Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы активации орфановых рецепторов пятого подсемейства: биохимические и рентгеноструктурные исследования

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы активации орфановых рецепторов пятого подсемейства: биохимические и рентгеноструктурные исследования"

На правах рукописи

Крылова Ирина Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ ОРФАНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПЯТОГО ПОДСЕМЕЙСТВА: БИОХИМИЧЕСКИЕ И РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2003

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) и в Университете Калифорнии в Сан-Франциско (Сан-Франциско, США).

Научные руководители:

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Ляхович В.В.; доктор биологических наук, профессор Холли А. Инграхам

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Гуляева Л.Ф.

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М.

Ведущая организация:

ГУ Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск)

Защита состоится " 14" ноября 2003 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимако-ва, 2; тел.: 8-3832-33-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан "13" октября 2003 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

TZfsf

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Наследственная предрасположенность, хронический стресс, приводящий к нарушению баланса гормонов надпочечников, а также неправильный образ жизни, приводящий к нарушению липидного обмена, являются факторами риска для таких болезней как неврозы, сердечно-сосудистые заболевания и диабет, поэтому исследование механизмов активации рецепторов гормонов, вовлеченных в регуляцию стресса и контроль липидного обмена, имеет важное значение для понимания этиологии этих патологий и разработки методов их коррекции (Chawla, 2001).

В многоклеточных организмах гормональная регуляция контролирует все аспекты развития и обмена веществ. Биологическая активность гормонов реализуется через рецепторы, расположенные как на поверхности, так и внутри клетки. Воздействием на трансмембранные или внутриклеточные ядерные рецепторы объясняется механизм действия более, чем трети лекарственных препаратов, выпускаемых в настоящее время, что обусловливает огромное биомедицинское значение изучения рецепторов гормонов (Willson, Moore, 2002).

Ядерные рецепторы - это белки со стандартной для этих транскрипционных факторов доменной организацией. ДНК-связывающий домен ядерных рецепторов связывается со специфическими для каждого рецептора гормоночувствительными элементами, содержащимися в промоторных участках контролируемых генов, в то время как основная функция лиганд-связывающего домена заключается во взаимодействии с регуляторными транскрипционными факторами. В случае активируемых гормоном рецепторов связывание гормона с лиганд-связывающим доменом приводит к возникновению аффинности к активаторам транскрипции и приводит к транскрипционной активации. В отсутствие лиганда такой рецептор имеет аффинность к репрессорам транскрипции. Шарнирный домен, расположенный между ДНК-связывающим и лиганд-связывающим доменами, играет важную роль в модуляции активности ядерных рецепторов (Steinmetz, 2001).

К числу небольших липофильных молекул, способных проникать через клеточную мембран)' и связываться с лиганд-связывающичи доменами соответствующих внутриклеточных (ядерных) рецепторов, относятся эстрогены, андрогены, глюкокортикоиды, витамины А и D; тогда как для половины известных ядерных рецепторов активирующие гормоны не идентифицированы, что является причиной классификации таких рецепторов как орфано-вых (или сиротских). Орфановые рецепторы Steroidogenic Factor-1 (SF-1) и Liver Receptor Homolog-I (LRH-1) имеют важное значение в раннем развитии, тогда как во взрослом организме SF-1 и LRH-1 вовлечены в регуляцию функционирования стероидогенных органов (таких как гонады и надпочечники) и липидного метаболизма

LRH-1 является одним из компонентов петли обратной связи, регулирующей обмен желчных кислот, где он контролирует транскрипцию холе-стерин-7а-гидроксилазы (CYP7A) - ключевого фермента биосинтеза желчных кислот, а также 12-а-гидроксилазы (CYP8B1) - фермента, определяющего степень гидрофобности циркулирующего пула желчи (Lu, 2000). К числу контролируемых LRH-1 генов относится также ароматаза (Сур 19) - фермент группы цитохромов Р450, превращающий андрогены в эстрогены. Роль LRH-1 в регуляции холестеринового обмена охватывает также обратный транспорт холестерина: показано, что LRH-1 контролирует транскрипцию белков, важных для этого метаболического пути, а именно рецептора для модифицированных липопротеинов и белка-транспорта эфи-ров холестерина СЕТР (Schoonjans, 2002).

В свою очередь, SF-1 играет ключевую роль в регуляции транскрипции генов, необходимых для продукции глюкокортикоидов и участвующих в синтезе стероидных гормонов.

В частности, SF-1 регулирует транскрипцию ароматазы и надпочечнико-вых гидроксилаз (ферментов группы Р450, синтезирующих стероидные гормоны); кроме того, SF-1 регулирует транскрипцию генов пептидных гормонов (гонадотропин-релизинг- фактора, адренокортикотропин-релизинг-фактора, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующе-го гормона, адренокортикотропного гормона) и их рецепторов (Parker, 2002).

Мыши с одной копией гена SF-1 проявляют ослабленную реакцию на стресс, а гетерозиготные ХУ пациенты с мутацией в гене SF-1 страдают острой надпочечниковой недостаточностью и являются фенотипическими женщинами. К числу контролируемых SF-1 генов относятся ключевой фермент биосинтеза холестерина -HMG-CoA-редуктаза, и рецептор для модифицированных липопротеинов, что указывает на важную роль SF-1 в контроле обмена холестерина (Parker, 2002, Achermann, 2001).

Таким образом, выяснение механизмов регуляции активности SF-1 и LRH-1 имеет огромное значение для понимания этиологии многих эндокринных патологий и нарушений обмена холестерина. Поскольку нарушение работы генов, играющих важную роль в раннем развитии, часто ассоциировано со злокачественной трансформацией клеток, исследование механизмов активации SF-1 и LRH-1 может внести вклад в понимание этиологии некоторых форм рака - в частности, рака надпочечников, где особенно хорошо экспрессирован SF-1, и рака органов пищеварительной системы, экспресси-рующих большие количества LRH-1.

Несмотря на важную роль SF-1 и LRH-1 в регуляции транскрипции контролируемых ими генов, механизмы действия этих рецепторов неизвестны. В экспериментах по экспрессии SF-1 и LRH-1 в культуре клеток млекопитающих эти рецепторы проявляют конститутивную активность, то есть ак-

тивируют транскрипцию репортерных конструктов в отсутствие лигандов. Противоречивость информации о гормональных лигандах и отсутствие рентгеноструктурных моделей лиганд-связывающих доменов SF-1 и LRH-1 являются основными препятствиями в понимании механизмов действия этих орфановых рецепторов. Было высказано предположение, что 25-гидроксихолестерин является лигандом для SP-1 (Lala, 1997), но это предположение не было подтверждено дальнейшими исследованиями (Mellon, 1998). Существуют данные, что активность как SF-1, так и LRH-1 может регулироваться через киназные пути, но механизмы этой активации и природа киназы остаются неизвестны. SF-1 является фосфопротеином, но при этом неизвестно, может ли фосфорилирование имитировать действие ли-ганда, так как структурная роль фосфорилирования в активации SF-1 не изучена.

Таким образом, исследование механизмов активации SF-1 и LRH-1 является важной научной проблемой, имеющей большое значение для биомедицинской науки.

Цель исследования. Целью настоящей работы является исследование молекулярных механизмов активации орфановых ядерных рецепторов подсемейства 5а.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить структурные механизмы активации SF-1 и LRH-1 через киназные пути и исследовать роль фосфорилирования в активации SF-1.

2. С помощью ПЦР создать суперпродуцентный конструкт, экспресси-рующий лиганд-связывающий домен LRH-1 в кишечной палочке, и получить очищенный белок.

3. Получить подходящие для рентгеноструктурного анализа кристаллы лиганд-связывающего домена SF-1 или LRH-1 и определить структуру этого домена.

4. На основе полученной кристаллографической модели определить структурные механизмы активации рецепторов подсемейства 5а.

5. На основе полученной кристаллографической модели определить структурные детерминанты мономерности рецепторов подсемейства 5а.

Научная новизна работы. В результате данного исследования было впервые показано, что зависимое от стимуляции митоген-активируемых киназных путей фосфорилирование серина 203 на SF-1 необходимо для максимальной активации рецептора и может осуществляться МАР-киназой Erk-2, а также вызывает конформационное изменение в шарнирном домене, сопровождающееся повышением стабильности рецептора.

Впервые была получена рентгеноструктурная модель лиганд-связывающего домена LRH-1, продемонстрировавшая, что в соответствии с конститутивно активной модальностью рецепторов подсемейства 5а лиганд-

связывающий домен LRH-1 находится в активной конформации, стабилизируемой с помощью нового структурного элемента - жесткой и длинной спирали Н2, и имеет большой полностью закрытый и неоккупированный лигандный карман, причем все мутанты с заполненным объемными боковыми цепями лигандным карманом имели активность, сравнимую с активностью LRH-1 дикого типа, что свидетельствует об отсутствии необходимости присутствия лиганда для поддержания активности рецептора. На основании полученной рентгеностуктурной модели LRH-1 была построена модель лиганд-связывающего домена SF-1, позволившая найти структурное объяснение патологическому фенотипу человеческой мутации SF-1R2S5L.

Практическая значимость работы. Результаты данного исследования имеют большое практическое значение для медицины, поскольку получение рентгеноструктурной модели LRH-1 позволяет построить высокоточную модель лиганд-связывающего домена SF-1 и сделать заключение о структурных механизмах патологий у пациентов с мутациями в гене SF-I; кроме того, информация о координатах лигандного кармана позволяет с помощью компьютерного моделирования вести рациональный поиск потенциальных лигандов, который, в случае успеха, позволит разработать новые лекарственные препараты, направленные на коррекцию нарушений баланса стероидных гормонов и липидного обмена.

Положения, выносимые на защиту:

1. Фосфорилирование SF-1 стабилизирует структуру рецептора и усиливает белок-белковое взаимодействие с корегуляторами.

2. Конститутивная активность LRH-1 не зависит от действия лиганда.

3. Спираль Н2 является структурным элементом, ответственным за активную конформацию и конститутивную активность LRH-1.

4. Наружная поверхность спирали Н2 образует поверхность белок-белкового взаимодействия.

5. Структурные детерминанты связывания с корегуляторами рецепторов подсемейства 5 а отличаются от таковых для стероидных рецепторов.

6. Негативные взаимодействия между отрицательно заряженными аминокислотными остатками, специфическими для подсемейства 5а, препятствуют образованию как гомо- так и гетеродимеров LRH-1.

Апробация работы. Результаты настоящего исследования были доложены на "Keystone Symposium on Nuclear Receptors" в 2000 году (Steamboat, Colorado) и 2002 году (Snowbird, Uta).

Публикации. По материалам диссертации имеется 8 печатных работ.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 112 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 27 рисунков и состоит из 6-ти разделов: введения; обзора литературы; материалов и методов; результатов и их обсуждения; выводов; а также списка цитируемой литературы, включающего 134 ссылки.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методы исследования

Для определения влияния фосфорилирования на стабильность белков и взаимодействие с корегуляторами проводилось in vitro реакция с киназой Erk-2. Эксперименты по трансфекции в культуре ткани проводились на клетках гепатокарциномы HepG2 с помощью препарата FuGENE 6 фирмы Roche. Активность люциферазы измерялась через 48 часов после трансфекции с использованием кита Enhanced Luciferase Assay Kit (BD PharMingen) на приборе Monolight 2010 (Analytical Luminescence laboratoiy). Стабильность белков определялась с помощью ограниченного протеолиза с химот-рипсином и температурного плавления; эксперименты по температурному плавлению белков под контролем кругового дихроизма осуществлялись на приборе Jasco J-715. Точечный мутагенез осуществлялся с помощью поли-меразы Pfu, а \п vitro трансляция - с помощью TNT системы транскрипции/трансляции фирмы Promega. Очистка белка проводилась методами аффинной, гидрофобной и ионообменной хроматографии. Аналитическое центрифугирование осуществлялось на ультрацентрифуге Beckman Optima XL-1 с детекцией на 277 нм. Подбор условий кристаллизации проводился с использованием растворов фирмы Hampton Research. Кристаллы были получены методом сидячей капли в присутствии криопротектора и заморожены в жидком азоте. Рамки дифракции с разрешением до 2.2 Á собирались на синхротроне Advanced Light Source (Lawrence Berkeley National Laboratory) на линии 8.3.1 (k= 1.1 Ä). Данные были обработаны и интегрированы с помощью программ DENZO и SCALEPACK.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние фосфорилирования SF-1 по серину 203 на транскрипион-ную активность и конформацию SF-1. Ранее было показано, что стимуляция киназных путей с помощью пептидных гормонов, факторов роста, а также агентов, повышающих внутриклеточную концентрацию цАМФ, приводит к росту транскрипционной активности SF-1 и фосфорилированию SF-1 по серину 203. Поскольку серин 203 расположен внутри мотива PYASP, родственного консенсусному мотиву серин/треониновых MAP ки-наз PX„S/TP, было высказано предположение, что фосфорилирование сери-на 203 является зависимым от MAP киназы.

Для проверки гипотезы о том, что SF-1 фосфорилируется MAP киназой in vitro были сконструированы в виде химер с белком glutathione S-transferase (GST), пять белков: SF-1265"462, SF-1 178-462, SF-1,78"462<S203A), SF-

, 180-265 , 180-265ÍS201A) xr

1 и SF-1 , причем все пять белков содержали N-

терминальный сайт фосфорилирования для киназы мышцы сердца (heart muscle kinase, НМК), выполнявший функцию внутреннего контроля фосфо-

рилирования. Как показано на рисунке 1, только SF-1 178-462 и SF-1180"265, но не SF-1265"462 или SF-l178"462™ подверглись in vitro фосфорилированию MAP киназой Erk-2.

OfTAfl АГ1««»* I ВО SSi АГ1 Aft**"*» в» MF1 AH"** UK

Coom«*»i« ник Eifcz

Рисунок 1. Серии 203 в SF-1 фосфорилируется MAP киназой Erk2 in vitro.

Глютатион тиотрансфераза (GST), имеющая сайт для киназы мышцы сердца, а также химерные с GST и сайтом фосфорилирования киназой мышцы сердца белки

„„. 180-265 „„ , 180-265(S203A) ,265-462 , л. л. .

sl'-l , Sr-1 и SI -1 были подвергнуты фосфорилированию ш vitro

MAP киназой Erk2. Только SF-1180"265 подвергся очень значительному фосфорилиро-

„ о . - от, ,180-265(S203A)

ванию киназои Erk2, в то время как SF-1 подвергся очень незначительно-

му фосфорилированию, а GST-SF-1 вообще не подвергся фосфорилированию.

Последующий эксперимент с in vitro транслированными коактиватором и корепрессором (рисунок 2) показал, что фосфорилирование усиливает взаимодействие с корегуляторами, что было дополнительно подтверждено экспериментом по котрансфекции SF-1 и SF-lS203Ac коактиватором и корепрессором в клетки хориокарциномы человека.

lOfbinput

pgrip mm

pSMRT

pG RIP

pSMRT 1

Щ$

G STSf 1 AF1/LBD

GST-SF1 AF1

GST -Erk2 +El*2

Рисунок 2. Фосфорилирование повышает силу белок-белковою взаимодействия SF-1 с корегуляторами. Взаимодействие нефосфорилированных и фосфори-лированных in vitro GST-SF-1178-462 и GST-SF-1180-265 с корегуляторами GR1P-1 и SMRT. Верхняя панель: взаимодействие возрастающих количеств (2. 5 и 10 мкг) с GST (три левые линии), нефосфорилированным GST-SF-1178-462 (три средние линии) и in vitro фосфорилированным с помощью Erk2 SF-1178-462 (три правые ли-

нии) с 6

S-мечеными GR1P-1 и SMRT. Нижняя панель: взаимодействие возрастаю-

тих количеств (2, 5 и 10 мкг) с GST (три левые линии), нефосфорилированньгм GST-SI'-1180-265 (три средние линии) и in vitro фосфорилированным с помошыо Erk2 SF-1180-265 (три правые линии) с 35S-mc4ciii>imh GRIP-1 и SMRT. Фрагменты SF-1 были иммобилизованы на GST-сефарозе и инкубированы с in vitro транслированными ^-мечеными, фосфорилированы или пет in vitro GRIP-1 и SMRT.

Поскольку конформационные изменения в лиганд-активируемом рецепторе, индуцированные связыванием лиганда, сопровождаются повышением стабильности рецептора, на поставленный в предыдущей главе вопрос было решено ответить с помощью прямого измерения стабильности фосфорили-рованного и нефосфорилированного SF-117S'462 методом температурного плавления с одновременным измерением сигнала кругового дихроизма. Эти эксперименты показали, что фосфорилирование приводило к повышению температуры плавления фосфорилированого in vitro SI7-1,7iM62 всего на два градуса, тогда как связывание лиганда с лиганд-активируемым рецептором (T3R) приводило к повышению температуры плавления лиганд-связывающего домена T3R на 16 градусов.

SF-1 Hinge LBD

179 282 219 264 врет(шнj 0 5 10 IS 0 5 ТО IS

III |

46?

Hinge

LBD

^^fHSBfejI^t щщтчтщ/тмш

А Б + Егк2

Рисунок 3. Фосфорилирование ссрина 203 вызывает конформационное изменение в шарнирном домене. (Л) Схематическое »'¡поражение фрагмента ЭР-!, подвергнутого офаниченному протеолизу е химофипсином, сверху обозначена Т^-терминальная аминокислота соответствующего химотрипсипового фрагмента (Б) Очищенный рекомбинантный ЭР-!|78"462, т гИго фосфорилированый (справа, + Егк-2) или нет (слева) с помощью рекомбинантной киназы Егк-2 (12,5 мкг 8Р-1 на реакцию) был подвергнут ограниченному протеолизу с химотрипсином в течение 5, 10 или 15 минут. Четыре протеолитических фрагмента были идентифицированы секве-нированием по Эдману.

Таким образом, фосфорилирование 8Р-1 по серину 203 аналогично связыванию лиганда с лиганд-активируемым рецептором тем, что оно усиливает взаимодействие с корегуляторами, индуцирует конформационное изменение в лиганд-связываюшем домене и повышает стабильность рецептора, тем не менее, вызванный фосфорилированием масштаб стабилизации рецептора драматически меньше масштаба стабилизациии, индуцированной связыванием лиганда. Таким образом, представляется маловероятным, что фосфорилирование серина 203 отвечает за конститутивно активное состояние 8Р-1. Приведенные данные скорее свидетельствуют о модулирующей активность роли фосфорилирования.

SF-1 8F-1 + Erk2

♦ 26-OHC »гв-онс

Рисунок 4. Фосфорилирование SF-1 приводит к уменьшению чувс1ви1сль-носги к протеазе. Полноразмерный З53-меченый in vitro транслированный HA-SF-1 был очищен с помощью иммунопреципитации с антителами против НА-тага на бе-локА-сефарозе, in vitro фосфорилирован (+ Erk-2) или нет с помощью рекомбинант-ной киназы Erk-2 и подвергнут ограниченному npoicojimy с возрастающими количествами химотринсина (40, 80, 160 и 200 нг/мл), в присуюшии или отсутствии 25-гидрокеихолеетерина.

Чтобы ответить на вопрос о том, каковы структурные детерминанты конститутивной активности ядерных рецепторов подсемейства 5а, мы решили получить рентгеноструктурную модель лиганд-связывающего домена одного из этих рецепторов.

Структурные основы независимой от лиганда активности орфано-вых рецепторов подсемейства NR5a. Рентгеноструктурный анализ лиганд-связывакнцих доменов в апо-форме и в комплексе с лигандом показывает консервативность общего плана строения этого домена, составленного 11 -13 а-спиралями и двумя короткими p-поворотами, уложенными в три антипараллельных слоя вокруг внутреннего гидрофобного лиганд-связывающего кармана.

Как результат первых полученных рентгеноструктурных моделей ли-ганд-связывающих доменов ядерных рецепторов - RXRa в апо-форме и RARy в комплексе с лигандом-агонистом и лигандом-антагонистом - была предложена модель активации лиганд-связывающего домена по принципу «мышеловки», согласно которой в ядерных рецепторах спираль Н12 играет роль дверцы, запирающей лиганд. Когда лиганд отсутствует (что соответствует неактивной конформации рецептора), спираль HI2 отходит в сторону от тела лиганд-связывающего домена, оставляя вход в лигандный карман открытым. После попадания лиганда в карман спираль 12 плотно прижимается к телу LBD, закрывая вход в карман.

Индуцированное связыванием лиганда конформационное изменение приводит к тому, что поверхность лиганд-связывающего домена приобретает способность взаимодействовать с коактиваторным комплексом, что является первой необходимой ступенью на пути к инициации транскрипции. В отсутствие лиганда ядерный рецептор имеет наибольшее сродство в коре-прессорному комплексу.

Рисунок 5. Одна из рамок дифракции и кристалл лиганд-связывающего домена ЫШ-1.

ЫШ-1 содержит большой, но пустой лигандный карман. Рентгено-структурный анализ выявил большой (-820 А3) лигандный карман, полностью окруженный 28-ю гидрофобными (за исключением принадлежащих спирали Н5 остатков Б408, Н409 и Я412) аминокислотными остатками, выстилающими его стенки (рисунок 6А, Б, В, Г).

I \ /О

I

Рисунок 6. Лиганд-связмваюший карман ЫШ-1. (Л) Фрагмент карты электронной плотности литанд-связывающего кармана ЬКИ-1 показывает отсутствие лиганда в кармане. (Б) Лиганд-связывающий карман ЬЯН-! достаточно велик, чтобы вместить 9-цис-ретиноевую кислоту (нагуральный лиганд ЯХКа). (В) Внутренняя поверхность кармана: выстилающие карман гидрофобные и полярные аминокислотные остатки окрашены серым и желтым, а положительно и отрицательно заряженные остатки окрашены красным и синим, соответственно. Стенки полости кармана обозначены зеленой штриховкой. (Г) Эффект мутации А368)У на размер и форму кармана.

Чтобы проверить, является ли конститутивная активность ЬЯН-1 независимой от лиганда, потенциально присутствующего в клетках гепатокарци-номы НерС2, мы сконструировали мутации в лигандном кармане таким образом, чтобы пространственно воспрепятствовать вхождению и связыванию такого лиганда.

ш-о

9

о ¡ЙОТ

ЛЕВО

ва* б«4 вы ем А368Я АЗИИ А55Л7 А532М

емт аз4 ем ем

Л 080 А3««¥ АЗИИ ЛИ» А5ЙМ

д нираг

рв*-КЕ Я+УР18ш$НР

.111) .ИЙ .1.1. ||Н1.1|||

емют ом вы ем

Д»И> швм А36Ш мот Д533Я

т

Оа«ЮТ 6»« 1080 АЗ)»»

ем

А53ЛЧ

6*»

Рисунок 7. Присутствие лнгаида не является необходимым для активации

ЫШ-1. (А) Котрансфекция 40 нг химерного с Оа14ПВО-ЬКИ-1 АОВО дикого типа и четырех вариантов 0а140ВП-1,КП-1 АВВП рецептора с мутациями в лиганд-связывающем кармане (A368W, А368М, А532\\', А532М), с возрастающими количествами (0, 30, 80 и 200 нг) корегуляторов УР16-ш8НР и р805-0К1Р-1 в клетки НерС2. (Б) Котрансфекция 40 нг ЬГ<Н-1 дикого типа и четырех вариантов рецептора с мутациями в лиганд-связывающем кармане с возрастающими количествами (0, 30, 80 и 200 нг) коактиваторов рсШЛЗ-А1В1 и рЭСб-ОШР-! в клетки НерС2.

Предполагалось, что, если лиганд действительно необходим для активности рецептора, эти мутации должны привести к ослаблению или полному прекращению транскрипционной активности ЫШ-1. Эксперименты по измерению транскрипционной активности как белка дикого типа, так и белков с мутациями в лигандном кармане показали, что введение объемных боковых групп в лигандный карман не снижало транскрипционную активность 1ЖН-1 (рисунки 7А, 7Б).

В результате описанных выше экспериментов было показано, что наличие лиганда в лигандном кармане не является необходимым условием как для транскрипционной активности, так и для активной конформации ЫШ-1.

Таким образом, возникает вопрос: как же полученная рентгеноструктурная модель объясняет активную (в отсутствие лиганда) конформацию ЫШ-1?

Структурная модель активации ЫШ-1. Рентгеноструктурный анализ показал, что спираль Н2 прямо или опосредованно контактирует с семью структурными элементами, положение которых определяет активную конформацию рецептора (рисунок 8А). Таким образом, было высказано предположение, что спираль Н2 выполняет роль "наружного гормона", как проиллюстрировано на рис. 8Б.

Рисунок 8. Структурная модель активации 1ЛН-1. (А) Семь структурных элементов [^ХЯа, определяющих активную конформацию рецептора (конформация и позиция этих элементов определяется наличием или отсутствием лиганда в лиганд-ном кармане). (Б) В ЦШ-1, спираль Н2 прямо или опосредованно контактирует с семью структурными элементами, определяющими активную конформацию рецептора, выполняя роль "наружного лиганда" (спиральШ выделена красным цветом).

Чтобы проверить предположение о том, что спираль Н2 является интегральным стабилизирующим структурным элементом, ответственным за активную конформацию рецептора, были проведены следующие экспери-

Ю52Н

менты: были созданы мутантные белки ЬЯН-1 ' и 5Р-1 с мутацией в позиции, соответствующей человеческой мутации в лиганд-связывающем домене 8Р-1; активность мутантных белков была проверена в экспериментах в культуре клеток НерС2. Согласно полученной нами модели мутация Я352Ь должна вызвать дестабилизацию контактов между спиралями Н2 и НЗ; более того, замена 11352 на такие аминокислотные остатки, как К352Е или Я3520, привносящие заряд противоположного аргинину знака должна была, предположительно, привести к изменению положения спирали НЗ, вследствие дестабилизации контактов между спиралями Н2 и НЗ.

400000 3SOOQO ЗООООО 250000 200000 -150000 100000 50000 О

Д H«pG2

■ pCt-LRH-1 WT В рСМЛИ-11Ш2Е

III

firttfN «ж#ие «>«ж ««им* «яип нппт пппт

mSHP й »WW « 38 Х3»9в

Рисунок 9. Мутации в основании спирали Н2 нарушают взаимодействие SF-1 и LRII-1 с корегуляторами. (А) Котрансфекции LRH-lR352fc с возрастающими количествами коактиватора GRIP-1 и корепрессоров SMRT и mSHP в клетки HepG2. (Б) Котрансфекции SF-lR255Lc возрастающими количествами mSHP в клетки HepG2. (В) Окрашенная в соответствии со степенью термодинамической стабильности модель лиганд-связывающего домена SF-I, построенная на основании координат модели лиганд-связывающего домена LRH-1; R255 в основании спирали Н2 показан в объеме. (Г) Та же модель, развернутая на 90°; спираль Н2 выделена зеленым цветом.

Действительно, котрансфекция LRH-1r352e с известным ингибитором активности LRH-1, атипичным орфановым рецептором SHP (small hetero-dimeric partner), показала полное отсутствие ингибирующего эффекта SHP на транскрипционную активность мутантного белка. В то же время, стимулирующее воздействие коактиватора GRIP-1 на активность LRH-1R352E был значительно слабее, чем таковой для дикого типа LRH-1. Эти данные были подкреплены результатами эксперимента по котрансфекции SF-1R255L с SHP, показавшими, что активность мутантного белка не поддается репрессивному действию SHP, в отличие от SF-1 дикого типа (рисунок 8А, Б, С, Г, Д).

Данный эксперимент подтверждает правильность нашей структурной модели LRH-1, в которой спирали Н2 отводится роль интегрального стаби-

лизирующего элемента, ответственного как за активную конформация LRH-1, так и за конститутивную активность этого орфанового рецептора.

Архитектура коактиваторной бороздки LRH-1. В эксперименте по влиянию фосфорилирования на связывание корегуляторов (рисунок 2) было замечено, что сила этого связывания была намного слабее, чем в описанных в литературе подобных экспериментах с лиганд-активируемыми рецепторами. Аналогичные различия в силе взаимодействия наблюдались также в экспериментах по связыванию флуоресцентно меченых LXXLL -пептидов (рисунок 10 В). Наличие модели дало возможность ответить на вопрос о том, каковы структурные детерминанты этих различий.

Чтобы определить, какова геометрия помещения коактиваторного пептида с мотивом LXXLL в коактиваторную бороздку лиганд-связывающего домена LRH-1, был проведен проиллюстрированный на рисунке 9А эксперимент по компьютерному моделированию с использованием рентгеност-руктурной модели LRH-1 и координат LXXLL-пептида из модели RXRa (код 1MZN для Protein Data Bank).

Данный эксперимент показал, что хотя лиганд-связывающий домен LRH-1 способен к связыванию коактиваторного пептида, несколько специфических для подсемейства 5а аминокислотных остатков или пространственно мешают оптимальному связыванию, или лишены заряда, необходимого для высокоаффинного связывания.

Оптимальное помещение пептида в коактиваторную бороздку получалось только при изменении боковых цепей четырех аминокислотных остатков: R380 (НЗ), Q398 и М394 (Н4), и N549 (Н12) (рисунок 9Б). У лиганд-активируемых рецепторов на месте R380 находится лизин, который является частью электростатического замка, стабилизирующего комплекс рецептора с коактиватором, а на месте Q398 обычно находятся аргинин или лизин, выполняющие функцию стабилизации позицию С-терминального конца спирали HI2. На месте двух других остатков (М394 и N549), имеющих относительно большие боковые цепи, обычно находят аминокислотные остатки с маленькими боковыми цепями, такие как A/S/T/V/P.

M394V/N549T

Мы создали мутантный белок LRH1 , в котором две специфи-

ческие для орфановых рецепторов подсемейства NR5a аминокислоты в коактиваторной бороздке LRH-1 были изменены на соответствующие аминокислоты активируемого лигандом рецептора RXR. Измерение активности мутантного рецептора в клетках HepG2 с использованием репортера Aroluc

M394V/N549T

показало улучшение связывания LRH1 с шестью различными ко-

регуляторами транскрипции (включая как коактиваторы, так и корепрессо-ры). Данный результат свидетельствует о структурных различиях в механизмах связывания с корегуляторами между активируемыми лигандом рецепторами и рецепторами подсемейства 5а.

130

I 25

3

О

5 20 в

0

Ж

s 15 £

| ю s

1 5

О

6 о

Г

Aroluc

■ PCI4.RH-1 WT В pCI-mCI«fl (M334VIMS4»T)

ЗШ! Säi» SSI Л! 1

кокшшищир веж*

♦SHP

Рисунок 10. Архитектура коактиваторной бороздки LRH-1. (А)

Суперпозиция LRH-1 спиралей (оранжевый цвет), образующих поверхность связывания корегуляторов, с соответствующими спиралями RXRa (голубой цвет, PDß код 1MZN); LXXLL-пептид показан серым. (Б) Специфические для подсемейства 5а аминокислоты в коактиваторной бороздке обозначены в кодовых для атомов цветах. (В) Связывание флюоресцентно меченых NR-бокс LXXLL-пептидов с возрастающими концентрациями очищенного лиганд-связывающего домена LRH-1. (Г) Влияние повышающихся количеств SHP, AIB1, GR1P-1, СВР, SMRT и SRC на

I г>т. . i птт1 M394V/N549T „

активность дикого типа LRH-1 и LRH1 в клегках HepG2, измеренную с

использованием репортера Aroluc.

Структурное объяснение мономерной природы LRH-1. В соответствии с мономерной модальностью связывания ядерных рецепторов подсемейства 5а с гормоночувствительными элементами, только мономеры были найдены в кристаллах LRH-1. Результаты аналитического ультрацентрифугирования препаратов лиганд-связывающих доменов LRH-1 и SF-1 показали, что эти белки в растворе представлены гомогенной популяцией мономе-V ров. Топологическая консервация поверхностей димеризации в ядерных

рецепторах позволила нам создать виртуальную поверхность димеризации лиганд-связывающего домена LRH-1 с помощью суперпозиции электронных координат модели 1FBY (представляющей активную конформацию RXRa) с координатами нашей рентгеноструктурной модели.

Изучение поверхности димеризации между мономерными субъединицами в виртуальном гомодимере LRH-1 показало, что гомодимеризации ли-ганд-связывающего домена LRH-1 препятствуют силы отталкивания между боковыми цепями некоторых аминокислот. Кроме того, боковые цепи ряда других аминокислот пространственно препятствуют взаимодействию между двумя поверхностями. Наиболее резко силы отталкивания проявляются во взаимодействии между двумя остатками глютаминовой кислоты, Е494 и Е513 (рисунок 10А).

Важно отметить, что во всех рецепторах с димерной модальностью на месте Е513 (в начале спирали НЮ) находится остаток маленькой незаряженной аминокислоты (к примеру, глицин в RXRa, рисунок 10В). Потенциальный гетеродимер между RXRa и LRH-1 тоже не представляется возможным, из-за препятствия со стороны сил отталкивания между Е513 LRH-1 и Е404 RXRa (рисунок 10 Б).

Таким образом, полученная нами модель LRH-1 объясняет неспособность лиганд-связывающих доменов ядерных рецепторов подсемейства 5а образовывать как гомо-, так и гетеродимеры.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что орфановый рецептор SF-1 фосфорилируется in vitro МАР-киназой Erk-2 по серину 203.

2. Показано, что фосфорилирование SF-1 по серину 203 вызывает кон-формационное изменение в шарнирном домене, повышает устойчивость SF-1 к воздействию химотрипсина и приводит в повышению температуры плавления лиганд-связывающего домена SF-I. При этом условный лиганд SF-1 25-гидроксихолестерин стабилизирующим действием не обладал.

3. Получены кристаллы лиганд-связывающего домена орфанового рецептора LRH-1 с разрешением до 2,2 А.

4. Получена рентгеноструктурная модель лиганд-связывающего домена LRH-1.

5. Приведены свидетельства структурных различий в механизмах связывания с корегуляторачи между рецепторами, активируемыми лигандоч, и рецепторами подсемейства 5а.

6. Предложен новый механизм стабилизации активной конформации, лежащий в основе конститутивной активности орфановых рецепторов подсемейства NR5a.

7. Открыты структурные детерминанты мономерности рецепторов подсемейства NR5a.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Hammer, G. D., Krylova, I., Zhang, Y., Darimont, B. D., Simpson, K., Weigel, N. L., and Ingraham, H. A. «Phosphorylation of the nuclear receptor SF-1 modulates cofactor recruitment: integration of hormone signaling in reproduction and stress». Mol Cell, 1999,3 (4), 521-526.

2. Desclozeaux, M., Krylova, 1. N., Horn, F., Fletterick, R. J., and Ingraham, H. A. «Phosphorylation and intramolecular stabilization of the ligand binding domain in the nuclear receptor steroidogenic factor 1». Mol Cell Biol, 2002, 22 (20), 7193-7203.

3. Sablin, E. P., Krylova, 1. N., Fletterick, R. J., and Ingraham, H. A. «Structural basis for ligand-independent activation of the orphan nuclear receptor LRH-1». Mol Cell, 2003, 11 (6), 1575-1585.

4. Krylova, I. N. «Biochemical studies on orphan nuclear receptor, SF-1». Master of Science Thesis at San Francisco State University, 2003.

5. Krylova, I.N., Huber, B.R., Fletterick, R.J., Ingraham, H.A. "Probing the conformation of Steriodogenic Factor 1". Abstract and poster № 427, Keystone symposium on nuclear receptors, Steamboat CO, USA, 2000.

6. Desclozeaux, M, Krylova, Ingraham, H.A. "Effects of MAP kinase pathway activation on SF-1 and SF-1/thyroid receptor chimera. " Abstract and poster № 114, Keystone symposium on nuclear receptors, Steamboat CO, USA, 2000.

7. Kiylova, I.N., Desclozeaux, M, Bland, M.L., Phu, T, Ingraham, H.A. "In vivo phosphorylation of Steroidogenic Factor 1: in multiple endocrine cell types: Refutation by hormone signaling and activation of endocrine axes."Abstruct and poster № 539, Keystone Symposium on Nuclear Receptors Snowbird, Uta, 2002.

8. Desclozeaux, M, Krylova, I.N., Horn, F., Fletterick, R.J., Ingraham, H.A. " Phosphorylation and intramolecular stabilization of the ligand-binding domain of the nuclear receptor, SF-l".Abstruct and poster № 516, Keystone Symposium on Nuclear Receptors Snowbird, Uta, 2002.

Зак 58, Тир 100 Печ л 1,0 Формат 60x84/16 Бумага офсетная

Типография СО РАМН, Новосибирск, ул Ак Тимакова, 2/12, 2003 г

" \6?s4

»1S 9 S 4

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Крылова, Ирина Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. 1. Ядерные рецепторы и механизмы регуляции их активности.

1. 1. 1. Суперсемейство ядерных рецепторов: биомедицинское значение, филогения и номенклатура.

1.1.2. Роль состояния хроматина в активации транскрипции ядерными рецепторами.

1. 1. 3. Доменная структура ЯР.

1. 1.4. Особенности связывания ЯР с гормоночувствительными элементами.

1. 1. 5. Лиганд-связывающий домен - мышеловка для лиганда.

1. 1.6. Связывание корегуляторов и коактиваторный карман.

1. 1.7. Корегуляторы, отличные от коактиваторов и корепрессоров.

1. 1. 8. Регуляция активности орфановых рецепторов.

1.1.9. Альтернативные механизмы регуляции активности ядерных рецепторов.

1. 2. Орфановые рецепторы подсемейства NR5а: роль в развитии и метаболизме и механизмы активации.

1.2. 1. Роль орфановых рецепторов стероидогенного фактора 1 и гомолога рецептора печени 1 в раннем развитии и метаболизме.

1. 2. 2. Мутации в гене SF-J у человека.

1. 2. 3. Роль LRH-1 в регуляции метаболизма холестерина.

1. 2. 4. SF-1 и LRH-1: механизмы активации, в отсутствие лиганда. ф- 1. 2. 4. 1. Роль Dax-1 и SHP в регуляции активности SF-1 и LRH-1.

1. 2. 4. 2. Активация SF-1 и LRH-1 через сигнальные пути.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы активации орфановых рецепторов пятого подсемейства: биохимические и рентгеноструктурные исследования"

Актуальность проблемы. Гормональная регуляция контролирует все аспекты развития и метаболизма многоклеточных организмов. Биологическая активность гормонов реализуется через рецепторы, расположенные как на поверхности, так и внутри клетки. Воздействием на трансмембранные или внутриклеточные ядерные рецепторы объясняется механизм действия более чем трети лекарственных препаратов, выпускаемых в настоящее время, что обуславливает огромное биомедицинское значение изучения рецепторов гормонов. К числу небольших липофильных молекул, способных проникать через клеточную мембрану и связываться с соответствующими внутриклеточными (ядерными) рецепторами, относятся эстрогены, андрогены, глюкокортикоиды, витамины А и D; в то же время, активирующие гормоны не идентифицированы для половииы ядерных рецепторов, что является причиной классификации таких рецепторов как сиротских, или орфановых [1].

Ядерные рецепторы - это белки со стандартной для этих транскрипционных факторов доменной организацией. ДНК-связывающий домен ядерных рецепторов связывается со специфическими для каждого рецептора гормоночувствительными элементами, содержащимися в промоторных участках контролируемых генов, тогда как основная функция лиганд-связывающего домена заключается во взаимодействии с регуляторными транскрипционными факторами. В случае активируемых гормоном рецепторов связывание гормона с лиганд-связывающим доменом приводит к возникновению аффинности к активаторам транскрипции и транскрипционной активации. В отсутствие лиганда такой рецептор имеет аффинность к репрессорам транскрипции. Шарнирный домен, расположенный между ДНК-связывающим и лиганд-связывающим доменами, играет важную роль в модуляции активности ядерных рецепторов [2].

Орфановые рецепторы Steroidogenic Factor-1 (SF-1) и Liver Receptor Homolog-1 (LRH-1), относящиеся к подсемейству NR5a, являются критическими организаторами раннего развития [2]. Во взрослом организме SF-1 и LRH-1 вовлечены в регуляцию функционирования органов гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой/гонадной оси и липидного метаболизма и контролируют работу генов, необходимых для синтеза стероидных гормонов и метаболизма холестерина [2]. SF-1'1' мыши лишены гонад, надпочечников и вентромедиального ядра гипоталамуса, а мыши с одной копией гена SF-1 проявляют ослабленную реакцию на стресс [2]. Гетерозиготные ХУ пациенты с мутацией в гене SF-1 страдают острой надпочечниковой недостаточностью и являются фенотипическими женщинами. Поскольку SF-1 и LRH-1 вовлечены в регуляцию биосинтеза и обмена стероидных гормонов и липидного метаболизма, исследование механизмов активации этих орфановых рецепторов имеет большое значение для понимания этиологии сердечно-сосудистых заболеваний и эндокринных патологий. Поскольку нарушение работы генов -критических организаторов раннего развития - часто ассоциировано со злокачественной трансформацией, исследование механизмов активации SF-1 и LRH-1 внесет вклад в понимание этиологии некоторых форм рака, в частности, рака надпочечников, где особенно хорошо экспрессирован SF-1, и рака органов пищеварительной системы, экспрессирующих большие количества LRH-1.

Поскольку лиганды для SF-1 и LRH-1 не идентифицированы, механизмы активации этих рецепторов неизвестны. Было высказано предположение, что 25-гидроксихолестерин является лигандом для SF-1, но это предположение не было подтверждено дальнейшими исследованиями. SF-1 является фосфопротеином, но при этом неизвестно, может ли фосфорилирование имитировать действие лиганда, так как структурная роль фосфорилирования в активации SF-1 не изучена. В отличие от «классических» ядерных рецепторов (таких как рецепторы стероидных гормонов), SF-1 и LRH-1 регулируют транскрипцию репортерных белков в культуре ткани конститутивно, т.е. независимым от лиганда способом. Механизм активации «классических» рецепторов был открыт благодаря получению рентгеноструктурных моделей лиганд-связывающих доменов этих рецепторов, тогда как структура лигандсвязывающих доменов SF-1 и LRH-1 неизвестна, поскольку отсутствуют соответствующие рентгеноструктурные модели.

Цель работы. Целью данной работы является исследование структурных механизмов активации ядерных рецепторов подсемейства пять, с использованием биохимических и рентгеноструктурных методов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить структурные механизмы активации SF-1 и LRH-1 через киназные пути и исследовать роль фосфорилирования в активации SF-1.

2. С помощью ПЦР создать суперпродуцентный конструкт, экспрессирующий лиганд-связывающий домен LRH-1 в кишечной палочке, и получить очищенный белок.

3. Получить подходящие для рентгеноструктурного анализа кристаллы лиганд-связывающего домена SF-1 или LRH-1 и определить структуру этого домена.

4. На основе полученной кристаллографической модели определить структурные механизмы активации рецепторов подсемейства NR5a.

5. На основе полученной кристаллографической модели определить структурные детерминанты мономерности рецепторов подсемейства NR5a. Научная новизна работы. В результате данного исследования было впервые показано, что зависимое от стимуляции митоген-активируемых киназных путей фосфорилирование серина 203 на SF-1 необходимо для максимальной активации рецептора, может осуществляться МАР-киназой Erk-2 и вызывает конформационное изменение в шарнирном домене, сопровождающееся повышением стабильности рецептора. Впервые была получена рентгеноструктурная модель лиганд-связывающего домена LRH-1. Эта модель продемонстрировала, что в соответствии с конститутивной модальностью активации рецепторов подсемейства пять, лиганд-связывающий домен LRH-1 находится в активной конформации, стабилизируемой с помощью нового структурного элемента - жесткой и длинной спирали Н2, и имеет большой, полностью закрытый и неоккупированный лигандный карман. При трансфекции в культуру клеток гепатокарциномы активность мутантов с заполненным объемными боковыми цепями лигандным карманом была близка к активности белка дикого типа, что свидетельствовало о необязательности лиганда для поддержания активного состояния рецептора. Впервые было найдено структурное объяснение мономерной модальности функционирования ядерных рецепторов подсемейства пять.

Практическая значимость работы. Результаты данного исследования имеют большое практическое значение для медицины, поскольку получение рентгеноструктурной модели LRH-1 позволяет построить высокоточную модель лиганд-связывающего домена SF-1 и сделать заключение о структурных механизмах патологий у пациентов с мутациями в гене SF-J', кроме того, информация о координатах лигандного кармана позволяет, с помощью компьютерного докинга, вести рациональный поиск потенциальных лигандов, который, в случае успеха, позволит разработать новые лекарственные препараты, направленные на коррекцию нарушений баланса стероидных гормонов и метаболизма липидов.

Основное теоретическое значение настоящей работы заключается в открытии механизма активации ядерных рецепторов подсемейства пять, а именно лежащей в основе конститутивной активности LRH-1 независимой от лиганда стабилизации лиганд-связывающего домена с помощью нового структурного элемента - жесткой и длинной спирали Н2. Впервые были показаны структурные детерминанты мономерности ядерных рецепторов подсемейства пять. Было дано объяснение патологическому фенотипу человеческой мутации SF-lRb5L. Кроме того, было показано, что для максимальной активности SF-1 необходимо фосфорилирование серина 203 в шарнирном домене. Было также показано, что фосфорилирование серина 203 на SF-1 может осуществляться in vitro МАР-киназой Erk-1, вызывает конформационное изменение в шарнирном домене и приводит к стабилизации рецептора.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фосфорилирование SF-1 стабилизирует структуру рецептора и усиливает белок-белковое взаимодействие с корегуляторами.

2. Конститутивная активность LRH-1 не зависит от действия лиганда.

3. Спираль Н2 является структурным элементом, ответственным за активную конформацию и конститутивную активность LRH-1.

4. Наружная поверхность спирали Н2 образует поверхность белок-белкового взаимодействия.

5. Структурные детерминанты связывания с корегуляторами рецепторов подсемейства NR5a отличаются от таковых для стероидных рецепторов.

6. Негативные взаимодействия между отрицательно заряженными аминокислотными остатками, специфическими для подсемейства NR5a, препятствуют образованию как гомо- так и гетеродимеров LRH-1. Апробация работы

Результаты настоящего исследования были доложены на семинарах в University of California, San Francisco, Duke University, Baylor College of Medicine, San Francisco State University и на Ernst Klenk Symposium "Transcriptional and other regulatory factors of lipid metabolism" (6-8 июля 2003 года, Cologne, Germany), а также были представлены в виде постерных сообщений на "Keystone Symposium on Nuclear Receptors" в 2000 году (Steamboat, Colorado) и 2002 году (Snowbird, Uta).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Крылова, Ирина Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что орфановый рецептор SF-1 фосфорилируется in vitro МАР-киназой Erk-2 по серину 203.

2. Показано, что фосфорилирование SF-1 по серину 203 вызывает конформационное изменение в шарнирном домене, повышает устойчивость SF-1 к воздействию химотрипсина и приводит к повышению температуры плавления лиганд-связывающего домена SF-1. При этом условный лиганд

Ф SF-1 25-гидроксихолестерин стабилизирующим действием не обладал.

3. Получены кристаллы лиганд-связывающего домена орфанового рецептора LRH-1 с разрешением до 2,2 А.

4. Получена рентгеноструктурная модель лиганд-связывающего домена LRH-1.

5. Приведены свидетельства структурных различий в механизмах связывания с корегуляторами между рецепторами, активируемыми лигандом, и рецепторами подсемейства NR5a.

6. Предложен новый механизм стабилизации активной конформации, лежащий ^ в основе конститутивной активности орфановых рецепторов подсемейства

NR5a.

7. Открыты структурные детерминанты мономерности рецепторов подсемейства NR5a.

БЛАГОДАРНОСТИ: Автор выражает глубокую признательность профессору Холли Инграхам, чьи идеи послужили основой настоящей работы, а также кристаллографу Елене Саблиной, превратившей набор рамок дифракции в трехмерную модель лиганд-связывающего домена LRH-1. Автор особенно благодарен профессору Вячеславу Валентиновичу Ляховичу за помошь в подготовке диссертации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Чтобы ответить на вопрос о механизмах регуляции орфановых рецепторов подсемейства пять, прежде всего нужно ответить на вопрос: существуют ли лиганды для этих рецепторов? Лиганды для многих орфановых рецепторов были идентифицированы методами обратной эндокринологии, но поток открытий в этой области иссякает, тогда как около половины всех ядерных рецепторов до сих пор являются «сиротами» £54].

Поскольку в LRH-1 имеется большой лигандный карман, возможность различных вариантов ответа на вопрос о наличии лиганда у LRH-1 находится в остром контрасте с ситуацией с DHR38 и Nurrl, лигандный карман которых практически отсутствует - и поэтому лиганда не может быть [35,36]. Несмотря на то, что рентгеноструктурная модель показала отсутствие лиганда в лигандном кармане LRH-1 и независимая от лиганда активность LRH-1 была подтверждена экспериментами по мутагенезу аминокислотных остатков лигандного кармана (рис 19А, 19Б), само наличие большого лигандного кармана с характерным распределением гидрофобных и заряженных аминокислотных остатков не позволяет закрбпъ вопрос о возможном участии лиганда (лигандов) в регуляции активности SF-1 и LRH-1 на определенных стадиях развития и в определенных тканях. SF-1 является основным регулятором биосинтеза стероидов в стероидогенных тканях, тогда как LRH-1 играет ключевую роль в регуляции биосинтеза желчных кислот. Стероиды, желчные кислоты и их метаболиты являются превосходными кандидатами на роль лигандов; при этом важно отметить, что открытие лигандов для SF-1 и LRH-1 будет иметь большое фармакологическое значение.

Поскольку активность ядерных рецепторов пятого подсемейства регулируется независимо от лиганда, исследование роли альтернативных механизмов имеет особую важность. Мы показали, что SF-1 является фосфопротеином, и его фосфорилирование зависит от MAP киназы Erk-2. Наши эксперименты также продемонстрировали драматическое повышению активности LRH-1, в ответ на активацию МАР-киназного пути, что означает, что и LRH-1 является фосфопротеином. Идентификация сайта (или сайтов) фосфорилирования на LRH-1 является задачей ближайших исследований.

Поскольку фосфорилирование приводит к конформационному изменению в шарнирном домене, логично предположить, что существуют корегуляторы для SF-1 и LRH-1, специфические для фосфорилированного состояния белка; идентификация таких регуляторов также является одной из задач дальнейших исследований.

Существует большое количество данных о том, что ядерные рецепторы пятого подсемейства контролируется атипичными орфановыми рецепторами Dax-1 и SHP, подавляющими активность SF-1 и LRH-1 через белок-белковые взаимодействия. В то время как аналитическое ультрацентрифугирование показало, что лиганд-связывающие домены SF-1 и LRH-1 не взаимодействуют с лиганд-связывающим доменом Dax-1, результаты электрофореза в нативном геле продемонстрировали, что SF-1178"462, включающий С-терминальную часть шарнирного домена, способен к такому взаимодействию (рисунок 27). Известно, что богатые пролином последовательности являются лигандами для WW и SH3 доменов белок-белкового взаимодействия [133]. Наличие богатой пролином последовательности аминокислот в N-терминальной части шарнирного домена SF-1, а также МАРК-зависимого сайта фосфорилирования в С-терминальной части этого домена, свидетельствуют о важной роли шарнирного домена в регуляции активности ядерных рецепторов пятого подсемейства, поэтому одной из задач дальнейших исследований является идентификация корегуляторов, специфически взаимодействующих с доменами белок-белкового взаимодействия в шарнирных доменах SF-1 и LRH-1.

Существуют свидетельства, что шарнирные домены LRH-1 и SF-1 участвуют во взаимодействии с рядом корегуляторов [130]. Получение рентгеноструктурной модели фрагмента LRH-1 или SF-1, содержащего лиганд-связывающий и шарнирный домены, а также моделей LRH-1 или SF-1 в комплексе с Dax-1, SHP, с коактиватором, корепрессором, или с соответствующим пептидом, тоже являются задачами последующих исследований.

Таким образом, настоящее исследование показало, что активность орфановых рецепторов пятого подсемейства регулируется через белок-белковые взаимодействия и через сигнальные пути с помощью фосфорилирования. Рентгеноструктурный анализ лиганд-связывающего домена LRH-1 продемонстрировал активную конформацию рецептора и наличие неоккупированного лигандного кармана, причем помещение объемных боковых цепей в лигандный карман не влияло на активность рецептора, свидетельствуя о том, что лиганд не является необходимым для активности LRH-1.

Получение модели лиганд-связывающего домена LRH-1 привело к открытию нового механизма стабилизации активированного состояния рецептора (с помощью спирали Н2), ответственного за конститутивную активность LRH-1 и формирующего новую поверхность связывания корегуляторов, а также позволило определить структурные детерминанты мономерности ядерных рецепторов подсемейства пять. Получение трехмерной структуры лиганд-связывающего домена LRH-1 дало также возможность проводить эксперименты по докингу потенциальных лигандов в лигандный карман, что, в свою очередь, может привести к открытию лигандов, модулирующих активность SF-1 или LRH-1.

Таким образом, в настоящей работе были получены имеющие важное научное и практическое значение новые знания о механизмах активации ядерных рецепторов подсемейства пять и о возможных путях регуляции этой активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Крылова, Ирина Николаевна, Новосибирск

1. Kliewer, S. A., Lehmann, J. М., and Willson, Т. М. «Orphan nuclear receptors: shifting endocrinology into reverse». Science, 1999, 284 (5415), 757-760.

2. Giguere,V.«Orphan nuclear receptors: from gene to function». Endocr Rev, 1999,20 (5), 689-725.

3. Aranda, A., and Pascual, A. «Nuclear hormone receptors and gene expression». Physiol Rev, 2001, 81 (3), 1269-1304.

4. Steinmetz, A. C., Renaud, J. P., and Moras, D. «Binding of ligands and activation of transcription by nuclear receptors». Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2001, 30 329-359.

5. Honkakoski, P., and Negishi, M. «Regulation of cytochrome P450 (CYP) genes by nuclear receptors». Biochem J, 2000, 347 (Pt 2), 321-337.

6. Li, С. I., Malone, К. E., Porter, P. L., Weiss, N. S., Tang, M. Т., Cushing-Haugen, K. L., and Daling, J. R. «Relationship between long durations and different regimens of hormone therapy and risk of breast cancer». Jama, 2003, 289 (24), 3254-3263.

7. Rossouw, J. E., Anderson, G. L., Prentice, R. L., LaCroix, A. Z., Kooperberg, C., Stefanick, M. L., Jackson, R. D., Beresford, S. A., Howard, В. V., Johnson, К. C.,

8. Щ Kotchen, J. M., and Ockene, J. «Risks and benefits of estrogen plus progestin inhealthy postmenopausal women: principal results From the Women's Health Initiative randomized controlled trial». Jama, 2002, 288 (3), 321-333.

9. Willson, Т. M., and Moore, J. T. «Genomics versus orphan nuclear receptors—a half-time report». Mol Endocrinol, 2002, 16 (6), 1135-1144.

10. Escriva, H., Manzon, L., Youson, J., and Laudet, V. «Analysis of lamprey and hagfish genes reveals a complex history of gene duplications during early vertebrate evolution». Mol Biol Evol, 2002, 19 (9), 1440-1450.

11. Robinson-Rechavi, M., Carpentier, A. S., Duffraisse, M., and Laudet, V. «How many nuclear hormone receptors are there in the human genome?». Trends Genet,1. Ф 2001, 17(10), 554-556.

12. Laudet, V. «Evolution of the nuclear receptor superfamily: early diversification from an ancestral orphan receptor». J Mol Endocrinol, 1997, 19 (3), 207-226.

13. Smirnov, A. N. «Nuclear receptors: nomenclature, ligands, mechanisms of their effects on gene expression». Biochemistry (Mosc), 2002, 67 (9), 957-977.

14. Ball, P. «Portrait of a molecule». Nature, 2003,421 (6921), 421-422.

15. Urnov, F. D., and Wolffe, A. P. «А necessary good: nuclear hormone receptors and their chromatin templates». Mol Endocrinol, 2001, 15 (1), 1-16.

16. Allfrey, V. G. «Structural modifications of histones and their possible role in the regulation of ribonucleic acid synthesis». Proc Can Cancer Conf, 1966, 6 313335.

17. Rosenfeld, M. G., and Glass, С. K. «Coregulator codes of transcriptional regulation by nuclear receptors». J Biol Chem, 2001, 276 (40), 36865-36868.

18. Tremblay, A., Tremblay, G. В., Labrie, F., and Giguere, V. «Ligand-independent recruitment of SRC-1 to estrogen receptor beta through phosphorylation of activation function AF-1». Mol Cell, 1999, 3 (4), 513-519.

19. Bourguet, W., Ruff, M., Chambon, P., Gronemeyer, H., and Moras, D. «Crystal structure of the ligand-binding domain of the human nuclear receptor RXR-alpha». Nature, 1995, 375 (6530), 377-382.

20. Desclozeaux, M., Krylova, I. N., Horn, F., Fletterick, R. J., and Ingraham, H. A. «Phosphorylation and intramolecular stabilization of the ligand binding domain in the nuclear receptor steroidogenic factor 1». Mol Cell Biol, 2002, 22 (20), 71937203.

21. Bourguet, W., Germain, P., and Gronemeyer, H. «Nuclear receptor ligand-binding domains: three-dimensional structures, molecular interactions and pharmacological implications». Trends Pharmacol Sci, 2000, 21 (10), 381-388.

22. Sablin, E. P., Krylova, I. N., Fletterick, R. J., and Ingraham, H. A. «Structural basis for ligand-independent activation of the orphan nuclear receptor LRH-1». Mol Cell, 2003, 11 (6), 1575-1585.

23. Meinke, G., and Sigler, P. B. «DNA-binding mechanism of the monomeric orphan nuclear receptor NGFI-В». Nat Struct Biol, 1999, 6 (5), 471-477.

24. Shaffer, P. L., and Gewirth, D. T. «Structural basis of VDR-DNA interactions on direct repeat response elements». Embo J, 2002, 21 (9), 2242-2252.

25. Zhao, Q., Khorasanizadeh, S., Miyoshi, Y., Lazar, M. A., and Rastinejad, F. «Structural elements of an orphan nuclear receptor-DNA complex». Mol Cell, 1998, 1 (6), 849-861.

26. Li, Y., Lambert, M. H., and Xu, H. E. «Activation of nuclear receptors: a perspective from structural genomics». Structure (Camb), 2003, 11 (7), 741-746.

27. Wang, Z., Benoit, G., Liu, J., Prasad, S., Aarnisalo, P., Liu, X., Xu, H., Walker, N. P., and Perlmann, T. «Structure and function of Nurrl identifies a class of ligand-independent nuclear receptors». Natiye, 2003, 423 (6939), 555-560.

28. Renaud, J. P., Rochel, N., Ruff, M., Vivat, V„ Chambon, P., Gronemeyer, H., and Moras, D. «Crystal structure of the RAR-gamma ligand-binding domain bound to all-trans retinoic acid». Nature, 1995, 378 (6558), 681-689.

29. Wurtz, J. M., Bourguet, W., Renaud, J. P., Vivat, V., Chambon, P., Moras, D., and Gronemeyer, H. «А canonical structure for the ligand-binding domain of nuclear receptors». Nat Struct Biol, 1996, 3 (1), 87-94.

30. Freedman, L. P. «Multimeric Coactivator Complexes for Steroid/Nuclear Receptors». Trends Endocrinol Metab, 1999, 10 (10), 403-407.

31. Ito, M., and Roeder, R. G. «The TRAP/SMCC/Mediator complex and thyroid hormone receptor function». Trends Endocrinol Metab, 2001, 12 (3), 127-134.

32. Ren, Y., Behre, E., Ren, Z., Zhang, J., Wang, Q., and Fondell, J. D. «Specific structural motifs determine TRAP220 interactions with nuclear hormone receptors». Mol Cell Biol, 2000, 20 (15), 5433-5446.

33. Ito, M., Okano, H. J., Darnell, R. В., and Roeder, R. G. «The TRAP100 component of the TRAP/Mediator complex is essential in broad transcriptional events and development». Embo J, 2002, 21 (13), 3464-3475.

34. Ito, M., Yuan, С. X., Okano, H. J., Darnell, R. В., and Roeder, R. G. «Involvement of the TRAP220 component of the TRAP/SMCC coactivator complex in embryonic development and thyroid hormone action». Mol Cell, 2000, 5 (4), 683-693.

35. Malik, S., Wallberg, A. E., Kang, Y. K., and Roeder, R. G. «TRAP/SMCC/mediator-dependent transcriptional activation from DNA and chromatin templates by orphan nuclear receptor hepatocyte nuclear factor 4». Mol Cell Biol, 2002, 22 (15), 5626-5637.

36. Ge, K., Guermah, M., Yuan, С. X., Ito, M., Wallberg, A. E., Spiegelman, В. M., and Roeder, R. G. «Transcription coactivator TRAP220 is required for PPAR gamma 2-stimulated adipogenesis». Nature, 2002, 417 (6888), 563-567.

37. Li, X., Wong, J., Tsai, S. Y., Tsai, M. J., and O'Malley, B. W. «Progesterone and glucocorticoid receptors recruit distinct coactivator complexes and promote distinct patterns of local chromatin modification». Mol Cell Biol, 2003, 23 (11), 3763-3773.

38. Sharma, D., and Fondell, J. D. «Ordered recruitment of histone acetyltransferases and the TRAP/Mediator complex to thyroid hormone-responsive promoters in vivo». Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99 (12), 7934-7939.

39. Stehlin, C., Wurtz, J. M., Steinmetz, A., Greiner, E., Schule, R., Moras, D., and Renaud, J. P. «Х-ray structure of the orphan nuclear receptor RORbeta ligand-binding domain in the active conformation». Embo J, 2001, 20 (21), 5822-5831.

40. Dhe-Paganon, S., Duda, K., Iwamoto, M., Chi, Y. I., and Shoelson, S. E. «Crystal structure of the HNF4 alpha ligand binding domain in complex with endogenous fatty acid ligand». J Biol Chem, 2002,277 (41), 37973-37976.

41. Clayton, G. M., Peak-Chew, S. Y., Evans, R. M., and Schwabe, J. W. «The structure of the ultraspiracle ligand-binding domain reveals a nuclear receptor locked in an inactive conformation». Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98 (4), 1549-1554.

42. Billas, I. M., Moulinier, L., Rochel, N., and Moras, D. «Crystal structure of the ligand-binding domain of the ultraspiracle protein USP, the ortholog of retinoid X receptors in insects». J Biol Chem, 2001, 276 (10), 7465-7474.

43. Ни, X., Cherbas, L., and Cherbas, P. «Transcription Activation by the Ecdysone Receptor (EcR/USP): Identification of Activation Functions». Mol Endocrinol, 2003, 17 (4), 716-731.

44. Escriva, H., Delaunay, F., and Laudet, V. «Ligand binding and nuclear receptor evolution». Bioessays, 2000,22 (8), 717-727.

45. Weigel, N. L., and Zhang, Y. «Ligand-independent activation of steroid hormone receptors». J Mol Med, 1998, 76 (7), 469-479.

46. Ciana, P., Raviscioni, M., Mussi, P., Vegeto, E., Que, I., Parker, M. G., Lowik, C., and Maggi, A. «In vivo imaging of transcriptionally active estrogen receptors». Nat Med, 2003, 9 (1), 82-86.

47. Greene, G. L. «In vivo imaging reveals estrogen receptor's hidden personality». Nat Med, 2003,9(1), 22-23.

48. Levin, E. R. «Bidirectional Signaling between the Estrogen Receptor and the Epidermal Growth Factor Receptor». Mol Endocrinol, 2003, 17 (3), 309-317.

49. Schreihofer, D. A., Resnick, E. M., Lin, V. Y., and Shupnik, M. A. «Ligand-independent activation of pituitary ER: dependence on PKA-stimuIated pathways». Endocrinology, 2001, 142 (8), 3361-3368.

50. Nazareth, L. V., and Weigel, N. L. «Activation of the human androgen receptor through a protein kinase A signaling pathway». J Biol Chem, 1996,271 (33), 19900-19907.

51. Ueda, Т., Bruchovsky, N., and Sadar, M. D. «Activation of the androgen receptor N-terminal domain by interleukin-6 via МАРК and STAT3 signal transduction pathways». J Biol Chem, 2002, 277 (9), 7076-7085.

52. Camp, H. S., and Tafuri, S. R. «Regulation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma activity by mitogen-activated protein kinase». J Biol Chem, 1997, 272 (16), 10811-10816.

53. Dowhan, D. H., and Muscat, G. E. «Characterization of the AB (AF-1) region in the muscle-specific retinoid X receptor-gamma: evidence that the AF-1 region functions in a cell-specific manner». Nucleic Acids Res, 1996, 24 (2), 264-271.

54. Solomon, C., White, J. H., and Kremer, R. «Mitogen-activated protein kinase inhibits 1,25-dihydroxyvitamin D3-dependent signal transduction by phosphorylating human retinoid X receptor alpha». J Clin Invest, 1999, 103 (12), 1729-1735.

55. Davis, I. J., and Lau, L. F. «Endocrine and neurogenic regulation of the orphan nuclear receptors Nur77 and Nurr-1 in the adrenal glands». Mol Cell Biol, 1994, 14 (5), 3469-3483.

56. Gay, F., Barath, P., Desbois-Le Peron, C., Metivier, R., Le Guevel, R., Birse, D., and Salbert, G. «Multiple phosphorylation events control chicken ovalbumin

57. Jacob, A. L., and Lund, J. «Mutations in the activation function-2 core domain of steroidogenic factor-1 dominantly suppresses РКА-dependent transactivation of the bovine CYP17 gene». J Biol Chem, 1998, 273 (22), 13391-13394.

58. Lopez, D., Sandhoff, T. W., and McLean, M. P. «Steroidogenic factor-1 mediates cyclic 3',5'-adenosine monophosphate regulation of the high density lipoprotein receptor». Endocrinology, 1999, 140 (7), 3034-3044.

59. Karin, M., Liu, Z., and Zandi, E. «АР-1 function and regulation». Curr Opin Cell Biol, 1997,9(2), 240-246.

60. Lemon, B. D., and Freedman, L. P. «Nuclear receptor cofactors as chromatin remodelers». Curr Opin Genet Dev, 1999, 9 (5), 499-504.

61. Galarneau, L., Pare, J. F., Allard, D., Hamel, D., Levesque, L., Tugwood, J. D., Green, S., and Belanger, L. «The alphal-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila FTZ-F1 family». Mol Cell Biol, 1996, 16 (7), 3853-3865.

62. Luo, X., Ikeda, Y., Schlosser, D. A., and Parker, K. L. «Steroidogenic factor 1 is the essential transcript of the mouse Ftz-Fl gene». Mol Endocrinol, 1995, 9 (9), 1233-1239.

63. Lala, D. S., Syka, P. M., Lazarchik, S. В., Mangelsdorf, D. J., Parker, K. L., and Heyman, R. A. «Activation of the orphan nuclear receptor steroidogenic factor 1 by oxysterols». Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 (10), 4895-4900.

64. Mellon, S. H., and Bair, S. R. «25-Hydroxycholesterol is not a ligand for the orphan nuclear receptor steroidogenic factor-1 (SF-1)». Endocrinology, 1998, 139 (6), 3026-3029.

65. Lobaccaro, J. M., Repa, J. J., Lu, Т. Т., Caira, F., Henry-Berger, J., Voile, D. H., and Mangelsdorf, D. J. «Regulation of lipid metabolism by the orphan nuclear receptors.». Ann Endocrinol (Paris), 2001, 62 (3), 239-247.

66. Parker, K. L., and Schimmer, B. P. «Steroidogenic factor 1: a key determinant of endocrine development and function». Endocr Rev, 1997, 18 (3), 361-377.

67. Roberts, L. M., Shen, J., and Ingraham, H. A. «New solutions to an ancient riddle: defining the differences between Adam and Eve». Am J Hum Genet, 1999, 65 (4), 933-942.m

68. Hammer, G. D., and Ingraham, H. A. «Steroidogenic factor-1: its role in endocrine organ development and differentiation». Front Neuroendocrinol, 1999, 20 (3), 199-223.

69. Wei, X., Sasaki, M., Huang, H., Dawson, V. L., and Dawson, Т. M. «The orphan nuclear receptor, steroidogenic factor 1, regulates neuronal nitric oxide synthase gene expression in pituitary gonadotropes». Mol Endocrinol, 2002, 16 (12), 28282839.

70. Achermann, J. C., Ito, M., Hindmarsh, P. C., and Jameson, J. L. «А mutation in the gene encoding steroidogenic factor-1 causes XY sex reversal and adrenal failure in humans». Nat Genet, 1999,22 (2), 125-126.

71. Biason-Lauber, A., and Schoenle, E. J. «Apparently normal ovarian differentiation in a prepubertal girl with transcriptionally inactive steroidogenic factor 1 (NR5A1/SF-1) and adrenocortical insufficiency». Am J Hum Genet, 2000, 67 (6), 1563-1568.

72. Achermann, J. C., Meeks, J. J., and Jameson, J. L. «Phenotypic spectrum of mutations in DAX-1 and SF-1». Mol Cell Endocrinol, 2001, 185 (1-2), 17-25.

73. Nachtigal, M. W., Hirokawa, Y., Enyeart-VanHouten, D. L., Flanagan, J. N., Hammer, G. D., and Ingraham, H. A. «Wilms' tumor 1 and Dax-1 modulate the orphan nuclear receptor SF-1 in sex-specific gene expression». Cell, 1998, 93 (3), 445-454.

74. Crawford, P. A., Dorn, C., Sadovsky, Y., and Milbrandt, J. «Nuclear receptor DAX-1 recruits nuclear receptor corepressor N-CoR to steroidogenic factor 1». Mol Cell Biol, 1998, 18 (5), 2949-2956.

75. Ito, M., Yu, R., and Jameson, J. L. «DAX-1 inhibits SF-l-mediated transactivation via a carboxy-terminal domain that is deleted in adrenal hypoplasia congenita». Mol Cell Biol, 1997, 17 (3), 1476-1483.

76. Clyne, С. D., Speed, С. J., Zhou, J., and Simpson, E. R. «Liver receptor homologue-1 (LRH-1) regulates expression of aromatase in preadipocytes». J Biol Chem, 2002, 277 (23), 20591-20597.

77. Luo, Y., Liang, C. P., and Tall, A. R. «The orphan nuclear receptor LRH-1 potentiates the sterol-mediated induction of the human CETP gene by liver X receptor». J Biol Chem, 2001, 276 (27), 24767-24773.

78. Chawla, A., Repa, J. J., Evans, R. M., and Mangelsdorf, D. J. «Nuclear receptors and lipid physiology: opening the Х-files». Science, 2001, 294 (5548), 18661870.

79. St-Pierre, M. V., Kullak-Ublick, G. A., Hagenbuch, В., and Meier, P. J. «Transport of bile acids in hepatic and non-hepatic tissues». J Exp Biol, 2001, 204 (Pt 10), 1673-1686.

80. Fayard, E., Schoonjans, K., Annicotte, J. S., and Auwerx, J. «Liver receptor homolog 1 controls the expression of carboxyl ester lipase». J Biol Chem, 2003,

81. Bohan, A., Chen, W. S., Denson, L. A., Held, M. A., and Boyer, J. L. «TNFalpha dependent up-regulation of Lrh-1 and Mrp3(Abcc3) reduces liver injury in obstructive cholestasis». J Biol Chem, 2003,

82. Schoonjans, K., Annicotte, J. S., Huby, Т., Botrugno, O. A., Fayard, E., Ueda, Y., Chapman, J., and Auwerx, J. «Liver receptor homolog 1 controls the expression of the scavenger receptor class В type I». EMBO Rep, 2002, 3 (12), 1181-1187.

83. Lu, Т. Т., Makishima, M., Repa, J. J., Schoonjans, K., Kerr, T. A., Auwerx, J., and Mangelsdorf, D. J. «Molecular basis for feedback regulation of bile acid synthesis by nuclear receptors». Mol Cell, 2000, 6 (3), 507-515.

84. Schoonjans, K., Brendel, C., Mangelsdorf, D., and Auwerx, J. «Sterols and gene expression: control of affluence». Biochim Biophys Acta, 2000, 1529 (1-3), 114125.

85. Liu, D. L., Liu, W. Z., Li, Q. L., Wang, H. M., Qian, D., Treuter, E., and Zhu, C. «Expression and functional analysis of liver receptor homologue 1 as a potential steroidogenic factor in rat ovary». Biol Reprod, 2003, 69 (2), 508-517.

86. Lee, Y. K., and Moore, D. D. «Dual mechanisms for repression of the monomeric orphan receptor liver receptor homologous protein-1 by the orphan small heterodimer partner». J Biol Chem, 2002, 277 (4), 2463-2467.

87. Suzuki, Т., Kasahara, M., Yoshioka, H., Morohashi, K., and Umesono, K. «LXXLL-related motifs in Dax-1 have target specificity for the orphan nuclear receptors Ad4BP/SF-l and LRH-1». Mol Cell Biol, 2003, 23 (1), 238-249.

88. Lalli, E., Bardoni, В., Zazopoulos, E., Wurtz, J. M., Strom, Т. M., Moras, D., and Sassone-Corsi, P. «А transcriptional silencing domain in DAX-1 whose mutation causes adrenal hypoplasia congenita». Mol Endocrinol, 1997, 11 (13), 1950-1960.

89. Seol, W., Chung, M., and Moore, D. D. «Novel receptor interaction and repression domains in the orphan receptor SHP». Mol Cell Biol, 1997,17 (12), 7126-7131.

90. Horn, F., Vriend, G., and Cohen, F. E. «Collecting and harvesting biological data: the GPCRDB and NucleaRDB information systems». Nucleic Acids Res, 2001, 29 (1), 346-349.

91. Maluf, N. K., Fischer, C. J., and Lohman, Т. M. «А Dimer of Escherichia coli UvrD is the active form of the helicase in vitro». J Mol Biol, 2003, 325 (5), 913935.

92. Krylova, I. N. «Biochemical studies on orphan nuclear receptor, SF-1», Master of Science Thesis at San Francisco State University, 2003,

93. Egea, P. F., Mitschler, A., Rochel, N., Ruff, M., Chambon, P., and Moras, D. «Crystal structure of the human RXRalpha ligand-binding domain bound to its natural ligand: 9-cis retinoic acid». Embo J, 2000,19 (11), 2592-2601.

94. Montclare, J. K., Sloan, L. S., and Schepartz, A. «Electrostatic control of half-site spacing preferences by the cyclic AMP response element-binding protein CREB». Nucleic Acids Res, 2001, 29 (16), 3311-3319.

95. Colgan, J., Ashali, H., and Manley, J. L. «А direct interaction between a glutamine-rich activator and the N terminus of TFIIB can mediate transcriptional activation in vivo». Mol Cell Biol, 1995, 15 (4), 2311-2320.

96. Darimont, B. D., Wagner, R. L., Apriletti, J. W., Stallcup, M. R., Kushner, P. J., Baxter, J. D., Fletterick, R. J., and Yamamoto, K. R. «Structure and specificity of nuclear receptor-coactivator interactions». Genes Dev, 1998, 12 (21), 3343-3356.

97. Gampe, R. Т., Jr., Montana, V. G., Lambert, M. H„ Miller, А. В., Bledsoe, R. K„ Milburn, M. V., Kliewer, S. A., Willson, Т. M., and Xu, H. E. «Asymmetry in the

98. PPARgamma/RXRalpha crystal structure reveals the molecular basis of heterodimerization among nuclear receptors». Mol Cell, 2000, 5 (3), 545-555.

99. Macias, M. J„ Wiesner, S., and Sudol, M. «WW and SH3 domains, two different scaffolds to recognize proline-rich ligands». FEBS Lett, 2002, 513 (1), 30-37.

100. Katz, D., Reginato, M. J., and Lazar, M. A. (1995). Functional regulation of thyroid hormone receptor variant TR alpha 2 by phosphorylation. Mol Cell Biol 15,2341-2348.