Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическое исследование х-сцепленного синдрома Альпорта

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическое исследование х-сцепленного синдрома Альпорта"

р г в од

- О НлН ДО5

Российская академия медицинских наук Мед ико-генетический научный центр

На правах рукописи

ТВЕРСКАЯ Светлана Марковна

УДК 616-056.7+577.214.622

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Х-СЦЕПЛЕННОГО СИНДРОМА АЛЬПОРТА

03.00.15 - "Генетика"

Афтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1995

Работа выполнена в лаборатории ДНК-диагностики Института клинической генетики МГНЦ РАМН.

Научный руководитель - д.б.н. О.В.Евграфов

Официальные оппоненты - д.м.н. В.В.Фокеева

д.м.н. Н.П.Кулешов

Ведущее учреждение - Российский государственный

медицинский университет им. Н. И. Пирогова

Защита состоится .........1995 г.

в ----- часов на заседании Диссертационного совета ир} МГНЦ РАМН по адресу г.Москва, 115478, ул.Москворечье д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек Института.

Афтореферат разослан ЛцМс^—.~ 1995г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, д.б.н., профессор

Л.Ф.Курило

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Исследования первичного дефекта на молекулярном уровне при наследственных болезнях является одним из актуальных и быстро развивающихся направлений медицинской генетики и генетики человека. Эти исследования являются методической и теоретической основой для точной дифференциальной диагностики моногенных наследственных заболеваний, их рациональной профилактики, существенно расширяют представления о структурно-функциональной организации генома человека. Они имеют непосредственное отношение я к проблеме охраны генофонда, т. е. представляют большую социальную значимость и создают реальные предпосылки для поиска возможных путей генноинженерной коррекции наследственных болезней. Актуальность данной проблемы как в теоретическом, так и в практическом отношении очевидна.

Синдром Альпорта (СА) - одно из распространенных (1:5000) моногенных инвалилизирующих заболеваний, клиническое проявление которого характеризуется прогрессирующим течением нефрита в сочетании с сенсоневральной глухотой, ультраструктурными изменениями гломерулярной Оазальной мембраны, патологией зрения (Alport 1927. Atkin ei .al. 1988). Заболевание•отличается выраженной генетической гетерогенностью и клиническим полиморфизмом, что часто приводит к диагностическим ошибкам на клиническом уровне. Исследования последних лет в области иммунологии, биохимии и молекулярной генетики позволили однозначно установить первичный биохимический дефект данного заболевания, обусловленный мутациями в структурных генах коллагена IV типа, составляющего основу базальных мембран различных органов (Brunrter et al. 1988, Szpi-ro-Tapia et al. 1938, Kashtan et al. 1S90). Существуют как ауто-сомный, так и Х-сцепленный тип наследования СА, что связазано с мутациями в различных генах, повреждение которых вызывает даннук патологию, причем Х-сцепленные формы составляют 80-60% случаеЕ данного заболевания (Gregory Atkin 1993.' DeMarchi 1995) и свя-. заны с мутациями в гене а5 цепи коллагена IV типа (C0L4A5). Подобно другим коллагено.вым болезням для СА неизвестно наличие так называемых "горячих точек" в гене, практически- для каждой семьи находят свою мутацию в одном из трех генов (C0L4A3. C0L4A4. C0L4A5) (Lemnik e't al. 1994). Исследование гено-фенотипической корреляции у больных с СА при различных мутациях для расшифровки механизмов зткопатогенеза данного заболевания является важной

- 4 -

международной задачей (ИШег & ВоЫсж. 1992). Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка мо-лекулярно-генетических подходов для прямой и косвенной ДНК-диагностики СА. а также анализ ДНК больных СА в России на наличие мутаций в гене С014А5, ответственном за возникновение Х-сцеплен-ного СА. При этом ставились следующие задачи:

- На основании результатов клинико-генетического анализа родословных сформировать выборку больных с предварительным диагнозом Х-сцепленного СА.

- Разработать метод скрининга образцов геномной ДНК больных с Х-сцепленнным СА на наличие делецнонных форм в 3' и 5' областях гена С0Ь4А5.

- Исследовать образцы ДНК больных с Х-сцепленным СА на наличие точковых мутаций в некоторых экзонах гена С014А5.

- На основании известных полиморфных маркеров в области гена С0Ь4А5 разработать подходы к косвенной ДНК-диагностике СА. Научная новизна и практическая значимость. В ходе данной работа охарактеризована выборка российских больных с синдромом Альпор-та, с использованием нового.для изучения данной патологии метода проведен анализ их ДНК. Выявлено и охарактеризовано 4 новых мутации. Данные, полученные в результате работы позволяют проводить прямую и косвенную ДНК-диагностику Х-сцепленного синдрома Альпорта.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработка метода мультиплексной амплификации для определения делеций в 3' и 5'-областях гена С0Ь4А5.

2. Характеристика двух новых мутаций, обнаруженных методом мультиплексной амплификации, сопоставление клинического фенотипа с характером повреждения гена.

3. Применение различных модификаций метода БЗСР для увеличения его разрешающей способности и характеристика двух точковых мутаций, обнаруженных в результате использования данного метода. Корреляция мевду генотипом и фенотипом у больных СА в случае малых мутаций.

4. Проведение пресимптоматической диагностики в двух семьях с использованием полиморфных маркеров.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на 4 конференции "Геном человека-94" (Черноголовка, март 1994). 3 международном конгрессе по синдрому Альпорта (Нюренберг, Герма-

ния, сентябрь 1994), 1(3) съезде медицинских генетиков России (Москва, декабрь 1994). международном семинаре по наследственным болезням почек (Лимассол, Кипр, январь 1995). Публикации. Опубликовано 9 работ, из них 6 по теме диссертации. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена —на страницах машинописного текста, содержит .... таблиц..... рисунков, библиографический указатель содержит .... наименований..

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования служили образцы ДНК. выделенные из венозной крови и культуры кожных фибробластов больных, а также пятна крови на фильтровальной бумаге. Все пробанды были обследованы в отделении нефрологии Института педиатрии и детской хирургии МЗ РФ.

ДНК из крови выделяли методом, описанному Lindblom and Holmlund, 1988 с небольшими изменениями. •

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили при помощи программируемого термоциклера с использованием термофильной ДНК~полимеразы Termus thermophllus производства СП "Медтех". г.Москва. В работе использовали метод ПЦР (Erlich et al..1991) с одной парой праймеров и мультиплексную амплификацию (МПА) с подобранными специально для каждой пары праймеров параметрами реакции.

Результаты ПЦР и МПА оценивали в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистыми этидием.

Скрининг образцов на наличие точковых мутаций осуществляли методами SSCP (Orita et al, 1989) и ПДРФ (полиморфизм длин рест-рикционных фрагментов). Использовали различные вариации параметров SSCP Для увеличения разрешающей способности метода.

Результаты SSCP анализа оценивали в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием серебром по методу, описанному Blum et al, 1982.

Для рестрикции использовали нуклеазы Sau3a, Ddel, Bañil, Hinf 1. НаеШ, Hphl производства НПО "Ферментас", фирм "Promega" и "Ammersham".

• Определение первичной последовательности нуклеотидов проводили по методу Сенгера (Sanger et al., 1977) с изменениями или с использованием Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit для Applied Biosystems 373A.

Мечение олигонуклеотида згР по 5'-концу проводили при помощи Т4-полинуклеотидкиназы производства НПО "Ферментас".

результаты и обсуждение

1. Анализ структуры выборки обследованных больных.

Обследованная выборка включала в себя 86 человек из 34 семей. имеющих одного или нескольких больных с СА. Диагноз СА выставлялся в случае наличия по крайней мере двух из следующих пята признаков:

1 - гематурия или смерть от ХПН в семейном анамнезе;

2 - наличие гематурии или нефротического синдрома у пациента;

3 - наличие изменений ГБМ при ЭМ исследовании биоптата

почки;.

4 - снижение слуха по данным аудиограммы;

5 - наличие врожденной патологии зрения.

" По родословным обследованных семей проведен клинико-генеа логический анализ с целью определения типа-наследования СА. В семьях ( 15% от всех исследованных семей) практически не вызыва ет сомнений аутосомно-доминантный тип наследования, в 6 случая (18%) не удается однозначно определить тип наследования - эт могут быть больные как с аутосомно-рецессивным СА, так и случа мутации de novo. В остальных 23 семьях (67%) наиболее вероятнь представляется Х-сцепленный тип наследования, однако, из-за не большого числа обследованных родственников и наличия только о; ного. редко двух детей в поколении нет четкой уверенности в та что аутосомно-доминантный тип наследования не мимикриру« Х-сцепленный.

Пробандами являлись 20 девочек и 27 мальчиков в возрасте < 5 до 14 лет. Распределение основных клинических признаков у пр< бандов представлено в таблице 1.

Выявлено некоторое отличие процента встречаемости основн диагностических признаков в российской популяции по сравнению литературными данными, что может быть объяснено несколькими фа тами. Во-первых.' данная выборка не отражает всех клиническ форм СА. существующих в современной классификации, так как о

Таблица 1

Спектр клинической патологии пробандов

Патология Число случаев (ж/м) % <к/м)

Гематурия 18/23 90/85

Протеинурия 14/18 70/67 Недостаточность •

фильтрац.функции почек 10/14- 50/52

Недостаточность

концентр.функции почек 6/9 30/33

Снижение слуха 4/14 20/52

Патология зрения 2/2 10/7

представлена больными детского отделения, т. е. .имеет ограничения по возрасту манифестации. В этой выборке также отсутствовали больные, претерпевшие трансплантацию почек, что исключало возможность оценки их реакции на эту процедуру. Во-вторых, этот факт может быть связан с недостатками диагностики. Например, в спектре глазной патологии, встречающейся у обследованных нами больных, отсутствовали передний и задний лентиконус, считающиеся по литературным данным одним из наиболее частых проявлений повреждения органа зрения при СА. Для правильной постановки диагноза такого рода патологии глаз необходимо применение специальной аппаратуры, что в настоящее время не представляется возможным. Такая важная диагностическая процедура как электронномикроскопи-ческое исследование нефробиоптата было проведено всего в 11 случаях, что • также затрудняет правильную постановку диагноза СА. В-третьих, возможно существование популяционных различий в спектре мутаций, приводящих к СА. Еще в 1988 году Фокеева & Ра-шидова при анализе фенотипического полиморфизма в различных популяциях обратили внимание на тот факт, что в словацкой популяции чаще наблюдается аутосомно-доминантный тип передачи заболевания, чем Х-сцепленный. Среди наших пациентов мы не наблюдали ни одного случая СА с лейомиоматозом пищевода, что вероятнее всего, также может быть связано с популяционными различиями, так как диагностическими критериями лейомиоматоза пищевода являются: диспноэ, загрудинные боли, рвота после приема пищи, затруднение глотания, рекуренТнке легочные инфекции. Все это не требует специальной диагностической аппаратуры и может быть определено при

врачебном осмотре и подтверждено при рентгенологическом исследовании пищевода.

2. Поиск делеционных форм в 3' и 5' частях гена C0L4A5.

Несмотря на то, что в известном сейчас спектре мутаций в гене C0L4A5 преобладают малые мутации, исследование больших структурных перестроек в этом гене необходимо для полноты картины гено-фенотипической корреляции при СА. Для поиска делеционных форм нами был использован метод МПА, который имеет ряд важных преимуществ перед используемым во всех лабораториях, занимающихся исследованием СА методом блот-гибридизации. Метод МПА не требует большого количества ДНК, на реакцию достаточно 25 нг ДНК пациента или она может быть проведена с использованием пятна крови на фильтре. Для реакции МПА и последующего электрофореза для детекции результатов достаточно нескольких часов, тогда как реакция блот-гибридизации является длительным трудоемким процессом и для нее необходимо по меньшей мере 10 мкг ДНК. Наибольшее количество и значительные по протяженности делеции встречаются в районах 3' и 5'концов гена, что обусловило выбор соответствующих пар праймеров (Табл.2). В качестве положительного контроля использовали фрагменты гена дистрофина, расположенного на той же хромосоме.

Методом МПА нами были проанализированы 32 образца ДНК больных мужского пола из семей, имеющих больных СА на наличие делений в 1, 42, 43. 44, 46, 47, 48, 51 экзонах. Обнаружено две протяженные' делеции. затрагивающие в первом случае 3' область, т.е. отсутствовали 42-51 экзоны, а во втором случае, предположительно, целиком ген C0L4A5, так как отсутствовали 1, 42-51 экзоны этого гена и участок, где расположен внутригенный полиморфный маркер, а присутствовал только внешний контроль - один из зкзо-нов гена дистрофина (Рис.1. 2).

Для сопоставления результатов, полученных методом МПА и ме-- тодом блот-гибридизации использовали образцы ДНК больных СА, любезно предоставленные Dr. Воуе (Лондон) и имеющие делеции в исследуемом гене, обнаруженные методом блот-гибридизации (Воуе et al. 1991 Genomics, Vetrle et al, 1992, Genomics). Полученные при исследовании этих образцов методом МПА результаты хорошо согласуются с результатами, полученными альтернативным методом, что позволяет сделать вывод о применимости более простого метода

МПА для прямой ДНК-диагностики СА вместо более трудоемкого метода блот-гибридизащи.

Название Нуклеотидная после- Амплифицируе- Длина фраг- Конц. т°с праймера довательность мый участок мента, п.н. Мв отж.

205

1Г ССССССААССААСАСТАССТССТ 1 ЭКЗОН

щ аттсттстссЬсстсссссасст

42Р СТССАТТАТТААССТСТАСС 42 ЭКЗОН 421* ССАТТТССТАССТССАСТСС 43Г ТТАТТСАСССТААТССТССС 43-44ЭК30Н 44Й ССТАТААСТАТСТТСАССАА 46Е СААТСССТСАТТСТТТТССТС 46 ЭКЗОН 46Я СТТСТСТТАССТСССТСТСС 47Р СТАТАСТСАТТАТТТССТСС 47 ЭКЗОН Ш ГГСАТТАТСТСАСССААСТС 48Е АТСТТТСТАССйАССССТСС 48 ЭКЗОН 48К СААТСССТТАССССАСТААТС 51Г ССАСТАААССТСАСТСАСАААСССТ 51 ЭКЗОН 51И АССССАССАСТАСТАААСГТСССС 8Е СТССТТТАСАСАСТТТАССТСТТСАС 8 экзон гена 352 8Й ССССТСАТТСТСАТСТТСТААТТАС яистрофина 19Г ТТСТАССАСАТСССАТТТТСТТССА 19 ЭКЗОН гена 19И САТСССААААСТСТТСАСАААААСТС ДИСТрофИНа

158

316

133

252

199

188

6 6 6

1.5

6

1.5 1.5 1.5 6

57 57 57 55 57 55 55 55 57

Таблица 2. Праймеры и условия, используемые для мультиплексной амплификации фрагментов ДНК при анализе делеционных форм Х-сцепленного СА.

3. Поиск точковых мутаций в 3' части гена С0Ь4А5.

Для определения точковых мутаций и малых структурных перестроек в гене сейчас используют целый арсенал различных методов. к сожалению, ни один из них не позволяет выявлять 100% всех малых мутаций и каждый имеет свои преимущества и недостатки.

Одним из наиболее используемых методов для выявления новых мутаций сейчас является-ББСР-анализ, так.как он довольно прост в исполнении и позволяет обнаруживать довольно высокий % структурных перестроек. Принцип ББСР-анализа основан на различие в электрофоретической подвижности короткого фрагмента одноцепочеч-

1 2 3 М 4 5 6 7

9 10 11 12 13

352 п.н. (8 экзон ^ дистрофина) • <— 252 п.н. (47 экзс <— 316 п.н. (43-44 э] 199 п.н. (48 экзо 188 п.н. (51 экзо — 158 п.н. (42 экзо 133 п.н. (46 экзо

Рисунок 1. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле образцов ДНК после МПА. Справа указаны длины фрагментов и номера экзонов, которым они соответствуют. М - маркер молекулярного веса рВЕ322, рестрицированньй НаеШ; дорожки 2 и И - образцы ДНК больного Ск.Д.; дорожки 6 и 12 - образцы ДНК больного Вед.Р.; остальные дорожки - образцы ДНК других пациентов и здоровых доноров.

М

— 459 п.н. (19 экзон ге дистрофии

^— 252 п.н. (47 экзон)

205 п.н. (1 экзон) К— 158 п.н. (42 экзон)

Рисунок 2. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле образцов ДНК после МПА. Справа указаны длины фрагментов и но мера экзонов, которым они соответствуют. 1 и 5 дорожки -контрольные образцы ДНК. любезно предоставленные Dr. Е..Boye;-2 дорожка - образец ДНК больного Ск.Д.; 3 дорожка - образец ДНК больного Вед.Р.; М - маркер молекулярного веса pBR322, рестрицированный НаеШ; остальные дорожки - образцы ДНК здоровых доноров.

ной ДНК (100-300 п. н.). обусловленном изменением вторичной структуры цепи при различных первичных последовательностях (Ori-ta et al.. 1989). Практически в каждой лаборатории используют свои условия для SSCP, добиваясь выявления возможно большего количества мутаций. Для повышения информативности метода SSCP мы вариировали ряд параметров, определяющих разрешающую способность 'метода (Табл. 3).

Обнаружено, измените электрофоретической подвижности в двух образцах ДНК больных СЛ из разных семей (Рис.3; Рис.4). Для определения первичной последовательности нуклеотидов был использо-

Параметр метода Различные использованные варианты

Денатурация формамидная. • щелочная

% пробы 85%. 50%, 20%, 10%

время денйт. 5мин. Юмин, 15мин. ЗОмин

ПААГ 5%. 6%. 10%

АА/МБА' 49.5/0.5, 29/1, 19/1

Глицерин 0%, 5%, 10%

Эф.буфер 1*ТВЕ, 0.6*ТВЕ, 0. 5*ТВЕ

Темп. 60°. омн., 15°. 4°

Напряжение V/cm 5, 15. 30

Окраска Серебро, Бромистый этидий

Таблица 3. ' Различные варианты изменяемых параметров, использованных для SSCP-анализа."

Еан метод прямого радиоактивного и нерадиоактивного суквенирова-кия. У обоих пациентоз обнаружены мутации в гетерозиготном состоянии.

Для подтверждения результатов секвенирования в данной работе мы использовали метод ПДРФ. Найденная у больной Б. С. нуклео-тидная замена А->Т приводила к образованию нового сайта для фермента Hphl, отсутствующего в норме и, таким образом, больная Б. С. являлась гетерозиготой по наличию сайта Hphl (Рис.5). Нук-леотидная замена С->А, найденная у больной М.У. приводила к потере сайта Bañil и та, в свою очередь, также являлась гетерозиготой по наличию сайта для данного фермента по сравнению с нормой (Рис.6).

Рисунок 3. Результаты ББСР-анализа при использовании щелочной денатурации и окрашивании полиакриламидного геля бромистым этидием. Дорожка 2 - маркер молекулярного веса рВй322, рестрицрованный НаеШ; дорожка 6 - образец ДНК больной Б. С.; остальные дорожки - образцы ДНК других .пациентов и здоровых доноре -.

Рисунок 4. Результаты ББСР-анализа при.использовании фор • мамидной денатурации и окрашивании полиакрйламидного геля серебром. Дорожка 1 - маркер-молекулярного веса рВИ322. рестрицированный НаеШ; дорожка 4 - образец ДНК больной М. У.; остальные дорожки - образцы ДНК здоровых доноров.

2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 5. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле.• окрашенном бромистым этидием образцов ДНК здоровых доноров и больной Б. С. после рестрикции фермейтом НрШ. Дорожка 2 - рЕЖ322, рестрицированный НрЫ; дорожка 5 - ДНК больной Б.с;; дорожка 8 - маркер молекулярного веса рВИ322, рестрицированный НаеШ; остальные дорожки - образцы ДНК здоровых доноров.

1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 6.- Результата электрофореза в полиакриламидном геле, окрашенном бромистым этидием образцов ДНК здоровых доноров и больной М.У. после рестрикции ферментом Bañil. Дорожка 4 - ДНК больной М.У.; дорожка 6 - ДНК здорового донора до рестрикции; дорожка 7 - маркер молекулярного веса pBR322; рестрицированный Mspí; остальные дорожки - ДНК здоровых доноров.

Проведенный методом ПДРФ анализ 20 здоровых хромосом не выявил наличия ни одной из обнаруженных у пробандов нуклестидных замен. Этот факт позволяет предполагать, что данные изменения в структуре гена являются мутациями, обуславливающими заболевание или случаем очень редкого полиморфизма.

При описании обнаруженных нами точковых мутаций на уровне белка в одном случае происходит аминокислотная замена гидрофобного аланина. занимающего высококонсервативную позицию, на отрицательно заряженную полярную аспарагиновую кислоту, что вызывает изменение вторичной конформации а-цепи. Данная мутация произошла в 47 экзоне гена С0Ь4А5, являющимся первым, кодирующим.неколла-геновый домен а5-цепи. участвующий в.процессе образования дилеров в структуре базальной мембраны. Вторая точковая замена, обнаруженная нами в 46 экзоне гена С0Ь4А5. не вызывает изменение аминокислоты, однако образующаяся последовательность нуклеотидов соответствует донорному сайту сплайсинга. Предположительно (так как для подтверждения этого предположения необходимо исследование на уровне мРНК), альтернативный сплайсинг данного экзона приводит к потере 102 п.н., кодирующих 32 аминокислотных остатка,- по сравнению с нормой. Укороченная в результате этого процесса а5-цепь нарушает правильную спирализацию молекулы коллагена 'IV типа.

Характеристика всех, обнаруженных нами мутаций представлена в таблице 4.

Мутации з гене С0Ь4А5 выражаются в изменении структуры а5-цепи. что приводит к нарушению правильной сборки молекулы коллагена IV типа, встраиванию ее в структуру базальной мембраны и. тем самым, обуславливает изменение функции последней. Повреждение в структуре гломерулярной базальной мембраны сказывается на Функции фильтрационного барьера и проявляется нефротич~:-кими изменениями на клиническом уровне, а также расщеплением, утолщением или истончением гломерулярной базальной мембраны, выявляемыми при электронно-микроскопическом исследовании нефробиоптата.

Большие структурные перестройки в гене С0Ь4А5, особенно затрагивающие неколлагеновый домен, или точковые мутации, приводящие к преждевременному стоп-кодону приводят к отсутствию части или всей а5-цепй, что обуславливает невозможность образования молекулы коллагена IV типа. Отсутствие основного компанента в составе фильтрационного барьера приводит к тяжелым клиническим

Таблица 4.

Характеристика больных СА, у которых обнаружены мутации в С0Ь4А5

Пробанд Родословная Мутация Повреждение на Клинический фенотип

--, в гене СОЬ4А5 уровне .белка нефротический снижение ХПН

ОгР( ОтО синдром слуха

Ск.Д. о Отвр Д» <6 делеция 3'области, отсутствие ИС-домена,

¿в и м А бой затрагивающая 42-51 вызывающее нарушение + . + +

/ экзоны сборки молекулы КГ/

р|-о От-а

Вед. Р. АЛЛ ¿-(¡^¿з Л делеция всего гена • отсутствие всей а5-цепи, + + +

Т Т Т I Т СОЬ4А5 неправильная сборка

□ЙСЗоЬ *шА о молекулы КГ/

М.У. . нуклеотидная замена . А1а1498Азр, изменение + -

II I I ' I Г Т 1 С->А в 47 экзоне вторичной конформации

)щЖ О О О □ □ □ Ш-гО ИС-домена, нарушение

г-1'-1 сборки молекулы КГ/

/ '

Б.С. о-г-а »та • нуклеотидная замена Альтернативный сплайсинг, + • -

А->Т в 46 экзоне приводящий к элиминации практически всего 46 экзона

О! I

последствиям. Наличие больших структурных перестроек в гене С0Ь4А5 обычно характерно для ювекильного типа СА (Яегпеп. 1994). Оба пробанда. у которых нами были найдены протяженные делеции также имеют ювенильный тип СА. т. е. гематурию, протеинурию. хроническую почечную недостаточность. Эта патология почек также • сопровождается снижением слуха, выявленным по данным . аудиомет-рии.

Небольшие мутации, не приводящие к потере значительных участков а5-цепи обуславливают более легкое течение заболевания. Изменение пространственной конфигурации коллагеновой сети в результате нарушения правильной конформации молекул коллагена IV типа, составляющего основу базальной мембраны приводит к .снижен>.-. 'ункции фильтрационного барьера, но не приводит или приводит ь ..ее позднем возрасте по сравнению с случаем отсутствия а5-цепи к хронической почечной недостаточности.

4.Скрининг на наличие некоторых известных мутаций в 3' части гена С0Ь4А5.

Для делеций в гене С0Ь4А5 довольно сложно определить, являются ли \ они уникальными.или одинаковыми у различных пациентов, -так как в большинстве случаев границы делеций остаются неизвестны. возможно определить только наличие/отсутствие тех или иных экзонов.

Среди описанных к настоящему моменту точковых мутаций в гене С0Ь4А5 очень редко, но все же. встречаются повторяющиеся.

Мы использовали описанный ПДРФ Шеп1ег1а!.. 1994; Бааг!-пеп е1'а1..19ЭЗ) для скрининга всех образцов ДНК больных СА. находившихся под нашим исследованием для анализа на наличие/от. сутствие мутаций, создающие новые сайты для рестриктаз БаиЗА и Ме1. Ни один из обследованных нами больных не имел вновь образованных сайтов для указанных ферментов.

Этот факт косвенно подтверждает гипотезу об уникальности мутаций в каждой семье, имеющей больного с СА. однако, оставляет возможность для поиска структур и механизмов, определяющих повышенную частоту мутации в тех или иных точках гена, если таковые существуют, так как исследованные нами мутации составляют только 4% от всех описанных на сегодняшний день точковых мутаций при СА.

5.Косвенная диагностика СА.

Современные методы косвенной ДНК-диагностики наследственных заболеваний опираются на использование тесно сцепленных с локу-сом заболевания анонимных геномных полиморфных маркеров. Нами были использованы два полиморфных маркера, один из которых является внутригенным. (Barker et al, 1992, NAR), а другой находится на расстоянии примерно 2.5 сИ от гена и расположен в локусе DXS178 ( de Weers et al., 1992, Hum.Mol. Genet.). Многоаллельный полиморфизм увеличивает информативность маркера и Позволяет в большем количестве семей проводить косвенную диагностику, используя факт передачи сцепленного с заболеванием аллеля. Гетеро-зиготность использованных нами маркеров составляла 0.76 и 0.85 соответственно.

К нам обратилось три семьи (родословние см. рис. 7.) для проведения пресимптоматической диагностики СА. По результатам клинико-генеалогического анализа тип наследования заболевания во всех трех семьях удовлетворял Х-сцепленному, на основании клинических проявлений мог быть диагностирован СА. и. таким образом, во всех трех семьях предполагалось наличие заболевания, обусловленное патологией в C0L4A5.

Для двух из трех обратившихся к нам семей (Хвт., Г.) внут-ригенный маркер 2В6 являлся информативным (Рис. 8.). Для третьей семьи' (Р.) 'информативным был только внегенный маркер DXS178 (Рис.9). Сцепление заболевания с тем или иным аллелем определяли по носительству этого аллеля у больных членов семьи, однако для семьи Г. не удалось определить сцепленный с заболеванием аллель ни в случае использования маркера 2В6. ни в случае использования маркера DXS178. В результате собственно диагностики для клинически необследованных родственников пробанда получили следующие результаты: в двух семьях можно исключить Х-сцепленный. обусловленный мутациями в C0L4A5 СА. однако, с разной вероятностью. Для семьи Хвт., для которой удалось поставить диагноз при использовании внутригенного маркера, это заключение верно практически в 100% случаев. Для семьи Р. вероятность отсутствия заболевания немного меньше, так.как на участке 2.5 сМ - расстоянии от C0L4A5 .до маркера DXS178 - возможны рекомбинации, В результате расчетов диагноз Х-сцепленного СА, обусловленного мутациями в' C0L4A5 в данной семье можно исключить в вероятностью около 95%.

О-т-О

Рисунок 7. Родословные семей, имеющих больных СА. обратившихся для пресиыптоматической диагностики СА для клинически необследованных родственников. А - родословная семьи Хвт.; Б - родословная семьи Г.; В - родословная семьи Р.

■ 5 й

I а »1 I

а2 а1 а1 а2 а2

Рисунок 8. Результаты пресимптоматической диагностики с использованием внутригенного маркера 2В6 для семьи Хвт.

¿Г—Ъ I и вд

а1 аЭ а1а2 а2 аЗ

Рисунок 9. Результаты пресимптоматической диагностики с использованием сцепленного с С01ЛА5 маркера 0X5178 для семьи Р.

' - 20 -ВЫВОДЫ

1. На основании клинико-генеалогического анализа 34 неродственных семей с клиническим диагнозом Синдром Альпорта сформирована выборка больных для ДНК-анализа спектра мутаций в гене С0Ь4А5, ответственном за возникновение Х^сцепленного СА. Выборка включала 23 семьи из разных регионов России. Соотношение больных мужчин и женщин равнялось 1:1. что■отличается от литературных данных. Этот факт может быть связан как с популяционными отличиями, так и с методами клинической диагностики, применяемыми в России.

2. Разработан метод мультиплексной полимеразной цепной реакции для анализа делеционных форм 3' и 5' областей гена С0Ь4А5 у пациентов мужского пола с Х-сцепленной формой Синдрома Альпорта. В обследованной выборке больных в двух семьях обнаружены протяженные делеции. затрагивающие в одном случае весь ген целиком, а в другом анализируемые экзоны ¡42-51) в 3' области.

3. Для исследования точковых мутаций в области ИС домена гена С0Ь4А5 разработан метод скрининга с использованием ББСР анализа. В двух семьях с Х-сцепленным Синдромом Альпорта обнаружены однонуклеотидные замены С->А и А->Т, приводящие в одном случае к аминокислотной замене А14980. в другом - предположительно к образованию сайта альтернативного сплайсинга.

4. Проведен скрининг всех пациентов на наличие/отсутствие некоторых точковых мутаций, для которых в литературе описан ПДРФ в гене С0Ь4А5. Не обнаружено ни одной из известных мутаций, что косвенно подтверждает гипотезу об уникальности мутаций в каждой семье, имеющей больного СА.

5. Проведено две пресимптоматические диагностики с использованием полиморфных маркеров 2В6 и ОХБ178, расположенных внутри и на расстоянии 2.5 см от района локализации гена С0Ь4А5. Диагноз Х-сцепленного СА опровергнут с вероятностью "практически 100% У клинически необследованного родственника пробакда в одной сомье и с вероятностью 95Х п другой.

- 21 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тверская С.М., Краснопольская К.Д., Игнатова М.С. ДНК-диагностика синдрома Альпорта.// Тез. докл. 4 конференции "Геном человека-94", Черноголовка, 1994, с. 94.

2. Цаликова Ф.Д.. Краснопольская К.Д., Тверская С.М., Бры-дун А. В. Клинико-морфологические особенности синдрома Альпорта, подтвержденные на молекулярно-генетическом уровне у представителей одной семьи в зависимости от пола.// Тез. докл. 1 съезда нефрологов России. Казань. 1994. с.145-146.

3. Тверская С.М., Краснопольская К.Д., Евграфов О.В. Поиск мутаций в гене C0L4A5 у больных с синдромом Альпорта.//1 (3) российский съезд медицинских генетиков, Москва, 1994, с. 59.

4. S.Tverskaya, F. Tsalykova, 0. Evgrafov. X. Krasnopolskaya. Investigation of C0L4A5 mutation in Russian Alport Syndrome patients.// Third .International Workshop on Alport Syndrome, Nu-remberg-Erlangen, Germany, 1994, p.20.

. 5. M.S.Ignatova, F.D.Tsalicova, S.M.Tverskaya, K.D. Krasnopolskaya. ■ The genotyplcal and phenotyplcal polymorphism of Alport's Syndrome (AS) in Russian population.// Seminar on inherited kidney diseases, Limassol. Cyprus.- 1995, p..17.

6. s.Tverskaya, V.Bobrynina, A.Taglev, 0.Evgrafov. F.Tsall-cova, M.Ignatova. X. Krasnopolskaya. C0L4A5 point mutations in two. patients with Alport Syndrome.// Seminar on inherited kidney diseases, Limassol, Cyprus, 1995, p.19.