Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы межвидовых барьеров в передаче прионного состояния у дрожжей

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы межвидовых барьеров в передаче прионного состояния у дрожжей"

На правах рукописи

4849081

АФАНАСЬЕВА Евгения Георгиевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МЕЖВИДОВЫХ БАРЬЕРОВ В ПЕРЕДАЧЕ ПРИОННОГО СОСТОЯНИЯ У ДРОЖЖЕЙ

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

9 11 ЮН 2011

Москва 2011

4849081

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Кушниров Виталий Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Колб Вячеслав Адамович кандидат биологических наук Каменский Пётр Андреевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «24» июня 2011 г. в // — часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « 7?. » мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Некоторые белки человека и животных, растворимые в норме, могут иногда полимеризоваться и накапливаться в виде внутри- или внеклеточных агрегатов или бляшек, что приводит к болезни. У человека известно более 30 белков, образующих такие агрегаты, называемые амилоидами. Амилоидные болезни, или амилоидозы, не поддаются лечению. Они широко распространены, и их встречаемость возрастает с увеличением возраста. К их числу относятся, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Амилоидозы в большинстве случаев неинфекционны, за исключением прионных болезней, связанных с белком РгР.

Прионные агрегаты РгР представляют уникальный пример инфекционного агента без генетической программы в виде ДНК или РНК. Прионные болезни редки, однако недавняя эпизоотия губчатой энцефалопатии коров в Великобритании нанесла многомиллиардный урон экономике, и поставила под угрозу жизни людей в связи с возможностью передачи этого заболевания человеку при употреблении в пищу говядины. Следует отметить, что межвидовая передача прионов обычно затруднена или невозможна, что удивительно ввиду небольших видовых отличий в последовательности прионного белка. Поэтому изучение барьеров в межвидовой передаче прионной инфекции важно и для медицины, и для понимания общих свойств прионов.

Имеющиеся в литературе данные по изучению передачи прионного состояния между разными видами млекопитающих ограничиваются в основном фактами существования прионных барьеров, однако об их молекулярных механизмах почти ничего не известно. Прионы дрожжей ЗассИаготусех являются удобной моделью для изучения молекулярных процессов, лежащих в основе межвидовых прионных барьеров. При этом наиболее информативным является использование прионогенных белков из близкородственных видов дрожжей, степень гомологии которых сопоставима с таковой для белков РгР млекопитающих. Использование близкородственных прионогенных белков 11ге2 позволило воспроизвести все основные закономерности прионной передачи у млекопитающих, хотя молекулярные основы событий, происходящих при межвидовой прионной передаче, выявлены не были (ЕсккеБ е1 а1., 2009).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение механизмов межвидовых барьеров в передаче прионного состояния между близкородственными белками 8ир35 в дрожжах 5'. сегеушае. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность передачи различных вариантов прионного состояния

Sup35 S. cerevisiae гибридным белкам Sup35 с прионными доменами из близкородственных видов дрожжей.

2. Охарактеризовать физическое взаимодействие (кополимеризацию) этих белков с прионной формой белка Sup35 S. cerevisiae.

3. Выявить области гетерологичных прионных доменов Sup35, ответственные за барьер в передаче приона [Р5Г].

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе были изучены и определены количественно (1) возможность передачи прионного состояния между близкородственными белками Sup35, (2) способность гетерологичных белков Sup35 нарушать поддержание исходного приона, и (3) способность гетерологичных белков Sup35 кополимеризоваться с прионными фибриллами Sup35 S. cerevisiae. Способность гетерологичных Sup35 препятствовать поддержанию приона была обнаружена в данной работе, и является важным проявлением взаимодействия белков. Впервые было показано, что передача амилоидной полимеризации между родственными прионогенными белками может происходить без передачи прионных свойств. Анализ полученных данных позволил восстановить подробную картину молекулярных событий, приводящих к барьеру в передаче прионов и к дестабилизации исходного приона, причем сценарии взаимодействия белков в существенной мере зависели от белка Sup35 и от варианта [PSI*]. Это позволило заключить, что: (1) причиной барьера является в одних случаях неспособность гетерологичных белков Sup35 кополимеризоваться, а в других - кополимеризация без передачи прионных свойств, то есть способности к наследованию. Причиной дестабилизации приона было образование неприонных амилоидов и/или блокирование прионной полимеризации гетерологичными белками Sup35. В работе были также определены области гетерологичных прионных доменов Sup35, ответственные за барьер в передаче прионного состояния.

Апробация работы. Результаты работы были апробированы на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РНКПК МЗ и CP РФ (15.04.2011), а также представлены на международной конференции Жака Моно CNRS (2010, Роскофф, Франция), международном конгрессе "Yeast, an evergreen model", (2010, Рим, Италия), II междисциплинарном микологическом форуме (2010, Москва), международном симпозиуме по структуре амилоидных фибрилл и механизме образования амилоидов, (2009, Галле, Германия), 24-й международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (2009, Манчестер, Англия), V съезде ВОГИС (2009, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 6 тезисных сообщений.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на ¡¡Ç страницах и включает 21 рисунок, 8 таблиц и список литературы, содержащий 102 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы S. cerevisiae и Е. coli. В работе были использованы штаммы дрожжей: 22 V-Н63Д5 (МАТа ura3-52 leu2-3,112his3-A200 ade2-l SUQ5 Asup35::TRPl [PSI'] или [рл]) (Shkundina et al„ 2006), 74-D694AS (MATa ura3-52 Ieu2-3,U2 his3-A200 adel-14 Asup35::TRPl [psi] [PIN*] pRS313-3ATG) (Alexandrov, et al. 2008). Для молекулярного клонирования использовали штамм Е. coli DH5a [supE44 Дlac U169 ((¡>80 lacZAMIS) hsdRXl recAXendAl gyrA96 thi-l relA 1 ] (Sambrook et al. 1989).

Генетические методы. Трансформация микроорганизмов. В работе применяли стандартные методики генетики дрожжей (Sherman et al., 1986). Трансформацию дрожжей S. cerevisiae проводили согласно Gietz et al. (2002) с небольшими изменениями. Трансформацию Е. coli DH5a (Sambrook et al., 1989) осуществляли в соответствие с методом Inoue et al. (1990). Для выявления детерминанта [PST] использовали генетические системы, основанные на супрессии мутаций ade2-l и adel-14, позволяющие определить наличие детерминанта [PST] визуально по цвету колоний. Клетки [psi], т.е. не содержащие [PST], не растут на среде, не содержащей аденин, и имеют красный цвет колоний на полной среде. Колонии клеток [PSF] имеют розовый или белый цвет в зависимости от варианта [PST] и растут при отсутствии аденина в среде.

Конструирование плазмид и другие генно-инженерные манипуляции. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli и конструирование плазмид проводили в соответствии со стандартным протоколом Sambrook et al. (1989). Нуклеотидные последовательности, кодирующие N-концевые прионные домены белков Sup35 четырёх видов дрожжей рода Saccharomyces: S. paradoxus, S. mikatae, S. bayanus и S. kudriavzevii, амплифицировали методом ПЦР из геномной ДНК соответствующих видов дрожжей. Эти виды дрожжей были получены от проф. Г.И. Наумова из коллекции РосНИИ Генетика. Первичная структура белков Sup35 S. bayanus, S, mikatae и S. paradoxus была получена из белковой базы данных, нуклеотидная

последовательность участка гена SUP35 S. kudriavzevii, кодирующая прионный домен, была определена в настоящей работе (номер в базе данных NCBI - JF715427). Вставку последовательности AACTACCAG, кодирующей аминокислотную последовательность NYQ, в ген SUP35-kud осуществляли путём ПЦР.

Белковый гель-электрофорез, иммуноблоттинг. Электрофорез денатурированных белков в полиакриламидном геле проводили согласно Laemmli (1970). Для оценки наличия и размера прионных полимеров был использован электрофоретический подход SDD-AGE (Kiyndushkin et al., 2003). Для разделения полимерной и мономерной форм белка Sup35 в одном геле метод электрофореза по Laemmli (1970) был модифицирован согласно Shkundina et al. (2006). Для анализа белков методом иммуноблоттинга после проведения электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали либо с поликлональными кроличьими антителами против N и М доменов Sup35, либо с моноклональными мышиными антителами против ЗНА тэга, а затем с видоспецифичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, активность которой проявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура гибридных белков Sup35. Чтобы исследовать механизмы межвидовых барьеров в передаче прионного состояния в дрожжевой модели, мы сконструировали набор генов SUP35, кодирующих гибридные белки Sup35 с N-концевыми прионными доменами из белков Sup35 следующих видов дрожжей рода Saccharomyces: S. mikatae, S. kudriavzevii, S. paradoxus и S. bayanus. В этих белках M участок и С-концевой домен, участвующий в терминации трансляции, были общими и происходили из белка Sup35 S. cerevisiae (рис. 1). Тем самым мы исключили влияние неприонных участков белка Sup35 на его прионные свойства. Это влияние невелико, и его исключение позволило существенно уменьшить изучаемую область. Для изучения взаимодействия гибридных Sup35 с прионными полимерами был создан дополнительный набор гибридных генов SUP35 с последовательностью, кодирующей ЗНА тэг в С-концевой части неприонного М домена Sup35, что позволило отличать гибридные Sup35 от Sup35 S. cerevisiae по электрофоретической подвижности и по ЗНА антигену.

А

Cer 1 MSDSNQGNNQQNYQQYSQNGNQQQGNNRYQGYQAYNAQAQ-PAGC^fYQNYQGYSGYQQGGY-

Kik ............-p....................--.S.H.............AF-

Kud ...........— . .G..P.......К............-. .N........FA.......I

Par ...........S....G..S..................S.J..................S.Bay . ..P...............F.......KF...........Q........P...A.......D

Cer 61 QQYNPDAGYQQQYNPQGGYQQYNPQGGYQQQFNPQGGRGNYKNFHYNNKLQGYOAGFQPQ

Mlk .....E.................S.................Q.I. ..S.I..........

Kud ...DR...S.............P..E.....S..........S......V..........

Par ..H....................L.........................A..........

Bay - -F. .E........A. . r--~.....................S...S..Q-.F.

Sup35 S. cerevisiae

I 124 254 <85

1 V

| Л . JV1

I mikatae 89% /\

I kudriavzevii 85% ЗНА

| paradoxus 94%

78%

Рис. 1. А. Сравнение аминокислотных последовательностей прионных доменов белков Sup35 S. cerevisiae, S. mikatae, S. kudriavzevii, S. paradoxus и S. bayanus. Точками показаны аминокислотные остатки, идентичные последовательности Sup35 S. cerevisiae. Различия в последовательности обозначены в однобуквенном аминокислотном коде. Делеции обозначены знаком «-».

Б. Схематическое изображение гибридных белков Sup35. Дополнительный набор белков содержал ЗНА тэг, после 251 аминокислотного остатка. Напротив каждого гетерологичного прионного домена показан уровень его гомологии с соответствующим доменом Sup35-cer (для простоты подсчёта вставки, делеции и замены аминокислотных остатков считали равными).

В дальнейшем, гибридные гены SUP35 и кодируемые ими белки называются с добавлением суффикса из первых трех букв вида дрожжей, из которого произошел прионный домен. Например, ген SUP35-cer или белок Sup35-mik.

Гибридные белки Sup35 способны переходить в прионное состояние в клетках S. cerevisiae. Понятие межвидовых барьеров на пути передачи прионного состояния имеет нетривиальный смысл лишь в том случае, если гибридные белки Sup35 способны самостоятельно поддерживать прионное состояние в клетках S. cerevisiae. Для определения такой способности в клетках [psi ] штамма 22V-H63AS плазмида с геном SUP35 S. cerevisiae была заменена на плазмиды с соответствующими гибридными генами SUP35, после чего индуцировали возникновение прионного состояния гибридных белков Sup35 путём их сверхпродукции. Все гибридные белки

были способны принимать прионное состояние. Надо отметить, что [РХГ] на основе гибридных белков Бир35 различались по своей стабильности (табл. 1).

Sup35-X

Sup35-mik

Sup35-kud

Sup35-par Sup35-bay

Количество проаналированных

изолятов

15

И

18

_Изолят [P51/ ] и его стабильность, %

слабый 1 слабый 2

О

2 (0%)

^ (0%)

1 (0%)

6 (5,2 — 7,2 %)

6(1,7 — 4,3%)

5 (1,2-5,9%) 3 (3,3 — 6,1 %)

9(12,8 — 22,1%)

_ 1(9,2%) _ 2 (8,3 — 9,7 %) 14(9,5—15.1)

Таблица 1. Сравнение стабильности [.P-ST] на основе различных гибридных Sup35. [PST1"] на основе белков Sup35-mik и Sup35-bay были преимущественно слабого типа.

Разнообразие вариантов является одним из фундаментальных свойств прионов. Оно связано со способностью прионного белка приобретать различные стабильно наследуемые прионные конформации. Для сильных вариантов [PSF] характерна эффективная супрессия нонсенс мутации ade2-l и белый цвет колоний из-за следующих взаимосвязанных свойств: низкой концентрации свободного белка Sup35, большого количества прионных фибрилл, имеющих малый размер вследствие их эффективной фрагментации шапероном Hspl04. Слабые варианты [PSP] определяют розовый цвет колоний и малоэффективную супрессию нонсенс мутации ade2-l, большее количество свободного Sup35 и большой размер прионных фибрилл в результате их малоэффективной фрагментации.

Между близкородственными белками вир35 существуют барьеры передачи [ЯИ*]. Клетки дрожжей штамма 22У-Н63А5' с четырьмя разными вариантами [Р£Г], сильным (в) и тремя слабыми У/2, '№'3), были трансформированы

центромерными плазмидами с гибридными генами 31/Р35, а также, в качестве контроля, плазмидой с геном 8иР35-сег.

В этих клетках, коэкспрессирующих два гена БиР35, индуцировали спонтанную потерю исходной плазмиды с геном 81/Р35-сег, после чего оценивали уровень передачи четырёх вариантов [Р5Т] гибридным белкам 8ир35. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует отсутствие передачи всех вариантов [Р57+] белкам 8ир35-гшк, 8ир35-Ьау и 8ир35-кис1. Уровень прионной передачи белку 8ир35-раг зависел от варианта прионного состояния, составляя от 5% (\¥3 [РХГ]) до 68% (8 [Р57+]).

Sup35-X Вариант [P5/']

S Wl W2 W3

Sup35-cer 100% 100% 100% 100%

Sup35-par 67,8% 13,0% 11,4% 5,0%

Sup35-mik 0% 0% 0% 0%

Sup35-bay 0% 1,7% 0% 0%

Sup35-kud 0% 0% 0% 0%

Таблица 2. Эффективность передачи четырёх вариантов [Р57+] гибридным белкам, определенная методом спонтанной потери плазмиды.

Экспрессия гибридных SUP35 в клетках с \PSP\ приводит к антисупрессорному фенотипу. Трансформация клеток дрожжей с четырьмя разными вариантами [PSP] (S, Wl, W2 и W3) центромерными плазмидами с гибридными генами SUP35 приводила к антисупрессорному фенотипу клеток. Этот фенотип свидетельствовал о затруднённой кополимеризации гибридных белков Sup35 с прионными полимерами Sup35-cer, в результате чего значительное количество гибридного белка Sup35 было в растворимой форме, активной в терминации трансляции.

Варианты [PS/+]:

пустой вектор

SUPX-mik

SUP35-hud

SUP 35-par Sl/P3S-bay

SUP3S-cer

Рис. 2. Фенотипы клеток дрожжей штамма 22У-Н63Д8 с разными вариантами [РЯ/+] (в, ■№2 и 'Л'З) при экспрессии в них гибридных генов 51/Р35. Экспрессия всех гибридных генов 811Р35 без последовательности, кодирующей ЗНА тэг, приводит к антисупрессорному фенотипу клеток дрожжей.

Гибридные белки Sup35 способны дестабилизировать \PSf'\. В настоящей работе

было обнаружено негативное влияние гетерологичных белков на поддержание исходного приона: экспрессия гибридных генов БиР35 приводила к потере [Р5!Г]. Частота потери зависела как от варианта приона, так и от аминокислотной последовательности продуцируемого гибридного 8ир35 (таблица 3).

Плазмида с % клеток [ртг" ] в колониях [Р5Г]

8 \У2 \¥3

Пустой вектор <0,1 <0,2 <0,3 <0,2

5С/Р55-сег <0,2 <0,2 <0,3 <0,2

БиР35-сег+ЗНА <0,3 <0,2 <0,3 <0,3

8иР35-т1к 1,1±0,5 12,6±0,7 15,2±3,5 13,4±2,1

8иР35-т1к+ЗНА 0,5 14,0±1,4 16,2±4,3 10,8±1,6

$иР35-Ъау <0,2 19,8±4,0 24,2±4,1 13,2±1,9

БиРЗб-Ьау+ЗНА <0,3 15,1±1,8 24,6±2,9 12,6±2,1

БиР35-кис1 <0,2 <0,3 <0,2 <0,3

БиР35-кис1+ЗНА <0,3 <0,3 <0,3 (0/331) <0,3 (0/366)

8иР35-раг <0,3 2,0±0,5 3,3±0,2 10,3±2,4

БиРЗб-раг+ЗНА <0,2 2,0±1,4 3,3±0,3 9,4±1,6

Таблица 3. Частоты потери четырёх вариантов [РЗГ] разными гибридными белками Бир35 с ЗНА тэгом и без него. Значения выражены в процентах. В качестве контроля была измерена митотическая стабильность четырёх представленных вариантов [Р57+] (клетки были трансформированы пустым вектором).

Кроме того, поскольку кополимеризацию гибридных белков Бир35 с прионными полимерами изучали при помощи белков 8ир35 с ЗНА тэгом, то было необходимо показать, что белки с ЗНА тэгом и без него ведут себя сходным образом. Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что частота потери [Р5Т] не зависела от наличия ЗНА тэга у гибридных белков 8ир35.

Передача одного варианта [Р5/+] может приводить к появлению нескольких

вариантов [Д?/*] на гибридном 8ир35. В результате анализа размера прионных полимеров белка 8ир35-раг после передачи ему \УЗ варианта [РЗГ] в двух проанализированных колониях, содержащих переданный [Р£Г], наблюдалась гетерогенность в размере прионных полимеров: в одной колонии клеток, потерявших плазмиду с геном 311Р35-сег, наблюдались полимеры меньшего размера, чем в другой

(рис. 3). Таким образом, это может говорить, что при прионной передаче возможно образование различных вариантов [PST] на белке-реципиенте.

Гибридные белки Sup35 способны кополимеризоваться с прионными полимерами Sup35 S. cerevisiae без передачи им прионного состояния. Гибридные белки Sup35 показали различные уровни кополимеризации с прионными полимерами Sup35 S. cerevisiae, зависящие также от варианта [PSP] (рис. 4). Так, например, белок Sup35-mik достаточно эффективно кополимеризовался с прионными полимерами W1 и W2 вариантов [Р£Г], но почти не кополимеризовался с прионными полимерами S и W3 вариантов [PST]. Несмотря на кополимеризацию, белок Sup35-mik, как мы показали (Табл. 2), не приобретал наследуемой прионной конформации. Белок Sup35-раг эффективно полимеризовался во всех вариантах [PST], кроме W3. Следует учесть, что анализируемые дрожжи с Sup35-par содержали некоторую долю клеток (указанную на рис. 4 как "передача [Р£Г]"), в которых Sup35-par приобрел прионное состояние и полимеризовался сам собой с эффективностью близкой к 100%. С учётом этого обстоятельства уровень кополимеризации Sup35-par без приобретения прионного состояния составлял не менее 50% во всех вариантах [Р5Г] кроме W3.

Белок Sup35-bay отсутствовал или был едва различим в полимерной фракции у всех вариантов [Р£Г]. Однако эффекты экспрессии гена SUP35-bay в клетках с четырьмя вариантами [PST] были различны: Sup35-bay дестабилизировал слабые варианты [PST], но не действовал на сильный [PST],

Рис. 3. Гетерогенность размера прионных полимеров 8ир35-раг после передачи варианта Показан результат анализа прионных

полимеров из двух колоний клеток.

полимеры

мономеры

ЯШ**** в*?*

п-Шч

» М вх-ЗНА

!

< Бх-ЗНА Л Бс

вектор ггнк кис) раг Ьау сег

потеря [РЭ1+] 0 1.1 0 0.1 0 0

передача [Р81+] - 0 0 67,8 0 100

W1

полпмеры

мономеры

-- - — Эир35 ^Эх-ЗНА чВРрвс

к- .•¿ЙИЯ*» — —- Ш- * ■^Бх-ЗНА

вектор потеря [Р81+] О передача [Р51+] -

пик 13 О

кис! О О

раг 2.1 13

Ьау 19.7 1.7

сег О 100

W2

полимеры

мономеры

вектор

потеря [РЭ1+] 0.2 передача [Р51+] -

полимеры

мономеры

вектор потеря [РЭ1+] О передача [Р51+] .

Рис. 4. Электрофоретический анализ кополимеризации гибридных БирЗб с прионными полимерами четырёх вариантов [Л£Г]. Клетки дрожжей с обозначенными вариантами [Р8Г] были трансформированы плазмидами с гибридными генами 811Р35-ЗНА. Иммуноблоттинг проводили с антителами против N и М доменов белка БирЗб-сег. Под каждым блотом указаны эффективность передачи приона соответствующему гибридному 8ир35 и уровень потери исходного [Р57+]. * - анализ лизатов клеток, потерявших плазмиду с геном 5'1/Р35-сег.

Это позволяет предполагать, что Sup35-bay не взаимодействовал с полимерами сильного [PST*], но в минимальном количестве присоединялся к концам полимеров слабых [Р5!Г]. Интересно отметить, что в клетках с W2 вариантом [PST], потеря которого была максимальна, белок Sup35-bay вовсе не обнаруживался в полимерной фракции, а в клетках с W1 и W3 вариантами [Р£Г] он присутствовал в прионных полимерах в следовом количестве. Это можно объяснить тем, что Sup35-bay включался в прионные полимеры в виде единичных молекул (W2 [Р57+]), или малых кластеров из нескольких молекул (W1 и W3 [PS7+]).

Белок Sup35-kud ни в одном из изученных вариантов [Р57+] не был способен сколько-нибудь эффективно взаимодействовать с прионными полимерами. Об этом говорит отсутствие белка Sup35-kud в прионной полимерной фракции всех вариантов [PST], отсутствие передачи [PST] белку Sup35-kud и отсутствие дестабилизации исходного приона белком Sup35-kud.

Молекулярная модель взаимодействия гетерологичного 8ир35 с прионной формой вир35 5. сегеушае. Одним из важнейших эффектов, обнаруженных в настоящей работе, является дестабилизация прионного состояния гибридными белками 8ир35. Очевидно, что этот эффект может уменьшать уровень прионной передачи, хотя и не является объяснением существования барьера на пути передачи прионного состояния.

Исходя из наблюдаемых типов взаимодействий гибридных белков 8ир35 следует ожидать, что присоединение молекул гибридного Бир35 исключает возможность дальнейшего образования прионной укладки 8ир35-сег на концах фибрилл. Это может происходить посредством двух механизмов. Более универсальный механизм состоит в том, что молекулы 8ир35-сег, присоединяющиеся к неприонному полимеру гибридного 8ир35, тоже будут иметь ненаследуемую амилоидную укладку, Это предположение основывается на нашем наблюдении, что такая укладка образуется с подавляющим предпочтением относительно прионной укладки, если взаимодействующие белки различны (8а1шкоуа е!: а1., 2005). В более частном механизме полимеризация может просто не передаваться с гетерологичного 8ир35 на 8ир35-сег. Это происходит, например, при продукции 8ир35-пик в клетках с XVI и \У2 вариантами [РЗТ] (сценарии 2 и 4 на рис. 5), и проявляется в повышенном уровне растворимого 8ир35-сег, который мы наблюдали. Интересно отметить, что первый механизм (образование неприонного амилоида 8ир35-сег,) может сильнее вредить поддержанию [Р5Т], поскольку количество мономерного 8ир35-сег, способного к образованию приона, уменьшается за счёт его укладки в ненаследуемый амилоид (рис. 5, сценарии 1 и 3).

11

Сценарий I II III

1 ccccccfPPPPECCCC

2 ссссссМММФ*ССССС

3 cccccdCCCCCC

4 сссссфССССС

5 CGCCCCCCCCCC

Su o35

[PSt] S mik 5 kud 5 par 1 bay 5

W1 W2 2 2 Ol Ol 1 1 4 3

W3 3 5 4 3

Рис. 5. Молекулярные сценарии взаимодействия гибридного Sup35 с прионными полимерами, предложенные в настоящей работе. Амилоидные полимеры изображены, как последовательность букв, каждая из которых представляет собой одну молекулу Sup35. с — белок Sup35-cer с прионной укладкой, С — белок Sup35-cer с ненаследуемой амилоидной укладкой. Р и М обозначают белки Sup35-par и Sup35-mik с ненаследуемой амилоидной укладкой, соответственно. Аналогично, X — молекула гибридного Sup35-X с ненаследуемой амилоидной укладкой. Для простоты, показан рост прионной фибриллы лишь в одну сторону. Фрагментация полимеров шапероном Hspl04 возможна лишь в области I, содержащей прионную укладку Sup35. Серые буквы в области III отражают отсутствие или пониженную вероятность полимеризации Sup35-cer после гибридного Sup35. В сценарии 5 гибридный Sup35 не кополи-меризуется с прионными полимерами Sup35-cer. Соответствие сценариев гибридным Sup35 и вариантам [PST] показано в таблице.

Важно отметить, что в обоих механизмах остается возможность поддержания [PST], поскольку Hspl04 может фрагментировать блокированные гибридным Sup35 прионные фибриллы в области исходного прионного полимера Sup35-cer (область I на рис. 5). Но поддержание [PST] будет происходить только в том случае, если частота присоединения гибридного Sup35 к прионным полимерам будет невысокой и не превысит частоту фрагментации полимера шапероном Hspl04. Частота фрагментации приблизительно равна обратной величине от среднего размера прионного полимера. Поэтому для сильных [PSI+] со средней длиной полимеров, равной примерно 20 молекулам (Kryndushkin et al., 2003), вероятность присоединения первой молекулы гибридного Sup35 в сравнении с Sup35-cer (обозначим её как h) должна быть меньше чем 5%, в противном случае [PST] будет быстро утрачен.

То, что в изученных случаях уровень дестабилизации [PST] не превышал 24%, указывает, что вероятность присоединение гибридного Sup35 к концу прионных фибрилл Sup35-cer была мала и не превышала названный критерий. При этом уровень потери [PST] не увеличивался при увеличении количества гибридного белка в полимерной фракции. Например, количество белка Sup35-bay в полимерной фракции в клетках с W2 вариантом [PST] ниже, но уровень потери [PST] выше, чем в аналогичном случае для W1 варианта. Это, по всей видимости, говорит, что белок Sup35-bay при присоединении к прионным фибриллам W1 варианта формировал кластеры из белка Sup35-bay на концах прионных фибрилл. В W1 и W3 вариантах [PST] белок Sup35-mik элиминировал [PST] с частотой равной примерно 15% в каждом случае.

Однако количество белка в полимерной фракции W1 варианта было гораздо выше, чем в полимерной фракции W3 варианта. Это говорит о том, что белок Sup35-mik при взаимодействии с прионными полимерами вариантов W1 и W2 образовывал участки из множества последовательных молекул (сценарий 2 на рис. 5), в то время как белок Sup35-mik присоединялся единичными молекулами к концам прионных фибрилл W3 варианта (сценарий 4 на рис. 5). Поэтому уровень кополимеризации гибридного Sup35 может отражать как вероятность присоединения гибридного белка к растущей фибрилле, так и количество гибридного белка в кластере.

В некотором противоречии с нашей логикой находится наблюдение, что Sup35-par в клетках с S, W1 и W2 вариантами [PST] кополимеризовался весьма эффективно, но вызывал лишь весьма незначительную потерю [Р5Г]. Это наблюдение можно объяснить, заметив, что вероятность h присоединения гибридного Sup35 должна быть пропорциональна количеству мономерного гибридного Sup35. Количество свободного Sup35-par в указанных случаях было весьма мало. Поэтому можно предполагать, что переключение полимеризации на белок Sup35-par происходило сравнительно редко, однако затем Sup35-par полимеризовался быстро, в сравнении с другими гибридными белками Sup35, образуя длинные участки, что объясняет наблюдаемый высокий уровень кополимеризации.

Затруднение в переходе полимеризации с гибридного Sup35 на Sup35-cer должно приводить к увеличению количества Sup35-cer в мономерной форме. Подобный эффект действительно наблюдали для белков Sup35-mik в клетках с W1 и W2 вариантами [PS7+], Sup35-bay в клетках с W1 вариантом [Р&Г], и Sup35-par в клетках с W3 вариантом [PSI*] (сценарии 2 и 4 на рис. 5). В этих случаях уровень мономерного Sup35-сег доходил до 20%, что в 5-10 раз превышает количество мономерного Sup35-cer в исходных клетках [Л£Г]. Поскольку количество мономерного Sup35 в клетках [Л57+] обратно пропорционально количеству свободных концов фибрилл, то можно сказать, что взаимодействие гибридного Sup35 с прионными фибриллами уменьшало количество свободных концов фибрилл в 5 раз.

Таким образом, на основании результатов проведённых экспериментов можно предполагать пять молекулярных сценариев взаимодействия гетерологичного Sup35 с прионными полимерами (рис. 5), различающихся тремя параметрами, а именно эффективностью связывания гибридного Sup35 с прионными фибриллами, эффективностью полимеризации гибридного Sup35 после Sup35-cer (в области II), а также эффективностью полимеризации Sup35-cer с ненаследуемой амилоидной укладкой после гибридного Sup35 (в области III).

Участки прионного домена 8ир35, ответственные за барьер в передаче прионно-го состояния. Прионный домен вир35 5. сегеги/ае состоит из двух участков: (^N11 (аминокислотные остатки 1-40), богатого остатками глутамина и аспарагина, и ОРЯ (41-123), содержащего олигопептидные повторы. Ряд работ позволял предполагать, что барьер в передаче [РХГ] должен определяться областью (21411, хотя имелись и противоположные данные.

Для выявления роли участков (^N11 и ОРЯ прионного домена 8ир35 в межвидовой прионной передаче нами были сконструированы следующие химерные гены £№35: 811Р35-т1к/сег, 8иР35-сегЫк, 8иР35-Ьау/сег, 8иР35-сег/Ьау, 8иР35-раг/сег, 811Р35-сег/раг. Эти гены кодируют белки с (^N11 и ОРЯ областями разного происхождения, что отражено в их буквенном суффиксе. При этом одна из областей происходит из ЭирЗб & сегеушае. Кроме того, был получен ген 8иР35-кш^гв со вставкой последовательности, кодирующей аминокислоты ИУО. Эта вставка нивелирует "делецию" остатков 12-14, видимую при сравнении с последовательностью белка 8ир35-сег (рис. !)■

Мы обнаружили, что отличия в обеих областях, и ОРЯ, отвечают за барьер передачи [/"¿Т] белку 8ир35-Ьау, хотя лишь область <3№1 вызывала потерю [Р5Г]. Так же, как и в случае белка 8ир35-Ьау, у белка 8ир35-раг обе области (ЗИЛ и ОРЯ были вовлечены в поддержание барьера прионной передачи. В белке 8ир35-гшк только область ОРЯ была ответственна как за барьер передачи прионного состояния, так и за вызванную экспрессией гена 8иР35-т1к дестабилизацию прионного состояния (рис. 6).

™ (иг/ сет/ с«/ ь-ц Ьау! сиг! к и кЫ*

Р1 иг ыг ™ с« пик сет Ьа>/ Киа

СШЛ

41

ОРЯ

124

ЭирЗб-раг 1ЙЙ5Й5Й5551

5ир35-т1к 1 ишгм

ЭирЗб-Ьау

Зцр354шс) 1 N 1 1

Рис. 6. А. Эффективность передачи 8, \\П, \У2 и \¥3 вариантов гибридным и химерным белкам Бир35 (определена методом индуцированной 5-фтороротовой кислотой потери

плазмид), а также частота потери [PST] при экспрессии химерных и гибридных генов SUP35 в клетках [AST]. В качестве контроля приведены данные для белка Sup35-cer. В настоящей работе было показано, что 5-фтороротовая кислота дестабилизирует слабые варианты [Р5!Г], что приводит к занижению контрольной (Sup35-cer - Sup35-cer) передачи слабых вариантов

[psr].

Б. Участки прионных доменов Sup35 S. mikatae, S. kudriavzevii, S. paradoxus и S. bayanus, ответственные за барьер передачи прионного состояния. Штрихованные области указывают на районы гетерологичных прионных доменов, отвечающие за межвидовой прионный барьер.

Неспособность белка Sup35-kud взаимодействовать с прионными полимерами всех изученных вариантов [Р57+] была связана с отсутствием, по сравнению с последовательностью Sup35-cer, трёх последовательных аминокислотных остатков (12-14) в области QNR. Добавление этих остатков в Sup35-kud полностью снимало барьер в передаче прионного состояния (рис.6).

Связь отсутствия кополимеризации белка Sup35-kud с отсутствием трёх аминокислотных остатков в положении 12-14, подтверждает важность ранее выдвинутого принципа о взаимодействия белков «в регистре» при построении амилоидных фибрилл: "делеции" аминокислотных остатков гораздо сильнее нарушают способность белков к взаимодействию, чем их замены. При этом, возможно, делеции в области QNR более весомы. Так, белок Sup35-bay, несущий вставки двух аминокислотных остатков в положениях 40 и 60 и делецию девяти аминокислот в положении 79-87, взаимодействовал с прионным Sup35-cer, в отличие от Sup35-kud с одной делецией в области QNR.

Повышенный уровень прионной передачи белку Sup35-par коррелировал с низким уровнем дестабилизации [PSI'}. Подобная зависимость была обнаружена и для некоторых химерных и мутантных гибридных белков (например, для белка Sup35-kud со вставкой NYQ, белка Sup35-mik/cer). Однако из этой зависимости нашлось одно исключение: белок Sup35-bay/cer во всех вариантах приобретал прионную укладку с достаточно высокой частотой, но также был способен к дестабилизации всех слабых вариантов [РБГ].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы показали существование трех типов взаимодействия гибридных белков Sup35 с прионными полимерами Sup35-cer: (1) отсутствие взаимодействия, (2) кополимеризация без передачи прионного состояния гетерологичному Sup35 и (3) кополимеризация с передачей приона. Данный ряд коррелирует с возрастанием сходства белков Sup35. Особенно интересен второй тип

15

взаимодействия, показанный нами впервые. Кополимеризация без передачи приона происходит вследствие приобретения гибридными белками ненаследуемой амилоидной укладки вместо прионной. Мы обнаружили важный побочный эффект такого взаимодействия - дестабилизацию и частую потерю исходного приона. Полученные данные позволяют предполагать существование четырех заметно отличающихся сценариев взаимодействия гетерологичного Sup35 с прионными полимерами Sup35-cer (рис. 5), которые реализуются в зависимости от вида гибридного белка Sup35 и варианта [PST].

Предложенные механизмы дестабилизации [PSP] гибридными Sup35 позволяют предполагать существование вариантов белка Sup35, способных излечивать [Р5Т] ещё более эффективно. Подобные аллели могут быть получены путём мутагенеза прионных доменов Sup35, в том числе гетерологичных. Последние имеют то преимущество, что вставки и делеции в белковых последовательностях трудно получить путём случайного мутагенеза ДНК.

Подобным образом могут быть получены и изменённые аллели гена PRNP млекопитающих, кодирующие белки, которые будут излечивать прионное состояние белка РгР или блокировать образование амилоидов. Важно отметить, что подобные случаи уже описаны: в клетках мышиной нейробластомы РгР хомяка и его некоторые аллели блокировали поддержание прионного состояния мышиного РгР (Priola et al., 1995).

выводы

]. Барьер передачи прионного состояния может существовать даже при эффективной кополимеризации гетерологичного белка Sup35 с прионными полимерами, что связано с образованием ненаследуемой амилоидной укладки гетерологичного Sup35.

2. Кополимеризация гетерологичного белка с прионными полимерами Sup35-cer может вызывать потерю [Р5/+], что может быть связано как с блокированием полимеризации гетерологичными белками Sup35, так и с приобретением ненаследуемой амилоидной укладки белком Sup35-cer.

3. Барьер в передаче прионного состояния может определяться аминокислотными отличиями в любой из областей QNR и OPR прионного домена Sup35.

4. Механизмы барьера передачи прионного состояния и индуцированной потери [PST] зависят как от последовательности гетерологичного белка, так и от варианта [PST].

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Evgenia G. Afanasieva, Vitaly V. Kushnirov, Mick F. Tuite and Michael D. Ter-Avanesyan, Molecular basis for transmission barrier and interference between closely related prion proteins in yeast. // J. Biol. Chem. - 2011 - V. 286, P. 15773-15780.

2. Афанасьева Е.Г., Кушниров B.B., Тер-Аванесян М.Д., Межвидовые барьеры прионной передачи. // Успехи биологической химии. -2011-Т. 51, С. 3-24.

3. E.G. Afanasieva, V. V. Kushnirov, and M.D. Ter-Avanesyan, Mechanisms of prion species barriers in the yeast model.// CNRS Jacques Monod Conference "Protein misfolding and aggregation in ageing and disease". - Abstract Book - 5-9 June 2010 -P. 89.

4. M.D. Ter-Avanesyan, E.G. Afanasieva and V. V. Kushnirov. Studying the molecular basis for the prion interspecies transmission barrier: a yeast model.// International Conference "Yeast, an evergreen model"- Abstract Book -23-25 September, 2010 -V. 46.

5. B.H. Ураков, Е.Г. Афанасьева, B.B. Кушниров и М.Д. Тер-Аванесян. Прионные и неприонные амилоиды дрожжей.// II междисциплинарный микологический форум. Иммунология, аллергология, инфектология - Сборник тезисов - 14-15 апреля 2010, С. 32.

6. E.G. Afanasieva, V.V. Kushnirov, and M.D. Ter-Avanesyan. Diversity of prion species barriers between closely related yeast proteins.// International Bunsen Discussion Meeting on "Structure of Amyloid Fibrils and Mechanism of Amyloid Formation". -Abstract Book - 8-11 February 2009 - P. 45.

7. E.G. Afanasieva, A.I. Alexandrov, M.D. Ter-Avanesyan and V.V. Kushnirov. Fragmentation of prion polymers in yeast: its determinants and the role in species barrier.// 24th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. -Abstract Book -19-24 July 2009 - P. 63.

8. А.И. Александров, Е.Г. Афанасьева, E.E. Соколова, B.B. Кушниров, М.Д. Тер-Аванесян. Прионные амилоиды дрожжей - наследование и межвидовые барьеры.// V съезд ВОГИС. - Сборник тезисов - 21-27 июня 2009, С. 42.

Подписано в печать 16.05.2011 г. Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38, 8 (926) 850-53-16 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Афанасьева, Евгения Георгиевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Межвидовая передача прионных болеваний

2. Аминокислотные замены в белке РгР, влияющие на передачу прионов

3. Прионы низших эукариот

4. Дрожжевые модели для изучения межвидовой передачи прионов

5. Межвидовая передача приона [иЯЕЗ]

6. Прион [Р51+]

7. Передача прионного состояния между белками 8ир35 из дрожжей, относящихся к разным родам

8. Передача прионного состояния между белками 8ир35 из близкородственных видов дрожжей

9. Мутации в гене Бир35, влияющие на передачу [Р57 ]

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы межвидовых барьеров в передаче прионного состояния у дрожжей"

Некоторые белки человека и животных, растворимые в норме, могут иногда полимеризоваться и накапливаться в виде внутри- или внеклеточных агрегатов или бляшек, что приводит к болезни. У человека известно более 30 белков, образующих такие агрегаты, называемые амилоидами. Амилоидные болезни, или амилоидозы, не поддаются лечению. Они широко распространены, и их встречаемость возрастает с увеличением возраста. К их числу относятся, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Амилоидозы в большинстве случаев неинфекционны, за исключением прионных болезней, связанных с белком РгР.

Прионные агрегаты РгР представляют уникальный пример инфекционного агента без генетической программы в виде ДНК или РНК. Прионные болезни редки, однако недавняя эпизоотия губчатой энцефалопатии коров в Великобритании нанесла многомиллиардный урон экономике и поставила под угрозу жизни людей в связи с возможностью передачи этого заболевания человеку при употреблении в пищу говядины. Следует отметить, что межвидовая передача прионов обычно затруднена или невозможна, что удивительно ввиду небольших видовых отличий в последовательности прионного белка. Поэтому изучение барьеров в межвидовой передаче прионов важно и для медицины, и для понимания общих свойств прионов.

Имеющиеся в литературе данные по изучению прионной передачи между разными видами млекопитающих ограничиваются в основном фактами существования прионных барьеров, однако об их молекулярных механизмах почти ничего не известно. Прионы дрожжей Засскаготусея являются удобной моделью для изучения молекулярных процессов, лежащих в основе межвидовых прионных барьеров. При этом наиболее информативным является использование прионогенных белков из близкородственных видов дрожжей, степень гомологии которых сопоставима с таковой белков РгР млекопитающих. Использование близкородственных прионогенных белков Иге2 позволило воспроизвести все основные закономерности прионной передачи у млекопитающих, хотя молекулярные основы событий, происходящих при межвидовой прионной передаче, выявлены не были [57].

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Прионы изначально были выявлены как инфекционные агенты белковой природы, вызывающие трансмиссивные губчатые энцефалопатии человека и животных, такие, как, например, болезнь Крейцфельдта-Якоба (БКЯ), синдром Терстманна-Штраусслера-Шейнкера и куру человека, а также скрейпи овец и губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (коровье бешенство). Эти неизлечимые заболевания сопровождаются морфологическими изменениями тканей мозга, связанными с накоплением амилондоподобных структур. Несмотря на то, что некоторые из этих болезней известны давно, БКЯ - около 100 лет, а скрейпи овец - с середины XVIII века, их этиология стала понятна лишь во второй половине прошлого века.

Существенную роль в выявлении этиологии этих заболеваний сыграло обнаружение сходства нейропатологий БКЯ, куру и скрейпи. В 1959 г. В. Хэдлоу выдвинул гипотезу об инфекционности куру, заболевания, распространенного у аборигенов о. Новая Гвинея, практикующих каннибализм, которую он предложил проверить путём интрацеребральной инокуляции шимпанзе гомогенатов мозга ч пациентов, умерших от куру [1]. Эта гипотеза впоследствии была подтверждена К. Гайдушеком с соавторами, которые обнаружили, что у шимпанзе при инъекции гомогенатов мозга таких пациентов развивается болезнь, сходная со скрейпи по всем патологическим проявлениям [2]. В свою очередь, скрейпи также относится к трансмиссивным заболеваниям, поскольку эту болезнь оказалось возможным экспериментально передавать мышам [3].

Примерно в то же время было показано, что агент, вызывающий скрейпи, необычайно устойчив к различным воздействиям, инактивирующим большинство известных видов бактерий и вирусов, таким, как высокая температура, фиксация формальдегидом [4] и облучение УФ светом [5]. Это привело к предположению, что агент скрейпи способен реплицироваться в отсутствие нуклеиновой кислоты [6]. В 1967 году Д. Гриффит предложил несколько гипотез распространения и наследования этих заболеваний, в том числе и будущую прионную гипотезу: «.субъединицы могут полимеризоваться только в присутствии уже имеющихся «конденсационных ядер» полимеров» [7]. Очистка инфекционного материала выявила агент массой 27-30 кДа, основной компонент которого имел белковую природу. Его инфекционность лишь частично инактивировалась протеиназой К, мочевиной и другими агентами, нарушающими структуру белков. Этот агент и был назван прионом (от proteinaceous infectious particle), а белок - PrP (Prion Protein) [8]. Идентификация гена PRNP, кодирующего РгР [9], показала, что не присутствие, а особое конформационное состояние этого белка связано с болезнью. Позже гомологи гена PRNP были обнаружены не только у млекопитающих, но и у птиц [10] и рыб [11]. На рисунке 1 приведено сравнение аминокислотных последовательностей белка РгР из некоторых видов млекопитающих.

Белок РгР млекопитающих 23 человек KKRPKPGG-WNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQ--------GGG бык .G.PHGGGGWGQ-' овца .G.GVJGQ • • мышь .—. *.

ХОНЯХ .-.- ■

95 129 человек THSQVTOKPSKPKTIWKHMAGñíUUiGAVVGGLGGYpLGSñMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNF бык ■-G.V.L.VQ. овод S.V.L----N.VE. мышь •-N.L--V.M----N-W.Y.VQ. хомяк • N.N----S.ML-•-N-W.N.VQ'N.

176 человек VHDCVNITIKQKTVTTTTKGENFTETDVKMMERWEQMCITQYERESQAYYQ—RGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG бык .V-E.X.Q.-A-VI. овца .V.I-1.С.A-VI. мышь .V-•-QK.DGR-S--T. хомяк .V-■-QK.DGR----A.

Рис. I. Сравнение первичных структур белков РгР (без сигнальной последовательности) некоторых видов млекопитающих. Приведена первичная структура РгР человека и аминокислотные остатки, по которым от них отличаются остальные белки. Серым цветом выделено положение остатка метионина-129 в белке РгР человека (его роль обсуждается ниже).

Прионный белок РгР заякорен на внешней стороне клеточной мембраны при помощи гликозил-фосфатидилинозитола и продуцируется в основном в клетках нервной системы и лимфоретикулярной ткани [12]. Его функция до сих пор полностью С не выяснена, хотя недавно было показано участие нейронального РгР в формировании миелиновой оболочки нервных волокон [13].

Se

Прионная изоформа белка РгР (РгР , где Se от scrapie) отличается от нормальной Q клеточной, неприонной формы (РгР , где С от cellular) вторичной структурой. Так, С форма РгР обогащена а-спиральными участками и почти не содержит р-слои, в то

Sc время как форма РгР имеет в основном р-складчатую структуру [14]. Инфекционная форма белка РгР, попадая в организм извне или возникая в нем спонтанно, способствует

С Se превращению обычного РгР в патогенный РгР посредством белок-белковых

Se взаимодействий. Патогенная форма РгР устойчива к протеолизу и поэтому накапливается в тканях мозга больных в виде бляшек, содержащих нитевидные или палочкообразные агрегаты этого белка.

Одним из важных свойств прионов является возможность их существования в виде различных вариантов (штаммов), в основе которых лежат различия в укладке

Se прионной формы белка РгР. РгР с различными конформациями обуславливают вариации в течении прионных заболеваний: могут различаться инкубационные периоды, клинические проявления, повреждаться разные отделы мозга. Штаммовые различия прионов стабильно поддерживаются in vivo. Это означает, что если

Se инфицировать лабораторных животных разными штаммами РгР , то при развитии болезни у них будет поддерживаться именно тот штамм приона, которым их инфицировали [15; 16].

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Афанасьева, Евгения Георгиевна

выводы

1. Барьер передачи прионного состояния может существовать даже при эффективной кополимеризации гетерологичного белка Эир35 с прионными полимерами, что связано с образованием ненаследуемой амилоидной укладки гетерологичного 8ир35.

2. Кополимеризация гетерологичного белка 8ир35 с прионными полимерами 8ир35-сег может вызывать потерю [Р5/+], что может быть связано как с блокированием полимеризации гетерологичными белками 8ир35, так и с приобретением ненаследуемой амилоидной укладки белком 8ир35-сег.

3. Барьер в передаче прионного состояния может определяться аминокислотными отличиями в любой из областей (^N11 и ОРЫ прионного домена 8ир35.

4. Механизмы барьера передачи прионного состояния и индуцированной потери [Р5/4] зависят как от последовательности гетерологичного белка, так и от варианта [Р57+].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы показали существование трех типов взаимодействия гибридных белков Эйр35 с прионными полимерами 8ир35-сег: (1) отсутствие взаимодействия, (2) кополимеризация без передачи прионного состояния гетерологичному БирЗЗ и (3) кополимеризация с передачей приона. Особенно интересен второй тип взаимодействия, показанный нами впервые. Кополимеризация без передачи приона происходит вследствие приобретения гибридными белками ненаследуемой амилоидной укладки вместо прионной. Мы обнаружили важный побочный эффект такого взаимодействия - дестабилизацию и частую потерю исходного приона. Полученные данные позволяют предполагать существование четырех заметно отличающихся сценариев взаимодействия гетерологичного Эир35 с прионными полимерами 8ир35-сег (рис. 21), которые реализуются в зависимости от вида гибридного белка 8ир35 и варианта [РБР].

Предложенные механизмы дестабилизации [Р.ХГ] гибридными 8ир35 позволяют предполагать существование вариантов белка 8ир35, способных излечивать [Р£Г] ещё более эффективно. Подобные аллели гена БиР35 могут быть получены путём мутагенеза последовательностей, кодирующих прионные домены 8ир35, в том числе гетерологичные. Последние имеют то преимущество, что вставки и делеции в белковых последовательностях трудно получить путём случайного мутагенеза ДНК.

Подобным образом могут быть получены и изменённые аллели гена Р1ШР млекопитающих, кодирующие белки, которые будут излечивать прионное состояние белка РгР или блокировать образование амилоидов. Важно отметить, что подобные случаи уже описаны: в клетках мышиной нейробластомы РгР хомяка и его некоторые аллели блокировали поддержание прионного состояния мышиного РгР [37].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Афанасьева, Евгения Георгиевна, Москва

1. Hadlow W.J. (1959), Scrapie and Kuru, Lancet, 274, 289-290.

2. Gajdusek D.C., Gibbs C.J., Alpers M. (1966), Experimental transmission of a Kuru-like syndrome to chimpanzees, Nature, 209, 794-796.

3. Chandler R.L. (1961), Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material, Lancet, 277, 1378-1379.

4. Pattison I.H. (1965), Resistance of the scrapie agent to formalin, J. Comp. Pathol., 75, 159164.

5. Alper T., Haig D.A., Clarke M.C. (1966), The exceptionally small size of the scrapie agent, Biochem. Biophys. Res. Commun., 22, 278-284.

6. Alper T., Cramp W.A., Haig D.A., Clarke M.C. (1967), Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid?, Nature, 214, 764-766.

7. Griffith J.S. (1967), Self-replication and scrapie, Nature, 215, 1043-1044.

8. Prusiner S.B. (1982), Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie, Science, 216, 136-144.

9. Oesch B., Westaway D., Waelchli M., McKinley MP., Kent S.B., Aebersold R., Barry R.A., Tempst P., Teplow D.B., Hood L.E. (1985), A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein, Cell, 40, 735-746.

10. Gabriel J.M., Oesch B., Kretzschmar H., Scott M., Prusiner S.B. (1992), Molecular cloning of a candidate chicken prion protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 9097-9101.

11. Rivera-Milla E., Stuermer C.A.O., Malaga-Trillo E. (2003), An evolutionary basis for scrapie disease: identification of a fish prion mRNA, Trends Genet., 19,12-15.

12. Simons K., Ehehalt R. J. (2002), Cholesterol, lipid rafts, and disease, Clin. Invest., 110, 597-603.

13. Bremer J., Baumann F., Tiberi C., Wessig C., Fischer H., Schwarz P., Steele A.D., Toyka K.V., Nave К.-Л., Weis J., Aguzzi A. (2010), Axonal prion protein is required for peripheral myelin maintenance, Nat. Neuroscl, 13, 310-318.

14. Bessen R.A., Kocisko D.A., Raymond G.J., Nandan S., Lansbury P.N., Jr, Caughey B. (1995), Non-genetic propagation of strain-specific properties of scrapie prion protein, Nature, 375, 698-700.

15. Fraser H., Dickinson A.G. (1973), Scrapie in mice. Agent-strain differences in the distribution and intensity of grey matter vacuolation, J. Сотр. Pathol., 83, 29-40.

16. Kimberlin R.H., Walker C.A. (1986), Pathogenesis of scrapie (strain 263K) in hamsters infected intracerebrally, intraperitoneally or intraocularly, J. Gen. Virol., 61, 255-263.

17. Kimberlin R.H., Walker C.A. (1978), Evidence that the transmission of one source of scrapie agent to hamsters involves separation of agent strains from a mixture, J. Gen. Virol., 39,487-496.

18. Kimberlin R.H., Cole S., Walker C.A. (1987), Temporary and permanent modifications toa single strain of mouse scrapie on transmission to rats and hamsters, J. Gen. Virol., 68, 18751881.

19. Kimberlin R.H., Walker C.A., Fraser H. (1989), The genomic identity of different strains of mouse scrapie is expressed in hamsters and preserved on reisolation in mice, J. Gen. Virol., 70, 2017-2025.

20. Bessen R.A., Marsh R.F. (1992), Biochemical and physical properties of the prion protein from two strains of the transmissible mink encephalopathy agent, J. Virol., 66, 2096-2101.

21. Hill A.F., Desbruslais M., Joiner S., Sidle K.C., Gowland I., Collinge J., Doey L.J., Lantos P. (1997), The same prion strain causes vCJD and BSE, Nature, 389,448-450.

22. Pattison I.H., Jones K.M. (1968), Modification of a strain of mouse-adapted scrapie by passage through rats, Res. Vet. Sci., 9,408-410.

23. Bruce M.E., Dickinson A.G. (1987), Biological evidence that scrapie agent has an independent genome, J. Gen. Virol., 68, 79-89.

24. Kimberlin R.H., Cole S„ Walker C.A. (1986), Transmissible mink encephalopathy (TME) in Chinese hamsters: identification of two strains of TME and comparisons with scrapie, Neuropathol. Appi Neurobiol., 12, 197-206.

25. Li J., Browning S., Mahal S.P., Oelschlegel A.M., Weissmann C. (2010), Darwinian evolution of prions in cell culture, Science, 327, 869-872.

26. Bartz J.C., McKenzie D.I., Bessen R.A., Marsh R.F., Aiken J.M. (1994), Transmissible mink encephalopathy species barrier effect between ferret and mink: PrP gene and protein analysis, J. Gen. Virol., 75, 2947-2953.

27. Bossers A., Schreuder B.E., Muileman I.H., Belt P.B., Smits M.A. (1996), PrP genotypecontributes to determining survival times of sheep with natural scrapie, J. Gen. Virol., 77, 2669-2673.

28. Westaway D, Cooper C, Turner S, Da Costa M, Carlson G.A., Prusiner S.B. (1994), Structure and polymorphism of the mouse prion protein gene, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 6418-6422.

29. Collinge J., Clark A.R. (2007), A general model of prion strains and their pathogenicity, Science, 318, 930-936.

30. Priola S.A., Chesebro B. (1995), A single hamster PrP amino acid blocks conversion to protease-resistant PrP in scrapie-infected mouse neuroblastoma cells, J. Virol., 69, 7754-7758.

31. Vanik D.L., Surewicz K.A., Surewicz W.K. (2004), Molecular basis of barriers for interspecies transmissibility of mammalian prions, Mol. Cell, 14, 139-145.

32. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. (1997), Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the AS7+. prion in Saccharomyces cerevisiae, Genetics, 147, 507-519.

33. Bradley M.E., Liebman S.W. (2004), The Sup35 domains required for maintenance" ofweak, strong or undifferentiated yeast PS7+. prions, Mol. Microbiol., 51, 1649-1659.

34. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. (1996), Propagation of the yeast prion-like P5/+. determinant is mediated by oligomerization of the SUP35-encoded polypeptide chain release factor, EMBO J., 15, 3127-3134.

35. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. (1998), Structure and replication of yeast prions, Cell, 94, 13-16.

36. Salnikova A.B., Kryndushkin D.S., Smirnov V.N., Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D. (2005), Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids, J. Biol. Chem., 280, 8808-8812.

37. Alexandrov I.M., Vishnevskaya A.B., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V. (2008), Appearance and propagation of polyglutamine-based amyloids in yeast: tyrosine residues enable polymer fragmentation, J. Biol. Chem., 283, 15185-15192.

38. Nakayashiki Т., Kurtzman C.P., Edskes H.K., Wickner R.B. (2005), Yeast prions URE3. and [.PSP] are diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 10575-10580.

39. True H.L., Berlin I., Lindquist S.L. (2004), Epigenetic regulation of translation reveals hidden genetic variation to produce complex traits, Nature, 431, 184-187.

40. Миронова JI.H., Гогинашвили А.И., Тер-Аванесян М.Д. (2008), Биологические функции амилоидов: факты и гипотезы, Молекулярная биология, 42, 798-808.

41. Tyedmers J., Madariaga ML, Lindquist S. (2008), Prion switching in response to environmental stress, PLoSBiol., 6, 2605-2613.

42. Halfmann R, Lindquist S. (2010), Epigenetics in the extreme: prions and the inheritance of environmentally acquired traits, Science, 330, 629-632.

43. Tuite M.F., Serio T.R. (2010), The prion hypothesis: from biological anomaly to basic regulatory mechanism, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 11, 823-833.

44. Santoso A., Chien P., Osherovich L.Z., Weissman J.S. (2000), Molecular basis of a yeastprion species barrier, Cell, 100, 277-288.

45. Kushnirov V.V., Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova M.B., Frolova N.S., Ter-Avanesyan M.D. (2000), Prion properties of the Sup35 protein of yeast Pichia methanolica, EMBOJ., 19, 324-331.

46. Chien P., Weissman J.S. (2001), Conformational diversity in a yeast prion dictates its seeding specificity, Nature, 410, 223-227.

47. Hara H., Nakayashiki T., Crist C.G., Nakamura Y. (2003), Prion domain interaction responsible for species discrimination in yeast PSI+. transmission, Genes Cells, 8, 925-939.

48. Tanaka M., Chien P., Yonekura K., Weissman J.S. (2005), Mechanism of cross-species prion transmission: an infectious conformation compatible with two highly divergent yeast prion proteins, Cell, 121,49-62.

49. Chen B., Nevvnam G.P., Chernoff Y.O. (2007), Prion species barrier between the closely related yeast proteins is detected despite coaggregation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 2791-2796.

50. Edskes H.K., McCann L.M., Hebert A.M., Wickner R.B. (2009), Prion variants and species barriers among Saccharomyces Ure2 proteins, Genetics, 181, 1159-1167.

51. Komar A.A., Lesnik T., Cullin C., Merrick W.C., Trachsel H., Altmann M. (2003), Internal initiation drives the synthesis of Ure2 protein lacking the prion domain and affects URE3. propagation in yeast cells, EMBO J, 22, 1199-1209.

52. Coschigano P.W., Magasanik B. (1991), The URE2 gene product of Saccharomyces cerevisiae plays an important role in the cellular response to the nitrogen source and has homology to glutathione s-transferases, Mol. Cell. Biol., 11, 822-832.

53. Patino M.M., Liu J.J., Glover J.R., Lindquist S. (1996), Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast, Science, 273, 622-626.

54. Kryndushkin D.S., Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D., Kushnirov V.V. (2003), Yeast

55. PSP. prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hspl04, J. Biol. Chem., 278,49636-49643.

56. Kushnirov V.V., Ter-Avanesyan M.D., Telckov M.V., Surguchov A.P., Smirnov V.N., Inge-Vechtomov S.G. (1988), Nucleotide sequence of the SUP2 (SUP35) gene of Saccharomyces cerevisiae, Gene, 66, 45-54.

57. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Smirnov V.N. (1994), The SUP35 omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant PSP. in the yeast Saccharomyces cerevisiae, Genetics, 137, 671-676.

58. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. (1997), Interaction between yeast Sup45p (eRFl) and Sup35p (eRF3) polypeptide chain release factors: implications for prion-dependent regulation, Mol. Cell. Biol, 17, 2798-2805.

59. Baxa U., Keller P.W., Cheng N., Wall J.S., Steven A.C. (2011), In Sup35p filaments (the PSP. prion), the globular C-terminal domains are widely offset from the amyloid fibril backbone, Mol. Microbiol, 79, 523-532.

60. Derkatch I.L., Chernoff Y.O., Kushnirov Y.V., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. (1996), Genesis and variability of PS7. prion factors in Saccharomyces cerevisiae, Genetics, 144, 1375-1386.

61. Kochneva-Pervukhova N.V., Chechenova M.B., Valouev I.A., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. (2001), Psi(+)j prion generation in yeast: characterization of the 'strain' difference, Yeast, 18, 489-497.

62. Tanaka M., Chien P., Naber N., Cooke R., Weissman J.S. (2004), Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences, Nature, 428, 323-328.

63. King C.Y., Diaz-Avalos R. (2004), Protein-only transmission of three yeast prion strains, Nature, 428, 319-323.

64. Kushnirov V.V., Vishnevskaya A.B.,Alexandrov I.M., Ter-Avanesyan M.D. (2007), Prionand nonprion amyloids: a comparison inspired by the yeast Sup35 protein, Prion, 1, 179-184.

65. Chernoff Y.O., Galkin A.P.,Lewitin E., Chernova T.A., Newnam G.P., Belenkiy S.M. (2000), Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein, Mol. Microbiol., 35, 865-876.

66. Tessier P.M., Lindquist S. (2007), Prion recognition elements govern nucleation, strain specificity and species barriers, Nature, 447, 556-561.

67. Wickner R.B. (1994), UIIE3. as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae, Science, 264, 566-569

68. Vishveshwara N., Liebman S.W. (2009), Heterologous cross-seeding mimics cross-species prion conversion in a yeast model, BMC Biol, 7,26

69. Chen B., Bruce K.L., Newnam G.P., Gyoneva S., Romanyuk A.V., Chernoff Y.O. (2010), Genetic and epigenetic control of the efficiency and fidelity of cross-species prion transmission, Mol. Microbiol., 76, 1483-1499.

70. Urakov V.N., Vishnevskaya A.B., Alexandrov I.M., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. (2010), Interdependence of amyloid formation in yeast: implications for polyglutamine disorders and biological functions, Prion, 4, 45-52.

71. Doel M.S., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. (1994), The dominant PNM2- mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene, Genetics, 137, 659-670.

72. Kochneva-Pervukhova N.Y., Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Cox B.S., Tuite M.F., Ter-Avanesyan M.D. (1998), Mechanism of inhibition of Psi+ prion determinant propagation by a mutation of the N-terminus of the yeast Sup35 protein, EMBOJ., 17, 5805-5810.

73. DePace A.H., Santoso A., Hillner P., Weissman J.S. (1998), A critical role for amino-terminal glutamine/asparagine repeats in the formation and propagation of a yeast prion, Cell, 93, 1241-1252.

74. Shkundina I.S., Kushnirov V.V., Tuite M.F., Ter-Avanesyan M.D. (2006), The role of the N-terminal oligopeptide repeats of the yeast Sup35 prion protein in propagation and transmission of prion variants, Genetics, 172, 827-835

75. Sherman F., Fink G.R., Hicks J.B. (1986) Methods in Yeast Genetics: A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Lab oratory Press.

76. Boeke J.D., LaCroute F., Fink G.R. (1984), A positive selection for mutants lacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5-fluoro-orotic acid resistance, Mol Gen Genet., 197, 345-346.

77. Sambrook, J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press.

78. ChernoffY.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. (1995), Role of the chaperone protein Hspl04 in propagation of the yeast prion-like factor psi+., Science, 268, 880-884.

79. Birnboim H.C., Doly J. (1979), A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523.

80. Rose M.D., Winston F., Hieter P. (1990), Methods in Yeast Genetics: A laboratory course manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA.

81. Sikorski RS, Hieter P. (1989), A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae, Genetics, 122, 19-27.

82. Parham S.N., Resende C.G., Tuite M.F. (2001), Oligopeptide repeats in the yeast protein Sup35p stabilize intermolecular prion interactions, EMBO J., 20, 2111-2119.

83. Cox B. (1965), A cytoplasmic suppressor of super-suppressor in yeast, Heredity, 20, 505-521.

84. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. (1981), Agents that cause a high frequency of genetic change from psi+. to [psi-] in Saccharomyces cerevisiae, Genetics, 98, 691-711.

85. Gietz R.D., Woods R.A. (2002), Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method, Methods Enzymol, 350, 87-96.

86. Inoue H, Nojima H, Okayama H. (1990), High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids, Gene, 96, 23-28.

87. Bradford M.M. (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem., 72, 248254.

88. Laemmli U.K. (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature 227, 680-685.

89. Bagriantsev S.N., Kushnirov V.V., Liebman S.W. (2006), Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis, Methods Enzymol., 412, 33-48.t

90. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. (1979), Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc Natl AcadSci USA, 16,4350-4354.

91. Liu J.-J., Sondheimer N. & Lindquist S.L. (2002), Changes in the middle region of Sup35 profoundly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeast prion />¿7+., Proc Natl AcadSci USA, 99,. 16446-16453.

92. Osherovich L.Z., Cox B.S., Tuite M.F., Weissman J.S. (2004), Dissection and design of yeast prions, PLoSBiol., 2, E86.

93. Kajava A.V., Baxa U., Wickner R.B., Steven A.C. (2004), A model for Ure2p prion filaments and other amyloids: the parallel superpleated beta-structure, Proc Natl Acad Sci U S1. A., 101, 7885-7890.

94. Ross E.D., Edskes H.K., Terry M.J., Wiekner R.B. (2005), Primary sequence independence for prion formation, Proc Natl Acad Sci USA., 102, 12825-12830.

95. Я очень признательна А.И. Александрову, М.О.Агафонову, О.В. Митькевич, В.Н. Уракову, Г.В. Фоминову, Н.В.Кочневой-Первуховой, И.А. Валуеву, И.С. Шкундиной за полезные методические советы, обсуждение результатов работы и дружеское участие.

96. Я хочу выразить бесконечную благодарность моей семье за то, что поддержали мое желание заниматься наукой и помогали мне на этом трудном пути, а также моим самым лучшим друзьям Василию Асееву и Александру Бюллю за их понимание и терпение.