейронов были проанализированы на экспрессию икА, 1гкВ и 1гкС транскриптов; рддиоавтографию проводили в течение 16 часов. С целью детекции продуктов амплификации меньшей интенсивности, радиоавтографию проводили более продолжительное время, вплоть до нескольких недель. Ряд "1гкВ*" на Рис. II показывает сигнал, полученный после двух недель экспозиции. Нейроны 3 и 8 остались негативными, тогда как 4, 7, 10 и 12 являются позитивными после продолжительной экспозиции. В ряду "сгкС" нейроны 2, 3, 4, 7 и 8 также проявляют себя как позитивные после продолжительной эспозиции, тогда как нейрон 13 остается негативным. Все нейроны, проанализированные в этом эксперименте, содержат мРНК более чем одного 1гк. Количественная оценка уровня экспрессии не проводилась, поэтому полученные данные я&пяются качественными - по принципу

I Я >11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 \Л/Вг

Рис. 11. ЯТ-РСЯ отбор НИ-!, положительных образцов из тройничных нейронов стадии Е16. Номера дорожек соответствуют отдельно изолированным и проанализированным образцам. "\У"- амплификация с водой в качестве контроля, "Вг"- сигнал кДНК мозга.

"все или ничего". Обобщенные результаты анализа экспрессии икА, икВ и икС транскриптов в изолированных ЫР-Ь позитивных тройничных нейронах на стадии Е12 и Е16 представлены в Таблице 2. 22 нейрона в случае Е12 и 24 нейрона в случае Е16 были успешно изолированы. На обеих стадиях были обнаружены нейроны, коэкспрессирующие мРНК для двух или трех рецепторов 1гк семейства. В некоторых

нейронах были зарегестрированы мРНК только одного из 1гк. Два нейрона не содержали мРНК ни одного из (гк, несмотря на то, что образцы были Ыр-Ь позитивными. Результаты, представление в Таблице 2, не являются количественными и, по всей видимости, не отражают всех возможных соотношений коэкспрессии »к рецепторов во всех тройничных нейронах. Целью в данном случае было проанализировать возможность существования экспресии мРНК для более чем одного 1гк рецептора. На основании полученных данных нельзя исключить возможность экспрессии нейронами только (гкА на стадиях Е12 и Е16, так как вполне вероятно, что эти варианты не были "пойманы" в эксперименте. Тем не менее, было обнаружено больше нейронов, экспрессирующих мРНК нескольких типов 1гк, чем только одного

Г

1 23456789 10111213 WPCBг

икА

1гкВ

тс

1 2345678 910111213УУРС8г

Рис. П. Детекция икА, 1гкВ и икС мРНК в отдельных тройничных нейронах на стадии Е16. В данном эксперименте 13 нейронов проанализированы одновременно на экспрессию мРНК икА, (гкВ и икС (номера 1-13). Сигналы экспрессии 1гкА, ЫсВ и 1гкС соответствуют друг другу в вертикальных колонках. Ряд ИкВ* соответствует ряду СгкВ посте переэкспозиции в течение двух недель.

из trk. В тех случаях, когда после анализа trk рецепторов оставалось достаточное количество материала, производили также анализ транскриптов р75. В общей сложности, девять нейронов было проанализировано на стадии Е12 и десять - на стадии Е16. Результаты такого анализа представлены в Таблице 3.

trk рецептор E12 E16

(n = 22) <n =

trkA 0 . 0

trkB 0 3

trkC 0 4

trkA/trkB 1 1

trkA/trkC 1 1

trkB/trkC 11 11

trkA/trkB/trkC 9 2

ни одного из trk 0 2

Таблица 2. Комбинации экспрессии/коэкспрессии мРНК рецепторов семейства Тгк в Е12 и Н16 нейронах тройничного ганглия. Показано число нейронов из общего количества, проанализированного на данной стадии (п).

В восьми случаях р75 был детектирован вместе с ик рецепторами, в девяти случаях 1гк представлены без р75, в одном нейроне р75 был обнаружен без какого-либо ик, и в двух случаях не было детектировано ни р75, ни какого-либо из 1гк. Следует отметить, что эти результаты дают только качественную характеристику определенных

паттернов экспрессии рецепторов и не определяют, какая часть тройничных нейроновпредставляег определенный тип коэкспрессии.

Нейроны, экспрессйруюшие несколько Тгк рецепторов, в принципе, должны функционально отвечать на более чем один нейрсгтрофин. Как отдельный нейрон может отвечать на несколько факторов? Эксперименты по аддитивному влиянию Е12 Е16

(п=9) (п=10)

trkB/trkC/p75 I trkC/p75 . 1

trkA/trkB/trkC/p75 2 tricA/trkB/p75 1

trkB/trkC/p75 3

нет trk/ p75 1

trkA/trkB/кет p75 l trkB/кет p7S 2

trkB/trkC/нет p75 5 нет trk/нет p75 2

Таблица 3. Коэкспрессия trk и p75 мРНК в тройничных нейронах на стадии Е12 и Е16.

показывают, что, по крайней мере, отдельные тройничные нейроны могут поддерживаться несколькими факторами одновременно (Buchman & Davis, 1993; Ibdnez et al., 1993). Также предположено, что для сенсорных нейронов, иннервирующих много тканей, одного нейротрофина может быть не достаточно, чтобы преодолеть необходимый для выживания критический уровень (Davies et al., 1986). Как было показано в работах (Ammäe et ah, 1993; Ernfors et ah, 1992; Ibäfiez et al., 1993), мРНК NGF, BDNF, NT-3 и NT-4/5 экспрессируются в максиллярном и мандибулярном эпителии (являющихся мишенями тройничных нейронов). При

иннервации этих тканей, начиная со стадии Е11 конус роста аксона нервной клетки неизбежно попадает в окружение всех четырех нейротрофинов. Выяснилось, что разные пары нейротрофинов могут иметь противоположные эффекты на рост аксона в нейральной культуре тройничного ганглия (Paves et al., 1995). Так, BDNF и NT-4/5 обладали ретрактивным эффектом для NGF- и NT-3- зависимых нейронов, другие комбинации двух нейротрофинов обладали аттрактивным действием. Обладая рецепторами для нескольких нейротрофинов, конус роста аксона в результате притяжения-отталкивания может найти верный объект иннервации в поле нескольких нейротрофинов. Кроме того, тройничный, нейрон может контактировать с несколькими клетками-мишенями, синтезирующими разные факторы, если окончания аксона экспрессируют несколько Trk рецепторов.

Взаимодействие нейротрофина с клеткой, экспрессирующей несколько Trk рецепторов, может быть довольно сложным. Действительно, NT-3 активирует все три Trk рецептора в культуре эмбриональных сенсорных нейронов (Davies et al., 1995). Какие из Trk рецепторов действительно активируются NT-3 в процессе развития in vivo, остается неизвестным. Кроме того, нельзя исключить возможность образования функциональных Trk гетеродимеров (Jungbluth et al., 1994). Если это имеет место в действительности, то это значительно усложняет эффект нейротрофина на нейрон.

Разработанная и использованная нами методика анализа экспрессии trk мРНК является единственной на сегодняшний день возможностью показать присутствие многих рецепторов в одном нейроне одновременно. Анализ экспрессии Trk рецепторов на уровне белка в индивидуальных нервных клетках является предметом дальнейших иследований.

Выводы

1. Из клонотек кДНК гиппокампа крысы выделены и секвенированы полноразмерные клоны каталитической формы и Т1 транкированной формы trkB, а также клоны, кодирующие большую часть молекул trkA и trkC. Методами молекулярного клонирования и PCR синтезированы пробы кДНК к разным изоформам и функциональным доменам trk рецепторов для анализа их экспресии.

2.' Методом in situ гибридизации охарактеризована экспрессия мРНК trk и р75 рецепторов в системе тройничного ганглия во время иннервации максиллярного процесса. Впервые установлено, что все рецепторы экспрессируются в преиннервированном тройничном ганглии до иннервации ткани-мишени. р75 рецептор кроме нейронов экспрессируется в иннервируемой ткани. мРНК транкироаанных форм trkB рецептора также экспрессируются в нейронах и в иннервируемой ткани.

3. Разработана RT-PCR методика, позволяющая анализировать экспрессию одновременно нескольких генов в одном нейроне.

4. Впервые установлена экспрессия и коэкспрессия мРНК trkA, trkB, trkC и р75 в тройничных нейронах на стадии Е12 и Е16.

5. Впервые показано, что отдельные нейроны могут экспрессировать один, два, а также все три trk рецептора одновременно.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Ylikoski, J., Pirvola, U., Moshnyakov, M., Palgi, J., Arumae, U., Saarma, M. Expression patterns of neurotrophin and their reccptor mRNAs in the rat inner ear. Hearing Research, 1993. v.65. p. 69-78.

Z Arumae, U., Pirvola, U., Palgi, J., Kiema,T.-R„ Palm, K., Moshnyakov, M., Ylikoski, J., Saarma, M. Neurotrophins and their receptors in rat peripheral trigeminal system during maxillary nerve growth. / Cell. Biol., 1993, v,122,p.l053-1065.

3. Pirvola, U., Arumae, U., Moshnyakov, M., Palgi, J., Saarma, M., Ylikoski, J. Neurotrophins and their receptors are coordinately expressed in the developing rat inner ear before and during target innervation. Hearing Research, 1994, v.75, p. 131-144.

4. Saarma. M., Pirvola, U., Palgi, J., Moshnyakov, M., Arumae, U., Ylikoski. J. Expression of neurotrophic factors and their receptors in developing rat inner ear. Clinical Chemistry and Enzymology Communications, 1993, v.5, p. 303-308.

5. Moshnyakov, M„ Arumae, U., Saarma, M. mRNAs for one, two or three members of trk receptor family are expressed in single rat trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research, 1996, v._, p._.