Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое картирование локусов качественных и количественных признаков у гороха

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое картирование локусов качественных и количественных признаков у гороха"

На правахрукописи

Чегамирза Киануш

Молекулярно-генетическое картирование локусов качественных и количественных признаков у гороха

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории генетики растений кафедры генетики Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор С. А. Гостимский Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ВЛ. Пухальский

кандидат биологических наук Ю.И. Долгих

Ведущая организация:

Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится " "_2004г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д.З. Факс: (095) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, по адресу: 119991, Москва, ул. Губкина, д.З.

Автореферат разослан " "_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ГЛ. Полухина

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Методы получения молекулярных маркеров, разработанные в последние десятилетия, позволили решить проблему недостатка морфологических маркеров, используемых для картирования в классической генетике [Tingey et al., 1992; Tanksley, 1993; Yuetal., 1995].

Наличие большого числа молекулярных маркеров, распределенных по всему геному, дает возможность эффективно картировать интересующие исследователей гены. Молекулярные маркеры позволяют избежать в генетическом анализе проблем, связанных с взаимодействием разных локусов [Tanksley, 1993; Yu et al., 1995]. При использовании данного подхода полностью исключаются эффекты, вызванные влиянием внешней среды [Newbury and Ford-Lloyd, 1993; Hahn et al., 1995].

Генетические карты, содержащие ДНК-маркеры, представляют собой мощные инструменты для генетических и селекционных исследований растений. Благодаря картам сцепления была облегчена характеристика количественных признаков и стало возможным идентифицировать районы генома, содержащие интересующие локусы, и оценить тип их действия на формирование фенотипа [Tanksley 1993].

Для изучения организации геномов растений генетики используют самые разные объекты, имеющие как чисто теоретическое значение (легкость проведения генетических исследований и хорошая изученность), так и практическое значение (важность для сельскохозяйственного использования). К таким, широко используемым генетическим объектам можно отнести и горох посевной.

Горох посевной (Pisum sativum L.) является важной сельскохозяйственной культурой и удобной моделью для генетических исследований. Горох выращивается как продовольственная и как кормовая культура. Главными проблемами выращивания гороха, как производственной культуры, считаются относительно низкий и изменчивый урожай, а также трудности, возникающие при уборке урожая [Hedley and Ambrose, 1985]. Значительный морфологический полиморфизм гороха обеспечил достаточное количество маркеров для первых генетических исследований и заложил основы построения первых генетических карт [Blixt, 1974].

В настоящее время опубликованы карты хромосом гороха, содержащие молекулярные маркеры (Ellis et al., 1993; Laucou et al.,1998). Благодаря использованию общих маркеров удалось создать «консенсусную» карту хромосом [Weeden et al.,1998], объединившую морфологические и молекулярные локусы. Небольшое число работ по

картированию QTL с применением

изучению веса семян (Timmerman-Vaughan et al., 1996], высоты и числа узлов [Irzykowska et al., 2002] и устойчивости к болезням [Timmerman-Vaughan et al., 2002; Pilet-Nayel et al., 2002]. Однако, детальная карта хромосом гороха еще не создана, и требуется дополнительный поиск новых морфологических и молекулярных маркеров и их локализация.

Цель и задачи исследования. Таким образом, все вышесказанное свидетельствует, что процесс генетического картирования у гороха ведется интенсивно, но требует дополнительных исследований. В связи с этим нами была предпринята работа, целью которой являлся поиск и идентификация новых молекулярных маркеров с помощью RAPD-, ISSR-, SCAR- и CAPS-методов, и создание генетической карты для локализации локусов важных качественных и количественных признаков гороха. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать новые молекулярные маркеры в геноме гороха.

2. Создать генетические карты сцепления гороха для двух скрещиваний (WL1238 х Chi115) и (WL1238 х Флагман).

3. С помощью молекулярных маркеров точно локализовать гены важных качественных физиологических признаков chill5, deh, xal8 и 6 SCAR-маркеров.

4. Выявить и картировать локусы количественных признаков (QTL), используя созданные карты групп сцепления гороха.

5. Сравнить созданные генетические карты сцепления друг с другом и ранее опубликованными картами гороха.

Научная новизна.

1. Выявлены новые полиморфные RAPD и ISSR-фрагменты генома гороха, использованные для построения детальных молекулярно-генетических карт хромосом.

2. Впервые в России с помощью RAPD, ISSR, SCAR и CAPS-маркеров созданы подробные карты групп сцепления гороха для двух скрещиваний. Созданные карты включают 202 маркера со средним расстоянием между маркерами около 10 сМ. Общая длина карт составляет 1262 и 1008 сМ. Эти карты в дальнейшем могут быть использованы для молекулярно-генетических исследований генома гороха.

3. Представленные карты групп сцепления гороха по насыщенности маркерами не уступают ранее созданным картам (Laucou et.al. 1998, Irzykowska et al., 2001) и позволяют вести успешную работу по локализации новых важных локусов качественных и количественных признаков гороха.

4. С помощью созданных генетических карт впервые точно локализованы на хромосомах гороха новые гены, влияющие на формирование фотосинтетического аппарата (chill5 и ха18) и ген, определяющий структуру стебля и соцветий (deh).

5. На основе построенных карт впервые в России идентифицированы и локализованы локусы количественных признаков (QTL), определяющие высоту растений, длину междоузлий, число семян, число бобов, размер семян и вес семян.

Научно-практическая значимость. Полученные результаты вносят важный вклад в изучение генома гороха и создают предпосылки для быстрой и точной локализации на хромосомах новых генов качественных и количественных признаков. Создание детальных молекулярно-генетических карт гороха облегчает возможность использования молекулярных маркеров в селекционных исследованиях и открывает возможность для выявления, клонирования и секвенирования генов, определяющих формирование сложных физиологических и морфологических признаков высших растений. Полученные данные по картированию молекулярных маркеров гороха могут быть использованы в учебной работе со студентами для демонстрации. эффективности ДНК-маркеров в картировании генома растений.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на 2-ой международной Ирано-Российской конференции "Сельское хозяйство и природные ресурсы" (МСХА, Москва, 2001); Конференции, посвященной 100-летию со дня рожденя А.Р. Жебрака и 70-летию образования генетики в Московской сельскохозяйственной академии имени КА. Тимирязева (Москва, 2002); Workshop "Application of Molecular Markers in Plants Studies". (Warsaw, Poland, 2002); 3-ей международной Ирано-Российской конференции "Сельское хозяйство и природные ресурсы" (МСХА, Москва, 2002); Sixth Iranian International Statistics Conference (Tehran, Iran, 2002); 9th Iranian Student Seminar in Europe, ISS (Birmingham, Uk., 2002); Conference on Applied Statistics in Agriculture (Kansas State University, USA, 2003); IV международной конференции "Геном растений" (Одесса, Украина, 2003); конференции, посвященной 100-летию начала научной селекции в России (МСХА, Москва, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, а также выводов и списка

литературы. Работа изложена на.....страницах машинописного текста, включая......

таблиц и ... .рисунок. Список литературы включает......наименования.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 01-04-48080,04-0448956) и научно-исследовательской программы "Геном растений".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исходный материал. Скрещивали мутант "Chi 115" и сорт "Флагман" (в качестве материнских растений) с маркерной линией "WL1238" (в качестве отцовских растений). Две популяции Fj (WL1238 х СЫ115) и (WL1238 х Флагман), состоящие из 223 и 147 индивидуальных растений, соответственно, получили путем самоопыления гибридов первого поколения. Растения всех поколений выращивали в полевых условиях. Выделение ДНК гороха для ПЦР-анализа. ДНК выделяли из свежих листьев методом, описанным Moller и сотрудниками [Moller et al., 1992] с незначительными модификациями. Концентрацию ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1 %-ном агарозном геле относительно контроля.

Амплификация ДНК. Для идентификации ДНК-маркеров использовали RAPD и ISSR методы с применением 46 RAPD и 10 ISSR-праймеров. Геномную ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР с RAPD и ISSR-праймерами. Для обозначения полиморфных ДНК-маркеров применяли название праймера и длину соответствующего фрагмента ДНК (например, маркер К10#950 выявлен в спектре продуктов ПЦР с праймером К10 как фрагмент длиной 950 п.н.).

Амплификацию проводили в приборе МС2 производства фирмы «ДНК-Технология». Конечный объем реакционной смеси составлял 20 мкл и содержал 5 мкл раствора ДНК, 1.5 ед. Taq-полимеразы (Силекс М.), 250 мкМ каждого дНТФ (Силекс М.), 0.2 мкМ праймера и 2 мкл 10х стандартного ПЦР-буфера (Силекс М.). Смесь доводили деионгоированной водой до 20 мкл. Для предотвращения испарения амплификационной смеси использовали 20 мкл минерального масла (Sigma).

Параметры амплификации были следующими: 94° в течение 1.5 мин, 5 циклов (20 сек денатурация при 94°, 5 сек отжиг при 34-42°, 10 сек синтез при 71°) и 35 циклов (1 сек денатурация при 94°, 5 сек отжиг при 34-42°, 10 сек синтез при 72°). Температуры отжига подбирались для каждого праймера эмпирически.

Продукты амплификации (10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле (Biotechnology Grade, USA) с бромистым этидием в ТВЕ-буфере. Для определения длины фрагментов использовали маркеры 123 bp DNA ladder, 100 bp DNA ladder ("Life Technology"), 1.5Kb-100 bp DNA ladder ("Сибэгоим"), 1 Kb DNA ladder (Gibco BRL) и 1 Kb DNA ladder (MBI Fermentas). После электрофореза гели анализировали в УФ свете и фотографировали на пленку Микрат-300.

Амплификацию с 10 ISSR-праймерами проводили по схеме, приведенной для RAPD-анализа, но параметры амплификации несколько отличались.

Амплификацию ДНК со SCAR-праймерами проводили в реахционной смеси объемом 20мкл, содержащей те же компоненты, что и в случае RAPD-метода, за тем исключением, что в каждой ПЦР-реакции использовали вместо одного короткого RAPD-праймера два протяженных праймера размером от 18 до 23пн в концентрации 0.3 мкМ каждый. Были использованы программы с разной ton, (от 56 до 69°С) и с разным количеством циклов третьей ступени п (от 25 до 40). Температуру отжига каждой пары праймеров оптимизировали экспериментально.

Амплификацию с 2 AP-PCR-праймерами (с последовательностью 5'-3' АРК1: TGG GGT GAA TCA TGG GAA CG, APK2: GAT TGG GTT CAC GGC АТТ ТА) проводили по схеме, приведенной для RAPD-анализа, но параметры амплификации немного отличались.

Последовательности праймеров для STS-маркеров Сор-1, Sodmt, TubAl, Rb, CipPor, Ssyn, Rpl22, Hop-1, Gsn-1 и ivdh были взяты из работы Brauner и сотрудников [Brauner et al., 2002]. Поиск, полиморфизма между ампликонами из родительских линий осуществлялся путем обработки различными 4-основными эндонуклеазами рестрикции (TaqI, Rsal, BstENII, BstFNI, Hinfl, AspLEI, Tru9I, Hpall, Haelll, Sse9I, AIuI) или путем прямого секвенирования очищенных ПЦР-продуктов.

Амплификацию с STS-праймерами проводили по схеме, приведенной для RAPD-анализа, но параметры амплификации немного различались.

Температуры для STS-праймеров соответствовали описанным Brauner и сотрудниками [Brauner et al. 2002].

Выделение фрагментов из геля. Фрагмент ДНК, обозначенный STS-фрагмент, препаративно выделяли из 2% агарозного геля и очищали с использованием набора "QIAEX П Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Germany).

Массовый сегрегационный анализ. Первоначальный поиск сцепления с интересующим геном велся путем массового сегрегационного анализа (bulked segregant analysis, BSA) [Michelmore et al., 1991]. Массовый сегрегационный анализ проводили на сегрегирующих популяциях Fî (WL1238 x Chi115) и (WL1238 x Флагман). Сцепление подтверждалось на основе анализа RAPD- и ISSR-методами ДНК индивидуальных растений F2 популяции. Полевые эксперименты. Для анализа коэффициентов путей данные были получены из экспериментов, проводимых в течение 2002 г. на Звенигородской биостанции Московского Государственного Университета. Для этого изучения использовали экспериментальный статистический план - полный рандомизированный блок с четырьмя повторениями. Десять растений в каждом повторении были случайно отобраны и

измерены следующие количественные признаки (компоненты урожая гороха): число семян, размер семян, число семян в одном бобе, число бобов, число узлов, длина междоузлий и высота растения.

Для анализа средних значений в ряду поколений (Generation mean analysis), скрещивали растения LW1238 (Pi) и Chilli^)» затем растения Fi выращивали для получения F2 и беккроссов (BCjPi и ВСЛ)- Полученные поколения выращивали в рамках плана полного рандомизированного блока с четырьмя повторениями в 2002 г. Анализ количественных признаков. Для статистического анализа использовали средние значения признаков на опытных делянках. Данные анализировали при помощи статистического пакета "SPSS for Windows 10". Путевой анализ (анализ коэффициентов путей) был сделан с данными на первичных, вторичных и третичных уровнях компонентов урожая.

Анализ средних значений в ряду поколений. Анализ средних значений признаков в ряду поколений был проведен по данным числа семян, числа бобов и высоты растения, с использованием модели, описанной Мазером и Джинксом [Mather and Jinks, 1977 and 1982]. Данные были проанализированы на основании индивидуальных растений при помощи компьютерной программы SPSS. Модель Мазера и Джинкса учитывает следующие показатели: среднюю величину родителей (т), аддитивные эффекты (а), доминантные эффекты (d), аддитивные х аддитивные (i), аддитивные х доминантные (j), доминантные х доминантные (1). Для анализа наследования была подобрана модель с шестью параметрами [Mather and Jinks, 1982].

Коэффициент наследуемости в широком смысле (НЬ) был рассчитан, используя метод компонентов дисперсии [Wright, 1968]. Коэффициент наследуемости в узком смысле (Нп) был рассчитан с использованием метода беккросса, описанного Варнером [Warner, 1952].

Анализ сцеплепия. Обработку данных по расщеплению и расчет генетических расстояний проводили с помощью пакета MapMaker/EXP 3.0 [Lincoln et al., 1992] с порогом LOD > 3.0 и максимальной длиной 50 сМ. Соответствие экспериментальных данных кодоминантному расщеплению (1:2:1) или доминантному (3:1) проверяли методом Д^-квадрат.

Картирование локусов количественных признаков (QTL). Картирование QTL проводили методом интервального картирования при помощи компьютерной программы МарМакег/QTL 1.1 (Lincoln et al., 1993). Величина числа LOD ассоциации между генотипом и количественными данными была

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Отбор линий

Родительские линии для скрещиваний были отобраны на основании различий, как по качественным, так и по количественным признакам. Мутант Chil 15 был выделен в результате обработки семян сорта Торсдаг химическим мутагеном этилметансульфонатом (ЭМС) и характеризовался бледно-зеленой окраской листьев. Сорт Флагман, несущий рецессивный алель гена deh, имел детерминантный тип стебля [Яковлев, 1992]. Мутация гена deh широко используется в селекции гороха для создания новых сортов, характеризующихся более- ранним и дружным созреванием бобов. Отцовская родительская линия WL1238 представляет собой тестерную линию, несущую большое число морфологических маркеров и широко используемую в генетических исследованиях.

2. Выявление молекулярных маркеров в ДНК гороха

С целью выявления полиморфных молекулярных фрагментов было проведено исследование RAPD, AP-PCR и ISSR-методами ДНК трех генотипов (WL1238, Chi115 и Флагман) с использованием 46 RAPD-праймеров, 10 ISSR-праймеров и 2 AP-PCR-праймера. Все эти праймеры, при применении их в ПЦР, оказались эффективными, и размеры выявляемых ими фрагментов находились в пределах от ISO до 1800 пн.

При анализе ДНК трех родительских генотипов гороха, наряду с наличием общих ампликонов были обнаружены полиморфные фрагменты, присутствующие в одном и отсутствующие у другого родителя (рис.1). Основным тестом надежности и достоверности молекулярных маркеров является их способность наследоваться из поколения в поколение. Для подтверждения наследуемости выбранных молекулярных маркеров были исследованы гибриды первого и второго поколения от двух скрещиваний. Полиморфные фрагменты присутствовали в гибридах Для определения характера наследования фрагментов и проверки гипотезы о случайпости отклонения от соотношения 3 : 1 было посчитано значение В F2 расщепление по выбранным фрагментам достоверно не отличалось от менделевского соотношения 3:1.

Таким образом, было показано, что исследуемые фрагменты являются доминантными и наследуются в соответствии с законами Менделя, что согласуется с литературными данными [Waugh and Powell, 1992; Tingey, et al., 1992]. Следовательно, выбранные фрагменты являются надежными маркерами и могут быть использованы в дальнейшей работе, особенно, в генетическом картировании.

3. Идентификация и локализация гена chill5 и сцепленных с ним ДНК-маркеров

Анализ расщепления по морфологическим признакам в скрещивании мутанта гороха chill5 и маркерной линии WL1238 показал, что гибридные растения Fi имели фенотип

s

дикого типа. В расщепляющейся популяции F2 мутация СЫ115 и исследуемые ДНК-маркеры давали менделевские расщепления 3:1 с параметром не превышающим критическое значение для уровня достоверности 0.95. Исходя из полученных данных, была выдвинута гипотеза о моногенной рецессивной природе мутации ch.il15 и предложен символ соответствующего гена Chi115. Для локализации нового гена было изучено расщепление в популяции F2 по 12 маркерным морфологическим признакам, определяемым генами из разных групп сцепления. Сцепление между геном chill5 и генами морфологических признаков обнаружено не было. На следующем этапе работы для локализации этой мутации использовали RAPD, ISSR и CAPS-маркеры.

Для поиска ДНК-маркеров, сцепленных с геном chilis, первоначально был использован метод массового сегрегационного анализа с 46 RAPD- и 10 ISSR-праймерами. Проведенное исследование позволило выявить 3 RAPD-маркера, тесно сцепленных с геном chillS(D6#550, К1Ш30 и kI0#950). Еще 9 RAPD и 2 ISSR-маркера выявлены в результате исследования ДНК 130 индивидуальных растений F2 (рис. 1) Таким образом, в результате генетического анализа расщепляющейся популяции F2 было отобрано 12 RAPD- и 2 ISSR-маркера, сцепленных с геном chill5. Обработка полученных данных в компьютерной программе Mapmaker/EXP 3.0 с порогом LOD > 3.0 позволила построить генетическую карту изученного района (рис. 2).

Ml 234 56 789 10 11 12

Рис. 1. RAPD-анализ расщепляющейся популяции Fj по маркерам К10#950 и Кю#830 М. 100-п н. маркер длин ДНК; родительские линии WL1238 (1, 2) и Chi 115 (3, 4); гомозиготы по доминантному аллелю (5,6 и 7); гетерозиготы (8 и 9), гомозиготы по рецессивному аллелю (10,11 и 12).

Генетический анализ полученных данных выявил в районе гена chill5 десять RAPD-, два SCAR- и два ISSR-маркера (рис. 2). RAPD-маркеры К10#830 и К10#950 оказались локализованы близко от гена chill5, на расстояниях от него около 5.4 и 11.6 сМ, соответственно. Остальные RAPD-маркеры РгШЗбО, В318#420, К10#300, QR2#350, ЕШ900, Е16Я530 и R12#340, локализованы на расстояниях 10.1, 24.9, 14 6, 0 1, 2 8, 3.8 и

5.3 сМ друг от друга, соответственно, с той же стороны от екШ5, что и ИАРВ-маркер К10#950. Три ИАРБ-маркера Б6#550, Р1390#1200 и дш#590 расположены, на относительных расстояниях 6.3,33.2 и 20.2 сМ друг от друга с другой стороны гена екШ5 (рис.2).

Два тесно сцепленных RAPD-маркера К10#830 и К10#950, вошедших в скрещивание в состоянии отталкивания, в совокупности могут быть использованы как кодоминантный маркер, идентифицирующий гетерозиготный генотип (рис. 1). ISSR-маркеры М1Ш200 и М9#480 картированы очень близко к RAPD-маркерам Е16#900 и R12#340, соответственно. Таким образом, найдено 14 RAPD и ISSR-маркеров, сцепленных с геном chillS гороха. Все маркеры, кроме D6#550, Р1390#1200, К10#950, Рг10#360, К10#300, и R12#340 находятся в фазе отталкивания с доминантным аллелем гена chillS.

При понижении порога LOD-балла до 2.00 ряд сцепленных с геном chill5 ДНК-маркеров оказался связан с маркерным геном Ь, находящимся в III группе сцепления и определяющим окраску цветка [Weeden et al., 1998]. Для доказательства предположения о принадлежности маркеров к Ш группе сцепления были использованы три STS-маркера,

локализованные ранее в данной хромосоме [Brauner et al., 2002]. Для этих маркеров (Sodmt, TubAl и Rb) был выявлен полиморфизм, соответственно, по сайтам рестриктаз Ksp22I, TaqI и Rsal. Подтвержден кодоминаитный тал наследования данных маркеров (рис. 3). Полученные данные о расщеплении CAPS-маркеров использованы в генетическом анализе популяции гибридов F2. По результатам анализа показано сцепление всех трех маркеров с геном chilis и двух из них (Rb и TubAl) между собой (рис. 2 и рис. 4).

1 2 3 4 5 6 7 9 9 10 11 12 13 14 1» М

Рис. 3. САРБ-полиморфизм, выявляемый при обработке амплифицированного фрагмента ТиЬА1 эндонукпеазой рестрикции Тац1.1,2- родительские линии А&Ъ1238 и СЫ115, соответственно, 3-15 - гибриды Ру, М 100-п н. маркер длин ДНК.

Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что ген Chi115 картирован в верхнем плече III группы сцепления и может быть нанесен на генетическую карту хромосом гороха.

Два RAPD-маркера D6#550 и К10#950, тесно сцепленных с геном chill5, ранее были превращены в нашей лаборатории в SCAR-маркеры (Ковеза, 2003). Полученные SCAR-маркеры были использованы в этой же работе, и наследовались так же, как и исходные RAPD, по доминантному типу. Для изучения наследования SCAR-маркеров во втором поколении были использованы те же самые индивидуальные растения F2, на которых изучалось наследование исходных RAPD-фрагментов. SCAR-маркеры присутствовали в ДНК тех же самых растений, что и исходные RAPD-маркеры.

Таким образом, нами локализованы SCAR-маркеры, которые дальше называются SD6#550 и SK10#950, сцепленные с доминантным аллелем гена Chi115 в Ш группе сцепления гороха. Картированные SCAR-маркеры SD6#550 и SK10#950 могут быть использованы в качестве якорных маркеров в дальнейших исследованиях.

Идентификация и использование в данной работе новых молекулярных маркеров позволили локализовать их в определенном районе одной из хромосом гороха, который охватывает около 137,6 сМ. В этом районе нам удалось идентифицировать новый ген,

обуславливающий хлорофильную недостаточность, 12 RAPD- и 2ISSR -маркера. Среднее расстояние между идентифицированными маркерами составляет около 8,1 сМ. 4. Локализация гена deh с помощью молекулярных маркеров

Для локализации гена deh сорт Флагман, несущий это ген, скрещивали с маркерной линией WL1238. Анализ расщепления по морфологическим признакам в скрещивании сорта Флагман и маркерпой линии WL1238 показал, что гибридные растения Fi имели недетерминантный тип стебля. Было проведено исследование 147 растений популяции Fj (Флагман х WL123 8). Генетический анализ гибридов F2 показал моногенную природу гена deh с расщеплением 3:1 (116:31,.Х* = 1.2).

Для локализации этого гена было изучено расщепление в популяции F2 по 7 STS-маркерам и 13 маркерным морфологическим признакам, определяемым генами из разных групп сцепления. Эти морфологические и молекулярные маркеры были использованы в качестве якорных локусов для привязки новых локусов (молекулярных или морфологических) к конкретным хромосомам гороха. Показано, что расщепление доминантных признаков (маркеров) и кодоминантаых STS-маркеров существенно не отклонялось от 3:1 и 1:2:1, соответственно.

При помощи компьютерной программы Mapmaker/EXP 3.0 с порогом LOD > 3.0, сцепление между геном deh и морфологическими и STS-маркерами обнаружено не было.

Для дальнейшего картирования данного гена и идентификации ДНК-маркеров, сцепленных с геном deh, использовали RAPD, AP-PCR и ISSR-методы с применением 46 RAPD- и 10 ISSR-праймеров. Первоначальный поиск сцепления велся путем массового сегрегационного анализа. В результате массового сегрегационного анализа и анализа индивидуальных растений расщепляющейся популяции Fj (WL1238 х Флагман) обнаружены и картированы 2 RAPD-маркера, сцепленных в фазе притяжения с геном deh.

Анализ сцепления показал, что RAPD-маркер 1#400 находится между геном deh и RAPD-маркером Q20#1480. Расстояния между геном deh и сцепленными с ним фрагментами определены как 20.6 и 20.7 сМ, соответственно (рис. 5).

При понижении порога LOD-балла до 2.50 обнаружено сцепление картированного участка хромосомы, содержащего ген deh, с CAPS-маркером TubAI, находящимся в Ш группе сцепления [Brauner et al., 2002]. Рассчитаны генетические расстояния между молекулярными маркерами и геном deh, с которым они сцеплены с порогом LOD = 2.5.

Один RAPD-маркер (Р474#470), который ранее в нашей лаборатории был превращен в SCAR-маркер, попал в группу молекулярных маркеров, сцепленных с CAPS-маркером TubAI, находящимся в III группе сцепления гороха (рис. 5). Изучено наследование этого SCAR-маркера в первом и втором поколениях. Показало, что данный SCAR-маркер,

подобно исходному ИАРБ-маркеру, является доминантным и наследуется в соответствии с законами Менделя. Таким образом, удалось картировать 8САК-маркер, полученный из ИАРБ-маркера Р474#470 (дальше называется 8САЯ-марксром 8Р474#470). Новый локализованный 8САК-маркер может быть использован в качестве якорного локуса в исследованиях по картированию новых генов.

Неудача с локализацией генов ^115 и deh без молекулярных маркеров демонстрирует трудности, возникающие при использовании в работе по картированию только морфологических маркеров, и указывает на необходимость и эффективность применения молекулярных маркеров в современном генетическом анализе. 5. Картирование SCAR-маркера, сцепленного с геном ха18у гороха

Мутация ха18 была получена на кафедре генетики и селекции МГУ путем обработки семян гороха сорта Ранний зеленый химическим мутагеном - этилметансульфонатом [Ежова и Гостимский, 1979]. ха18 - хлорофильная полудоминантная мутация, в гомозиготе детальна. Гомозиготные по данной мутации проростки имеют кремово-желтый цвет. Гетерозиготы имеют недостаток хлорофилла и желто-зеленую окраску. С целью локализации данного гена желто-зеленые мутантные растения скрещивали с маркерной линии WL84 [Ковеза, 2003]. Анализ расщепления в популяциях Рг по морфологическим маркерам не выявил сцепления между геном и маркерными

генами морфологических маркеров. При использовании массового сегрегационного анализа был найден ИАРБ-маркер У03#800, сцепленный с геном ха18. Расстояние между геном ха!8 и 8САЯ-маркером У03#800, полученным из ИАРБ-маркера У03#800, составило около 0.0 сМ. Однако сам ген ха18 не удалось локализовать [Ковеза, 2003].

Поскольку 8САЯ-маркеры являются более надежным типом маркеров по сравнению с ИАРБ-маркерамя, в данной работе с целью картирования гена ха18, была произведена попытка найти молекулярные маркеры сцепленные со 8САЯ-маркером У03#800. Для обнаружения молекулярных маркеров, сцепленных со 8САЯ-маркером У03#800, было проведено исследование популяции Иг (WL1238 * Флагман) методами ИАРБ, и АР-РСЯ. Анализ сцепления с помощью компьютерной программы Мартакег/ЕХР 3.0 с порогом L0D > 3.0 показал, что 8САК-маркер У03#800 был сцеплен с ИАРБ-маркером Р10#340 и 8Т8-маркером Fed-1 (рис. 5). RAPD-маркер Р10#340 и 8Т8-маркер Fed-1 расположены близко от SCAR-маркера У03#800 на расстояниях от него около 8.2 и 22 сМ, соответственно. В последней консенсусной карте хромосом гороха ^еес!еп е! а1., 1998] ген Рей-1 находится в верхнем конце Ш группы сцепления. Однако, при понижении порога L0D до 2.7 полученный нами участок, содержащий молекулярные маркеры (SCAR-маркер У03#800, RAPD-маркер Р10#340 и STS-маркер Fed-1), обнаружил

сцепление с геном JI, находящимся в VI группе сцепления гороха. Необходимо отметить, что ген Fed-J в предыдущей консенсусной карте хромосом гороха (http://pisum.bionet.nsc.ru/peamap/peamap.gif; 1995) был локализован в том же месте (в нижнем конце VI группы сцепления), где расположили его мы.

Полученный результат показывает важность использования в генетических исследованиях воспроизводимых молекулярных маркеров, особенно SCAR-маркеров, которые надежно выявляют простые электрофоретические спектры. SCAR-маркеры могут также служить связующим звеном между физической и генетической картами хромосом. 6. Создание генетических карт сцепления гороха

Идентификация новых молекулярных маркеров, полученных на основе 1ЩР (RAPD, AP-PCR и ISSR), дала возможность создать карту хромосом, основанную на генетическом анализе расщеплений в двух изученных скрещиваниях (WL1238 * Chi 115) и (WL1238 х Флагман). Предварительный поиск молекулярных маркеров, сцепленных с классическими генами гороха, осуществлялся с помощью массового сегрегационного анализа.

Полученные полиморфные маркеры в популяции F2 (WL1238 xChi115) включали 92 RAPD, 20 ISSR; 5 AP-PCR-, 4 SCAR, 8 CAPS-маркеров и 13 морфологических признаков. CAPS и классические морфологические маркеры использовали в качестве якорных локусов для привязки новых молекулярных маркеров к конкретным группам сцепления гороха. После анализа сцепления при помощи компьютерной программы Mapmaker/EXP 3.0 с порогом LOD >3.0 для скрещивания (WL1238 x Chi115) была создана генетическая карта сцепления, состоящая преимущественно из RAPD и ISSR-маркеров^ Карта сцепления имела размер 1262 сМ со средним расстоянием между маркерами 12.6 сМ, и включала в свой состав 100 маркеров. Причем около 46 % интервалов карты были короче 10 сМ и только 17 % интервалов оказались длиннее, чем 25 сМ. Для исследуемого скрещивания было определено 12 районов сцепления, и 10 из них были расположены в известных группах сцепления гороха, а положение двух остальных участков пока неизвестно (рис. 4).

SCAR-маркер SP10#800, полученный Ковезой в нашей лаборатории, локализован между CAPS-маркером Gsn-1 и RAPD-маркером V#1500 в седьмой группе сцепления для скрещивания (WL1238 xChi115). Это - новый SCAR-маркер, который может быть использован в качестве якорного маркера в дальнейших исследованиях.

В популяции F2 (WL1238 х флагман) обнаружено 149 полиморфных маркеров (103 RAPD, 18 ISSR, 5 AP-PCR-, 3 SCAR, 6 CAPS-маркеров и 14 морфологических маркеров), идентифицированных с помощью массового. сегрегационного анализа и изучения индивидуальных растений

LGI

АРКШ20 2«- №K1#390

UliW 07 ■ ' П03#400 11 O.C*

е.б

20.4 '•» : :

COP-1

D6#14Q0

• об#ега

7.3

. I

■ Q20#900

LGII - 0s#280

27 I

, . J. V03#600 if- V20#II00 0 . . D6#790 R12#630

28.8

LGI

LG IV

. . LeM480 CMUOO

Mt#620 PI 390-1000

6.7

96

14.4 ,„ + RU#340 Rt 1*1050

29.7

. . CH2#350 B-4 V#530

23/1

12.5 02*

33.2

6.3** **

6.4 6.2

1.3*

24.9

14.6 if' ,e3B 5.3 4.7

11.0

23.3

19.7

37.4 *

26 0 *

17.7

ORI»590 Rb

ПМ1

P1390#1200

SDó#550Q4Mj Chl11S 0 а

K!0í630 I

SK10#950

Ssyn

Sodmi P10#360

T

K10#30Q

TÎS«00M1,#,î00 E16#S30 R12#340 M9#4B0

M9#440 P1386 2 W?1

4.0 13.7

ке #420

w>

5521

0.3. ISO

B31B#390 P1390-1400

OP04#650

QR1 #690 В

QR2#1000 1*1200

LG V *

пл.

37.1

50.3

LG VI

34.6

ЗЛ 14.6

l.l

10.3

11.5 18 2

V20#900

>313*150 XI5*800

02034403

Hl 1*480

R06HI00

M9#230

M?#4!0

м,„5оНа2»53

Ha3Sa2

22.7

3.7* f 3 ' " Te

LG VII

s.s **

26.6

R03#220 Hg4

V#1500

spio#eoo

Unrec. 1

. - OR2*3(JO

13Л

■ - M6«i3oa . . U*>#1000

я я . - t«» iuuj

2 e**- ■ SLeb#1500 20.4

■ ■ P1390 200

132

Gm-1

.. 020*600 Hg5

2.0 . ■ 9.6

• • V#I200

4 9 ' • D6#UOO NkO Wg4 *Y Ml#570 -

19.9

- - V20*S20

Unrec. 2

. . Ml #650

11.4

. - pio#sbo

/4*1*110 015*550

IM

Hg6

- WO «500

. - QR1*500

Рис. 4. Генетическая карта сцепления, полученная для скрещивания (WL1238 * Chili5) гороха. * Якорные локусы; ** Новые картированные локусы. hg, npd, nsd, ssz и wg QTL для высоты, числа бобов, числа семян, размера семян и Веса семян, соответственно.

Карта сцепления, построенная на основе анализа скрещивания (WL1238 х Флагман), включала в себя 102 маркера и приблизительный размер ее составлял 1008 сМ со средним расстоянием между маркерами 9.9 сМ. Около 46 % интервалов карты были короче 10 сМ и только 12 % интервалов оказались длиннее 25 сМ. Данная карта содержала 13 сцепленных участков, соответствующих известным группам сцепления гороха, а положение двух участков остается неизвестным (рис. 5).

Создание насыщенных генетических карт гороха служит основой для планирования прикладных генетических и селекционных исследований с важнейшими сельскохозяйственными культурами. Использование молекулярных маркеров в тонком генетическом картировании хромосом гороха даст возможность совместить молекулярные и генетические карты и подойти к клонированию и секвенированию отдельных генов гороха, определяющих хозяйственно значимые признаки. 7. Сравнение карт сцепления гороха, построенных для двух скрещиваний

Целью настаящей работы было не только создание еще одной карты сцепления с новыми маркерами, но и объединение ее с другими картами сцепления гороха, опубликованными ранее [Weeden et al., 1998; Laucou et al. 1998; Brauner et al, 2002]. По сравнению с опубликованной обобщенной картой мы обнаружат общее увеличение генетических расстояний между отобранными якорными маркерами в данных скрещиваниях (рис. 4,5 и Weeden et al., 1998; Brauner et al., 2002).

В построенных картах наблюдали неравномерное распределение районов рекомбинации. Можно предположить, что рекомбинация чаще всего происходит в участках расположения структурных генов [Gill et al., 1996].

Основные маркеры, использованные для сравнения групп сцепления, это - маркеры, отобранные в качестве якорных локусов и присутствующие в обеих построенных картах. Порядок расположения якорных маркеров и общих молекулярных маркеров в изученных скрещиваниях остается неизменным. Таким образом, можно сделать вывод, что порядок расположения молекулярных маркеров в группах сцепления, характереный для генома гороха, сохраняется при исследовании разных линий.

Кроме известных групп сцепления в каждом скрещивании были получены по две неопознанных группы. В скрещивании (WL1238 x Chi115) первая неизвестная группа (Unrecognized group I, Unrec.l) содержит 9 маркеров (5 RAPD, 3ISSR и 1 SCAR), а вторая 3 маркера (1 RAPD, I AP-PCR и 1 ISSR). Новый SCAR-маркер SLeb#1500 находится в первой неизвестной группе. В скрещивании (WL1238 х Флагман) две неизвестных группы содержат 6 маркеров (4 RAPD и 2 ISSR-маркера). В диссертации описаны результаты сравнения каждой из семи известных групп сцепления.

164

64 ' 00 7.4 00 * КЗ 3.3

12.5

18.2

196 6.0 13.6 20.5

\ГОЗ#250 ¥#700

АРМ #390

К8#800

У03#740

Й03#650

Сор-1

М2«400

АЖ2#630

АЕ13#150

имьоа

К8#600 ОР04#450

£164350 У1#450

1/311

■лз'боо

06#790

13.» 3.4 10.3

1012 а7 11.9

05#950

\Ш40 И12#650 АЕ13#430 О5#1100

ОП24540 №#1450

Р10#140

1ео#|аоо

24.0 *

17.3

Нд1

УЛ> 8

1.6111

0.1 20.6 • *4- ОеЬ

в20#1480 1#400 Мд2 Мр<)1Г

VI« 730

10 V

и© VI

1.6 VII

ипгес. 1

6.3 во

50 |

».о *

33.2 10.4

**

16.7

АЕ13#980 МЛ1

К10#750 Р10#360

0201)15»] М1*500

Бзуп

е.7

8.7

*

6.8 *

16.1 16 2

М4#1400

НдЗ

М2#300

020*1100 02041200 К

+ И

020*420 Е16С180

Пр<)2 83184150 .

5Р474#470 ке#9оо

4- Р10#280

11.« 48 87

86 <2.2

ОМ #240

М1141000 Ь 1)064620 СР044600

1Х15#350 1еЬ#!300

ПрА22 |?11 #490

У03#150

21.7

34 8

10.6

43' 01

15,0 31Л

И

11 ороа#38с№« 1 л1-3 : : АРК1 #250 П 7.9 1#750 Н

46*- ер и

Мп<)1 27.4

138

+ ГеО-1

+ Р10#340

32 8

10.5 105

** 4- $юз#воо а.«

(Ю18)

МП #320

4- СП2#1000

* ОрРог

Рис. 5. Генетическая карта сцепления, полученная для скрещивания (\VLI238 * Флагман). * Якорные локусы; •* Новые картированные локусы. ¡лШ(1, пр<1, п*1, 532 и ОТЬ для высоты, длины междоузлии, числа бобов, числа семян, размера семян и Веса семян, соответственно.

9.6 14.3

Х15#370

№#1200 ОР04#350

Р12#1250

^Ц2#300 М1#600 Р10#550

+ 8318#в<Х>

• • 06#1000

- СЖ24850 • М18#380 ■ ■ 050/600

К06#8С0 К10#1200

VI #1700

ипгес. 2

5.) ' 2.в:

МП #420

. Р474#490 . М9#250

0204520

13.1

* 4- мл 90 1 СТ1#500 Но5

22.6

V 1#500

8. Изучение взаимосвязей компонентов урожая гороха

Для изучения взаимосвязей компонентов урожая и определения относительной важности этих компонентов в формировании конечного урожая гороха (вес семян), был проведен анализ коэффициентов путей компонентов урожая гороха (высота, число узлов, число семян, число бобов, число семян в одном бобе и размер семян).

Анализ коэффициентов путей показал, что среди первичных компонентов урожая (число семян и размер семян), число семян имело больший прямой эффект на урожай, чем размер семян (рис. 6). Размер семян существенно не коррелировал с урожаем. Число семян имело небольшой косвенный эффект на урожай через размер семян, указывая на то, что компенсации первичного компонента урожая (то есть, уменьшение размера семян с увеличением числа семян) не происходило. Таким образом, для оценки важности компонентов в процессе формирования урожая число семян оказалось более важным, чем размер семян.

Среди вторичных компонентов урожая (число бобов и число семян в одном бобе) число бобов оказывало более сильное воздействие на число семян, имея большие прямые коэффициенты путей и корреляции (рис. б). Признак "число бобов" оказался более важным, чем число семян в одном бобе в воздействии на число семян.

На число бобов высота растений влияла больше, чем число узлов (рис.6), хотя число узлов через высоту оказывало сильный положительный косвенный эффект на число бобов. Это показывает, что компенсация не происходила.

Третичный уровень Вторичный уровень Первичный уровень

высоте в-ЗВ число EcOoi числа сем. 090 .«.грм

Ч Н^У Ц yáT^

чисгаушша 2. число csu. Y размером. X

• одном Goce

Рис. б. Диаграмма взаимосвязей признаков на разных уровнях компонентов урожая, величины прямых эффектов и коэффициенты корреляции между признаками на каждом уровне урожая. X, Y, и Z представляют собой остаточные эффекта, соответственно, на первичных, вторичных и третичных уровнях.

В результате проделанной работы можно прийти к заключению, что большее число семян образуется в результате увеличения числа бобов. Число бобов было более важно, чем другие компоненты в формировании конечного урожая, благодаря высокому

коэффициенту корреляции с конечным урожаем, высокому коэффициенту наследуемости в узком смысле (таб. 1) и отсутствию отрицательной компенсации.

Анализ средних значений в ряду поколений был сделан для трех важных компонентов урожая (числа семян, числа бобов и высоты). Полученные результаты показали, что генетический контроль сложен для признака "число семян", "число бобов" и "высота растений", так как эпистатические эффекты были существенными (таб. 1). Для этих признаков, аддитивно-доминантные эффекты не объясняли всей изменчивости. Присутствие эпистатических эффектов указывает на то, что наследование этих признаков является сложным. Проведенное исследование позволяет заключить, что неаддитивные эффекты также вовлечены в формирование урожая.

Рассчитанная величина Нп для числа бобов была 0.50 (таб. 1). Для признаков с высокой наследуемостью, где Нп превышает 0.40, отбор в популяции ожидается достаточно эффективным [Смиряев и др., 1992]. Хотя для числа бобов установлен сложный характер наследования, более высокая величина Нп предполагает, что отбор по эгому признаку также может быть эффективен.

Таблица 1. Действие генов и коэффициенты наследуемости для числа семян, числа бобов и высоты растений гороха в скрещивании (LW1238 х СЫ115).

_Конечнад модель_Коэффициент наследуемости

Число семян 40.13 ** 2.33" 10.5" -60 ** -2.93" 145.3 * 0.78 0.37

Число бобов 9.9** -4.7* 15.33** 32" -6.02* 15.34** 0.79 0.50

Высота 79.4** 2.6" 58.33 ** -24.7" -7.45 ** 81.8* 0.94 0.35

Недостоверный и достоверный генетический эффект для Р=0.05 и 0.01, соответственно. IIb• Коэффициент наследуемости в широком смысле. Нп: Коэффициент наследуемости в узком смысле.

9. Картирование локусов количественных признаков (QTL), контролирующих компоненты урожая у гороха

Одной из целей создания карт в данной работе было их использование для картирования локусов количественных признаков (QTL), представленных в таблице 2.

Полученные нами генетические карты содержат 100 и 102 маркера в изученных скрещиваниях (WL1238 xChi115) и (WL1238 х Флагман), соответственно. Карты включают около 1262 и 1008 сМ, причем среднее расстояние между маркерами составляет 12.6 и 9.9 сМ в изученных популяциях, соответственно. Генетические карты большинства видов растений имеют расстояние между маркерами более 20-25 сМ [Gilpin

et al., 1997; Irzikowska et al., 2001]. Поэтому наши карты могут быть успешно использованы для картирования локусов количественных признаков.

Таблица 2. Измеренные признаки в Fj для картирования QTL и их сокращения. _Описание признака_Сокращение признака

Длина междоузлий (Intemodes distance) intnd

Число семян (Number of seed) nsd

Для анализа QTL был использован метод интервального картирования. Интервальное картирование проводилось с применением программы МарМакег/QTL 1.1 (Lincoln et al., 1993). Величина числа LOD, характеризующего степень ассоциации между генотипом и данными по количественному признаку была LOD>2.0. Локализация QTL в скрещивании (WL1238 х Chill5). В популяции F2 (WL1238 * СЫН5) анализ QTL был проведен для признаков "высота стебля", "число семян", "число бобов", "размер семян" и "вес семян". Обобщенные данные для всех QTL, которые были обнаружены в исследуемом скрещивании (WL1238 * Chi 115) представлены в таблице 3.

Для признака "высота" было идентифицировано шесть QTL (таб. 3 и рис. 4). При анализе QTL, исследованных с помощью МарМакег/QTL, было обнаружено шесть пиков с наибольшими значениями числа LOD, ассоциированных со значительными фенотипическими эффектами и локализованных в группах сцепления LGIII, LGV(2 QTL), LGV П (2 QTL) и в неизвестной группе Unrec. 2.

Шесть найденных QTL обуславливали 84.2% от общей изменчивости высоты растений гороха. Все QTL могут быть расположены, в соответствии с величиной их вклада в общую высоту растения, от большего к меньшему в следующем порядке: hg2 (70.6 %), hg4 (69.8 %), hg5 (69.6 %), hg3 (60.2 %), hg6 (57 %) и bgl (16.5 %).

После сравнения LOD, полученного из объединения найденных QTL вместе (1527) с суммарным значением единичных LOD

можно сделать вывод, что в соответствии с результатом анализа средних значений признака в ряду поколений, эпистатические взаимодействия существует и между полученными QTL. Анализ QTL показал, что QTL hgl, hg2 и hg3 наследовались от материнского родителя (Chill5, Р2), a QTL hg4, hg5 и hg6 от отцовского родителя (WL1238, Pi) (таб. 3). Вычисленные коэффициенты наследования показали, что все

найденные QTL я&чяются сверх-доминантными, кроме hgl. QTL hgl имеет аддитивный, рецессивный и доминантный характер действия.

Найдя шесть QTL для высоты стебля гороха, мы подтвердили тот факт, что этот сложный признак контролируется многими генами, что согласуется с полученным результатом анализа средних значений высоты стебля в ряду поколений. Четыре QTL hg2, hg3, hg4 и hg5 были локализованы в группах сцепления V и VII. Это указывает на важную роль этих групп в генетическом контроле высоты растений (таб. 3), и соответствует результатам, полученным Иржиковской и др. [Iгzikowska й а1., 2002].

Таблица 3. Генетические характеристики идентифицированных QTL для различных признаков методом интервального картирования в скрещивании (WL1238 х ^^5).

Признак ОТЪ1 Юъ ближащ ий маркер ШОсУЕ (%)" ае Налравл епие® ОА1

Ьё1 Ш Ш/пг 5.58 16.5 19.43 -1.04 Р2 -0.05 АЮ>

ъ& V М9#350 6.51 70 6 131 -58.26 Р2 -44.47 СЖ

Высота ЬgЗ V й> 5.25 60.2 17.86 43.69 р2 2.45 С®

УП Ш#220 5.79 69.8 -126 -58.02 р! 46.05 ОБ

УП С}20#600 5.32 69.6 -3.85 -572 Р1 14.86 <Ю

1щб Шгес.2 АРК1#500 2.26 57 -17.8 4529 Р] 2.54 СЮ

Число бобов пр<1 Ш К,о#830 11 23.8 0.20 0.14 р2 0.7

пвсИ Ш сЫ115 17.79 35.3 0.30 0.22 Р2 0.73 А.Я.О

Число п*12 V 020#420 205 34.7 -0.27 0.29 Р. -1.07 Я

семян п«13 1)пгес.1 М1#550 3.46 50.6 0.26 0.40 Р2 1.55 О

Размер 8521 П К8#420 2.1 8.7 -0.21 0.21 Р1 -1 Л

семян V Ш> 4.62 18.6 -0.35 0.34 Р1 -0.97 А.Я

wgl п В318#400 333 64.8 0.02 -0.54 Р2 27 СЮ

Вес семян wg2 ш сЫШ 14.26 29.6 0.24 0.16 Р2 0.67 А.Я.О

wgЗ V М9#350 2.41 61.8 -0.15 0.46 Р. -3.07 ОЭ

wg4 ипгес.2 М1#550 2.45 47.8 0.22 0.32 Р2 1.45 О

* Полученный (УП,; ь Группа сцепления гороха;' значение числа ЬСЮ; 4 процент изменчивости признака, объясняемый наличием данного <ЗТЬ; ® Аддитивный генетический эффект С^ТЬ; ' Доминантной эффект <2ТЬ; ' Направление определяет родителя, который увеличивает величину признака;к Степень доминирования;1 Действие гена;

Рн >№1.1238; Р2: СЫ115; А: аддитивный, Я: рецессивный, Б: доминантный, СЮ: сверх-доминакгный

Для признака "число бобов" был идентифицирован только один рТЬ с большим значением ЬОБ =11. Это рТЬ наследовался от материнского родителя (СЫ115), и все генетические эффекты (аддитивный, доминантный и рецессивный) оказались для пего существенны (таб. 3). Идентификация одного рТЬ для признака "число бобов" показывает, что наследование этого признака, вероятно, не очень сложно. Это соответствует результатам анализа средних значений в ряду поколений. Эти анализы показали, что коэффициент наследуемости числа бобов в узком смысле равен 0.50.

Для признака "число семян" было идентифицировано три рТЬ (таб. 3). Найденные рТЬ локализованы в интервалах между маркерными локусами 15 и 506#550 в группе сцепления (}2(ШИИ,1 У20#330 в группе ЬОУ и М1#550иМ1#570в группе Шгес. 1. рТЬ шШ в третьей группе сцепления был определен, как наибольший, со значением числа ЬОБ равным 17.79. Характеристики полученных рТЬ представлены в таблице 3. Результаты объединения показывают, что найденные рТЬ обуславливали 81.6% от общей изменчивости изученного признака, и взаимодействие между ОТЬ является аддитивным. Анализ средних значений в ряду поколений также показал, что эпистаткческие эффекты (ад дитивные х ад дитивные, ad) существенны . В результате этих исследований можно сделать вывод, что между полученными рТЬ имеются аддитивные взаимодействия.

Для признака "размер семян" были найдены два рТЬ. рТЬ ББг! и 5822 находятся в группах сцепления Пи V между маркерными локусами К8#420 и к, и Ш2#240 и соответственно (таб. 3). Полученные результаты объединения рТЬ показывают, что взаимодействие между рТЬ, определяющими размер семян, является аддитивным.

Четыре рТЬ были идентифицированы для веса семян. рТЬ, «^2, был локализован в третьей группе сцепления (ЬОШ) между маркерными локусами МН5 и 8Б6#550 и имел высокое значение ЬОБ, равное 14.26. Характеристики каждого отдельного рТЬ представлены в таблице 3. Четыре найденных рТЬ обуславливали 75.2% общей изменчивости веса семян гороха. Сравнение величины ЬОБ, полученной из объединения рТЬ (21.26) с суммарным значением отдельных ЬОБ (3.33 + 14.26 + 2.41 + 2.45 = 22.45) показывает, что взаимодействие между рТЬ является аддитивным.

В некоторых интервалах, таких как М9#350-И06#850 и Ш2#240^ в группе сцепления ЬО^ позиция двух рТЬ, контролирующих различные признаки, близко совпадает друг с другом. Это предполагает, что некоторые отдельные рТЬ производят плейтропный эффект на оба признака, или разные рТЬ находятся рядом. Локализация QTL в скрещивании (WL1238 х Флагман). В популяции Бг (МЬ1238 * Флагман) анализ рТЬ был проведен для признаков "высота стебля", "длина междоузлий", "число семян", "число бобов", "размер семян" и "вес семян".

Обобщенные данные для всех QTL, которые были обнаружены в исследуемом скрещивании, представлены в таблице 4.

Для признака "высота" были обнаружены пять QTL. Важно отметить, что один QTL был обнаружен для высоты с наибольшим значением LOD в группе сцепления LGffl (hg2). Этот QTL, как и ожидалось, расположен в интервале I#4OO-deh близко от гена ёеИ, ответственного за формирование соцветия и детермипантный тип стебля. Позиция трех QTL в группах сцепления LGII, LGV и LGVII гороха (hgl, hg4 и hg5) и QTL, полученных Иржиковской [Iгzikowska et al., 2002], совпадает.

Таблица 4. Генетические характеристики идентифицированных <}ТЬ для различных признаков методом интервального картирования в скрещивании (ИХ,1238 х Флагман)._

Признак QTL* LGb Ближ ащий маркер LODc VE (%)d ae df Направл ение8 d/a" GA'

hgl И wb 2.31 52.8 11.72 39.74 P2 339 OD

hg2 Ш moo 4.4 40.5 24.07 12.86 P2 0.53 A.D

Высота hg3 IV M2#300 4.14 66.6 -14.42 45.51 P. -3.2 OD

hg4 V gP 3.33 11.8 -10.58 14.02 Pi -1.33 A.R

hgS VII VB500 4.1 56 23 J1 31.62 Pj 1.36 D

Длина intndl V 8P 5.83 19.6 -47.71 33.87 P. -0.71 A.R

междоузлии intnd2 Ш K8#900 2.35 92 -26.34 -29.92 Pi 1.14 A.D

Число бобов npdl npd2 Ш V deh B318#IS0 2.31 2.21 15.6 17.7 0.12 -0.09 0.07 0.16 Pj P. 0.63 -1.78 A.D R

Число семян nsd V В31Ш50 2.9 21.1 -0.15 0.19 Pi -1.27 R

Размер семян ssz V QR1#240 2.63 30.8 0.06 -.0.39 Pj -6.5 OD

Вес семян wg vn VI#500 221 42.2 0.18 0.32 P: 1.78 OD

* Полученный (ЗТЬ; ь Группа сцепления гороха;' значение числа ЬОЭ; а процент изменчивости признака, объясняемый наличием данного <271,; ' Аддитивный генетический эффект <ЗТЪ; г Доминантной эффект (}ТЬ; ' Направление определяет родителя, который увеличивает величину признака;11 Степень доминирования;1 Действие гена;

Р]: \VL1238; Р2: Флагман; А: аддитивный, Я: рецессивный, Р: доминантный, СЮ: сверхдоминантный

Полученные результаты объединения QTL показывают, что взаимодействие между данными QTL вляется эпистатическим. Сравнивая позиции найденных QTL, определяющих высоту стебля в двух изученных нами скрещиваниях, можно отметить, что два QTL были локализованы практически в одной и той же позиции и находились очень близко к гену ^р в пятой группе сцепления (рис. 4 и 5). Этот факт может служить

доказательством того, что в этом районе действительно находится QTL, играющий важную роль в изменении длины стебля гороха.

Для длины междоузлий были выявлены два QTL (таб. 4). Высокое значение LOO было получено для QTL intndl (5.83), локализованного в пятой группе сцепления близко к гену gp, где находится QTL hg4, контролирующий высоту растения. Эти данные показывают, что этот район оказывает плейотропный эффект на оба признака.

Число LOD объединенной модели найденных QTL равнялось 7.79, однако суммарное значение LOD составляло 8.18. Таким образом, между двумя QTL существует аддитивное взаимодействие.

Для признака "число бобов" были идентифицированы два QTL в разных группах сцепления (LGIII и LGV) (таб. 4). Как и ожидалось, один QTL (npdl) расположен близко к гену dehy ответственному за детерминантный тип стебля, вследствие чего уменьшается число бобов на растении. Сравнение объединенного значения LOD (4.40) с суммарным значением LOD (2.31 + 2.21 = 4.52) показывает, что аддитивный эффект играет большую роль во взаимодействии этих QTL друг с другом.

Единственный QTL для признака "число семян" в данном скрещивании был выявлен в пятой группе сцепления (LGV) (таб. 4). Данный QTL находится близко к позиции QTL, найденного для числа семян (nsd2) в другом скрещивании (WL1238 * Chil 15) (рис. 4 и 5).

Для размера семян был найден один QTL (таб. 4), локализованный в пятой группе сцепления (LGV). Позиция этого QTL близка к позиции QTL npd2 и nsd в интервале B318#150-QRl#240 (рис. 5).

Один QTL для признака "веса семян" был идентифицирован в седьмой группе сцепления (таб. 4).

После анализа QTL в двух изученных скрещиваниях было установлено, что 36% полученных QTL для урожая и его компонентов локализованы в пятой группе сцепления гороха (LGV), 25% - в третьей группе сцепления (LGIII) и 14% - во второй группе сцепления (LGII). Таким образом, можно сделать вывод, что группы сцепления LGV и LGIII играют большую роль в формировании урожая. Поскольку в данной работе не идентифицировано ни одного QTL в первой группе сцепления (LGI), то вероятно, что эта группа играет небольшую роль в становлении урожая.

ВЫВОДЫ:

1. Идентифицировано около 150 полиморфных ИАРБ и маркеров в каждой популяции Флагман). Изучение наследования ИАРБ и ^И-фрагментов показало, что данные маркеры наследуются как менделевские факторы.

2. Созданы генетические карты сцепления для двух популяций Р2 (МЪ1238 х СЫ115) и (МЪ1238 х Флагман). Карты общей длиной около 1262 и 1008 сМ, соответственно, включают в свой состав 100 и 102 маркера со средним расстоянием между маркерами 12.6 и 9.9 сМ, соответственно. Эти карты могут быть использованы для более детальных генетических исследований.

3. Насыщение молекулярными маркерами отдельных групп сцепления позволило картировать в этих группах гены "сЫ115я (ЬвШ), "ха18" (ЬО"У1), определяющие структуру и функцию фотосинтетического аппарата у гороха, ген "deh" (ЬО111), обусловливающий формирование дстерминированно стебля, и 6 8САК-маркеров.

4. Изучение взаимосвязей и наследования компонентов урожая гороха показало, что число бобов, число семян и высота растения, соответственно, были наиболее важными компонентами при формировании конечного урожая. Анализ средних значений признаков в ряду поколений показал, что генетический контроль числа семян, числа бобов и высоты растений определяется многими генами.

5. На основе созданных генетических карт групп сцепления гороха были картированы новые локусы количественных признаков (ОТЬ), ответственные за высоту растений (11 ОТЬ), число бобов (3 ОТЬ), число семян (4 ОТЬ), длину междоузлий (2 ОТЬ), размер семян (3 рТЬ) и вес семян (5 ОТЬ).

6. Большинство локусов количественных признаков (ОТЬ) расположено в третьей и пятой группах сцепления гороха. Этот факт подчеркивает значение этих групп сцепления в формирования конечного урожая.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Опубликованные статьи:

1. Cheghamirza, К., (2001) Use of molecular markers in genetic mapping of plants. Proceedings ofThe second international Iran and Russia conference "Agriculture and Natural Resources". Moscow Timiriazev Agricultural Academy, Moscow, pp: 178-185.

2. Cheghamirza, K., O. Koveza, F. Konovalov and S. Gostimsky (2002) Identification of RAPD Markers and Their use for molecular mapping in Pea (Pisum sativum L). Cellular & Molecular Biology Letters 7:649-655.

3. Cheghamirza, K., SA Gostimsky (2002) Studying genetic effect and inheritance of yield components in pea {Pisum sativum L.). Proceedings ofthe third international Iran and Russia conference "Agriculture and Natural Resources". Moscow Timiriazev Agricultural Academy, Moscow, pp: 43-46.

4. Чегамирза, К., О.В. Ковеза, ФА Коновалов, СА. Гостимский (2004) Идентификация и локализация гена chill5 и сцепленных с ним ДНК-маркеров у гороха посевного (Pisum sativum L.). Генетика 40 № 7 (в печати).

Тезисы конференций:

5. Kokaeva, Z.G., O.V. Koveza, К. Cheghamirza, OA Ash, SA Gostimsky (2001) Identification of DNA polymorphism in different pea genotypes using RAPD and SCAR markers. The second international Iran and Russia conference "Agriculture and Natural Resources". Feb. 13-14, Moscow, Russia, pp. 8-9.

6. Чегамирза, К., О.В. Ковеза, ФА Коновалов, СА Гостимский (2002) Выявление и картирование RAPD-маркеров у гороха (Pisum sativum L.). Конференция, посвященная 100-летию со дня рожденя А.Р. Жебрака и 70-летию образования генетики в Московской сельскохозяйственной академии имени КЛ. Тимирязева. Москва, стр. 349-350.

7. Cheghamirza, К., О. Koveza, F. Konovalov, S. Gostimsky (2002) Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in Pea (Pisum sativum L). Application of Molecular Markers in Plants Studies. Sep. 25-29, Warsaw, Poland, pp. 24.

8. Чегамирза, К. С.А. Гостимский (2002) Изучение наследования и генетических эфектов важных признаков у гороха. Трерья международная ирано-российская конференция сельскохозяйство и природные ресурсы. МСХА, Москва, стр. 64.

9. Cheghamirza, К., S.A. Gostimsky (2002) Path coefficient analysis of yield formation process different segregated populations ofpea (Pisum sativum L.). The third international Iran and Russia conference "Agriculture and Natural Resources". Sep. 18-20, Moscow, Russia, pp. 71.

10. Cheghamirza, K, SA Gostimsky (2002) Use and comparison of statistics methods to determinate relative importance of yield components in pea. Sixth Iranian International Statistics Conference, Aug. 26-28, Tarbiat Modarres University, Tehran, Iran, pp. 39.

11. Cheghamirza, К., O. Koveza, F. Konovalov, S. Gostimsky (2002) Mapping of Molecular markers inpea. 9"1 Iranian Student Seminar in Europe, ISS 2002, Birmingham, Uk. pp: 8.

12. Cheghamirza, K, SA Gostimsky (2002) Determination of relative importance of yield components in pea {Piston sativum). Genotype - Phenotype: Narrowing the Gaps, 16-18 December 2002, Royal Agricultural College, Cirencester, Gloucestershire, UK (www.abb.org.uk).

13. Cheghamirza, K., SA. Gostimsky (2003) Studying relationship and inheritance of yield components in pea (Pisum sativum L.) using statistical and genetic methods. Kansas State University, Conference on Applied Statistics in Agriculture April 27-29, 2003 (httpA/www.ksu.edu/stats/agstatconference/abstractsJitm).

14. Чегамирза, К., ОЗ. Ковеза, ФА. Коновалов, СА Гостимский (2003) Картирования гена. сЫ15 с помощью молекулярных. маркеров у гороха. IV международная конференция геном растений. 10-13 июня 2003, Одесса, Украина, стр. 42.

15. Чегамирза, К., О.В. Ковеза, СЛ. Гостимский (2003) Картирования гена ха18 с помощью молекулярных маркеров у гороха. Конференция, посвященной 100-летию начала научной селекции в России, 8 - 11 декабря 2003, Московской сельскохозяйственной академии имени КЛ. Тимирязева, Москва.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 04.03.2004 г. Формат 60x901/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 246. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В Ломоносова.

№- 67 4 3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чегамирза Киануш

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Горох.

1.2. Молекулярные маркеры.

1.2.1. Белковые маркеры.

1.2.2. Молекулярные ДНК-маркеры.

1.2.2.1. ПДРФ-маркеры.

1.2.2.2. Полимеразная цепная реакция.

1.2.2.3. МААР-маркеры.

1.2.2.3.1. RAPD-маркеры.

1.2.2.3.2. AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR) маркеры.

1.2.2.3.3. DAF-маркеры.

1.2.2.4. STS-маркеры.

1.2.2.4.1. SCAR-маркеры.

1.2.2.4.2. С APS-маркеры.

1.2.2.4.3. SSR-маркеры.

1.2.2.5. ДНК-Маркеры с полупроизвольными праймерами.

1.2.2.5.1. ISSR-маркеры.

1.2.2.5.2. AFLP-маркеры.

1.3. Генетические карты сцепления.

1.4. Количественные признаки.

1.4.1. Картирование локусов количественных признаков.

1.4.2. Методы картирования локусов количественных признаков.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Исходный материал.

2.2. Выделение ДНК гороха для ПЦР-анализа.

2.3. Амплификация ДНК RAPD-методом.

2.4. Амплификация ДНК ISSR-методом.

2.5. SCAR-маркеры.

2.6. AP-PCR-метод.

2.7. CAPS-маркеры.

2.7.1. Выделение фрагментов из геля.

2.7.2. Секвенирование фрагментов.

2.8. Массовый сегрегационный анализ.

2.9. Полевые эксперименты.

2.10. Анализ количественных признаков.

2.11. Анализ средних значений в ряду поколений.

2.12. Анализ сцепления.

2.13. Картирование локусов количественных признаков (QTL).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Отбор линий.

3.2. Выявление молекулярных маркеров в ДНК гороха.

3.3. Идентификация и локализация гена chill5 и сцепленных с ним ДНК-маркеров.

3.3.1. Анализ расщепления по морфологическим признакам.

3.3.2. RAPD- и ISSR-анализ.

3.3.3. Анализ расщепления с использованием молекулярных маркеров.

3.4. Локализация гена deh с помощью молекулярных маркеров.

3.5. Картирование SCAR-маркера, сцепленного с геном ха18 у гороха.

3.6. Создание генетических карт сцепления гороха.

3.6.1. Построение генетической карты сцепления для скрещивания (WL1238 х СЫ115).

3.6.2. Построение генетической карты сцепления для скрещивания (WL123 8 х Флагман).

3.6.3. Сравнение маркерных локусов в каждой группе сцепления в двух скрещиваниях гороха.

3.7. Изучение взаимосвязей компонентов урожая гороха.

3.7. 1. Анализ коэффициентов путей.

3.7. 2. Анализ средних значений в ряду поколений.

3.8. Картирование локусов количественных признаков (QTL), контролирующих компоненты урожая у гороха.

3.8.1. Локализация QTL в скрещивании (WL1238 х Chil 15).

3.8.1.1. Локализация QTL высоты.

3.8.1.2. Локализация QTL, определяющих признак "число бобов".

3.8.1.3. Локализация QTL, определяющих признак "число семян".

3.8.1.4. Локализация QTL размера семян.

3.8.1.5. Локализация QTL признака "вес семян".

3.8.2. Локализация QTL в скрещивании (WL1238 х Флагман).

3.8.2.1. Локализация QTL высоты.

3.8.2.2. Локализация QTL длины междоузлий.

3.8.2.3. Локализация QTL числа бобов.

3.8.2.4. Локализация QTL числа семян.

3.8.2.5. Локализация QTL размера семян.

3.8.2.6. Локализация QTL веса семян.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическое картирование локусов качественных и количественных признаков у гороха"

Актуальность проблемы. В последние десятилетия молекулярные маркеры нашли очень широкое применение в различных областях генетических исследований [Caetano-Anolles, 1993; Mohan et al., 1997]. Применение молекулярных маркеров открывает большие перспективы для детального картирования хромосом, идентификации генов, их клонирования и конструирования новых сортов растений.

Молекулярные маркеры широко используют для точной и быстрой паспортизации различных видов и сортов растений [Multani and Lion, 1995; Журавлев и др., 1996; Sanchez-Escribano et al., 1999; Кочиева и др, 1999], для изучения филогенетического родства [Gonzales and Ferrer, 1993; Lanza et al., 1997; Chowdari et al., 1998], исследования сомаклональной изменчивости [Кокаева и др., 1997; Осипова и др., 2001], идентификации соматических гибридов [Гавриленко и др., 1994; Дорохов и Клоке, 1997].

Большую роль молекулярные маркеры играют в разработке таких направлений генетических исследований, как идентификация и маркирование генов селекционно-ценных признаков [Messeguer et al. 1991; Barzen et al., 1997]. Они значительно облегчают процесс клонирования генов [Tanksley et al., 1995; Mohan et al., 1997], а также важны при изучении полигенных локусов количественных признаков (QTL) [Tanksley, 1993; Van der Knaap et al., 2002].

Особенно широкое применение молекулярные маркеры получили в картировании геномов растений. Они позволили решить проблему недостатка морфологических маркеров и составить подробные генетические карты различных видов растений [Ganal et al., 1992; Yu et al., 1995; Laucou et al., 1998; Saliba-Colombani et al., 2000; Irzykowska et al., 2001 и др.].

Благодаря картам сцепления была облегчена характеристика количественных признаков, и стало возможным идентифицировать районы генома, содержащие локусы важных агрономических и физиологических признаков и оценить их действия на формирование конечного урожая растений [Tanksley 1993].

Для изучения организации геномов растений генетики используют самые разные объекты, имеющие как чисто теоретическое значение (легкость проведения генетических исследований и хорошая изученность), так и практическое значение (важность для сельскохозяйственного использования). К таким, широко используемым генетическим объектам, можно отнести и горох посевной.

Горох посевной (Pisum sativum L.) является важной сельскохозяйственной культурой и удобной моделью для генетических исследований. Горох выращивается как продовольственная и как кормовая культура. Главными проблемами выращивания гороха как производственной культуры считаются относительно низкий и нестабильный урожай, а также трудности, возникающие при уборке урожая [Hedley and Ambrose, 1985]. Значительный морфологический полиморфизм гороха обеспечил достаточное количество маркеров для первых генетических исследований и заложил основы построения первых генетических карт [Blixt, 1974].

В настоящее время опубликованы карты хромосом гороха, содержащие молекулярные маркеры [Ellis et al., 1993; Laucou et al.,1998]. Благодаря использованию общих маркеров удалось создать «консенсусную» карту хромосом [Weeden et al.,1998], объединившую морфологические и молекулярные локусы. Небольшое число работ по картированию QTL с применением молекулярных маркеров у гороха посвящены изучению веса семян [Timmerman-Vaughan et al., 1996] высоты и числа узлов [Irzykowska et al., 2002] и устойчивости к болезням [Timmerman-Vaughan et al., 2002; Pilet-Nayel et al., 2002]. Однако детальная карта хромосом гороха еще не создана, и требуется дополнительный поиск новых морфологических и молекулярных маркеров и их локализация.

Цель и задачи исследования. Таким образом, все вышесказанное свидетельствует, что процесс генетического картирования у гороха ведется интенсивно, но требует дополнительных исследований. В связи с этим нами была предпринята работа, целью которой являлся поиск и идентификация новых молекулярных маркеров с помощью RAPD-, ISSR-, SCAR- и CAPS-методов, и создание генетической карты для локализации локусов важных качественных и количественных признаков гороха. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать новые молекулярные маркеры в геноме гороха.

С этой целью скрещивали мутант "Chil 15й и сорт "Флагман" с маркерной линией WL1238, и получили две популяции F2 (WL1238 х Chil 15) и (WL1238 х Флагман).

2. Создать генетические карты сцепления гороха для двух скрещиваний (WL1238 х Chil 15) и (WL1238 х Флагман).

3. С помощью молекулярных маркеров точно локализовать гены важных качественных физиологических признаков chil 15, deh, ха18 и 6 SCAR-маркеров.

4. Используя созданные карты групп сцепления гороха, выявить и картировать локусы количественных признаков (QTL).

5. Сравнить созданные генетические карты сцепления друг с другом и ранее опубликованными картами гороха.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Чегамирза Киануш

ВЫВОДЫ

1. Идентифицировано около 150 полиморфных RAPD и ISSR маркеров в каждой популяции F2 (WL1238 х Chil 15) и (WL1238 х Флагман). Изучение наследования RAPD и ISSR-фрагментов показало, что данные маркеры наследуются как простые менделевские факторы.

2. Созданы генетические карты сцепления для двух популяций F2 (WL1238 х Chil 15) и (WL1238 х Флагман). Карты общей длиной около 1262 и 1008 сМ, соответственно, включают в свой состав 100 и 102 маркера со средним расстоянием между маркерами 12.6 и 9.9 сМ, соответственно. Эти карты могут быть использованы для более детальных генетических исследований.

3. Насыщение молекулярными маркерами отдельных групп сцепления позволило картировать в этих группах гены "chil 15" (LGIII), "ха18" (LGVI), определяющие структуру и функцию фотосинтетического аппарата у гороха, ген "deh" (LGIII), обусловливающий формирование структуры соцветия, и 6 SCAR-маркеров.

4. Изучение взаимосвязей и наследования компонентов урожая гороха показало, что число бобов, число семян и высота растения, соответственно, были наиболее важными компонентами при формировании конечного урожая. Анализ средних значений признаков в ряду поколений показал, что генетический контроль числа семян, числа бобов и высоты растений определяется многими генами.

5. На основе созданных генетических карт групп сцепления гороха были картированы новые локусы количественных признаков (QTL), ответственные за высоту растений (11 QTL), число бобов (3 QTL), число семян (4 QTL), длину междоузлий (2 QTL), размер семян (3 QTL) и вес семян (5 QTL).

6. Большинство локусов количественных признаков (QTL) расположено в третьей и пятой группах сцепления гороха. Этот факт подчеркивает значение этих групп сцепления в формирования конечного урожая.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование, прежде всего, посвящено выявлению новых молекулярных маркеров в геноме гороха и их картированию на картах хромосом. Благодаря применению RAPD-, ISSR-, SCAR- и CAPS-методов, удалось обнаружить множество полиморфных фрагментов ДНК гороха, присутствующих в одних линиях, сортах и мутантах гороха и отсутствующих в других. Генотипирование линий гороха по содержанию молекулярных маркеров позволило дифференцировать разные генотипы и подобрать внутривидовые формы гороха, резко различающиеся по молекулярным и морфологическим маркерам. В результате такой работы были подобраны генотипы (сорт Флагман, мутант СЫ115 и линия WL1238) для создания расщепляющихся популяций, которые и послужили материалом для построения детальных молекулярно-генетических карт гороха.

Именно эти линии были использованы в скрещиваниях (WL1238 х СЫ115) и (WL1238 х Флагман). Кроме указанных генетических различий, линия СЫ115 несла интересную хлорофильную мутацию [Ежова и Гостимский, 1979], влияющую на структурно-функциональную организацию фотосинтетического аппарата. Сорт Флагман является новым районированным сортом зернового гороха и несет редкую, генетически мало исследованную мутацию (cfe/i), определяющую детерминантный тип стебля, заканчивающийся генеративной меристемой [Яковлев, 1992].

Линия WL1238 представляет собой тесторную линию, несущую 12 морфологических маркеров и широко используемую в генетических исследованиях [Rameau et al.,1998].

Исходные родительские линии, гибриды Fi, бэккроссы и гибриды F2 подвергались генетическому анализу и одновременно исследовались по количественным признакам, определяющим важные компоненты урожая гороха. Анализировали число семян, число бобов, высоту растений, длину междоузлий, размер семян, вес семян, число семян в одном бобе.

При анализе ДНК трех родительских линий гороха с использованием 46 RAPD-праймеров, 10 ISSR-праймеров и 2-х AP-PCR-праймеров были обнаружены полиморфные фрагменты, присутствующие у одного и отсутствующие у другого родителя. Основным критерием надежности обнаруженных полиморфных маркеров служила их наследуемость у гибридов Fj hF2.

Показано, что все исследованные полиморфные RAPD, ISSR, АР- ПЦР-фрагменты ДНК гороха проявляли доминантный характер наследования и давали простые менделеевские соотношения 3:1 в F2, что хорошо согласуется с литературными данными [Tingey et al.,1992; Кокаева и др., 1998; Ковеза, 2003]. CAPS-маркеры наследовались как кодоминантные признаки.

Всего для скрещивания (WL1238 х Chil 15) и (WL1238 х Флагман) было идентифицировано 92 и 103 новых RAPD- маркеров , 18 и 20 новых ISSR-маркеров 5 и 5 новых AP-PCR-маркеров, 3 и 5 SCAR-маркеров, 6 и 7 CAPS-маркеров, соответственно. Обнаружение такого большого числа молекулярных маркеров позволило приступить к их картированию и попытке создать молекулярно-генетическую карту хромосом гороха.

Молекулярно-генетические карты хромосом высших растений открывают путь к позиционному клонированию и секвенированию генов важных качественных и количественных признаков и эффективному использованию маркерных локусов в селекции растений при отборе экономически важных признаков. К настоящему времени создано несколько вариантов молекулярно-генетических карт гороха, основанных на использовании разных типов молекулярных маркеров [Ellis et al.,1992; Gilpin et al.,1997; Hall et al., 1997; Laucou et al., 1998; Irzykowska et al.,2001]. Все эти карты построены при использовании разных типов расщепляющихся популяций (рекомбинантные инбредные линии, F2, полученные от скрещивания отдаленных линий и сортов) и разных типов молекулярных маркеров. Каждая карта имеет свои преимущества и недостатки, но все они дополняют друг друга и дают первое предварительное представление о расположении генов в геноме гороха.

Создавая собственную молекулярно-генетическую карту генома гороха, мы, прежде всего, стремились создать основу для картирования новых мутаций, новых генов и молекулярных маркеров, полученных в нашей лаборатории. В этой ситуации уже существующие карты, построенные на других генотипах и на других молекулярных маркерах, не очень удобны и не всегда воспроизводимы. Мы не старались создать очень насыщенную и очень детальную карту групп сцепления гороха. Главной нашей задачей оставалось создание прочного фундамента для успешной работы по картированию локусов новых качественных и количественных признаков гороха, генетический анализ которых успешно проводится в нашей лаборатории [Ежова и Гостимский, 1979; Гостимский, 1982; Фучжун и Гостимский, 1998].

Идентификация новых молекулярных маркеров, основанных на ПЦР [Кокаева,1998; Cheghamirza et al., 2002; Ковеза, 2003], дала возможность создать карту хромосом гороха, основанную на базе расщепляющихся популяций, полученных в результате скрещивания линий, имеющихся в коллекции кафедры генетики МГУ.

Предварительный поиск молекулярных маркеров, сцепленных с классическими генами гороха, осуществлялся с помощью массового сегрегационного анализа. Основная работа по анализу сцепления была проведена на двух расщепляющихся популяциях F2, полученных в скрещиваниях (WL1238 х Chil 15) и (WL1238 х Флагман). Изучение ДНК индивидуальных растений F2 от каждой популяции позволило определить генетические расстояния между маркерами и ранее локализованными (якорными) генами гороха. В качестве якорных локусов использовали 13 генов классических морфологических признаков и 10 CAPS-маркеров, локализованных ранее на консенсусной карте хромосом гороха [Weeden et al., 1998].

После анализа сцепления при помощи компьютерной программы Mapmaker/EXP 3.0 с порогом LOD=3 для скрещивания (WL1238 х Chi 115) была создана генетическая карта сцепления, состоящая преимущественно из RAPD и ISSR-маркеров. Карта сцепления имела размер 1262 сМ со средним расстоянием между маркерами 12.6 сМ и включала в свой состав более 100 маркеров. Для исследуемого скрещивания, с помощью компьютерной программы, было определено 12 районов сцепления, и 10 из них были с помощью якорных локусов привязаны к известных группам сцепления гороха. Расположение двух оставшихся районов остается пока не определенным. Обнаружение «лишних» групп сцепления характерно для всех вновь создаваемых молекулярно-генетических карт [Ellis et al.,1992; Laucou et al., 1998; Irzykowska et al., 2001] и свидетельствует лишь о недостатке якорных локусов, используемых для привязки обнаруженных групп сцепления к классическим группам сцепления гороха.

После анализа сцепления в расщепляющейся популяции F2 скрещивания (WL1238 х Флагман) была создана генетическая карта сцепления, включающая 102 молекулярных маркера. Вся карта имела размер 1008 сМ со средним расстоянием между маркерами 9.9 сМ. Данная карта содержала 13 участков сцепления, которые с помощью якорных локусов удалось привязать к известным группам сцепления гороха. Позиция двух участков осталось неизвестной.

Таким образом, в результате проведенной работы удалось создать генетические карты сцепления для двух расщепляющихся популяций. При сравнении с опубликованной обобщенной картой хромосом гороха мы обнаружили хорошее сходство в порядке расположения якорных локусов по отдельным группам сцепления гороха, однако расстояния между этими локусами иногда значительно различались. Подобное несоответствие в определении расстояний между генами и отдельными маркерами отмечают все исследователи, работавшие с картами хромосом гороха [Ellis et al., 1992; Gilpin et al., 1997; Hall et al., 1997; Laucou et al., 1998; Irzykowska et al., 2001].

Различие в расстояниях между генами может объясняться, прежде всего, различием генотипов линий, используемых разными исследователями для создания исходных картирующих популяций растений гороха.

Полученные нами карты отличаются достаточно хорошей насыщенностью маркерами и дают хорошее совпадение в расположении якорных и общих молеклярных маркеров на обеих картах. Создание детальных молекулярно-генетических карт гороха служит основой для планирования прикладных генетических и селекционных исследований с этой важной сельскохозяйственной культурой. Кроме того, эти карты позволяют достаточно эффективно локализовать гены важных качественных и количественных признаков гороха.

Так, в нашей работе созданные карты групп сцепления гороха были успешно использованы для картирования трех генов, отвечающих за важные морфологические признаки гороха. Анализ сцепления в расщепляющейся популяции F2 (Chil 15 х WL1238) позволил выявить 10 RAPD-маркеров, 2 SCAR и 2 ISSR-маркера тесно сцепленных с геном chil 15, определяющим структурно-функциональную организацию фотосинтетического аппарата. Сам ген chil 15 не проявлял сцепления ни с одним из якорных генов, но при анализе сцепления связанных с ним молекулярных маркеров выявилась связь этих маркеров с классическим маркером (геном Ъ), расположенным в III группе сцепления гороха. Таким образом, ген chil 15 был локализован в III группе сцепления гороха.

Подобным образом были локализованы и 2 других новых гена гороха (ха18 и deh), отвечающих за важные морфологические признаки. Ген deh, обусловливающий формирование детерминированного стебля, был локализован в LGIII, а ген ха18, отвечающий за синтез хлорофилла, был отнесен к группе сцепления LGVI.

Таким же способом на определенных группах сцепления гороха были локализованы 6 новых SCAR-маркеров, представляющих собой специфические, легко выявляемые фрагменты ДНК генома гороха.

Еще одной целью создания молекулярно-генетических карт гороха было их использование для локализации локусов количественных признаков (QTL). Сравнение полученных нами карт показало, что по своей насыщенности маркерами они мало уступают ранее созданным картам хромосом гороха и могут использоваться для картирования QTL.

С целью идентификации и локализации количественных признаков нами были исследованы различные компоненты урожая. Прежде всего, был проведен анализ коэффициентов путей компонентов урожая гороха (высота растений, число узлов, число семян, число бобов, число семян в одном бобе и размер семян). Этот анализ показал, что число бобов, число семян и высота растений были наиболее важными компонентами при формировании конечного урожая. Анализ средних значений признаков в ряду поколений показал, что генетический контроль числа семян, числа бобов и высоты растений определяется многими генами.

Проведенное исследование демонстрирует использование молекулярных маркеров в работе по картированию, для локализации локусов новых важных качественных признаков, а также для идентифицирования локусов количественных признаков гороха.

Целый ряд работ, посвященных изучению высоты растений гороха показал, что высота растений является количественным признаком [Irzykowska et al., 2002; Cheghamirza and Gostimsky, 2002]. В настоящей работе был обнаружен ряд локусов количественных признаков для высоты растений.

В нашем исследовании большинство локусов высоты оказались сверхдоминантными, это может объясняться буферными эффектами гетерозиготности. Необходимо отметить, что для некоторых QTL характер наследования различался в двух изучаемых популяциях гороха. Например, в популяции (WL1238 х Chil 15) локус QTL для высоты растений в пятой группе сцепления близко к гену gp был сверхдоминантный, в то время, как характер QTL, расположенного в той же позиции для популяции (WL1238 х

Флагман), был аддитивный или рецессивный. Наиболее вероятное объяснение этого эффекта заключается в том, что это различие связано с эффектами сцепленных генов или разных аллелей в одном и том же локусе.

Проведенные исследования по локализации QTL показали, что в двух анализируемых скрещиваниях идентифицированные QTL, влияющие на важные агрономические признаки гороха, были расположены в каждой группе сцепления кроме LGI. Большинство локусов количественных признаков (QTL) находились в третьей и пятой группах сцепления гороха. Этот факт подчеркивает значение этих групп сцепления в формировании конечного урожая. Для каждого исследованного признака нами было обнаружено от 1 до 6 QTL. Такое число QTL может служить минимальной оценкой общего числа QTL по каждому признаку. Вероятно, что в нашем исследовании были выявлены только QTL, имеющие самые большие эффекты, в то же время многие небольшие QTL остались незамеченными. Из-за трудностей в обнаружении полиморфных маркеров, построенные карты сцепления не покрывали полный геном гороха и, следовательно, какая-то часть QTL осталась необнаруженной. Некоторые QTL, особенно выявленные в скрещивании (WL1238 х Флагман), совпадают с ранее найденными QTL [Timmerman-Vaughan et al., 1996; Irzykowska et al., 2002].

В данной работе были обнаружены эпистатические эффекты для высоты растений. Эпистатические эффекты встречались в обеих популяциях, и были также выявлены в результате анализа средних значений признаков в ряду поколений. Маловероятно, что все эти эффекты оказались случайными. У ячменя наблюдали эпистатическое взаимодействие (QTL х QTL) для кампонентов урожая [Thomas et al., 1995]. Эпистатическое взаимодействие может быть использовано при отборе определенных аллельных комбинаций.

В имеющейся литературе картирование QTL рассматривается как предварительный этап в определении QTL. Следующим этапом является исследование характера наследуемости генов, определяющих компоненты урожая, изучение их вклада в формирование конечного урожая в различных lis условиях окружающей среды, а также их специфическое фенотипическое проявление. В целом ряде исследований показано, что условия окружающей среды оказывают значительное влияние на QTL признаков урожайности у кукурузы [Stuber et al., 1987; Paterson et al., 1991; Beavis et al., 1991; Bubeck et al., 1993].

Как показало проведенное нами исследование, картирование QTL оказалось высокоэффективным методом для локализации локусов количественных признаков у гороха. Информация о наличии и локализации QTL может быть использована при постановке новых скрещиваний и отборе генотипов с оптимальной комбинацией QTL. Однако, перед использованием предполагаемого QTL в селекции растений, точное местоположение QTL и его эффекты должны быть проверены на конкретных линиях использованного скрещивания или на другом генетическом фоне.

119

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чегамирза Киануш, Москва

1. Гостимский С.А., Карвовская Е.А., Синещеков В.А., Беляева О.Б. (1982) Электронно-микроскопические и спектральные свойства желтых летальных мутантов гороха. Генетика 28 (1): 124-132

2. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Боброва В.К. (1999) Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений. Генетика 35 (11): 1538-1549

3. Гавриленко Т.А., Дорохов Д.Б., Никуленкова Т.В. (1994) Характеристика межродовых соматических гибридов томата Lycopersicon Esculentum Mill. и неклубеньковых видов картофеля серии Etuberosa. Генетика 30 (12): 1605-1615

4. Дорохов Д.Б., Клоке Э. (1997) Быстрая и экономичная технология RAPD анализа растительных геномов. Генетика 33 (4): 443-450

5. Ежова Т.А., Гостимский С.А. (1979) Генетический анализ хлорофильных мутантов гороха. Генетика 25 (4): 691-700

6. Журавлев Ю.Н., Козыренко М.М., Артюкова Е.В., Реунова Г.Д., Музарок Т.И., Еляков Г.Б. (1996) ПЦР-генетическое типирование женьшеня с использованием произвольных праймеров. Доклады Академии Наук 349 (1): 111-114

7. Калинин В.Н., Шипицина Г.И., Кикодзе М.Л., Рубцов П.М., Свердлова П.С., Скрябин К.Г., Логачев М.Ф., Князев Ю.А. (1988) Использование генов гормона роста для диагностики заболевания карликовостью. Мол. генет. микробиол. и вирусология 6: 30-32

8. Ковеза, О.В. (2003) Идентификация, клонирование и исследование молекулярных маркеров генома гороха. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Изд-во МГУ, Москва

9. Ю.Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Гостимский С.А., Петрова Т.В., Осипова Е.С. (2001) Создание SCAR-маркера у гороха (Pisum sativum L.) на основании RAPD-анализа. Генетика 37 (4): 574-576

10. П.Кокаева З.Г., Боброва В.К., Вальехо-Роман К.М., Гостимский С.А., Троицкий А.В. (1997) RAPD-анализ сомаклональной и межсортовой изменчивости гороха. Доклады Академии Наук 355 (1): 1-7

11. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Гостимский С.А., Троицкий А.В. (1998) Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха по данным RAPD-анализа. Генетика 34 (6): 771-777

12. Конарев В.Г., Гаврилюк Н.К., Губарева и др., под ред. Конарева В.Г. (1993) Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции. М.: Колос,

13. М.Кочиева Е.З., Оганисян А.С., Рьтсков А.П. (1999) RAPD -маркеры генома картофеля: клонирование и использование для определения межвидовых и межсортовых различий. Молекулярная биология 33 (5): 893-897

14. Малышев С.В., Картель Н.А. (1997) Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений. Молекулярная биология 31 (62): 197-208

15. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. (1984) Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Изд-во Мир, Москва

16. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. (1995) Генетический полиморфизм ячменя, выявленный ПЦР с произвольными праймерами. Генетика 31 (10): 13581364

17. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев В.П. (1997) Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя (Hordeum vulgareL.). Генетика 33 (1): 53-60

18. Смиряев А.В., Мартынов С.П., Кильчевский А.В. (1992) Биометрия в генетике и селекции растений. Издательство МСХА, Москва

19. Фучжун Л., Гостимский С.А. (1998) Исследование транслокаций у гороха. Генетика 34 (9): 1-8

20. Хлесткина Е.К., Салина Е.А., Леонова И.Н., Лайкова Л.И., Коваль С.Ф.1999) Использование RAPD- и STS-анализа для маркирования генов пятой гомеологической группы хромосом мягкой пшеницы. Генетика 35 (35): 1349-1357

21. Чегамирза, К., Ковеза, О.В., Коновалов, Ф.А., Гостимский С.А. (2004) Идентификация и локализация гена chil 15 и сцепленных с ним ДНК-маркеров у гороха посевного (Pisum sativum L.). Генетика 40 (7): в печати

22. Шишкин С.С., Калинин В.Н. (1992) Медицинские аспекты биохимической и молекулярной генетики. Москва

23. Яковлев, В.Л. (1992) Интродукция генов af def и deh в генотип высокодрожайного сорта гороха "Смарагд". Сборник научных трудов ВНИИ зернобобовых и крупяных культур, с 27-34

24. Aggarwal R.K., Brar D.S., Nandi S., Huang N., Khush G.S. (1999) Phylogenetic relationships among Oryza species revealed by AFLP markers. Theor Appl Genet 98:1320-1328

25. Akanda S.I., Mundt C.C. (1996) Path coefficient analysis of the effects of stripe rust and cultivar mixtures on yield and yield components of winter wheat. Theor Appl Genet 92: 666-672

26. Arcade A., Anselin F., Faivre Rampant P., Lesage M.C., Purques L.E., Prat D.2000) Application of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese Irach. Theor Appl Genet 100: 299-307

27. Ayaz S., McNeil D.L., McKenzie B.A., Hill G.D. (2001) Population and sowing depth effects on yield components of grain legumes. Proceeding of the 10th Australian Agronomy Conference, Hobart. The Regional institute Ltd.

28. Bai Y., Michaels I.E., Pauls K.P. (1997) Identification of RAPD markers linked to common bacterial blight resistant genes in Phaseolus vulgaris L. Genome 40: 544-551

29. Barzen E., Stahl R., Fuchs E., Borchardt D.C., Salamini F. (1997) Development of coupling-repulsion-phase SCAR markers diagnostic for thesugar beet Rrl allele conferring resistance to rhizomania. Molecular Breeding 3:231-238

30. Baumbusch L.O., Sundal I.K., Hughes D.W., Galau G.A., Jakobsen K.S. (2001) Efficient protocols for CAPS-based mapping in Arabidopsis. Plant Mol. Biol. Rep. 19: 137-149

31. Beavis W.D., Grant D., Albertson M., Fincher R. (1991) Quantitative trait loci for plant height in four maize populations and their associations with qualitative genetic loci. Theor Appl Genet 83:141-145

32. Bhat K.V., Jarret R.L., Rana R.S. (1995) DNA profiling of banana and plantain cultivars using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers. Electrophoresis 16 (9): 1736-1745

33. Binelli G., Bucci G. (1994) A genetic linkage map of Picea abies Karst, based on RAPD markers, as a tool in population genetics. Theor Appl Genet 88: 283-288

34. Blixt, S., (1974) The pea. In: King RC (ed) Handbook of genetics, vol. 2, Plenum Press, New York, pp. 181-221

35. Board, J.E., Kang M.S., Harville B.G. (1999) Path Analyses of the Yield Formation Process for Late-Planted Soybean. Agron. J. 91:128-135

36. Bornet, B. Branchard, M. (2001) Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers: Reproducible and Specific Tools for Genome Fingerprinting. Plant Molecular Biology Reporter 19: 209-215

37. Brauner S., Murphy R.L., Przyborowski J., Walling J.G., Weeden N.F. (2002) STS markers for comparative mapping in legumes. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 127 (4): 616-622

38. Bubeck D.M., Goodman M.M., Beavis W.D., Grant D. (1993) Quantitative trait loci controlling resistance to gray leaf spot in maize. Crop Science 33: 838-847

39. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. (1991) DNA amplification fingerprinting: A strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 9: 294307

40. Caetano-Anolles, Amplifying G. (1993) DNA with arbitrary oligonucleotide primers. PCR Methods and Applications 3: 85-94

41. Causse M.A., Fulton T.M., Cho Y.G., Ahn S.N., Chunwongse J., Wu K., Xiao J., Yu Z., Ronald P.C., Harrington S.E., et al. (1994) Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population. Genetics 138 (4): 1251-1274

42. Chang C., Bowman J.L., DeJohn A.W., Lander E.S., Meyerowitz E.M. (1988) Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana. ProcNatl Acad Sci 85 (18): 6856-6860

43. Cheghamirza K., Koveza O.K., Konovalov F.K., Gostimsky S.A. (2002) Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in pea (Pisum sativum L.). Cellular & Molecular Biology Letter 7: 649-655

44. Cheghamirza, K., Gostimsky, S.A. (2002) Studying genetic effects and inheritance of yield components in pea (Pisum sativum L.). Proceedings: The third International Iran and Russia Conference "Agriculture and Natural Resources", Moscow, v. 1: 43-46

45. Chowdari K.V., Venkatachalam S.R., Davierwala A.P., Gupta V.S., Ranjekar P.K., Govila O.P. (1998) Hybrid performance and genetic distance as revealed by the (GATA)4 microsatellite and RAPD markers in pearl millet. Theor Appl Genet 97:163-169

46. Coyne C.J., Meksem K., Lightfoot D.A., Keller K.E., Martin R.R., McClendon M.T., Inglis D.A., Storlie E.W., McPhee K.E. (2000) Construction of a bacterial artificial chromosome library for pea (Pisum sativum L.). Pisum Genetics 32: 23-26

47. Darvasi A., Weinreb A., Minke V., Weller J.I., Soller M. (1993) Detecting marker-QTL linkage and estimating QTL gene effect and map location using a saturated genetic map. Genetics 134: 943 -951

48. Darvasi A., Soller M. (1994) Optimum spacing of genetic markers for determining linkage between marker loci and quantitative trait loci. Theor Appl Genet 89: 351-357

49. Dax E., Livneh O., AUskevicius E., Edelbaum O., Kedar N., Gavish N.,Milo J., Geffen A., Blumenthal A., Rabinowitch H.D., Sela I. (1998) A SCAR marker linked to the ToMV resistance gene, Tm22, in tomato. Euphytica 101:73-77

50. Deng Z., Huang S., Xiao S.Y, and Gmitter F.G., Jr. (1997) Development and characterization of SCAR markers linked to the citrus tristeza virus resistance gene from Poncirus trifoliata. Genome 40: 697-704

51. Devos K.M., Dubcovsky J., Dvorak J., Chinoy C.N., Gale M.D. (1995) Structural evolution of wheat chromosomes 4A, 5 A and 7B and its impact on recombination. Theor Appl Genet 91: 282-288

52. Devos K.M., Gale M.D. (1997) Comparative genetics in the grasses. Plant Molecular Biology 35:3-15

53. Dewey D.R., Lu K.H. (1959) A correlation and path analysis of components of crested wheatgrass seed production. Agron. J. 51: 515-518

54. Dirlewanger E., Isaac P.G., Ranade S., and et al., (1994) Restriction fragment polymorphism analysis of loci associated with disease resistance genes and developmental traits in Pisum sativum L., Theor Appl Genet 88: 17-27

55. Domoney C., Ellis T.H.N., Davies D.R. (1986) Organisation and mapping of legumin genes in Pisum. Mol. Gen. Genet. 202:280-285

56. Edwards M.D., Stuber C.W., Wendel J.F. (1987) Molecular marker - facilitated investigations of quantitative trait loci in maize. I. Numbers, genomic distribution, and types of gene action. Genetics 116:113-125

57. Ellis T.H.N., Turner L., Hellens R.P., and et al., (1992) Linkage maps in pea. Genetics 130: 649-663

58. Ellis T.H.N., Hellens R.P., Turner L., and et al., (1993) On the pea linkage map. Pisum Genet. 25: 5-12

59. Falconer D.S., Mackay T.F.C. (1996) Introduction to quantitative genetics. Longman Group Ltd, Edinburgh

60. Folkeson D. (1990) A revised genetic map of Pisum sativum. Department of Genetics, University of Lund. Sweden, 1-33

61. Galande A.A., Tiwari R., Ammiraju J.S.S., Santra D.K., Lagu M.D., Rao V.S., Gupta V.S., Misra B.K., Nagarajan S., Ranjekar P.K. (2001) Genetic analysis of kernel hardness in bread wheat using PCR-based markers. Theor Appl Genet 103:601-606

62. Ganal M.W., Broun P., Tanksley S.D. (1992) Genetic mapping of tandemly repeated telomeric DNA sequences in tomato (Lycopersicon esculentum). Genomics 14:444-448

63. Gelfand D.H., White T.J. (1990) Termostable DNA polymerases. PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 129-141

64. Giese H., Holm-Jensen A.G., Mathiassen H., Kjaer В., Rasmussen S.K., Bay H., Jensen J. (1994) Distribution of RAPD markers on a linkage map of barley. Hereditas 120: 267-273

65. Gill K.S., Gill S., Endo T.R., Taylor T. (1996) Identification and high-density mapping of gene-rich regions in chromosome group I of wheat. Genetics 144:1883-1891

66. Gilpin B.J., McCallum J.A., Frew T.J., Timmerman-Vaughan G.M. (1997) A linkage map of the pea genome containing cloned sequence of know function and expressed sequence tags (ESTs). Theor Appl Genet 95: 1289-1299

67. Gonzalez J.M. Ferrer E. (1993) Random amplified polymorphic DNA analysis inHordeum species. Genome 38: 1029-1031

68. Gravois K.A., MaNew R.W. (1993) Genetic relationships among and selection for rice yield and yield components. Crop Sci. 33:249-252

69. Guadagnuolo R., Savova-Bianchi D., Felber F. (2001) Specific genetic markers for wheat, spelt and four wild relatives : comparison of isozymes, RAPD and wheat microsatellites. Genome 44 (4): 610-621

70. Hadrys H., Balick M., Schierwater B. (1992) Applications of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology. Molecular Ecology 1: 55-63

71. Hahn V., Blankenhorn K., Schwall M., Melchinger A.E. (1995) Relationships among early European maize inbreds: III. Genetic diversity revealed with RAPD markers and comparison with RFLP and Pedigree data. Maydica 40:299-310

72. Haley C.S. Knott S.A. (1992) A simple regression method for mapping quantitative trait loci in line crosses using flanking markers. Heredity 69: 315324

73. Hallden C., Hansen M., Nilsson N.O., Hjerdin A., Sail T. (1996) Competition as source of errors in RAPD analysis. Theor Appl Genet 93: 1185-1192

74. Hansen M., Hallden С., Sail Т. (1998) Error rates and polymorphism frequencies for three RAPD protocols. Plant Molecular Biology Reporter 16: 139-146

75. Hartwig E.E., Edwards. C.J. (1970) Effects of morphological characteristics upon seed yield in soybeans. Agron. J. 62: 64-65

76. Hedley C.L., Ambrose M.J. (1985) In: The Pea Crop (Eds. P.D. Hebblethwaite, M.C. Heath & T.C.K. Dawkins). Butteworths, London

77. Halluer A.R., Miranda. J.B. (1988) Quantitative genetics in maize breeding, 2nd edn. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA

78. Hernandez P., Dorado G., Cabrera A., Laurie D.A., Snape J.W, and Martin A (2002) Rapid verification of wheat-Hordeum introgressions by direct staining of SCAR, STS, and SSR amplicons. Genome 45:198-203

79. Herrmann R.G., Martin R., Busch W., Wanner G., Hohmann U. (1996) Physical and topographical mapping among Triticeae chromosomes. Symp Soc Exp Biol 50: 25-30

80. Hicks M., Adams D., O'Keefe S., Macdonald E., Hodgetts R. (1998) The development of RAPD and microsatellite markers in lodgepole pine (Pinus contorta var. latifolia). Genome 41: 797-805

81. Hunter R.L., Markert. C.L. (1957) Histochemical demonstration of enzymes separated by zone electrophoresis in starch gels. Science 125:1294-1295

82. Irzykowska L., Wolko В., Swikcicki, W.K. (2002) Interval mapping of QTLs controlling some morphological traits in pea, Cellular & Molecular Biology Letters 7: 417-422

83. Jansen R.C., Stam P. (1994) High resolution of quantitative traits into multiple loci via interval mapping. Genetics 136: 1447-1455

84. Jena K.K., Khush G.S., Kochert G. (1994) Comparative RFLP mapping of a wild rice, Oryza officinalis, and cultivated rice, O. sativa. Genome 37 (3): 382389

85. Jiang C., Sink K.C., (1997) RAPD and SCAR markers linked to the sex expression locus M in asparagus. Euphytica 94: 229-333

86. Joshi C.P., Nguyen H.T. (1993) RAPD (Random Amplified polymorphic DNA) analysis based intervarietal relationships among hexaploid wheat. Plant Science 93: 95-103

87. Jung G., Ariyarathne H.M., Coyne D.P., Nienhuis J. (2003) Mapping QTL for Bacterial Brown Spot Resistance under Natural Infection in Field and Seedling Stem Inoculation in Growth Chamber in Common Bean. Crop Sci. 43:350-357

88. Kallo G., Dhankhar A.S., Rai M., (1976) Variability and correlation studies in peas (Pisum sativum L.). Haryana J. Hortic. Sci. 5: 252-560

89. Kang M.S., Miller J.D., Tai. P.Y.P. (1983) Genetic and phenotypic path analyses and heritability in sugarcane. Crop Sci. 23:643-647

90. Karp A., Kresovich S., Bhat K.V., Ayada W.G., Hodgkin T. (1997) Molecular tools in plant genetic resources conservation: a guide to the technologies. IPGRI technical bulletin no 2. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy

91. Kojima Т., Nagoda Т., Noda К., Ogihara Y. (1998) Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in Eincorn wheat in relation to that of RFLP markers. Theor Appl Genet 96: 37-45

92. Komatsuda Т., Nakamura I., Takaiwa F., and Oka S. (1998) Development of STS markers closely linked to the vrsl locus of barley, Hordeum vulgare. Genome 41:680-685

93. Konieczny A., and Ausubel F.M. (1993) A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. Plant J. 4: 403-410

94. Korol A.B., Ronin Y.I., Nevo E. (1998) Approximate analysis of QTL-environment interaction with no limits on the number of environments. Genetics 148: 2015-2028

95. Kruglyak L., Lander E.S., (1995) A nonparametric approach for mapping quantitative trait loci. Genetics 139: 1421-1428

96. Kumar L.D., Kathirvel M., Rao G.V., Nagaraju J. (2001) DNA profiling of disputed chilli samples {Capsicum, annum) using ISSR-PCR and FISSR-PCR marker assays. Forensic Sci. Int. 116: 63-8

97. Kunzel G., Korzun L., Meister A. (2000) Cytologically integrated physical restriction fragment length polymorphism maps for the barley genome based on translocation breakpoints. Genetics 154:397-412

98. Lander E.S., Green P., Abrahamson J., Barlow A., Daly M.J., Lincoln SJ. Newburg L. (1987) MAPMAKER: An interactive computer package for constructing primary genetic linkage mapsof experimental and natural populations. Genomics 1: 174-181

99. Lander E.S., Botstein D. (1989) Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics 121 185-199

100. Lanza L.L.B., de Souza Jr. C.L., Ottoboni L.M.M., VieiraM.L.C., de Souza A.P. (1997) Genetic distance of inbred lines and prediction of maize single-cross performance using RAPD markers. Theor Appl Genet 94 (8): 1023-1030

101. Laroche A., Demeke Т., Gaudet D.A., Puchalski В., Frick M., McKenzie R. (2000) Development of a PCR marker for rapid identification of the Bt-10 gene for common bunt resistance in wheat. Genome 43: 217-223

102. Laucou V., Haurogne K., Ellis N., Rameau C. (1998) Genetic mapping in pea. 1. RAPD-based genetic linkage map of Pisum Sativum. Theor Appl Genet 97: 905-915

103. Lebreton C.M., Visscher P.M., Haley C.S., Semikhodskii A., Quarrie S.A., (1998) A nonparametric bootstrap method for testing close linkage vs. pleiotropy of coincident quantitative trait loci. Genetics 150: 931-943

104. Lincoln S., Daly M., Lander E. (1992) Constructing genetic maps with MAPMAKER/EXP 3.0. Whitehead Institute Technical Report 3rd edn. Whitehead Institute, Cambridge, Massachusetts

105. Lincoln S.E., Daly M.J., Lander E.S. (1993) Mapping genes controlling quantitative traits using MAPMAKER/QTL version 1.1. A tutorial and reference manual. A Whitehead Institute for Biomedical Research Technical Report

106. Litt M., Luty J.A (1989) A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet. 44: 397-401

107. Lukowitz W., Gillmor C.S., Scheible W.R. (2000) Positional cloning in Arabidopsis. Why it feels good to have a genome initiative working for you. Plant Physiol. 123: 795-805

108. Mano Y., Sayed-Tabatabaei B.E., Graner A., Blake Т., Takaiura F., Oka S., Komatsuda T. (1999) Map construction of sequence-tagged sites (STSs) in barley (Hordeum vulgare L.). Theor Appl Genet 98: 937-946

109. Manzanares-Dauleux M.J., Barret P., Thomas G. (2000) Development of pathotipe specific SCAR marker in Plasmodiophora brassicae. Europen Journal of Plant Pathology 106: 781-787

110. Masojc P. (2002) The application of molecular markers in the process of selection. Cell, and Mol. Bio. Lett. 7:499 509

111. Mather K., Jinks J.L. (1977) Introduction to biometrical genetics. Cornell University Press, Ithaca, NY, pp 32-129

112. Mather K., Jinks J.L. (1982) Biometrical genetics: The study of continues variation. 3rd ed. Chapman and Hall, NY, pp 65-81

113. Mauricio, R. (2001) Mapping quatitative trait loci in plants: uses and caveats for evolutionary biology, review genetics 2: 370-381

114. Meksem K., Leister D., Peleman J., Zabeau M, Salamini F., Gebhardt C. (1995) A high-resolution map of the vicinity of the R1 locus on chromosome V of potato based on RFLP and AFLP markers. Mol. Gen. Genet. 249: 74-81

115. Messeguer R., Ganal M., de Vicente M.C., Young N.D., Bolkan H., Tanksley S.D. (1991) High resolution RFLP map around the root knot nematode resistance gene (Mi) in tomato. Theor Appl Genet 82: 529-536

116. Meyer W., Michell T.G., Freedman E.Z., Vilgalys R. (1993) Hybridization probes for conventional DNA fingerprinting used as single primers in polymerase chain reaction to distinguish strain of Cryptococcus neoformans. J Clin Biol 31: 2274-2280

117. Milbourne D., Meyer R., Bradshaw J.E., Baird E., Bonar N., Provan J., Powell W., Waugh R. (1997) Comparison of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato. Molecular Breeding 3: 127136

118. Mohammadi S.A., Prasanna B.I.M., Sudan C., Singh N.N. (2002) A microsatellite marker based study of chromosomal regions and gene effects on yield and yield components in maize, Cellular & Molecular Biology Letters, Volume 7: 599-606

119. Mohan M., Nair S., Bhagwat A., Krishna T.G., Yano. M. (1997) Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants. Molecular Breeding 3:87-103

120. Moller E.M., Bahnweg G., Sandermann H., Geiger H.H. (1992) A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA fromfllamentos fungi, fruit bodies and infected tissues. Nucleic Acids Res. 20: 61156116

121. Multani D.S., Lyon B.R. (1995) Genetic fingerprinting of Australian cotton cultivars with RAPD markers. Genome 38:1005-1008

122. Nagaoka Т., Ogihara Y. (1997) Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theor Appl Genet 94: 597-602

123. Nagaraju J., Goldsmith M.R. (2002) Silkworm genomics-progress and prospects Current Science 83 (4): 415-425

124. Naqvi N.I., Bonman J.M., Mackill D.J., Nelson R.J., Chattoo B.B. (1995) Identification of RAPD markers linked to a major blast resistance gene in rice. Molecular Breeding 1:341-348

125. Nazarenko LA., Bhatnagar S.K., Hohman RJ. (1997) A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer". Nucleic Acids Res. 25:2516-2521

126. Newbury H.J., Fofd-Lloyd B.V. (1993) The use of RAPD for assessing variation in plants. Plant Growth Regulation 12: 43-51

127. Nilson N.O., Hallden C., Hansen M., Hjerdin A., Sail T. (1997) Comparing the distribution of RAPD and RFLP markers in a high density linkage map of sugar beet. Genome 40:644-651

128. Noli E., Salvi S., Tuberosa R. (1997) Comparative analysis of genetic relationships in barley based on RFLP and RAPD markers. Genome 40: 607616

129. Olson M., Hood L., Cantor C., Botstein D. (1989) A common language for physical mapping of the human genome. Science 245:1434-1435

130. Paniego N., Echaide M., Munoz M., Fernandez L., Torales S., Faccio P., Fuxan I., Carrera M., Zandomeni R., Suarez E.Y., Hopp H.E. (2002) Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus annuus L.). Genome 45(1): 34-43

131. Paran J., Michelmore R.W. (1993) Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet 85: 985-993

132. Parsons B.J., Newbury H.J., Jackson M.T., Ford-Lloyd B.V. (1997) Contrasting genetic diversity relationships are revealed in rice (Oryza sativa L.) using different marker types. Molecular Breeding 3:115-125

133. Paterson A.H., Lander E.S., Hewitt J.D., Peterson S., Linkoln S.E., Tanksley S.D. (1988) Resolution of quantitative traits into Mendelian factors by using a complete linkage map of restriction fragment length polymorphisms. Nature 335: 721-726

134. Paterson A.H. (1995) Molecular dissection of quantitative traits: Progress and prospects. Genome Res 5: 321-333

135. Perry M.D., Davey M.R., Power J.B., Lowe K.C., Bligh H.F.J., Roach P.S., Jones C. (1998) DNA Isolation and AFLP™ Genetic Fingerprinting of Theobroma cacao (L.). Plant Molecular Biology Reporter 16: 49-59

136. Pilet-Nayel M.L., Muehlbauer F.J., McGee R.J., Kraft J.M., Baranger A., Coyne C.J. (2002) Quantitative trait loci for partial resistance to Aphanomyces root rot in pea. Theor Appl Genet 106:28.39

137. Price A.H., Steele K.A., Moore B.J., Barraclough P.B., Clark L.J. (2000) A combined RFLP and AFLP linkage map of upland rice (Oryza saliva L.) used to identify QTLs for root-penetration ability. Theor Appl Genet 100:49-56

138. Qui J., van Senten E., Tuzun S. (1995) Optimization of DNA amplification fingerprinting to study genetic relationships of white lupin germplasm. Plant Breeding 114: 525-529

139. Rafalki J.A., Tingey S.V. (1993) Genetic diagnostics in plant breeding; RAPDs, microsatelites, and machines. TIG 9 (8): 275-280

140. Rameau C., Denoue D., Fraval F., Haurogne K., Josserand J., Laucou V., Batge S., Murfet I.C. (1998) Genetic mapping in pea. 2. Identification of RAPD and SCAR markers linked to genes affecting plant architecture. Theor Appl Genet 97: 916-928

141. Remingthon D.L., Whetten R.W., Ziu B.H., O'Mailey D.M. (1999) Construction of an AFLP genetic map with nearly complete genome coverage in Pimts taeda. Theor Appl Genet 98:1279-1292

142. Roder M.S., Plaschke J., Konig S.U., Borner A., Sorrells M.E., Tanksley S.D., Ganal M.W. (1995) Abundance, variability and chromosomal location microsatellites in wheat". Mol. Gen. Genet. 246: 327-333

143. Rus-Kortekaas V., Smulder M.J.M., Arens P., Vosman V. (1994) Direct comparision of levels of genetic variation in tomato detected by a GACA- containing microsatellite probe and by random amplified polymorphic DNA. Genome 37: 375-381

144. Saiki R. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. (1990) Amplification of genomic DNA. In (eds) PCR protocols. Academic Press, Inc. San Diego: pp. 13-20

145. Saliba-Colombani V., Causse M., Gervais L., and Philouze J. (2000) Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome. Genome 43: 29-40

146. Sanchez de la Hoz M.P., Davila J.A., Loarce Y., Ferrer E. (1996) Simple sequence repeat primers used in polymerase chain reaction amplifications to study genetic diversity in barley. Genome 39: 112-117

147. Sanchez-Escribano E.M., Martin J.P., Carreno J., Cenis J.L. (1999) Use of sequence-tagged microsatellite site markers for characterizing table grape cultivars. Genome 42: 87-93

148. Sax K., (1923) The association of size differences with seed-coat pattern and pigmentation in Phaseolus vulgaris. Genetics 8: 552-560

149. Schnable P.S., Hsia A.P., Nikolau B.J. (1998) Genetic recombination in plants. Curr Opin Plant Biol 1:123-129

150. Simsek M., Adnan H. (2000) Effect of single mismatches at З'-end of primers on polymerase chain reaction. Medical Sciences 2: 11-14

151. Singh M.N., Singh R.B. (1989). Genetic analysis of yield traits in pea. Crop Improvement 16: 62-70

152. Soller M., Brody T. (1976) On the power of experimental designs for the detection of linkagebetween marker loci and quantitative loci in crosses between inbred lines. Theor Appl Genet 47: 35-39

153. Southern E.M. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98 (3): 503-517

154. Stackelberg M.V., Lindemann S., Menke M., Riesselmann S., Jacobsen H.J. (2003) Identification of AFLP and STS markers closely linked to the def locus in pea. Theor Appl Genet 106:1293-1299

155. Steel R.G.D., Torrie J.H. (1982) Principles and procedures of statistics. Mc Grow-Hill, New York

156. Stuber C.W., Edwards M.D., Wendel J.F. (1987) Molecular marker-facilitated investigations of quantitative trait loci in maize, n. Factors effecting yield and its componant traits. Crop Science 27:639-648

157. Svitashev S., Bryngelsson Т., Li X., Wang R.R.C. (1998) Genome specific repetitive DNA and RAPD markers for genome identification in Elymus and Hordelymus. Genome 41: 120-128

158. Swiecicki W.K. (1987) A second costata gene (lum-2) on chromosome 3. The Pisum Newsletter 19: 70-71

159. Swiecicki W.K., Wolko В., Weeden N.F. (2000) Mendel's genetics, the Pisum genome and pea breeding. Vortr. Planzenzuchtg 48: 65-76

160. Tanksley S.G. (1993) Mapping polygenes. Annu Rev Genet 27: 205-233

161. Tanksley S.D., Ganal, M.W., Martin G.B. (1995) Chromosome Vanding: A parading for map-based gene cloning in plants with large genomes. Trends Genet. 11: 63-68

162. Tautz D. (1989) Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers. Nucleic Acids Res. 17 (16): 6463-6471

163. Thoday J.M. (1961) Localisation of polygenes. Nature 191: 368-370

164. Timmerman-Vaughan G.M., McCallum J.A., Frew T.J., Weeden N.F. Russell A.C. (1996) Linkage mapping of quantitative trait loci controlling seed weight in pea (Pisum sativum L.). Theor Appl Genet 93: 431-439

165. Timmerman-Vaughan G. M., Frew T. J., Russell A. C., Khan Т., Butler R., Gilpin M., Murray S., Falloon K. (2002) QTL Mapping of Partial Resistance to Field Epidemics of Ascochyta Blight of Pea, Crop Science 42:2100-2111

166. Tingey S.V., Rafalsky J.A., Williams J.G.K. (1992) Genetic analysis with RAPD markers. In: Proceeding of the Symposium: "Application of RAPD technology to plant breeding". Joint Plant Breeding Symposia Series. Minneapolis, Minnesota, US. pp.3-6

167. Tinker N.A., Mather D.E. (1995) Methods for QTL analysis with progeny replicated in multiple environments. J Quantitative Trait Loci http://probe.nalusda.gov:8000/otherdocs/jqtl/jqtl 1995-01/jqtl 15 html

168. Tiwari K.R., Penner G.A., Warkentin T.D. (1997) Inheritence of powdery mildew resistance in pea. Can. J. Plant Sci. 77:307-310

169. Tsumura Y., Ohba K., Strauss S.H., (1996) Diversity and inheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii) and sugi (Cryptomeria japonica). Theor Appl Genet 92: 40-45

170. Van de Wiel C., Arens P., Vosman B. (1999) Microsatellite retrieval in lettuce (Lactuca sativa L). Genome 42:139-149

171. Van der Knaap E., Lippman Z.B., Tanksley S.D. (2002) Extremely elongated tomato fruit controlled by four quantitative trait loci with epistatic interactions. Theor Appl Genet 104: 241-247

172. Van Eck, H.J., Rouppe J., Van Der V., Draaistra J., Van Zandvoort P., Van Enckevort E. and et al., (1995) The inheritance and chromosomal localization of AFLP markers in a non-inbred potato offspring. Mol. Breed. 1:397-410

173. Vaz Patto M.C., Torres A.M., Koblizkova A., Macas J., Cubero J.I., (1999) Development of a genetic composite map of Vicia faba using F2 populations derived from trisomic plants. Theor Appl Genet 99:736-743

174. Virk P.S., Zhu J., Newbury H.J., Bryan G.J., Jackson M.T., Ford-Lloyd B.V. (2000) Effectiveness of different classes of molecular markers for classifying and revealing variations in rice (Oryza sativa) germplasm. Euphytica 112: 275284

175. Vos P., Hogers R., Bleeker M., Reijans M, Van der Lee Т., Homes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414

176. Wang G.L., Paterson A.H. (1994) Assessment of DNA pooling strategies for mapping of QTLs. Theor Appl Genet 88: 355-361

177. Warner J.N. (1952). A method for estimating heritability. Agron. J. 44:427430

178. Waugh R., Powell W. (1992) Using RAPD markers for crop improvement. Trends Biotechnol. 10: 186-191

179. Weber J.L., May P.E., (1989) Abundant class of human DNA polymorphism which can be typed using the polymerase chain reaction. Am J Hum Genet 44: 388-396

180. Weeden N.F., Timmerman G.M., Hemmat M., Kneen B.E., Lodhi M.A. (1993) Inheritance and reliability of RAPD markers. Applications of RAPD Technology to Plant Breeding 12-17

181. Weeden N.F., Swiecicki W.K., Timmerman-Vaughan G.M., and et al., (1996) The current pea linkage map. Pisum Genetics 28: 1-4

182. Weeden N.F., Ellis T.H.N., Timmerman-Vaughan G.M., Swiecicki W.K., and et al., (1998) A consensus linkage map for Pisum sativum. Pisum Genetics 30: 1-4

183. Welsh S., McCleland M. (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18: 7213-7218

184. Weng C., Kubisiak T.L., Stine M. (1998) SCAR markers in a longleaf pine x slash pine Fj family. Forest Genetics 5 (4): 239-247

185. Whitkus R., Doebley J., Lee M. (1992) Comparative genome mapping of sorghum and maize. Genetics 132:119-1130

186. Wicking C., Williamson B. (1991) From linked marker to gene. Trends Genet 7: 288-293

187. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1990) DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: 6231-6235

188. Wolf D.P., Hallauer A.R. (1997) Triple testcross analysis to detect epistasis in maize. Crop Sci. 37:763-770

189. Wright S. (1968) Evolution and genetic of populations: I. Genetic and Biometric foundations. University of Chicago Press, Chicago, pp. 371-420

190. Wu J.Y., Wu H.K. Chung M.C. (2002) Co-dominant RAPD markers closely linked with two morphological genes in rice (Oryza saliva L). Bot Bull Acad Sin 43: 171-180

191. Yu Z.H., McCouch S.R., Kinoshita Т., Sato S., Tanksley S.D. (1995) Association of morphological and RFLP markers in rice (Oryza sativa L.). Genome 38: 566-574

192. Yu K., Park S.J., Poysa V. (1999) Abudance and variation of microsatellite DNA sequences in beans (Phaseolus and Vigna). Genome 42: 27-34

193. Zeng Z.B. (1994) Precision mapping of quantitative trait loci. Genetics 136: 1457-1468

194. Zhang L.H., Ozias-Akins P., Kochert G., Kresovich S., Dean R., Hanna W. (1999) Differentiation of bertnuda grass (Cynodon spp) genotypes by AFLP analyses. Theor Appl Genet 98: 895-902

195. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. (1994) Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20: 176-183

196. В заключение автор хотел бы поблагодарить заведующего кафедрой генетики биологического ф-та МГУ, академика С.В. Шестакова за предоставленную возможность обучения и проведения данной диссертационной работы.