Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромомеров политенных хромосом DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромомеров политенных хромосом DROSOPHILA MELANOGASTER"

vb ob yfacx

ССИИСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт патологии и генетики

На прав'х рукописи УДК 575.1:595.773.4

КОКОСА ЕЛЕНА ЮРИОСВНА

ЮЛ^ЛЯГШ-ЦИГ0геНЕПР5Ш{АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОШЕРС9 ПОЛШЕШХ ШЖХХИ . DROSOPHILA MELANOGASTEE

ГеШТШШ - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ дахсертавдк на соискание учшэй степени кандидата бяалогичэскжс иаук

НовосиСирск - 1994

РгЗога шпсшсш в Ивзгсггуге цтгологии и гевзтакн СО РАИ, г.Новосибирск

Научный руководитель - доктор Сиататачосккг щук И.Ф.йшулев Иастигут цитологии в генетики СО РАН, г. Новосибирск

сияциалькыа отасаенга - доктор биологических наук Л.А.Васильева, Иастигут цитологии я генетжи 00 РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук В.Н.Стегний НИИ биологии и биофизики Тшокого государственного университета, г.Т&мгк

Ведущая организация - Институт биоиопш развитая

иц. Н.К.Нольцова, РАН, г.Кооква

Зьщита состоится января 199^~Гна ¡п ¡К

заседания спеа-шлЕзировзижго совета по эаацгге жюсерга-даа га соасланае ученой степени доктора юук (Д-002.11.01) в Ивзтшуге 1$пздогия и генетики СО РАН в ковдеренц-оаге йстатута то адресу: 6300Э0, г.йоЕосибирск-эо, проспект академика ЛгЕреятьсва.ю.

С диссертацией шею ознакомиться в библиотеке И; ¡статута цитологии и генетики СО РАЯ

Автореферат разослан < " г*- у-"РЪВ94г.

Ученый секретарь . специализированного совета доктор биологических наук А.Д.Груздев

Актуальность проблемы Политенные хромосомы двукрылых с середина 30-х годов заслужен» рассматриваются в качестве наклучпея модели интерфазнах хромосом. Одной из характерных чэрт полятешах хромосоц является специЗичэский хромэмеркьй рисунок, складывающийся из поперечных полос - более темные из них содэраат плот» упакованный материал ДНК (диски), а болте светлые полосы (иендиски) состоят из декомпактиэованного хроматина. Начиная с работ Н.Н,Кольцова (1934), не утихают дискуссии о генетическом со дергании дисков и шадисков.

В лаборатории молекулярной цитогенетики методом генетического насыщения изучены два хромомера х-хроиосош ю. ш^аповавЪег, 2ВЗ-4 и ЮА1-2. В диске 10А1-2 обнаружено з гена и две "молчащие " зоны ДНК, составляющие около 70Х рекомбинационной длины диска. В "молчал?«" зонах могут бить либо гены, не выявляема» с помощью мутагенеза, либо повторы. Наличие значительного числа транскрибиругсчкхся фрагментов ДНК в молчащих зонах было недавно показано (Козлова, 1994). Однако, и с их учетом плотность распределения генов в диске нэдостаточнэ велика, что может подразумевать наличие в диске повторов.

Гигантский ген Вгоас1-Совр1ех (Вгс или еса), имеюсяй протяженность примерно 120 т.п.н. и сложную систему транскрипции одиннадцати экзоюв, занимает только часть хроиомэра 2ВЗ-5, что также подразумевает наличие в этом хромомере фрагментов ДНИ с какими-то другими Функциями. Кроме того, пуф 2В является морфологически сложной структурой го-за многочисленных эктопических контактов, ' что подразумевает наличие в этом районе ингеркалярного гетерохроматина и, возможно, повторов.

Представляет существенный интерес изучение консервативности организации генов в районе 2в и ЮА близких и эволгцношо разошедшихся видов. Получение таких данных могло бы свидетельствовать о сцэгиенности функционирования генов, расположенных в хромомере 2ВЗ-5 и в диске ЮА1-2.

Цель и задачи исследования. Для дальнейшего углубления представлений о структурно-функциональной организации хромомеров политенных хромосом представляется существенным: 1. Проанализировать содержание уникальных и повторенных последовательностей ДНК в составе индивидуальных хромомеров, нетранскрибируемых (район диска ЮА1-2) и транскрибируемых (пуф 2ВЗ-5) в сланных железах, выявить особенности их

распределения в пределах хрошаеров; 2. Установить, является ли хроишер зволэдиошю-ковоереативяой структурой, т.е. соответствует ли по кфораыциошюму содэрваншо отделы®® хромомеры D. melanogaster хроюерам близких и отдаленных видав дрозофил.

Научная новизна. В работе получэны новые данные о взаимной

расположении генов и повторов в хромомэрах гВз-5 и ioai-2. Существенным является нахгждаше в диске 10а1-2 товлоров, специфических для половой хроиосош. Эти повторы имерг несколько сайтов в хроюыере ЮА1-2 и в роде других районов х-хроихош. Наедены различия в характере распределения поли д (А-Ц) -гоыопоиаарвдх повторов в хршэиерах 2ВЗ-5 и 10A1-Z. Установлено, что гены Broad-Complex, dor и swi, расположенные в 160 т.п.н. в рагонэ 2ВЗ-5, формирусщэм луФ, у восьми отдаленных видав дрозофил такие расположены в области крупного Пуфа. Шследователыюсть КРУПНОГО ДКСКа 1СА1-2 D. nelanogaser у отдалешх видов дрозофил расположена в двух различных хромошрах, что позволяет считать, что гены, вхедяздаа в состав диска 10а1-2, югут Функционировать иззазисимо друг от друга.

Теоретическая и практическая ценность. Полученные в работе результата способствуют дальвзйшеуу развитию представлений о структурно-Функцишальнэй организащм политеинах хрогюсон. У восьми видов дрозойш локализованы последрвателыюсти кластера из трех генов, вовлеченных в экдязон-регулируемую активацию генов, что позволяет начать исследование гормональной регуляции генетической активности у этих видов. Данные, получение о повторах, специфкчэских для X-хроиосоыы, югут служить основой для изучения дозовой компедаации генов половых хромосом у насекошх.

Апробация работа. Материалы диссертации были представлены на 5-и и 6-м Всесоюзных симпозиумах "Молекулярные механизмы клеточных процессов" (1983, 1987, Москва), на 8-ы Всесоюзном симпозиуме "Структура и Функции клеточного ядра" (1984, Пущино), на 5-м Съезде ВСГиС (1987, Москва), на 6-й Критской Конференции ЕИБО по молекулярной генетике и биологии развития дрозофилы (1988, Нрит, Греция) и на 5-м и 6-м Всессозных совещаниях по генетике дрозофилы (1987, Львов; 1989, Одесса).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в семи

Структура и объем работы. Диссертация состоит ю введения, обзора литературы, списания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Обадай объем работы 190 страниц, 5 таблиц и 26 рисунков.

матичеаш и методы

Линии дроэофял. При анализе уникальных и повторенных последовательностей ДНК в клонированных районах использовали стандарпыэ линии D. melanogaster: Батуми-Л, Canton-S, Oregon-R, Novosibirsk, а также uman ( Университет Глазго, Великобритания ), дикую линию d. sinulans (Неибридаский университет, Великобритания); дня анализа консервативности дисков гехтггекивс эфомосон использовали лиши D.melanogaster, Еэделенные М.Д.ГолуЗовекш нз разных популяция СССР (Нокоэа и др., 1990), также ЛИНИИ: группы ВИДОВ melanogaster - D. teissieri, D. yakuba, D. siaulans, D. erecta, ü. mauritiana, D. orena, D. sechellia (предоставлены проф. М.Аабурнером и Ф.Лемгнье), группы ВИДОВ obscura - D. guanche, D. pseudoobecura, группы ВИДОВ funebris -D.funebris, группы ВИДОВ repleta - D. repleta, D. hydei, D.nercatorua, D. paranaensis, группы ВИДОВ virilis - D. virilis, D. novaoexicana, D. littoralis, D. americana americana, D. americana texatm, D. kanekoi (предоставлены проф. Л.и.Корочкиныи и Х.Л. ненвуа).

Югаы геношюй ДНК из района пу$а 2В (Protopopov et al., 1991); ИЗ района 9F12 - 10А7 (Koalova et al., 1994); КЛОН PvEl, СОДергащиЯ часть гена vermilion (Walker et al., 1986), И КЛОН CED3.1, ЯВЛЯОДИЙСЯ КДННОЕОЯ последователыюотьо гена Eevenleas (Bunerjee et al., 1987)

Мэяекулщяяэ ютодн выделения Фаговой ДНК кленов, радиоактивного иечения ДНК, рестрикции, переноса та Фильтры и Сауэерн-блэт гибридизации выполняли в основной по руководству т.Машатиса (Maniatis et al., 1982).

При использовании в качестве зонда ж-юных 32Р поли д(А-Ц) (Pharmacia, Sweden) Саузерн-гибридюацк» ПРОВОДИЛИ В УСЛОВИЯХ потаенной строгости: температуру инкубации снижали до 50" С, а отиывку проводили при 37ПС, поскольку . те5йтэратуры плавления этих последовательностей понижена по сравнен1,ж с суммарной ДНК и щи стандартных условиях гибридизации шгкаких сигналов гибридизации обнаружить не удавалось. Саузерн-гибридиэацию в этих экспериментах выполняли либо с озвученной ДНК цыплят шш тимуса теленка (ЮОнкг/ил),

либо без носителя ДНК, что приводило лишь к некоторому усилению сигналов; неспецифической гибридизации в последнем случае не возникало.

In situ гибридизация с 3Н-меченыыи зондами, включая приготовление препаратов слюнных желез, выполняли по стандартным методикам (Gall, Pardue, 1969; Atherton, Gall, 1972). В случае гетерологичной гибридизации зондов D. melanogaster на хромосомы других видов дрозофил процедуру проводили в условиях пониженной строгости: температуру инкубации снижали до 50°С, время увеличивали до 16 часов. Отмывку также проводили при пониженной температуре (37°С). Время экспозиции 60 - 100 дней.

In situ гибридизацию биотинилированной ДНК клонов и пероксвдазное окрашивание препаратов после гибридизации выполняли согласно методикам руководства М.Ашбурнера (Ashburner, 1989). Гибридизацию на политенные xpOUOCOUH ЛИНИЙ D. melanogaster ДИКОГО ПЛЭ И D.simulaos ПРОВОДИЛИ В

строгих условиях специфичности: 4xSSC, 50% формами®, 46°С, 16 часов, с конечной отмывкой в o,2xssC при 53°С. В случае гибридизации зондов D. melanogaster на хромосомы других видов дрозофил процедуру проводили в условиях пониженной строгости: температуру инкубации снижали до 37°С. Отмывку также проводили при пониженной температуре: в 4 ssc, 37°С 2 раза по 5 мин, в 2xssc, 46°С, 3 раза по 20 мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ Я СБОВДЖЕ Выявление уникальных в повторенных последовательностей ДНК С помощью метода гибридизации in situ было установлено, что в клонированных районах далеко не все последовательности являются уникальными. Не менее 180 из 300 кб, составляющих последовательность ДНК района 9F12 - ЮА1-2, не содержат диспергированных повторов . Это районы тонких дисков, здесь расположены кодирующие последовательности ■ генов fliG, fs(i)BP2, slm и как минимум пяти существенных генов. Уникальные последовательности ДНК составляют часть левой и правое "молчащей зоны" диска ЮА1-2 (Рис. 1). В этих районах недавно было найдено около 20 транскрипционно-активных Фрагментов ДНК (Козлова, 1994). В двух клонах присутствуют последовательности, характерные для хромоценгра. Большую часть "правой молчащей зоны" представляют клоны, имеющие в своем составе диспергированные повторы, их положение консервативно у проанализированных линий дикого типа d. melanogaster

И D. simulans.

Интересный является обнаружение двух вариантов повторяющихся элементов К1 и К2, локализованных только в Х-зфююсоие (Табл. 1 и 2). Этот повтор консервативен в незначительной степени, т.к. в геноме d. simulans этот повтор имеет такое же распределение в Х-хромосомз, как и у D.melanogaster, хотя сигналы иечекия слабее, а в генэмах отдаленных видов дрозофил этот повтор отсутствует. Элемент К1 на протяжении 300 т.п.н. клонировашэго участка имеет 5 сайтов локализации, а К2 элемент - как минимум г (РисЛ, 2), причем оба эти повтора расположены в основной в непосредственной близости от генов и транзкрипционно-активдах Фрагментов ДНК (Риг. 1). Кояно думать, что отсутствие иездинейиэго полиморфизма в локализации ка хроюсоиах этих X-специфических повторов свидетельствует в пользу такой структурсю-Функционалыюй роли этого элемента, где ваяно его определенное положение относительно конкретной генетической информации. Тэт факт, что в x-xpouoccue нами обнаружено два варианта диспергированных, но не мобильных повторов, отражает какую-то специфику в кх Функциях -

2. i I 5 з;

о 3» г 5 i íE|íl

d —

васО

u

Мб 1 г га Ы

.1 [Г

lv?» $4f29 fJCcB P1 Lt U

и н® i?i € m *

- ^ ■■

10AÍ-2

T—

—Г"

ги

loo

—Г

i»

Рис. 1. Схема района 9Р12 - 10А1-2: а - гены; б - тражкрилта; в

- клоны к-ДНК; г- Фрагменты, содержащие АЦ- повторы; д - повторы: К1 (белые квадраты), Н2 (чергое квадраты), диспергированные повторы (круги) и повторы, характерные для прицентромерных районов и хромоценгра (звездочки); е - точки разрыва хромосомных перестроек; и

- дисковый рисунок хромосомы; з - физический маспгтаб района (т.п.о.); и - точки разрыва "эволюционных перестроек"

Таблица 1. Сайты Kl-твтора

Клои Линия Райош качания

1АВ IE 5A 5C 7C 7D 7E 7F 8A 8B 8С9-10 8F 9А 9С 9DE

3.18 8 CS 4 - - + - - + + - + + + - + +

Urn - - - - - - + + + + - - - - +

aim - - + - - - + - - + + - + - +

К172 CS + + + + - - + - + + + + + + +

ОЕ + - + + + + + + + + - - + + +

* Nov + - + + - + + - + + + + + + +

Ua - - - - - - + - + + - - - - -

К175 Urn + + + + - - - + +

Т233 CS + - + - - - + - + + - - + -

OS + - + + - - + - - + - - + - -

Nov + - - - - - + + + + + + + + -

Um + + + + - - - - -

sin - - - - - + - - + - - + - -

ЗВ CS - - + + - - + - + + + + + + +

Um - - - - - - + - + + - - - - +

Н325 CS

OR - - - - - - + - + + + - + - -

Nov + - + + + + + + + + + + + + +

SID - + - - - - - + + + - - - - -

К321 CS - - + . - - - + - - + + + + +

Nov + - - - - - + - + + + + - - +

5F CS + - + л - - + - + + + + + + +

* - юшориыа сайга: 8С1-2, 8Е, 9В, НЕ, 12D, 18А, 18С, 18D

воэнэанэ, что они способны связывать 2 разных сигнальных Фактора. Нзжно предполовить участие этих повторов в процессе доэовой коипензации (chatterjee, 1985), перкгаюго установления пола при дифференциации (Chandra, 1985), СпгрЫатОГОВОЭе (Lindsley, Tokuyasu, 1980), поскольку во всех упомянутых процессах Х-хроизсома имеет специфическую роль.

В целом, по результатам гибридизации in situ клонкросашия район 9F12 - 10А7 предетаааязт собой чередование повторенных (мало- и средне-копийных) и уникальных (Рис. 1) последовательностей ДНК. Значительное количэство различных диспергированных повторов, найденных в молчадей зона диска ioAi-2, ыовет объяснить геиетичзскую инертгность этого района при нутационном насыщении, как это предполагалось ранее (Zhieulev et al., 1987).

В районе пуфа 2в присутствуют последовательности двух, а возможно и трех шзбипъиих элементов. Диспергированных повторов со стабильным половением в геноме обнаружено не было.

б

Таблица 1. Сайты К1-позтора (продолззэнге)

Клон Линия Районы дачкам

9Р12 10В НА 11С т 12А 12В 12Е 12Р 13А 13В 14В

3.18 8 СЗ + - + - + - - + - -

ит + - + - + - - + - -

в1т + - + - + + - - - -

К172 СЭ + + + + + + + + + + + -

Ой + + + + + + + - + + + +

ЫОУ + + + + + + + + + -

ит + - - - - - - - - -

К175 ио + - + + + + + - + + - -

Т233 СЭ - - + - +■ - - + + - +

Ой + - + - - - - + - -

N0» + + + - -

ит +

вхт

ЗВ СЭ + - + - + +■ + - + + - -

ит +

М325 сэ +

Ой - + - + - - 4- - - -

Коу + + - + + + + + - - +

г1т + - - - - + + - - -

К321 СЗ + - + + + - + + - -

КОТ + - + + - - - t + - -

5Р СЭ - + + + + - - + — -

Таблица 2. „Сайты Кг-псзтсра

Клоя Линия Районы меченая

1В 4А 40 7С 7Б1 -2 7Ш4- 18 7Е 8В 9А 9С 90 9Е 10А1-2

К186 СБ + - - - - - - - - - + +

ОН + - - - - - - - - + +

ИОУ + - - - - - - - - - + +

ит + - - - - - - - - - + +

З1!а - - - - - - - - - - + +

К192 С5 + + + - - - - - - - + +

оп + - - - - - - - - - + +

М193 *СБ + - - - - - - - - - + +

+ - - - - - - - - - +

К191 СЭ + + + - - - + + + + + +

Ой + - - + + + - - - + +

НОУ + + - - - - - - - - + +

ит + + + - - - - - - - - +

81П1 + - - - - - + - - - + +

* сильно метится хромоцентр, .основания плеч: 40АВ, 80Е1С, 4-я хромосома (41АР не еидно).

** Сильно метится 1Е, хроиоценгр, основания плеч: гоАр, 40АВ, 41АБ, 80ВС, 81Р, 4-я хромосома.

□ааоаапоро

_ ° о . 9> • ■' о у о

■■Т» тС»

ьб

То"

ооо оооооооооооооо □□□оаооаоооаосюас » .От.» . от. 09 гО» у «.»

-2/П

ТОО

■ЭЕЗб

М5СЭ- К17Э-

К178-

Э—Р16. Р?2

О »» » »« — о . , „ р

™ 1^0 130 140 150

---уЭ М62--

_____ Ы193--¿уз_

л!о

аооооооооооао *>о 1т «г ™ «• •

160

оооооооооооооооооооооооооооооо»»«оо

О Т.

^¿0 2&0 -М 2Ш<1

180

—уго

-•Орт

ооооаооаооооосюоо

у _Г 9 у

ОООООО

О»-*?_О

□ □□□ гг т

зЬо

2

От

100

Рис. 2. Расположение диспергированных повтордащися последовательностей ДНК и поли д(А-Ц)-повторов в районе 9Р12 -ЮА7. Над Физической картой светлые прямоугольники - К1-вариант х-спещйичэского повтора; заштрихованные прямоугольники - К2-вариант повтора; пунктирная линия - последовательности ДНК, имеющие гомологию с другими районами генома; точки - последовательности ДНК, гибридиэующиеся с хромоцетром и основаниями плеч. Над клонированыии Фрагментами - локализация простых АЦ-повторов с указанием интеноивности сигнала на фильтрах Саузерн-гибридизации: жирная линия -сильный сигнал; тонкая линия - умеренный сигнал; пунктир - слабый сигнал.

Распределен®} «ростах годогалшсцршх АЦ-псвторсз

Районы ДгП<, состоящие из мотивов проотюс гомопошакрккх последовательностей, состоящих го мономеров, дкмеров, тримерсв и т.д., известна для геномов большинства орг-гэдизиэв. Такие повторяющиеся после довательихгш ДНК регулярного состава интересны тем, что встречаются в 5-10 раз чадр, чем эквивалентные по размеру случайные мотивы в кодирующих и иекодируадих участках ДНК (Teuti et al., 1986). Благодаря способности формировать нетривиальные вторичные структуры (Nordhein, Rich, 1983), они могут участвовать в регуляции генетической экспрессии и функционировании гедана (Pardue et al., 1987), изменять структуру хроматина (Коо et al., 1986), быть горячими точками генетической рекомбинации и перестроек (siightom et al., 1980; Bullock et al.; 1986). В геноме дрозофилы обнаруживается до 2000 копий поли д(А-Ц) повтора (далее АЦ-псвтор) со средним размером стало 50 оснований. Есть сведения, что блоки этого повтора встречаются вблизи некоторых генов дрозофил, в промоторных районах (Gilnour et al., 1889) И В интронах (Newfeld et al., 1991), ЧТО ОНИ усиливают транскрипционную активность генов, считываемых РНН-полимеразой 11 (Hamada, 1984). Удвоенное количество АЦ-повторов в эухроматинэ X-хромосоиы дрозофил по сравнению с аутосомами, воз мол», является составной частью механизма дозоюй компежацни (Huijser et al., 1987). Анализ локализации АЦ-повторов в пределах клонированных районов генома, имещих детальную молекулярво-цитогенетическу» характеристику, дополнит наше понимание структурно-Функциональной роли этих повторов в организации хромосом.

Положение Фрагментов, содержащих АЦ-последовательностей, на молекулярной карте районов 9F12 - 10А7 (Рис. 1, 2) и 2В (Рис. з) было установлено по результатам Саузерн-гибрвдизации. Очевидно, что разная интенсивность сигналов, полученная в этих экспериментах, отражает относительное количество АЦ-повторов в конкретном месте и степень их однородности. 3 районе 9F12 - 10А7 на протяжении зоо т.п.о. выявлено около 15 Фрагментов, содержащих АЦ-првторы, т.е. в среднем, один блок на 20 т.п.и., а в пределах диска 10А1-2 - один блок на 15 т.п.н. Возможно,что фрагменты поли д(А-Ц), способные образовывать неканонические комплексы нити ДНК , а также при достаточной длине повтора препятствовать нормальному Формированию нуклеосом (Prunell,

1982), мэг/г пороздать откратыз потенциалыю активные участки в зфокатине. В полетенных xpoiescouax такой структурой обладают ыездиски и района пуфировашя. По нашим даниш районы мзвдасков 9F10-11/SF12 и 10А1-2/10АЗ совпадают с сайгаки локализации АЦ-повтора, тогда как района меадзюков 9F12/9F13, 10АЗ/10А4-5 и ЮА7/ЮА8 - но совпадают. То есть АЦ-noBTüfii нэ являются обязательным компонентом шадисков в этом районз. Необходимо отметить заметную корреляцию в расположении отрезков этих повторов и транскршционно-активных единиц (Рис. 1), хотя, напрямэр, в клокэ К172, несущэм две транскриСирукзиеся последовательности - гена v и фрапанта sE - шт АЦ-повторов.

В районе пуфа 2в АЦ-последовательшсти представлены более обильно (Рис. з), причем положение сильных сигналов их гибридизации в значительном числе случаев совпадает с положением экзонов гена Вг-с (DlBello et al., 1991). Для сравгекия распределения АЦ-повторов в двух анализируемых районах, района пуфа 2В и района 9F12 - 10А7, представленного в личиночных слюнных железах семью дисками, мошю привести весьма грубые количественные оценки: менее половины длины клонированной последовательности из района 2в свободны от трактов АЦ-повторов, в зова локализации гена Ег-С свободно около одной четвери последовательностей , в то время как для района 9F12 - 10А7 эта величина превышает две трети. Таким образом, в актизно-траижрибарующемся участке х-хромосоыы, содериащем кластер экдизон-индуцируешх генов, в том числе ген ВгС, экспрессирующийся щ протяаении всего развития организма и продуцирующий вэсколько классов РНК, наблэдается больная концентрация АЦ-повторов, чем в районе, состоядам из дисков и содержащем 12 групп комплементации и как минимум 25 транскрибируемых Фрагментов да, каждый из которых работает в определенной ткани ограниченное врекя. Полученные результаты свидетельтвуот в пользу того, что повышенный уровень экспресии ДНК какого-либо района может быть отчасти следствием специфических свойств таких повторяющихся последовательностей.

Анализ кожервативтюстн хронагеров

Четкая дисковая структура политенных хромосом, характерная для кавдого вида, тем более различается у двух видов, чем больше эволюционная дистанция между видами. Одним го способов изменения генома при межвидовой дифференциации является фиксация перестроек

,7 т

ТУТ Т7,

Т 1Т1' Т1

-т—

110

7 Т ТТ1

90 -Р266

100

- Р218

-<—1 з орэггзо

3 5И. ЭМЭО

5 20 _2_

=3 в 131 т I ^ ч

I >11 14 и

130

вс

А 17 ПГГ Т.

' I

290

I 0р(1)у2У67д24.2 ■ ,И_1_

-1—и_д

г-

...ЗЛО_

! т1503-

Т1500"

ЭТ(1;2)Ьог"

Рис. 3. Расположение поли д(А-Ц) последовательностей в районе 2В: А - рестрикционная каргга ДНК; Б - размеры клонированных фрагментов; В - положение точек разрыва хромосомных перестроек, стрелки указывает направление деления. Над клонировании фрагментами - локализация простых повторов с указанием интенсивности сигнала на фильтрах Саузерн-гибридизации: лирная линия - сильный сигнал; тонкая линия -умеренный сигнал; пунктир - слабый сигнал.

2

В

хромосом. Поэтом/ задача установления у разных видов гомологии хромосомных структур, несущих конкретную генетическую информацию, наиболее адекватно может быть ранена посредством in situ гибридизации определенных последовательжстей ДНК с полигенными хромосомами этих видов.

Кластер из трех генов Вг-с, dor и swi занимает часть диска 2ВЗ-5 и диск 2В6. Ошако, как было отмечено выше, вследствие своеобразия морфологии пуфа, обусловленного эктопическим спариванием дисков 2В1-Ю друг с другом и приводящего к их пассивному втягиванию в зону формирования пуфа, оказывается весьма затрудненным локализовать клоны в том или ином диске этого участка, клоны практически всегда метят весь пуф. Выявленные наш у отдаленных видов дрозофил группы funebris, virilis И repleta пуфы, гомологичные пуфу 2В D. melanogaster, расположены также на х-хромосош и имеют неоднородное распределение хромосомного материала - характерную зернистость, которая, видимо, представляет собой фрагменты соседних эктопирущих дисков. Такая особенность района не позволяет здесь сделать заключение о локализации отдельных клонов ДНК в том или ином индивидуальной хромомере и об их взаимном расположении. Однако, полученные нами результаты позволяет прийти к выводу, что расположенные в районе пуфа 2В с. selanogaster гены Br-c, dor и swi возможно также имеют кластерное расположение в X-хромэсоме дрозофил, относящимся к разным таксономическим группам. Нельзя, однако, полностью исключить возможность некоторых перемещений отдельных локусов в пределах участка хромосомы, занятой пуфом, ингерций и делений Фрагментов ДНК. Сохранение совместного расположения последовательностей ДНК этого района в геномах отдаленных видов дрозофил, очевидно, свидетельствует об эволюционной ценности такого кластерного расположения генов.

Цри анализе эволюционной консервативности диска ЮА1-2, как структурной единицы полигенной хромосомы, у видов подгруппы oelanogaster (D.sinulans, D.erecta, D.orena, D. mauritiana И др.) было продемонстрировано, что последовательности ДНК из дисталыюй и из проксимальной частей диска расположены в одзом и том же крупном диске Х-хромосош. Для уточнения взаимного расположения последовательностей ДНК этого диска у отдаленных видов дрозофил (группы funebris, virilis и repleta) в качестве зондов использовали последовательности, как

ограничивающие диск, так и из средней части диска. Результаты гибридизации in situ свидетельствуют, что ни у одного ¡о проанализированных видов эти клоны »г входят в состав одного я того ze диска, а локализуются в двух раэобщгнных участках Х-хроюсош.

Таким образен, южно предположить, что большой диск IOA1-2 d. melanogaster возник в результате слияния двух разных стеков, существовавших у предков и продолжающих существовать у проанализированных видов, а случилось это до того, как произошла дифференциация ыэвду видами подгруппы видов melanogaster. Нзльзя также отрицать и другую возможность: этот диск существовал у предков и сохранился в целом виде у melanogaster, а расщгпление его на две части произошло в той ветви, которая дала в дальнейшем остальные виды дрозофил.

Гибридизация in situ всех последовательностей ДНК из клонированного района 9F12-10A7 преследовала две цели: точно прокаргировать »геста разрыва хромосомы D.melanogaster при эволюционных перестройках и проследить, не произойдет ли утрата "молчащей ДНК". Локализация клонов ДНК из генома d.melanogaster на хромосомах d. virilis приведет на схеме (Рис. 4). Клоны ДНК, представляющие небольшой район Х-хромосош D.melanogaster, расположены в б различных районах на Х-хромосоме D.virilis, а клоны из диска 10А1-2 - в 2 районах, причем основная доля диска -140 т.п.н. из 180 и еще 30 т.п.». прилежащих последовательностей ДНК, видало, лежат единым блоком в тон ге порядке, что и у d.melanogaster. Точки эволюционных разрывов в двух случаях приходятся на последовательности ДНК дисков: МА1-2 (100-105 ед. карта) и ЮА8 (295-300 ед. карго), а в трех случаях совпадают или примыкают к зонам локализации междисков: 9F12/9F13, 9F13/10A1-2 и ЮА4-5/10А6. Поскольку все последовательности ДНК из района 9F12-10A7 D. melanogaster, в том чизле и из "молчащих зон" диска, дали сигналы гибридизации на хромосомах D. virilism", можно заключить, что эти последовательности эволюциокно достаточ4ю s консервативны и не подверглись элиминации как незначимые.

Полученные нами результаты свидетельствуют, что хромомер может быть сложным образованием, содержать несколько генов и транскрипционных единиц, не связанных функционально, быть представлен/ ; уникальными и повторяидамися последовательностями ДНИ, и что одной из

КХ)

Рис. 4. Локализация последовательностей ДНК из района 9Р12 - 10А7 П. ше1аповаа1ег га полигенных хромосомах Б. ушНв, (А) фотографическая карга х-хромосош р. ухгШб (СиЬепко, Еуйеп'еу, 1984) с указанием сайтов локализации последовательностей, гомологичных участкам клонированного района б. те1аш^а5Ьег (в).

боэшенкх причин такой сложности является слсзность его проясхоядения.

ЕйОДа

1. В диске ЮА1-2 выявлены повторы, принадлежащие к различным классам. Использование в работе различных линия D. Eelanoga3ter свидетельствует о постоянной локализации в хромосомах этих повторов, поэтому они на могут б!пъ избильньвги элементами. В составе диска обнаружены: Hi и Кг элемента, специфичные только дня Х-хромссски, кроме диска ЮА1-2 они шшвлет еще в жскольких гаясртж и шяюригх сайгах х-хроиэсош; элемента Н203.5 и М325, шевдяе гомологию с рядом районов 2 и з хромосом, со мвэгини райгаами 4 хрсиоссш к с основаниями плеч всех хромосом; ДНК, нходшзая в состав клопов Тс207, T2S3, К206. 1, М236, имеет гомологию с нжотореви райокаии 2 и з хромосом. Примерно на 15 т.п.н. последовательности ДНК дака ЮА1-2 приходится один блок АЦ-гоюполюяэрвого повтора.

2. В районе пуФа 2ВЗ-5 последовательность ДНК обогагрна АЦ-повтораки значительно сильнее, чей последрзателыюсть диска ЮА1-2: менее половины протяженности ЛЕК в районе пуфа свободно от АЦ-повторов (в зоне локализации гена Вг-с около одной четверги последовательностей свобода от АЦ-псвторов), тогда как для района диска эта величии превышает две трети длины.

3. При сопоставлении локализации кластера генов, распологенннх в районе 2ВЗ-6 d. aelanogaster, обнаружено, что у восьми изученных ВИДОВ (D. pseudoobscura, D. repleta, D. nercatorum, D. hydei, D. paranaensis, D. virilis, D. kanekoi, D. funebris) ОНИ ТЗК2Э расположены в одном пуфе х-хроиосомы, что свидетельствует о значительной консервативности организации этого кластера.

4. ДНК, входящая в состав диска 10А1-2 D. aelanogaster, локализована в том зе диске у предгавателей разных популяций D.

aelanogaster, а также У ВИДОВ, ОТНОСЯЩИХСЯ К группе ¡aelanogaster; у ВИДОВ, относящихся В группам funebris, virilis (2 вида), repleta (4 вида), эти последовательности входят в состав двух разобщенных дисков х-хроиосомн. Эти данные свидетельствуют о том, что различные фрагменты ДНК, входящие в состав одного хроиоиера, могут существовать и Функционировать независимо.

5. Последовательность ДНК размером 300 т.п.н., заключенная в семи дисках 9F12 т ЮА7 х-хромосомы d. melanogaster, представлена в шести

различных сайтах х-хроюсош D. virilie.

СШЭСК РАЮГ.ШУБЛИКСВАНИЙ œ ТЕМЕ ДЕСНТАЦИИ

1. Цротопопов И.О., Беляева Е.С., Кокоза Е.Б., Шарапова Е.М., Баркчева Э.Н., Демакова О.В., Графодатская В.Е. Цитогенетический аналга района 2В1-2 - 2ВЭ-Ю х-хроюсомы Drosophila nelanogaster. VIII. Клонирование локусов ecs, dor и ewi. // Генетика. 1988. Т. 25. С. 1614-1623.

2. Unbetova G.H., Kokoza E.B., Zhimulev I.F. localization of the DNA fragments from the Drosophila nelanogaster X-chromosome 10A1-2 band in the polytene chromosomes of some other species // Genet. (Life Sci. Adv.). 1988. V.7. P.43-46.

3. Кокоза Е.Б., Козлова Т.Ю., Умбетова Г.Х., Дубровский Э.Б., Пирротта В., Хииулев И.Ф. Малекулщиый и цитогенетический анализ диска 10А1-2 D. nelanogaster // Генетика. 1990. Т. 26. С.1361-1369.

4. Кокоза Е.Б., Беляева Е.С., Хииулев И.О. Локализация генов ecs, dor И swi у 8 видов дрозофил // Генетика. 1991. Т. 27. С. 1361-1369.

5. Kokoza Е.В., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Localization of genes ecs, dor and swi in 8 Drosophila species // Genetica (Netherl&nd). 1992. V.87. P.79-85.

6. Kozlova T.Yu., Seneshin V.F., Tretyakova I.V., Kokoza E.B., Pirrotta V., Grafodatkaya V.E., Belyaeva E.S., Zhimulev I.F. Molecular and cytogenetical characterization of 10A1-2 band and adjoining region in the D.nelanogaster polytene X chromosome // Genetics. 1994. V.136. P.1063-1073.

7. Kokoza E.B., Zhimulev I.F. Ectopic stretches labbeled by DNA clones from the 10A1-2 band of D. nelanogaster // Drosophila Inf. Service. 1994. V. 75. P. 69-71

IG