Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Картирование и молекулярно-генетический анализ генов гороха (Pisum sativum L.)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Картирование и молекулярно-генетический анализ генов гороха (Pisum sativum L.)"

На правах рукописи

Коновалов Федор Андреевич

КАРТИРОВАНИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ГОРОХА (Pisum sativum L.)

Специальность 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва,2006г. ОБЯЗАТЕЛЬНЫЙ '

БЕСПЛАТНЫЙ ; ЭКЗЕМПЛЯР J

Работа выполнена в лаборатории генетики растений кафедры генетики Биологического факультета МГУ им. М.ВЛомоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Гостимский Сергей Александрович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Голдевкова-Павлова Ирнна Васильевна

кандидат биологических наук Малееве Юлия Владимировна

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН

Защита диссертации состоится « »_2006г. в _часов на заседании

Диссертационного совета Д 002.214.01 при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, ул.Губкина, д.З. Факс: (495) 132-89-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан « »_2006 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.НЛолухина

Х006Й-

IWH

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Приоритетным направлением в картировании геномов высших растений сегодня является разработка надежных методов для сопряжения рекомбинационных и физических карт, а также поиск новых генетических маркеров, позволяющих проводить сравнительное картирование геномов различных видов. Среди множества типов молекулярных маркеров, удовлетворяющих указанным критериям, одними из самых удобных и надежных являются CAPS'-маркеры, выявляющие полиморфизм по наличию сайтов рестрикции внутри последовательностей уникальных генов растений.

В случае гороха посевного (Pisum sativum L.), важного объекта генетики растений, вышеупомянутые направления только начинают развиваться. До сих пор не создана полноценная система надежных маркерных локусов, пригодных для широкого использования в генетическом анализе и для сопоставления генетической карты гороха с физическими картами других бобовых, в первую очередь люцерны Medicago truncatula, геном которой будет секвенирован в 2007 г. В ряде работ уже составлены подробные карты групп сцепления гороха на основе маркеров, выявляемых с помощью произвольных праймеров [Weeden et al., 1998; Rameau et al., 1998; Irzikowska et al., 2001; Чегамирза, 2004], a также локализовано некоторое количество генов с помощью CAPS-метода [Brauner et al., 2002], однако область применения таких маркерных систем пока ограничена либо в силу малой воспроизводимости методов случайного ампликона, либо из-за отсутствия данных о полиморфизме маркеров среди подавляющего числа важнейших линий и сортов. Кроме того, количество известных CAPS-маркеров, выявляющих внутригенный полиморфизм у гороха, пока невелико. Для множества генов гороха с известной последовательностью, доступных в базе GenBank, отсутствует информация о локализации в геноме и о внутривидовой изменчивости. Микросателлитные маркеры, большое число которых описало в работе [London et al., 2005], будучи достаточно надежными и высокополиморфными, мало пригодны для сопоставления генетической карты гороха с физической картой люцерны из-за недостаточного консерватизма большинства сайтов отжига праймеров.

Таким образом, существует необходимость локализации генов гороха с известной последовательностью и создания надежных молекулярных маркеров на их основе. Кроме того, возможность успешного использования маркерных локусов определяется наличием информации об их полиморфизме у репрезентативного набора линий и сортов, и любая работа по получению такой информации сегодня является актуальной и востребованной.

CAPS - Cleaved Amplified Polymorphic Sequences

РОС НАЦИОНАЛЫ! \Я

библиотека

с.-Петербург ОЭ гор^акт

Пель настоящей работы - построить генетическую карту для гороха посевного на основе молекулярных маркеров типа CAPS, выявляющих полиморфизм в последовательностях уникальных генов. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Амплифшшровать фрагменты ряда уникальных генов гороха посевного с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР);

2. Выявить полиморфизм в амшшфицированных последовательностях среди сортов и линий гороха;

3. Локализовать полиморфные генные последовательности на карте групп сцепления в ходе генетического анализа популяции гибридов F2 от скрещиваний (СЫ115 х WL1238) и (Флагман х WL1238);

4. Определить наиболее вероятное положение ортологичных локусов на физической карте генома Medicago truncatula и сравнить полученные данные с результатами генетического картирования у гороха.

Научная новизна

Впервые изучен полиморфизм по наличию сайтов рестрикции 12 эндонуклеаз во фрагментах 60 генов гороха, полученных из ДНК различных сортов и линий.

Проведена локализация полиморфных фрагментов 40 генов на карте групп сцепления гороха. Положение на карте 15 генов гороха определено впервые. Разработана система CAPS-маркеров, использованная для анализа полиморфизма и картирования генома гороха.

Предложена система для идентификации 24 линий, сортов и подвидов гороха на основе шести высокополиморфных CAPS-маркеров.

В результате поиска in silico предполагаемых ортологов изученных генов у люцерны Medicago truncatula на генетической карте гороха и физической карте люцерны выявлены участки с выраженной макросинтенией.

Практическая значимость

Новая система из 40 маркерных локусов, подкрепленная данными о полиморфизме маркеров у важнейших линий и сортов гороха, позволит быстро и эффективно проводить точную локализацию генов хозяйственно важных признаков у данного модельного объекта.

Впервые полученная информация о локализации 15 генов гороха найдет свое применение в изучении мутантов с нарушениями, имеющими отношение к функциям данных генов.

Продемонстрировано успешное применение САРБ-метода у гороха в целях паспортизации линий и сортов. Предложенная система идентификации 24 линий, сортов и подвидов гороха на основе 6 маркеров может быть легко расширена и адаптирована для применения в биотехнологии и сельском хозяйстве.

Представленные в диссертации результаты использованы в подготовке задачи практикума по молекулярно-генетическому картированию у растений, проводимого на кафедре генетики МГУ.

Апробадия работы

Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, ИОГен РАН, 28 июня - 2 июля 2006 г.); на XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 12-15 апреля 2006г.); на Конкурсе работ молодых ученых ИОГен РАН (Москва, 2006 г.); на XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 12-15 апреля 2005г.); на Конкурсе работ молодых ученых ИОГен РАН (Москва, 2005 г.); на Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Звенигород, 28 ноября - 2 декабря 2005 г.); на Третьем международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 1418 марта 2005 г.); на XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 12-15 апреля 2004г.); на III Съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС), Москва, 6-12 июня 2004 г.; на Конкурсе работ молодых ученых ИОГен РАН (Москва, 2004 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на_страницах,

состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и

обсуждение», заключения, выводов и списка литературы, включающего_источников.

Работа содержит_рисунков и_таблиц.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 01-04-48080, 04-0448956) и программы поддержки ведущих научных школ (грант НШ-1731,2005).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Исходный материал

В работе были использованы сорта, мутанты и маркерные линии гороха посевного (Pisunt sativum I..), гороха полевого (Pisum sativum ssp arvense; линия JI2423), абиссинского подвила гороха (Р sativum ssp. abyssinicum\ линия JI2) а также видов P.elatius ( линия JI64) и Phumile (линия JI1794) из коллекции кафедры генетики биологического факультета МГУ и коллекции центра Джона Иннеса (Норвич, Великобритания).

Для получения картирующих популяций скрещивали мутант "Chill5" и сорт "Флагман" с маркерной линией "WL1238". Две популяции F2 (WL1238 х СЫ115) и (WL1238 х Флагман), состоящие из 223 и 147 индивидуальных растений, соответственно, получили путем самоопыления гибридов первого поколения. Растения всех поколений выращивали в полевых условиях.

Выделение геномной ДНК гороха

Для выделения геномной ДНК из зеленой массы растений гороха использовался один из вариантов СТАВ-метода [Torres et al., 1993] с незначительными модификациями.

Полимеразная цепная реакция

Амплификацию проводили в приборе МС2 производства фирмы «ДНК-Технология». Конечный объем реакционной смеси составлял 25 мкл и содержал 5 мкл раствора ДНК, 2.5 ед. Taq-полимерэзы (Силекс М.), 250 мкМ каждого дНТФ (Силекс М.), по 0 5 мкМ каждого праймера и 2 5 мкл 10х стандартного ПЦР-буфера (Силекс М). Доводили объем деионизированной водой до 25 мкл. Для предотвращения испарения амплификационной смеси использовали 20 мкл минерального масла (Sigma). Амплификация проводилась по следующей программе:

1. Предварительная денатурация 94°С, 2 мин 30 сек

2. Пять циклов 1) 94°С, 30 сек

2) Тт+2°С, 30 сек

3) 70°С, 1 мин 30 сек

3. Тридцать пять циклов 1) 93 °С, 20 сек

2) Тт, 30 сек

3) 71,5°С, 1 мин

4. Конечная элонгация 72°С, 3 мин

Tm (температура отжига) подбиралась для каждой пары праймеров с помощью программы Sigma-Genosys DNA Calculator и оптимизировалась эмпирически.

Обработка ПЦР-фрагментов эндонуклеазами рестрикции

Для анализа полиморфизма и генотипирования CAPS-маркеров использовались эндонуклеазы рестрикции Tru9l, Taql, RsaI, НаеIII, AspLEl, Bs/FNl, HpaU, Hinfl, PspWl, 5sfDEI, Bst4Ci и AM производства компании «СибЭнзим». Сайты узнавания всех указанных ферментов имеют в своем составе 4 пары оснований или эквивалентны по своей специфичности сайтам из 4 п.о. при наличии в их составе вырожденных нуклеотидов (как, например, сайт эндонуклеазы Hinfl (ЗЛАКТС).

Обработка ПЦР-продуктов эндонуклеазами рестрикции проводилась в исходной ПЦР-смеси, разбавленной деионизированной водой в 2 раза или неразбавленной (в зависимости от концентрации фрагмента), с добавлением соответствующего буфера фирмы-производителя до рекомендованной концентрации 1х, а также BSA при использовании эндонуклеазы Taql.

Фракционирование фрагментов ДНК

Разделение фрагментов ДНК, полученных в результате амплификации, проводили стандартным электрофорезом в 1.7% агарозном геле при напряженности электрического поля 3 В/см. В качестве буферной системы использовали TBE; для приготовления геля применяли агарозу Amresco Type I. Окрашивание ДНК проводили путем окрашивания геля раствором бромистого этидия (конечная концентрация 0,001%). Для определения длин фрагментов ДНК использовали маркер молекулярного веса ЮОЬр +1.5 kbp производства «СибЭнзим».

Клонирование и секвенирование ПЦР-фрагментов

ПЦР-фрагменты для клонирования были выделены из реакционной смеси и очищены с помощью набора Fermentas PureXtreme согласно протоколу производителя. Клонирование фрагментов проводилось в клетках Escerichia coli JM109 с использованием вектора pTZ57R/T и набора Fermentas InsT/Aclone согласно протоколу производителя.

Секвенирование клонированных фрагментов проводилось на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer в центре коллективного пользования «Геном» (ИМБ РАН, зав. центром Полтараус А.Б.). В качестве праймеров для секвенирования использовались стандартные олигонуклеотиды М13. Для секвенирования протяженных фрагментов (более 1000 п.о.) с помощью программы Oligo 4.0 были дополнительно подобраны 19- или 20-членные внутренние праймеры к двум концам секвенированных участков фрагмента.

Обработка результатов генетического анализа

При работе гибридологическим методом производили подсчет величин фенотипических классов в расщепляющихся популяциях ¥г с оценкой достоверности соответствия наблюдаемого соотношения Но-гипотезе статистическим методом %2 («хи-квадрат»). При этом расчитывали суммарное значение хг по следующей формуле-

Х^Е.СО.-Е^/Е,,

где О, - наблюдаемая величина фенотипического класса по ¡-компоненту, Е, -ожидаемое значение [Серебровский, 1970]. Полученное значение сравнивали с табличным по Фишеру, принимая число степеней свободы df равным числу фенотипических классов, уменьшенному на 1. Вероятность случайности отклонения р принимали не превышающим 0.05. Если полученное суммарное значение хг не превышало табличное, делали вывод об отсутствии оснований для отвержепия Но-гипотезы

Для генетического анализа расщеплений в F2 использован программный пакет Mapmaker/EXP 3.0 [Lander et al., 1987] с порогом LOD > 3 0 и максимальным расстоянием между сцепленными локусами 50 сМ. В качестве картирующей функции использовалась формула Косамби.

Для каждого CAPS-маркера в программе Mapmaker были найдены сцепленные с ним локусы Для этого использовалась команда "near" с порогом LOD-балла 3.00. Используя рапее полученные данные о расположении маркеров и локусов морфологических признаков, а также определяя наиболее вероятное местонахождение среди них новых CAPS-маркеров с помощью команд "order" и "try", мы провели локализацию изученных генных фрагментов на карте групп сцепления гороха.

Каждый маркер считался локализованным в том случае, если между ним и известным якорным локусом (ранее изученным CAPS-маркером или локусом морфологического признака) было зарегистрировано сцепление при генетическом расстоянии менее 40 сМ (функция Косамби) и значении LOD-балла не менее 3.00. В ряде случаев локализация считалась подтвержденной, если новый маркер был сцеплен с ранее картированными случайными маркерами, составляющими непрерывную цепь (с LOD не менее 3.00 и расстоянием между соседями менее 40 сМ) до ближайшего якорного локуса. При построении общих карт «группой сцепления» считалась цепочка локусов, значение LOD-балла для всех интервалов между которыми было равно или превосходило 3.00. Карты групп сцепления строились с помощью команды "тар". Для вывода таблицы расстояний и значений LOD-балла для каждой последовательности локусов использовалась команда "lod".

Поиск гомологичных последовательностей в базах данных

Поиск предполагаемых гомологов исследуемых генов гороха в геноме люцерны проводился с помощью программы WU-BLAST 2.0 на сайте TIGR fhttp.V/tigrblast.tigr org/er-blast/index cgi?proiect=mtbe') в базе данных нуклеотидных последовательностей "Daily Contig Pipeline - All Medicago BACs" по состоянию на 24 мая 2006 г., включающую все секвенированные на тот момент участки генома люцерны, в том числе со статусом "draft". При проведении анализа обычно использовался алгоритм tblastn, а в качестве запросов в форму вводились белковые последовательности предполагаемых продуктов генов гороха, приведенные на страницах с их описанием в Genbank. Такой подход обеспечивает повышенную чувствительность поиска и наибольшую функциональную близость обнаруженных фрагментов генома люцерны к исследуемым генам гороха. В ряде случаев, когда транслированная последовательность гена имела небольшой размер из-за наличия в нем крупных интронов, использовался стандартный алгоритм blastn. Обнаруженные ВАС-клоны, имеющие наибольшее сходство с каждым геном (значение Е-value не более Ю'10), были локализованы на физической карте генома люцерны с помощью программы CViT-BACs (bttp://medicago.org/genome/cvit bacs.phpl.

Результаты и обсуждение

ПЦР-амплификация фрагментов генов гороха

Среди литературных данных и в базе ОепЬапк был проведен поиск генов гороха для подбора праймеров и постановки ПЦР-амплификации. Поскольку обязательным условием дальнейшего генетического картирования ПЦР-фрагментов являлась возможность выявить полиморфизм их последовательностей, приоритет получали те гены, в состав которых входили протяженные интроны, окруженные более консервативными экзонными участками. В ходе отбора было выявлено 62 гена, удовлетворяющих указанным критериям (Табл. 1 и 2).

Табл. 1. Гены, локализованные с помощью CAPS-метода в работе [Brauner et al, 2002] и ____использованные в качестве якорных локусов _

№ Ген Кодируемый белок № в Genbank

1 Aair Изомероредуктаза гликолевой кислоты AJ251333

2 Apxl Аскорбатпироксидаза М93051

3 Ару Апираза типа S АВ038554

4 Bfruct Бета-фруктозофуранозидаза Х85328

5 CipPor Протохлорофиллидредуктаза Х63060

6 Copl Белок конститутивного фотоморфогенеза AJ276592

7 Fbpp Фруктозобисфосфатаза хлоропластная AF378925

8 Gsnl Глутаминсинтетаза цитоплазматическая U28924

9 Gsp Глутаминсинтетаза хлоропластная U22971

10 Hopl Гомеодомен-содержащий белок AF063307

11 HsfA Транскрипционный фактор теплового шока AJ010644

12 Ivdh Изовалерил-коА- дегидрогеназа AJ010946

13 P628 Глицеральдегид-3 -фосфат-дегидрогеназа -

14 Paal Фенилаланин-аммоний-лиаза Dl0002

15 Pepc Фосфоенолпируваткарбоксилаза хлоропластов D64037

16 Phy Апопротеин фитохрома XI4077

17 Rb АДФ-глюкозопирофосфорилаза Х96766

18 Rpl22 Рибосомальный белок большой субъединицы, 22 кДа М60951

19 Sahh в-аденозин-Ь-гомоцистеингидролаза L36119

20 Sodmt Mn-суп ероксиддисмутаза Х60170

21 Ssyn Сахарозосинтаза И AJ001071

22 TubAl Альфа-тубулин U12589

23 Uni LEAFY-подобный белок UNI AF010190

24 Vc2 Вицилин J/K Х67429

25 Vc3 Вицилин XI4076

Последовательности 25 генов среди отобранных уже были использованы зарубежными авторами в качестве CAPS-маркеров при картировании генома гороха, поэтому в настоящей работе они выполняли роль якорных локусов. Последовательности праймеров для их амплификации были взяты из литературных источников [Brauner et al., 2002].

Поиск в базе NCBI Nucleotide позволил найти последовательности более 500 генов гороха с различной степенью изученности, чаще всего без информации о локализации в геноме. Среди таких записей GenBank нами было отобрано 37 генов с ошимальной длиной и экзон-интронной структурой (длина не менее 2000 п.о., суммарная длина интронов между выбранными сайтами отжига праймеров не менее 500 п.о.; табл. 2).

Табл. 2. Гены, праймеры для амплификации которых были подобраны в ходе работы

№ Ген Кодируемый белок № в Genbank

1 Acsl 1 -Аминоциклопропан-1 -карбоксилатсинтаза AF016460

2 Adhl Алкогольдегидрогеназа Х06281

3 As2 Аспарагинсинтетаза 2 У13322

4 AtpFl Р1-АТФаза, субъединица 5' L13320

5 Bgll Бета-1,3-глюканаза L02212

6 СЫ Белок, сходный с кальциневрином В AY883569

7 Cryl Криптохром-1 апопротеин AY508970

8 Cyp?3 Гидроксилаза транс-р-фенилакриловой кислоты AF175275

9 Dbh ОЕАО-Ьох РНК-хеликаза AY513583

10 EgU Эндо-1,4-бета-глюканаза L41046

11 Fedl Ферредоксин I М31713

12 Frol Железоредуктаза AY747697

13 GapCl Глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа Х73150

14 GapN Глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа нефосфорилирующая U34988

15 GprAJI в-белок, субъединица а-Н AF533439

16 GprB в-белок, субъединица р AF533440

17 Gr Глутатион редуктаза Х90996

18 Hoi Предшественник гемоксигеназы 1 AF276230

19 Hsp70 Белок теплового шока Х69213

20 Iaa6 Ауксин-индуцируемый белок Х68218

21 lcdhl НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа I AY730588

22 U ТИЛ -подобный белок, регулятор времени зацветания AY343326

23 Mccc 3-Метилкротонил-КоА-карбоксилаза АВ075695

24 Mdharl Монодегидроаскорбатредуктаза I AY662655

25 MgchlD Магний-хелатаза, субъединица Э AF014399

26 Mkrn Макорин, белок с доменом ЫЫО-йт^сг АВ116263

27 Mil Металлотионеин-подобный белок Z23097

28 Nin Фактор иншшации нодуляции AJ493064

29 P4* Орган-специфичный белок Р4 Х51594

30 Peam4 \lADS-box транскрипционный фактор, гомолог АР1 AJ291298

31 PhlC Фосфолипаза С AF280748

32 Pk4 Фототропин I AY093427

33 Psil Вакуолярная кислая инвертаза AY112703

34 Rnp33 Рибонуклеопротсин с массой 33 кДа AF255058

35 S2* Орган-специфичный белок Б2 Х51595

36 Sdh4 Сукцинатдегидрогеназа, субъединица 4 АВ070892

37 Sym29 СЬУ1-подобная рецепторная киназа с ЫШ-доменом AJ495759

* Амплификацию фрагментов S2 и Р4, имеющих сходные последовательности,

предполагалось проводить мультиппексно с помощью универсальных праймеров

После подбора праймеров и отработки условий ПЦР удалось амплифицировать фрагменты почти всех целевых генов гороха, за исключением семи (ChlSyn, Lf, S2, Р4, CYP73a, Petal, Icdhl). В указанных случаях синтез продуктов нужной длины не происходил.

Длины продуктов ПЦР при низком уровне неспецифической амплификации, которого удавалось добиваться путем оптимизации условий, соответствовали ожидаемым (Табл. 3). В некоторых случаях (гены Adhl, Mil, Sym29) с высокой повторяемостью наблюдалась амплификация одного-двух дополнительных продуктов, что может быть связано с неспецифическим отжигом праймеров или с наличием в геноме паралогичных последовательностей.

Табл. 3. Длины всех амплифицированных фрагментов генов гороха

№ Ген Длина продукта, п.о. Л» Ген Длина продукта, П.О.

1 Aair 2600 32 Icdhl _

2 Acsl 1800 33 Ivdh 1950

3 Adhl 1500, 1300,1200 34 M -

4 Apxl 1700 35 Mccc 2250

5 Ару 2000 36 Mdharl 2350

6 As2 1100 37 MgchlD 1000

7 AtpFl 2200 38 Mkm 2350

g Bfruct 500 39 Mtl 850*, 370

9 Bull 1200 40 Nm 2600

10 СЫ 2250 41 P62S -

11 CipPor 1100 42 Paal -

12 Cop1 2000 43 Peam4 2150

13 Cryl 2000 44 Pepc 3500

14 Cyp73 - 45 PhlC 2550

15 Dbh 2050 46 Phy 1650

16 Egll 2400 47 Pk4 2200

17 Fbpp 1700 48 Psil 1900

18 Fed! 800*» 49 Rb 3000

19 Frol 2400 50 Rnp33 2050

20 GapCl 2300 51 Rpl22 900

21 GapN 1400 52 S2.P4 -

22 GprAIl 2300 53 Sahh 1500

23 GprB 2200 54 Sdh4 2200

24 Gr 2200 55 Sodmt 1400

25 Gsnl 1350 56 Ssyn 1850

26 Gsp 900 57 Sym29 1600,300**

27 Hoi 1850 58 TubAl 1350

28 Hopl 900 59 Um 1250

29 HsfA 500 60 Vc2 1600

30 Hsp70 1950 61 Vc3 2350

31 laa6 1950

* Выявлен полиморфизм по длине фрагмента, ** Выявлен полиморфизм по наличию/отсутствию амплифицированного фрагмента

В двух случаях (фрагмент Fedl длиной 850 п.о., соответствующий целевой последовательности и отсутствующий у линии WL1238, а также дополнительный продукт реакции с праймерами к гену Sym29, имеющий длину около 300 п.о., не соогветствующий

целевой последовательности и амплифицирующийся только с ДНК линии Флагман) был обнаружен полиморфизм по наличию/отсутствию амплифицированного фрагмента, причем проверка растений Fi показала, что в обоих случаях полиморфные варианты ведут себя как состояния менделевских признаков с взаимодействием по типу полного доминирования. Данный вид полиморфизма в случае гена Fedl был использован в генетическом анализе.

При амплификации участка гена М/ с ДНК различных линий гороха был обнаружен полиморфизм по длине фрагмента: среди двух продуктов реакции более протяженный (около 900 п.о.; этот фрагмент соответствует целевой последовательности) у линии WLI238 имел несколько большую длину (на ~5%), чем у линии Chi 115. Полученный таким образом кодомияантный маркер с полиморфизмом по длине ПЦР-фрагмента был использован в генетическом анализе.

Многие гены морфогенеза, а также важные структурные гены цепи биосинтеза хлорофилла у гороха не секвенированы, однако их выделение из генома может быть осуществимо в ходе ПЦР с вырожденными праймерами. Данные о локализации таких генов стали бы важным подспорьем для идентификации различных мутантных локусов у сортов и линий гороха, содержащихся в отечественных и мировых коллекциях. В настоящей работе была предпринята попытка выделить шесть неизвестных генов гороха с целью их дальнейшего изучения и локализации. Для подбора праймеров были использованы последовательности шести генов Arabidopsis thaliana: генов CLV2, FAS] и FAS2, участвующих в регуляции структуры апикальной меристемы, и генов CHLG, CHLI и CHLH, продукты которых играют важную роль в синтезе хлорофилла. Интерес к данным локусам вызван прежде всею тем, что фенотип соответствующих мутантов Arabidopsis имеет сходные черты с фенотипом растений нескольких линий гороха, полученных в ходе работ по индуцированному мутагенезу на кафедре генетики МГУ.

Подбор вырожденных праймеров проводился вручную с использованием множественного выравнивания (ClustalW) последовательностей указанных генов и их известных гомологов у бобовых.

Табл. 4. Предполагаемые гены гороха с неизвестной последовательностью

№ Ген Кодируемый белок № в Genbank Ортолог Arabidopsis

1 PsCHLG Хлорофилл-синтаза NM 115041

2 PsCLV2 СЬУ2-подобный белок DQ478949* NM 105212

3 PsFASl FAS 1-подобный белок DQ480717* NM 105221

4 PsFAS2 РА82-подобный белок DQ480716* NM 203263

5 PsCHIJ Магний-хелатаза, субъед. I NM 117962

б PsCHLH Магний-хелатаза, субъед. Н NM 121366

* [Коновалов и др., 2006] 11

В случае предполагаемых генов РхСЬ К?, ЛЛ4Ж?, РяСНП и РвСНШ после

оптимизации условий реакции удалось получить ПЦР-фрагменты ожидаемого размера без выраженного фона неспепифических продуктов (Табл. 5). Фрагменты Р.чСЬУ2, РзРАЯ! и Р.чРЛ82 были клонированы и секвенированы, а их последовательности были размещены в базе ОепВапк под соответствующими номерами (Табл. 4). При амплификации с праймерами для гена РхСНЮ наблюдалось большое количество неспецифических продуктов, и выделение данного гена у гороха на текущий момент признано нами не удавшимся.

Табл. 5. Параметры ПЦР и длины фрагментов предполагаемых генов гороха

Л Фрагмент Праймеры (прямой я обратный) Tm, °C Длина продукта, п.о.

1 PsCHLG GATACAATGGTRCCAATWGAWTGYTTTGA TATGACAAGCTYGGWRTYCGGTAT - -

2 PsCLV2 CCTGAGAGTTTRCTKTATTTGAAGTC GAGAAAGATACYTGAGGTTKGWCC 58 835

3 PsFASl CGTTGTCKAAGCTTGTWGATG AGCTTCWCWTCTATTTYTMTCC 55 933

4 PsFAS2 GATACCCATGCACACTATGTTC CAAGTAGAAATGAACCATCWGGAG 60 368

5 PsCHLl ATTGGWGGTGTRATGATMATG ACTATKTCWCCTCTYAATCCATC 60 800

6 PsCHLH GTTGAAGCTTGTGAGRACATTG ACATCCTTRTCAAGATTRCAYTG 60 1500

Таким образом, в ходе первого этапа работы были подобраны праймеры и успешно отработаны условия для амплификации фрагментов 60 генов гороха со средней длиной 1800 п.о. и максимальной длиной 3500 п.о.

Секвенирование и анализ последовательностей фрагментов генома гороха

Фрагменты предполагаемых генов гороха PsCLV2, PsFASl и PsFAS2 были клонированы в Т-векторе и секвенированы. Во всех трех последовательностях с помощью ORF Finder были выявлены открытые рамки считывания. Анализ последовательностей выявил их сильное сходство с теми генами A. thaliana и других видов растений (в первую очередь бобовых), которые были использованы при подборе праймеров. Сходство последовательностей гипотетических белковых продуктов с гомологами Arabidopsis составило 74% и 87% для CLV2, 52% и 71% для FAS1,1А% и 84% для FAS2 (первое число -без учета синонимичных замен, второе - с учетом таковых; параметры результатов BLASTp identities и positives, соответственно).

Для определения экзон-интронной структуры секвенированных фрагментов был проведен поиск сайтов сплайсинга вручную и с помощью программы GenScan. Во фрагменте PsCLV2 сайтов сплайсинга обнаружено не было; внутри фрагмента PsFASl выявлено три предполагаемых интрона, а внутри фрагмента PsFAS2 - один интрон (рис. 1; экзон-интронная структура фрагментов также указана в записях GenBank, см. Табл. 4) .

203 п о.

PsFASI

ОТ AI

£¡100 П.О.

—L

ST AG 147 П.О. ОТ AG 68 П.О.

Л

шШМт

— 192 п.о. F-^fe?" PsFAS2 ^

Рис. 1. Предполагаемая экзон-интронная структура фрагментов Р.%РА8! и Р$РА82 Экзоны заключены в прямоугольники, интроны представлены линиями «АК» - число аминокислотных остатков.

Поиск полиморфизма внутри фрагментов генов гороха среди набора контрастных линий и сортов

Среди различных методов поиска полиморфизма по наличию сайтов рестрикции в амплифицированных фрагментах генов нами было выбрано экспериментальное расщепление ПЦР-продуктов, полученных из ДНК ряда контрастных линий гороха, 12 эндонуклеазами рестрикции (рис. 2). Набор ДНК контрастных линий включал в себя три или четыре образца, полученных из растений сорта Флагман, мутанта Chil 15, маркерной линии WL1238 и представителя вида Pisum humile линии JI1794, использованной авторами одной из генетических карт в качестве тестерной [Brauner et al., 2002], В ряде случаев линия JI1794 не использовалась. Набор эндонуклеаз рестрикции был составлен на базе каталога «СибЭнзим» и включал в себя следующие ферменты: AM, AspLEI, BstACl, ÄtfDEl, ÄtfFNI, HaeП1, Hinfl, HpaII, PspfiAl, Rsal, Taql, Tru9l.

Продукты амплификации 60 фрагментов генов гороха, полученные из ДНК трех или четырех контрастных линий (включая или не включая JI1794), были обработаны каждой из 12 эндонуклеаз рестрикции. Продукты расщепления были разделены электрофорезом в агарозном геле, после чего спектры фрагментов ДНК различных линий были сопоставлены между собой, а также с теоретическими ожидаемыми спектрами, полученными на основе последовательностей генов в GenBank с помощью программы REBase REBsites flittp://tools.neb.com/REBsites/index.php3'> (Рис. 2, 3,4).

- Флагман -Хл-115

М

-ХЛ-115

I-WL1238

Г.........и т.д.

М

1500 4»-. 1000 f*»

^liß^

1500 1000

Tru9 I

Rsa I Hae III AspLE I BsiFN I Hpn II

Рис. 2. Поиск рестриктного полиморфизма во фрагменте гена Hol, амплифицированного из

ДНК линий гороха Флагман, Chill 5 и WL1238 и обработанного шестью различными эндонукпеазами рестрикции. Электрофорез в 1.7% агарозном геле. Маркер длин фрагментов ДНК- "100 bp + 1.5 kbpDNA Ladder" (СибЭнзим).

В ходе проделанной работы был обнаружен полиморфизм внутри 43 фрагментов генов гороха, выявляемый одной или несколькими эндонукпеазами рестрикции (Табл. 6). 15 фрагментов были признаны мономорфными по наличию сайтов рестрикции всех использованных ферментов. Полиморфизм внутри фрагментов PsCLV2 и PsFAS2 не изучался в связи с их небольшой длиной (~300 п.о. в случае PsFAS2) или высокой степенью консерватизма последовательности, выявленной с помощью BLAST на межвидовом уровне (в случае PsCLV2). В трех случаях (Acsl, Phy, Psil) полиморфизм был выявлен только между идентичными спектрами линий Флагман, СЫ115 и WL1238, с одной стороны, и спектром линии JI1794 - с другой стороны; отсутствие полиморфизма в картирующих популяциях не позволило локализовать данные гены.

Сравнение спектров с теоретически ожидаемыми позволило подтвердить специфичность амплификации и соответствие ампликонов целевой последовательности во всех случаях, кроме гена алкогольдегидрогеназы Adhl (среди трех амплифицированных фрагментов только самый протяженный соответствовал целевой последовательности, согласно спектрам его индивидуального расщепления эндонуклезами рестрикции после выделения из геля и очистки).

REBSKes

Эксперимент

Oui Tru»l

<ш

9000-

1000 - —

500 - —

— —

100 - SS

Rsa I

Тгив I

M

bp ip

1000I

5001

1009

^flUiÄ' Ш1

Рис. 3. Сравнение ожидаемых (слева) и наблюдаемых (справа) спектров рестриктных фрагментов участка гена Rnp33. Слева • компьютерная модель электрофореграммы, полученная с помощью программы REBSites на основе известной последовательности фрагмента (№ в Genbank AF255058) Справа, обработка ампликона Rnp33 эндонуклеазами Rsal и Tru91; 1, 2, 3- линии гороха Флагман, Chill5 и WL1238, соотв. Электрофорез в 1 7% агарозном геле. Маркер длин фрагментов ДНК - "100 bp + 1 5 kbp DNA Ladder" (СибЭнзим) Видно, что спектры линии Chilis совпадают с теоретически ожидаемыми.

XI А2 A3 M В1 В2 ВЗ В4 Cl С2 СЗ С4

■ s

1500 1000

01 02 D3 D4 El Е2 БЗ Е4 Fl Г2 РЗ F4

ФР'Ш^ШЯЁЬ га

«да

Рис. 4. Поиск рестриктного полиморфизма во фрагменте гена Aair. 1,2, 3, 4-линии гороха Флагман, Chilli, Ш1238иЛ1794, соответственно; расщепление эндонуклеазами: А - Тги91, В - Taql, С -Rsal, D - HaelII, Е - AspLEl, F - BstFNl, G - Hpall, H-Hinfl, I-PspN4I, J-BstDEI, К - Bst4CI, L-Alul Электрофорез в 1.7% агарозном геле. Маркер длин фрагментов ДНК - "100 bp + 1.5 kbp DNA Ladder" (СибЭнзим).

61 62 ез 04 Hl Н2 НЗ В4

!gf%fM

; ¿j Щ

J1 J2 J3 J4 Kl К2 КЗ К4 LI L2 L3 1.4

о» mm «•»

Табл. 6. Число полиморфных вариантов дчя всех изученных фрагментов среди трех ти четырех проанализированных линий гороха

№ Маркер Число линий Число ITB № Маркер Число линий Число ИВ

1 Aair 4 2 31 HsfA 3 1*

2 Acsl 4 2* 32 Hsp70 4 1*

3 Adhl 3 2 33 laaó 3 2

4 Apxl 4 3 34 Ivdh 3 2

5 Ару 4 3 35 Mccc 4 2

6 As2 4 3 36 Mdharl 4 3

7 AtpFl 3 2 37 Mgchll 3 2

8 BJruct 3 1* 38 MgchlD 3 1*

9 Bgll 3 2 39 MgchlH 3 1*

10 СЫ 4 4 40 Mkrn 3 1*

11 CipPor 3 3 41 Mtl 4 2

12 CLV2 - 42 Nin 3 2

13 Copl 3 2 43 Peam4 3 2

14 Cryl 4 3 44 Pepe 3 2

15 Dbh 4 2 45 PhLypC 3 3

16 EgU 3 2 46 Phy 4 2*

17 FAS1 4 2 47 Pk4 •> j 2

18 FAS2 - 48 Psil 4 2*

19 Fbpp 3 2 49 Rb 3 3

20 Fedl 3 2 50 Rnp33 3 3

21 Frol 4 4 51 Rpl22 3 2

22 GapCl 4 3 52 Sahh 4 3

23 GapN 3 1* 53 Sdh4 3 1*

24 GprAII 3 2 54 Sodmt 3 2

25 GprB 3 3 55 Ssyn 3 3

26 Gr 3 1* 56 Sym29 3 1*

27 Gsnl 3 2 57 TubAl 3 3

28 Gsp 3 1* 58 Uni 3 1*

29 Hol 3 2 59 Vc2 4 1*

30 Hopl 3 1* 60 Vc3 3 1*

* Полиморфизм между линиями Флагман, Chilis и WL1238 не выявлен, что не дало возможности локализовать ген входе генетического анализа

Дополнительный анализ полиморфизма внутри амплифицированных фрагментов среди линий, сортов и различных видов гороха

Высокий уровень полиморфизма, обнаруженный в ходе предварительного анализа среди 3 или 4 линий гороха и проявляющийся как наличие множества полиморфных сайтов рестрикции в составе фрагментов ряда генов, делает полученные на их основе CAPS-маркеры многообещающим инструментом не только для картирования генома гороха, по и для надежной паспортизации линий и сортов этого важного вида культурных растений: вопроизводимость результатов при генотипировании методом CAPS значительно выше, чем

при работе с RAPD и другими методами случайного ампликона, и широкое распространение CAPS-маркеров в паспортизации сортов затруднено в первую очередь из-за недостатка полиморфизма по каждому отдельному локусу У гороха до сих пор не проводилось масштабных исследований изменчивости последовательностей генов, ставших предметом изучения в настоящей работе. По этой причине нами был проведен дополнительный анализ рестриктного полиморфизма по ряду CAPS-маркеров с вовлечением дополнительных линий, сортов, подвидов и видов гороха (рис. 5). Среди проанализированных сортов большая часть представляет собой исходные формы, использованные ранее в программе индуцированного мутагенеза на кафедре генетики МГУ; изученные маркерные линии обычно используются в качестве тестерных при проведении генетического анализа. Генотипирование 13 широко используемых в генетическом анализе сортов и линий гороха (рис. 5) было проведено с использованием 24 полиморфных CAPS-маркеров (Приложение 1); в определении генотипа по 9 наиболее полиморфным локусам (Aair, Adhl, Ару, Cryl, Fbpp, Frol, Hol, Peam4, Rnp33) было задействовано 24 линии, сорта, вида и подвида гороха (табл. 7).

М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 />ис. 5. Внутривидовой п 0 z:, W. полиморфизм по спектрам

рестрикционных фрагментов тт участка гена ЯпрЗЗ,

ЗЦ м» mm тт ям *** тт тт *

1000

расщепленного эндонукчеазами Тги91 (вверху) "TT Ä «тт»9***-*. " Rsal (внизу), среди 13 линий

, Шя mm IB ** mm Шт ** mm и сортов гороха (№№ 1-13,

100 <е» шк ¿«3« Iг г lÄ1 i't — соответственно Pcjhhuü

М 1 ,2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Ученый. Капитап< фш6иу

' WJ * Флагман, Немчиновский, Роза

~ ' - * f'* ■ Краун, Виола, Chilli,

= mm Ът *т mm WL1238, WL1132,WL851,

И тт т» mm mm mm WL1072, Slow) Электрофорез

500 5* mm mm Лт """ *** mm' *** *** e 1.7% агарозном геле Маркер

длин фрагментов ДНК - "100 bp + 1.5 kbp DNA Ladder " (СибЭнзим)

V (t ft- -yS 1 * »¡5 « »" V ^ *

Генотипирование линий и сортов гороха позволило выявить относительно высокий уровень полиморфизма, в случае ряда генов сопоставимый с таковым для микросателлитных маркеров гороха [London et al., 2005] (к примеру, при обработке фрагмента Hoi эндонуклеазой НраИ нами выявлено 7 полиморфных вариантов; в указанной работе для микросателлитных локусов было обнаружено в среднем по 5 полиморфных вариантов среди 8 контрастных линий гороха). Полученная информация о состоянии полиморфных сайтов рестрикции у 24 линий, сортов, видов и подвидов гороха позвочила создать набор молекулярных маркеров для их надежной паспортизации и идентификации (Табл. 7).

Минимальное число маркеров, позволяющее однозначно различать все исследованные линии, равно 6; другими словами, для идентификации любой линии достаточно провести одновременно или последовательно 6 реакций. Используемые в созданном наборе эндонуклеазы рестрикции отличаются сравнительно невысокой стоимостью.

Табл. 7. Распределение полиморфных вариантов по б САРБ-маркерам у 24 линий, сортов,

подвидов и видов гороха.

! I Н ! { I И I ! И § ! I : ! I

Аак Нае III Сгу1 Тад 1 №рр Тая 1 Рго1 Тач I

НОХ Нрз II

ЯпрЗЗ Тги91

Использование САРв-полиморфизма для локализации генов на карте групп

сцепления гороха

Для локализации генов с полиморфными последовательностями на карте групп сцепления гороха бью проведен генетический анализ в популяциях гибридов Иг от скрещиваний (СЫ115 х \VL1238) и (Флагман х №Ь1238). В данных популяциях уже проводился анализ с использованием большого числа случайных маркеров, в ходе которого были построены насыщенные карты групп сцепления гороха [Чегамирза, 2004].

В ходе генетического анализа было идентифицировано состояние всех полиморфных маркеров у 38-120 растений Р2 одной или двух популяций (рис. 6). Расщепления по каждому маркеру были проверены на соответствие гипотезе о моногенном наследовании (кодоминантное проявление, расщепление 1:2:1) с помощью подсчета в большинстве случаев значительных отклонений обнаружено не было.

М1 234 56 789 10 11 12

bp - *

100 - Jggggb _ _ ^ ^

Рис. 6. Расщепление по полиморфным состояниям маркера PhlC (ген фосфолипазы С) у гибридов Fj от скрещивания Chill5 х WL1238. Расщепление эндонуклеазой TaqI 1,2-родительские растения; 3-12 - растения F2. Электрофорез в 1 7% агарозном геле Маркер длин фрагментов ДНК- "100 bp + 1 5 kbp DNA Ladder" (СибЭнзим).

1 1 1 1 ш 1 1 1 |3 Ж 3 1 1 % Я т щ 1 т 1 ш !-V S'.

3 3 3 Щ 1 3 1 1 1 з1 1 т 1 1 1 3 3 1 3 1 6 4 5 3

1 1 1 т 1 1 1 ud 1 1 1 1 ш 1 lit т 1 3 1 1 1 4 1

5 1 Sil 1 3 3 1 [Ms 1 1 щ 5 5 $ 3 1 3 3 1 4 ft 4

1 1 1 3 1 1 1 1| 4 1 1 1 1 1 3 p. 1 ш 1 5 4 6 7

№ 3 3 4 3 it 1 ш. 4 3 3 3 т 3 5 4 5 1

После проверки достоверности гипотез о моногенном наследовании полиморфных вариантов данные о расщеплениях были внесены в общие исходные файлы формата Mapmaker для двух указанных скрещиваний, содержащие ранее полученные данные о фенотипе растений по качественным морфологическим признакам и по ряду случайных маркеров (около 125 в каждой популяции) [Чегамирза, 2004; Чегамирза и др., 2004].

В ходе проведенного генетического анализа удалось локализовать большую часть исследованных маркеров. Некоторые гены с неясной локализацией {Cryl, Реат4, Frol, GapCl) во время выполнения данной работы были картированы в других лабораториях [Grusak et al., 2004; Hecht et al., 2005], и поэтому могут бьггь использованы в качестве якорных локусов. Принадлежность ряда новых маркеров к известным группам сцепления определить не удалось. Среди локусов с неясным положением - гены Dhh, Bgll, Hol и AtpFl. Тем не менее, каждый среди указанных локусов проявил сцепление с несколькими RAPD-маркерами, сегрегирующими в картирующих популяциях, и в совокупности с ними изученные гены были выделены в отдельные «дополнительные» группы сцепления. Точное картирование генов будет завершено по мере ввода в анализ новых маркеров.

Проведенная работа показала, что исследованные локусы распределены по всем 7 хромосомам гороха. Наибольшее количество генов локализовано в самой протяженной III группе сцепления, длина которой составила 180 2 сМ. Протяженные участки с достоверным сцеплением исследованных локусов выявлены также в V (от гена R до Fbpp, 87.4 сМ) и в VII (от Gsnl до 1ааб, 157.6 сМ) группах сцепления.

Интегрированные данные о локализации исследованных генов и маркеров, полученные в ходе генетического анализа на популяциях F2, представлены на схеме (рис. 7). Положение 15 генов определено впервые; положения других локусов, известные по литературным данным, были подтверждены или по меньшей мере не опровергались: случаи их достоверного сцепления с маркерами других районов генома не зарегистрированы

В ходе работы удалось локализовать два фрагмента генома гороха (PsChll и PsFasl), предположительно гомологичные генам A thaliana CHLI и FAS1. Полученная информация представляет большой интерес, поскольку картированные локусы могут выступать в качестве кандидатов для идентификации мутантных генов у растений гороха с дефектами биосинтеза хлорофилла (в случае PsChll) и с признаком фасциации стебля (в случае PsFasl). Особенно важен тот факт, что фрагмент PsFasl локализован в том же районе V группы сцепления, что и одна из мутаций, приводящая к фасциации стебля в сочетании с гипернодуляцией [Sidorova and Uzhintseva, 1995]. Тест на косегрегацию между мутантным аллелем данного гена и полиморфным CAPS-маркером PsFasl, возможно, позволит ответить на вопрос о роли гена-гомолога FAS1 у гороха посевного.

II

III

IV

VI VII

f Nln

\Cop1

AS2 Cryl

I A

I Mccc I Mdharl

I К i Wb

i GprB I Rb TubA1

GprAH Chl11S Sodmt i Adhl

1 Rnp33 РЫС

СЫ I В Ball

ClpPor

I Pk*

I Le

Ssyn

GapC1

Fro1

О

i R V

I Ару i PsFatl

вр ' Fbpp

Hp!22

Fl

Fetff

Ssni

PsChll Aalr

ilvdh l Mil I laaB

Локусы морфологических признаков

Гены, локализованные впервые

Гены с подтвержденной локализацией

Рис. 7. Схема хромосом гороха с приблизительными положениями изученных генов, полученная при объединении карт для двух популяций F2 и литературных данных. Белой линией отмечены участки между локусами, для которых хотя бы на одной популяции показано достоверное сцепление (LOD-балл не менее 3 00). Относительные длины групп сцепления соответствуют карте из работы [Ellis et al, 2002].

Сравнение генетической карты гороха с распределением предполагаемых ортологов изученных генов на физической карте генома М.1гипсаШа

САР Э-маркеры, выявляющие внутригенный полиморфизм, могут с успехом бьггь использованы для сопряжения генетических и физических карт [Мекяеш « а1., 2005]. Наличие большого числа локализованных генов во всех группах сцепления позволило нам провести сопоставление полученной генетической карты гороха с распределением предполагаемых гомологичных последовательностей на физической карте генома люцерны К^edicago ¡гипсаш1а (рис. 8). Поиск гомологов в секвенированной части генома люцерны был проведен т ьШсо с использованием последовательностей генов гороха из ОепВапк и последовательностей их предполагаемых белковых продуктов. Для поиска в геноме люцерны предполагаемых гомологов гена РяСИИ гороха использовалась последовательность гена СЫ1

сои (D45857), так как ген субъединицы I Mg-хелатазного комплекса гороха еще не секвенирован. Аналогично, при поиске гомологов гена Sahh использовалась последовательность гена аденозилгомоцистеиназы люцерны Medicago sativa (№ в Genbank L36119), на базе которой были подобраны праймеры для ПЦР с ДНК гороха [Brauner et al., 2002].

Кроме того, на физической карте люцерны были локализованы участки, сходные с секвенироваными генами классических морфологических признаков гороха, менделевскому локусу R (отвечающему за форму семян) соответствует ген SBEI (№ в Genbank Х80009), а локусу Le - ген гибберелин-ЗР-карбоксилазы (№ в Genbank U93210).

20 локусов из 42 проанализированных оказались расположены у гороха и люцерны в тех хромосомах, для которых была показана высокая степень сшггении в экспериментальных работах по сравнительному картированию на уровне генетического анализа. Такие локусы были обнаружены во всех группах сцепления гороха, в первую очередь в III группе (8 локусов). Таким образом, физическая карта генома люцерны М. truncatula сохраняет определенную степень соответствия генетической карте гороха, хотя и в меньшей степени, чем генетическая карта люцерны М. sativa [Kalo et al., 2004].

Многие предполагаемые ортологи генов гороха оказались локализованы в негомологичных, согласно литературным данным, районах хромосом люцерны. Отчасти это может быть связано с тем, что найденные in silico последовательности не являются наиболее близкими гомологами генов гороха, а обнаружение последних в настоящий момент было невозможным из-за незавершенности процесса секвенировапия генома люцерны. Кроме того, расположение ряда ВАС-клонов на незаконченной физической карте может быть ошибочным, поскольку применяемая при ее построении степень избыточности секвенируемых клонов довольно невелика и в настоящий момент составляет около 2 [VandenBosch and Stacey, 2003]. Тем не менее, в некоторых случаях при сохранении общей синтенности района хромосомы имеет место локальное несоответствие порядка следования локусов в геномах гороха и люцерны, которое может быть объяснено наличием инверсий и других перестроек хромосом (в частности, у люцерны не соблюдается порядок следования локусов III группы сцепления гороха Adhl - PhlC - СЫ - CipPor, хотя все сходные с ними фрагменты располагаются в гомологичной 3 хромосоме). Кроме того, очень высокая степень сходства (значение Е-value меньше Ю"200) последовательностей ряда генов гороха с некоторыми участками генома люцерны, расположенными в несинтенных районах, может говорить о наличии в геноме люцерны паралогичных локусов, небольших дупликаций или траяслокаций. По мере завершения работы в области физического картирования и секвенирования генома люцерны полученные результаты будут уточнены.

Capí

II

Mccct

? *

Sayn

варС1

Fed1

Рис. 8. Сопоставление карты групп сцепления гороха (римские цифры) и физической карты хромосом люцерны (арабские цифры). Сегменты хромосом, синтения между которыми предполагается исходя из литературных данных [Kalo el al„ 2004; Choi et al., 2004a, b J, объединены тонировкой. На карте отмечены гены, расположенные в синтенныхрайонах хромосом.

Как и следовало ожидать, относительные расстояния между локусами на генетической и физической картах могут различаться (см. участки Nin - Copl, PhlC - Adhl -TubAl, R - Ару - PsFasl). Тем не менее, полученные данпые могут быть использованы в качестве ориентира при поиске генов-кандидатов для мутаций, картированных у гороха с помошью генетического анализа, а при проведении более точной локализации мутантных локусов - как инструмент для позиционного клонирования генов in silico.

Выводы

1. Подобраны последовательности праймеров и оптимизированы условия для амплификации фрагментов 60 генов гороха посевного;

2. Обнаружен существенный уровень внутривидового полиморфизма у гороха по наличию сайтов рестрикции в амплифицированных фрагментах 43 генов, что обеспечивает возможность широкого применения полученных CAPS-маркеров в генетическом анализе, в том числе в других лабораториях;

3. Показана возможность применения CAPS-метода в качестве средства для надежной паспортизации линий и сортов растений. Предложен набор из 6 CAPS-маркеров для идентификации 24 линий, сортов, видов и подвидов гороха;

4. Клонированы фрагменты генома гороха, сходные с генами CLV2, FAS1, FAS2, CHLG, CHLIk CHLHArabidopsis thaliana\

5. На базе 40 генов гороха получены полиморфные CAPS-маркеры с кодоминантным проявлением, локализованные на карте групп сцепления гороха в ходе генетического анализа. 15 уникальных генов гороха локализовано впервые. Обнаружена макросинтения между группами сцепления гороха и участками физической карты генома люцерны Medicago truncatula.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в научных журналах:

1. Konovalov F.A., Toshcbakova Е.А. and Gostimskv S.A. A CAPS Marker Set for Mapping in Linkage Group III of Pea (Pisum sativum L.). Cell. Mol. Biol. Lett. 10 (2005) p.163-172.

2. Гостимский C.A., Кокаева З.Г., Коновалов Ф.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров. Генетика, т.41 (2005) №4 с.480-492.

3. Ковеза О.В., Кокаева З.Г., Коновалов Ф.А., Гостимский С.А. Выявление и картирование полиморфных RAPD-маркеров генома гороха (Pisum sativum L.). Генетика, т.41 (2005) №3 с.341-348.

4 Чсгамирза К., Ковеза О.В., Коновалов Ф.А., Гостимский С.А. Идентификация и локализация гена chill5 и сцепленных с ним ДНК-маркеров у гороха посевного (Pisum sativum L.). Генетика, т.40 (2004) №7 с. 909-915.

5. Cheghamirza К., Koveza O.V., Konovalov F.A. and Gostimsky S.A. Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in pea (Pisum sativum L.). Cell. Mol. Biol. Lett. 7 (2002) p. 649-655.

Тезисы докладов на конференциях:

1. Коновалов Ф.А. Молекулярные маркеры и постгеномные технологии в изучении генетики бобовых. Материалы Международной Конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию ИОГен им. Н.И.Вавилова РАН. М.: РИИС ФИАН, 2006, с. 96.

2. Коновалов Ф.А., Вячеславова А.О. Клонирование и локализация фрагментов генома гороха посевного, сходных с генами FAS1 и FAS2 Arabidopsis thaliana. Материалы XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». М.: Макс-пресс, 2006, с.119.

3. Коновалов Ф.А. Разработка CAPS-маркеров для анализа генома гороха посевного (Pisum sativum L.) и создание базы данных на основе полученной информации Материалы международной конференции «Ломоносов-2005» М/ Макс-пресс, 2005, с. 102.

4. Коновалов Ф.А., Тощакова Е.А., Гостимский С.А. Молекулярно-генетическое картирование генома гороха посевного (Pisum sativum L.). Материалы международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия». М.: Макс-пресс, 2005, с. 180.

5. Коновалов Ф.А., Тощакова Е.А. Внутригенный полиморфизм линий и сортов гороха, выявляемый с помощью метода CAPS. Материалы Третьего Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», 2005, с.259.

6. Коновалов Ф.А. CAPS-маркеры с вырожденными праймерами и их потенциал в картировании геномов растений. Материалы XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004». М.: ООО «Артхамайя», 2004, с.69.

7. Гостимский С.А., Кокаева З.Г., Ковеза О.В., Чегамирза К., Коновалов Ф.А., Дрибноходова О.П. Использование молекулярных маркеров для анализа генома гороха. Материалы ГО Съезда Всероссийского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». М.: Издательство УРСС, т.1,2004, с.69.

8 Cheghamirza К., Konovalov Г.А. Gene-based CAPS markers and their use for genetic mapping in pea (Pisum sativum L.). Proceedings of the Fourth International Iran and Russia Conference '"Agriculture and Natural Resources". Iran, Shahrecord, Dadyar pub., 2004, p.82.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 14.07.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 507. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

»1 59 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коновалов, Федор Андреевич

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Структура генома высших растений.

1.1.1. Размер генома высших растений.

1.1.2. Состав генома растений.

1.1.2.1. Уникальные последовательности.

1.1.2.2. Повторяющиеся последовательности.

1.1.2.2.1. Сателлитная, мини- и микросателлитная ДНК.

1.1.2.2.2. Мобильные генетические элементы.

1.2. Картирование геномов растений.

1.2.1. Генетические карты.

1.2.2. Физические карты.

1.2.3. Интеграция карт.

1.3. Методы выявления полиморфизма ДНК.

1.3.1. Случайные маркеры.

1.3.2. Специфичные маркеры.

1.4. Генетические особенности представителей семейства

Бобовые (Fabaceae).

1.4.1. Выраженная синтенность геномов бобовых.

1.4.2. Горох посевной: особенности объекта и состояние исследований.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Исходный материал.

2.2. Выделение геномной ДНК гороха.

2.3. Полимеразная цепная реакция.

2.4. Обработка ПЦР-фрагментов эндонуклеазами рестрикции.

2.5. Фракционирование фрагментов ДНК.

2.6. Клонирование и секвенирование ПЦР-фрагментов.

2.7. Обработка результатов генетического анализа.

2.8. Поиск гомологичных последовательностей в базах данных.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. ПЦР-амплификация фрагментов генов гороха.

3.2. Клонирование, секвенирование и анализ последовательностей фрагментов генома гороха.

3.3. Поиск полиморфизма внутри фрагментов генов гороха среди набора контрастных линий и сортов.

3.4. Дополнительный анализ нуклеотидного полиморфизма внутри амплифицированных генных фрагментов среди линий, сортов и различных видов гороха.

3.5. Использование CAPS-полиморфизма для локализации генов на карте групп сцепления гороха.

3.6. Сопоставление данных по картированию генов с информацией о положении их ортологов на физической карте M.truncatula.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Картирование и молекулярно-генетический анализ генов гороха (Pisum sativum L.)"

Актуальность проблемы. Открытие методов, позволяющих обнаружить различия между объектами непосредственно в генетическом материале, дало большой скачок в картировании геномов растений. Все ДНК-маркеры обладают существенными преимуществами по сравнению с морфологическими маркерами: они позволяют выявлять полиморфизм в любом участке генома, дают возможность вести анализ по неограниченному числу локусов в одном скрещивании, а различные полиморфные состояния маркеров обычно не оказывают влияния на жизнеспособность организмов [Малышев и Картель, 1997; Saliba-Colombani et al, 2000].

Приоритетным направлением в картировании геномов высших растений сегодня является разработка надежных методов для сопряжения реком-бинационных и физических карт, а также поиск новых универсальных генетических маркеров, позволяющих проводить сравнительное картирование геномов различных видов. Среди нескольких типов молекулярных маркеров, подходящих для этих целей, одними из самых удобных и надежных являются CAPS-маркеры, выявляющие полиморфизм по наличию сайтов рестрикции внутри последовательностей уникальных генов растений [Konieczny and Ausubel, 1993; Weeden et al., 1999; Brauner et al, 2002].

Метод CAPS (ПЦР-ПДРФ) успешно применяется в современных генетических исследованиях. В первую очередь он используется для насыщения генетических карт надежными молекулярными маркерами с точно известной локализацией, относительно которых можно проводить картирование новых генов на широком круге скрещиваний. Впервые система таких маркеров была предложена для Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. [Konieczny and Ausubel, 1993; Jarvis et al, 1994], и благодаря ее использованию картирование мутантных локусов стало простой и несложной процедурой [Baumbusch et al, 2001].

Использование внутригенного полиморфизма в картировании дает возможность не только насыщать карты надежными молекулярными маркерами, но и сопоставлять положения генов у различных видов растений. Сравнительное картирование представляет интерес не только как фундаментальная задача геномики, но и как необходимое подспорье для работ по позиционному клонированию генов у растений, геном которых не секвени-рован. В частности, при изучении новых мутаций сегодня широко применяется метод поиска генов-кандидатов [Borisov et al., 2003; Hecht et al., 2005; Tattersall et al., 2005]. По литературным данным исследователи находят потенциальные гомологи исследуемого гена, изученные у модельных объектов и имеющие сходные функции. Прежде чем гены-кандидаты проверяются на соответствие исследуемому локусу, среди них отбираются те, которые, согласно данным сравнительного картирования между двумя видами, располагаются в гомологичных районах хромосом. Такой подход позволяет во много раз сокращать объем работы при клонировании новых генов и дает возможность активно использовать результаты секвенирования геномов модельных объектов при работе с хозяйственно важными видами растений [Devos and Gale, 2000; Borisov et al., 2003; Choi et al., 2004b; Gonzales et al., 2005].

В случае гороха посевного (Pisum sativum L.), важного объекта генетики растений, вышеупомянутые направления только начинают развиваться. Горох активно используется как модель для изучения генетического контроля ряда комплексных процессов, в первую очередь процессов симбиогенеза с клубеньковыми бактериями [Борисов и др., 1998; Borisov et al., 2003; Greshoff, 2005] и формирования сложного листа [Tattersall et al., 2005]. Несмотря на постоянную необходимость локализации новых генов гороха, до сих пор не создана полноценная система надежных маркерных локусов, пригодных для широкого использования в генетическом анализе и для сопоставления генетической карты гороха с физическими картами других бобовых, в первую очередь люцерны Medicago truncatula Gaertn., геном которой будет секвенирован в 2007 г. [VandenBosch and Stacey, 2003]. В ряде работ уже составлены подробные карты групп сцепления гороха на основе маркеров, выявляемых с помощью произвольных праймеров [Weeden et al., 1998; Rameau et al., 1998; Irzikowska et al., 2001; Чегамирза, 2004], а также локализовано несколько десятков генов с помощью CAPS-метода [Brauner et al., 2002; Grusak et al., 2004; Kalo et al., 2004; Hecht et al., 2005], однако область применения таких маркерных систем пока ограничена либо в силу малой воспроизводимости методов случайного ампликона, либо из-за отсутствия данных о полиморфизме маркеров среди большинства важнейших линий и сортов. Кроме того, количество известных CAPS-маркеров, выявляющих внутригенный полиморфизм у гороха, пока невелико. Для многих генов гороха с известной последовательностью, доступных в базе GenBank, отсутствует информация о локализации в геноме и, что не менее важно, о внутривидовой изменчивости. Микросателлитные маркеры, большое число которых описано в работе [Loridon et al., 2005], будучи достаточно надежными и высоко полиморфными, мало пригодны для сопоставления генетической карты гороха с физической картой люцерны из-за недостаточного консерватизма большинства сайтов отжига праймеров.

Таким образом, существует необходимость локализации генов гороха с известной последовательностью и создания надежных молекулярных маркеров на их основе. Кроме того, возможность успешного использования маркерных локусов определяется наличием информации об их полиморфизме у репрезентативного набора линий и сортов, и любая работа по получению такой информации сегодня является актуальной и востребованной.

Цель настоящей работы - построить генетическую карту для гороха посевного на основе молекулярных маркеров типа CAPS, выявляющих полиморфизм в последовательностях уникальных генов. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Амплифицировать фрагменты ряда уникальных генов гороха посевного с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР);

2. Выявить полиморфизм в амплифицированных последовательностях среди сортов и линий гороха;

3. Локализовать полиморфные генные последовательности на карте групп сцепления в ходе генетического анализа популяций гибридов F2 от скрещиваний (Chil 15 х WL1238) и (Флагман х WL1238);

4. Определить наиболее вероятное положение ортологичных локусов на физической карте генома Medicago truncatula и сравнить полученные данные с результатами генетического картирования у гороха.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Коновалов, Федор Андреевич

1. Подобраны последовательности нраймеров и онтимизированы условия

для амплификации фрагментов 60 генов гороха посевного;

2. Обнаружен существенный уровень внутривидового полиморфизма у

гороха по наличию сайтов рестрикции в амплифицированных

фрагментах 43 генов, что обеспечивает возможность широкого

применения полученных CAPS-маркеров в генетическом анализе, в том

числе в других лабораториях;

3. Показана возможность применения CAPS-метода в качестве средства

для надежной паспортизации линий и сортов растений. Предложен

набор из 6 CAPS-маркеров для идентификации 24 линий, сортов, видов

и подвидов гороха;

4. Клонированы фрагменты генома гороха, сходные с генами CLV2, FAS1,

FAS2, СНЫ и CHLH Arabidopsis thaliam;

5. На базе 40 генов гороха получены полиморфные CAPS-маркеры с

кодоминантным проявлением, локализованные на карте групп

сцепления гороха в ходе генетического анализа. 15 уникальных генов

гороха локализовано впервые. Обнаружена макросинтения между

группами сцепления гороха и участками физической карты генома

люцерны Medicago truncatula.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коновалов, Федор Андреевич, Москва

1. Кузнецова О.И., Аш О.А., Хартина Г.А. и Гостимский А. «Исследование растений-регенерантов гороха (Pisum sativum L.) с номощью молекулярных RAPD- и ISSR-маркеров». Генетика т.41 №1 с.60-65, 2005

2. Малышев СВ., Картель Н.А. «Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений». Молекулярная биология т.31 №62 с. 197-208, 1997

3. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. «Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование». Москва, «Мир», 1984

4. Оганисян А.С., Кочиева Е.З., Рысков А.П. «Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD-PCR». Генетика 32(3): 448451,1996

5. Осинова Е.С., Кокаева З.Г., Троицкий А.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский А. «RAPD-анализ сомаклонов кукурузы». Генетика 37(1): 91-96,2001

6. Прокофьева-Бельговская А. А. «Гетерохроматические районы хромосом». М.: Наука, 1986

7. Саматадзе Т.Е., Муравенко О.В., Зеленин А.В., Гостимский А. «Идентификация хромосом генома гороха (Pisum sativum L.) но рисунку С-окраски». Доклады академии наук 387(5): 714-717, 2002

8. Серебровский А.С. «Генетический анализ». М.: Наука, 1970

9. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев В.Н. «Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя {HordeumvulgareL.)».TGEeTHKSi33(l): 53-60, 1997

10. Сиволап Ю.М., Солоденко А.Е., Бурлов В.В. «RAPD-анализ молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника (Helianthus annuus)». Генетика, т.34, 2: 266-271, 1998

11. Фучжун Л., Гостимский А. «Исследование транслокаций у гороха». Генетика, 34(9): 1-8, 1998

12. Хлесткина Е.К., Салина Е.А., Леонова И.Н., Лайкова Л.И., Коваль Ф. «Иснользование RAPD- и STS-анализа для маркирования генов пятой гомеологической группы хромосом мягкой пшеницы». Генетика, т.35, №35: 1349-1357, 1999

13. Чегамирза К. «Молекулярно-генетическое картирование локусов качественных и количественных признаков у гороха». Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М., 2004

14. Чегамирза К., Ковеза О.В., Коновалов Ф.А., Гостимский А. "Идентификация и локализация гена chill5 и сцепленных с ним ДНКмаркеров у гороха посевного (Pisum sativum L.)". Генетика, т.4О №7 с. 909-915,2004

15. Яковлев, В.Л. Интродукция генов af, def и deh в генотип высокодрожайного сорта гороха «Смарагд». Сборник научных трудов ВНИИ зернобобовых и крупяных культур, с.27-34, 1992

16. Arcade A., Anselin F., Faivre Rampant P., Lesage M.C., Purques L.E., Prat D. "Application of AFLP, RAPD and ISSR markers to genetic mapping of European and Japanese Irach". Theor Appl Genet 100: 299-307, 2000

17. Asakura N., Nakamura C and Ohtsuka I. "RAPD markers lined to the nuclear gene from Triticum tiwpheevii that confers compatability with Aegilops squarrosa cytoplasm on alloplasmic durum wheat". Genome 40: 201-210, 1997

18. Baumbusch L.O., Sundal I.K., Hughes D.W., Galau G.A. Jakobsen K.S. "Efficient protocols for CAPS-based mapping in Arabidopsis". Plant Mol. Biol. Rep. 19: 137-149, 2001

19. Bennett M.D. and Leitch I.J. "Angiosperm DNA C-values database (release 5.0, Dec. 2004)" http://www.rbgkew.org.uk/cvai/homepage.html, 2004

20. Bennett M.D. and Leitch I.J. "Plant Genome Size Research: A Field In Focus". Armals of Botany 95: 1-6, 2005

21. Bennetzen J.L., SanMiguel P., Chen M., Tikhonov A., Francki M., and Avramova Z. "Grass genomes" PNAS 95(5): 1975 1978, 1998

22. Bennetzen J., Ma J. and Devos K.M. "Mechanisms of recent genome size variation in flowering plants". Annals of Botany 95: 127-132, 2005

23. Bhat K.V., Jarret R.L., Rana R.S. "DNA profiling of banana and plantain cultivars using random amplified polymorphic DNA (RAPD) and restriction fragment length polymorphism (RFLP) markers". Electrophoresis 16(9): 1736-1745, 1995

24. Blixt S. "Cytology in Pisum. III. Investigation of five interchange lines and coordination of linkage groups with chromosomes". Agri Hort. Genet. 17(12): 47-75, 1959

25. Borisov A.Y., Madsen L.H., Tsyganov V.E., Umehara Y., Voroshilova V.A., Batagov A.O., Sandal N., Mortensen A., Schauser L., Ellis N., Tikhonovich LA. and Stougaard J. "The Sym35 gene required for root nodule development in pea is an ortholog of Nin from Lotus japonicus". Plant Physiol. 131(3): 1009-1017,2003

26. Bomet, B. Branchard, M. "Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers: Reproducible and Specific Tools for Genome Fingerprinting". Plant Molecular Biology Reporter 19: 209-215, 2001

27. Bowen N.J. and Jordan I.K. "Transposable elements and the evolution of eukaryotic complexity". Curr Issues Mol. Biol. 4(3): 65-76, 2002

28. Bradshaw H.D. Jr., Villar M., Watson B.D., Otto K.G., Stewart S., Stettler R.F. "Molecular genetics of growth and development in Populus. III. A genetic linkage map of a hybrid poplar composed of RFLP, STS, and RAPD markers". Theoretical and Applied Genetics 89(5): 167-178, 1994

29. Brauner S., Murphy R.L., Walling J.G., Przyborowski J. and Weeden, N.F. "STS markers for comparative mapping in legumes". J. Amer. Soc. Hort. Sci. 127(4): 616-622, 2002

30. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. "DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers". Biotechnology (NY) 9(6): 553-557, 1991

31. Caetano-Annoles G. "Amplifying DNA with arbitrary oligonucleotide primers". PCR Methods and Applications 3: 85-94,1993

32. Cavalier-Smith T. "Economy, speed and size matter: evolutionary forces driving nuclear genome miniaturisation and expansion". Annals of Botany 95: 147-175,2005

33. Causse M.A., Fulton T.M., Cho Y.G., Ahn S.N., Chunwongse J., Wu K., Xiao J., Yu Z., Ronald P.C., Harrington S.E., et al. "Saturated molecular map of the rice genome based on an interspecific backcross population". Genetics 138 (4): 1251-1274, 1994

34. Chang C Bowman J.L., DeJohn A.W., Lander E.S., Meyerowitz E.M. "Restriction fragment length polymorphism linkage map for Arabidopsis thaliana". Proc Natl Acad Sci 85 (18): 6856-6860, 1988

35. Cheghamirza K., Koveza O., Konovalov F. and Gostimsky S. "Identification of RAPD markers and their use for molecular mapping in pea (Pisum sativumL.)". Cell. Mol. BioL Lett. 7(2B): 649-655, 2002

36. Cheng Z., Dong F., Langdon Т., Ouyang S., Buell C.R., Gu M., Blattner F.R. and Jiang J. "Functional rice centromeres are marked by a satellite repeat and a centromere-specific retrotransposon". Plant Cell. 14(8): 16911704,2002

37. Choi H.K., Kim D., Uhm Т., Limpens E., Lim H., Mun J.H., Kalo P., Penmetsa R.V., Seres A., Kulikova O., Roe B.A., Bisseling Т., Kiss G.B., Cook D.R. "A sequence-based genetic map of Medicago tmncatula and comparison of marker colinearity with M. sativa". Genetics 166(3): 1463502, 2004a

38. Choi H.K., Mun J.H., Kim D.J., Zhu H., Baek J.M., Mudge J., Roe В., Elhs N., Doyle J., Kiss G.B., Young N.D., Cook D.R. "Estimating genome conservation between crop and model legume species". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(43): 15289-94, 2004b

39. Cnops G., den Boer В., Gerats A., Van Montagu M. and Van Lijsebettens M. "Chromosome landing at the Arabidopsis TORNADO 1 locus using an AFLP-based strategy". Mol Gen Genet. 253(l-2):32-41, 1996 53. Сое E., Cone K., McMullen M., Chen S.S., Davis G., Gardiner J., Liscum E., Polacco M., Paterson A., Sanchez-Villeda H., Soderlund С and Wing R. "Access to the maize genome: an integrated physical and genetic map". Plant Physiol. 128(1): 9-12, 2002

40. Deng Z., Huang S., Xiao S.Y. and Gmitter F.G., Jr. "Development and characterization of SCAR markers linked to the citrus tristeza virus resistance gene from Poncirus trifoliata". Genome. 40. p.697-704, 1997

41. Devos K.M. and Gale M.D. "Genome Relationships: The Grass Model in Current Research". Plant Cell, 12: 637-646, 2000

42. Diao X., Freeling M. and Lisch D. "Horizontal Transfer of a Plant Transposon". PLoS Biol. 4(l):e5, 2006

43. Doyle J.J. and Luckow M.A. "The rest of the iceberg. Legume diversity and evolution in a phylogenetic contexf. Plant Physiol. 131(3): 900-910, 2003

44. Dubrova Y.E., Plumb М., Brown J., Fennelly J., Bois P., Goodhead D. and Jeffreys AJ. "Stage specificity, dose response, and doubling dose for mouse minisatellite germ-line mutation induced by acute radiation". Proc. Natl. Acad.Sci. 95: 6251-6255, 1998

45. Ellis Т.Н., Turner L., Hellens R.P., Lee D., Harker C.L., Enard C Domoney C Davies D.R. "Linkage maps in pea". Genetics 130(3): 649-663, 1992

46. Ellis T.H.N. and Poyser S.J. "An integrated and comparative view of pea genetic and cytogenetic maps". New Phytologist 153:17-25, 2002

47. Feschotte C Jiang N. and Wessler S.R. "Plant transposable elements: where genetics meets genomics". Nat. Rev. Genet. 3(5):329-341, 2002

48. Flavell A.J., Knox M.R., Pearce S.R. and Ellis T.H.N. "RetrotransposonBased Insertion Polymorphism (RBIP) for High Throughput Marker Analysis". The Plant Journal 16(5): 643-650, 1998

49. Folkeson D. "The use of BSG-staining in making a more detailed nomenclature possible for interchange systems in Pisum sativum L.". Hereditas 101: 119-122, 1984(a)

50. Folkeson D. "Free segregation beetwen a (3S-7S) interchange and genes within linkage group VII in Pisum sativum L." Hereditas 101: 127-133, 1984(b)

51. Folkeson D. "Assignment of linkage segments to chromosomes 3 and 5 in Pisum sativum". Hereditas 112: 249-255,1990

52. Galande A.A., Tiwari R., Ammiraju J.S.S., Santra D.K., Lagu M.D., Rao V.S., Gupta V.S., Misra B.K., Nagarajan S., Ranjekar P.K. "Genetic analysis of kernel hardness in bread wheat using PCR-based markers". Theor. Appl. Genet. 103:601-606,2001

53. Giese H., Holm-Jensen A.G., Mathiassen H., Kjaer В., Rasmussen S.K., Bay H. and Jensen J. "Distribution of RAPD markers on a linkage map of barley". Hereditas 120: 267-273,1994

54. Gilpin B.J., McCallum J.A., Frew T.J. and Timmerman-Vaughan G.M. "A linkage map ot the pea {Pisum sativum L.) genome containing cloned sequences of known ftinction and expressed sequence tags (ESTs)". Theor. Appl. Genet. 95: 1289-1299, 1997

55. Goff S.A., Ricke D., Lan Т.Н., Presting G., Wang R., Dunn M. et al. "A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica)". Science. 296(5565): 92-100, 2002

56. Gonzales M.D., Archuleta E., Farmer A., Gajendran K., Grant D., Shoemaker R., Beavis W.D. and Waugh M.E. "The Legume Information System (LIS): an integrated information resource for comparative legume biology". Nucleic Acids Res. 33(Database issue): 660-665, 2005

57. Grant D., Cregan P. and Shoemaker R.C. "Genome organization in dicots: genome duplication in Arabidopsis and synteny between soybean and Arabidopsis". Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97(8): 4168-4173, 2000

58. Gregory T.R. "The C-value enigma in plants and animals: a review of parallels and an appeal for partnership". Annals of Botany 95: 133-146, 2005

59. Greshoff P.M. "Positional Cloning of Plant Developmental Genes". In: "The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping". Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005

60. Grusak M.A., Li C-M., Moffet M. and Weeden N.F. "Map position of the FROl locus in Pisum sativum". Pisum Genetics 36: 6-8, 2004

61. Hall K.J., Parker J.S., EUis T.H.N., Turner L., Knox M.R., Hofer J.M.I., Lu J., Ferrandiz C, Hunter P.J., Taylor J.D., Baird K. "The relationship between genetic and cytogenetic maps of pea. II. Physical maps of linkage mapping populations". Genome 40: 755-769,1997

62. Hass-Jacobus B. and Jackson S.A. "Physical Mapping of Plant Chromosomes". In: "The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping". Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005

63. Hecht V., Foucher F., Ferrandiz C Macknight R., Navarro C Morin J., Vardy M.E., Ellis N., Beltran J.P., Rameau C, Weller J.L. "Conservation of Arabidopsis flowering genes in model legumes". Plant Physiol. 137(4): 1420-34, 2005

64. Herrmann R.G., Martin R., Busch W., Wanner G., Hohmann U. "Physical and topographical mapping among Triticeae chromosomes". Symp Soc Exp Biol 50: 25-30, 1996

65. Hicks M., Adams D., OKeefe S., Macdonald E., and Hodgetts R. "The development of RAPD and microsatellite markers in lodgepole pine (Pinus contorta var. latifoHa)". Genome 41: 797-805, 1998 80. Hu J., Quiros C.F. "Identification of brokkoh and cauli-flower cultivars with RAPD markers". Plant Cell Rep. V.IO. P.505-511, 1991

66. Irzikowska L., Wolko В., Swicicki W.K. "The genetic linkage map of pea (Pisum sativum L.) based on molecular, biochemical and morphological markers". Pisum Genetics 33: 13-18, 2001

67. Irzikowska L., Wolko B. and Swi?cicki W.K. "Interval Mapping of QTLs Controlling Some Morphological Traits In Pea". Cell. Mol. Biol. Lett. 7(2A): 417-422,2002

68. Jarvis P., Lister C, Szabo V. and Dean С "Integration of CAPS markers into the RFLP map generated using recombinant inbred lines of Arabidopsis thahana". Plant Mol. Biol. 24: 685-687, 1994

69. Jena K.K., KJiush G.S., Kochert G. "Comparative RFLP mapping of a wild rice, Oryza offidnalis, and cultivated rice, O. sativa". Genome 37 (3): 382389,1994

70. Jiang C. and Sink K.C. "RAPD and SCAR markers linked to the sex expression locus M in asparagus". Euphytica 94: 229-333, 1997

71. Jones C.J., Edwards K.J., Castiglione S., Winfiels M.O., Sala F., Van der Wiel C, Vosman B.L., Matthes M., Daly A., Brettschneider R., Bettini P., Buiatti M., Maestri E., Marmiroli N., Aert R.L., Volckaert G., Rueda J., Vazques A. Karp A. "Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories". Molecular Breeding 3:381-390,1997

72. Kalo P., Seres A., Taylor S.A., Jakab J., Kevei Z., Kereszt A., Endre G., Ellis Т.Н., Kiss G.B. "Comparative mapping between Medicago sativa and Pisum sativum". Mol Genet Genomics 272(3): 235-46, 2004

73. Kesseli R.V., Paran I., Michelmore R.W. "Efficient mapping of specifically targeted genomic regions and the tagging of these regions with reliable PCR-based genetic markers". In: Proceeding of the Symposium: "Application of RAPD technology to plant breeding". Joint Plant Breeding Symposia Series. Minneapolis, Minnesota, US: 31-36, 1992

74. Klein P.E., Klein R.R., Cartinhour S.W., Ulanch P.E., Dong J., Obert J.A., Morishige D.T., Schlueter S.D., Childs K.L., Ale M. and Mullet J.E. "A high-throughput AFLP-based method for constructing integrated genetic and physical maps: progress toward a sorghum genome map". Genome Res. 10(6): 789-807,2000

75. Knight C.A., Molinari N.A. and Petrov D.A. "The Large Genome Constraint Hypothesis: Evolution, Ecology and Phenotype". Annals of Botany 95: 177190,2005

76. Kojima Т., Nagoda Т., Noda K., Ogihara Y. "Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in Eincom wheat in relation to that of RFLP markers". Theor Appl Genet 96: 37-45, 1998

77. Konieczny A. and Ausubel F.M. "A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers". Plant J. 4(2): 403-410,1993

78. Konovalov F., Toshchakova E. and Gostimsky S. "A CAPS marker set for mapping in linkage group III of pea (Pisum sativum L.)". Cell. Mol. Biol. Lett. 10(1): 163-171,2005

79. Kulikova O., Gualtieri G., Geurts R., Kim D.J., Cook D., Huguet Т., de Jong J.H., Fransz P.F. and Bisseling T. "Integration of the FISH pachytene and genetic maps of Medicago truncatula". Plant J. 27(1): 49-58, 2001

80. Kumar A. and Hirochika H. "Applications of retrotransposons as genetic tools in plant biology". Trends Plant Sci. 6(3): 127-134, 2001

81. Kumar L.D., Kathirvel M., Rao G.V., Nagaraju J. "DNA profiling of disputed chilli samples {Capsicum annum) using ISSR-PCR and FISSRPCR marker assays". Forensic Sci. Int. 116: 63-8, 2001

82. Lamm R. and Miravalle J.R. "A translocation tester set in Pisum sativum". Hereditas 4: 417-440,1959

83. Lamm R. "Giemsa C-banding and silver-staining for cytological studies in Pisum". Hereditas 94: 45-52, 1981

84. Lander E.S., Green P., Abrahamson J., Barlow A., Daly M.J., Lincoln S.E. and Newburg L. "MAPMAKER: an interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations". Genomics 1(2): 174-181, 1987

85. Lander E.S. et al. "Initial sequencing and analysis of the human genome". Nature 409(6822): 860-921, 2001

86. Laucou V., Haurogne K., Ellis N., Rameau С "Genetic mapping in pea. 1. RAPD-based genetic linkage map of Pisum Sativum". Theor. Appl. Genet. V.97.p.905-915,1998

87. Leeton P.R. and Smyth D.R. "An abundant LrNOE-like element amplified in the genome of Lilium speciosum". Mol. Gen. Genet. 237: 97-104, 1993 104.Li Y.-C, Korol A.B., Fahima T. and Nevo E. "Microsatellites Within Genes: Structure, Function, and Evolution". Mol. Biol. Evol. 21(6): 991-1007, 2004

88. Lodhi M.A., Daly M.J., Ye G.N. et al. "A molecular marker based linkage map of Vitis". Genome. V.38. p.786-794, 1995

89. Loridon K., McPhee K., Morin J., Dubreuil P., Pilet-Nayel M.L., Aubert G., Rameau C Baranger A., Coyne C Lejeune-Henaut I. and Burstin J. "Microsatellite marker polymorphism and mapping in pea (Pisum sativum L.)". Theor. Appl. Genet. I l l 1022-1031, 2005

90. Lysak M.A., Fransz P.F., АИ H.B. and Schubert I. "Chromosome painting in Arabidopsis thaliana". Plant J. 28(6): 689-697, 2001

91. Maher C, Stein L. and Ware D. "Evolution of Arabidopsis microRNA families through duplication events". Genome Res. 16(4):510-509, 2006

92. Meksem K., Ishihara H. and Jesse T. "Integration of Physical and Genetic Maps". In: "The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping". Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005 114. Men A.E., Borisov A.Y, Rozov S.M., Ushakov K.V., Tsyganov V.E., Tikhonovich LA. and Gresshoff P.M. "Identification of DNA amplification fingerprinting (DAF) markers close to the symbiosis ineffective sym31 mutation of pea (Pisum sativum L.)". Theor. Appl. Genet. 98: 929-936, 1999

93. Metzgar D., Bytof J. and Wills C. "Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA". Genome Res. 10(1): 72-80, 2000

94. Morgante M., Hanafey M. and Powell W. "Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes". Nature Genetics 30(2): 194-200, 2002

95. Nagaoka Т., Ogihara Y. "Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RPLP and RAPD markers" Theor Appl Genet 94: 597-602,1997

96. Nagaraju J., Goldsmith M.R. "Silkworm genomics-progress and prospects". Current Science 83 (4): 415-425, 2002

97. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. "A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer". Nucleic Acids Res 25: 2516-2521,1997

98. Neumann P., Nouzova M. and Macas J. "Molecular and cytogenetic analysis of repetitive DNA in pea (pisum sativum L.)". Genome 44 (4), 716-728, 2001

99. Nguyen H.T. and Wu X. "Molecular Marker Systems for Genetic Mapping". In: "The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping". Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005

100. Nilsson N.O., Hallden C Hansen M., Hjerdin A., Sail T. "Comparing the distribution of RAPD and RFLP markers in a high density linkage map of sugar beet". Genome 40: 644-651,1997 124.0hri D. "Climate And Growth Form: The Consequences For Genome Size In Plants". Plant Biol. 7: 449-458, 2005

101. Panaud O., Chen X. and McCouch S.R. "Frequency of microsatellite sequences in rice (Oryza sativa L.)". Genome 38(6): 1170-1176, 1995

102. Paniego N., Echaide M., Munoz M., Fernandez L., Torales S., Faccio P., Fuxan L, Carrera M., Zandomeni R., Suarez E.Y., Hopp H.E. "Microsatellite isolation and characterization in sunflower (Helianthus armuus L.)". Genome 45(1): 34-43, 2002

103. Paterson A.H., Bowers J.E., Burow M.D., Draye X., Elsik C.G., Jiang C.X., Katsar C.S., Lan Т.Н., Lin Y.R., Ming R. and Wright R.J. "Comparative Genomics of Plant Chromosomes". Plant Cell 12(9): 1523-1540, 2000

104. Paterson A.H., Bowers J.E., Chapman B.A., Peterson D.G., Rong J. and Wicker T.M. "Comparative genome analysis of monocots and dicots, toward characterization of angiosperm diversity". Сшт. Opin. Biotechnol. 15(2):120-125,2004

105. Pearce S.R., Knox M.R., ElHs T.H.N., Flavell A.J., Kumar A. "Pea Tylcopia group retrotransposon: transpositional activity and use as markers to study genetic diversity in Pisum." Molecular General Genetics, 263: 898907, 2000

106. Rakoczy-Trojanowska M. and Bolibok H. "Characteristics and a comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants". Cell. Mol. Biol. Lett. 9(2):221-238, 2004

107. Rameau С Denoue D., Fraval F., Haurogne K., Josserand J., Laucou V., Batge S., Murfet I.C. "Genetic mapping in pea.

108. Identification of RAPD and SCAR markers linked to genes affecting plant architecture". Theor Appl Genetv.97: 916-928, 1998 132. Rao G.U., Ben Chaim A., Borovsky Y., Paran I. "Mapping of yield-related QTLs in pepper in an interspecific cross of Capsicum annuum and C. frutescens". Theor Appl Genet 106(8): 1457-1466, 2003

109. Roder M.S., Plaschke J., Konig S.U., Bomer A., Sorrells M.E., Tanksley S.D. and Ganal M.W. "Abundance, variability and chromosomal location microsatellites in wheaf. Mol. Gen. Genet. 246: 327-333,1995

110. Rosbash M., Ford P.J., Bishop J.O. "Analysis of the C-value paradox by molecular hybridization". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71(9): 3746-3750, 1974

111. Saliba-Colombani V., Causse M., Gervais L., and Philouze J. "Efficiency of RFLP, RAPD and AFLP markers for the construction of an intraspecific map of the tomato genome". Genome 43: 29-40, 2000

112. Schmidt T. "LINEs, SINEs and repetitive DNA: non-LTR retrotransposons in plant genomes". Plant Molecular Biology 40: 903-910, 1999

113. Schneider K. "Mapping Populations and Principles of Genetic Mapping". In: "The Handbook of Plant Genome Mapping. Genetic and Physical Mapping". Eds.: Meksem K. and Kahl G. Wiley-VCH, Weinheim, 2005

114. Sharma R., Aggarwal R.A.K., Kumar R., Mohapatra T. and Sharma R.P. "Construction of RAPD linkage map and localization of QTLs for oleic acid level using recombinant inbreds in mustard". Genome 45(3): 467-472, 2002

115. Sharma S. and Raina S.N. "Organization and evolution of highly repeated satellite DNA sequences in plant chromosomes". Cytogenet Genome Res 109: 15-26, 2005

116. Shepherd M., Cross M., Dieters M.J., Henry R. "Genetic maps for Pinus elliottii var. elliottii and P. caribaea var. hondurensis using AFLP and microsatellite markers" Theor Appl Genet 106(8): 1409-1419, 2003

117. Shoemaker R.C., Schlueter J. and Doyle J.J. "Paleopolyploidy and gene duplication in soybean and other legumes". Curr. Opin. Plant Biol. 9(2): 104-109,2006

118. Sidorova K.K. and Uzhintseva L.P. "Mapping of nod4, a new hypemodulating mutant in pea". Pisum Genetics 27: 21, 1995

119. Simon C.J. and Muehlbauer F J Construction of a chickpea linkage map and its comparison with maps of pea and lentil". The Journal of Heredity: 88(2), 115-119,1997

120. Southern E.M. "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis". J. Mol. Biol. 98(3): 503-517, 1975

121. Tanksley S.D., Ganal M.W., Martin G.B. "Chromosome landing: a paradigm for map-based gene cloning in plants with large genomes". Trends Biotechnol. V.ll. №2. p.63-68,1995

122. Tattersall A.D., Turner L., Knox M.R., Ambrose M.J., Ellis T.H.N. and Hofer J.M.I. "The Mutant crispa Reveals Multiple Roles for PHANTASTICA in Pea Compound Leaf Development". The Plant Cell 17: 1046-1060, 2005

123. Tautz D., Trick M., and Dover G.A. "Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation". Nature 322(6080): 652-656,1986 150. The Arabidopsis Genome Initiative "Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana". Nature 408: 796-815, 2000

124. Tiwari K.R., Penner G.A., and Warkentin T.D. "Inheritence of powdery mildew resistance in pea". Can. J. Plant Sci. 77: 307-310, 1997

125. Torres A.M., Weeden N.F. and Martin A. "Linkage among isozyme, lUFLP and RAPD markers in Viciafaba". Theor. Appl. Genet. 85: 937-945, 1993

126. Udvardi M.K., Tabata S., Pamiske M. and Stougaard J. "Lotus japonicus: Legume Research in the Fast Lane". Trends in Plant Science 10(5): 222-228, 2005

127. VandenBosch K.A. and Stacey G. (eds.) "Summaries of Legume Genomics Projects from around the Globe. Community Resources for Crops and Models". Plant Physiology 131: 840-865, 2003

128. Vergnaud G. and Denoeud F. "Minisatellites: Mutability and Genome Architecture". Genome Research 10: 899-907, 2000

129. Vershinin A.V., Allnutt T.R., Knox M.R., Ambrose M.J. and Ellis Т.Н. "Transposable elements reveal the impact of introgression, rather than transposition, in Pisum diversity, evolution, and domestication". Mol. Biol. Evol. 20(12): 2067-2075, 2003

130. Vogel C. and Chothia С "Protein family expansions and biological complexity". PLoS Comput. Biol. 2(5):e48, 2006 158.Vos P., Hogers R., Bleeker M., Rejans M., van de Lee Т., Homes M., Fritjers A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., and Zabeau M. "AFLP: a new technique for DNA fmgerprinting". Nucl. Acids Res. 23: 4407-4414, 1995

131. Weeden N.F., Swiecicki W.K., Ambrose A. and Timmerman G.M. "Linkage groups of pea". Pisum Genetics 25: 4 and cover, 1993 (a)

132. Weeden N.F., Timmerman G.M., Hemmat M., Kneen B.E., and Lodhi M.A. "Inheritance and reliability of RAPD markers". Applications of RAPD Technology to Plant Breeding: 12-17, 1993(b)

133. Weeden N.F., Swiecicki W.K., Timmerman-Vaughan G.M., Ellis T.H.N., Ambrose M. "The current pea linkage map". Pisum Genetics 28: 1-4, 1996

134. Weeden N.F., Tongue M. and Boone W.F. "Mapping coding sequences in peaby PCR". Pisum Genetics, 31: 30-32, 1999

135. Weeden N.F. and Moffet M. "Identification of genes affecting root mass and root/shoot ratio in a Л1794 x Slow RIL population". Pisum Genetics, 34: 28-31,2002

136. Weising K., Nybom H., Wolff K., Meyer W. "DNA fingerprinting in plants and fungi". Boca Raton: CRC Press, p.322, 1995

137. Weng C, Kubisiak T.L., Stine M. "SCAR markers in a longleaf pine x slash pine Fi family". Forest Genetics 5(4): 239-247, 1998

138. Whitelaw С A., Barbazuk W.B., Pertea G., Chan A.P., Cheung F., Lee Y., Zheng L., van Heeringen S., Karamycheva S., Bennetzen J.L. et al. "Enrichment of gene-coding sequences in maize by genome filtration". Science 302: 2118-2120, 2003

139. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak KJ., Rafalski J.A. and Tingey S.V. "DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers". Nucleic Acids Research 18(22): 6531-6535,1990

140. Young N.D., Mudge J. and Ellis Т.Н. "Legume genomes: more than peas in apod". Curr. Opin. Plant. Biol. 6(2): 199-204, 2003 173. Yu J., Hu S., Wang J., Wong G.K., Li S. et al. "A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica)". Science 296(5565):79-92, 2002

141. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. "Genome flngeфrinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification". Genomics20: 176-183, 1994

142. Zijlstra C. "Identification of Meloidogyne chitwoodi, M. fallax and M. hapla based on SCAR-PCR: a powerful way of enabling reliable identification of population or individuals that share common traits". European journal of Plant Physiology 106: 283-290, 2000