Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетические исследования хромосомных аномалий в постнатальной и пренатальной диагностике при медико-генетическом консультировании

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетические исследования хромосомных аномалий в постнатальной и пренатальной диагностике при медико-генетическом консультировании"

ХАРКШСЬКИИ ДЕРЖАВИНЙ УН1ВЕРСИТЕТ

На правах рукопису

ХР ИСТ 114

Алла Василпша

МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТЙЧШ ДОСЛ1ДЖЕННЯ ХРОМОСОМНИХ АНОМАЛ1Й В ПОСТИАТАЛЬНШ I ПРЕНАТАЛЫИЙ Д1АГНОСТИЦ1 ПРИ МЕДИЧНО-ГЕНЕТИЧНОМУ КОНСУЛЬТУВАНШ

03.00.15 — гепсшка

Авторе ф е р а г

днеертацп на здобуття вченого ступенч кандидата (иолопчних наук

X а р к I в — 1

Диееркиш! с рукопнсом.

Робота впконапа у Хармвському ¡шжобласпому меднч-1:()-гс1!ст11чпому центр! 1 Москоиському пауковому центр1 т'снхипюго здоров'я РАЛДТТ.

Наукош керизипкн: доктор бюлопчпих наук, доцент Юров Юрш Борисович; доктор ме-днчних паук, професор, академп< УЕЛИ Гречаш'на Олена Якшл1виа.

Офщшм опонентп: доктор бшлопчинх наук, Атраменто-ва Любов Олекспвна; доктор мсдич-них наук, професор Бужиевська Тамара (вашвна.

Прошдпа ор1 ашзащя: УкраТнськин науковий медично-

генетнчпнн центр (м. Кто).

Захип в¡_чб\деться « юд. на запдаиш спещалЬованоТ вченоТ ради К 053.06.07 Харювського державного ушверептету (310077, м. Хар1ив, ма1"[дан Свобод». 4. аудитор1я 3-15). .

3 диоертапк-ю можпд ознаномптпсь н Цептральшн нау-копп! бшлишчи ХДУ.

Автореферат розк\тано «

с&У » 1994 р.

Вчсний секретар спец1ал1зованоУ вченоТ ради, кандидат б1олог1чних наук

А. В. НЕКРАСОВА.

- i - . ..

ЗаГйЛЬНА ХЙРЙКТЕОИСТИКЯ РОБОТй . Актуальность теки: Хроносомнг- хвогоби зайнагу'ь teÄy4s ¡псце з спадковМ патологii" лвдини. Серед причин загпбел! eMöpioniB або плод1в, а такон багатьох вродсених над i ано-иал1й розвитку и новонародяених хроыосомним аноиал1яа нале-жить одне з-ПЕриих ккць (Фогель 0., Цотульск! й., .1389; Зорсанова С.Г., 19°П. До 50% Bcix д1агностованих спонтанних аборт!в обуиовлен! хромосонним дисбалансом, а в 10 з 1000 живонародяеких д1тей спостер!гапться хроиосокн! змши (Бочков Н.П. та 1н., 1984; Ворсанова С.Г, Вров В.Б., 1987). Найбыыз розпоссЕдаеники е анеушшдП по ..ромосомам-13, 18, 21, X i У, цо супрг'зодяаиться тягкими фенотипними проявэми, aKi потребують i'x ранньоГ пррнатально! д!агностики (Lubs.H., . Ruddle F._, 1970; Jacobs P.. 1977; Epstein C.,' 986; Kuo H.ct al, 19910 з-ие'тов ел!ьш;ацП" для.попередаення дитячо!' скерт-HOCTi. Цс" пояснпе кеобх!дн1сть вивчення методов зфективнй'!" д1агностики хромосомно! латологп, як в пост::атальний, так i в пранатальний пер!оди розвитку плода.

Одним з найб!лы! сучасних i перспективних напрамюв в д1агностиц! хроносоиних хвороб е метод г1бридизац"1! нук-ле'Гнових кислот in situ, оснований на технологи отрицания реконб1н5нтннх молекул ДНК i' використашп i'x у вигляд.' ДНК-зонд1в для д1агностики хромосомно!'патологи'. Цей .четод мае •вазлизу 'перевагу в napiBHanni ? Днпикк способами дослхднення храносомних аномалий в постнатальнШ i прен^-тальнГй дхагностиц1, так як BiH дозволяс анал1зуватк окремг t хромосоми практично .у Bcix стад!ях uniтинного циклу, э.току чиип на iHTe;pa3i (Сгепшг Т. et al, 1986; Julien С. et al, 1986; Lichter. P. et al, 1988; Pinkel D. et al, 19B8; Ворса- -нова С.Г., Яров В.Б., 1991; Klinger К. ' et al, 1992).

- ' - 2 -. Застосоаувчи модекулярно-цмтогенетичний метод (метод . ridpn-дизацП адкле1нових кислот in situ)(> моана биьа точно i еоектиБно эизначнти особливосп хромосомного набору ладини i ' розв'яэати ряд- практичних завдань б облает! вивченкт хро-. мосомних поруаень. Таким чином, розробка ноейх, вдосконален-на попередшх иетоддв диагностики хромосомно! паталог11 е актуальними проблемами сучасно!" медично1 генетики.

. HEffl.I ЗАВДЙННЯ РОБОТИ. Основна мета роботи - вивчити ефективнкть комплексного цитогенетичного i молекулярно-ци-_ тогенетичного 'досл1джень в. постнатальнп} i пренатальн1й . fliarHOCTMni хроаосомннх аномал1й. Для досягнення вказано!

метл бу^.и поставлен! cjiiflyi)4i завдання: »

1. OqiHUTii потребу МГК в про_реденн1 аолекулярна-цитогене-тичного анал1зу на pisHHX клгтинах в постнатальний i прена-тальний период.

2. 0птии1зувати умови нера^оактивно!" г!бридизацП in situ (РШ-флшоресцентно!. in situ гчбридизацп) для 1ден-THSiKaui'i 1ндив1дуалъйих хромосом ладини в метафазних i

' !нтерфазних кл!тинах людини з викооистагшям клонованкх са-тел1тних ДНК ладини."

3; OqiHHTH ножливкть використання ДНК-зсндгв, спе-циф1чних для хромосои 13, 18, 2i, X i У лвдини при прове-денн1 ,пренатально! i постнатально! д1?гностика за допомогош г1бриди:=ацП нуклеХнових кислот' in situ.

4..Застосувати дат клонованоГ посл1довносп для ifieH-.TH$iKauiI аберрантных хромосом при оснозних, соц1ал^но знач-них формах хромосокних хвороб (Tpiicoaifl 18. 21, аноиалП го-носом, вклвчашчи Boaa'iKOBi фории).

НЙУКОВЙ НОВИЗНА РОБОТИ. Вперве оц1нена достов1рн1сть не-рад1оактивно1 НбридизацП' in situ для метафазиого та 1нтер-

- 3 - ■ -

•разного аналгзу аномал!й ка^отчпу у лпдшш.

Вперпе'визначен! умови е ¡користашг цього нбього, ефек-тиечого методу в постнаталыш! i пронаталыпй flianiocTr.iu хроносонних аномалий. Показано, цо храмосомоспецч^чн! ДНК-зонди для центро!Прш<х райотз хроаосоа лядинм (13, 18, 21, X i 31 иозна jfjGKTHDHo використовувати для вияэлення аноиалiA карicinny.

Встановлсно. цо- конялексне - цитогенетичне . нолекулярно-.цитогенетнчне досл1дяенна гпгвицуюг* точн1сть медично-геяг-тичкого пвогнозу. Застосовз!п иетоди дозволили екявити п форми хромосомноV патологии ¿?Ki части ззлизаатося нед!аг-нпстованиии (иаркерн1 хромосоии, аоза'Гцизм з числом аномаль-них клхткн до 20Z).

Дл.т д1агностики мозаГцизму гоносок використаие аолеяуляр-но-цктзгенетнчне д а с л iдзення п>тер:азних ядер.

ПРпКТ'ЛЧНй Ц1КЙ1СТЬ РОБСТИ. Зикористанкз нерадхоактпаяого зар!анта гIбридизацi'i i.n situ прист<ор::Е отрицании точного цитогепетачного дЬзгнози ь 2-3 раза про та метода радюзк-тазного. Отвиаан! дан! дозволила niдзицмт'и ефектншисть i точн1сть ранньоТ пранаталоно! д!аг.чостааа хроаосоиних хвороб плоду. Розроблен1 гпдходм цо б!льт гочно!" аолекулярно-цнтс, -гснетич::о1 диагностики. ян! дозво-лрзть скоротатн час ассяЦзеииз i гпдбигг.пи ftoro осектив:псть п1д час згчо- , ристаннл з робот! агдлчно-генетпчних иентрiв. . ' ПЯРОо.А'ПЛ РОоОТИ. Иатер1?пи дисертацп Сули представ;.jui на зас!дашп в1дд!л1в ИНДI педiатрii дитячо! xipyprii (В1дд1лу вродзенях I спадковнх захворпвань у дхтой з' пзру-зенняа ncaximi i лабораторИ" молекулярно!' цитогенотнки нер-всво-психлчних захворшвань; лаборатпи цитогенетики Паукового центру ncaxianoro здсров.'я PflJH) (Носкна, 1993): 1 ilia-

народному Сикпсзнук1 "Ультразвукова «[агностика в перинато-логiT i мнекологП" (Балаклея, 1993); I з'Тзд1 Рос1йсько!" acoqiaui'i л1кар1в УЗД перинаталогП i гшекологп (Ыосква, 1992); IIU 1нтернац1ональн1й конференцП' э ранньо! прена-тально'1 диагностики (Иерусалим. 1зра1ль, 1994).

ПУБЛ1КЙЦ11. На тему дисертацП опубл1ковано 5 робзт. Мо- • лекудярно-цитогекетич'н1 досл1дження i б1льша частина постна-тальних i пренатальних анал131в зроблен1 автором.

3MICT I ОБСЯГ РОБОТИ. Дисертац1йна робота викпадена на 143 стор. мапинописнсго тексту, складаеться з вступу, огляду Л1тератури, опису матерiалis i методов досл1дження, чо-тирьох роздШп досл1дженна з викладанням отриманих резуль-тапв. зак1нчечня, висновк1в i списка цитовано! л1тератури.

Робота м!стить 10 табяиць, 1*1 малшнк1в.

П0Л0Ш1НЧ. Щ0 ВИНОСЯТЬСЯ НА ЗАХИСТ. 1. Нолекулярно-цито-генетичний анал1з ьчтсрфазних кл!тинних ядер, г!бридизованих in situ, с вксакодостов1рнии методом, цо дозволяв зд!йсншва-ти ефектизну д1аг'ностику хромосомниХ анеупло1дгй i складних випадк1в хромосомного мозаГцизму.

2. Використання комплексного цитсгенетичного i моле^уляр-но-цитогенетичного анализа у хворих з високим ризиком' хро-мосомних аномалий дозволяе виявлятк HOCiiB иаркерних хромосом i мозаГк з кевеликим числом ансиальник ил 1тин,

3. 0птим1зован1 укови флиоресцентно"! г^бридизаци in situ ДНК-зонд1в для ueHTpoHipHKX pafionip хромосом 18, X i У доз-волйшть ьад!йно 1дентиф1кувати ц! хрокосоии в 1нтерфазних Kniтинах.

4. ДНК-зонди альфа-Рч1-18 i адьфа-И-6 для центромхрних paftoHiB хромосом 13 i 21 дозволасть точно Центш^цкуваги ui хромосоми пяьки в метафазних ядрах.

- 5 -ЗМ1СТ РОБОТИ

. МАТЕР1ЛЛИ I НЕТОДИ ДОШДИНЯ. Вих^дачи з ■ поставлених " завдань, основним матер1алом досл!дненняя були клиини ворсин хор1она (КВХ), л!мфоцити пуповинноТ кров1, л1мфоимти перифер!йно'1 кров!. *

Вказаний иатер1ал Зув взятий: в грцгп 1ндив1дууи!в,.нап-равлених на цитоген°тичне досл1дзення по показам, прййнятин в клШчн1й генетиц1 (I трупа); в труп! вагинит гпнок, нап-равлених на ПД по генетичним показам (II трупа); в контрольна труп!, до складалась 1з здорових 1ндив1дуум1в.

Нами було прсанал!ковано 360 посгнатальк«х ! 52 ■ пренэ-тальних випадк1в, з них з 38 проводилось комплексне молрку-лярно-цитогенетнчне-дослЦжспня. Кр1м того, цитогенетичними методами оистежено 50 1ндив]дуум1в контрольно! групи.

Для кожного'1ндив1дууиа. з I 1 .30 з контрольно! групи проведено традиц1йне цитогенетичне досл1дкення з застосуванням методу культивування л1мфощтв периферШюТ кровКВ II групг в- 31 випадку проведений анзл!з препарат!в виготовлених 1з некультивованих КВХ (Баранов В.С. та 1н.. 1989), а в 21 випадку - досл!дяення пуповинног кровх плоду, отринано'Г з допомогов кордоцентеза 1 досл1джено}" стандартним ьётодои культизурання л!мфоцит1в (Захаров А.Ф. та 1н., 1982). Р контрол1 для II групи, цо оК.падаеться з 20 вагиних, направ-лених на перериваннч через особист! иотиви. проведений аналгз препарат1в, виготовлених ¡з

Мол'екулярно-цитогенетичний анал1з' був проведений з вико-ристанняа ДНК-зонд1в альфа-й1-18, альфа-Р1-б, альфа-1}1-22, рУАМ 10-10; рГВ18. специо1чних для цгнтром1рних рай01ив хромосом 13, 21, -18, у в1дповЦноВ робот! використовува-ли метод рад1оактизно'1 г!5ридизацп нуклеГнових кислот дп

situ (Gail 3. Pardue И. L., 1971; Chandler К. E., Yunis ,1,3., 1978.1 3 ■ модиф1кац1ями, запропонованими Вровиь Ю.5. ( 19841 i метод нерад1оактивно"1 МбридизацП" in situ (Pinkel D. et al.,1986). Результати обробляли з допомогою стандарт-них статистичних иетод!в (Закс Л., 1976).

РЕЗУЛЬТР.ТИ Д0СЛ1Д1ЕННЯ ЦИТОГЕНЕТИЧНI ПОСТНйТйЛЫП Д0СЛ1ДШЕННЯ. Цитогенетичне обстеве-шя проведене 360 шдивгдууыам. Серед них хвор! з перБйннои аменореей, кедорозвитком зторинних статевих ознак, затриианням статевого дозр1вання в поеднанн1 з розумовов в1дстал1ств або ReciaHTHoa формою повед!нки (11,92); з niцозрон? на синдром Еереыевського-Тернера i синдром Клайн-фельтера (14,3%); з аномалиями статевого диференгцввання в дорослих i дзтей (2,2%); з багатьма "вродаеними вадаии розвитку i Сабо) MAP (35,3;.'); з мертвонародкенняк, з п1дозроЕ на ту чи !нпу форму внеупло1д!1' (36,1л). У 96 ( 26,6%) сбсте-гених вкявлен! 'xpoMocoKHi -аномалп. Хромисомн1 поруиення зчстрзчалксь у вигляд1; 1) численних аномал1й аутосом - у 44; 2) численних аномалifi toholgh -у '/; 3) иоза!кових форм - у 40; 4) структурних перебудов - у 4t 5) маркерчих хро-моссм - у 1 (табл. 1). В контрольна rpyni хромосомних аномалий не виявлено. йасова частка хромосомних' аномал1й в

rpyni 'з МВПР i (або) MAP склала 55,2%; при nifiospi на синд-

ö

рок Тернера i синдром Клайнфельтера - 34,4%; в rpyni з аменореей - 9,4%; при nopymeHHi статевого диферетйювання - 1% siд загально!' к!лькосп виявлених патолопй, що в1дпов1дае даним, AKi наводяться в fliTepaTypi (мал. 1).

3 380 обстедених индив1дуум1в цитогенетичниии методами в !9 (5,27%) випадках було немокливо 1дентиф1кувати гоносомний

иозащизн з незначноп часткоа аномального клоку. Гону б цих випадкзх оули зэстосоезн! но л2куларно-1г-1тогенетичн1 цет.оди.

ЦИТОГЕНЕТИЧШ ПРЕНЯШЬШ.Д0СЛ1ДНЕННЯ. Виксристовуачи метода отримання "иряиих" хромосомних npenapaTiB з бiоплата xopiona i хромосомних препарат1в з к;льтурн л!мфоцит5в пупо-' BHHH01 кровi плоду, проведено обстенення матер1алу в!д 52 Bariтних siHOK, нзправлених на ПД з такими генетичними показами: 1) поп-зредне народзсння дитини з синдроме.» Дауна (14 зипадк!в; абс багатьма ВПР (10 зипадк1в); 2) похилий siK BariTHOi siHKH (12 випадкхв); 3) тератогенна д!я на пл!д (9 зипадкчв); 4) епонтанч! аборти на ранних "ермгнэх (4 випэд-khju5) захворвзаннр. пов'язан! з сгаттю (3 випадки).

В результат! пренатального обстемення 52 вагпних siHoi;. хромосомна патолог1я в плоду виязлена в 4 випадках i с 2 зи-падках. обстеггених в зв'язку з гемофШсю, виявлена чолоЕЛча стать пледу. Встановлен! слЦуичи кар1отипи г хромосокяез патологка: 46,ХХ/45,Х; 47,ХУ,+21/46,ХУ и в деох випадках 47.ХУ.+21. BariTiiocTi. при вкявленн1 хроносокних анокзлхй. були nepepsaHi i д1агноз1? sepioiKonaHi.

П1слл проведения 1нвазивних процедур у ваг!тних «пнок повиомлен]'я про спонтанн! викиди не зареестровапГ. Bei ээгiтност1 зак1нчились нормалъними пологами, народились дiт" без будъ-якоТ зроддено! пс.:олог11.

МОЛЁКУЛЯРНО'-ЦИТОГРНЕТЯЧЩ ПОСТНАШЬШ ДССЛШЕННЗ. Hi ела проведения постнатально!' цитогенетич:-о1 ць-гностики с 13 випадках (L.27%) не вдалось встановити точний д1агноз. J них: 1 випздок з маркерной додатковош хромосомой; 4 - з анеуп-лоШез аутос-м; 12 - з гоносомнин моза1'цизион; 1 - з поед-нанои патолзг1еа синдрома Тернера i Fдвардса; 1 - з i ¡¿¿¡»a фродитизмом (табл. 2J.

У патента' з фенотипними ознаками синдрома Дауна дослЦкення з допомогош диференц1йного пофарбування дозволили 1дентиф1кувати походаення маркерно!' хромосоми. Шсля проведения рад1оактивно'1 гпбридизацП in situ з застосуван-кям хр0Ы0С0М0епециф1Ч{50Г0 ДНК-зонду альфа-РЛ-6 вдалось з'я-сувати походгекня маркернс! хромосоми, яка була дериватом (der) 21 хромосоми. •

3 ¡2 пробанд:в з пЦозроа на гонссомний мозагдизм п1сля проведения "класично:" цитогенетичшп д1агностики, 8 прови-дзна рад1оактиЕна г1бридизац1я нукле1нових к1.:лот in situ i 4 - FISH г1бридиза1Ця.• 3 них: 4 - з припуцен"м аномальним клоном 45,X С синдром Шерешевського-Тернера), 6 - з синдромом Клайнфельтера i 2 - з синдромом трипло-Х. На ochobí схеми знал i за мозаХцизму у bcíx .12 випадках обстеаених цитогене-тичними методами иогна було виключити аномальний клон, так як на 17-23 нормальк! клейку зустр1чались 1-2 аномальна Проте, враховузчи ярисутн1сть клш1чних ознак хромосомно'!" хвороби в пац!ент1в, а таков.виявлення аномальних кл!тин, нами була проведена молекулярко-цитогенетична д!агностика. У ьсix випадках з гоносокним мозаГиизмоц проведений анал1з хромосом, як з. метафазних, так i в штерфазних кллтинах. П1сля чого в 1нд;:в 1дгв з п1дозров на трипло-Х в одному ви-падку Д1агноз пЦтЁердився (10% аномальних клтш), а в ip.ioMy. - bcí кл1тини виявились нормальними.

а

При обстеженн! naqieuTiB з-синдромом Тернера i синдромом Клайнфел- тера д1агнози, встановлен1 цитогснетичними метода-■ми, п1дтвердвен1.

Таким чином, з допологое ДНК'д1агностики вдалось подтвердит 11 (91,'62) припуцених д1агноз!в з 12, направлеких на молекулярно-цитогенетичну д1агностику " п!дозров на гоносом-

нал мозагцизм.

3 4 вг;пад:-пв анеуплоЦП аутоссм в 'дно;:у папа^:'' прозе-дзна рад1са:гп!1!на г1бридпзац!я in situ, в трьох - FISH пбрпдизаща. 3 них: 3 - з хозаТксзсп oovvnn скпдрога Лгуна, 1 - з синдромом Едвардса. При Застасузаг;п1 :сроас :саоспз-цк01чного ДНК-зонду аль?а-Я1-22 зстанозлсш:3 д1гпгсз спчдро-ка Едвардса з йпег^лзнах i метэфззних кл^гчах, прачогу цо-загкова форма з аномальней клоноа 3G2. При внаорасташп ДНК-зонда, специфичного для хромосом 13 i 21, в метаТ'азннх ¡Штанах бив niдтвердаеннй у вс!х трьох вападках ггозаТковиЛ sapiaHT хвороб»; Даунз.

Комб1нцпчи цитогенетичний i нолекулярно-цитогенер'чнаГ. метод анализа аномалия хромосом, при зикористашп двох хро-уосомоспецифхчних ДНК-зондгв альфа-Н1-22, pYP.M 10-40, вста-новлений в. одному випадку кар1отип 46,ХХ/45,Х/47,ХХ,*1Я з сгпЕв1днозеннп» клон!в 50Z/40X/10Z, а при застосуванн! ДНК-зонда pPD13 п1дтвердзений Kapioran 40.XU/45.X , гричому з незначноп частно™ С122) нормального клона 46,ХЭ.

.Таким чаном, з допойогоз хромосомоспецаейчних ДНК-зонд1з уоана проводата есг:анзну д!агнос.тику складнах випадн!в хромосомного мозаГцизму, вазначап! ч.хслешп змйн: аноупло1д!"1 аутосок.

!!олеаулярно-цитогенетнчн1 метода анал1зу карIотипа лпдани i клонован1 фрагмент'.! ДНК ладана СхроносомоспецнМчгп ДНК-зонда) дозволязть б!льп точ;;о t ейектавно оизначати особл'авост1 хромосомного набору, Проте, застосувакнд иетода нерад1оактизноГ г1бриднзац11 In situ усгладнпе'ться тому, цо ДНК—с.зндл npv. pi3HOMaiiiTHiix уловах г1бридчзацП козуть »пти-та окрем! гомолог!чн1 хроаосони 1 окрен! групи хромосои,

Зм1нг:пчи умови троведення нерад1оэчтивно'1 гДбридкзацИ in.

"■ ' 7 " - 1С -

зНи вдалось встаноБнгн, що ДНК-зонди альфа-1?1-22, рУйК 10-40, рРВ18 спе.циф1чн1 для ценгроы1рких райошв хрокосок 18, X 1 У в1дповгдно при г1брндизац11 в специф!чних уцозах експершента Сг1бридкзац1я в суи!н1 2х55С, 50% форианЦ при 42 С 1 е1дмизка хрсиосокних препарапв у сук1с1 0,1х5БС, 50% ф.ориааЦ) дозволязть над1йно 1дентиф1кувати хромосоии 18, X Ч У в ¡йетафззнпх 1 1ктерфазних клпинах. Використовувчи ДНК-зонди альфа-И1-10 1 альфа-К1-6, специф!чн1 для цент-роихрних районхв хромосои 13 1 21, при г1бридиза"П в оп-тии1зованих ууовах експериыента не дозволявть 1дентиф1ку-вати ц1 хромосоыи р плерфазних ядрах з-за артефакт1в, пов'язаних з асоц1ац!яки ак^оцентри'чних хроиосок в 1нтерфаз-ноку ядрк

Длл оцшкк коеливост! використання иетода нерад1оактивно"1 ггбридкзацП з цетов окзнач^ння числа хроиосои 13, 18, 21, X 1 3 в нперфазних кл1тинах пооана<йзували 8 зразк1в пери-Фер1йно1 крсс! пац1е'нт1в з норцальннь: кар!отипоы.

В досл1дЕуваних ; зразках без патолог!!' визначали сп1вв1дноаенн5 частот ядер з р!зноман1тнии числое сигнал!в нераглоактивно'Г и1тки (табл. 5, 4).- Результат;; досл1дгень статевих хроиосоь; показали, цо: 1) б1.гъпе 90% ядер в кл1ти-нах з кар1откпо« 46,ХУ улетать один сигнал нерад1оактивно'1 иикк при викорп'ташл ДНК-зонда рУЙ'1 10-40 Г б!льце 95% ядер - и1стять один сигнал прн^викоркстанн! ДНК-зонда рРБ1€; 2) 61 лье о 90% ядер б кд1ткнах з "ар1отипоь: 46,XX. иавть два сигнала б1отин1льоЕанс\' к1ткн при викоркстанн! ДНК-зонда рУПП 10-40, а анал!з епночогс кер'отнпу з допоиогов ДНК-зонда рР0*8, специфичного для хромосоии У, проденонстрував б 1дсутп1сть снгналу в 98% пиерфазннх-ядер (кал. 2), Таюш чинрч, штерфазиий агая1з з внкориьтаншш ДНК-зонд1в рУАН

10-40, рРПЮ, специ<р1чних длз центрон1рннх район!в хромосом X 1 У з1дпоз!дно, дозволяе легко розр!зняти вшочий 1 чо-льз1чий кар1отип.

Результат» анализу аутосон, отриман! при досл^ненн! нор-мальних зразк1в з допомогоа Д!1Н-зг.нд1в альфа-1и-18, аль-фа-Ш-б, •эльфа-!?1-22, специф1чних для центром1рних район1в хромосом 13, 21 1 18 в1дпов1дно показали, цо: 1) при вико-ристаннх ДНК-зонда альфа-й!~22 з середньому 90% пбридизова-них ¿нтерфазних ядер дем^нструптъ два сигнала б1огин1льова-но"1 м1тки, . 1 не б1лызе 3% ядер дають три г1бридизац1йних сигнала; 2) пни використаши ДНК-зонд1в альфа-!Н-18 ! аль-фа-И1-Б най51льпа к1льк1сть' 1нтерфазних юптин ьпстили 4 сигнала нерадз'оактивно! мзтки, що склало в середньому для хромосом/ 13-52,2%; для хромосоми 21-48,4% (мал. 3). Роз-подзл ядер з трьома сигналами в нормальних зразках, дозволиз зробити висновск про те, цо при г 1бридмззц1Г ДНК-зонд аль-фа-Я1-22 точно Центиф1куе хромосоми 18 в ¡нтерфазному ядр1, а ДНК-зонди альфа-Р.1-18 1 алъфа-К5-Ь не дозволяпть точно визначати число хромосом 13 1 21 в нкерфазному ядрк

В процесг дослЦкення мсжливост1 використання хнтерфазно-го анал1за в медичн'й практиц! нами бул:-; проанал1зован! три зразки з аномальниы кар1отипом.'(46,ХХУ4?ДХ, + 18; 45,Х/4б,ХУ; 46,ХУ/4?,ХХи) 1 проведени'"' пср1вняльний анал13 частоти роз-под1лу нерад1оактивно1 а1тки в зразках з кормой 1 патолог1евз (мал. 4 (а, б, в)). Проведений статистичний анал1з розпод1ль сигнал!в нерад1оактивно! птки и штерфазних ядрах дозволяе зробити висновок про те, що аномальн! '1 нормальн! кар1атипи достов1рно мпяна розр1зннти.

Таким чином, ртриман1 дан1 -свЦчать про моалив1стъ провя-дення диагностики хромосомно! па-ологп', аналДзушчи не т!ль

- i2 -

i -.... ■

ки метафазш, алё i iHT"p®a3HÍ ядра п1сля нерад1оактивно1 ПбридизацП' з хромосомоспециф1чними ДНК-зондами pPftM 10—40. pPDi8 1.альфа-Л1-22. " •

МОЛЕКНЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧШ ПРЕНйТАЛЬШ Д0СЛ1ДШШЯ. Метод фдворосцентно! г!бридизаци нуклегнових кислот (FISH) був застосований пренатально в 17 випадках на - некультивованих ", KJiiTHHax ворсин xopio.na. lía культивованих кл!тинах л1мфо-uhtíb пуповинно! kpobí плоду нерад1оактивну г1бридизац1ю ви-корнстозували в двох випадках. В результат! мопекулярного дослЦження з використаннам ДНК-зонда pYfiM 10-40, встановле-ний кархотип 46,ХХ/45,Х, а при використашй ДНК-зонда аль-фа-RI-6 виявлйшй кар1отип 47,ХН,+21, що повн1ста подтвердило flocTOBipHiCTb "класичного" цитогенетичного досл!дяення, проведеного нами на зразках "пуповинно! кров i. В первому спостерекеннг з синдромом Шерешевського-Тернера було проведено. досл!дження як- мгтафазних, так i 'штерфазних кл1тин. Встановлено, що результата 1нтерфазного анал1за повн1стю сп1впадають з д!агнозпм, виявленик на метафазних пластинках

КрОЕÍ ПЛОДУ.

В дьох 1Н1их спостереяеннях з трисом1еЕ по хромосом! 21 (47,XX,+21; 4б,ХУ/47,ХУ,+21), виязле'шх в некультивованих ворсинах xopioHa, проведена' г!бридизац1я нуклеУнових кислот in situ, для гтклшчення або П1дтвердаення моза!'цизна. При засто'суванн! хромосомоспецпф1чного ДНК-зонча альфа-К1-8 на метафаз^'их кл!тинах були п!дтвердяен1 цитогенетичн! д!агно-зи: синдром Дауна в первому випадку i мозаГкова форма трисоыП L1 з аномальним клоном в 30"/ - в другому.

В 15 зразках з нормальним карготипои, встановленим в КВХ, молекулярно-цитогенетичне доел1д2ення поводили з метой вик-"вчрння локилки в пост вленн! д1агиоз!в i для визначення

над1йност1 пренатально! 1дентиф1кацП стат! плоду. При г!бридизецП'. у ccix зразках застосовув~лись ДНК-зонди. апь-фа-RI-S на метафазних пластинках i pYflH 10-40 або pPD!8, як на метафазних, так 1 на штерфазних пластинках. На осчов1 штерфазного анзл1зу хромосом п!сл>. флюоресцентно! Г1бридиг зацИ нукле!нових кг:лот були виявлен1 9 плод1в чолов1чо! 1 6 знючо! стать В одному випадку встановлена помилка в д1агностиц1 стат! питогенетичним методом. Викоркстання метода флноресцентно! г1бридизацИ демонструе сувору спе-циф1чн!сть хромосом X, У i п1дтверджуе повну над1йн!сть пренатально! 1дентиф1ка-и'! стап, як на стад!! нетафази,- так 1 в 1нтерфаз1.

Таким чином, метод флюоресцентно! гхбридизацИ нукле!но-вих кислит дозволяв зд!йснювати д1агностику уюмосомно! патолог!": (анеугитдн, мозаншзма) в пренатальний пер!од на стадп ябтафази. При зикористанн1 ДНК-зонд1в. специф'чнлх для uenipoMipHiix район1Е хромосом X, 9 - i в 1нтерфазному ядрк При обстененн! карготипу методом флиоресиентко! г 1бри-дизацп вдаеться зд1йснйти явидке визначення основних хро-мосомних хвороб на протяз1 2-3 дн1в nie..я отримання цитге-нетичних npenapaTis на зiдмiяу ьiд Г-9 днЛв при внкор'истакн! рад1оактивного методу, що с'уттево шдвищун: ефективн1с-ь д1агностики.

ВИСНОВКЧ

1) Проведено 412 цитогенетичних досл!дгенкя у ваг1тних та хворкх з шдозрзш на спадкову патолог1а. У 100 '(24,32) з них ви'яв..гн1 xpcuqcomhi аномалП", уточнения рких було !!зо5х!дним в 38 випадках мог^кулярно-цитогенеп. шиии методаик.

2) 0птим13ован' умози флноресцентно! пбридизащ! in sifu

ДНК-зонд1в для центро^прних paftcmiB хромосом 18, X i У. як! дозволяеть над1йно 1дентиф1кувати ц1 хромосоми в 1нтспфазних юптинах при проведен^ пост- i пренатальис! дхагностики.

3) ficouiauil акроцентричних хромосом, наявн1сть накладень в 1ктерфазних'кл1тинах ■ i Феномен гетероморф1зма гомолигпчних хромосом по зм1сту центром1рних посл!довностей ДНК приводить до зменшення числа 1нфармативних ядер, що не дозволяе застосовуватя ДНК-зонди, специф1чн1 для хромосом 13 i 21 при 1нтерфазному анал!з! в постнатальн1й 1 пренатальнхй'д!аг-ностиц!.

4) Флюоресцентна пбридизац1я in situ з зикористанням Д!1К-зо.чд1в, загальних для хромосом 13 i 21, дозволяе ефек-тивно 1зентиф1кусати ц! хромосоми пльки в метафазних oiтинах. -

5) Практичне застосув^ння хрохосомоспецифхчних ДНК-зонд!в, якл маркуыт.ь центром1р!П райони'хромосом 13, 18, 21, X i Ь', дозволяв зд1йснавати комплексну молепулярно-цктогене-тичну д!агностику основних хромосомних аномал!й у лвдини, пов'дзаннх з чксленними порушеннями статевих хромосом i ау-тосом (синдром Клайнфельтера, синдром £ереиевського-Тернера, синдром трипло-Х, синдром ¿двардса, синдрон Дауна)'.

Нал - 1- вага xporrc-amurs: лпотт-тл^и з постпата/.Ь!пн

Д1_ЛГНС!СТ11и1 :

Jj - гертта^род^ггпая" i, - аис?|гпре?п;

iby - С5ТПДРГ!—il Терпрра i 11л .ишлолътсра î ю - îîrtnp i ( aGo ) fAV

Teú^as i

Результат а-шхза xpcroco::--.';: о::::-'ал1Г: d ц ;тсггьет;г4л1п постнзталз-niíi siarHOCTi'Tji

В с ь о г о I

X р о о с о а и i а н о и а л i ï

сбстегегек

гутссс:.1

44 (12,27.)

rcitccctf • '

7(1,9%) ¡40 (И.Ш

ГОЗс.КСЩ

струг:турн!

4 (1,1%)

и СС1 *"

1 (0.3%)

- ÍG

Таблицг 2

■Результата иолекударио-цнтогекехлчнси постттально! • диагностики

ЧИСЛО СП— пад- KÍB Цнтогенетична ! постнзтальна д1агностш;а 1'зтод, s Епкорясто рад1оак. киП вували FISH- ¿■олекулярно- цитогенетичка д1агностика

1. 45ДХ/45Д ' + визкачення числа аяоналышх кл1тин 9Û2/1Û2

2. 45ДХ/45Д + - £Г2/132

3. 46ДХ/45Д + - 902/102

4. 46 ДХ/45Д . - + 842/162

5. 46 ДХ/47 ДХХ -i - 902/102

б. 4S ДХ/47 ДХХ . - + 46 ДХ

7. 46ДУ/47ДХУ + - 882/122 '

.8. 46ДЗ/47ДХУ • + •- 902/102

9. 45.ХЬ747,Ш - + 872/132

10. 46Д9/47ДХУ - 802/202

11. 4ß ДУ/47 ДХУ + - 852/152

12. ■io ДЧ/4? ДХУ + - - 422/1р2

13. 46 ДХ/45 Д/47 ДХ, + 18 - + 502/402/102

14. 46 ДЙ/45 Д. - т 122/882

15. 46 ДХ/47 ДХ. + 18 . - ' + 702/302

16. 46 ДХ/47 ДХ,+21 0 + - 602/402

17. 46ДУ /47ДУ,+21 - 252/752

18.- 46 ДХ/47 ДХ,+21 - + 802/202

19." 47 ДХ,+наг •• ! - der 21.

Тз^лш+л 3

Сп1зв1д.чо:?ення частот ядер с р!зет» числом снгнашв нер^оакттаюТ м1тки п^и використакт ДКК-зснца рУАМ 10-40

N Числа сигвипв нерзд1оактгена1 «1т! 31

дос- Кар1отип!

Л1да 0 1 ! 3 4

1. 45,XX ! • 1 3(0,0%) ; 1 30(6,4% ; 438[91,2%) 4(0,8%) 1%)

2. 46, XX : 7(0,7%) : 51(5.3%) ! 865(30,2%) 17(1,8%) 19(2,0%)

3. 40,XX : 4(0,7%) : 43(7,3%) : 532(90.8%) 5(0,97.) 2(0,3%)

4. 4?,XX ! 12(1,с%): 57(4,7%) I 1121(92,8%) 10(0,8%) со сэ -о

5. 46,ХУ : 8(1.5%) : 491(96,7%) : 9(1,8%) - -

6. 46,ХУ : 5(0,7%) : 340(37,2%) ! 18(2,1%) -

?. 46,ХУ ; 3(0.3%) ; 1025(97,6%о: 16(1,5%) - -

8. - 46,ХУ : 8(0.9%) ; 1 307(97,5%) ! 15(1,6%) - -

Таблиия 4

Ствв1дношення частот ядер з р1зикм числом скпшив нерад1оакт1Шко1 мпга при використанн! Дй-зоеда рРВ18

! N 1дос- !л!да Нар1откп Число сигнал1В нерад1оактигно"1 м!тки

0 - 1 1 2

! 1. 46,XX 423(38,3%) : 5(1,2%) 2(0,5%)

: 2. 46, XX 862(98,6%) ' ! 7(0,8%) 5(0.6%)

: з. 46, XX 1237(99,0%) : 9(0,7%) 4(0,3%)

; 4. 46,XX 66498,4%) ; ?(1,о%) 4(0,6%)

: 5. 46.ХУ 4(3,2%) : 326(95,9%) 3(0,9%)

: 6. 46, ХУ 16(2,8%) : 553(96,2%) 6(1,0%)

: ?. 46,ХУ • 15(2,8%) ■ : 516(96,3%) 5(0,9%)

! 8. 46,ХУ • 16(2,3%) : 690(97,0%) 5(0,7%)

Мал- Результата флуоресцентноï гiбридкзацiï о зразкат з

1ЮГГ!3.1ънии кар1отип"и при BKKDpucTaiiHi ДНК-зопд1в pYAM 10-40 i pPD18, сяЕЦИф1чвв1 до центрояiрнвт районiв хроиосоя X i У

niдловiдно: ' _

K^Vi - л.тл хройосопи К; ~ Для хроиосояи У

t_> число сигиатй hepafliоактий. штум

Кал- 3- Результат« Флюоресцентно'! тмбрмдиоац i V при да г-л i д-xeimi' opaCKÍB з иорвальнин карiатипеп з дпппнаго» ЯКК-зонд1в аль<га-т-18! алъфа-Ш-22, аль*а-Ш-6, cneustÇiiHirx до чентро-иjpBHx paftonin хропосск 13> 18» 21 BivöioBiдно!

- дin хроносоют 13; __Wt - для ipotTOCo™ Î8Î

'.i - для хроиосони 21

ж)

tí)

К®

>.\\\\V'\\V ■ЗЧЩ

\ч" v"'

л\\у

I i г

чис/»0 сигнал! в hpfvftju сзктмв. Ml ТКИ

i

число одктну, ml тки

L

■

1 -"'"S

pr-3 Г- rï

чыспр сягна/пв НУРЛД i (УГ ив. миги

Пал. 4- Розпод1л сигналi нерад! оактивно!" иiтки п зразках з нориальнип i акоттальнин клр ] птиппя -

а) резч.1"Т£. гм ^tSH ri 6ридкзац1 »• в "разках з KapionmoK 46*ХЧ i 6,КЧ/47,ХХУ ( сгтi DBÍ лиошэняя клан1и ВО'Л/20*<) при використавнЧ ДНК-ооидл pYAtt 1С-.40, cnfuVTí i''llovó для u*?irrF —«ipKoro -рзгпнз тряпсспии м: - при норм i ; - при na-rojjortv;

S) peo'j/.-.татм FISH тт^ридизац! V в .эргтэтсат з KapiDTHiiOM i 45,3{/4»>,"4 i гп1РВ1дис1пегтя k«ohí в ВВ'/,/12У,) лри птсорчгтан-III ЯНК--.о>;.1?. рРП18. rnn^iifiчного -ля цснтротpworo xponocomi 'j: -- прч норн i ï - при патолог i ï ;

в) Р531льтчти FISIi i-.Срилиаэи! ■ в spamci.^ 3 карjотппся 46»ÎC: î 4':-,:г:;/47т>С?| < IB I птоНдношення клон in УОК/ЗОУ,) при викогигз-Taimi '>ьк-г»о»!ла альфл-Ш-22, спеди<мчиот-о для д|лчтсл црнтро-nipHoro района хрояоеонк 10'

R^ - при ног"! î ЙЙ - " патоло: i .

. -120 -

СПИСОК РОБ IT, 0ПУБЛ1К0ВЙНИХ ПО TEMI ДНСЕРТАЦИ

С.Г. Ворсанова. В.Б. Вров, Й.В. Христич. Г.Л. Дорсшн, О.Я. Гречан1на, В.И. Бусиг1на. Ыолекулярно-цитоген8тичн1 ме-тоди в пренаталыпй д1агностиц1 хроиосоиних .аномал1й. // Ультразвукова перинатальна д!агностика. 1993, т. 1, N2-3, с.

■ 13-15.

0.2. Гречанша, Е.'й. Пессяна, Е.Н. Бабаднанян, Й.В.. Бон-даренко. Хромосемн1 синдроми в систем! аутосом, проблеми ди-фбрешийного диагнозу. // Цитология i генетика. 1993, т. 27. N4, с. 51-65.

ft.В. Христич. Нерад-"оактивна г1бридизац1я нуклешових кислот in Situ в пренатальн1й д1агности1д хромосомних хвороб. // Ультразвукова перинатальна д1агностика. 1994. N4-5, с. 58-61. " ■ - *

О.Я. Гречан1на, О.Я. Яковенко," О.П. Здибська, ft.В. Христич. Визчення цддход1в до антенатально! д1агностики ге-нетично обумовлених- форм синдрома затримки внутр!шньоутройного розвитку плоду. //". Натергали I з'Тзду PociftcKoT асоцхацП л!кар1в УЗД д!агностики в перинаталогп i г1неко-логП. 1992, с. 16-17.

Yurov Yu.B.,- Uorsanoua S.G., krechanina E.Ya., Xhristich Я. У., Soloviov I.U., Malet P., Doronln E.L. P.oizes Б. The use of centroaerio, telomeric and region-specific DHfi probe for prenatal diagnosis of chonosoial aneuploidies. // IIU international conferens on early Drenatal diagnosis. 1994. May 22-27, Israil, Derusalin, p. 142.

- 21 -

Христич й. В. !!олекулярно-цитогенеткческие исследования хромосомных аномалий в псстнатальной и пренатальной,диагностике при медико-генетическом консультировании. ' Диссертация на соискание ученой стспени кандидата биологических наук. Специальность 03.00.15.'- генетика, Украинский институт усо-" верзенствования врачей, Харьков, 1Э94.

В данной работе представлены результат!! практического применения метода нерадиоактивной гибридизации in situ в псстнатальной и пренатальмй диагностике при медико-генетическом консультировании. Показано, что метод флуоресцентной гибридизации нуклеиногих кислот позволяет осуществлять диагностику хромосомной гзтологии (анеипмоидий, мозаицизма) как в постнатальный, так и в пренатальный период.

Khristlch й.' 'J. Molecular-cytogenetics investigations of chroiosoie'abnornialities for postnatal and prenatal diagnosis in nedical-genetic consultation. Dissertation on conpe-tition of acadeuic degree of candidate of biological sciences. Speciality 03.00.15"- genetic, Ukrainian fldvansed Training Institute for Doctors, Kharkov, 1994.

The results of the practical application of non-radioactive hybridization in situ for'postnatal and prenatal diagnosis in nedical-genetic consultation were represented at this uor!:'. It has been shcmeii, that the nethod of fluorescent .hubridisation of nuclei acids allows to diagnosticate the chrososoral pathology in postnatal and prenatal period.

Клгногп ' c/.jca: колекулярио-цптогенетичн! дос досиня, анеуплош ï, xopio'-ент.ез, кордоцентез, г1бридпззцИ нукле)-нопих кислот in situ, xpoiîocoHHi анокалП", моза'щизн.