Диссертации » Общая биология » Генетика

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса "Maculipennis"
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса "Maculipennis""

f

Артемов Глеб Николаевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РАЙОНОВ ПРИКРЕПЛЕНИЯ

ХРОМОСОМ К ОБОЛОЧКЕ ЯДРА ТРОФОЦИТОВ ЯИЧНИКОВ МАЛЯРИЙНЫХ КОМАРОВ ANOPHELES КОМПЛЕКСА «MACULIPENNIS»

Генетика-03.02.07

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ЯКЗ 2011

Томск 2010

004619288

Работа выполнена в лаборатории эволюционной цитогенетики Научно-исследовательского института биологии и биофизики Томского государственного университета, г. Томск.

Научный руководитель: д-р биол. наук, профессор В. Н. Стегний

Научно-исследовательский институт биологии и биофизики Томского государственного университета, г. Томск.

Официальные оппоненты: д-р биол. наук, профессор Л. В. Высоцкая

Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

канд. биол. наук Э. М. Баричева Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Учреждение Российской академии наук

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, г. Москва

Защита состоится «26» января 201 ljr. на утреннем заседании Диссертационного совета Д 003. 011. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 10. Факс: (383)333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан «-¿» ^UUxSjt^ 201 Or.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук [У^ Т. М. Хлебодарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Проблема пространственной организации генома возникла в то же время, что и современная генетика, но была незаслуженно забыта в связи с активным развитием представлений о том, что только первичная последовательность ДНК определяет работу генома. В настоящее время, когда просеквенированы геномы многих организмов, стало ясно, что большая часть генома не несет очевидной информационной функции. Считается, что некодирующая ДНК, представленная по большей части гетерохроматическими районами, ответственна за укладку остальной части генома (Manuelidis, Borden, 1988; Haaf, Schmid, 1999). Гетерохроматин состоит в основном из двух классов последовательностей - умеренных и тандемных повторов сателлитной ДНК. Как организованы эти повторы в гетерохроматине, каково их значение и посредством каких механизмов осуществляется их функционирование до сих пор остается нерешенной проблемой. Поэтому актуальным является исследование эпигенетических (надгенетических) механизмов функционирования генома, в которых участвует гетерохроматин. Одним из таких механизмов, вероятно, является реорганизация повторов разных классов, которая способна изменять трехмерную ориентацию хромосом в ядре.

Понимание принципов расположения генетического материала в пространстве ядра (принципов организации хромосомных территорий) имеет особое значение, так как оно во многом определяет его активность, его транскрипционный статус. Следовательно, детальный анализ районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке и становление принципов внутриядерной организации хроматина является актуальной задачей.

Малярийные комары Anopheles комплекса «maculipennis» являются подходящим объектом для изучения вопросов, касающихся надгенетической регуляции работы генома, её механизмов и эволюции. На протяжении многих лет в Томском госуниверситете ведутся работы по изучению генетики этих насекомых. Детально изучена цитогенетика Anopheles комплекса «maculipennis», обитающих на территории Палеарктики (Кабанова и др., 1972, 1973), исследованы принципы видообразования этих насекомых (Стегний, 1991), выявлены закономерности пространственной организации ядра и открыт новый тип мутаций - системные мутации (Стегний, 1979, 1991), проведены исследования организации гетерохроматина у малярийных комаров (Шарахова и др., 1997). Установлено, что у близкородственных видов малярийных комаров в клетках генеративной системы хромосомы организованы в пространстве по-разному - хромосомы различаются по наличию/отсутствию контактов с ядерной оболочкой, расположению районов прикрепления на самих хромосомах и. их морфологией (Стегний, 1979), что свидетельствует об эволюционном значении архитектуры хромосом в ядре.

Дальнейшее изучение взаиморасположения хромосом в пространстве ядра и особенностей организации гетерохроматина у Anopheles должно быть основано на богатом опыте проведенных исследований и использовании современных подходов. Имеющаяся информация о цитогенетике и филогенезе малярийных комаров комплекса «maculipennis» позволит провести оценку эволюционного аспекта пространственной реорганизации хромосом в ядре, связанного с изменением молекулярно-генетической структуры гетерохроматина.

ii LLJ1 LVH'ililllH и арлИ1&КТурш ЯДра ¡it* »¿¿ШЛрНШПЛХ

«maculipennis» необходимо проводить в направлении поиска зависимости -

пространственной реорганизации хромосом в ядре от изменения последовательности ДНК в районах прикрепления хромосом к ядерной оболочке.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является сравнительный анализ ДНК из районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке у малярийных комаров Anopheles комплекса «maculipennis».

Задачи исследования:

1. Осуществить микродиссекцию районов прикрепления хромосом XL и 3R Anopheles messeae Fall., XL An. atroparvus van Thiel, и получить библиотеку клонов района прикрепления XL хромосомы An. messeae.

2. Провести сравнительный анализ локализации ДНК из района прикрепления XL хромосомы An. messeae на хромосомах An. messeae, An. atroparvus, An. beklemishevi Steg, et Kab., An. maculipennis Mg. и An. melanoon Hackett. с помощью флуоресцентной in situ гибридизации.

3. Определить и охарактеризовать первичную последовательность ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae.

4. Выявить последовательности ДНК гомологичные для районов прикрепления хромосом XL, 3R An. messeae, XL хромосомы An. atroparvus и провести анализ их взаимодействия с белками внутриядерных структур.

Научная новизна

Впервые была изучена первичная последовательность района прикрепления XL хромосомы к ядерной оболочке трофоцитов An. messeae.

Впервые проведен сравнительный анализ локализации последовательности ДНК района прикрепления An. messeae на пяти видах малярийных комаров комплекса «maculipennis». Показано, что район прикрепления XL хромосомы An. messeae сформировался в результате реорганизации последовательности ДНК района 2Ь-с, а не путем его переноса из прицентромерного района инверсией или другими хромосомными перестройками.

Были выявлены различия в локализации повторов на хромосомах трофоцитов комаров комплекса «maculipennis». Показано, что в ходе филогенеза происходила аккумуляция повторов в прицентромерном гетерохроматине An. maculipennis и An. messeae.

В районе прикрепления XL хромосомы An. messeae выявлены мобильные элементы, тандемные повторы и последовательности, гомологичные генам.

Проведен поиск гомологичных последовательностей ДНК районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae, а также XL An. atroparvus, что позволило впервые выявить характеризующие их элементы.

Полученные данные расширяют знания о структуре, функции клеточного ядра и пространственной организации интерфазных ядер.

Положения, выносимые на защиту

1. Виды малярийных комаров комплекса «maculipennis» различаются по локализации повторов ДНК на политенных хромосомах трофоцитов.

2. Район прикрепления XL хромосомы An. messeae к ядерной оболочке содержит мобильные элементы, тандемные повторы и последовательности, гомологичные генам.

3. Характеристикой районов прикрепления XL хромосомы An. messeae и An. atroparvus, а также 3R хромосомы An. messeae является обогащенность последовательностями ДНК, потенциально связывающих белки внутриядерных структур. Общими для них являются последовательность клона Mes2b-c_395 и LINE-элементы.

Практическая значимость

Получены районспецифичные ДНК пробы из районов 2b-c An. messeae, 5а An. atroparvus и 32d An. beklemishevi, а также библиотека клонов ДНК района 2b-c An. messeae которые необходимы для анализа гетерохроматиновых районов и их вклада в пространственную организацию хромосом Anopheles комплекса «maculipennis». Полученные ДНК пробы могут быть использованы для видовой диагностики малярийных комаров. Данные анализа районов прикрепления хромосом к оболочке ядра у малярийных комаров позволят оценить эволюционные механизмы в этой группе насекомых, дадут возможность в дальнейшем контролировать их численность в ходе эпидемиологических мероприятий. Апробация работы

Результаты работы представлены в материалах Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.), материалах II Съезда Общества клеточной биологии совместно с конференцией, посвященной юбилею Института цитологии РАН (С.-Петербург, 16-19 октября 2007г.) и материалах международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.). По теме диссертации сделано четыре публикации в отечественных журналах рецензируемых ВАК.

Вклад автора

Основные результаты работы были получены автором самостоятельно. Микродиссекция района 2b-c XL хромосомы An. messeae трофоцитов проводилась совместно с д-ром биол. наук Н. Б. Рубцовым и канд. биол. наук Т. В. Карамышевой (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). Секвенирование библиотеки проводилось совместно с канд. биол. наук Н. В. Храбровой (ОСП «НИИ ББ ТомГУ», г. Томск).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 116 страницах, содержит 29 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве материала исследования использовали малярийных комаров Anopheles комплекса «maculipennis». Самки An. messeae и An. beklemishevi были собраны в природных популяциях пос. Коларово и с. Тегульдет (Томская область), самки An. maculipennis и An. melanoon собраны в природных популяциях г. Адлер (Краснодарский край). Самки An. atroparvus были взяты из лабораторной культуры.

1. Приготовление препаратов хромосом

Яичники самок малярийных комаров для приготовления воздушно-сухих препаратов фиксировали в растворе Карнуа (96 % этанол с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3:1). Фолликулы яичников малярийного комара выдерживали 5 минут в 50 % пропионовой кислоте на предметном стекле. Затем материал накрывали покровным стеклом и раздавливали. Далее препарат опускали в жидкий азот, покровное стекло удаляли. Дегидратацию проводили в 50 %, 70 % и 96 % растворах этанола по 5 минут в каждом при -20 °С. Препараты сушили при комнатной температуре.

2. Микродиссекция исследуемых районов и ПНР

Микродиссекция района 2b-c XL An. messeae (Рисунок 1 а, в), 5а XL An. atroparvus (Рисунок 1 б, г) и 32d An. messeae (Рисунок 2) осуществлялась с помощью инвертированного микроскопа с микроманипулятором по методике, разработанной для политенных хромосом (Рубцов и др., 1999) с модификациями.

Были собраны фрагменты из района 2Ь-с трех XL хромосом An. messeae, из района 5а пяти XL хромосом An. atroparvus и фрагменты из района 32d пята 3R хромосом An. messeae. Проводили микродиссекцию хромосом более чем одной особи.

3. Флуоресцентная гибридизация in situ

Мечение ДНК проб тетраметилродамин-5-дУТФ (ЗАО «Биосан») проводили в 25 циклах ПЦР с праймером MW6 в режиме: 94 °С - 1 минута, 56 °С - 1,5 минуты, 72 °С - 2 минуты, 72 °С - 8 минут. Зонд смешивали с гибридизационной смесью.

Флуоресцентную гибридизацию проводили по стандартному протоколу (Lichter et al., 1990). Окраску хроматина осуществляли с помощью DAPI. Препараты микроскопировали на люминисцентном микроскопе Axiolmager ZI («Zeiss»), фиксацию и обработку изображений проводили с использованием программного обеспечения AxioVision Reí. 4.7 («Zeiss»).

Для FISH использовали препараты хромосом An. messeae, An. atroparvus, An. beklemishevi, An. maculipennis и An. melanoon. Было проанализировано не менее 30 ядер в каждом эксперименте.

4. Получение библиотеки клонов ДНК района 2b-c An. messeae в плазмиде р.ТЕТ 1.2/blunt

Библиотеку клонов ДНК района 2b-c An. messeae получали в плазмиде pJET 1.2/blunt с использованием наборов реактивов CloneJet PCR Cloning Kit («Fermentas»), TransformAid Bacterial Transformation Kit («Fermentas»), GeneJet Plasmid Miniprep Kit («Fermentas») согласно предложенным протоколам. Было получено 485 колоний Е. coli, несущих плазмиды со встройками и выделено 323 образца плазмидной ДНК.

Рисунок 1 - Хромосома XL трофоцитов An. messeae (а, в) и An. atroparvus (б, г) Примечание - Синим контуром отмечен диссектированный район 2b-c An. messeae (а) и 5а An. atroparvus (б); в - FISH ДНК из района 2b-c XL хромосомы An. messeae с XL хромосомой An. messeae; г - FISH ДНК из района 5а An. atroparvus с XL хромосомой An. atroparvus. С - центромера. Масштабная линейка 20 мкм.

Рисунок 2 - Хромосома 3R трофоцитов An. messeae Примечание - Синим контуром отмечен диссектированный район 32d (а, б); в - FISH ДНК из района 32d 3R хромосомы с 3R хромосомой An. messeae. С - центромера. Масштабная линейка 20 мкм.

5. Определение первичной последовательности ДНК района 2b-c Art. messeae

Определение первичной последовательности ДНК проводили с помощью четырехкапиллярного автоматического анализатора 3130 Genetic Analyser («Applied Biosystems»). Была получена первичная последовательность для 300 фрагментов ДНК изучаемого района.

6. Анализ последовательности ДНК района 2b-c An. messeae in silico

Полученные после секвенирования последовательности ДНК клонов апалгпфозалг "" silico ^ocrтcдo,1r>'*'r>r,, ,"~>r>'т,, кленов чо гп»«апагшл п

геномами An. gambiae в программе TBLASTX VectorBase (www.vectorbase.org

/Tools/BLAST/), Aedes aegypti, Culex qiiinquefasciatus, с геномами видов Drosophila в BLASTN Ensembl Metazoa (metazoan.ensembl.org/Anopheles_gambiae/blastview/) и FlyBase (flybase.org/blast). Кроме того, был проведен поиск мобильных генетических элементов (МГЭ) с помощью программ RepeatMasker (www.repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker/) и Censor (www.girinst.org/ censor/). Полученные последовательности анализировали на наличие тандемных повторов в Tandem Repeat Finder (www.tandem.bu.edu/trf/trf.html). Была проведена оценка фрагментов на потенциальное сродство с белками ядра с использованием программы ChrClass (Rogozin et al., 2000).

7. Дот-блот гибридизация ДНК проб районов 32d An. messeae и 5а An. atroparvus с библиотекой клонов района 2b-c An. messeae

Для приготовления биотинилированного зонда использовали ник-трансляцию. Около 50 нг ДНК клонов района 2b-c An. messeae после амплификации плазмидной ДНК наносили на положительнозаряженную нитроцеллюлозную мембрану («Fermentas»). Мембрану помещали в 80 мл гибридизационной смеси, состоящей из 50% формамида, 0,5 % SDS, 5х раствора Денхарда, и 6х SSC. Объем гибридизационной смеси устанавливали из расчета 0,2 мл/см2 мембраны. Денатурацию связанной с мембраной ДНК проводили в водяной бане при температуре 80 °С 20 мин. Гибридизация осуществлялась при температуре 37/42 °С 36 часов. Отмывка и детекция проводилась с помощью Biotin detection kit («Fermentas») по предложенному протоколу.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование локализации последовательностей ДНК района 2Ь-с An. messeae на хромосомах малярийных комаров Anopheles комплекса «maculipennis»

Была поставлена задача - выявить имеет ли район прикрепления XL хромосомы An. messeae общие последовательности с районами прикрепления хромосом.

В трофоцитах XL хромосома An. messeae образует контакт с ядерной оболочкой участком, расположенном в районе 2Ь-с, который находится в середине плеча, что отличает вид An. messeae от других видов комплекса «maculipennis» (Стегний, 1979). Поиск гомологичных последовательностей ДНК района 2Ь-с интересен тем, что этот район прикрепления хромосомы располагается не в прицентромерной области, а значит, позволит провести анализ района, ответственного за контакт с ядерной оболочкой «в чистом виде», исключив последовательности характерные для центромер.

Результаты FISH показали, что ДНК района 2b-c XL хромосомы An. messeae локализовалась не только в районе 2Ь-с, но и в прицентромерном районе хромосомы XL An. messeae (Рисунок 3). Подобная ситуация наблюдалась при гибридизации этой ДНК с XL хромосомой других видов комплекса «maculipennis». Сигнал был обнаружен в районе, гомейологичном району 2Ь-с, а также прицентромерном районе хромосомы XL. В прицентромерном районе у An. beklemishevi, An. atroparvus и An. melanoon сигнал находился только в ß -гетерохроматине, а у An. maculipennis и An. messeae - в ß - и а -гетерохроматине.

Т & ( т

* а _ о и

*

#

Рисунок 3 - Локализация ДНК района 2Ь-с ХЬ хромосомы А п. те.кеае на ХЬ хромосоме трофоцитов комаров комплекса «тасиНрепт5У> Примечание - а - Ап. темеае; б - Ап. Шгорагуш', в - Ап. Ьек1ет15Иеуг, г -Ап. тасиНрептя; д - Ап. те1апооп; С - центромера; стрелка синего цвета указывает на сигнал в районе прикрепления хромосомы; * - на сигнал в а -гетерохроматине. Масштабная линейка 20 мкм.

*

* «

/ •«-- 1 1 ■' О" к

Ч ^

ъ ^даш - т '

V 1

' + * О С

11 - и _ н

Рисунок 4 - Локализация ДНК района 2Ь-с ХЬ хромосомы Ап. тех.чеае на хромосоме

2 трофоцитов комаров комплекса «тасиИрептя» Примечание - а - Ап. теязеае", б - Ап. Лгорагмиу, в - Ап. Ьек1ет15Иеуу, г -Ап. тасиНреппй; д - Ап. те1апооп\ С - центромера; стрелка синего цвета указывает на сигнал в районе прикрепления хромосомы; * - на сигнал в а -гетерохроматине. Масштабная линейка 20 мкм.

Рисунок 5 - Локализация ДНК района 2Ь-с ХЬ хромосомы Ап. теязеае на ЗЯ хромосоме трофоцитов комаров комплекса «тасиИрептя» Примечание - а - Ап. /иемеае; б - Ап. а^орагут', в - Ап. ЬеЫетгякеуг, г -Ап. тасиНрептэ; д - Ап. те1апооп\ С - центромера; стрелка синего цвета указывает на сигнал в районе прикрепления хромосомы; * - на сигнал в а -гетерохроматине. Масштабная линейка 20 мкм.

VI V и +

¿4-Х

■ I— Л

Рисунок 6 - Локализация ДНК района 2Ь-с ХЬ хромосомы Ап. теязвае на ЗЬ хромосоме трофоцитов комаров комплекса «тасиИрептэ» Примечание - а - Ап. тв8$еае\ б - Ап. а1горагми$\ в - Ап. Ьек1ет1зкеуу, г -Ап. тасиНрептэ; д - Ап. те!апооп; С - центромера; стрелка синего цвета указывает на сигнал в районе прикрепления хромосомы; * - на сигнал в а -гетерохроматине. Масштабная линейка 20 мкм.

Интенсивный сигнал в гомеиологичном району 2b-c An. messetie районе XL хромосомы видов комплекса «maculipennis» позволяет провести оценку происхождения района прикрепления XL хромосомы у Art. messeae. Вероятно, образование района прикрепления в середине плеча хромосомы было обеспечено не переносом инверсией из прицентромерной области, а возникло в результате реорганизации последовательности ДНК этого района. Хромосома 2

У большинства изучаемых видов хромосома 2 не имеет связи с ядерной оболочкой, но у An. beklemishevi она образует контакт с оболочкой ядра в прицентромерной области (Стегний, 1993). Гомология ДНК 2b-c An. messeae обнаружена с прицентромерным районом хромосомы 2 у всех видов (Рисунок 4). При этом происходило мечение как ß -гетерохроматина у An. beklemishevi, An. atroparvus и An. melanoon, так и а - и ß -гетерохроматина у An. maculipennis и An. messeae. Сигналы были обнаружены также в середине обоих плеч хромосомы 2 у всех видов. Хромосома 3

В трофоцитах самок всех изученных видов хромосома 3 крепится к оболочке ядра прицентромерными участками, и на препаратах плечи этой хромосомы лежат отдельно друг от друга (Стегний, 1993). В прицентромерном районе правого плеча хромосомы 3 пометались тяжи района 32d (район прикрепления хромосомы 3R к оболочке ядра у всех видов комаров комплекса «maculipennis»). У An. melanoon, An. atroparvus и An. beklemishevi был также обнаружен сигнал в районе 32d дистальнее а -гетерохроматического блока (Рисунок 5). У An. maculipennis и An. messeae таких сигналов обнаружено не было. Однако лишь у этих двух видов происходила гибридизация с а -гетерохроматическим блоком района 32d.

В левом плече хромосомы 3 был обнаружен сигнал в прицентромерном районе ЗЗа-с, которым плечо крепится к ядерной оболочке (Рисунок 6). Сигналы можно было наблюдать в районах интеркалярного а-гетерохроматина у An. beklemishevi (35b), An. atroparvus (35b), An. melanoon (34b) и An. maculipennis (34b).

Флуоресцентная in situ гибридизация ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae с хромосомами того же вида и видов комплекса «maculipennis» показала, что этот район характеризуют последовательности, не являющиеся универсальными в определении способности хромосомы XL или прочих хромосом кариотипа образовывать контакт с ядерной оболочкой в трофоцитах. Доказательством этому утверждению служат: 1) отсутствие сигнала в районах прикрепления хромосомы XL An. beklemishevi и 3L хромосом An. maculipennis и An. melanoon; 2) наличие сигнала в инертных по отношению к ядерной оболочке XL хромосоме An. maculipennis и хромосомах 2 An. atroparvus An. messeae, An. melanoon и An. maculipennis.

FISH ДНК района 2b-c An. messeae с хромосомами трофоцитов видов комплекса «maculipennis» позволил провести сравнительный анализ, иллюстрирующий различие в распределении повторенных последовательностей ДНК на хромосомах близкородственных видов малярийных комаров. Анализ нуклеотидной последовательности ДНК этого района показал высокое содержание в нем МГЭ. СатДНК и генов было выявлено небольшое количество. Характерное для малярийных комаров высокое содержание МГЭ в гетерохроматине (Holt et al, 2002), их локализация преимущественно в ß -гетерохроматине (Chantal et al., 1989), а также большое количество МГЭ в библиотеке клонов района 2b-c An. messeae позволяет

предположить, что в эксперименте FISH главным образом наблюдали локализацию МГЭ. Таким образом, можно утверждать о тенденции к аккумуляции МГЭ в прицентромерных районах. Так у эволюционно исходного вида An. atroparvus МГЭ можно было обнаружить в середине плеч, прежде всего хромосом 3 и XL, у An. melanoon количество идентифицированных встроек вдоль плечей было обнаружено меньше и, наконец, у «молодого» вида An. messeae такие повторы локализовались, прежде всего, в а -гетерохроматине хромосом XL, 2 и 3R. Возможно, что возникновение в филогенезе «новых» а -гетерохроматиновых блоков связано с перемещением МГЭ в прицентромерные районы.

2. Сравнительный анализ районов прикрепления XL хромосомы An. messeae. 2L хромосомы An. beklemishevi и прицентромерного района 2R хромосомы An. atroparvus

Ранее с помощью микродиссекции были получены ДНК-пробы прицентромерных районов 15d хромосомы 2 An. beklemishevi - района прикрепления хромосомы (Сайджафарова и др., 2009), и 14с хромосомы 2 An. atroparvus (Грушко и др., 2004; Grushko et al., 2009), инертного по отношению к ядерной оболочке. Была проведена in situ гибридизация ДНК этих районов с хромосомами An. messeae, An. beklemishevi и An. atroparvus. Были выявлены отличия в локализации ДНК-проб 15d An. beklemishevi и 14с An. atroparvus от ДНК-пробы 2b-c XL хромосомы An. messeae. Общим свойством для последовательностей ДНК из всех сравниваемых районов является их локализация, главным образом в прицентромерном ß -гетерохроматине. Однако ДНК-проба района 2Ь-с локализовалась также во множестве районов интеркалярного гетерохроматина. Эти результаты позволяют сделать заключение о наличии специфичных последовательностей для района прикрепления, расположенного в середине плеча.

3. Анализ первичной последовательности ДНК района прикрепления хромосомы XL к оболочке ядра в трофоцитах An. messeae

Общая протяженность области, первичная последовательность которой была определена, составляет около 72 тыс. п. н. Обнаружено, что район 2Ь-с представляют АТ-богатые последовательности (содержание АТ-пар - 58 %). Последовательность ДНК этого района анализировали на предмет умеренных повторов, сатДНК, генов, SAR/MAR элементов и последовательностей способных связываться с белками ядерных структур.

В изучаемом районе были выявлены все классы нуклеотидных последовательностей. Тандемных повторов обнаружено мало (таблица 1). Среди них выявлены микросаттелиты (Mes2b-c_273, Mes2b-c_426, Mes2b-c_430) и минисателлиты (Mes2b-c_2, Mes2b-c_157, Mes2b-c_229, Mes2b-c_273, Mes2b-c_353).

Сателлитов обнаружить не удалось, видимо, по той причине, что анализу подвергались фрагменты, по длине не превышающие в среднем 250 п. н. Следует обратить внимание, что тандемные повторы, которые входят в состав клонов Mes2b-с_2, Mes2b-c_157, Mes2b-c_175, Mes2b-c_229 и Mes2b-c_273 имеют мотивы AAG/AAAG/ AAAAG/AAAAAG, которые подобны описанному консенсусу для ДНК ядерной ламины гепатоцитов мыши - AAAAG (Шабарина и др., 2006).

Клон 2b-c Последовательность Длина Число

An. messeae консенсуса консенсуса повторов

Mes2b-c_2 AGGAAGAAAACAG 13 2

GAAAGGAGAAA 11 2.6

Mes2b-c 157 TTATGATGAAAAAG 14 1.9

Mes2b-c 229 GAAGTATGAAAGA 13 3.8

Mes2b-c_273 AAAG 4 8.8

AAAGAAAGAACGAAAG 16 2.2

Mes2b-c 353 TTTTGTTTTGTTTG G 15 1.9

Mes2b-c 426 TAC 3 40.7

Mes2b-c 430 ТС 2 13.5

Анализ показал высокое разнообразие МГЭ (таблица 2). Были обнаружены ЬТЯ ретротранспозоны и ЬГЫЕ-элементы, а также транспозоны, перемещающиеся по принципу «вырезания-встройки».

Таблица 2 - Мобильные элементы района 2Ь-с ХЬ хромосомы Ап. техкеае

Семейство МГЭ Mr3/opraHH3M Гомология %

LI SS, L1MC4 5end, LI Mur2 orf2, L1MA6,

LI L1MB3 EC, LIMB, L1MEC_5, L1HS, Ll-2 Ttr, LIMEf 5end/Eutheria 75-91

w ¡Z CRI L2A/Eutheria 66

CR1-4 AG/Anopheles gambiae 66-71

hJ RTE RTE-9 SP/Strongylocentrotus purpuratus 88; 91

Penelope Penelope-13 HM/Hydra magnipapillata 91

R4 EhRLE2/Entamoeba histolytica 72

Outcast Outcast!Anopheles gambiae

LTR/Gypsy Gypsy43-1 AG-mi/Anopheles gambiae 70

LTR LTR/BEL BEL13-I AG!Anopheles gambiae 65; 71

LTR TONTl_LE_IASWam//fi lycopersicum AGM1 /Anopheles gambiae 79; 67

ERV/ERV1 HARLEQUIN, ZFERV-2-I DR/Chordata 72; 80

EnSpm ENSPM-6_DR, EnSpm-3_HV, EnSpm-6 W/Danio rerio, Triticeae, Vitis vinifera 67-83

А DNA/P PI AG!Anopheles gambiae 89-94

X О Sola Sola 1-7 AP, Sola 1-9 AP /Acyrthosiphon pisum 91; 72

о с Polinton Polinton-2 NW/Nematostella vectensis 72

ж MuDR MUDSOLTl/So/am™ tuberosum 76

о. H hAT CHARLIE3/Eutheria 86

Chapaev Chapaev3-2 AC/Oryzias latipes 69

piggyBac/Looper LOOPERN2_DR/Diwio rerio 72

Однако SINE, MITE и гелитроны в районе 2Ь-с не найдены. Были выявлены характерные для An. gambiae LINE-элемент CR1-4_AG (семейство CRI), пртпотпянсптпн Онtrast ¡ri той же rnvnnM T.TR петпотпянгпозоны Gvnsv43-I AG-int (семейство Gypsy), BEL13-IAG (семейство BEL) и AGM1. Среди транспозонов,

типичных для An. gambiae выявлен трансиозон P1_AG. Найдено также большое разнообразие МГЭ, описанных у представителей одноклеточных, позвоночных, растений и других таксонов. Характерными для района 2b-c An. messeae оказались типичные для позвоночных животных, в том числе Homo sapiens, ретеротранспозоны L1 и L2A. В районе 2Ь-с были обнаружены также ретротранспозон TONT1LEI и транспозоны EnSpm-3_HV, EnSpm-6_VV, MUDSOLT1, описанные у растений. Представленные МГЭ имеют довольно низкий процент дивергенции с обнаруженными у An. messeae, даже по сравнению с мобильными элементами семейства Gypsy An. gambiae. Возможно, что присутствие в изучаемом районе данных МГЭ связано с явлением «горизонтального переноса».

Поиск уникальных последовательностей в районе 2b-c An. messeae показал крайнюю обедненность его генами (таблица 3). Найденные уникальные последовательности оказались гомологичны генам An. gambiae, функция которых неизвестна. Однако, для большинства генов были определены ортологи у D. melanogaster.

Таблица 3 - Генетический состав района 2b-c An. messeae

Клон 2Ь-с An. messeae Гомолог у An. gambiae Ортолог у D. melanogaster

Ген E-value Хр-ма/район

Mes2b-c 144 AAGAP000357 5,5e-07 XL/3B -

Mes2b-c 198 AAGAP006662 2e-10 2L/25D CG3165

Mes2b-c 255 AAGAP001531 3e-23 2R/8B CG6125

Mes2b-c 263 AAGAP005897 3e-04 2L/23C CG5087

Mes2b-c 425 AAGAP000621 2e-47 X/1C, X/5D CG3108

Подводя итог оценки состава ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae следует отметить, что тандемные повторы и гены образуют незначительную часть района 2Ь-с. Наиболее значительную фракцию анализируемого района составляют МГЭ всех классов за исключением MITE, SINE и гелитронов.

4. Поиск общих последовательностей ДНК в районах прикрепления XL и 3R хромосом An. messeae

Последовательность ДНК районов прикрепления хромосом трофоцитов малярийных комаров имеет сложную организацию. Вероятно, такие районы образуют последовательности, типичные для гетерохроматина и последовательности, определяющие функцию контакта хромосомы с ядерной оболочкой. Для выявления последовательностей, принадлежащих ко второй группе, был использован подход, позволяющий провести скрининг библиотеки клонов района 2b-c An. messeae с использованием ДНК района прикрепления хромосомы 3R An. messeae (район 32d). В результате эксперимента было показано, что общими для районов 2Ь-с и 32d An. messeae являются последовательности МГЭ типа DOC6_DM, ретротранспозоны семейств LI и Erv (таблица 4). Последовательность клона Mes2b-с_403, которая представлена в прицентромерных районах хромосом X, 2L, 2R и некартированных сайтах An. gambiae, имеет свойство образовывать контакт с ядерной ламиной. Однако с большей достоверностью ДНК ядерной ламины выявлялась в клонах, содержащих МГЭ LlMC4_5end и HARLEQUIN. Все клоны кроме Mes2b-c_417 обладают свойствами потенциального взаимодействия с ядерными и хромосомными структурами.

Таблица 4 - Характеристика гомологичных последовательностей районов

прикрепления хромосом XL и 3RAn. messeae

Клон 2Ь-с An. messeae МГЭ Взаимодействие с белками или SAR/MAR

Название Гомология %

Mes2b-c 18 DOC6 DM 44 CK, SAR/MAR

Mes2b-c 346 L1MC4 5end 85 яд. ламина

Mes2b-c 383 HARLEQUIN 72 яд. матрикс, яд. ламина

Mes2b-c 390 L1HS 91 яд. матрикс

Mes2b-c 417 LIMEf 5end 75

Тандемные повторы

Консенсус Период/Score

Mes2b-c 431 AAAACACATT 2,2/35 я/1, матрикс

Другие последовательности

Mes2b-c 204 яд. матрикс, SAR/MAR

Mes2b-c 277 CK

Mes2b-c 395 яд. матрикс

Mes2b-c 432 SAR/MAR

Mes2b-c 403 яд. ламина

Mes2b-c 455 яд. матрикс

Примечание - CK - синаптонемальный комплекс.

Таким образом, удалось выявить двенадцать клонов общих для районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae. Они представляли собой МГЭ и тандемные повторы. 90 % полученых клонов способны взаимодействовать с белками внутриядерных структур.

5. Поиск хромосомспецифичных последовательностей ДНК в районах прикрепления XL хромосомы у An. messeae и An. atroparvus

Для поиска эволюционно консервативных элементов, которые характеризуют районы прикрепления XL хромосом, был проведен скрининг библиотеки клонов 2Ь-с An. messeae с помощью ДНК-пробы района прикрепления XL хромосомы An. atroparvus (район 5а). FISH ДНК района 2b-c An. messeae с хромосомами An. atroparvus показал его гомологию с районом 5а. В результате скрининга было выявлено одиннадцать последовательностей (таблица 5), среди которых отсутствовали кодирующие белки. Около половины выявленных клонов представляли собой ретротранспозоны и лишь в одном клоне (Mes2b-c_199) был найден тандемный повтор. Большинство фрагментов после анализа в программе ChrClass было отнесено к классу взаимодействующих с белками розеткоподобных структур и внутриядерным матриксом фибриллярно-гранулярной сети. В ходе анализа были найдены клоны, характерные для 2b-c An. messeae, 32d An. messeae и 5a An. atroparvus - Mes2b-c_390, Mes2b-c_395 и Mes2b-c_417. Mes2b-c_390 и Mes2b-c_417 представляют собой LINE ретротранспозоны, а последовательность Mes2b-с_395 способна потенциально взаимодействовать с белками ядерного матрикса.

Таблица 5 - Характеристика последовательностей общих для районов прикрепления хромосомы ХЬ Ап. теэяеае и Ап. Шгораптз

Клон 2Ь-с An. messeae МГЭ Взаимодействие с белками или SAR/MAR

Название Гомология %

Mes2b-c 3 Gypsy43-I AG-int 70,79 яд. ламина

Mes2b-c 243 ERV3 90,62

Mes2b-c 390 L1HS 91,20 яд. матрикс

Mes2b-c 417 LIMEf 5end 75,00 -

Тандемные повторы

Консенсус Период/Score

Mes2b-c 199 TTTTTTC 2,9/33 -

Другие последовательности

Mes2b-c 153 яд. ламина

Mes2b-c 158 яд. матрикс

Mes2b-c 195 яд. матрикс

Mes2b-c 337 яд. матрикс

Mes2b-c 395 яд. матрикс

Mes2b-c 418 яд. матрикс

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе проведен сравнительный анализ последовательности ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae к оболочке ядра. Была выявлена локализация этой ДНК на хромосомах близкородственных видов, проведен анализ её нуклеотидной последовательности, найдены элементы, характерные для районов прикрепления хромосом.

Район прикрепления хромосомы XL An. messeae к ядерной оболочке, вероятно, является гетерохроматическим. Такой вывод можно сделать на основании проведенной FISH ДНК этого района с хромосомами близкородственных видов, а также сходной картины гибридизации ДНК из прицентромерных районов хромосом видов An. beklemishevi и An. atroparvus. Анализ первичной последовательности ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae показал большое разнообразие МГЭ и небольшое содержание кодирующих последовательностей, что также является косвенным свидетельством гетерохроматической природы района прикрепления XL хромосомы An. messeae. Большое количество МГЭ не вызывает удивление, так как известно, что ß -гетерохроматин представляют, как правило, умеренные повторы. В гетерохроматине An. gambiae тандемные повторы занимают незначительную часть (Koryakov et al., 1996), что и было отмечено в данной работе для района 2b-c An. messeae. Таким образом, последовательность ДНК района 2Ь-с не является принципиально отличной от других районов, имеющих морфологию ß -гетерохроматина, в том числе хромосом, не имеющих контактов с оболочкой ядра. Морфологическое сходство этого района с ß -гетерохроматином политенных хромосом являлось основой гипотезы происхождения этого района (Стегний, 1991; Шарахова и др., 1997). Ранее предполагалось, что эволюционно исходным инверсионным вариантом является тот, у которого район 2Ь-с расположен в прицентромерной области. Однако эксперименты FISH ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae с хромосомами близкородственных видов показывают, что у предковых видов и даже представителя неарктической ветви комплекса

An. beklemishevi гомейологичный району 2b-c район всегда находится в середине плеча XL хромосомы. Таким образом, возникновение у An. messeae хромосомы с районом прикрепления, расположенным в центральной части плеча было вызвано реорганизацией самой последовательности ДНК и не связано с хромосомными перестройками. Различия в организации последовательностей ДНК районов прикрепления хромосом у малярийных комаров комплекса «maculipennis» таким образом, может быть вызвано перемещением МГЭ, содержащих SAR/MAR элементы. Этот процесс мог сопровождаться изменением концентрации последовательностей, содержащих SAR/MAR согласно концепции «библиотек» (Ugarkovic and Plohl, 2002). Согласно модели библиотек реорганизация повторов гетерохроматина происходит за счет амплификации одних повторов и элиминации других. Совокупность указанных процессов могло привести к формированию характерной морфологии района прикрепления XL хромосомы и его локализации в центральной части плеча этой хромосомы у An. messeae.

Результаты исследования пространственной организации ядра у малярийных комаров подтверждают существование в геноме специфических сайтов, обогащенных элементами, обеспечивающими взаимодействие хромосом с ядерной оболочкой. Впервые проведенный анализ района прикрепления, расположенного в середине плеча хромосомы показал, что такие районы являются гетерохроматическими и могут локализоваться не только в прицентромерных районах хромосом, но и в середине плеч. Настоящая работа показала многокомпонентность молекулярно-генетического состава гетерохроматина в отношении его взаимодействия со структурными элементами ядра. Это свойство гетерохроматина проявляется в существовании двух компонентов, которые входят в его состав - консервативных элементов, характерных как для прицентромерного, так и интеркалярного гетерохроматина всех хромосом, а также вариабельного компонента - видоспецифичных и районспецифичных последовательностей ДНК. За счет реорганизации элементов вариабельного компонента гетерохроматина происходит изменение взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой. Реорганизация последовательностей гетерохроматина районов прикрепления хромосом может являться ключевым процессом, который сопровождает видообразовательные события у малярийных комаров.

выводы

1. Проведена микродиссекция районов прикрепления хромосом XL, 3R Art. messeae и XL An. atroparvus. Получена библиотека клонов района прикрепления XL хромосомы An. messeae.

2. С помощью флуоресцентной in situ гибридизации было показано, что ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae локализуется в интеркалярных районах и прицентромерном ß-гетерохромапше хромосом малярийных комаров комплекса «maculipennis», а также в прицентромерном а-гетерохроматине у An. maculipennis и An. messeae.

3. Секвенирование ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae выявило наличие мобильных элементов, тандемных повторов и последовательностей, гомологичных генам.

4. Показано, что для районов прикрепления XL и 3R хромосом An. messeae характерны мобильные элементы Doc6_DM, LlMC4_5end, Harlequin, L1HS, Llmef_5end; S/MAR и последовательности, взаимодействующие с белками ядерного матрикса, ядерной ламины, синаптонемального комплекса.

5. Выявлена межвидовая специфика районов прикрепления XL хромосомы An. messeae и An. atroparvus. Показано, что эти районы содержат мобильные элементы Gypsy43-I_AG-int, ERV3, LI HS и LlMEf_5end и последовательности, взаимодействующие с белками ядерного матрикса и ядерной ламины.

6. Показано, что районы прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae, а также XL An. atroparvus характеризуют мобильные элементы L1HS, LlMEf_5end, а также последовательность клона Mes2b-c_395, потенциально взаимодействующая с белками ядерного матрикса.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Сайджафарова А. О., Артемов Г. Н.. Карамышева Т. В., Рубцов Н. Б., Стегний В. Н. Сравнительный анализ молекулярного состава прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом малярийных комаров рода Anopheles (CULICIDAE, DIPTERA) // Вестник Томского государственного университета. -2007.-№1.-С. 96-106.

2. Артемов Г. Н., Стегний В. Н. Анализ ДНК участка прикрепления хромосомы XL трофоцитов яичников к ядерной оболочке малярийного комара Anopheles messeae Fall. II Материалы Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 9-12 мая 2007 г.). -Томск, 2007.-С. 10.

3. Стегний В. Н., Сайджафарова А. О., Артемов Г. Н. Молекулярно-цитогенетический анализ участков прикрепления хромосом к ядерной оболочке у малярийных комаров // Цитология. - 2007 - Т.49, №9. - С. 796-797.

4. Сайджафарова А. О., Артемов Г. Н., Карамышева Т. В., Рубцов Н. Б., Стегний В. Н. Молекулярно-цитогенетическое изучение ДНК прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2L у малярийного комара Anopheles beklemishevi (Culicidae, Díptera) II Генетика. - 2009. - Т.45, № 1. - С. 59-63.

5. Артемов Г. Н.. Ананьина Т. В., Стегний В. Н. Пространственное расположение XL-хромосомы в ядрах трофоцитов яичников Anopheles messae Fall. // Материалы международной конференции «Хромосома-2009» (Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009 г.). - Новосибирск, 2009. - С. 115-116.

6. Артемов Г. Н., Фисенко О. Ю., Стегний В. Н. Молекулярно-цитогенетический анализ района прикрепления XL-хромосомы трофоцитов яичников малярийного комара Anopheles atroparvus II Материалы международной конференции «Хромосома-2009», Новосибирск. - 2009. - С. 116.

7. Артемов Г. Н., Стегний В. Н. Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса maculipennis II Всстник Томского государственного университета.-2010. -№2.-С. 123-131.

Тираж 110 экз. Заказ 1074. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. (3822) 533018.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Артемов, Глеб Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Пространственная организация хромосом в ядре

1.1.1 Модели пространственной организации ядра

1.1.2 Пространственная организация ядра в трофоцитах яичников малярийных комаров

1.1.3 Молекулярные основы внутриядерной организации хроматина

1.1.3.1 Взаимодействие хроматина с белками ядерного матрикса

1.1.3.2 Взаимодействие хроматина с белками ядерной оболочки

1.2 Организация районов прикрепления хромосом к ядерному каркасу

1.2.1 SAR/MAR элементы

1.2.2 Конститутивный гетерохроматин — компартмент, определяющий пространственную организацию ядра

1.2.3 Эпигенетические особенности формирования гетерохроматина 33 1.2.3.1 Молекулярно-генетическая организация конститутивного гетерохроматина

1.3 Молекулярная цитогенетика малярийных комаров рода Anopheles

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Приготовление препаратов хромосом

2.2 Микродиссекция исследуемых районов и ПЦР

2.3 Флуоресцентная гибридизация in situ

2.3.1 Введение метки в ДНК-библиотеку

2.3.2 In situ гибридизация

2.4 Получение библиотеки клонов ДНК района 2b-c XL хромосомы An.messeae в плазмиде pJET 1.2/blunt

2.4.1 Лигирование фрагментов ДНК в вектор

2.4.2 Трансформация Е. coli

2.4.3 Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli

2.5 Определение первичной последовательности ДНК района 2b-c XL хромосомы Ап. твББеае

2.6 Анализ последовательности ДНК района 2Ь-с ХЬ хромосомы Ап. теззеае т яШсо

2.7 Дот- блот гибридизация ДНК проб районов 326. Ап. теББеае и 5а

Ап. а1горагут с библиотекой клонов района 2Ь-с Ап. теяяеае

2.7.1 Приготовление биотинилированных зондов ДНК 326. Ап. тезяеае и 5 а Ап. а^орагуш

2.7.2 Б лот-гибридизация 62 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Исследование локализации последовательностей ДНК, гомологичных последовательностям района 2Ь-с Ап. теББвае на хромосомах малярийных комаров комплекса «тасиНрептв»

3.2 Сравнительный анализ районов прикрепления ХЬ хромосомы Ап. техяеае и 2Ь хромосомы Ап. Ъек1ет1$}1еу1, а также прицентромерного района 2Я хромосомы Ап. Шгорагуш

3.3 Анализ нуклеотидной последовательности ДНК района прикрепления ХЬ хромосомы трофоцитов Ап. теББеае

3.4 Поиск общих последовательностей ДНК в районах прикрепления

ХЬ иЗЯ хромосом Ап. rn.esбеае

3.5 Поиск хромосомоспецифичных последовательностей ДНК в районах прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теяяеае и Ап. (Игоратт

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса "Maculipennis""

Актуальность работы

Проблема пространственной организации генома возникла в то же время, что и современная генетика, но была незаслуженно забыта в связи с активным развитием представлений о том, что только первичная последовательность ДНК определяет работу генома. В настоящее время, когда просеквенированы геномы многих организмов, стало ясно, что большая часть генома не несет очевидной информационной функции. Считается, что именно некодирующая ДНК, представленная по большей части гетерохроматическими районами, ответственна за укладку остальной части генома (Manuelidis, Borden, 1988; Haaf, Schmid, 1999). Гетерохроматин состоит в основном из двух классов последовательностей - умеренных и тандемных повторов сателлитной ДНК. Как организованы эти повторы в гетерохроматине, каково их значение и посредством каких механизмов осуществляется их функционирование до сих пор остается нерешенной проблемой. Поэтому актуальным является исследование эпигенетических (надгенетических) механизмов функционирования генома, в которых участвует гетерохроматин (Стегний, 2006). Одним из таких механизмов, вероятно, является реорганизация повторов разных классов, которая способна изменять трехмерную ориентацию хромосом в пространстве ядра.

Понимание принципов расположения генетического материала в пространстве ядра (принципов организации хромосомных территорий) имеет особое значение, так как оно во многом определяет его активность, его транскрипционный статус. Следовательно, детальный анализ районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке и становление принципов внутриядерной организации хроматина является актуальной задачей.

Малярийные комары Anopheles комплекса, «maculipennis» являются удобным объектом для изучения вопросов, касающихся надгенетической регуляции работы генома, её механизмов и эволюции. На протяжении многих лет в Томском госуниверситете ведутся работы по изучению генетики этих насекомых. Детально изучена цитогенетика Anopheles комплекса maculipennis, обитающих на территории Палеарктики (Кабанова и Карташева, 1972; Кабанова и др., 1973), исследованы принципы видообразования этих насекомых (Стегний, 1991), выявлены закономерности пространственной организации ядра и открыт новый тип мутаций (Стегний, 1979, 1991), проведены исследования организации гетерохроматина у малярийных комаров (Шарахова и др., 1997). Установлено, что у разных близкородственных видов малярийных комаров в клетках генеративной системы хромосомы организованы в пространстве по-разному - они различаются по наличию/отсутствию контактов с ядерной оболочкой, расположению районов прикрепления на самих хромосомах (Стегний и др., 1979), что свидетельствует об эволюционном значении архитектуры хромосом в ядре.

Дальнейшее изучение взаиморасположения хромосом в пространстве ядра и особенностей организации гетерохроматина у Anopheles должно быть основано на богатом опыте проведенных исследований и использовании современных подходов. Имеющаяся информация о цитогенетике и филогенезе малярийных комаров комплекса «maculipennis» позволит провести оценку эволюционного аспекта пространственной организации хромосом в ядре, связанного с изменением молекулярно-генетической структуры гетерохроматина.

Исследование архитектуры ядра на малярийных комарах комплекса «maculipennis» необходимо проводить в ключе поиска зависимости пространственной реорганизации хромосом от изменения последовательностей, находящихся в гетерохроматических районах хромосом. Ранее проводился анализ районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке, которые расположены в прицентромерных районах хромосом (Грушко и др., 2004, Grushko et al., 2009; Сайджафарова и др. 2009). Настоящая работа посвящена изучению последовательности ДНК района прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теББеае, который локализован в середине левого плеча этой хромосомы.

Цель и задачи работы

Целью исследования является сравнительный анализ ДНК из районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке у малярийных комаров АпорНе1еБ комплекса «тасиИрептя».

Задачи исследования:

1. Осуществить микродиссекцию районов прикрепления хромосом ХЬ и ЗЯ Ап. тевБеае, ХЬ Ап. а^орагуш и получить библиотеку клонов района прикрепления Ап. теББеае.

2. Провести сравнительный анализ локализации ДНК из района прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теББвае на хромосомах Ап. теБяеае, Ап. а&орагуш, Ап. ЬеЫетгякеуг, А п. тасиИрептя и Ап. те1апооп методом флуоресцентной т я Ни гибридизации.

3. Определить первичную последовательность ДНК района прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теББеае и охарактеризовать её.

4. Выявить последовательности ДНК, гомологичные районам прикрепления хромосом ХЬ, ЗЫ Ап. тезБеае, ХЬ хромосомы Ап. Мгорагут и осуществить анализ их взаимодействия с белками внутриядерных структур.

Научная новизна

Впервые была изучена первичная последовательность района прикрепления ХЬ хромосомы к ядерной оболочке ядра трофоцитов Ап. теБяеае, расположенного в середине плеча хромосомы.

Впервые проведен сравнительный анализ последовательности ДНК района прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теьхеае у пяти видов малярийных комаров комплекса «тасиНрептя». Показано, что свойство ХЬ хромосомы Ап. теББеав образовывать контакт с ядерной оболочкой сформировалось в результате реорганизации последовательности района прикрепления ХЬ хромосомы к ядерной оболочке, а не путем переноса из прицентромерного района инверсией или другими хромосомными перестройками.

Были выявлены различия в локализации повторов на хромосомах трофоцитов комаров комплекса «тасиНрептя». Показано, что в ходе филогенеза происходила аккумуляция консервативных повторов в прицентромерном гетерохроматине Ап. тасиИрептз и Ап. тезявае.

В районе прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теяБеае выявлены мобильные элементы, тандемные повторы и последовательности ДНК, гомологичные генам.

Проведен поиск гомологичных последовательностей ДНК районов прикрепления хромосом ХЬ и ЗЯ Ап. тезяеае, а также ХЬ Ап. Шгорагуш, что позволило впервые выявить характеризующие их консервативные и хромосомспецифичные элементы.

Полученные данные расширяют знания о структуре и функции клеточного ядра и пространственной организации интерфазных ядер.

Практическая значимость

Результаты работы имеют значение для развития представлений о молекулярно-генетической организации гетерохроматических районов хромосом, образующих контакт с ядерной оболочкой. Полученные ДНК пробы из районов прикрепления хромосом могут быть использованы для видовой диагностики эпидемически опасных малярийных комаров.

Положения, выносимые на защиту диссертации

1. Виды малярийных комаров комплекса «тасиПрептэ» различаются по локализации консервативных повторов ДНК на политенных хромосомах трофоцитов.

2. Район прикрепления ХЬ хромосомы Ап. тезхеае к ядерной оболочке содержит мобильные элементы, тандемные повторы и кодирующие белки последовательности.

3. Характеристикой районов прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теББвае и Ап. Шгорапшз, а также 311 хромосомы Ап. теяяеае является обогащенность последовательностями ДНК, способными потенциально связывать белки внутриядерных структур. Общими для них являются последовательность клона Mes2b-c395 и LINE элементы.

Апробация результатов

Результаты исследования были представлены на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (г. Томск, 9-12 мая 2007 г.), на «Втором съезде Общества клеточной биологии» (г. Санкт-Петербург, 17-19 октября 2007 г.), на международной конференции «Хромосома 2009» (г. Новосибирск, 31 августа - 6 сентября 2009). По теме диссертации опубликовано 4 работы в журналах, рецензируемых ВАК.

Благодарности

Автор работы выражает глубокую благодарность всем сотрудникам лаборатории эволюционной цитогенетики Научно-исследовательского института биологии и биофизики Томского государственного университета и Института цитологии и генетики СО РАН, которые наставляли, помогали и поддерживали его. Выражаю благодарность Владимиру Николаевичу Стегнию, Татьяне Витальевне Карамышевой, Николаю Борисовичу Рубцову, Антонине Михайловне Русаковой, Анастасии Малаховой, Наталье Валерьевне Храбровой, Татьяне Викторовне Ананьиной, Оксане Фисенко, Андрею Ведерникову, Алине Коханенко, Ануарбеку Каримовичу Сибатаеву, Константину Усову, Татьяне Шелковниковой, Анне Сайджафаровой и Игорю Рогозину.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Артемов, Глеб Николаевич

выводы

1. Проведена микродиссекция районов прикрепления хромосом XL, 3R An. messeae и XL An. atroparvus. Получена библиотека клонов района прикрепления XL хромосомы An. messeae.

2. С помощью флуоресцентной in situ гибридизации было показано, что ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae локализуется в интеркалярных районах и прицентромерном ß-гетерохроматине хромосом малярийных комаров комплекса «maculipennis», а также в прицентромерном а-гетерохроматине у An. maculipennis и An. messeae.

3. Секвенирование ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae выявило наличие мобильных элементов, тандемных повторов и последовательностей, гомологичных генам.

4. Показано, что для районов прикрепления XL и 3R хромосом An. messeae характерны мобильные элементы Doc6DM, LlMC45end, Harlequin, L1HS, Llmef5end; SAR/MAR и последовательности, взаимодействующие с белками ядерного матрикса, ядерной ламины, синаптонемального комплекса.

5. Выявлена межвидовая специфика районов прикрепления XL хромосомы An. messeae и An. atroparvus. Показано, что эти районы содержат мобильные элементы Gypsy43-IAG-int, ERV3, L1HS и LlMEf5end и последовательности, взаимодействующие с белками ядерного матрикса и ядерной ламины.

6. Показано, что районы прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae, а также XL An. atroparvus характеризуют мобильные элементы LI HS, LlMEf5end, а также последовательность клона Mes2b-c395, потенциально взаимодействующая с белками ядерного матрикса.

Заключение

В настоящей работе проведен сравнительный анализ последовательности ДНК района прикрепления ХЬ хромосомы Ап. теязеае к оболочке ядра. Была выявлена локализация этой ДНК на хромосомах близкородственных видов, проведен анализ её нуклеотидной последовательности, найдены элементы, характерные для районов прикрепления хромосом. Район прикрепления хромосомы XL An. messeae к ядерной оболочке, вероятно, является гетерохроматическим. Такой вывод можно сделать на основании проведенной FISH ДНК этого района с хромосомами близкородственных видов, а также сходной картины гибридизации ДНК из прицентромерных районов хромосом видов An. beklemishevi и An. atroparvus. Анализ первичной последовательности ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae показал большое разнообразие МГЭ и небольшое содержание кодирующих последовательностей, что также является косвенным свидетельством гетерохроматической природы района прикрепления XL хромосомы An. messeae. Большое количество МГЭ не вызывает удивление, так как известно, что ß-гетерохроматин представляют, как правило, умеренные повторы. В гетерохроматине An. gambiae тандемные повторы занимают незначительную часть (Koryakov et al., 1996), что также было отмечено в данной работе для района 2b-c An. messeae. Таким образом, последовательность ДНК района 2Ь-с не является принципиально отличной от других районов, имеющих морфологию ß-гетерохроматина, в том числе хромосом, не имеющих контактов с оболочкой ядра. Морфологическое сходство этого района с ß-гетерохроматином политенных хромосом являлось основой гипотезы происхождения этого района (Стегний, 1991; Шарахова и др., 1997). Ранее предполагалось, что эволюционно исходным инверсионным вариантом является тот, у которого район 2Ь-с расположен в прицентромерной области. Однако эксперименты FISH ДНК района прикрепления XL хромосомы An. messeae с хромосомами близкородственных видов показывают, что у предковых видов и даже представителя неарктической ветви комплекса An. beklemishevi гомейологичный району 2Ь-с район всегда находится в середине плеча XL хромосомы. Таким образом, возникновение у An. messeae хромосомы с районом прикрепления, расположенным в центральной части плеча было вызвано реорганизацией самой последовательности ДНК и не связано с хромосомными перестройками. Различия в организации последовательностей ДНК районов прикрепления хромосом у малярийных комаров комплекса «maculipennis» таким образом, может быть вызвано перемещением МГЭ, содержащих SAR/MAR элементы. Этот процесс мог сопровождаться изменением концентрации последовательностей, содержащих SAR/MAR согласно концепции «библиотек» (Ugarkovic and Plohl, 2002). Согласно модели библиотек реорганизация повторов гетерохроматина происходит за счет амплификации одних повторов и элиминации других. Совокупность указанных процессов могло привести к формированию характерной морфологии района прикрепления XL хромосомы и его локализации в центральной части плеча этой хромосомы у An. messeae.

Таким образом, в данной работе было установлено, что район прикрепления хромосомы XL хромосомы является гетерохроматическим, образован, главным образом, мобильными элементами, имеет сложную структуру, состоящую из последовательностей, характерных для прицентромерного гетерохроматина, эволюционно консервативных, хромосомоспецифичных и районоспецифичных. Результаты исследования пространственной организации ядра у малярийных комаров подтверждают существование в геноме специфических сайтов, обогащенных элементами обеспечивающими взаимодействие хромосом с ядерной оболочкой. Впервые проведенный анализ района прикрепления, расположенного в середине плеча хромосомы показал, что эти районы являются гетерохроматическими и могут локализоваться не только в прицентромерных районах хромосом, но и в интеркалярном гетерохроматине. Настоящая работа показала многокомпонентность молекулярно-генетического состава гетерохроматина в отношении его взаимодействия со структурными элементами ядра. Это свойство гетерохроматина проявляется в существовании двух компонентов, которые входят в его состав — консервативных элементов, характерных как для прицентромерного, так и интеркалярного гетерохроматина всех хромосом, а также вариабельного компонента - видоспецифичных и районспецифичных последовательностей ДНК. За счет реорганизации элементов вариабельного компонента гетерохроматина происходит изменение взаимодействия хромосом с ядерной оболочкой. Реорганизация последовательностей гетерохроматина районов прикреплениях хромосом может являться ключевым процессом, который сопровождает видообразовательные события у малярийных комаров.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Артемов, Глеб Николаевич, Томск

1. Байбородин и др., 1993. Клонирование и молекулярно-биологический анализ 120 фрагмента ДНК из бета-гетерохроматина Drosophila melanogaster / С.И. Байбородин, Э. М. Баричева, С.С. Богачев и др. // Генетика. 1993. -Т.29, №3. - С. 403-416.

2. Башкиров, 2002 Происхождение гетерохроматина эукариот / В. Н. Башкиров // Генетика. 2002. - Т.38, №6. - С. 789-792.

3. Галактионов и др., 1991. Ультраструктура и некоторые свойства прицентромерного гетерохроматина в культивируемых клетках трахеи быка / И.В. Галактионов, О.В. Зацепина, В.Ю. Поляков и др. // Цитология. 1991. — Т.ЗЗ, №12. - С. 28-35.

4. Гвоздев и др., 1999. Гетерохроматин: молекулярная эволюция и эффекты положения генов у Drosophila melanogaster / В.А. Гвоздев, В.Е. Алаторцев, А.А. Аравин и др. // Молекулярная биология. 1999 - Т.ЗЗ, №1. - С. 14-25.

5. Грушко и др., 2004. Характеристика и сравнительный анализ ДНК из прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 Anopheles atroparvus V. Tiel (Culicidae, Diptera) / О.Г. Грушко, M.B. Шарахова, А.И. Шевченко и др. // Генетика. 2004. - Т.40, №8. - С.1-10.

6. Жимулев, 1993. Гетерохроматин и эффект положения гена / И. Ф. Жимулев // Новосибирск: ВО Наука. Сибирская издательская фирма, 1993. -491с.

7. Жимулев, 2002. Политенные хромосомы: морфология и структура / И. Ф. Жимулев // Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1992. 480с.

8. Кабанова и Карташева, 1972. Кариотипы кровососущих комаров рода Aedes (Diptera, Culicidae) / В. М. Кабанова и Н. Н. Карташева // Генетика. -1972. Т. 8, №3. - С. 47.

9. Кабанова, 1973. Сезонная динамика инверсионного полиморфизма в природной популяции малярийного комара Anopheles messeae / В. М. Кабанова, В. Н. Стегний, А. Г. Лужкова // Генетика. 1973. - Т. 9, №10. - С. 78-92.

10. Коган и Гвоздев, 2002. Молекулярная эволюция тандемных повторов гетерохроматина в связи с их функцией в геноме / Г.Л. Коган и В.А. Гвоздев //Генетика. 2002. - Т.38, №6. - С. 710-718.

11. Кузнецова и др., 2002. Положение сателлитной ДНК по отношению к гетерохроматину в интерфазных ядрах клеток в культуре / И.С. Кузнецова, И.В. Матвеев, О.П. Подгорная и др. // Цитология. — 2002. Т.44, №5. - С. 423-430.

12. Монахова, 1990. Цитогенетические аспекты пространственной организации ядра / М. А. Монахова // Успехи совр. биол. 1990. - Т.110, Вып. 2 (5). - С.163-179.

13. Прокофьева-Бельговская, 1986. Гетерохроматические районы хромосом / А. А. Прокофьева-Бельговская // М.: Наука, 1986. 432с.

14. Рубцов и др., 1999. Микроклонирование и характеристика ДНК из районов прицентромерного гетерохроматина политенных хромосом Drosophila melanogaster / Н. Б. Рубцов, А. А. Алексеенко, Е. С. Беляева и др. // Генетика. 1999. - Т.35, №1. - С. 55-61.

15. Стегний В.Н. Реорганизация структуры интерфазных ядер в онто- и филогенезе малярийных комаров // Докл. АН СССР. 1979. - Т.249, №5 -С.1231.

16. Стегний и Вассерлауф, 1994. Видовая архитектоника хромосом генеративной ткани и проблемы филогенетических отношений в подгруппеmelanogaster рода Drosophila (Sophophora) / В. H. Стегний и И. Э. Вассерлауф // Генетика.- 1994. Т.ЗО, №4. - С. 478-483.

17. Стегний и Шарахова, 1990. Повторяющиеся последовательности ДНК малярийных комаров. Особенности локализации высокоповторяющейся ДНК у Anopheles messeae / В. Н. Стегний и М. В. Шарахова // Генетика. — 1990. -Т.26, №7. С. 1187-1194.

18. Стегний, 1976. Цитогенетическое исследование видов-двойников Anopheles палеарктического комплекса maculipennis / В.Н. Стегний // Автореф. дис. . канд. биол. наук. J1.: Изд-во ЛГУ. 1976. - 16 с.

19. Стегний, 1981. Генетические основы эволюции малярийных комаров. I. Хромосомные филогенетические связи / В.Н. Стегний // Зоол. журнал. -1981. -Т.60, Вып. 1.-С. 69.

20. Стегний, 1983. Инверсионный полиморфизм малярийного комара Anopheles messeae. IV. Стационарность частотного распределения инверсий по ареалу вида / В.Н. Стегний // Генетика. 1983. - Т. 19, №3. - С. 446

21. Стегний, 1987. Системная реорганизация архитектоники политенных хромосом в онто- и филогенезе малярийных комаров. Сообщение I. Различия структуры ядер соматических и генеративной тканей / В.Н. Стегний // Генетика. 1987. - Т.23, №5. - С.821-827.

22. Стегний, 1991. Популяционная генетика и эволюция малярийных комаров / В. Н. Стегний // Изд-во Томского университета. 1991. - 137 с.

23. Стегний, 1993. Архитектоника генома, системные мутации и эволюция / В.Н. Стегний // Новосибирск: Изд-во Новосиб. Ун-та, 1993. 111 с.

24. Стегний, 2006. Эволюционное значение архитектоники хромосом как формы эпигенетического контроля онто- и филогенеза эукариот / В. Н. Стегний //Генетика. 2006. - Т. 42., № 9. - С. 1215-1224.

25. Шабарина и др., 2006. Необычная нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, выделенного из ядерных оболочек гепатоцитов мыши / А. Н. Шабарина, Е. И. Прилепа, М. В. Глазков // Генетика. Т. 42, № 7. - С. 879886.

26. Яровая и Разин, 1983. Два типа участковприкрепления ДНК к ядерному скелету в клетках асцитной карциномы Эрлиха / О.В. Яровая и С.В.Разин // Молек. биология. 1983. - Т.34. - С. 120-126.

27. Alexandrova et al., 2003. Replication labeling patterns and chromosome territories typical of mammalian nuclei are conserved in the early metazoan Hydra / O. Alexandrova, I. Solovei, T. Cremer, C.N. David // Chromosoma. 2003. -V. 112.-P. 190-200.

28. Allen et al., 1996. High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco / G. C. Allen, G. J. Hall, S. Michalowski, et al. // Plant Cell. 1996. - V.8, No. 5. - P. 899-913.

29. Alvarez et al., 2000. The MAR-binding protein SATB1 orchestrates temporal and spatial expression of multiple genes during T-cell development / J. D. Alvarez, D. H. Yasui, H. Niidaet al. // Genes Dev. 2000. - V. 14, No. 5. - P. 521-535.

30. Ashery-Padan et al., 1997. Distinct regions specify the targeting of otefin to the nucleoplasms side of the nuclear envelope / R. Ashery-Padan, A. M. Weiss, N. Feinstein, Y. Gruenbaum // J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - P. 2493-2499.

31. Avramova Z. et al., 1998. Matrix attachment regions and structural colinearity in the genomes of two grass species /ГДЕ // Nucleic Acids Res. 1998. - No. 26. -P. 761-767.

32. Baimai, 1998. Heterochromatin accomulation and kariotypic evolution in some dipterian insects / V. Baimai // Zoological studies. 1998. - Vol. 37, No 2. — P. 75-88.

33. Baricheva et al., 1996. DNA from Drosophila melanogaster beta-heterochromatin binds specifically to nuclear lamins in vitro and the nuclear envelope in situ / E. A. Baricheva, M. Berrios, S. S. Bogachev et al. // Gene. -1996.-V. 171.-P. 171-176.

34. Belyaeva et al., 2008. Intercalary heterochromatin in polytene chromosomes of Drosophila melanogaster / E. S. Belyaeva, E. N. Andreyeva, S. N. Belyakin et al. // Chromosoma. 2008.-V. 117.-P. 411-418.

35. Bengtsson and Wilson, 2004. Multiple and surprising new functions for emerin, a nuclear membrane protein / L. Bengtsson and K. L. Wilson // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. - V. 16. - P. 73-79.

36. Berger et al., 1996. The characterization and localization of the mouse thymopoietin/lamina-associated polypeptide 2 gene and its alternatively spliced products / R. Berger, L. Theodor, J. Shoham et al. // Genome Res. 1996. - V. 6. P. 361-370.

37. Bidwell et al., 1993. Osteocalcin gene promoter-binding factors are tissue-specific nuclear matrix components / J. P. Bidwell, A. J. van Wijnen, E. G. Fey et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. U S A. 1993. - V. 90, No. 8. - P. 3162-3166.

38. Bode et al., 2006. Correlations between scaffold/matrix attachment region (S/MAR) binding activity and DNA duplex destabilization energy / J. Bode, S. Winkelmann, S. Götze et al. // J. Mol. Biol. 2006. - V. 358, No. 2. - P. 597-613.

39. Boulikas, 1993. Homeodomain protein binding sites, inverted repeats, and nuclear matrix attachment regions along the human beta-globin gene complex / T. Boulikas // J. Cell Biochem. 1993. - V. 52, No. 1. - P. 23-36.

40. Boyle et al., 2001. The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells / S. Boyle, S. Gilchrist, J.M. Bridger et al. // Hum. Mol. Genet. 2001. - V. 10. - P. 211-219.

41. Branco and Pombo et al., 2006. Intermingling of chromosome territories in interphase suggests role in translocations and transcription-dependent associations / M.R. Branco and A. Pombo // PLoS Biol. 2006. - V.4. - P. 138

42. Burke and Ellenberg, 2002. Remodelling the walls of thenucleus / B. Burke and J. Ellenberg // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2002. - V. 3. - P. 487-497.

43. Cai et al., 2001. Solution structure of the constant region of nuclear envelope protein LAP2 reveals two LEM-domain structures: one binds BAF and the other binds DNA / M. Cai, Y. Huang, R. Ghirlando et al. // EMBO J. V. 20. P. 43994407.

44. Casolari et al., 2004. Genome-wide localization of the nuclear transport machinery couples transcriptional status and nuclear organization / J.M. Casolari, C.R. Brown, S. Komili et al. // Cell. 2004. - V. 117. - P. 427-439.

45. Chaly and Munro, 1996. Centromeres reposition to the nuclear periphery during L6E9 myogenesis in vitro / N. Chaly and S.B. Munro // Exp. Cell Res. -1996.-V. 223. P. 274-278.

46. Charlesworth et al., 1994. The evolutionary dynamics of repetitive DNA in eukaryotes / B. Charlesworth, P. Sniegowski, W. Stephan // Nature. 1994. - V. 371.-P. 215-220.

47. Chattopadhyay et al., 2000. SMAR1, a novel, alternatively spliced gene product, binds the Scaffold/Matrix-associated region at the T cell receptor beta locus / S. Chattopadhyay, R. Kaul, A. Charest et al. // Genomics. 2000. - V. 68, No. l.-P. 93-96.

48. Chubb et al., 2002. Chromatin motion is constrained by association with nuclear compartments in human cells / J.R. Chubb, S. Boyle, P. Perry, W. A. Bickmore // Curr. Biol. 2002. - V. 12. - P. 439-445.

49. Comings, 1968. The rationale for an ordered arrangement of chromatin in the interphase nucleus / D. E. Comings // The Amer. J. Human. Genet. 1968. V. 20, №5. P.440.

50. Cremer and Cremer, 2010. Chromosome Territories / T. Cremer and M. Cremer // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010. - No. 2. - P. 1-22.

51. Cremer et al., 2006. Chromosome territories a functional nuclear land-scape / T. Cremer, M. Cremer, S. Dietzel et al. // Curr. Opin. Cell Biol. - 2006. - V.18. -P.307-316.

52. Croft et al., 1999. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus / J.A. Croft, J.M. Bridger, S. Boyle et al. // J. Cell Biol. 1999.-V. 145.-P. 1119-1131.

53. Croft et al., 1999. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus / J.A. Croft, J.M. Bridger, S. Boyle et al. // J. Cell Biol. 1999. - V.145, №6. - P. 1119-1131.

54. Czermin et al., 2001. Physical and functional association of SU(VAR)3-9 and HDAC1 in Drosophila / B. Czermin, G. Schotta, B. B. Hulsmann et al. // Imhof. A EMBO Rep. 2001. - V. 2. - P. 915-919.

55. Dehghani et al., 2005. Organization of chromatin in the interphase mammalian cell / H. Dehghani, G. Dellaire, D. P. Bazett-Jones // Micron. 2005. -V.36. -P.95-108.

56. Dijke and Hill, 2004. New insights into TGF-p-Smad signaling / P. ten Dijke, C. S. Hill // Trends Biochem. Sci. 2004. - V. 29. P. 265-273.

57. Dobreva et al., 2003. SUMO modification of a novel MAR-binding protein, SATB2, modulates immunoglobulin mu gene expression / G. Dobreva, J. Dambacher, R. Grosschedl // Genes Dev. 2003. -V. 17, No. 24. - P. 3048-3061.

58. Dover, 1982. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution / G. Dover // Nature. 1982. - V.299, № 5879. - P. 111-117.

59. Driel et al., 2004. Nuclear architecture and genome functioning in plants and animals: what can we learn from both? / van R. Driel, P. Fransz // Exp. Cell Res. -2004.-V.296.-P. 86-90.

60. Duband-Goulet and Courvalin, 2000. Inner nuclear membrane protein LBR preferentially interacts with DNA secondary structures and nucleosomal linker / I. Duband-Goulet and J.-C. Courvalin // Biochemistry. 2000. - V. 39. - P. 64836488.

61. Eberl et al., 1993. The role of heterochromatin in the expression of a heterochromatic gene, the rolled locus of Drosophila melanogaster / D.F. Eberl, B.J. Duyf, A.J. Hilliker // Genetics. 1993. - V.134. - P. 277-292.

62. Elder and Turner, 1995. Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes / Jr. F. Elder and B. J. Turner // Q. Rev. Biol. 1995. - V.70. - P. 297320.

63. Elgin et al., 2004. Heterochromatin: silence is golden / C.R. Elgin, C.R.Sarah, I.S. Grewal Shiv // Current Biology. 2004. - Vol. 13, No.23. - P. 895-898.

64. Ellingsen et al., 2007. Sequence evolution of the major satellite DNA of the genus Ctenomys (Octodontidae, Rodentia) / A. Ellingsen, C.H. Slamovits, M.S. Rossi // Gene. 2007. - V. 392, №1-2. - P. 283-290.

65. Fackelmayer et al., 1994. Nucleic-acid-binding properties of hnRNP-U/SAF-A, a nuclear-matrix protein which binds DNA and RNA in vivo and in vitro / F. O.

66. Fackelmayer, K. Dahm, A. Renz et al. // Eur. J. Biochem. — 1994. V. 221, No. 2.- P. 749-757.

67. Fukuda, 1997. Characterization of matrix attachment sites in the upstream regions of a tobacco chitinase gene / Y. J. Fukuda // Plant Mol. Biol. 1997. - V. 39,No. 5.-P. 1051-1062.

68. Furukawa et al., 1994. Identification and cloning of an mRNA coding for a germ cell-specific A-type lamin in mice / K. Furukawa, H. Inagaki, Y. Hotta // Exp. Cell Res. V. 212. - P. 426-430.

69. Galy et al., 2000. Nuclear pore complex in the organization of silent telomeric chromatin / V. Galy, J.C. Olivo-Marin, H. Scherthan et al. // Nature. 2000. - V. 403.-P. 108-112.

70. Gaudin et al., 2009. Modeling the 3D functional architecture of the nucleus in animal and plant kingdoms / V. Gaudin, P. Andrey E. Devinoy et al. // C. R. Biologies. 2009. - V. 332 - P. 937-946.

71. Girod et al., 2007. Genome-wide prediction of matrix attachment regions that increase gene expression in mammalian cells / P. A. Girod, D. Q. Nguyen, D. Calabrese et al. // Nat. Methods. 2007. - V. 4, No. 9. - P. 747-753.

72. Goldman et al., 2002. Nuclear lamins: building blocks of nuclear architecture / R. D. Goldman, Y. Gruenbaum, R. D. Moir et al. // Genes Dev. 2002. - V. 16: -P. 533-547.

73. Gong et al., 2009. SATB1 regulates beta-like globin genes through matrix related nuclear relocation of the cluster / H. Gong, Z. Wang, G. W. Zhao et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009. - V. 383, No. 1. - P. 11-15.

74. Grewal and Elgin, 2002. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure / I.S.Grewal and C.R. Elgin // Current Opinion in Genetics & Development. 2002. - V. 12. - P. 178-187.

75. Grewal and Elgin, 2007. Transcription and RNA interference in the formation of heterochromatin / S. I. S. Grewal 1 and S. C. R. Elgin // Nature. 2007. - V. 447. - P. 399-406.

76. Gruenbaum et al., 2000. Nuclear lamins-structural proteins with fundamental functions / Y. Gruenbaum, K. L.Wilson, A. Harel et al. // J. Struct. Biol. 2000. -V. 129.-P. 313-323.

77. Gruenbaum et al., 2005. The nuclear lamina comes of age / Y. Gruenbaum, A. Margalit, D.K. Shumaker, K.L. Wilson // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. -P. 21-31.

78. Grushko et al., 2009 Molecular organization of heterochromatin in malaria mosquitoes of the Anopheles maculipennis subgroup / O. G. Grushko, M. V. Sharakhova, V. N. Stegnii, I. V. Sharakhov // Gene. 2009. - No.448. - P. 192197.

79. Guarda et al., 2009. Interaction between the inner nuclear membrane lamin B receptor and the heterochromatic methyl binding protein, MeCP2 / A. Guarda, F. Bolognese, I. M. Bonopace et al. // Exp. Cell Res. 2009. - V.315, №11. - P. 1895-1903.

80. Haaf and Schmidt, 1989. Centromeric association and non-random distribution of centromemres in human tumour cells / T. Haaf, M. Schmidt // Hum. Genet. 1989. - V.81. - P. 137-143.

81. Habermann et al., 2001. Arrangements of macro- and microchromosomes in chicken cells / F.A. Habermann, M. Cremer, J. Walter et al. // Chromosome Res. -2001.-V. 9.-P. 569-584.

82. Hakes and Berezney, 1991. DNAbinding properties of the nuclear matrix and individual nuclear matrix proteins. Evidence for salt-resistant DNA binding sites. / D. J. Hakes and R. Berezney // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266, No. 17. - P. 11131-11140.

83. Hall et al., 2003. Centromere Satellites From Arabidopsis populations: maintenance of conserved and variable domains / S.E. Hall, G. Kettler, D. Preuss // Genome Res. 2003. - V. 13. - P. 195-205.

84. Hall, et al., 2005. Differential rates of local and global homogenization in centromere satellites from Arabidopsis relatives / S. E. Hall, S. Luo, A. E. Hall, D. Preuss // Genetics. 2005. - V. 170, No. 4. - V. 1913-27.

85. Haraguchi et al, 2000. Live fluorescence imaging reveals early recruitment of emerin, LBR, RanBP2, and Nupl53 to reforming functional nuclear envelopes / T. Haraguchi, T. Koujin, T. Hayakawa et al. // J. Cell Sei. V. 113. - P. 779-794.

86. Hart and Laemmli, 1998. Facilitation of chromatin dynamics by SARs / C. M. Hart and U. K. Laemmli // Curr. Opin. Genet. Dev. 1998. - V. 8, No. 5. - P. 51925.

87. Heitz, 1934. Uber a- und ß-heterochromatin sowie konstanz und bau der Chromosomen bei Drosophila /E. Heitz // Biol. Zentr. Bl. 1934. - V. 54. - S.588-609.

88. Henikoff et al., 2001. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA / S. Henikoff, K. Ahmad, H.S. Malik // Science. 2001. - V.293, №5532.-P. 1098-1102.

89. Henikoff, 2000. Heterochromatin Function in complex genomes / S. Henikoff // Biochimica et biophisica acta. 2000. - V. 1470. - P. 1-8.

90. Holley et al., 2002. A model for interphase chromosomes and evaluation of radiation-induced aberrations / D.Holley // Radiat. Res. 2002. - V.158. - P. 568580.

91. Holmer and Worman, 2001. Inner nuclear membrane proteins: functions and targeting / L. Holmer and H. J. Worman // Cell Mol. Life Sci. 2001. - V. 58, No. 12-13.-P. 1741-1747.

92. Holmer et al., 1998. The human lamin B receptor/sterol reductase multigene family / L. Holmer, A. Pezhman, H. J. Worman // Genomics. 1998. - V. 54. - P. 469-476.

93. Holmquist et al., 1998. Mobile genetic elements? chiasmata? and the unique organization of beta-heterochromatin / G. P. Holmquist, V.V. Kapitonov, J. Jurka // Cytogenet. Cell Genet. 1998. - V.80, №1-4. - P.l 13-116.

94. Holt et al., 2002. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae / R.A. Holt, G. M. Subramanian, A. Halpern et al. // Science. 2002.,Vol. 298. P.129-149.

95. Kapitonov and Jurka, 2008. Helitrons on a roll: eukaryotic rolling-circle transposons / V. V. Kapitonov, J. Jurka // Trends in Genetics. 2007. - V.23, No. 10.-521-529.

96. Karamjit et al.,1999. Mosquito Genomes: Structure, Organization, and Evolution / S. Karamjit, Rai, C. William, I.V. Black // Advances in genetics. -1999.-Vol. 41.-P. 27.

97. Kidwell and Lisch, 2000. Transposable elements and host genome evolution TREE / M. G. Kidwell and D. R. Lisch // Trends Ecol. Evol. 2000. - V. 15, No.3. - P. 95-99.

98. Kimura and Hirano, 1997. ATP-dependent positive supercoiling of DNA by 13S condensin; a biochemical implication for chromosome condensation // Cell. 1997. V. 90. P. 625-634.

99. King and Cummings, 1997. Satellite DNA repeat sequence variation is low in three species of burying beetles in the genus Nicrophorus (Coleoptera: Silphidae) /

100. M. King and M.P Cummings // Mol. Biol. Evol. 1997. - V. 14. - P. 10881095.

101. Knight and Stone, 1977. A catalog of the mosquitoes of the world / K. L. Knight and A. Stone / Ent. Soc. of America, 1977. 612 p.

102. Kries et al., 1991. A matrix/scaffold attachment region binding protein: identification, purification, and mode of binding / J. P. von Kries, H. Buhrmester, W. H. Startling// Cell. 1991. -V. 64, No. 1. - P. 123-135.

103. Krzywinski et al., 2005. Satellite DNA from the Y chromosome of the malaria vector Anopheles gambiae / J. Krzywinski, D. Sangare and N. J. Besansky // Genetics. 2005. - No 1. - P. 185-196.

104. Kumar et al., 1997. In situ hybridization to Anopheles polytene chromosomes / V. Kumar, A.J. Cornel O. Mukabayire // Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. London.: Chapman and Hall, 1997. P. 337-345.

105. Mahy et al., 2002. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH / N. L. Mahy, P. E. Perry, W. A. Bickmore // J. of Cell Biol. 2002. - V. 159, №5. - P. 753-763.

106. Makunin et al., 2002. The Drosophila suppressor of underreplication protein binds to late-replicating regions of polytene chromosomes / I. V. Makunin, E. I. Volkova, E. S. Belyaeva et al. // Genetics. 2002. - V. 160, No. 3. - P. 1023-34.

107. Malone et al., 1999. UNC-84 localizes to the nuclear envelope and is required for nuclear migration and anchoring during C. elegans development / C. J. Malone, W. D. Fixsen, H. R. Horvitz et al. // Development. 1999. - V. 126. - P. 31713181.

108. Margueron et al., 2005. The key to development: interpreting the histone code? / R. Margueron, P. Trojer, D. Reinberg // Curr. Opin. Genet. Dev. 2005. -V. 15, No. 2.-P. 163-76.

109. Marshall W. F. Gene expression and nuclear architecture during development and differentiation // Mechanisms of Development. 2003. - V. 120. - P. 12171230.

110. Mattout-Drubezki and Gruenbaum, 2003. Dynamic interactions of nuclear lamina proteins with chromatin and transcriptional machinery / A.Mattout-Drubezki and Y. Gruenbaum // Cell. Mol. Life Sci. 2003. - V. 60. - P. 20532063.

111. Mekhail, 2008. Role for perinuclear chromosome tethering in maintenance of genome stability / K. Mekhail, J. Seebacher, S. P. Gygi, D Moazed // Nature. -2008.-V. 456.-667-671.

112. Melcer et al., 2007. Invertebrate lamins / S. Melcer, Y. Gruenbauma, G. Krohneb//Exp. Cell Res.-2007.-V. 313.-P. 2157-2166.

113. Mora et al., 2006. Chromosome territory positioning of conserved homologous chromosomes in different primate species / L. Mora, I. Sánchez, M. Garcia et al. // Chromosoma. 2006. - V.l 15. - P. 367-375.

114. Parada, 2004. Tissue-specific spatial organization of genomes / L. A. Parada, P. G. McQueen, T. Misteli // Genome Biol. 2004. - V. 5, No. 7. - P. R44.

115. Pardue and DeBaryshe, 1999. Telomeres and telomerase: more than the end of line / M.-L. Pardue, P. G. DeBaryshe // Chromosoma. V. 108, No 2. - P. 7382.

116. Pederson and Aebi, 2002. Actin in the nucleus: what form and what for? / T. Pederson and U. Aebi // J. Struct. Biol. 2002. - V. 140. - P. 3-9.

117. Peng and Karpen, 2008. Epigenetic regulation of heterochromatic DNA stability / J. C Peng and G. H Karpen // Curr. Opin. Genet. Devel. 2008. - V. 18. -P. 204-211.

118. Pickersgill et al., 2006. Characterization of the Drosophila melanogaster genome at the nuclear lamina / H. Pickersgill, B. Kalverda, V. de Wit et al. // Nat. Genet. 2006. - V. 38. - P. 1005-1014.

119. Pindyurin et al., 2007. SUUR joins separate subsets of PcG, HP1 and B-type lamin targets in Drosophila / A. V. Pindyurin, C. Moorman, E. de Wit et al. // J. Cell Sei. 2007. - V. 120. - P. 2344-51.

120. Plohl et al., 2008. Satellite DNAs between selfishness and functionality: Structure, genomics and evolution of tandem repeats in centromeric (hetero)chromatin / M. Plohl, A. Luchetti, N. Mestrovic, B. Mantovani // Gene. -2008.-V.409.-P. 72-82.

121. Rabl, 1885. Über Zellteilung / C. Rabl // Morphologisches Jahrbuch. 1885. P.214

122. Reeves and Beckerbauer, 2001. HMGI/Y proteins: flexible regulators of transcription and chromatin structure / R. Reeves and L. Beckerbauer // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V. 1519, No. 1-2. - P. 13-29.

123. Rice and Allis, 2001. Histone methylation versus histoneacetylation: new insights into epigenetic regulation / J. C. Rice and C. D. Allis // Curr. Opin. Cell Biol. -2001. -V. 13. P. 263-273.

124. Rice et al., 2003. Histone methyltransferases direct different degrees of methylation to define distinct chromatin domains / J. C. Rice, S. D. Briggs, B. Ueberheide et al. // Mol Cell 2003, 12:1591-1598.

125. Rogozin et al., 1999. Computer prediction of sites associated with various elements of the nuclear matrix / I. B. Rogozin, G. V. Glazko, M. V. Glazkov // Briefings in bioinformatics. 1999. - T.l, №1. - P. 33-44.

126. Rudd and Willard, 2004. Analysis of the centromeric regions of the human genome assembly / M.K. Rudd and H.F.Willard // Trends Genet. 2004. - V. 20. -P. 529-533.

127. Rzepecki et al., 1998. In vivo association of lamins with nucleic acids in Drosophila melanogaster / R. Rzepecki, S. S. Bogachev, E. Kokozaet al. // J. Cell Sci. 1998. - V. 111. P. 121-129.

128. Schirmer and Foisner, 2007. Proteins that associate with lamins: Many faces, many functions / E. C. Schirmer and R. Foisner // Exp. Cell Res. 2007. - V. 313 -P. 2167-2179.

129. Schneider and Grosschedl, 2007. Dynamics and interplay of nuclear architecture, genome organization, and gene expression / R. Schneider, R. Grosschedl // Genes Dev. 2007. - V. 21. - P. 3027-3043.

130. Schoenherr and Tilghman, 2000. Epigenetics in mammals. In Chromatin Structure and Gene Expression / C. J. Schoenherr and S. M. Tilghman // Oxford, UK: Oxford University Press. 2000. - P. 252-277.

131. Sexton et al., 2009 Genomic interactions: Chromatin loops and gene meeting points in transcriptional regulation / T. Sexton, F. Bantignies, G. Cavalli // Seminars in Cell and Developmental Biology 2009. - V. 20. - P. 849-855.

132. Sharachov et al., 2002. Inversions and gene order shuffling in Anopheles gambiae and A. funestus / I.V. Sharakhov, A.C. Serazin, O.G. Grushko et al. // Science. 2002. - V.298, №5591. - P. 182-185.

133. Singh, 1998. Molecular characterization of two heterochromatic genes from third chromosome Drosophila melanogaster / M. Singh // Simon Fraser University. 1998. - C. 138.

134. Stuurman et al., 1995 Interphase phosphorylation of the Drosophila nuclear lamin: site-mapping using a monoclonal antibody / N. Stuurman, N. Maus, P.A. Fisher//J. Cell Sci. 1995.-V. 108.-P. 3137-3144.

135. Stuurman et al., 1998. Nuclear lamins: their structure, assembly and interactions / N. Stuurman, S. Heins, U. Aebi // J. Struct. Biol. 1998. - V. 122. -P. 42-66.

136. Talbert and Henikoff, 2006. Spreading of silent chromatin: inaction at a distance / P. B. Talbert and S. Henikoff// Nature Rev. Genet. 2006. - V. 7. - P. 793-803.

137. Trojer and Reinberg, 2007. Facultative heterochromatin: is there a distinctive molecular signature? / P. Trojer and D. Reinberg // Molecular Cell. 2007. - V. 28. - P. 1-13.

138. Tu and Coates, 2004. Mosquito transposable elements / Z. Tu and C. Coates // Insect Biochemistry and Molecular Biology. 2004. -No.34. - P. 631-644.

139. Ugarkovic et al., 1995. Satellite DNAs in Tenebrionid species: structure, organization and evolution / D. Ugarkovic, E. Petitpierrz, C. Juan, M. Plohl // Croat. Chem. Acta. 1995. - V. 68. - P. 627-638.

140. Ulitzur et al., 1992. Lamin activity is essential for nuclear envelope assembly in a Drosophila embryo cell-free extract / N. Ulitzur, A. Harel, N. Feinstein, Y. Gruenbaum // J. Cell Biol. 1992. - V. 119. - P. 17-25.

141. Usdin, 2008. The biological effects of simple tandem repeats: lessons from therepeat expansion deseases / K. Usdin // Genom Res. 2008. - V.18. - P. 10111019.

142. Vazquez et al., 2001. Multiple regimes of constrained chromosome motion are regulated in the interphase Drosophila nucleus / J. Vazquez, A.S. Belmont, J.W. Sedat//Curr. Biol.-2001.-V. 11.-P. 1227-1239.

143. Visser et al., 2000. High resolution analysis of interphase chromosome domains / A.E. Visser, F. Jaunin, S. Fakan, J.A. Aten // J. Cell Sci. 2000. -V.113.-P. 2585-2593.

144. Wagner et al., 2004. The lamin B receptor of Drosophila melanogaster / N. Wagner, D. Weber, S. Seitz, G. Krohne // J. Cell Sci. 2004. - V. 117. - P. 20152028.

145. Wagner et al., 2006. The Drosophila melanogaster LEM-domain protein MAN1 / N. Wagner, B. Kagermeier, S. Loserth, G. Krohne // Eur. J. Cell Biol. -2006.-V. 85 P.91-105.

146. Wang et al., 2004. Effects and the mechanism of nuclear matrix attachment regions on transgene expression / T. Y. Wang, Y. R. Chai, B. M. Yuan // Chin. J. Cell Biol. V. 26, No. 6. - P. 587-590.

147. Wang et al., 2008. Analysis of repetitive DNA distribution patterns in the Tribolium castaneum genome / S. Wang, M.D. Lorenzen, R.W. Beeman et al. // Genome Biol. 2008. - V.9, №3. - P. R61.

148. Wang et al., 2010. A mini review of MAR-binding proteins / T.-Y. Wang, Z.-M. Han Y.-R. Chai, J.-H. Zhang // Mol. Biol. Rep. 2010 (in press).

149. Wong et al., 1998. Distinct requirements for chromatin assembly in transcriptional repression by thyroid hormone receptor and histone deacetylase / J. Wong, D. Patterton, A. Imhof et al. // EMBO J. 1998. - V. 17. - P. 520-534.

150. Zhang et al., 2003. Identification of novel histone post-translationalmodifications by peptidemass fingerprinting / L. Zhang, E. E. Eugeni, M. R. Parthun, M. A. Freitas // Chromosoma. 2003. - V. 112. - P. 77-86.

151. Zhao et al., 1996. Binding of matrix attachment regions to nuclear lamin is mediated by the rod domain and depends on the lamin polymerization state / K. Zhao, A. Harel, N. Stuurman et al. // Y. FEBS Lett. 1996. - V. 380. - P. 161— 164.

152. Zorn et al., 1979. Unscheduled DNA synthesis after partial UV irradiation of the cell nucleus: distribution in interphase and metaphase / C. Zorn, C. Cremer, T. Cremer, J. Zimmer // Exp. Cell Res. 1979. - V.124, №1. - P. 111-119.

Информация о работе
  • Артемов, Глеб Николаевич
  • кандидата биологических наук
  • Томск, 2010
  • ВАК 03.02.07
Диссертация
Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса "Maculipennis" - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно
Автореферат
Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом к оболочке ядра трофоцитов яичников малярийных комаров Anopheles комплекса "Maculipennis" - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации
Похожие работы