Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронно-микроскопический анализ хромомерной организации политенных хромосом дрозофилы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Электронно-микроскопический анализ хромомерной организации политенных хромосом дрозофилы"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СО АН-СССР

Специализированный совет по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук

На правах рукописи УДК 575.113:576.312.32

СЕМЕШИН Валерий Федорович

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ХРОМОМЕРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ ДРОЗОФИЛЫ

Генетика - 03.00.15

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Новосибирск - 1990

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР, г.Новосибирск.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Л.И.Корочкш,

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова АН СССР, г.Москва;

доктор биологических наук, старишй научный сотрудник

A.Ф.Смирнов,

ЕНШ разведения и генетики животных ВАСХНИЛ СССР, г.Душкин, Ленинград;

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

B.Н.Стегний,

Томский государственный университет, г.Томск.

Ленинградский государственный университет, г.Ленинград.

Защита диссертации состоится _"_ 1990 г.

на_ заседании специализированного совета

Д-002.11.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте цитологии и генетики Сибир-. ского отделения АН СССР в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО АН СССР.

Диссертация в форме научного доклада разослана "_"

'_ 1990 г.

Ученый секретарь ,, т,

специализированного совета /^¿¿¿Ь^и..

доктор биологических наук / Н.'Б.Христолюбова

ВВЕДЕНИЕ

Хромосомы эукариотических организмов являются сложными надмолекулярными образованиями,осуществляющими кодирование и реализацию наследственной информации.Выяснение принципов организации хромосомы и составляющих ее структурных элементов является одной из главных задач современной генетики.

В зависимости, от стадии клеточного цикла,укладка ДО1 и интенсивность функционирования хромосомы меняется .Максимальная экспрессия генетического материала происходит в интерфазе. Однако в это время хромосомы каксиьально деконденсированн, и визуальный анализ подавляющего большинства локусов невозможен.

Уникальной и общепринятой моделью интерфазной -хромосомы являются политенные хромосомы слюнных желез двукрылых. Они представляют собой пучки хроматид, кадцая из которых неоднородна по дайне и состоит из плотных конденсированных образований - хромомеров,соединенных мезду собой менее конденсированными мезоромомерными образованиями .Параллельные связки гомологичных хромомеров формируют диски,активация генетического материала которых сопровождается образованием вздутий или пуфов.Большие размеры хромосом и высокая специфичность дискового рисунка позволяет легко идентифицировать отдельные районы. Данное исследование проводилось на наиболее изученном генетическом Объекте Drosoph.Ha Iaвlaílogaвtвг.

Одним из ключевых вопросов организации интерфазной хромосомы является вопрос о функциональном смысле ее дифференцированное™ по длине,о соотношении мевду генами и составлявшими хромосому морфологическими элементами - дисками.меадисками и пуфами. Наличие многочисленных гипотез,объясняющих организацию этих структур,отражает отсутствие надежного фактического материала, который позволил бы осуществить привязку генов к наблюдаемым структурам (обзоры:Веегшатт,1962, 1972; Кикнад-зе, 1972;АвЬЪитег,1972; Гвоздев,1978;2Ыжи1еу в* а1.,1981 ). Решить эту проблему можно путем исследования информационного содержания конкретных дисков,меадисков и пуфов,выяснёния вопроса о том,какие последовательности ДНК формируют эти структуры и как зависит их морфология от активности этих последовательностей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение функционального значения хромомерной организации по-литенной хромосомы путем анализа информационного содержания составляющих ее морфологических элементов - дисков,междисков и пуфов.

Для достижения этой цели в работе были использованы два . подхода. Первый из них, традиционный в датогенетике, состоял в изучении генетическими методами функциональной организации элементарных структур - дисков, мевдисков и пуфов. При этом необходимо было перевести такие исследования на электронно-микроскопический (ЭМ) уровень,позволяющий с максимальной точностью картировать как исследуемые районы, так и затрагивающие их хромосомные перестройки. Ультраструктурный уровень ци-тогенетического анализа использовался впервые, что потребовало проведения ряда методических разработок.

Второй - совершенно новый, оригинальный подход заключался в выявлении и морфологическом описании "искусственных" структур, формируемых встроенными в хромосому фрагментами ДНК с заранее известными молекулярно-генетическими характеристиками. Этот подход также требует применения ЭМ уровня анализа.

Кошфетные задачи данной работы состояли в следупцем:

1.Разработать приемы ЭМ картирования,позволяющие эффективно и точно определить дисковый рисунок исследуемого района.

2.Провести ЭМ картирование трех районов почтенных хромосом В.те1аж>ваз*ег - 24А-25Р, 9Е-10В, 2АВ - И определить границы хромосомных перестроек,затрагивающих эти районы. Используя генетические данные.осуществить привязку выявляемых генетических локусов к морфологическим структурам, и таким путем оценить информационное содержание отдельных дисков.

3.Проанализировать развитие по возможности большого числа пуфов с разнообразной морфологией. Это позволило бы:

а) выявить закономерности онтогенеза пуфов,как активных районов хромосом; б) оценить вклад пассивной деконденсации в процессы пуфообразования; в) определить степень морфологической и генетической сложности пуфов,сравнив полученные результаты с известными молекулярно-генетическими данными.

4.С помощью ЭМ авторадиографии провести анализ включения %-уридина в непуфовые районы политенных хромосом.чтобы, оце-

нить наличие транскрипционной активности в междисках.

5.Провести ультраструктурный анализ трансформированных районов хромосом, содержащих в своем составе фрагменты ДНК с известными молекулярно-генетическими характеристиками.Выявление новых структурных элементов,образуемых этими фрагментами, анализ их активного и неактивного состояния,дает возможность осуществить моделирование дисков, междисков и пуфов,что позволяет прямым путем оценить соотношение между морфологией,молекулярной организацией и функциональным состоянием встроенного материала ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Основным научным результата! данной работы является создание нового направления, которое мояет быть сформулировано как молекулярно-цитогенетический анализ политенных хромосом на ультраструктурном уровне.Вклад автора в это направление состоит в разработке приемов и принципов ЭМ анализа политенных хромосом и их применение для изучения информационного содержания индивидуальных структур - дисков, мекдисков и пуфов.

С помсщы) разработанных приемов впервые реализован новый подход в изучении функциональной морфологии политенных хромосом - моделирование структур, формируемых фрагментами. ДЖ, встроенными в хромосомы путем трансформации.

- Сделаны оценки молекулярной длины ДНК в составе дисков, междасков и пуфов, а также определены коэффициенты упаковки . ДНК в этих структурах.

Впервые выполнен анализ развития более 60 морфологически различных пуфов и проведена классификация пуфов по числу дисков, участвующих в их формировании.

С помощью ЭМ авторадиографии осуществлен анализ интенсивности синтеза ИПС в малых пуфах и междисках.

С привлечением генетических данных построены наиболее точные цитогенетические карты трех районов политенных' хромосом, используемых в настоящее время для молекулярно-генетиче-ских исследований.

На основании, полученных данных сделан ряд заключений,имеющих принципиальное значение для понимания структурной и функциональной организации хромосомы:

а) наряду с хромомерами, содержащими один ген, существуют

полигенные хромомеры;

б) активация гена в составе сложного хромомера строго локальна; хромомер не является единицей декомпактизации;

в) размер деконденсированной зоны соответствует длине транскрибируемой последовательности ДНК;

г) морфологическое разнообразие пуфинга отражает степень . транскрипционной сложности района;

д) мевдиск является транскрибируемым участком хромосомы и может быть образован небольшой по длине последовательностью ДНК.

Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в ряде вузов страны (Новосибирск,Алма-Ата,Томск) и могут быть применены в дальнейших генетических л мопекулярно-гене-тических исследованиях. Разработанные приемы ЭМ картирования применяются при изучении политешшх хромосом в ряде зарубежных лабораторий (Венгрия, Испания).

Апробация работы. Основные результаты данного исследова- • ния докладывались на различных всесоюзных и международных симпозиумах,в том числе на третьем (Ленинград,1977), четвертом (Кишинев,1981) и пятом (Москва,1987) Съездах ВОГиС им. Н.И.Вавилова, Х1У M езду народа да генетическом конгрессе (Москва,1978),17 Совегско-западаогермансяом симпозиуме "Структура и транскрипция генома" (Ереван,1981),мезвдународном симпозиуме "Организация и экспрессия тканеспевдфических генов"(Новосибирск, 1982),У1 Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино,1984), У Всесоюзном совещании по структуре и функциям хромосомы (Пущино,1985),7 Всесоюзном совещании эмбриологов "Закономерности индивидуального развития организмов" (Ленинград,1985), 71 Всесоюзном симпозиуме"Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), У Всесоюзной конференции по биологии и генетике дрозофилы (Львов,1987),а также на У1 Европейской конференции по генетике и биологии дрозофилы (Купари,Югославия, 1979), 1У, У и 71 Международных совещаниях "Молекулярная биология и биология-развития дрозофилы (о.Крит, Греция, 1984, 1986, I988).

Структура и объем работы. Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада. По теме диссертации опубликовано 49 работ. Представленный в них научный материал

по методическим разработкам (I раздел доклада),анализу транс-крипционно активных районов (3 раздел), а также трансформированных районов политенных хромосом (4 раздел) получен авторш лично. В некоторых экспериментах принимали участие И.Ф. Жиму-лёв, Е.С.Беляева, Э.М.Баричева и С.А.Демаков. Данные по цито-генетическому анализу районов (2 раздел) получены в коллективных исследованиях; личный вклад автора в эти работы состоит в ЭМ картировании районов и локализации границ хромосомных перестроек.Беем коллегам автор приносит благодарность за помадь в выполнении экспериментов.Автор также глубоко благодарен Н.Б.Христолюбовой, А.Ю.Керкису и В.А.Мельникову за содействие в организации ЭМ исследовании.

ЭКСПЕРИМШТАЛШАЯ ЧАСТЬ

I. Метод электронно-микроскопического картирования политенных хромосом

Первые работы по ЭМ картированию политенных хромосом слюнных желез 0.те1аповавЪег были проведены М.Сорсой (Зогаа,19б9) и Г.Берендесом (Вегепаеа,19Т0). Однако,ни в работах этих авторов, ни в последующих ЭМ исследованиях не обсувдались вопросы об оптимальных условиях приготовления ЕМ препаратов и возможной интерпретации наблвдаемых картин, что потребовало проведения специальной работы по отработке метода.

1,1. Изготовление препаратов /2,?/.х В основу методики была взята ранее описанная процедура (Бегав,1969), которая, однако, была изменена и дополнена наш в ходе проведения данного исследования.Суть этих модификаций заключается в следующем:

1. Использование для обезвоживания препаратов обычной гистологической проводки по схеме этанол - бутанол - ксилол.

2. Применение для заключения препаратов в аралдит специальных капсул из алюминиевой фольги: заполненная аралдитом капсула прикрепляется к предметному стеклу, на котором находится давленый препарат слюнной железы; после полимеризации аралдита стекло удаляется в кидасом азоте, при этом хромосомы остаются заключенными в аралдатовый блок.

3. Проведение анализа хромосом непосредственно на полу-

х цифры в косых скобках соответствуют номерам в списке опубликованных работ на стр. 28-32.

ченном блоке в фазово-контрастном микроскопе и отметка выбранных районов хромосом с помощью специально разработанного для подобных целей метчика (Хрисгсяюбова, Керкис, 1968).

Использованные приемы приготовления препаратов позволяют существенно сэкономить время и расходуемые реактивы.

1.2. Дравида ЭМ картирования политенных хромосом /15. 22. 35,36/. Дальнейшая интерпретация ЭМ фотографий осложнена разнообразием морфологии структур. В связи с этим особое значение приобретает соблюдение определенных правил картирования, разработанных авторш и использованных в дальнейшем исследовании. Эти правила могут быть сформулированы следующим образом.

1. Содержащиеся в крупных дисках вакуслеподобные образования не могут служить показателем двойственности диска. Такого рода "вакуолизация" возрастает с увеличением обводненности фиксатора и крайне выражена при фиксации слюнных желез в 45$ уксусной кислоте.Безводные смеси спирта и кислоты к эффектам такого рода не приводят, а их применение дает наиболее четкую картину дискового рисунка.

2. Тонкие "точечные" или "пунктирные" диски, особенно на препаратах потянутых хромосом,часто выглядят в виде отдельных сгустков ДШ,расположенных в шахматном порядке.В этих случаях необходим анализ многих хромосом (иногда нескольких десятков) , причем дисковый рисунок района должен воспроизводиться на серийных срезах, по крайней мере, 2-3 зромосом.

3. Оптимальная толщина срезов политенных хромосом, используемых для картирования, составляет 120-150 нм; это помогает исключить ошибочную интерпретацию крупных дисков как дублетов и обеспечивает лучшую выявляемость минидисков, по сравнению с обычными ультратошшш срезами толщиной 50-70 нм.

4. При сценке числа дисков, участвующих в развитии пуфов, необходимо вести анализ на различных стадиях развития личинок с тем, чтобы включить в рассмотрение начальные этапы пуфооб-разования.,

В качестве иллюстрации использования принципов картирования на рисЛ приведены данные ЭМ анализа района эе-юв Х-хро-мосомы (суммированы результаты анализа серийных срезов более 100 хромосом) в сравнении с картой Бриджеса (bindsley, Grell, 1968). Типичные расхождения ЭМ данных с данными световой мик-

роскоши, характерные и для других районов, состоят в том,что двойные диски Бриджеса выглядят либо одиночными, либо, в более редких случаях, состоящими из двух дисков; тонкие диски часто расположены в тесной близости с соседними дисками и выявляются только на ультраструктурном уровне.

Рис. I. Сравнение ЭМ карты района 9е-ЮВ Х-хромосомы (б) с уточненной картой Бриджеса (а).

2. Электронно-микроскопический и генетический анализ •районов политенных хромосом

Классический метод анализа генетической организации районов хромосом разработан С.И.Алиханяном (1937)-и состоит в том, что, используя хромосомные перестройки, затрагивающие изучаемый район, выявляют мутации, расположенные в пределах той или иной делеции; локализацию мутаций друг относительно друга картируют с помощью рекомбинационных тестов; число полученных групп комплементации затем сравнивают с числом дисков в районе.Однозначность интерпретации полученных данных,в первую очередь, зависит от точности морфологического картирования хромосомных перестроек. Главной задачей данного раздела работы поэтому было ЭМ картирование трех участков полигенных хромосом Б.ще1апс^аэ*ег: 24-25 района 2Ь хромосомы и районов 9Е-10В и 2аб Х-хромосомы, а также хромосомных перестроек,затрагивающих эти районы. Параллельно в лаборатории молекулярной цито-генетики Института цитологии и генетики СО АН СССР, а также в Институте генетики дологического научного центра АН Венгрии проводились генетические эксперименты по насыщению этих районов мутациями и их комплементационному анализу. Автор не принимал непосредственного участия в генетических экспериментах,

однако,общие выводы об информационном содержании участков,полученные в результате этой работы,базировались на данных ЭМ анализа.

2.1. Байон 24A-25F 21 хромосомы /24/. Цитогенетическая карта этого района представлена на рис.2. 16 исследованных хромосомных перестроек разделяют участок 24C-25I' на 20 интервалов, что позволяет далее анализировать его генетическую организацию. С помощью ЭМ выявлено 44 одиночных диска, а генетическими методами локализовано 112 летальных и видимых мутаций, которые распределяются в 41 группу комплементации (Szidonya, . Reuter, 1988). Рассмотрение отдельных узких интервалов района показало, что группы комплементации распределены неравномерно, и в отдельных интервалах соотношение числа дисков и групп комплементации может быть больше, равно или меньше единицы. Данные свидетельствуют о возможности ситуации, когда в диске содержится более одной генетической единицы.

II

►3 "г» •• »•. ••

^ iy I- В. ^ CI •• * •• и "Г

(MVO *> <y\Vi Vt

££ .. Г "

?.....^ s

О (V n (Л r- C\

Ё. s

г?

п-

I 24

-га 4 s} 24 ft

.».ÜTJ pr> n iT®!"0! Г3 I Ä I *"* I

r|,2,,«,.., |,24S.,,»|,2.7I1.2 e|i-2 eil

iD! 1 1:Е:.У izs». • c • d! !! e : If •

в

CJ

«я •• «г» н

••«Г <п csipj cvjLt ыь* й е

от» «г» ■s

** Ч© ю ИС йй "О ■и

.b«

О r(2LJdr' OFtZLJM-i8 Of(ZL)dBh28

DF(2L)IU1 DF<2L)«d du Df(2L»dohZS

Df(2LJio" "

DF{2LJse19-5

Do(2:l)B19

ItZj3)dph"

Рис.2. Цитогенетическая карта района 24A-25F 2l хромосомы. 2.2. Район ЭЕ-юв Х-хромосомы /1,2.5,7.8.11-13/. Данные

ЭМ анализа границ 13 наиболее важных хромосомных перестроек, затрагивающих этот район, приведены на рис. 3. С помощью а! здесь выявлено 34 одиночных диска,а генетическими методами -

§ s

/ i /А

, J§3 $л isIStih /

£0 5

К О

a

Df(l)Rft37

г s

r

Df(l)sbrX1 DF(l)sbrK1B Df(l)sbrK® Dftl)«64"9

TCI;VJB149

Рис. 3. Цитогенетическая карта района эе-юв Х-хромосомы.

33 группы комплементации (zMmuiev et ai.,1981,1987). Генетически наиболее полно изучен центральный участок карты, 9Р12-10А7, включающий 7 дисков. Б этом интервале хромосомы получено около 170 различных мутаций, которые после теста на алле-лизм образуют 12 групп комплементации /13/ (рис.3). Принципиально новые данные были получены в результате цитогенетическо-го анализа крупного диска ЮА1-2. Мевду его левым краем и точкой разрыва транслокации т(тд)вн9 гены не были обнаружены (т.н. "молчащая" зона); далее в тесной близости друг с другом расположены гены v и 1(1)ВР4. В средней части диска выявлена еще одна "молчащая" "зона ДНК очень больших размеров. Наконец, в правой части-диска находится локус sev. Согласно генетическим оценкам /13/, диск ЮА1-2 занимает 0,48 морга-ниды, что составляет около 190 кб (I кб = 1000 пар нуклеоти-

дов), а зоны "молчащей" ДНК - около 1/7 части материала диска. Пространственное разделение каядой из 5 зон с помощью хромосомных перестроек (рис.3) свидетельствует od отсутствии функциональной зависимости мевду выявленными в диске генетическими локусами. Таким образом, данные комплексного ЭМ и генетического анализа впервые продемонстрировали возможность поли-генности диска политенной хромосомы.

2.3. Район 2АВ Х-хромосомы /4,6,31/. Наибольший интерес представляет анализ пуфирупцего района 2В1-Ю, где находится сложный генетический локус ees, икающий ключевую роль в процессах эвдизоновой щдукция.

На ЭМ уровне бнло проанализировано 10 наиболее важных хромосомных перестроек, что позволило цитогенетически локализовать в диске 2ВЗ-5 локусы ees и ata, причем ees оказался расположенным в правой части диска (рис.4). Изученные перестройки существенно облегчили работы по клонированию и локализации локуоа все на физической карте района (Belyaeva et al., 1967; Протопопов и др., 1988).

Последовательность ДОС, необходимая для нормального пу-финга, локализована внутри локуса ees, мевду границами пере-

й> я

к 3 ь о

а >>

(а о с- ч

Й' Й

Df(1)Р154

М(1)А94 Df(1)RA19

Df(1)ata

Df(1)рп7Ь

Df(1)S39

Df(1)St472

й

Dp(1;Y)Sz280 1П(1)ЪгП1°3

Рис.4. Цитогенетическая карта района 2ав Х-хромосомы.

строек 1п(1)Ъг103 и от (1^472; согласно молекулярным данным, она занимает около 65 кб. Удаление проксимальной части диска 2ВЗ-5 с помощью делеции ог(1)Р154 (рис.4) не нарушает индукцию эндистероном, но уменьшает размер пуфа. Следовательно, регуляторные участки пуфа локализованы в дистальной части диска. В процессе регрессии пуфа его проксимальная часть конденсируется и оказывается отделенной от дистальной части рыхлой зоной остаточного пуфинга. Таким образом, пуф в изучаемом районе формируется из части диска гвз-5.

В настоящее время этот пуф является единственным в геноме дрозофилы, для которого известна точная привязка последовательности локуса к цитологической структуре (правая часть диска 2ВЗ-5) и молекулярно-генетической карте.

3. Электронно-микроскопически'й анализ транскрипционно • активных районов политенннх хромосом

Изучение последовательных этапов развития или регрессии пуфов дает уникальную возможность для идентификации хромоме-ров, вовлекаемых в процессы активации и позволяет подойти к -анализу информационного содержания структурных элементов по-литенной хромосомы. Несмотря на существование огромной литературы, посвященной исследованию пуфинга, работы, где специально изучали развитие пуфов, немногочисленны и выполнены, в основном," на уровне светового микроскопа. Анализ такого рода требует тщательного изучения стадий развития пуфов,который на ЭМ уровне ранее не проводился. Ввиду ограниченности экспериментальных данных в этой области мы не могли ответить на целый ряд вопросов, имеющих принципиальное значение для понимания организации хромосомы. Как соотносятся процессы генетической активации отдельных локусов и процессы пуфообразования ? Ограничены ли процессы деконденсации дисков только участками активной транскрипции? Являются ли диск и пуф единицами транскрипции? Существуют ли пуфы, возникающие в результате одновременной деконденсации нескольких дисков, и как широко они распространены? Как часто встречаются пуфы, развивающиеся из отдельного диска или его части? Является ли меядиск транскрип-ционно активным районом хромосомы?

Начиная данную работу, мы располагали детальным описанием

пуфинга у B.meianogaster ца,уровне светового микроскопа (Becker,1959; Asht)unier,1972; Zhimulev, 1974; Беляева,1982). Это дало возможность выбрать дая ЭМ анализа 43 района и проследить развитие в них 63 пуфов с разнообразным морфологиче- -ским проявлением. Результаты ЭМ анализа по локализации пуфи-рукщих дисков и выявленные варианты пуфинга представлены в таблице I.

3.1. Развитие однодисковых пуфов /20.21.23.25,33/.В ходе ЭМ анализа было выявлено 29 пуфов, развитие которых связано • с декомпактизацией одного риска (таблица I). Большинство из них формируется в результате дековденсации всего диска ( 20 пуфов),однако.имеются варианты,когда пуфирует часть диска (4 пуфа), либо цроисходит "пуфирование левой и правой частей одного и того же диска (3 пуфа). Выявлено также два случая, когда на первых этапах развития пуфа вначале происходит расщепление диска, а затем расщепленные части начинают пуфиро-вать (таблица I).

3.2. Развитие морфологически сложных.пуфов /9.14.17.19 -22.33/. Как видно из таблицы I, среди 63 исследованных пуфов более половины являются многодисковыми, формируемыми в результате одновременной дековденсации двух и более дисков.Среди двухдисковых пуфов найдены три морфологических варианта, когда пуфы развиваются либо в результате равномерной и одновременной дековденсации обоих дисков, либо имеет место де-конденсация отдельного целого диска и части соседнего (2 пуфа) , либо происходит декомпактизация обращенных друг к другу частей соседних дисков (2 пуфа).

Наибольший интерес представляет ЭМ анализ сложных пуфи-рунцих комплексов, затрагивающих серию близко расположенных дисков. В наиболее сложном пуфирущем районе 50ср 2R хромосомы с помощью ЭМ удается выявить 6 зон пуфирования; в двух из них пуфы развиваются из одного диска, в трех - из двух и в одной - из. трех дисковтаблица I). Сложный многоэтапный пуфинг происходит также в районе 71 се зх, хромосомы, где на различных онтогенетических стадиях удается выявить 4 зоны активации; в каждой из них пуфы формируются из двух дисков.Возникновение пуфирупцих зон разобщено во времени; участки де-компактизации 'расположены в тесной близости,-но захватывают

\

Районы образования пуфов и морфологические варианты зон деконденсации.

Тип пуфа

Вариант

Локализация на хромосоме

Число пуфов

Олнолисковые пуфы

Ф

ш;

/

-у»

\

Ш Ш

Равномерная деконденсация лиска

Пуфирование части лиска

Пуфарование правой и левой частей диска

Расщепление лиска и пуфирование •НТ его частей

2В11; ЗС11-12; 21Ш; 29РЗ; 35А11; Э5ВЗ; 50С23; 55СЗ; 58ЕЗ-4; 62С2': 63В9; 63Е2-3; 63Р7; 68СЗ; 70С5; 70С6; 76СЗ; 79Р1'; 90В7; 95011;

1ЕЗ-4; 35В1-2; 64Е1-2; 9306-7; 2104; 50Ш-2; 100А5-6; 2ВЗ-5; 2С1-2;

ЗШ,2; 25В4,5: 25С5.6; 50С9Д0; 50С11,12; 50С1"/-18,20-21; 56Е1-2,4-5; 60В12.13; 62ЕЗ.З'; 62В4.5: 6301,2; 63Р5,5': 67В1,2: 71С2.3; 7103,4; 71Е3.4; 72010,11; 74Е1-2.4; 85Ь1,2; 85Р3.4-5; ОТ 4,5;

22ВЗ,4-5; 71Е5,Р1-2; 101,2-3; 7А1-2.4-5;

20 4 3

М СО

Двухдисковые пуфы

ш-Ш

ХФ

Одновременная деконденсация обоих дисков

Деконденсация целого диска и части соседнего

Деконденсация обращенных друг к другу частей соседних дисков

21

2 2

Трехлисковыс пуфы

ш-

Одновременная деконденсация трех дисков

21ЕЗ',4,4'; ЗЗВЯ-9,10,11-12; 50Р4-5,6-7,8; 55Е2Д4; 75ВЗА5; 7804^6,6'; 82Р5,6,7.

Чстырехдисковые пуфы

Ш

N

Одновременная деконденсация 87А6,7,8,9; четырех дисков

Частичная деконденсация 87В13,14,15,С1; одного из дисков

различные диски, что свидетельствует в пользу существования нескольких функционально различных пуфов в этих районах.

ЭМ анализ еще 6 районов хромосом, 62Е, 6зр, 3cd, 35ав,70с и 99EF, в каждом из которых выявлено по паре близко расположенных пуфирупцих участков (таблица I), хорошо дополняет наблюдаемую картину. Анализ последовательных этапов развития пуфов в этих районах показывает, что короткие временные интервалы между начальными этапами деконденсации дисков создают впечатление "движения" пуфового максимума. Если этот интервал достаточно большой, то пуфинг считается независимым. Наоборот, совпадение времени декомпенсации рядом расположенных дисков можно рассматривать как активацию морфологически и онтогенетически единой структуры.

3.3. Классификация пуфов по числу дисков /20,83,25.28/. Основываясь лишь на морфологических критериях, можно выделить 4 класса пуфов в соответствии с числом дисков,декомпакти-зация которых происходит одновременно .-одно-, двух-.трех- и че-тырехдисковые-пуфы,численное соотношение которых в исследованной выборке,соответственно, равно 29, 25, 7 и 3 (таблица I).

3.4. Информационное содержание пуфов /10,16.19,22,23/. 0 степени сложности информационного содержания ряда транскрип-ционно активных районов псмитенных хромосом позволяет судить сопоставление результатов ЭМ анализа развития пуфов с данными молекулярной генетики, известными из литературы.

С помощью ЭМ было показано, что в районе 2В Х-хромосомы пуф развивается из части диска гвз-5. Методами клонирования и гибридизации in situ был исследован участок ДОС этого диска, протяженностью 160 кб (Belyáeva et al., 1987; Протопопов и др., 1988). Показано,что последовательность, необходимая для нормального пуфинга, локализована внутри локуса ees и составляет около 65 кб; выявлено наличие двух регулягорньгх зон, расположенных в левой,.дастальной, части пуфа, т.е. в средней части диска 2ВЗ-5- Активация регуляторной зоны на начальных этапах развития пуфа,очевидно,приведет к расщеплению диска.

В районе 68С мы наблвдали образование пуфа из единичного диска. Молекулярно-генетическими методами в нем выявлено три гена, кодирующие белки секрета слюнной железы, 5gs3,Sgs7,Sgs8

(Meyerowitz, Hogness, 1982 ). Гены имеют сравнительно небольшую протяженность (0,3-1,1 кб), а каждый из них обладает собственными регуляторнши сайтами.

Два пуфа теплового шока, возникающие в районах бзв и 67В, формируются, соответственно, из I и 2 дисков. В однодисковом пуфе бзв установлено наличие двух транскрипционных единиц дайной 2,4 и 0,5 кб (O'Connor, lia, 1982). Пуф в районе 67В имеет 7 независимо регулируемых единиц транскрипции длиной 0,41,8 кб (Sirotkin, 1982).

С помощью ЭМ показано, что два пуфа теплового шока в райо- ^ нах 87А и 87с формируются в результате одновременной декон-денсации 4 дисков. По данным молекулярно-генетического анализа, каждый из районов содержит повторенные копии генов hsp70 Q длиной кодирующих участков около 2,5 кб; минимальное число копий составляет 2 в районе 87А и 3 в-районе 87с; гены имеют различное направление транскрипции, собственные регуляторные сайты и разделены некодирующими участками ДНК длиной 1,5 кб. Общая длина транскрибируемых локусов составляет 10 и 55 кб,соответственно, ДЛЯ районов 87А И 87С (Ashburner,Bonner, 1979).

Для некоторых участков хромосом, картированных с помощью ЭМ, показано наличие более сложной кластерной организации генов. В участке 39DS 2Ь хромосомы, заключающем не более 5 дисков, расположены последовательности ДНК, кодирующие гистоновые гены, повторенные более 100 раз (Saigo, 1980). В другом районе, 5бЕР, где по данным ЭМ развивается двухдисковый пуф, локализовано около 200 генов, кодирующих 5S РНК (Wimber, stef-fenaon, 1970).

Наконец, два пуфа в районах 74EF и 75в, формируемые по нашим данным, соответственно, из 2 и 3 дисков, имеют сложную экзон-интронную структуру транскрипционных единиц, протяженностью В несколько десятков кб (Boyd et al., 1988; Segravea, Hognesa,1988).в настоящее время, однако, не ясно, как связаны участки экзонов и интронов с дисковым рисунком районов.

Приведенные примеры служат хорошим подтверлдением сделанного наш ранее заключения о сложной организации диска. Очевидно также,что пуф,будучи сформированным из одного или нескольких дисков,не может быть единицей генетической функции.

3.5. Анализ транскрипционной активности малых пуфов и меж,-дисков /3.10.II,18.34/. В геноме дрозофилы имеется большой класс дековденсированных и постоянно транскрибируемых районов хромосом, которые, как правило, не проявляют признаков пуфи-рования и редко меняют морфологию в онтогенезе. Такие районы были названы "малыми пуфами" или микропуфами (Жимулёв.Беляева, 1974). По морфологическим критериям к разряду микропуфов могут быть отнесены и междиски, участие которых в транскрипционных событиях, однако, не доказано. В связи с этим мы попытались локализовать синтез НТК в междисках с помощью высокораз-решавдего метода ЭМ авторадиографии. Для исследования были выбраны 3 района: юоав, 21б и 7ер. Результаты анализа, проведенного на серийных срезах многих хромосом, суммированы на рис. 5.

эоо-

Рис.5. Активность включения ^н-уридина в районы политенных хромосом 21п (а), юоав (б) и 7кр (в).По оси абсцисс - район хромосомы,по оси ординат - общее число зёрен серебра над ним.

Показано, что наибольшая интенсивность мечения наблюдается над рыхлым,слегка пуфирушш диском юоа5-6 и несколько меньшая - над рыхлыми серыми дисками 2ЮЗ и юовв. Наиболее низкий уровень включения изотопа выявляется в плотных конденсированных дисках 2101-2, 2Ю4, ЮОВ4-5, ю0с1-2. в сравнении с ними ряд мевдисков, таких как 2103/2104, 2Ю4/21Е1-2 , юов5/ЮОВ8, 7Р1-2/7РЗ-4, включают ^-уридан с большей интен-. сивностью...Эти данные говорят в пользу представления о наличии транскрипционной активности в деконденсированных или частично деконденеированных структурных элементах политенной хромосомы. Ряд фактов, известных из литературы, подтверждают этот вывод: показано наличие гранул НШ (Зкаег, 1977; 1978 ), локализация ШК-полимеразы В (Лапг1сЬ еъ а1.,1977) и гибридов ДНК-РНК (Власова и др., 1984) как в пуфах и разрыхленных дисках, так и в мевдисках.

4.Электронно-микроскопический анализ трансформируемых шрапдентов ДНК в составе политенных хромосом

Новый оригинальный подход к исследованию структурной и функциональной организации индивидуального хромомера дает метод Р-элемент опосредованной трансформации (Rubin,Spradling, 1982), позволяющий встроить в геном дрозофилы последовательности ДНК с известными молекулярно-генетическими характеристиками и экспериментально регулируемой транскрипцией.

ЭМ анализ трансформированных 'районов, проведенный нами впервые, позволил, подробно изучить морфологию встроенного в хромосомы материала в неактивном состоянии и после активации транскрипции. Фактически, оказалось, что мы можем таким образом моделировать естественные хромосомные структуры -диски, медциски и пуфы.

Трансформированные линии мух были получены из различных лабораторий США и Франции; фралленты ДНК, встроенные е геном дрозофилы, ограничены с обеих сторон материалом ДНК Р-элеыен-та и содержат гены, активация которых контролируется либо собственными промоторами (гены Sga3, hapl8.5, rosy, Р-элемент), либо промотором гена теплового шока hsp70 (гены Adh и р-gal), (таблица 2).

4.1. Морфологическая характеристика возникавших структур /26,27.29,30.35,37/. Согласно данным ЭМ анализа, в 10 из 13 изученных трансформированных районах образуются новые диски (таблица 2), т.е. транспозируемые фрагменты ДНК с высокой ча-' стотой встраиваются в участки мевдисков. Новые диски морфологически не отличимы от естественных дисков политенной хромосомы. Среди изученных конструкций минимальная длина фрагмента ДНК, обнаруживаемого в виде нового диска, составляет 5 кб.

Точное знание молекулярной длины фрагмента дает возможность оценить степень упаковки его ДНК как отношение длины фратаента к толщине диска. Найденные отношения варьируют от 30 до 50 (таблица 2). Наиболее правдоподобная оценка,по-видимому, Слизка к 50,как это имеет место в линии НВд-23, когда ■ у встроенного фрагмента удалены регуляторные элементы гена hsp70; в условиях теплового шока ген /з-gal не транскрибируется (Simon et al.,1985) и новый диск находится в неактиг::

Таблица 2. Генетический состав и цитологические характеристики инсерций в трансформированных линиях.

Структура,общая длина и длина транскрибируемой части фрагмента ДНК в кб

Наличие

Коэффициент упаковки ДНК

нового нового диска межда-диска пуфа ска

Линия

Источник получения

Éf

-- 0,95-

hspl8,S

t

10

микропуфы

42

1,8 1,8

28X-F 28Х-С 28-term

Hoffman, Corees, 1984; 1986;

i----1.1 —

El

Sgs3

Ti

микропуфы

33 44

1,4 1.7

gl(60AB) gl(67D)

Richards et al.,1983;

é

[p hsp/U Adh p

пуфы 30 16 средних ^ • размеров ои 1,4

Adhhs61C Bonneret Adhhs82B al.,1984;

E

rosy

-•Zlrisp/o

18

j^-Sal

крупные 46 пуфы

54

3.5

3.6

„Вд 9.61

НВл-194

НВд-23

НВд-59

НВд-73

Lis et al., 1983; Simon et al.,1985;

комплекс

rosy lr—НИ rosy -^МЪ rosy ¿Ph rosy И ИЗ 4 p p p p _ _ p p PBR p p ДИСКОВ

весь комплекс 27

R 310.1

Rubin,

Spradling,

1983;

новый междиск

hd

Searls,

Voelker,

1986.

состоянии. Такой уровень упаковки ДНК близок к супербидному и соответствует фибрилле ДНИ диаметром 300

Активация генов инсертов приводит к декомпактизации новых дисков. Особенности этих процессов зависят от генетического состава встроенного в хромосомы фрагмента ДНК, Если в составе фрагмента содержится один ген (например,Sgs3 или Adh), то его активация приводит к деконденсации всего диска (рис.6 а,г-е). В случаях, когда фрагмент состоит из двух генов (гу-р -gal или ry-hspi8.5), независимо от положения промотора, на краю (рис.6 б) или в средней части фрагмента (рис.6 в),в неактивном состоянии он представлен единичным диском (рис.6 ж,и). Однако после индукции транскрипции процесс пуфирования таких дисков различен.После кратковременного теплового шока в первом случае пуфинг "начинается в правой части диска и распространяется влево (рис.6 ж,з). Во втором случае диск расщепляется на две части (рис.6 и,к), что можно интерпретировать как визуализацию активации промотора гена hsp70, от которого процесс транскрипции распространяется на отщепившуюся правую часть диска. Аналогичные морфологические картины имеют место при формирования естественных пуфов в районах 2вз-5 и 2с1-2 Х-хромосомы (таблица I).

Рис.6. Схема образования дисков и пуфов в трансформированных районах: а,б,в - конструкция фрагментов ДНК; г - исходное состояние района; д,ж,и - образование новых дисков; е,з,к - их пуфирование.

С увеличением продолжительности теплового воздействия , участок диска, соответствующий гену формирует крупный

пуф, а другая его часть, содержащая ген гу, сохраняется в

конденсированном виде.

Анализ пуфинга в трансформированных районах выявил прямую корреляцию мевду величиной зоны деконденсации и длиной транскрибируемой части фрагмента (таблица 2): гены длиной порядка I кб формируют структуры, сходные с меадисками или микропуфами (гены Sgs3, Ьвр18.5), последовательности длиной 3 кб - пуфы средних размеров Uah), ч 9-II кб - крупные пуфы (/-gal).

Оценка коэффициентов упаковки ДНК в новых пуфах, основанная на измерениях протяженности деконденсированной зоны, дает значения в пределах 1,4-3,6 (таблица 2).

Таким образом, искусственные диски могут быть полигенными, но выглядят они при этом как единичные элементарные структуры. Процессы активации отдельных генов в составе сложного диска сопровождаются локальной деконденсацией материала диска, что хорошо согласуется с картинами формирования естественных пуфов из части (ила частей) отдельных дисков (таблица I).Продемонстрированные в работе цревращения тонких дисков в междиски (или микропуфы) можно рассматривать как модель формирования естественных междисков. Идеальной эта модель может быть,однако, в том случае, если шлые фрагменты, транскрипционно регулируемого материала, будут встроены в плотные диски,что приведет к их расщеплению.

4.2. Фоширование междасков из материала ДНК Р-элемента /32.35.38/. Морфологический анализ трансформированных районов показывает, что во всех исследованных случаях суммарная ширина мевдисков, прилегающих с обеих сторон к новым дискам-, увеличивается, в среднем, на 0,15-0,25 мкм. Можно предполагать, что наблюдаемое удлинение создается за счет ДНК Р-элемента, ограничившей фрагмент,и,следовательно.инсерция в диск одного только Р-элемента приведет к образованию нового мевдиска.

Для проверки этого предположения был проведен анализ района 9ЗА в линии кзю.1, куда был встроен тетрамер плазмиды pryi длиной 54 кб, каащнй из мономеров которого ограничен Р-ДНК и соединен с последующим посредством ДЖ плазмиды рвн 322 и гена w (Rubin, Spradüng, 1983; таблица 2). В районе инсерции этого крупного фрагмента появляется рыхлый комплекс хроматина,в составе которого можно выделить 4 ряда параллельно лежащих структур (рис.7), что можно интерпретировать как

чередование компактной ДНК гена гу с деконденсированными участками Р-ЖК. В этом случае, однако, нельзя исключить, что в формировании структур,сходных с междиском,принимают участие •последовательности ДОК, принадлежащие рВИ322 или у/.

гу ГУ гу гу

Рис. 7. Формирование комплекса дисков (в) из сложного фрагмента ДНК, содержащего 4 гена гу I (а), б - нетрансформированннй

■ШШГ

Поиск более точного ответа на поставленный вопрос привел нас к анализу линии i(i)BP7S3, полученной путем гибридного дисгенеза (Похолкова,Соловьева,1989);линия несет мутацию по локусу ВР7, ранее локализованному в интервале ЮАб-7 Х-хро-мосомы (см.рис.З). По данным гибридизации in aitu, встройка Р-элемента была полилокальной; для ЗМ анализа были выбраны два района с отчетливой локализацией Р-ДНК в районах 8С и 1 од.Согласно морфометрическим данным,полученным в результате, анализа серийных срезов 15-20 хромосом.исследуемые участки удлинялись на 0,09-0,13 мкм по сравнению с контролем за счет увеличения ширины междисков, между дисками 8С1-2 и ЮА5-8.

Прямое доказательство сделанного предположения было получено в результате анализа диска 10A1-2 в линии vhd, куда, по данным гибридизации in situ и рестрикционного анализа,полный Р-элемент длиной 2,9 кб встроен правее локуса v (Searles, Voeiker,1986; таблица 2). Анализ этого района с помощью ЭМ выявил расщепление диска юи-г на две неравные части и образование нового междиска,ширина которого составляла 0,09 мкм.

Таким образом, Р-элемент может встраиваться как в междиск, так и в диск (рис.8). В первом случае происходит удлинение ранее существовавшего междиска,а во втором - расщепление диска и формирование нового междиска.Коэффициент упаковки Д1К такого междиска составляет II (таблица 2). Полученный результат хорошо согласуется с данными литературы о способности Р-элемента синтезировать м-ШК в ходе онтогенетического развития (Laski et al.,1986) и подтверждает представление о междиске как транскрипционно активном районе хромосомы.

Ряс.8. Формирование междиска материалом ДНК Р-элемента. а - Р-эле-мент; о,г - исходное состояние участков хромосомы; в - картина после инсерции Р-элемента в меж-даск, д - в диск.

В связи с полученными данными возникает вопрос о возможности формирования новых структурных элементов хромосомы мобильными генетическими элементами (мгэ) других типов.ЭМ анализ двух линий, мутантных по локусу v, v1 и vk, содершцих встройку мгэ вт412 (семейство copia, длина 7,5 кб) в диске 10А1-2 (Searles.Voelker,1986) показал, что морфология диска в обеих линиях не отличалась от таковой в контроле. Можно предполагать, что мгэ этого типа, будучи интегрированными в диск, на исследуемой стадии развития личинки находятся в неактивном состоянии и морфологически не выявляются,что подтверждается данными других исследований (Ananiev et al., 1984).

\

5. Функциональная морфология структур политепных хромосом (заключение) ДО.II.18,22.23.27.35/

Дискуссии о структурной и функциональной организации основных элементов политенных хромосом - дисков, мездисков и пуфов - ведутся на протяжении нескольких десятков лет (Koi-zoff,1934; Huiler, Prokofjeva, 1935). В 70-е годы наибольшую известность приобрела гипотеза Беерманна ,(Beermaim,i965, 1967) о том, что диск и развивающийся из него пуф являются эквивалентами менделевского гена. Случаи, когда пуфинг не ограничен деконденсацией одиночного диска, объяснялись с помощью гипотез о' "пассивной" десшрализации материала хромосомы за очет накопления ИБС и продуктов, необходимых доя ее синтеза (Seermann, 1962; Лачев,1968), а также"движения" пуфо-вого максимума (iiecheike.1961 ). Развитие представлений о петлевой организации хромосом привело к предположению о соответствии ОДНОЙ ПеТЛИ ДНК отдельному ХромОГЛеру (Poulson,Laer=mli, 1977; Sorsa, 1982).При этом цредполагается также,что диск по-

Р element

литенной хромосомы может быть единицей декомпактизации.Что касается мевдисков, то им приписывалась либо роль участков,разграничивающих диски (Кикнадзе,1972),либо роль контролирующих элементов транскрипции (Crick,1971; Poul, 1972; Soras, 1976).

Новый подход к исследуемой проблеме дает модель динамической организации политенной хромосомы, появившаяся ко времени, когда начиналась эта работа (Zhimulev, Belyaeva.1975). В ее основе лежит положение о наличии прямой связи между процессами деконденсации и транскрипции соответствующих структур хромосомы. При этом хромомер рассматривается как морфологическая структура, содержащая один или несколько генов, неактивных и, следовательно, конденсированных в данный момент. Участки J0Kr связывавдие соседние хромом еры, мездисЯог^постоянно транскрибируются, что и создает относительную стабильность дискового рисунка. Гены в-составе хромомеров активируются на определенных стадиях развития, обеспечивая динамический характер хрсмомер-ной организации полигенных хромосом.

Для понимания функциональной роли морфологических элементов хромосомы необходимы знания об их информационном содержании; получение этих знаний и было целью данного исследования. Главная стратегия работы состояла в сопоставлении молекуляр-но-генетической организации районов с морфологическими особенностями структур в неактивном и активном состояниях. Дальнейшая проверка правильности выводов осуществлялась путем моделирования дисков, мевдисков и-пуфов, возникающих при трансформации районов с помощью Р-элемента.

Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что морфология диска зависит от протяженности и степени компактизации составляющей его ДНК: согласно сделаннш оценкам, длина ДНК варьирует от 5 до 200'кб; коэффициент упаковки ДЖ диска, в среднем, равен 50 и уменьшается до 1,4 в пуфируицих районах. Такие оценки являются наиболее точными, так как сделаны для структур, количество ДНК которых определено на молекулярном уровне.

Факты превышения числа групп комплементации над числом дисков в районе эе-юв Х-хромосомы d.meianogaster, а также выявление в диске юа1-2 5 функционально различных зон ДНК впервые показали принципиальную возможность существования

полигенных дисков. Это заключение, вытекающее из коллективных исследований, было в дальнейшем развито и экспериментально подтверждено в цикле работ, вклад автора в которые был определяющим.Результаты анализа других районов,изучение формирования пуфов, а также искусственных дисков,образуемых сложными транспозируемыми фрагментами ДНК, позволили заключить,-что полигенность - не редкое или исключительное явление,а характерное для хромомеров политенных хромосом.В настоящее время данное представление подтверэдено другими исследователями и получило широкое признание (ЬеГеуге, 1986).

Исследование с помощью ЭМ развития 63 морфологически различных пуфов впервые позволило идентифицировать диски, из которых пуфы формируются, выявить степень словностии закономерности процессов активации хромосомных локусов. Показано, что пуфы могут развиваться из 1,2,3 и 4 дисков, а их соотношение в исследованной выборке составляет 29,25,7 и 2. Для последующего анализа принципиальное значение имеет заключение о том, что процессы декомпенсации дисков строго ограничены участками транскрипции и не связаны с "пассивной" деспирализацией дисков, прилегающих к зоне пуфообразования (Веегтапп,19б2). Наиболее веско это заключение подтверждается данными анализа трансформированных районов хромосом: в зависимости от генетического состава инсерционного материала и положения промоторов, пуфы формируются из целого диска или его части, при этом наблюдается прямая корреляция меяду длиной транскрибируемой зоны и величиной формируемого пуфа. Таким образом,размер пуфа определяется протяженностью активируемого участка ДНК и интенсивностью его транскрипции.

Показано, что однодисковые пуфы могут возникать как из целого диска, так и его части, а в некоторых случаях, - в результате расщепления единичного диска. Такая ситуация имеет -место, Ващямер, в районе гв Х-хромосомы, для которого путем ЭМ картирования хромосомных перестроек и молекулярно-генети-чесгого анализа было установлено, что последовательность, ответственная за формирование пуфа, находится внутри сложного локуса осе, составляющего часть диска 2ВЗ-5.

Сравнение результатов ЭМ анализа с данными молекулярной генетики приводит к заключению, что в составе пуфа, развиваю-

щегося из единичного диска, может находиться несколько независимо регулируемых генов ( пуфы в районах 68СЗ, 63В9), т.е. пуф, будучи морфологически цельной структурой может быть сложным генетическим комплексом.

С точки зрения полученных данных ставится под сомнение представление о соответствии диска политенной хромосомы домену деконденсации, отдельные хромомеры которого при активации образуют единичные петли. ДЖ (Рои1аоп, ЬаешшИ, 1977; Эогва, 1982; МогЫп, Эе(1а1;, 1982; Вигк1ю1с1ег, 1988). Такому представлению, имеющему принципиальный характер,противоречат две группы фактов, полученных в результате ЭМ анализа трансформированных районов хромосом: I) пуф может формироваться из части диска; 2) встраивание Р-элемента в диск приводит к расщеплению и формированию в его составе небольшой деконденсирован-ной зоны. Таким образом,ЭМ анализ активных районов убедительно подтверждают вывод о том, что диск политенной хромосомы,не являясь единицей функции и единицей декомлактизации, соответствует участку ЛНП, в данный период онтогенетического развития находящемуся в конденсированном состоянии.

Наличие в политенных хромосомах большого числа многодисковых пуфов отражает существование в геноме дрозофилы разнообразных по сложности транскрипционных районов. Одновременную деконденсацию дисков в таких системах, вероятно, можно объяснить либо кластерностью организации функционально сходных или одинаковых генов (пуфы 87А, 87ВС, 67В), либо наличием в них функционально различных генов, активируемых синхронно ( пуф 74ЕР). Наличие в многодисковых пуфирутацих районах экзон-ин-тронных последовательностей с большой протяженностью транскрибируемого участка ДНК (пуфы 74ЕР, 75В) ставит вопрос о соотношении таких последовательностей с дисками и междисками, что является предметом дальнейших исследований.

Функциональное значение' другого деконденсированного элемента политенной хромосомы, меядаска, вплоть до настоящего времени остается дискуссионным. Анализ включения %-уридина , проведенный нами с помощью ЭМ авторадиографии,свидетельствует о наличии в нем транскрипционной активности. Это приводит к предположению о том, что междиски являются эквивалентами микропуфов и отличаются от крупных пуфов лишь малыми размерами

транскрибируемых участков ДНК. Такое предположение подтверждает 3«! анализ районов хромосом, трансформированных с помощью Р-элемента. Показано, что последовательности ДНК длиной порядка I кб; входящие в состав новых дисков, при активации превращаются в структуры, морфологически не отличимые от естественных междисков. Ярким примером моделирования междиска является картина расщепления диска ЮА1-2 при встраивании в него Р-элемента, транскрибируемого в соматических клетках в ходе онтогенеза (Ьаак! е* а1.,198б). Вопрос о природе РНК, синтезируемой в естественных междасках, остается открытым.Обнаруженный нами факт преимущественного встраивания в междиски инсер-ций, транспозируемых с помощью Р-элемента, говорит о том, что либо генетический материал междаска уникален, но не существенен для вшивания организма, либо расположенные в нем последовательности обладают сходными функциями,поскольку особи,гомозиготные по вставкам, жизнеспособны.Проведенный ЭМ анализ трансформантов лег в основу дальнейшего молекулярного анализа первичной структуры ДНК междисков с помощью методов клонирования; при этом в качестве зонда используется встроенный в междиск транспозируемый фрагмент .выявляемый в ЭМ в виде нового диска.

В целом, полученные ЭМ данные в сочетании с генетическими и молекулярно-генетическими данными позволяют объединить сведения о структурной и функциональной организации подитенной хромосомы и экспериментально обосновать концепцию о том, что хромомерный рисунок хромосомы отражает функциональное состояние генома. Разнообразие морфологии структурных элементов по-литенной хр см ос алы обусловлено дифференциальной активностью генов, входящих в состав отдельных хромомеров и свидетельствует о динамичном характере ее хромомерной организации.

ВЫВОДЫ

I. ЭМ картирование политенных хромосом позволило выйти на новый, ультраструктурный, уровень- цитогенетических работ и впервые осуществить:

а) максимально точную привязку отдельных генов к индивидуальным дискам и пуфам;

б) моделирование дисков, междасков и пуфов, формируемых

транспозируемыми фрагментами ДНК с известными молекулярными характеристиками.

2. На основании полученных данных об информационном содержании основных морфологических элементов политенных хромосом - дисков,междисков и пуфов - развито и обосновано представление о том, что хромомерный рисунок хромосомы является морфологическим выражением дифференциальной активности генома.

3. Показано, что полигенность хромомеров в политенных хромосомах дрозофилы - широко распространенное явление:

а) сочетание данных ЭМ анализа с результатами генетических исследований дало возможность установить сложную генетическую организацию дисков ЮА1-2 и 2ВЗ-5; диск ЮА1-2 содержит 5 функционально не связанных последовательностей, в том числе 3 разных гена; диск 2ВЗ-5 имеет, как минимум, 2 гена; пуф, возникающий в этом районе, развивается в результате активации гена ees;

б) моделирование полигенных дисков с помощью фрагментов ДНК, имеющих сложную молекулярную организацию, показало, что в неактивном состоянии такие фрагменты в составе по-литенной хромосомы цредставлены плотными единичными дисками;

в) в пользу полигенности дисков говорят обнаруженные в работе факты пуфирования отдельных частей дисков при активации транскрипции.

4. Проведен анализ развития 63 пуфирующих участков политенных зфомосом. Выявленное разнообразие картин формирования пуфов по числу одновременно деконденсируемых дисков и наличие различных вариантов пуфирования единичных дисков позволяет рассматривать пуфы как транскрипционные районы различной степени информационной сложности.

5. Анализ процессов пуфинга в трансформированных районах политенных хромосом приводит к заключению о том, что участки декомпактизации ограничены зонами транскрипции и не распространяются на диски, прилегагацие к центрам пуфообразования. Возможность развития пуфов из частей дисков свидетельствуют о том, что диск не является единицей декомпактизации.

6. Обосновано представление о междисках как малых пуфах:

а) анализ меадисков с помощью высокоразрешающего метода ЭМ

авторадиографии после импульсного меченая %-уридином выявил в них наличие транскрипционной активности; б) моделирование междисков с помощью транспозируемых фрагментов ДНК показало, что при активации генов небольшой величины формируются структуры, морфологически сходные с мевдисками; встройка Р-элемента в диск 1ОА1-2 приводит к расщеплению этого диска на две части и образованию нового мездиска.

7. Морфологическое разнообразие структур политенной хромосомы определяется степенью компактизации и протяженностью ДНК. Анализ структур, формируемых транспозируемыми фрагментами ДНК, показал, что уровень упаковки ДОС в искусственных дисках близок к нуклеомерному уровню организации хроматина, причем минимальный размер диска равен примерно 5 кб. Размер пуфирующей зоны коррелирует с длиной транскрибируемой последовательности ДНК; коэффициент упаковки ДНК в активных районах варьирует от 1,4 до 3,6.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Semeshin V.P..Zhimulev I.P..Belyaeva E.S. An electron microscopic investigation of the polytene chromosomes of Dro-eophila melanogaster//Abstracts of the Helsinki chromosome conference. - Finland. - 1977. - P. 62.

2. Семешин В.Ф.,3£имулёв И.Ф.,Беляева E.C.Патогенетическое изучение района 9-Е-ЮА Х-хромосощ Drosophila melanogaater . Сообщение I. Морфология района и картирование делеций, затрагивающих даек 10А1-2//Генегика. - 1979. - 15, № 10. -С. I78I-I792.

3. Semeshin V.P.,Zhimulev I.P..Belyaeva E.S. Electron microscope autoradiographic study on transcriptional activity of Drosophila melanogaster polytene chromo в ome з//Chromo soma. - 1979. - 73, N 2. - P. 163-177.

4. Беляева Е.С.Димулёв И.Ф.,Семешин В.Ф. Цитогенетический анализ района 2В1-2 - 2Б9-Ю Х-хромосомы Drosophila melanogaster. Сообщение I. Цитологическая локализация перестроек и закономерности пуфинга//Генетика. - 1980. - 16,

№ I. - С.103-104.

5. Жимулёв И.Ф. .Беляева Е.С..Похолкова Г.В.,Семешин В.Ф.,

Бгатов А.В,.Баричева З.М.Цитогенетическое изучение района 9Е-ЮА Х-хромосомы Drosophila melanogaster. Сообщение П. Мутации, влияющие на жизнеспособность и некоторые морфологические признаки//Генетика. - 1980. - 16, №8. -С. 1404-1424.

6. Belyaeva E,S.,Aizenzon M.G.,Semeshin T.P.,Kiss I.I.,Kocz-ka K.,Baricheva E.M..Gorelova T.D.,Zhimulev I.P. Cytogenetic analysis of the 2B3-4 - 2B11 region of the X-chromosome of Drosophila melanogaater.I.Cytology of the region and mutant complementation groups//Chromosoma. - 1980.

81, II 2. - P. 281-306.

7. Zhimulev I.P.,Semeshin V.P.,Belyaeva E.S. Pine cytogeneti-cal analysis of the band 10A1-2 and the adjoining regions in the Drosophila melanogaster X chromosome. I.Cytology of the region and mapping of chromosome rearrangements//Chro-mosoma. - 1981. - 82, If 1. - P. 9-23.

8. Zhimulev I.P..Pokholkova G.V,,Bgatov A.V,.Semeshin V.P., Belyaeva E.S. Pine cytogenetical analysis of the hand 10A1-2 and the adjoining regions in the Drosophila melanogaater X chromosome.II. Genetical analysis//Chromosoma. - 1981. - 82, I 1. - Ï. 25-40.

9. Semeehin V.P.,Baricheva E.M.,Zhimulev I.P..Belyaeva E.S. RHP-containing structures induced by heat shook in puffs of Drosophila melanogaster polytene chromosomes//Abst-racts of the 7th EDRC. Oulu, Finland. - 1981. - P. 96.

10.Zhimulev I.P.,Belyaeva E.S.,Semeehin V.Ï1., Informational content of polytene chromosome bands and puffa//CRC Critical Reviews in Biochemistry. - 1981. - 11, N 4, -

P. 303-340.

П.Яимулёв И.Ф..Беляева Е.С.,Семешин В.Ф..Похолкова Г.В.,Гра-фодатская В.Е. О структурно-функциональной организации по-литенных хромое ом//Молекулярные основы генетических про-цессов//Под ред. С.В.Шестакова. - М.: Наука, 1981. - С.403-413.

12.Похолкова Г.В..Жимулёв И.Ф..Графодатская В.Е..Фомина О.В., Баричева Э.М.,Семешин В.Ф..Беляева Е.С. Патогенетическое изучение района 9Е-10А Х-хромосомы Drosophila melanogaster. Сообщение Ш. Генетическое картирование локусов в

интервале ras-dsh //Генетика.-1982.-18 2. - С.255-262.

13.Жимулёв И.Ф.,Семешин В.Ф.,Кочнева Г.В.,Фомина О.В..Баричева Э.М..Беляева Е.С. Патогенетическое изучение района 9е-10а Х-хромосомы Drosophila melanogaster. Сообщение 1У. Получение и характеристики хромосомных перестроек в интервале газ-dsh //Генетика. - 1982. - 18,гё 4. - С.596-612.

14.Семешн В.Ф..Баричева Э.М.Ультраструктурный анализ развития пуфов политенных хромосом дрозофилы//Тезисы сообщений Международного симпозиума "Организация и экспрессия ткане-специфических генов".-Новосибирск, 1982. - С. 71.

15.Zhimulev I.F..Semeshin 7.F..Kulichkov V.A..Belyaeva E.S. Intercalary heteroohromatin in. Drosophila. I.Localization and general charact eriet iоe//Chromoвoma. - 1982. - 87,

N 2. - P. 197-228.

16.Semeshin V.P.,Baricheva E.M.,Belyaeva E.S..Zhimulev i.p. Electron microscopical analysis of Drosophila polytene chromosomes.I.Mapping of the 87A and 87C heat shock puffs in development//Chromosoma. - 1982. - 87, H 2.-P.229-237.

17.Semeshin V.P..Zhimulev I.P.,Shilov A.G..Belyaeva E.S.,Ba-richeva E.M. RNP-bodies in puffs of Drosophila melanogas-ter//Dros.Inform.Serv. - 1983.'- 59. - P. 108-109.

18.Zhimulev I.F..Pokholkova O.V..Bgatov A.V..Semeshin v.p., Umbetova G.H..Belyaeva E.S. Genetic interpretation of polytene chromosomes banding pattern//Molec.Biol.Reports. -1983. - 9. - P. 19-23.

19.Семешн В.Ф..Баричева Э.М.,Кимулёв И.Ф.Морфология и генетическая организация района 67В 3L хромосомы Drosophila melanogaster //Генетика. - 1984. - 20.& 5. - С.794-799.

20.Семешн В.Ф..Баричева Э.М. .Беляева Е.С.,Жимулёв И.Ф. Развитие пуфов политенных хромосом Droeophila melanogaster// Тезисы докладов УП Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра" - Пущине, 1984. - С. 59-60.

21.Баричева Э.М.,Семешин В.Ф. Электронно-микроскопическое исследование формирования некоторых пуфов зь хромос алы Drosophila melanogaster //Цитология.-1985.-27,М.-С.50-53.

22.Semeshin V.P.,Baricheva E.M..Belyaeva E.S..Zhimulev I.P. Electron microscopical analysis of Drosophila polytene

ohromoaomes.il.Development of complex puffs //Chromosome. - 1985. - 91, H 3/4. - P. 210-233.

23.Semeshin V.F..Baricheva E.M..Belyaeva E.S. .Zhimilev I.P. Electron microscopical analysis of Drosophila polytene chromosomes.III.' Mapping of puffs developing from one ' band//Chromosoma. - 1985. - 91, N 3/4. - P. 234-250.

24.Semeshin V.F.,ôzidonya J. EM mapping of rearrangements in the 24-25 sections of D.melanogaster 2L chromosome// Dros.Inform.Serv. - 1985. - v. 61. - P.148-154.

25.Semeshin V.P..Baricheva E.M..Belyaeva E.S.,Zhimulev I.P. Electron microscopical (Eli) analysis of puffing in Drosophila melanogaster polytene chromosomes/Abstracts of the 9th EDRC. Szeged, Hungary. - 1985. - P. 121.

26.Семешн В.Ф.,Беляева E.C..Жямулёв И.Ф.,Лис Дж.Т..Ричарде Де.,Боруа М. Картирование морфологических структур, возникающих при встраивании генетического материала в хромосомы дрозофилы//Генетика. - 1986. - 22, Ji9. - С.2220-2227.

27.Semeshin V.P..Belyaeva E.S..Zhimulev I.F.,Lis J.T., Richards G..Bourouis M. Electron microscopical analysis of Drosophila polytene chromosomes. IY. Mapping of morphological structures appearing аз a result of transformation of DliA sequences into chromo some s//Chr ото soma. -1986. - 93, H. - Г. 461-468.

28.Семешин В.Ф..Баричева Э.M..Беляева Е.С.,Жимулёв И.Ф. Электронно-микроскопический анализ развития экдизонзави-симых пуфов политенных хромосом дрозофилы/Д1атериалы УП Всесоюзного совещания эмбриологов "Закономерности индивидуального развития'живых организмов". - М.: Наука, 1986. - С.54. _

29.Семешин В.Ф.,Демаков С.А..Беляева Е.С.,Жимулёв И.Ф. Морфологическая характеристика трансформированного материала ДНК в составе полигенных хромосом дрозофилы//Тезисы -докладов УТ Всесоюзного симпозиума "Молекулярные механизмы генетических процессов'.' - M., 1987. - С.42-43.

30.Семешин В.Ф. Электронно-микроскопический анализ трансформированных районов политенных хромосом дрозофилы//Тезисы докладов 7 съезда ВОГиС. - M., 1987. - T.I. - С. 252. •

3IJBelyaeva E.S..Protopopov M.O.,Baricheva E.M.,Semeshin V.P., Izquierdo M.L..Zhimulev I.P. Cytogenetic analysis of region 2B3-4 - 2B11 of the X-chromosome of Drosophila melano-gaster. YI. Molecular and cytological mapping of the ecs locus and the 2B puff//Chromosome. - 1987. - 95, Я 4. -P. 295-ЗЮ.

32.Semeshin V.P.,Perez Alonao M. .Demakov S.A. EM analysis of Droeophila melanogaater polytene chromosome regions with inserted P element/Abstracts of the 10th EDRC, Barcelona, Spain. - 1987. - P. 234.

33.Bar±cheva E.M.,Semeshin V.P.,Zhimulev I.F.,Belyaeva E.S. Electron microscopical mapping of some puffs of Droaophi-la melanogaater polytene chromosomes//Dros. Inform.Serv.-1987. - 66. - P. 18-22.

34.Vlassova I.E.,Zhimulev I.F., Belyaeva E.S,,Semeshin V.F. The effect of DRB and «t -am an it in on the OTA synthesis "in Drosophila melanogaster polytene chrотоsomes//Drоs. Inform. Serv. - 1987. - 66. - P.151-154.

35.Semeshin V.F..Demakov S.A.,Perez Alonso II.,Belyaeva E.S., Bonner J.J.,Zhimulev I.P. Electron microscopical analysis of Drosophila polytene chromosomes.Y.Characteristics of structures formed by transposed ША segments of mobile elements//Chromosoiaa. - 1989. - 97, H 5. - P.396-412.

36.Семешин В.Ф..Кимулёв И.Ф. О правилах электронно-микроско-пическсго картирования политенных хромосом на давленных препаратах слюнных келез дрозофилы//Цитология. - 1989. -31, В 6. - С.728-731.

37.Семешн В.Ф.,Демаков С.А.,Кимулёв И.Ф. Характеристика структур политенных хромосом дрозофилы,образуемых транс-позируемыии фрагментами даК//Генетика. - 1989. - 25,й II. - С. 1968-1978.

38.Семешин В.Ф.,Демаков С.А.,Алонсо М.П.,Еимулёв И.Ф. Формирование меядасков из материала ДНК Р-элемента в политенных хромосомах дрозофилы//Генетика. - 1990. - 26,№ 3.