Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное моделирование структурных и функциональных аспектов взаимодействия АТФаз Р-типа с АТФ

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное моделирование структурных и функциональных аспектов взаимодействия АТФаз Р-типа с АТФ"

!

На правах рукописи

; КОСИНСКИЙ ЮРИЙ АЮЕЛЬМОВИЧ

I

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АСПЕКТОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АТФАЗ Р-ТИПА С АТФ

I

Специальность 03.00.02 - Биофизика

I

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

Доктор физико-математических наук Р.Г. Ефремов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор В. В. Поройков

Доктор физико-математических наук Ю. Д. Нечипуревко

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельдгарта РАН

Защита диссертации состоится марта 2006 г. в 75 часов на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.96 при Московском Государственном Университете по адресу: 119992, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория «новая».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан_ февраля 2006 г.

Актуальность проблемы.

Для понимания молекулярного механизма работы ферментов необходим анализ их пространственной структуры атомарного разрешения. Более того, часто нужно установить пространственные структуры белка в разных функциональных состояниях: в комплексе с субстратами или их аналогами, ингибиторами и др. Однако во многих случаях определение структуры белков с помощью экспериментальных методов представляет значительную техническую проблему. Наибольшие трудности возникают при структурных исследованиях мембранных белков, к которым относятся множество важнейших ферментов, рецепторов и транспортеров.

В связи с этим, широкое применение находит метод построения моделей пространственной структуры белков (3-мерных моделей) на основании гомологии с аминокислотными последовательностями родственных белков, для которых пространственная структура установлена экспериментально. Дальнейшее исследование 3-мерных моделей ферментов с помощью методов молекулярного моделирования, таких как молекулярная динамика (МД) и докинг лигандов, позволяет эффективнее анализировать экспериментальные данные, осуществлять компьютерный дизайн точечных мутаций белков, а также выдвигать различные гипотезы о структуре и функции белков.

В диссертационной работе с помощью методов молекулярного моделирования исследуется структура, динамика и взаимодействие с АТФ цитоплазматических нуклеотид-связывающих доменов (т.н. 14- и Р-доменов) АТФаз Р-типа - Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума, Ыа+,К'-АТФазы плазматической мембраны и медь-транспортирующей АТФазы. Структуры высокого разрешения были получены экспериментально только для Са2+-АТФазы, которая служит основой для построения 3-мерных моделей других биологически важных АТФаз Р-типа. Полученные результаты позволяют объяснить многие экспериментальные факты и могут бьггь полезны для планирования дальнейших экспериментальных исследований. Цели настоящей работы:

- Апробация методов молекулярного моделирования для изучения структурных и динамических аспектов взаимодействия нуклеотид-связывающих доменов АТФаз Р-типа с АТФ на основе кристаллических структур Са2+-АТФазы.

- Построение 3-мерной модели нуклеотид-связывающих доменов №+,К+-АТФазы и применение подходов молекулярного моделирования для изучения их взаимодействий с АТФ.

- Построение 3-мерной модели нуклеотид-связывающих доменов медь-транспортирующей АТФазы и изучение их взаимодействий с АТФ с помощью методов молекулярного моделирования.

РОС НАЦИОЬ чм. 6ИБЛИОТС

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Предложена структурно-динамическая модель связывания АТФ с К- и Р-доменами АТФаз Р-типа на основе изучения методами молекулярного моделирования структур Са2+-АТФазы.

2. Показано, что полученные с помощью методов молекулярного моделирования структуры комплексов Са2+-АТФазы с АТФ хорошо согласуются с данными рентгенострукгурного анализа и точечного мутагенеза.

3. На основе анализа кристаллических структур белков в комплексе с АТФ сформулированы качественные критерии для ранжирования комплексов белок-АТФ, полученных в результате молекулярного докянга. Характерными свойствами, определяющими связывание АТФ белками, являются гидрофобное окружение аденинового основания АТФ в комплексе и водородные связи его N112 группы с атомами белка.

4. Методом моделирования по гомологии построены 3-мерные модели нуклеотид-связывакмцих доменов ^^К^АТФазы и предложены структуры ее комплекса с АТФ. Проведена интерпретация экспериментальных данных точечного мутагенеза. Предложена гипотеза, объясняющая более высокое сродство к АТФ №+,К*-АТФазы по сравнению с Са2+-АТФазой.

5. Впервые построены 3-мерные модели нуклеотид-связывающих доменов медь-транспортирующей АТФазы (WNDP). Предложена модель комплекса Д¥№)Р с АТФ, которая согласуется с данными точечного мутагенеза и удовлетворяет предложенным в работе критериям для связывания АТФ белками. Выявлены остатки ШКОР, отвечающие за связывание АТФ.

Научное значение и новизна работы.

Все представленные выше результаты получены впервые. Разработан подход для анализа результатов докинга АТФ и метод учета информационной подвижности белка-мишени при докинге. Получен ряд новых результатов. Среди них: 1) гипотетическая структура комплекса №+,К+-АТФазы с АТФ, на основе которой были объяснены экспериментальные данные точечного мутагенеза; 2) структура комплекса ДУМ!)? с АТФ, которая согласуется с данными точечного мутагенеза; 3) гипотеза, объясняющая влияние междоменных (М-Р) взаимодействий на сродство АТФаз Р-типа к АТФ. Практическое значение работы.

Полученные результаты дополняют существующие представления о структуре и функции АТФаз Р-типа и позволяют лучше понять на молекулярном уровне механизмы их взаимодействий с АТФ. Применение разработанных подходов молекулярного моделирования открывает перспективы исследований других биологически важных ферментов. В частности, разработан усовершенствованный подход для предсказания структуры комплексов белок-

лиганд, сочетающий метод молекулярной динамики и докинга, а также специфичный для АТФ критерий отбора "правдоподобных" результатов докинга. Построенные и верифицированные в работе модели пространственной структуры нуклеотид-связывающих доменов №+,К+-АТФазы плазматической мембраны и медь-транспортирующей АТФазы послужат основой для дальнейших экспериментальных и теоретических исследований этих биологически важных объектов.

Публикации и апробация.

Основные результаты работы изложены в 9 публикациях, из которых 4 опубликованы в российских и международных реферируемых журналах. Материалы диссертации докладывались на IV Международной конференции по биоинформатике и регуляции и структуре генома (Новосибирск, 2004), III Международной конференции по вычислительной молекулярной биологии (Москва, 2003), XV Зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» в ИБХ РАН (Москва, 2003), I Российской электронной конференции по биоинформатике (Москва, 2000).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, приложения и списка цитируемой литературы из 145 наименований. Диссертация изложена на 115 страницах, содержит 28 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Во Введении обосновывается необходимость применения методов молекулярного моделирования для получения структурно-функциональной информации о взаимодействиях АТФаз Р-типа с АТФ, сформулированы направления и цели исследования.

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ.

Первая глава является обзором литературы по исследованиям в области структуры, специфичности, механизмов работы и регуляции АТФаз Р-типа. Изложены опубликованные в литературе экспериментальные результаты, на которых построено данное теоретическое исследование.

В структурах АТФаз Р-типа выделяют (Рис. 1) три цитоплазматических домена (домены А, N и Р) и трансмембранный (ТМ) домен, включающий от 7 до 10 (в зависимости от подтипа фермента) гидрофобных а-спиралей, пронизывающих мембрану. Наиболее изученным в структурном и функциональном плане представителем семейства АТФаз Р-типа является саркоплазматическая Са2+-АТФаза. Этот фермент производит откачку ионов Са2+ из

цитоплазмы мышечных клеток в полости саркоплазматического ретикулума и играет важнейшую роль в осуществлении и регуляции мышечного сокращения В 2000 г. методом рентгеноструктурного анализа (РСА) была впервые получена структура высокого разрешения Са2+-АТФазы в т.н. Е1 (Са2+-связанной) форме. На основе этой структуры было выяснено строение важнейших функциональных центров фермента: сайтов связывания АТФ и фосфорилирования, которые сформированы в цитоплазматических доменах, и сайта связывания 2-х ионов Са2* в ТМ-домене. В дальнейшем была получена кристаллическая структура Са2+-АТФазы в форме Е2. Сравнительный анализ структур Е1 и Е2 показывает, что в каталитическом цикле АТФаз Р-типа происходят весьма значительные перемещения цитоплазматических доменов, сопряженные с изменениями конформации и взаимного расположения ТМ сегментов. В связи с этим, при переходе фермента из формы Е1 в Е2 (который сопровождается гидролизом АТФ и каталитическим фосфорилированием белка по остатку А$р351) структура и свойства сайта связывания в ТМ-домене изменяются, и сродство к ионам Са2* сильно снижается.

Рисунок 1. Схема структурной организации АТФаз Р-типа. N - нуклеотид-связывающий домен; Р - фосфорилируемый домен; А -вспомогательный домен; ТМ - трансмембранный сегмент, состоящий из 10 а-спиралей. Черным кружком в Ы-домене показан участок связывания АТФ.

Данная работа сосредоточена на изучении взаимодействий Г>1- и Р-доменов АТФаз Р-типа с АТФ. Аминокислотная последовательность 14-домена представляет собой обширную вставку в последовательность Р-домена, которая, в свою очередь, соединена с двумя трансмембранными сегментами (Рис. 1). Систему, состоящую из изолированных К- и Р-доменов, в первом приближении, можно считать независимой от прочих частей белка в процессе связывания АТФ.

Глава 2. МЕТОДЫ И ПОДХОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

В данной главе приведен обзор теоретических основ и проблематики методов молекулярного моделирования: построения моделей пространственной структуры белков на основании гомологии, молекулярной динамики (МД), докинга лигандов и др.

Глава 3. Исследования кристаллических структур Са2+-АТФазы саокоплазматического ретикудума. Изучение характерных взаимодействий в комплекса» белков с АТФ.

В разделе изложен анализ кристаллических структур АТФ-связывающих № и Р-доменов Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума. С помощью методов молекулярного моделирования исследуется динамическое поведение доменов и их взаимодействие с АТФ. Была предсказана структура комплекса Са2+-АТФазы с АТФ, которая показала близкое сходство с полученными позднее методом РСА структурами комплексов белка с аналогами АТФ. Одна из целей данного этапа работы - отработка методик и протоколов молекулярного моделирования для последующих исследований 3-мерныхмоделей АТФаз Р-типа с не установленной экспериментально структурой.

Функционирование белков определяется не только их структурой, но и динамическими свойствами. Известно, что в связывании АТФ Са2+-АТФазой одновременно участвуют остатки как N1- (нуклеотид-связывающий сайт), так и Р-домена (сайт фосфорилирования). В структурах Са2+-АТФазы в формах Е1 и Е2 характерное расстояние между указанными сайтами составляет около 25 и 17 А, соответственно. Сближение сайтов при переходе Е1 —> Е2 обусловлено доменным движением типа "закрывание", которое происходит в результате конформационных переходов в гибком ("шарнирном") участке, соединяющем и Р-домены. В дальнейшем мы обозначаем конформации АТФ-связывающих доменов Са2+-АТФазы, отвечающие формам Е1 и Е2, как "открытая" и "закрытая", соответственно. Тем не менее, даже в "закрытой" конформации расстояние между доменами слишком велико, чтобы молекула АТФ могла взаимодействовать с сайтами обоих доменов одновременно.

Расчеты МД изолированной пары И- и Р-доменов были проведены в явно заданном растворителе на временном интервале -10 не с целью изучения взаимного расположения доменов. В качестве стартовых были взяты кристаллические структуры Са2+-АТФазы в формах Е1 и Е2 (траектории были обозначены МД(Е1) и МД(Е2), соответственно). Показано, что структура отдельных доменов остается достаточно стабильной в МД, но их взаимное расположение значительно изменяется за счет конформационной подвижности "шарнирного" участка. Структурные изменения этого типа удобно отражать с помощью угла <9, вершина которого расположена на "шарнирном" участке, а лучи направлены к центрам масс отдельных доменов (Рис. 2А).

В ходе МД(Е1) И- и Р-домены сближаются в результате движения доменов типа "закрывание", и угол ©достигает минимального значения 115° в момент времени ~ 1.5 не. В МД(Е2), напротив, домены несколько удаляются друг от друга. В результате, в каждой из МД-траекторий конформация белка достигает равновесия с колебаниями значения угла 0 около 135°. Выявленные доменные движения ведут к значительным изменениям позиции

нуклеотид-связывающего сайта в И-домене относительно сайта фосфорилирования в Р-домене (остаток Авр351), что вполне согласуется с экспериментальными структурными данными.

N-домен

д Том 5555 3Ü5S По5 jööö Йоо

А Время, пс

Р-домвн

Рисунок 2. (А) Изменение значений междоменного угла & в МД АТФ-связывакнцих доменов Са2*-АТФазы. Зависимости значений угла <?от времени для МД со стартовых структур Е1 и Е2 показаны сплошной и пунктирной линией, соответственно. (Б) Комплекс нуклеотид-связывающих доменов Са24-АТФазы с АТФ, полученный в результате докинга в структуру из МД(Е1), соответствующую одной из наиболее "закрытых" конформаций доменов (0-115°).

Исследование конформационного пространства белка с помощью метода МД дало возможность получить представление о связывании АТФ в различных равновесных состояниях. Процедура докинга АТФ была произведена для представительного набора конформеров из траектории МД(Е1), в которых наблюдались различные взаимные ориентации N- и Р-доменов (значение ©варьирует от 115° до 145°). В результате докинга были получены весьма разнообразные ориентации молекулы АТФ относительно белка, но для анализа были выбраны только те комплексы, в которых концевая фосфатная группа лиганда удалена от остатка Р-домена Asp351 не более, чем на 10 Ä, т.е. фосфатный "хвост" направлен в сторону сайта фосфорилирования. Критерием для отбора решений докинга бьио также наличие контактов АТФ в комплексе с функционально важными остатками N-домена, установленными экспериментально.

Результаты докинга АТФ демонстрируют важную роль доменного движения типа "закрывание", которое ведет к сближению сайта связывания N-домена с фосфорилируемым остатком Р-домена Asp351. Как видно на Рис. 2Б, молекула АТФ, связанная своим основанием в сайте N-домена, может вступать в непосредственный контакт с остатком Asp351 Р-домена, если белок достигает "закрытой" конформации, соответствующей <9 -115°.

В результате описанного выше отбора были найдены комплексы белок-лиганд, которые хорошо согласуются с кристаллической структурой комплекса Са2+-АТФазы с аналогом АТФ. На Рис. 3 видно, что основные взаимодействия остатков N-домена с АТФ в полученных

комплексах и в комплексе, установленном экспериментально, совпадают. Азотистое основание и остаток рибозы АТФ, встроенные в полость сайта И-домена, взаимодействуют с известными функционально важными остатками. Так, карбоксильная группа остатка С1и442 может формировать водородную связь с №Ь-группой аденинового основания. Боковые цепи остатков РЬе487, Ьув515, ТЬг441 и Уа1562 находятся в близком контакте с адениновым кольцом, а остаток рибозы контактирует с боковыми цепями Ьув492 и Уа1562. При этом наблюдается стэкинг-взаимодействие между фенольным кольцом РЬе487 и кольцом аденинового основания. Полученная структура комплекса демонстрирует важную роль остатка А^бО, который формирует до трех водородных связей с а-, Р- или у-РОз группами АТФ и определяет ориентацию фосфатного "хвоста".

Рисунок 3. (А) Структура комплекса Са2*-АТФазы с АТФ, полученная в результате докинга лиганда в наиболее "закрытую" (угол 0 ~ 115°) конформацию, взятую из траектории МД(Е1). (Б) Кристаллическая структура комплекса Са2+-АТФазы с негидролизуемым аналогом АТФ (PDB-код 1T5S). Комплексы Са^-АТФазы с АТФ, полученные экспериментально и теоретически, показывают принципиальное сходство.

Таким образом, комбинированное использование методов МД и докинга позволило корректно предсказать структуру комплекса нухлеотид-связывающих доменов Са2+-АТФазы с АТФ. Проведение независимой процедуры докинга лиганда в каждый из наборов МД-конформеров белка-мишени позволяет учесть его конформационную подвижность и выбрать наиболее достоверные структуры комплексов. В случае связывания АТФ АТФазой Р-типа важно учитывать как перемещения доменов относительно друг друга (изменение взаимного положения сайтов N- и Р-домена), так и локальные изменения конформации петлевых участков и боковых цепей остатков, формирующих сайты связывания.

Апробированные на Са^-АТФазе методы и протоколы молекулярного моделирования затем были использованы для анализа 3-мерных моделей Ка*,К+-АТФазы и АТФ-связьгааюших доменов медь-транспортирующей АТФазы человека 0ЛТЧЕ>Р).

При докинге АТФ в 3-мерные модели нуклеотид-связывающих доменов АТФаз Р-типа актуальна проблема отбора "корректной" структуры комплекса из многих вариантов. Если для предсказанной структуры комплекса №+,К+-АТФазы с АТФ (Глава 4) следует ожидать подобия с аналогичной структурой Са2+-АТФачы в силу сходства сайтов связывания этих белков, то для >У>ГОР это не так. Поскольку И-домен \VNDP не имеет заметной гомологии по аминокислотной последовательности с Са2+-АТФазой, его сайт связывания нуклеотида устроен по другому (см. Главу 5).

Один из подходов к решению указанной проблемы - это разработка дополнительного критерия, специфичного для АТФ, с целью отбора "правдоподобных" вариантов комплексов. Для разработки критерия "правдоподобия" необходимо выяснить, какие межмолекулярные взаимодействия наиболее характерны для связывания АТФ с белком. В данной работе был проанализирован набор из 49 кристаллических структур различных белков в комплексе с АТФ из банка данных белковых структур (РОВ). Исследование было сосредоточено на микроокружении аденинового основания АТФ. Из-за жесткой структуры аденинового основания, его ориентация относительно белка во многом определяет как положение остатка рибозы, так и направление фосфатного "хвоста" молекулы.

Таблица 1. Статистические показатели для некоторых взаимодействий аденинового основания АТФ с белками, рассчитанные по выборке 49 кристаллических структур высокого разрешения из РОВ.

Гидрофобный контакт Стэкинг-взаимодействие Водородные связи с NH2 группой АТФ, число Водородные связи с участием атомов N АТФ, число

"сильный" "слабый" "нет" "есть" "нет" 2 1 0 1 0

70% 28% 2% 36% 64% 32% 44% 24% 32% 68%

При анализе структур комплексов различных белков с АТФ (Табл. 1) было выявлено, что при связывании АТФ характерны следующие взаимодействия для аденинового основания: (1) водородные связи аминогруппы и циклических атомов азота с белком; (2) гидрофобные взаимодействия; (3) в ряде случаев - стэкинг-взаимодействия с остатками Phe, Туг и His, а также с л-системой гуанидиновой группировки остатков Arg. На примере результатов докинга АТФ в структуры Са2+-АТФазы из МД(Е1) было показано, что предложенный качественный критерий "правдоподобия" для комплексов белок-АТФ помогает выделить "правильное" решение.

Глава 4. Построение 3-мерной модели нуклеотид-связывающих доменов ^^.К^-АТФазы. Исследование структурно-функциональных аспектов связывания АТФ.

В настоящей главе обсуждается построение 3-мерных моделей АТФ-связьгвающих (К и Р) доменов а1 На+,К+-АТФазы крысы и исследование их структуры, динамики и взаимодействия с АТФ. Ыа*,К+-АТФаза плазматической мембраны - наиболее распространенный в клетках млекопитающих представитель семейства АТФаз Р-типа. По некоторым оценкам, 20+30% синтезированной в клетках АТФ тратится на активный транспорт ионов из клетки наружу и ионов К* внутрь клетки. Градиенты концентраций ионов и К+ необходимы для формирования трансмембранного потенциала, поддержания клеточного объема, вторичного активного транспорта других веществ.

Модели пространственной структуры нуклеотид-связывающих доменов Ка+,К+-АТФазы (фрагмент Ьуз342-Ьу876б) были построены по гомологии аминокислотной последовательности с соответствующим регионом Са2+-АТФазы. В отличие от предлагавшихся ранее 3-мерных моделей №+,К+-АТФазы, в данной работе была использована пространственная структура изолированного М-домена №\К+-АТФазы (код 1М08 в РОВ), полученная в 2003 г. по данным спектроскопии ЯМР.

Было выполнено выравнивание аминокислотных последовательностей нуклеотид-связывающих доменов №+,К+-АТФазы и Са2+-АТФазой. Участки последовательности Иа\К+-АТФазы, соответствующие Р-домену (Ьув342-А^78, Пе582-Ьу8766), за исключением фрагмента "вставки" А1а638-Суя656. имеют высокую гомологию с Са2+-ЛТФазой (48% идентичных остатков). Для 1Ч-домена (Мс1379-Ьеи581) показана относительно низкая степень гомологии по последовательности (20% идентичных остатков), и выравнивание было оптимизировано по совпадениям элементов вторичной структуры АТФаз. Структурные различия в ^доменах обеих АТФаз, главным образом, обусловлены наличием двух делений в аминокислотной последовательности №+,К+-АТФазы (между остатками РЬе386/А5р387 и Уа1455/Су8456, соответственно). Первая деления соответствует дополнительному р-тяжу в структуре Ы-домена Са2+-АТФазы, а вторая - неструктурированной петле между спиралями а1 и а2 КГ-домена. Тем не менее, анализ ЯМР-структуры изолированного N домена АТФазы показьшает, что его общая укладка сходна с соответствующим доменом Са2+-АТФазы: -75% остатков близки по положению Са атомов (Рис. 4).

Рисунок 4. (А) Модель структуры изолированного К-домена Ка*,К*-АТФазы в комплексе с АТФ, определенная по данным спектроскопии ЯМР (1М08). (Б) Структура И-домена из кристаллической структуры Са2*-АТФазы в комплексе с аналогом АТФ (РйВ-код 1Т58). Отмечены важнейшие остатки сайта связывания АТФ и темным цветом окрашены консервативные элементы вторичной структуры. Пунктирными овалом показан участок структуры И-домена Ыа^Ю-АТФазы, который должны находиться в контакте с Р-доменом в интактной структуре. В ЯМР-структуре. Видно, что боковая цепь остатка Аг£>544 (аналогичный Arg560 Са3*-АТФазы) не участвует в связывании АТФ.

По ЯМР-структуре комплекса изолированного 1Ч-домена с АТФ можно лишь приблизительно оценить локализацию лиганда в интактном белке, т.к. в связывании АТФ принимают участие также и остатки Р-домена. Сравнение с кристаллической структурой Са2+-АТФазы позволяет заключить, что в изолированном N домене конформация некоторых важных участков белка может бьгть искажена из-за отсутствия контакта с Р доменом (Рис. 4). Это участки перехода между И- и Р- доменами, теряющие в изолированном N домене р-структурную конформацию, и петлевой участок между а-спиралью и р-тяжем Туг535-Агц544, непосредственно контактирующий с Р-доменом в "закрытом" состоянии. Поэтому предсказание и анализ структуры комплекса Ыа\К*-АТФазы с АТФ представляет фундаментальный интерес.

В настоящей работе получены 3-мерные модели Ка4,К+-АТФазы 2-х типов: в первом из них структура обоих доменов построена только на основании РСА-структуры Са2+-АТФазы (Х-модели); во втором случае для построения структуры И-домена использована его ЯМР-структура (Ы-модели). Проверка качества моделей осуществлена с помощью расчетов "профиля окружения" остатков (критерий Айзенберга). Низкие значения оценочной функции Я, (где 1 - номер остатка) соответствуют "необычным" параметрам микроокружения остатка и могут быть связаны либо с неправильной структурой модели, либо со специальной функцией этого остатка (например, такие остатки встречаются в активных центрах ферментов).

Распределение значений Я, по остаткам отображено на Рис.5., где темным цветом выделены остатки, находящиеся в «невыгодном» окружении.

И-доит

т связывания АТФ Р-домвн

"Открытая" X-модель

"Открыт»«" N-модель

Рисунок 5. Структуры Х-модели (построена только на основании структуры Са^-АТФазы) и Ы-модели (1>)-домен построен по ЯМР-структуре) нуклеотид-связывающих доменов Иа^.К^-АТФазы в "открытой" конформации (форма Е1) Участки, соответствующие низким (остатки находятся в "невыгодном" окружении) и высоким значениям оценочной функции 5„ окрашенные темно- и светло-серым цветом, соответственно.

Конформация некоторых петлевых участков 1Ч-домена значительно отличается в разных моделях (остатки в1п430 - А1а439, Рго554 - Аяп570) По значениям Я, для этих остатков можно предположить, что в ГЧ-модели, их конформация задана более точно, чем в X-модели. В обоих моделях для практически идентичных структур Р-домена также выделяются участки с низкими значениями 5, (АврбЗб - Аг{»651, в1у660 - Ьеи671), относящиеся к области "вставки" с неизвестной пространственной структурой в Р домене Так как в ЗО-моделях все эти участки достаточно удалены от предполагаемого сайта связывания АТФ и интерфейсного участка между доменами, неточность в предсказании их структуры не должна принципиально влиять на результаты моделирования взаимодействий белок-лиганд. Для оценки качества пространственной структуры белка в целом значения 5, суммируют по всем остаткам, и результат (5) сравнивают со среднестатистическим значением 5 сог (194 в данном случае), полученным из анализа выборки экспериментальных структур глобулярных белков. Считается, что, если для некоторой модели значение 5 < 0.45-5сот., то она заведомо неправильна Было показано, что для Х- и Ы-моделей отношение $/5С0Г составляет 0.66 и 0.85, соответственно. Таким образом, оба варианта модели удовлетворяют указанному критерию.

Для уточнения моделей и изучения конформационной подвижности был применен метод МД. Расчеты проводили в явно заданном растворителе на временах 6+10 не. Во всех МД пространственная структура отдельных доменов остается достаточно стабильной, средне-

квадратичное отклонение (СКО) по позициям атомов основной цепи относительно стартовой структуры для них составляет ~3т4 Ä, что близко к аналогичным показателям для МД Са2+-АТФазы.

В ходе МД 3-мерных моделей №*,К+-АТФазы показаны доменные движения типа "закрывание", аналогичные наблюдаемым в траекториях МД нуклеотид-связывающих доменов Са2+-АТФазы. При старте МД "открытой" N-модели (междоменный угол 0 =165°), в течение первой не происходило "закрывание" доменов до 0 -125° , а затем наблюдали колебания значений © с амплитудой -20° (Рис. 6). Таким образом, при старте из "открытой" конформации N-домен может совершать значительные перемещения относительно Р домена в наносекундном диапазоне. В МД "закрытой" (Е2) конформации N-модели наблюдалось дополнительное сближение ("закрывание") N- и Р- доменов: величина угла © менялась от 118° до 90° в течение первых 4 не МД, а затем структура белка стабилизируется, демонстрируя значение 0 ~ 90°. Интересно, что в МД-структурах "закрытой" N-модели N- и Р-домены сближены даже в большей степени, чем в кристаллических структурах Са2*-АТФазы в комплексе с аналогами АТФ. В результате анализа МД можно сделать вывод о значительной вариабельности взаимного пространственного расположения N- и Р-доменов. Оценить какие-либо предпочтительные доменные конфигурации при относительно малых временах МД (-10 не) не представляется возможным.

N-домен

Р-домен

Рисунок 6. (А) Зависимости междоменного угла & от времени в траекториях МД со стартовых структур "открытой" (сплошная линия) и "закрытой" (пунктирная линия) ]Ч-моделей №*,К*-АТФазы. (В) Структура из МД "закрытой" И-модели в комплексе с АТФ, полученном в результате докинга. Адениновое основание АТФ связано в сайте 14-домена, а фосфатный "хвост" достигает фосфорнлируемого остатка АврЗб? Р-домена.

Апробированный для структур Са2+-АТФазы подход использования молекулярного докинга в сочетании с МД был применен для исследования взаимодействия АТФ с 3-мерными моделями нуклеотид-связывающих доменов №+,К+-АТФазы. Докинг АТФ был выполнен для представительного набора пространственных структур, выбранных из МД-траекторий, Варианты комплекса, в которых молекула АТФ связана одновременно с остатками сайтов К- и Р-доменов, удалось получить только для МД(Е2)-конформеров К-модели (см. Рис. 6Б). Это объясняется тем, что в МД этой модели домены находились в "закрытой" конформации, и указанные сайты достаточно сближены друг с другом. В МД-конформерах со значением 0 -100* расстояние между сайтами К- и Р-доменов оптимально для связывания АТФ.

Отбор комплексов 3-мерных моделей №*,К+-АТФазы с АТФ, полученных в результате докинга, производили по критериям, аналогичным примененным при исследовании Са2*-АТФазы. Для большинства отобранных комплексов (пример на Рис. 7) наблюдалось стэкинг-взаимодействие аденинового основания АТФ с боковой цепью РЬе475, аналогичного остатку РЬе487 Саг+-АТФазы. Адениновое основание лиганда находится в преимущественно гидрофобном окружении, которое создается не только за счет РЬе475, но также и за счет боковых цепей остатков 1^501, Ьеи546, А1а503. Важно отметить, что в ряде комплексов была обнаружена водородная связь группы №12 аденинового основания с амидной группой остатка Йп482. Эта водородная связь наблюдалась и в структуре комплекса АТФ с изолированным № доменом ^^К^-АТФазы, определенной с помощью методов спектроскопии ЯМР. В отличие от комплекса Са2+-АТФаза/АТФ, в моделях №*,К+-АТФазы не наблюдается образования водородной связи аминогруппы аденинового основания с карбоксильной группой остатка 01и446 (аналог С1и442 Саг+-АТФазы, см. Рис.3 и Рис. 7). На этом основании можно заключить, что образование водородной связи аденинового основания АТФ с 01п482, а не с 01и446, является одной из специфических особенностей №*,К*-АТФазы.

Результаты докинга показывают, что роль остатка А^544, боковая цепь которого образует водородные связи с фосфатными группами и/или остатком рибозы АТФ, аналогична роли остатка Аг^бО Саг+-АТФазы. Взаимодействие фосфатного "хвоста" с Аг^44 ориентирует АТФ таким образом, что у-РОз группа направлена в сторону сайта фосфорилирования Р-домена. Конформация А^544 подвижна в МД, когда И- и Р-домены находятся в "открытой" конфигурации. Однако в "закрытой" форме боковые цепи Аг^44 и остатка Авр621 Р-домена сближаются с образованием солевого мостика.

(угол & ~ 100°) конформацию, взятую из траектории МД(Е2).

Рисунок 7. Структура комплекса N-модели Ыа\К*-АТФазы с АТФ, полученная в

результате докинга лиганда в "закрытую'

Сравнение структуры комплексов АТФ с Ка\К+-АТФазой (Рис. 7) и Са2+-АТФазой (Рис. 3) при их выравнивании в пространстве по элементам вторичной структуре N-доменов показывает, что ориентация в сайте связывания аденинового основания лиганда близка в этих двух структурах. СКО по позициям атомов аденинового основания АТФ в комплексе с Са2+-АТФазой и 3-мерной моделью Ка+,К*-АТФазы составляет 2.5 Ä. Фосфатный "хвост" АТФ в комплексах с №+,К+-АТФазой образует водородные связи с остатками Asp343, ThrölO, Lys691 Р-домена, находящимися в непосредственной близости от каталитического Asp369. Расстояние между у-фосфатом и карбоксильной группой этого остатка составляет 4 + 5 Ä, что близко к наблюдаемому в комплексе Са2+-АТФаза/АТФ.

Для Ка+,К+-АТФазы дикого типа и ряда ее мутантных форм из литературы доступны результаты измерений параметра Ко 5 по Mg-АТФ (Ко 5 М8"АТФ), который можно считать верхней оценкой константы диссоциации (IQ). На основании полученной модели комплекса №+,К+-АТФазы с АТФ был проведен анализ этих данных. (1) Эксперимент показал, что эффект замены консервативного остатка Lys501Ala весьма мал. В Са2+-АТФазе остаток Lys515 (аналог остатка LysSOl Ыа\К+-АТФачы) образует "солевой мостик" с Glu442, который образует водородную связь с NH2 аденинового основания АТФ в комплексе. В модели комплекса Ыа\К*-АТФазы с АТФ аналогичную водородную связь формирует боковая цепь Gln482, а остаток Glu446 (аналог Glu442) несколько удален от лиганда. По-видимому, в Ыа^.К^-АТФазе влияние пары взаимодействующих остатков Lys501-Glu443 на сродство к АТФ не столь значительно, как в Са2+-АТФазе. (2) Относительно мало меняется сродство к Mg-АТФ при замене консервативного остатка Phe475 на Туг, т.к., вероятно, при этом сохраняется стэкинг-взаимодействие ароматического кольца остатка с адениновым

основанием лиганда. (3) При мутации консервативного остатка Arg544Ala сродство фермента к Mg-АТФ значительно снижается (Kos Mg AT<l> 26 нМ и 1530 пМ для дикого типа и мутанта, соответственно). Таким образом, функциональная роль Arg544 не отличается от аналогичного остатка Arg560 Са2+-АТФазы - это стабилизация фосфатного "хвоста" АТФ в комплексе, а также "закрытой" коиформации N- и Р-доменов за счет электростатического взаимодействия с остатком Asp612 из Р-домена. (4) Интересно, что замена Lys480Ala не меняет, а мутация Lys480Glu ведет к относительно малому росту значения Ко.5 М8'АТФ - до 490 нМ. В отличие от Са2+-АТФазы, где аналогичный остаток Lys489 участвует в электростатическом взаимодействии с остатком Glu680 Р-домена, в Ыа\К+-АТФазе Lys480 не может стабилизировать "закрытое" состояние доменов, т.к. в Р-домене его "партнер" (аналог Glu680) замещен на остаток Ser. Влияние взаимодействий между N- и Р-доменами на сродство к Mg-АТФ обсуждается ниже.

По результатам моделирования положение АТФ в сайге связывания №+,К+-АТФазы в целом аналогично таковому в кристаллической структуре комплекса 1T5S. Если в более консервативном Р-домене обоих ферментов остатки, находящиеся в контакте с лигандом, полностью идентичны, то в N домене имеются важные отличия в микроокружении АТФ. Так, один из важнейших (по данным мутагенеза) для связывания АТФ остаток Са2+-АТФазы Arg489 в Ка+,К+-АТФазе замещен остатком Ser477, т.е. в Ыа+,К+-АТФазе отсутствует одно из выгодных электростатических взаимодействий, стабилизирующих отрицательно заряженные фосфатные группы лиганда. Тем не менее, для дикого типа №+,К+-АТФазы значение Kojs Mg" АТФ (по разным оценкам, от 12 до 26 нМ) в -20 раз меньше, чем для Са2+-АТФазы дикого типа (510 нМ). Можно сделать вывод о том, что в №+,К+-АТФазе существуют дополнительные компенсирующие факторы, обеспечивающие высокое сродство к АТФ.

В работе предложена гипотеза, что одним из этих факторов (возможно, главным) может быть соотношение свободных энергий N- и Р-доменов в "закрытой" и "открытой" конформации. В траекториях МД нуклеотид-связывающих доменов обоих белков показаны крупномасштабные обратимые движения указанных доменов, наблюдаемые в наносекундном диапазоне, в ходе которых их связывающие сайты сближаются, а площадь контакта между доменами растет на определенных участках. Согласно кристаллографическим данным, комплексу Са2+-АТФазы с АТФ соответствует "закрытая" конформация доменов. При некоторых допущениях бьио показано, что свободная энергия, связанная с процессом "закрывания" доменов, входит как слагаемое в свободную энергию связывания лиганда, наряду с энергиями взаимодействий белок-АТФ и десольватации молекул при образовании комплекса. Белок-белковые и междоменные контакты могут стабилизироваться как гидрофобными, так и электростатическими взаимодействиями. Анализ данных мутагенеза позволяет предположить, что в случае Са2+- и №*,К+-АТФаз именно электростатические

взаимодействия стабилизируют контакт между N- и Р-доменами. На это указывает образование солевых мое гиков между остатками из разных доменов (К492 - Е680, R560-D627 и E519-R678 в Са2+-АТФазе; R544-D612 и E505-R685 в №+,К+-АТФазе) при их сближении в процессе "закрывания". Хотя боковая цепь остатка К492 Са2+-АТФазы достаточно удалена от АТФ, замена Lys492Tyr значительно повышает К(1М8"ЛТФ, а замена аналогичного остатка Lys480Ala в Na\K+-ATOaie практически не меняет этот показатель. Эти факты можно объяснить тем, что в Na*,K+-AT®a3e остаток Lys480 не образует солевого мостика с остатком Р-домена и не слишком важен для стабилизации "закрытой" конфигурации доменов.

Для проверки предложенной гипотезы был проведен анализ распределения электростатического потенциала, рассчитанного на поверхности изолированных N- и Р-доменов обоих ферментов. В области связывания АТФ электростатические свойства консервативны: сайт в N-домене характеризуется положительными, а сайт в Р-домене -отрицательными значениями потенциала. Существенные отличия выявлены в области междоменных контактов Поверхность контакта N домена (петлевой участок между а-спиралью и ß-тяжем Ile549-Arg560) в Са2+-ЛТФазе в целом электронейтральна: положительно заряженные боковые цепи Lys550 и Arg556 компенсируют поле расположенных в окрестности остатков Glu и Asp. Напротив, в №+,К*-АТФазе аналогичная контактная поверхность -область отрицательного потенциала, что объясняется замещением остатков, аналогичных Lys550 и Arg556 в Са2+-АТФазе, на Leu и Gly, соответственно, а также присутствием в окрестности "дополнительных" отрицательно заряженных боковых цепей. Контактные участки Р-домена обоих белков - области положительного электростатического потенциала. Таким образом, в Ыа\К+-АТФазе потенциал на контактных поверхностях доменов относительно мал по величине, и при этом поверхности электростатически "комплементарны" друг другу. Напротив, при сближении N- и Р-доменов Са2+-АТФазы, вероятно, происходит электростатическое отталкивание между остатками, находящимися в Р-домене и формирующими обширную положительно заряженную область вблизи контакта, и остатками Lys550 и Arg556 в N-домене. За счет выгодных междоменных электростатических взаимодействий в №+,К+-АТФазе "закрытая" конформация N- и Р-доменов может бьгть более стабильна, чем в Са2+-АТФазе.

Итак, эксперимент показывает, что сродство к АТФ Ка+,К*-АТФазы выше, чем Са2+-АТФазы. При этом анализ комплексов белков с АТФ позволяет предположить, что в Na+,K+-АТФазе взаимодействие белка с АТФ менее выгодно, чем в Са2+-АТФазе, из-за отсутствия в Ыа+,К+-АТФазе аналога остатка Arg489. Исходя из предложенной гипотезы, этот эффект можно объяснить вкладом энергии "невыгодных" электростатических взаимодействий N- и Р-доменов в "закрытом" состоянии, которые снижают сродство Са2+-АТФазы к АТФ.

I

i

' Глав» 5. Построение 3-мерной модели нуклеотид-связываюших доменов медь* транспортирующей АТФазы. Исследование структурно-функциональных аспектов связывания АТФ и механизмов проявления мутаций, связанных с болезнью Вильсона.

' Структура медь-транспортирующей АТФазы человека, обозначаемой далее WNDP (от

' WilsoN Disease Protein), значительно отличается от Са2*-АТФазы. Кроме типичных для всех 1 АТФаз Р-типа цитоплазматических доменов (А, N и Р), WNDP содержит дополнительный ' внутриклеточный сегмент, несущий шесть эквивалентных доменов, связывающих ионы меди, ! которые, вероятно, имеют регуляторную функцию. Кроме того, ТМ-домен включает 8 (а не 10, f как в Са2+-АТФазе) сегментов. Выравнивание аминокислотных последовательностей WNDP и ' Са2+-АТФазы свидетельствует о значительной гомологии только в области Р-домена и о ее ^ отсутствии в области N-домена. Все это делает построение модели пространственной структуры WNDP по гомологии с Са2+-АТФазой задачей нетривиальной.

Известен ряд мутаций в гене, кодирующем WNDP, фенотипически проявляющихся в избыточном накоплении меди в клетках ряда тканей, в особенности в печени и головпом мозге. Для большинства мутаций механизм влияния на структуру, функцию и регуляцию фермента WNDP не изучен. Подробно исследована наиболее часто встречающаяся при 1 болезни Вильсона мутация Hisl069Gln. Установлено, что эта мутация нарушает каталитическое фосфорилирование в белке по остатку Aspl027. Остаток N-домена Hisl069, ' по-видимому, играет важную роль в координации АТФ в сайте связывания. Однако остается неизвестным, координирует ли Hisl069 молекулу АТФ непосредственно, или его влияние на связывание АТФ опосредовано другими остатками.

Основная цель данного исследования - идентифицировать остатки WNDP, которые могут быть вовлечены в связывание нуклеотидов. Взаимодействие с АТФ и каталитическое фосфорилирование - важнейшие этапы в механизме транспортировки ионов Си2* ферментом. В настоящее время доступно очень мало информации об этих процессах. Трудность ^ заключается в том, что хорошо изученные остатки, участвующие в связывании АТФ в Са2+-АТФазе, не консервативны в структуре WNDP. Это позволяет сделать вывод о том, что структуры сайтов связывания АТФ в указанных ферментах отличаются. Для того, чтобы исследовать гипотетические структуры комплексов белка с АТФ и анализировать экспериментальные данные мутагенеза, необходимо построить модель пространственной структуры WNDP на основании гомологии. ' Для построения модели АТФ-связывающих доменов WNDP необходимо выполнить

^ выравнивание их аминокислотной последовательности (Met996-Argl322) с соответствующим 1 участком Са2+-АТФазы (Ala320-Lys758). Для трех сегментов последовательности WNDP, Met996-Alal065, Aspll85-Del236 и Phel240-Ilel311 наблюдается гомология с Са2+-АТФазой с ' идентичностью 21, 33, и 47%, соответственно. В структуре Са2+-АТФазы эти регионы

принадлежат Р-домену и "шарнирному" участку, соединяющему И- и Р-домены. Напротив, участок последовательности WNDP, соответствующий К-домену, не обнаруживает даже отдаленного сходства с соответствующим сегментом Са2+-АТФазы или какими-либо другими белками с известной пространственной структурой Для того, чтобы установить возможный тип укладки основной цепи (фолда) для Ы-домена У/МБР, был использован метод "протягивания" аминокислотной последовательности через набор структурных шаблонов. Этот подход использует статистические данные по атом-атомным контактам в белках с известной пространственной структурой. Полученные результаты позволили заключить, что наиболее подходящим структурным шаблоном для \VNDP является АТФ-связывающий фрагмент Са2+-АТФазы в состоянии Е1. Соответствующее выравнивание аминокислотных последовательностей М- и Р-доменов WNDP и Са2+-АТФазы послужило основой для построения модели АТФ-связывающего участка ^ГОР.

Методом моделирования по гомологии на основании соответствующих кристаллических структур Са2+-АТФазы были получены модели пространственной структуры нуклеотид-связывающих доменов как в форме Е1 ("открытая" модель, см. Рис. 8), так и

в форме Е2 ("закрытая" модель). Построенные модели характеризуются достаточно высокими значениями оценочной функции Б, рассчитанной по методу "профиля окружения" Айзенберга, - для них 5УБсог > 0-68 (при уровне надежности 0.45), что свидетельствует о хорошем качестве моделей в целом. Как и ожидалось, качество модели по этому критерию для Р-домсна значительно лучше, чем для домена. Например, для "открытой" модели показатель 8/8сог для индивидуальных доменов составляет 0.82 и 0.53, соответственно. Это может быть обусловлено отклонениями 3-мерной модели последнего от нативной структуры белка - главным образом, в области петлевых участков.

Как видно из Рис. 8, укладка Р-доменов Са2+-АТФазы и 3-мерные модели WNDP весьма сходна. Для 14-доменов этих белков наблюдаются значительные отличия, обусловленные несколькими обширными делениями в аминокислотной последовательности \VNDP относительно последовательности Са2+-АТФазы. Сопоставление данных точечного мутагенеза и модели нуклеотид-связывающих доменов АУШЭР показывает, что остатки, отвечающие за связывание АТФ - прежде всего №1069 и 01и1064, - расположены вблизи полости М-домена, аналогичной сайту связывания М-домена Са2+-АТФазы.

Рисунок 8. (А) Кристаллическая структура Са2+-АТФазы в состоянии Е1, послужившая "шаблоном" для ЗО-модели АЛТШР. Показаны консервативные остатки РИе487 и СЫ42, отвечающие за связывание АТФ в Ы-домене, и фосфорилируемый остаток Азр351 Р-домена. Расстояние между остатками С1и442 и Ахр351 составляет -26 А. (Б) Модель пространственной структуры \VNDP в состоянии Е1. Показаны остатки Ив 1069 и С1и1064 1Ч-домена, мутации по которым наиболее часто встречаются при болезни Вильсона, и фосфорилируемый остаток Дер1027 Р-домена. Расстояние между 01иЮ64 (возможный функциональный аналог С1и442 Са^-АТФазы) и МрКШ составляет -28 А. Элементы вторичной структуры - а-спирали и Р-тяжи показаны в виде цилиндров и лент, соответственно

Для уточнения структуры сайта связывания АТФ, а также с целью установления взаимного расположения доменов для 3-мерных моделей WNDP в формах El и Е2 были выполнены расчеты МД в явно заданном растворителе. Отдельные домены WNDP в целом сохраняют свою структуру в ходе МД. При этом наблюдаются движения динамических доменов друг относительно друга. Анализ изменений междоменного угла <9 в траекториях МД (Рис. 9А) показал, что при старте из форм El и Е2 получаются различные равновесные конформации доменов. Аналогично Са2+-АТФазе, в МД(Е1) происходит доменное движение типа "закрывание", и ©достигает значения -140° (при стартовом значении 0=160°). В МД(Е2) наблюдается дополнительное сближение доменов: <9 стабилизируется около 105° (стартовое значение 0 = 122°).

Рисунок 9. (А) Зависимости междоменного угла в от времени в траекториях МД со стартовых структур "открытой" (сплошная линия) и "закрытой" (пунктирная линия) моделей нуклеотид-связывающих доменов \VNDP. (Б) Комплекс нуклеотид-связывающих с АТФ, полученный в

результате докинга в структуру из МД(Е2), соответствующую "закрытой" конформации нуклеотид-связывающих доменов (0-105°).

Протокол докинга, отработанный на примере Са2+-АТФазы, был применен для изучения взаимодействий АТФ с моделью АТФ-связывающих доменов АОТШР. Докинг АТФ был произведен для представительного набора конформеров WNDP, извлеченных из траекторий МО(Е1) и МО(Е2). Во всех комплексах, предложенных в результате докинга, нуклеотид встраивается вблизи интерфейсного участка между и Р-доменами, а фосфатные группы могут координироваться остатками из обоих доменов. Для анализа отбирали только те комплексы, в которых у-РОз группа АТФ была направлена в сторону сайта Р-домена.

Фосфатный "хвост" молекулы АТФ, связанной в сайте М-домена посредством аденинового основания, может достигать фосфорилируемого остатка Авр1027 Р-домена при л

условии, что & £ 105° (Рис. 9Б). Такие конформации наблюдали в траектории МД(Е2). Результаты докинга показали возможность весьма разнообразных положений аденинового основания АТФ в полости сайта К-домена. По-видимому, эта гетерогенность комплексов обусловлена относительно малой точностью предсказания пространственной структуры И-домена \VNDP.

В результате докинга АТФ в МД(Е1)-конформеры, характеризуемые значениями угла в >125°, были получены комплексы, в которых слишком большое расстояние между сайтом связывания в !Ч-домене и каталитическим остатком А£р1027 не позволяет получить одновременного контакта лиганда с обоими доменами (Рис. 10). Комплексы ДУ1"ФР с АТФ можно разделить на две группы:

1) Адениновое основание и остаток рибозы АТФ встроены в полость 1Ч-домена (Рис. 10), которую формируют преимущественно гидрофобные остатки. Для многих комплексов характерна водородная связь между 1ЧН2 группой АТФ и карбоксильной группой остатков С1и1064 или А8р1164. Фосфатный "хвост" АТФ формирует одну или две водородных связи с боковой цепью Аг§1151. Совместно с остатками Р-домена 1^1028 и Аяр1222, боковая цепь А^1151 может фиксировать фосфатные группы АТФ и "направляет" их в сторону фосфорилируемого остатка А$р1027. При этом у-РОз группа лиганда остается удаленной от сайта фосфорилирования на расстояние свыше 8 А.

2) у-РОз группа АТФ находится в непосредственном контакте с остатком А5р1027, а адениновое основание располагается на интерфейсном участке между Ы- и Р-доменами. В этом случае взаимодействия белок-лиганд определяются сетью водородных связей между фосфатными группами АТФ и полярными остатками из Р-домена.

Таким образом, нуклеотид-связывающие домены \VNDP содержат два мотива, отвечающих за связывание АТФ: (1) гидрофобную полость в М-домене, которая изолирует адениновое основание лиганда от растворителя; (2) кластер остатков в Р-домене, фиксирующих фосфатный "хвост" АТФ сетью водородных связей. Связывание АТФ с высокой аффинностью, по-видимому, происходит при взаимодействии молекулы с обоими мотивами одновременно. Необходимое для этого сближение связывающих мотивов происходит в результате доменного движения типа "закрывание", наблюдавшегося в МД. По экспериментальным данным [2], связывание АТФ с изолированным №доменом \VNDP характеризуется высокой аффинностью, близкой к показателю дам нативного белка, т.е. вклад сайта Ы-домена в связывание АТФ является определяющим.

Из-за низкой гомологии аминокислотных последовательностей \VNDP и Са2+-АТФазы (структуры- "шаблона"), 3-мерная модель >Л^РД5Р в области М-домена может значительно отличаться от "реальной". В связи с этим особенно актуальным становится сопоставление модели с экспериментальными данными мутагенеза. В работе [2] были проведены измерения параметров связывания АТФ для рекомбинантного Ы-домена дикого типа Ч^ГТОР и его мутантов 01и1064А1а, Ш810б901п, А^ШПйв и Су81104РЬе. Сделан вывод о том, что мутации 01и1064А1а и №810690111 значительно снижают сродство белка к АТФ. Кроме того, для анализа были использованы данные точечного мутагенеза для близкородственного \VNDP белка - цинк-транспортирующей АТФазы. В этой работе исследовано влияние мутаций, аналогичных мутациям, связанных с болезнью Вильсона (С1и1064А1а, ШвЮбЭйп, 01у10998ег, ®у1101Аг& Су51104РЬе и 01уЮ35Уа1), на взаимодействие с АТФ, фосфорилирование и транспорт катионов. Показано, что указанные остатки также важны для связывания АТФ, наряду с в1и1064 и Ш$1069.

Рисунок 10. Один из вариантов встраивания АТФ в структуры из МД Е1-модели нуклеотид-связывающих доменов Ш^Р. Расстояние между у-Р03 группой АТФ и фосфорилируемым остатком Ахр1027 из Р-домена составляет ~8 А. Сферами показана локализация остатков, мутации по которым

экспериментально изучены и связаны с болезнью Вильсона, а также остаток Дер 1027. Выделены остатки С1и1064, №51069 и Аф151 из 14-домена, формирующие контасты с АТФ в предсказанной структуре комплекса.

Как видно из Рис. 10, на основании построенной модели можно объяснить эффекты, измеренные в экспериментах по мутагенезу. Так, замена остатка Glyl035, расположенного на "шарнирном" участке между N- и Р-доменами, на Val может затруднять необходимые в каталитическом цикле доменные переходы. Остаток Argll51 находится на поверхности контакта между N- и Р-доменами; площадь контакта между доменами значительно увеличивается при переходе из состояния El в Е2. Таким образом, мутация Argll51His может изменять соотношение энергий "открытого" и "закрытого" состояний и, тем самым, нарушать работу фермента.

В предлагаемой модели остатки Glul064 и Hisl069 находятся в контакте или хотя бы близки к молекуле АТФ, что может указывать на их непосредственное участие в связывании лиганда. Замена Glul064Ala в контексте нашей модели связана с потерей водородной связи карбоксильной группы остатка с NH2 группой аденинового основания АТФ. Сложнее интерпретировать влияние на связывание АТФ мутации Hisl069Gln, которая наиболее часто встречается при синдроме Вильсона. В ряде комплексов, полученных методом докинга, Hisl069 находится в контакте с фосфатным "хвостом" АТФ. В связи с этим, мы выдвигаем гипотезу, что эффект замены Hisl069Gln может бьггь объяснен потерей положительного заряда протонированной формы боковой цепи остатка His, которая стабилизирует отрицательно заряженные фосфатные группы АТФ в сайте связывания.

Наконец, по данным точечного мутагенеза для цинк-транспортирующей АТФазы в стабилизации фосфатного "хвоста" АТФ должны участвовать NH-группы основной цепи остатков глицинового мотива (Gly1099 -Х- Gly1101) из петлевого участка в N-домене. В модели

\VNDP этот петлевой участок расположен на некотором удалении от сайта связывания АТФ (Рис. 10), что, по-видимому, является одной из неточностей модели.

Таким образом, на основании анализа экспериментальных данных можно заключить, что предложенная ЗО-модель нуклеотид-связывающих доменов \VNDP и модель ее комплекса с АТФ являются в целом корректными. Эти модели могут служить стартовыми точками для последующих уточнений и помогут планировать и интерпретировать эксперименты по мутагенезу АТФ-связывающих доменов Ч^ШР и родственных ей АТФаз.

ВЫВОДЫ

В этом разделе суммированы проведенные в работе исследования, полученные новые результаты и выводы.

1. На основе изучения методами молекулярного моделирования кристаллических структур Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума предложена структурно-динамическая модель взаимодействия нуклеотид-связывающих доменов фермента с АТФ. Показано, что разработанные подходы приводят к результатам, которые хорошо согласуются с экспериментальными данными.

2. При изучении взаимодействий Са2+-АТФазы с АТФ показана целесообразность сочетания методов молекулярной динамики (МД) и докинга, с целью учета конформационноб подвижности белка-мишени. В случае АТФаз Р-типа для предсказания корректной структуры комплекса необходимо рассматривать как медленные доменные движения, так и локальную конформационную подвижность остатков сайта связывания.

3. В результате анализа кристаллических структур белков в комплексе с АТФ выявлены межмолекулярные взаимодействия, определяющие связывание лиганда: гидрофобное окружение аденинового основания АТФ и характерные водородные связи с его ОТЪ группой. Сформулированы качественные критерии для ранжирования комплексов белков с АТФ, полученных в результате молекулярного докинга.

4. Методом моделирования по гомологии построены 3-мерные модели нуклеотид-связывающих доменов Ыа+,К+-АТФазы. С помощью методов молекулярного моделирования предложена модель комплекса №+,К+-АТФазы с АТФ, на основе которой были интерпретированы экспериментальные данные точечного мутагенеза Предложена гипотеза, объясняющая более высокое сродство к АТФ Ка*,К*-АТФазы по сравнению с Са2+-АТФазой.

5. Предложены 3-мерные модели нуклеотид-связывающих доменов медь-транспортирующей АТФазы не имеющей заметной гомологии по последовательности 1Ч-домена с Са2+-

АТФазой. Разработана модель пространственной структуры комплекса >ЛТ«®Р с АТФ. Результаты моделирования хорошо согласуются с данными точечного мутагенеза. Это дает основание для дальнейшего использования модели ^ГОР для планирования будущих экспериментальных исследований этого белка.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. E&emov, R. G., Kosinsky Yu.A., Nolde D.E., Tsivkovskii, R., Arseniev A.S., Lutsenko, S. Molecular Modeling of the Nucleotide-Binding Domain of the Wilson' Disease Protein: Location of the АТР-binding Site, Domain Dynamics, and Potential Effects of the Major Disease Mutations. (2004) Biochem. J. 382, Part 1,293-305.

2. Morgan C.T., Tsivkovskii R., Kosinsky Yu.A., Efremov R.G., Lutsenko S. The Distinct Functional Properties of the Nucleotide-binding Domain of ATP7B, the Human Copper-transporting ATPase. Analysis of the Wilson disease mutations E1064A, H1069Q, R1151H, and C1104F. (2004) J. BioL Chem. 279(35), 36363-36371.

3. Полянский А.А., Косинский Ю.А., Ефремов Р.Г. Локальные температурные изменения подвижности в молекулах тиоредоксинов влияют на их термостабильные свойства. (2004) Биоорганическая химия 30(5), 470-480.

4. Kosinsky Yu.A., Volynsky Р.Е., Lagant P., Vergoten G., Suzuki E., Arseniev A.S., Efremov R.G. Development of the Force Field Parameters for Phosphoimidazole and Phosphohistidine. (2004) J. Comput. Chem. 25(11), 1313-1321.

5. Kosinsky Yu.A., Nolde D.E., Tsivkovskii R., Arseniev A.S., Lutsenko S., Efremov R.G. Molecular modeling of the nucleotide-binding domain of the Wilson' disease protein: the ATP binding site and domain dynamics. Proceedings of the Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure 1, 290-292 (Novosibirsk 2004).

6. Efremov, R. G., Kosinsky Yu.A., Nolde D.E., Arseniev A.S., Lutsenko, S. Molecular modeling study of nucleotide-binding domain of the human copper-transpoerting ATPase. Proceedings of the III International Moscow Conference on Computational Molecular Biology 1, 62-63 (Moscow 2003).

7. Polyansky A.A., Kosinsky Yu.A., Efremov R.G. Molecular dynamics as a powerful tool in design of thermostable protein mutants. Proceedings of the III International Moscow Conference on Computational Molecular Biology 1, 190-191(Moscow 2003).

8. Косинский Ю.А., Ефремов Р.Г., Арсеньев A.C. Расчет энергии электростатических взаимодействий в белках с использованием макроскопической модели с локальными значениями диэлектрической проницаемости. Материалы 1-й Российской электронной конференции по биоинформатике (Москва 2000; http://www.ibmh.msk.su/recob/F/F01-poster-rus.htm).

9. Полянский А.А., Косинский Ю.А., Ефремов Р.Г. Взаимосвязь подвижности белковой молекулы с ее термостабильными свойствами. XV Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 29 (Москва 2003).

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия HRN 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 13.02.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 084. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

ЛаРбА ¿УМ

• -8&Н

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Косинский, Юрий Анзельмович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ

АТФазы Р-типа: классификация, структура, механизм работы.

1.1. История вопроса и основные сведения по АТФазам Р-типа.

1.2. Геномика и субстратная специфичность семейства АТФаз Р-типа.

1.3. Исследования пространственной структуры АТФаз Р-типа.

1.4. Молекулярный механизм работы АТФаз Р-типа.

1.5. Регуляция активности АТФаз Р-типа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное моделирование структурных и функциональных аспектов взаимодействия АТФаз Р-типа с АТФ"

Для понимания молекулярного механизма работы ферментов необходим анализ их пространственной структуры атомарного разрешения. Более того, часто нужно установить пространственные структуры белка в разных функциональных состояниях: в комплексе с субстратами или их аналогами, ингибиторами и др. Однако во многих случаях определение структуры белков с помощью экспериментальных методов представляет значительную техническую проблему. Наибольшие трудности возникают при структурных исследованиях мембранных белков, к которым относятся множество важнейших ферментов, рецепторов и транспортеров. Экспериментально установлены пространственные структуры высокого разрешения только нескольких типов мембранных белков. В то же время, благодаря успехам геномных исследований, для большинства биологически важных белков известна аминокислотная последовательность.

В связи с этим, широкое применение находит метод построения моделей пространственной структуры белков (3-мерных моделей) на основании гомологии аминокислотной последовательности с родственными белками, для которых пространственная структура установлена экспериментально. Дальнейшее исследование 3-мерных моделей ферментов с помощью методов молекулярного моделирования, таких как молекулярная динамика и докинг лигандов, позволяет эффективнее анализировать экспериментальные данные, осуществлять компьютерный дизайн точечных мутаций белков, а также выдвигать различные гипотезы о структуре и функции белка.

Одно из важных и перспективных направлений структурной биологии связано с изучением мембранных белков из семейства АТФаз Р-типа. Ферменты из этого обширного и широко распространенного в живых организмах семейства осуществляют активный транспорт специфичных для них катионов за счет энергии гидролиза АТФ. Для наиболее изученного представителя АТФаз Р-типа, Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума, в последние годы был получен ряд кристаллических структур высокого разрешения в различных функциональных состояниях, в том числе в комплексе с аналогами АТФ. Эти структуры используются в качестве основы ("шаблона") для построения моделей пространственной структуры других АТФаз Р-типа на основании гомологии.

Диссертационная работа посвящена построению 3-мерных моделей двух цитоплазматических нуклеотид-связывающих доменов (т. н. Ы- и Р-доменов) Ыа+,К+-АТФазы плазматической мембраны и медь-транспортирующей АТФазы человека, и изучению их структуры, динамики и взаимодействий с АТФ с помощью методов молекулярного моделирования.

Ыа+,К+-АТФаза плазматической мембраны - наиболее распространенный в клетках млекопитающих представитель семейства АТФаз Р-типа. Градиенты концентраций ионов Ыа+ и К+ необходимы для формирования трансмембранного потенциала, поддержания клеточного объема, вторичного активного транспорта других веществ. Пространственная структура Ка+,К+-АТФазы атомарного разрешения до сих пор экспериментально не установлена. Выравнивание аминокислотной последовательности нуклеотид-связывающих доменов фермента с Са -АТФазой показало относительно высокую гомологию. Это дало возможность построить реалистичную 3-мерную модель Ыа+,К+-АТФазы и предложить модель ее комплекса с АТФ, на основе которых были объяснены экспериментальные данные точечного мутагенеза.

Более сложная задача решалась при построении и анализе 3-мерных моделей медьтранспортирующей АТФазы. Для аминокислотной последовательности Ы-домена этого белка гомология с соответствующим участком Са2+-АТФазы практически отсутствует.

Тем не менее, результаты теоретического анализа показали, что укладка пространственной структуры нуклеотид-связывающих доменов обоих ферментов сходна.

Исследование 3-мерной модели медь-транспортирующей АТФазы, построенной на

2+ основе структуры

Са -АТФазы, представляет не только фундаментальный, но и биомедицинский интерес. Мутации гена, кодирующего данный фермент, обусловливают летальный гепато-неврологический синдром - болезнь Вильсона. При этом многие и наиболее часто встречающиеся мутации локализованы в >1- и Р-доменах и являются причиной нарушения связывания АТФ белком и/или процесса каталитического фосфорилирования. Объяснение молекулярного механизма этих мутаций и выявление функционально важных остатков, отвечающих за связывание АТФ, необходимо для поиска путей лечения этого наследственного заболевания.

Результаты моделирования как для

Ыа ,К -АТФазы, так и для медь-транспортирующей АТФазы, помогут планировать эксперименты сайт-направленного мутагенеза и лучше понять механизм работы этих ферментов. Модели нуклеотид-связывающих доменов АТФаз, полученные в данной работе, могут быть в дальнейшем использованы в качестве стартовой точки для построений более подробных молекулярных моделей ферментов.

В диссертации приняты следующие сокращения:

МД — молекулярная динамика; РСА — рентгеноструктурный анализ; СКО — среднеквадратичное отклонение; ЭМ - электронная микроскопия; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; PDB - Protein Data Bank; WNDP - WilsoN Disease Protein.

Аминокислотные остатки представлены в однобуквенном обозначении:

Алании Ala A Лейцин Leu L

Аргинин Arg R Лизин Lys К

Аспарагин Asn N Метионин Met M

Аспарагиновая кислота Asp D Фенилаланин Phe F

Цистеин Cys С Пролин Pro P

Глутамин Gin Q Серин Ser S

Глутаминовая кислота Glu E Треонин Thr T

Глицин Gly G Триптофан Trp W

Гистидин His H Тирозин Tyr Y

Изолейцин lie I Валин Val V

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Косинский, Юрий Анзельмович

выводы

1. На основе изучения методами молекулярного моделирования кристаллических структур Са2+-АТФазы саркоплазматического . ретикулума предложена структурно-динамическая модель взаимодействия нуклеотид-связывающих доменов фермента с АТФ. Показано, что разработанные подходы приводят к результатам, которые хорошо согласуются с экспериментальными данными.

2. При изучении взаимодействий

Са -АТФазы с АТФ показана целесообразность сочетания методов молекулярной динамики (МД) и докинга - с целью учета конформационной подвижности белка-мишени, В случае АТФаз Р-типа для предсказания корректной структуры комплекса необходимо рассматривать как медленные доменные движения, так и локальную конформационную подвижность остатков сайта связывания.

3. В результате анализа кристаллических структур белков в комплексе с АТФ выявлены межмолекулярные взаимодействия, определяющие связывание лиганда: гидрофобное окружение аденииового основания АТФ и характерные водородные связи с его ЫНг группой. Сформулированы качественные критерии для ранжирования комплексов белков с АТФ, полученных в результате молекулярного докинга.

4. Методом моделирования по гомологии построены 3-мерные модели нуклеотид-связывающих доменов Ыа+,К+-АТФазы. С помощью методов молекулярного. моделирования предложена модель комплекса Ыа+,К+-АТФазы с АТФ, на основе которой были интерпретированы экспериментальные данные точечного мутагенеза. Предложена гипотеза, объясняющая более высокое сродство к

АТФ Ыа ,К -АТФазы по сравнению с

Са2+-АТФазой.

5. . Предложены 3-мерные модели нуклеотид-связывающих доменов медь-трапспортирующей АТФазы (\VNDP), не имеющей заметной гомологии по

Л I последовательности Ы-домеиа с Са -АТФазой. Разработана модель пространственной структуры комплекса \VNDP с АТФ. Результаты моделирования хорошо согласуются с данными точечного мутагенеза. Это дает основание для дальнейшего использования модели \VNDP для планирования будущих экспериментальных исследований этого белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Косинский, Юрий Анзельмович, Москва

1. Skou, J. C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta 23, 394-401 (1957).

2. Hasselbach, W., Makinose, M. Die Calcium pumpe der Erschlaffungsgrana des Muskels und ihre Abhängigkeit von der ATP-Spaltung. Eur. J. Biochem. 333, 518-528 (1961).

3. Slayman, C. L., Lu, C. Y., Shane, L. Correlated changes in membrane potential and ATP concentrations in Neurospora. Nature 226, 274-276 (1970).

4. Jorgensen, P. L. Purification and characterization of Na+,K+-ATPase V. Conformational changes in the enzyme. Transitions between the Na-form and the K-form studied with tryptic digestion as a tool. Biochim. Biophys. Acta 401, 399-415 (1975).

5. Jencks, W. P. Utilization of binding energy and coupling rules for active transport and other coupled vectorial processes. Methods Enzymol. 171, 145-164 (1989).

6. Kuhlbrandt W. Biology, structure and mechanism of P-type ATPases. Nature 5, 282-295 (2004).

7. Axelsen, K. B., Palmgren, M. G. Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase superfamily. J. Mol. Evol. 46, 84-101 (1998).

8. Bult, C. J. et al. Complete genome sequence of the methanogenic archaeon, Methanococcus jannaschii. Science 273, 1058-1073 (1996).

9. Goffeau, A. The inventory of all ion and drug ATPases encoded by the yeast genome. Acta Physiol. Scand. 643, 297-300 (1998).

10. Axelsen, K. B., Palmgren, M. G. Inventory of the superfamily of P-type ion pumps in Arabidopsis. Plant Physiol. 126, 696-706 (2001).

11. Altendorf, K. et al. Structure and function of the Kdp-ATPase of Escherichia coli. Acta Physiol. Scand. 643, 137-146 (1998).

12. Rensing, C., Fan, B., Sharma, R., Mitra, B., Rosen, B. P. CopA: an Escherichia coli Cu(I)-translocating P-type ATPase. Proc. Natl Acad. Sei. USA 97, 652-656 (2000).

13. Okkeri, J., Haltia, T. Expression and mutagenesis of ZntA, a zinc-transporting P-type ATPase from Escherichia coli. Biochemistry 38, 14109-14116 (1999).

14. Rosen, B. P. Transport and detoxification systems for transition metals, heavy metals and metalloids in eukaryotic and prokaryotic microbes. Comp. Biochem. Physiol., Part A Mol. Integr. Physiol. 133, 689-693 (2002).

15. Nelson, N. Metal ion transporters and homeostasis. EMBOJ. 18, 4361-4371 (1999).

16. Lutsenko, S., Petris, M. J. Function and regulation of the mammalian copper-transporting ATPases: insights from biochemical and cell biological approaches. J. Membr. Biol. 191, 1-12 (2003).

17. Tanzi, R. E. et al. The Wilson disease gene is a copper transporting ATPase with homology to the Menkes disease gene. Nature Genet. 5, 344-350 (1993).

18. Odermatt, A., Suter, H., Krapf, R., Solioz, M. Primary structure of two P-type ATPases involved in copper homeostasis in Enterococcus hirae. J. Biol. Chem. 268, 12775-12779 (1993).

19. Bull, P. C., Thomas, G. R., Rommens, J. M., Forbes, J. R., Cox, D. W. The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene. Nature Genet. 5,327-337 (1993).

20. Daleke, D. L. Regulation of transbilayer plasma membrane phospholipd asymmetry. J. Lipid Res. 44, 233-242 (2003).

21. Lee, A. G. A calcium pump made visible. Curr. Opin.Struct. Biol. 12, 547-554 (2002).

22. Stokes, D. L. & Green, N. M. Structure and function of the calcium pump. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 445-468 (2003).

23. Toyoshima, C., Nakasako, M., Nomura, H. & Ogawa, H. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. Nature 405, 641-655 (2000).

24. Toyoshima, C. & Nomura, H. Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium. Nature 418, 605-611 (2002).

25. Ma, J. J. & Pan, Z. Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells. Front. Biosci. 8, D242-D255 (2003).

26. Harper, J. F. Dissecting calcium oscillators in plant cells. Trends Plant Sci. 6, 395-397 (2001).

27. Palmgren, M. G. Plant plasma membrane H+-ATPases: powerhouses for nutrient uptake. Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 52,817-845 (2001).

28. Geisler, M., Koenen, W., Richter, J. & Schumann, J. Molecular aspects of higher plant P-type Ca2+-ATPases. Biochim. Biophys. Acta 1456, 52-78 (2000).

29. Kaplan, J. H. Biochemistry of Na,K-ATPase. Annu. Rev.Biochem. 71, 511-535 (2002).

30. Jorgensen, P., Hakansson, K., Karlish, S. Structure and mechanism of Na,K-ATPase: functional sites and their interactions. Annu. Rev. Physiol. 65, 817-849 (2003).

31. Mense, M., Rajendran, V., Blostein, R., Caplan, M. J. Extracellular domains, transmembrane segments, and intracellular domains interact to determine the cation selectivity of Na,K- and gastric H,K-ATPase. Biochemistry 41, 9803-9812 (2002).

32. Vagin, O., Denevich, S., Munson, K., Sachs, G. SCH28080, a K+-competitive inhibitor of the gastric H,K-ATPase, binds near the M5-6 luminal loop, preventing K+ access to the ion binding domain. Biochemistry 41, 12755-12762 (2002).

33. Monk, B. C., Perlin, D. S. Fungal plasma membrane proton pumps as promising new antifungal targets. Crit. Rev. Microbiol. 20, 209-223 (1994).

34. Besancon, M. et al. Membrane topology and omeprazole labeling of the gastric H+,K+-adenosinetriphosphatase. Biochemistry 32, 2345-2355 (1993).

35. Geering, K. The functional role of P subunits in oligomeric P-type ATPases. J. Bioenerg. Biomembr. 33, 425-438 (2001).

36. Eraso, P., Gancedo, C. Activation of yeast plasma membrane ATPase by acid pH during growth. FEBSLett. 224, 187-192 (1987).

37. Skriver, E., Maunsbach, A. B., Jorgensen, P. L. Formation of two-dimensional crystals in pure membrane-bound Na+,K+-ATPase. FEBSLett. 131, 219-222 (1981).

38. Dux, L. & Martonosi, A. Two-dimensional arrays of proteins in sarcoplasmic reticulum and purified Ca2+-ATPase vesicles treated with vanadate. J. Biol. Chem. 258, 2599-2603 (1983).

39. Rabon, E., Wilke, M., Sachs, G., Zampighi, G. Crystallization of the gastric H+,K+-ATPase. J. Mol. Biol. 261, 1434-1439 (1986).

40. Xu, C., Rice, W. J., He, W., Stokes, D. L. A structural model for the catalytic cycle of Ca2+-ATPase. J. Mol. Biol. 316, 201-211 (2002).

41. Rice, W. J. et al. Structure of Na+,K+-ATPase at 11-A resolution: comparison with Ca2+-ATPase in El and E2 states. Biophys. J. 80, 2187-2197 (2001).

42. Auer, M., Scarborough, G. A., Klihlbrandt, W. Threedimensional map of the plasma membrane H+-ATPase in the open conformation. Nature 392, 840-843 (1998).

43. Lahiri, S. D., Zhang, G., Dunaway-Mariano, D., Allen, K. N. The pentacovalent phosphorus intermediate of a phosphoryl transfer reaction. Science 299, 2067-2071 (2003).

44. Hilge, M. et al. ATP-induced conformational changes of the nucleotide-binding domain of Na,K-ATPase. Nature Struct. Biol. 10, 468-474 (2003).

45. Ogawa, H., Toyoshima, C. Homology modeling of the cation binding sites of Na+K+-ATPase. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 15977-15982 (2002).

46. Toyofuku, T., Kurzydlowski, K., Tada, M., MacLennan, D. H. Amino acids Lys-Asp-Asp-Lys-Pro-Val402 in the Ca2+-ATPase of cardiac sarcoplasmic reticulum are critical for functional association with phospholamban. J. Biol. Chem.269, 22929-22932 (1994).

47. Toyoshima, C., Mizutani, T. Crystal structure of the calcium pump with a bound ATP analogue. Nature 430, 529-535 (2004).

48. Gitschier, J., Moffat, B., Reilly, D., Wood, W. I., Fairbrother, W. J. Solution structure of the fourth metal-binding domain from the Menkes copper-transporting ATPase. Nature Struct. Biol. 5,47-54(1998).

49. Banci, L. et al. A new zinc-protein coordination site in intracellular metal trafficking: solution structure of the Apo and Zn(II) forms of ZntA(46-l 18). J. Mol. Biol. 323, 883-897 (2002).

50. Wakabayashi, S. & Shigekawa, M. Role of divalent cation bound to phosphoenzyme intermediate of sarcoplasmic reticulum ATPase. J. Biol Chem. 259, 4427^1436 (1984).

51. Portillo, F. Regulation of plasma membrane H+-ATPase in fungi and plants. Biochim. Biophys. Acta 1469, 31^2 (2000).

52. Petris, M. J. et al. Ligand-regulated transport of the Menkes copper P-type ATPase efflux pump from the Golgi apparatus to the plasma membrane: a novel mechanism ofregulated trafficking. EMBOJ. 15, 6084-6095 (1996). '

53. East, J. M. Sarco(endo)plasmic reticulum calcium pumps: recent .advances in our understanding of structure/function and biology. Mol. Membr. Biol. 17, 189-200 (2000).

54. MacLennan, D.H., Kranias, E.G. Phospholamban: a crucial regulator of cardiac contractility. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 4, 566-577 (2003).

55. Toyoshima, C., Asahi, M., Sugita, Y., Khanna, R., Tsuda, T-, MacLennan D.H. Modeling of the inhibitory interaction of phospholamban with the Ca -ATPase. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 467—472 (2003).

56. Carafoli, E. Biogenesis: plasma membrane calcium ATPase: 15 years of work on the purified enzyme. FASEBJ. 8, 993-1002 (1994).

57. Curran, A. C. et al. Autoinhibition of a calmodulin-dependent calcium pump involves a structure in the stalk that connects the transmembrane domain to the ATPase catalytic domain.

58. J. Biol. Chem. 275, 30301-30308 (2000).

59. Sze, H., Liang, F., Hwang, I., Curran A. C., Harper J. F. Diversity and regulation of plant Ca2+ pumps: insights from expression in yeast. Annu. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 51, 433-462 (2000).

60. Palmgren, M. G., Sommarin, M., Serrano, R., Larsson, C. Identification of an autoinhibitory domain in the C-terminal region of the plant plasma membrane H+-ATPase. J. Biol.Chem. 266, 20470-20475 (1991).

61. Palmgren, M. Regulation of plant plasma-membrane H+-ATPase activity. Physiol. Plantarum 83,314-323 (1991).

62. Serrano, R., Portillo, F., Monk, B. C., Palmgren, M. G. The regulatory domain of fungal and plant plasma membrane H+-ATPase. Acta Physiol. Scand. Suppl. 607, 131-136 (1992).

63. Morsomme, P., Slayman, C. W., Goffeau, A. Mutagenic study of the structure, function and biogenesis of the yeast plasma membrane H+-ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1469, 133-157 (2000).

64. Aducci, P., Marra, M., Fogliano, V., Fullone M. R. Fusicoccin receptors: perception and transduction of the fusicoccin-signal. J. Exp. Bot. 46, 1463-1478 (1995).

65. Goossens, A., de la Fuente, N., Forment, J., Serrano, R., Portillo, F. Regulation of yeast H+-ATPase by protein kinases belonging to a family dedicated to activation of plasma membrane transporters. Mol. Cell. Biol 20, 7654-7661 (2000).

66. Brooks, B.R., Bruccoleri, R.E., Olafson, B.D., States, D.J., Swaminathan, S. and Karplus, M., CHARMM: A Program for Macromolecular Energy, Minimization, and Dynamics Calculations. J. Comp. Chem. 4, 187-217(1993).

67. Jorgensen, W.L. and Tirado-Rives, J., The OPLS Potential Functions for Proteins. Energy Minimizations for Crystals of Cyclic Peptides and Crambin. J. Am. Chem. Soc., 110, 1657-1666 (1988).

68. Berendsen, H. J. C., Postma, J. P. M., DiNola, A., Haak, J. R. Molecular dynamics with coupling to an external bath. J. Chem. Phys. 81, 3684-3690 (1984).

69. Berendsen, H.J.C., van der Spoel, D., van Drunen, R. GROMACS Сотр. Phys. Comm. 91, 43-56 (1995).

70. Полянский А.А., Косинский Ю.А., Ефремов P.Г. Локальные температурные изменения подвижности в молекулах тиоредоксинов влияют на их термостабильные свойства. Биоорганическая химия 30(5), 470-480 (2004).

71. Polyansky А.А., Kosinsky Yu.A., Efremov R.G. Molecular dynamics as a powerful tool in design of thermostable protein mutants. Proceedings of the III International Moscow Conference on Computational Molecular Biology 1, 190-191(Moscow 2003).

72. Essmann, U., Perera, L., Berkowitz, M. L., Darden, Т., Lee, H., Pedersen, L. G. A smooth particle mesh ewald potential. J. Chem. Phys. 103, 8577-8592 (1995).

73. Kosinsky Yu.A., Volynsky P.E., Lagant P., Vergoten G., Suzuki E., Arseniev A.S., Efremov R.G. Development of the Force Field Parameters for Phosphoimidazole and Phosphohistidine. J. Comput Chem. 25(11), 1313-1321 (2004).

74. Sali, A. & Blundell, T. L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J. Mol. Biol. 234, 779-815 (1993).

75. Sali, A. and Overington, J.P. Derivation of rules for comparative protein modeling from a database of protein structure alignments. Protein Sci. 3, 1582-1596 (1994).

76. Altschul, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997).

77. Jones, D.T. GenTHREADER: an efficient and reliable protein fold recognition method for genomic sequences. J. Mol. Biol. 287, 797-815 (1999).

78. Rost, B., Sander, C. Prediction of protein secondary structure at better than 70% accuracy. J. Mol. Biol. 232, pp. 584-599 (1993).

79. Bowie, J.U., Luthy, R. and Eisenberg, D. A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure. Science 253, 164-170 (1991).

80. Luthy, R., Bowie, J.U. and Eisenberg, D. Assessment of protein models with three-dimensional profiles. Nature 356, 83-85 (1992).

81. Valler, M.J. and Green, D. Diversity screening versus focused screening in drug discovery. Drug Discov. Today 7, 286-293 (2000).

82. Lengauer, T., Lemmen, C., Rarey, M., Zimmermann, M. Novel technologies for virtual screening. Drug Discov. Today 9, 27-34 (2004).

83. Wang J., Kollman P.A., Kuntz I.D. Flexible Ligand Docking: A Multistep Strategy Approach Proteins 36, 1-19 (1999).

84. Nissink, J.W.M., Murray, C., Hartshorn, M., Verdonk, M.L., Cole, J.C. and Taylor, R. A new test set for validating predictions of protein-ligand interaction, Proteins, 49, 457-471 (2002).

85. Jones, G., Willett, P., Glen, R. C., Leach, A. R. and Taylor, R. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking. J. Mol. Biol. 267, 727r748 (1997).

86. Perola, E., Walters, W.P., and Charifson, P.S. A Detailed Comparison of Current Docking and Scoring Methods on Systems of Pharmaceutical Relevance. Proteins 56, 235-49 (2004).

87. Hansson, T., Marelius, J., Aqvist, J. Ligand binding affinity prediction by linear interaction energy methods. J. Comput. Aided Mol. Des. 12,27-35 (1998).

88. Miyamoto, S., and Kollman, P.A. Absolute and relative binding free energy calculations of the interaction of biotin and its analogs with streptavidin using molecular dynamics/free energy perturbation approaches. Proteins 16, 226-245 (1993).

89. Rader, S.D., Agard, D.A. conformational substates in enzyme mechanism: the 120K structure of alpha-lytic protease at 15 A resolution. Protein Sci. 6, pp. 1375-1386 (1997).

90. Volkman, B.F., Lipson, D., Werner, D.E., Fern, D. Two-state allosteric behavior in a singledomain signaling protein. Science 291, 2429-2433 (2001).

91. Zhao, S., Goodsell, D.C., Olson, A.J. Analysis of data set of paired uncomplexed protein structures: new metrics of side-chain flexibility and model evaluation. Proteins 43, 271r279 (2001).

92. Lin, J.H., Perryman, A.L., Schames, J.R., McCammon, J.A. Computational drug design accomadating receptor flexibility: the relaxed complex scheme. J. Am. Chem. Soc. 124, 56325633 (2002).

93. Erickson, J.A., Jalaie, M., Robertson, D.H., Lewis, R.A., Vieth, M. Lessons in molecular recognition: the effects of ligand and protein flexibility on molecular docking accuracy. J. Med. Chem. 47, 45-55 (2004).

94. Betts, M.J., Sternberg, M.J.E. An analysis of conformational changes upon protein-protein association: implications for predictive docking. Protein Eng. 12, pp. 271-283 (1999).

95. Murray, C.W., Baxter, C.A., Frenkel, A.D. The sensitivity of the results of molecular docking to induced fit effects: application to thrombin, thermolysin and neurominidase. J. Comput. AidedMol. Des. 13,547-562(1999).

96. Najmanovich, R., Kuttner, J., Sobolev, V., Edelman, M. Side-chain flexibility in proteins upon ligand binding. Proteins 39, 261 -268 (2000).

97. Carlson, H.A. Protein flexibility and drug design: how to hit a moving target. Curr, Opin. Chem. Biol. 6,447-452 (2002).

98. Ferrari, A.M., Wei, B.Q., Costantino, L., Shoichet, B.K. Soft docking and multiple receptor conformations in virtual screening. J. Med. Chem. 47, 5076-5084 (2004).

99. Ghose, A. K., Viswanadhan, V.N., Wendoloski, J.J. Prediction of Hydrophobic (Lipophilic) Properties of Small Organic Molecules Using Fragmental Methods: An Analysis of ALOGP and CLOGP Methods. J. Phys. Chem. 102, 3762-3772 (1998).

100. Fauchere, J.L., Quaredon, P., Kaetterer, L., Estimating and representing hydrophobicity potential. J. Mol. Graphics 6, 203-206 (1988).

101. Xu, C., Rice, W.J., He, W., Stokes, D.L. A Structural Model for the Catalytic Cycle of Ca2+-ATPase. J. Mol. Biol. 316,201-211 (2002).

102. Olesen, C., Sorensen, T. L.-M., Nielsen, R. C., Moller, J. V., Nissen, P. Dephosphorylation of the Calcium Pump Coupled to Counterion Occlusion. Science 306, 2251-2255 (2004).

103. Sorensen, T. L.-M., Moller, J. V., Nissen, P. Phosphoryl Transfer and Calcium Ion Occlusion in the Calcium Pump. Science 306, 1672-1675 (2004).

104. Hayward, S. and Berendsen, H.J.C. Systematic Analysis of Domain Motions in Proteins from Conformational Change; New Results on Citrate Synthase and T4 Lysozyme. Proteins 30, 144-154(1998).

105. Abu-Abed, M., Mai, T.K., Kainosho, M., MacLennan, D.H., Ikura, M. Characterization of the ATP-Binding Domain of the Sarco(endo)plasmic Reticulum Ca2+-ATPase: Probing Nucleotide Binding by Multidimensional NMR. Biochemistry 41, 1156-1164 (2002).

106. Clarke, R. J., Kane, D. J., Apell, H.-J., Roudna, M., Bamberg, E. Kinetics of Na+-Dependent Conformational Changes of Rabbit Kidney Na,K-ATPase. Biophys. J. 75, 1340— 1353 (1998).

107. Babes, A., Fendler, K. Na+ Transport, and the E1P-E2P Conformational Transition of the Na+/K+-ATPase Biophys. J. 79, 2557-2571 (2000).

108. Wang, K., Farley, RA. Lysine 480 is not an essential residue for ATP-binding or hydrolysis by Na,K-ATPase. J. Biol. Chem. 267, 3577-3580 (1992).

109. Jacobsen, M.D., Pedersen, P.A., Jorgensen, P.L. Importance of Na,K-ATPase residue al-Arg544 in the segment Arg544-Asp567 for high-affinity binding of ATP, ADP, or MgATP. Biochemistry 41, pp. 1451-1456 (2002).

110. Herbert, H., Purhonen, P., Vorum, H., Thomsen, K., Maunsbach, A.B. Three-dimensional structure of renal Na,K-ATPase from cryo-electron microscopy of two-dimensional crystals. J. Mol. Biol. 314, 479-494 (2001).

111. Hakansson, K.O. The crystallographic structure of Na,K-ATPase N-domain at 2.6 A resolution. J. Mol. Biol. 332, pp. 1175-1182 (2003).

112. Jones, S., Thornton, J. M. Principles of protein-protein interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 13-20(1996).

113. Gilson, M.K., Sharp, K. and Honig, B. Calculating the Electrostatic Potential of Molecules in Solution: Method and error assessment. J. Сотр. Chem. 9, 327-335 (1987).

114. Fatemi, N., Sarkar, В. Structural and Functional Insights of Wilson Disease Copper-Transporting ATPase. J. Bioenerg. Biomembr. 34, 339-349 (2002).

115. Lutsenko, S., Efremov, R.G., Tsivkovskii, R., Walker, J.M. Human Copper-Transporting ATPase ATP7B (The Wilson's Disease Protein): Biochemical Properties and Regulation. J. Bioenerg. Biomembr., 34, 351-362 (2002).

116. Gitlin, J.D. Wilson disease. Gastroenterology 125, 1868-1877 (2003).

117. Ferenci, P., Caca, K., Loudianos, G., Mieli-Vergani, G., Tanner, S., Sternlieb, i., Schilsky, M., Cox, D. and Berr, F. Diagnosis and phenotypic classification of Wilson disease. Liver Int. 23,139-142(2003).

118. Petrukhin, K., Lutsenko, S., Chernov, I., Ross, В. M., Kaplan, J. H., and Gilliam, Т. C. Hum. Mol. Genet. 3(9), 1647-1656(1994).

119. Kim, E. K., Yoo, O.J., Song, K. Y., Yoo, H.W., Choi, S.Y., Cho, S.W. and Hahn, S.H. (1998) Identification of three novel mutations and a high frequency of the Arg778Leu mutation in Korean patients with Wilson disease. Hum. Mutat. 11, 275-278

120. Nanji, M.S., Nguyen, V.T., Kawasoe, J.H., Inui, K., Endo, F., Nakajima, T., Anezaki, T. and Cox, D.W. (1997) Haplotype and mutation analysis in Japanese patients with Wilson disease. Am. J. Hum. Genet. 60, 1423-1429

121. Tsivkovskii, R., Eisses, J.F., Kaplan, J.H. and Lutsenko, S. Functional properties of the copper-transporting ATPase ATP7B (the Wilson's disease protein) expressed in insect cells. J. Biol. Chem. 277, 976-983 (2002).

122. Tsivkovskii, R., Efremov, R.G., Lutsenko, S. The Role of the Invariant His-1069 in Folding and Function of the Wilson's Disease Protein, the Human Copper-transporting ATPase ATP7B. J. Biol. Chem. 278, 13302-13308 (2003).

123. Kabsch, W. and Sander, C. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Biopolymers 22,2577-2637 (1983).

124. Okkeri, J., Laakkonen, L., Haltia, T. The nucleotide-binding domain of the Zn -transporting P-type ATPase from Escherichia coli carries a glycine motif that may be involved in binding of ATP. Biochem. J. 377, 95-105 (2004).