Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ природы нестабильной мутации WHITE-STARKA и ее производных

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ природы нестабильной мутации WHITE-STARKA и ее производных"

На правах рукописи

МУТАЦИИ ШИЕ-БТАНКА И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫХ специальность 03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории нейрогенетики и генетики развита Института биологии гена РАН, г. Москва.

Научные руководители:

д.м.н., проф., чл.-корр. РАН Л.И.Корочкин к.б.н. В.Н.Банкиров

Официальные оппоненты:

д.б.н., проф В.Г.Митрованов к.б.н. А.М.Куликов

Ведущая организациям

Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН

Защита диссертации состоится "3/ " Мал 996 г. в ^Учас. на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: Москва, ул. Вавилова, 34/5 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Автореферат разослан ллреля 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд.фарм.наук ^^слЪо^о^Грабовская Л.С.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность задачи.

Локус white является на сегодняшний день одним из наиболее изученных локусов у эукариотов.•Самая первая мутация на дрозофиле была открыта именно в локусе white (Morgan,1910). Исследования локуса white внесли большой вклад в развитие генетики. В частности, этот локус оказался удобным инструментом для изучения сцепленной с полом наследственности, феномена множественного аллелизма, тонкой структуры гена, спонтанного и индуцированного мутагенеза, эффекта трансвекции, эффекта положения, дозовой компенсации, регуляции работы гена и влияния на нее различных модификаторов. В настоящее время ген white часто является удобным генетическим маркером при трансформациях мух экзогенной ДНК. В то же время этот ген играет важную роль в изучении мобильных генетических элементов и систем генетической нестабильности. Поскольку мутации в локусе w не являются летальными и сравнительно • легко обнаруживаются на фенотипическом уровне. (Green,1959), на этом гене легко наблюдать различные перестройки структуры, инсерции и эксцизии, вызванные- различными мобильными элементами. Но, несмотря на такое широкое исследование гена white, остаются не до конца ясными некоторые аспекты работы этого гена. В частности, довольно слабо изучены окружающие ген white последовательности, хотя есть указания на то, что- они оказывают большое влияние на экспрессию гена (Levis et al.,1984; Hazelrig^et al.,1984).

В связи с вышеизложенным, несомненный интерес представляет анализ влияния перестроек во вставке в локус white, проявляющей свойства мобильного элемента, на регуляцию работы гена white.

Цель работы.

Целью данной работы было исследование нестабильной мутации wstr и производных мутантов, полученных от нее.

Первая часть работы посвящена молекулярно - генетическому

str

анализу исходной мутации w . для этого были поставлены

следующие конкретные задачи:

1) молекулярный анализ мутации wstr и исходной линии, из которой эта мутация была получена.

2) создание рестриктной карты мугантного локуса vstr.

Вторая часть работы связана с исследованием мутагенеза в линии wstr и анализу полученных мутантов. В связи с этим били поставлены задачи:.

1) Молекулярный анализ, различных производных мутаций по локусу white, полученных ОТ wStr.

2) Изучение транскрипции мРНК у мутанта wstr и различных производных этой линии.

3) Молекулярный анализ перестроек в Локусе w у линий, несущих дупликации этого локуса в 3-й хромосоме.

Научная новизна и практическое значение работы.

В результате проведенных экспериментов проанализирована новая система - генетической нестабильности, связанная с нестабильной мутацией wstr. Показано, что мутация wstr вызвана инсерцией мобильного элемента, не похожего на ранее описанные ни по сайтам рестрикции, ни по размерам. Анализ производных мутантов выявил необычные делеции в- локусе white, ранее нигде не изученные. По результатам исследования делеций можно сделать предположение о наличии в проксимальной части локуса white, на расстоянии примерно в 5 т.п.н. от транскрибируемого района, энхансерного участка.

Результаты проведенной генетической и молекулярно-генетической работы представляют как теоретический, так и практический интерес. Получена большая коллекция различных мутантов, в которой исследована лишь часть мутантов по локусу white. Подробно проанализированы различные перестройки в этом локусе, влияющие на его регуляцию. Исследована неизвестная ранее

ВСТаВКа В ЛОКУС white.

В целом, полученные данные позволяют по-новому подойти к исследованию транспозиций и влиянию прерстроек, вызванных этими транспозициями на регуляцию уникального локуса дрозофилы.

Апробация работы.

Научные результаты и материалы диссертации были представлены на межлабораторном семинаре в Институте биологии гена (1995) И на 4th Russian-Swedish Symposium "New Research in Neurobiology", Moscow, (1996).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано три печатные работы.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на £<? страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов,■ обсуждения и выводов. Представлен список использованной литературы. Работа иллюстрирована . J А. рисунками и ..3. таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Постановка скрещиваний и получение мутантов.

В данной работе исследована одна из систем нестабильности, появившаяся спонтанно в линии D. melanogaster с дупликацией Dp (1;3) wvco. Данная дупликация велика и представляет собой участок Х-хромосомы в 45 дисков по карте Бриджеса (локусы от Pgd до rst), перенесенный в прицентромерный район третьей хромосомы. Данная транспозиция В' гомозиготе летальна, что свидетельствует о сильном нарушении хромосомного баланса. В дальнейшем, в процесса поддерживания мух этой линии, в ней спонтанно возникла нестабильная мутация в локусе white. Данная работа посвящена анлизу нестабильной мутации локуса white, которая была выявлена в Х-хромосоме и возникла на фоне дупликации Dp (1;3) wveo.

Исходная линия, в которой была обнаружена нестабильная мутация по локусу w, была получена скрещиванием двух линий:

1)$$C(1)DX,ywf/Y;Dp(1;3)wvco/+ и О 0 Df(1)w v?°i/Y;Dp(1;3)wvco/+;

2)<jKJ>C(1 )RM,yw/Q И Оу ас so я "i^.Y1, у+/0.

Обе линии имеют цитотип м,1. Для получения исходной линии в скрещивание брали самок линии № 1 и самцов линии Л 2. Схема скрещиваний представлена на рис. 1. В ?1 были отобраны единичные

Линия № 1 Линия № 2

Р: $ С(1)БХ,у 71 £/У;Бр(1 ;3^со/+ X 0*у ас бс у/ У^У1, у+/0;4/+

I $С(1)М,у и/0;+/+

-1 /

X

/

F.,: О* у ао so w 4s.YL y+/0;Dp(1 ;3)wvco/+

P1: О* у ас so w Is.УЪ y+/0;Dp(1;3)wvco/+

$C(1 )RM,y w/0;+/+;Dp(1;3)wvco/+

r . . У

gC(1)RM,y wstr Рис.1. Схема получения исходной линии и мутанта wstr.

самцы с хромосомой Dp(i;3)wvc0, не имеющие свободной У-хромосомы. Такие самцы были возвратно скрещены с самками линии й 2. Исходная 'линия заложена от пары мух и велась в течение ряда неконтролируемых поколений с отбором гетерозиготных особей Dpd;3)wvco/+, имеющих мозаичный цвет глаз. Во время одного из пересевов обнаружена самка, глаза которой имели красно-бурую окраску. В потомстве от этой самки, наряду с дочерьми с мозаичными глазами, были получены дочери с темно-оранжевыми глазами. Цвет глаз наследовался в ряду поколений от матери к дочерям, особи с мозаичными глазами не появлялись. Это говорит о том, что изменение цвета глаз связано исключительно с мутацией гена в сцепленных Х-хромосомах, а не с мутацией локуса white в дупликации. С помощью скрещивания с самцами с w+Y-xpoMoсомой было

установлено, что мутация произошла в локусе white. Мутация оказалась нестабильной, поэтому ее исходно назвали white-unstable-apricot (wua). В связи с тем, что данное обозначение аллеля часто встречается в публикациях, и, фактически аллели разного происхождения называются одинаково, то мы, чтобы избежать путаницы решили переименовать его в white-starka (wstr). В течение ряда поколений наблюдались. в .основном два типа событий:

— Л ' — 9

появление белоглазых самок с частотами 3x10 4 - 2x10 и белоглазых самок, одновременно имеющих грубые фасетки, с частотами 4хЮ-4" - 1,1хЮ-2 (минимальная выборка самок 283, максимальное число просмотренных' самок в одном из поколений 2I80I). В отдельных поколениях появлялись и другие мутации, как по локусу white Х-хромосомы: w+ (4,6х10~^ - 1,1x10-4), светло-

я

оранжевые глаза типа w (5,6x10 J), бледно-желтые глаза (4,6x1); по другим локусам Х-хромосомы - темно-оранжевые глаза с грубыми фасетками (5,6хЮ~5 - ^бпо"4), крылья, по внешнему виду 'напоминающие мутацию Notch; так и мутации аутосомных локусов: практически полное отсутствие макрохет на спине

-Т — ? -Ц

(1,9x10 J - 2,7x10 ), утонченные прозрачные щетинки (5,6x10 J). (В скобках приведены частоты появления мутаций.) Таким образом, в линии с мутацией wsir наблюдался активный мутагенез, причем в некоторых случаях частота мутирования" очень высока и составила ю-3 - ю-2, что говорило о значительной дестабилизации генома.

2. Молекулярный анализ структуры локуса white у мутанта wstl\

В первых работах по исследованию мутанта wstr , было показано, что мутация wstr вызвана инсерцией в локус white неизвестной последовательности, размер которой был весьма приблизительно оценен в 7 т.п.н. (Башкиров и др., 1992). Но для дальнейших исследований природы мутации wstr необходимо было провести более подробный анализ мутантного локуса. В связи с этим был существенно расширен круг используемых рестриктаз , а также значительно увеличено расстояние, на которое разгонялись в геле фрагменты ДНК после рестрикции. При проведении Олот-гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах в качестве зонда бралась плазмида pw+(B-R), содержащая фрагмент локуса white линии дрозофил дикого

типа (примерно 8 т.п.н.) (рис. 2,Б). Таким образом, размер

str

Таблица i. Результаты молекулярного анализа линии v

Рестриктазы Сумма длин Предпола-

фрагментов гаемое

По картам Наблюдаемая Л число сайтов

С Levi set •во

al..19825 вставке

10. 9

Bam HI +

:}-

о +

11.6 •

+

lO. 9

+

6. 6

29. 1

+15.1

HI ndlll

9.2 5.7

1.1

16. 0

+10. 8

+10. 0 ♦ 9-a"

1.1

+15.1

31..1

Eco RI

12.8 x 13. O ..

2.7 } 15-5 11.О 1 + 2.7 J

+11.2 >2

2S. 7

Sal I

11.4

12'° ) 18.0 6.О J

+ 6. 6 >2

ХЬа I

8. 8

19.6 + I 23. 9

4.3 >

+15.1

Sac I

5.8 6.0

+ 15.1 +

9. 3

9.3

8.О

23.1 + 8.0 >2

Xho I 15. 0

30.1

+15. 1

вставки в мутантном аллеле white-starka был оценен более точно, а также построена ее рестриктная карта по рестриктазам ВашН I, Hind III, EcoR I, Xba I, Sac I И Sal I.

Полученные результаты представлены на рис. 2,А. На блоте геномного, перевара по сайтам Bam Н1 видно, что фрагмент с координатами (+4,8; +15,7) у мутанта wstr отсутствует. Вместо этого фрагмента, присутствуют два новых с длинами 11,6 т.п.н. и 6,6 т.п.н. Суммарное превышение длины района, гибридизующегося с зондом, по сравнению с длиной по карте (Levis et al., 1982) составляет около 15 т.п.н. (табл. 1). На основании этих данных молено высказать предположение, что в случае"аллеля wstrHHcep4Hfl тлеет длину примерно 15 т.п.н., и- что Енутри инсерции имеется один сайт BamH I. Это предположение о "наличии в wstlBCTaBKH размером в 15 т.п.н. подкрепляется результатами блот-анализа геномных переваров wstr по другим рестриктазам. Так, в переваре по Hind III суммарное превышение длины также составляет 15 т.п.н., а отсутствующий фрагмент с координатами карты (+3,4; +9,1) заменен на два новых, с длинами 10,8 т.п.н. и 10,0 т.п.н. Более тяжелый фрагмент дает слабый, но вполне отчетливый сигнал. Это, по-видимому, свидетельствует о том , что один из сайтов рестрикции Hind III располагается таким образом, что во фрагмент 10,8 т.п.н. входит лишь очень маленький'кусок последовательности локуса white. Такое возможно, если точка внедрения инсерции лежит очень близко к сайту Hind III с координатой карты (+3,4). Данные по остальным рестриктазам сведены в таблицу 1. Рестриктная карта аллеля white-starka, построенная на основе этих данных приведена на рис. 2,Б. Эта карта носит приблизительный характер, поскольку разделение фрагментов ДНК в агарозном геле не позволяет оценить размеры этих фрагментов с точностью до десятка нуклеотидных пар.

о ty*

По полученной карте можно сказать, .что инсерция в w аллеле по своим размерам и по характеру расположения сайтов рестрикции не похожа на известные ретропозоны обычного типа (Lindsley & Grell,1992). Определенное сходство у данной инсерции имеется с недавно описанными мобильными элементами ЬШЕ-типа Het-а и tart, которые имеют тенденцию локализоваться в теломерных и гетерохроматиновых районах и имеют гигантские размеры (Biessman, 1992). Учитывая, что исходная перестройка Dp(1;3)wvo° является перестройкой эу-гетерохроматического типа, проявляющей эффект

Р1

МО X X СО

(> О 3 В (■

О р> О

. я.....

са р

в

о р-

23.1

9.4

6.6

4.3

23.1

9.4 ■ 6.6

4.3

2.3 2.0

23-1

9.4 6.6

4.3

2.3

-ч

.5131

I О в о 1ц ПШ ,1 м * «О 1 ^Ьн | Ь « в}** 111 1 н5 ь 11 I 11111

. 11 1 И Г У Г н » 1 * С 11111 *Э«1ЭмН 1 1 ? к и 1-1

-5 0 *5

I lT.au.

Рис.2. А - блоты по Саузерну различных геномных переваров Б - Рестриктная карта аллеля Волнистая линия - область

зонда р«+в(И). 8

положения гена мозаичного типа, участие подобных мобильных элементов в возникновении аллеля wstr представляется весьма вероятным.

2. Молекулярный анализ природы нестабильности в мутантных аллелях локуса white. '■

Несмотря на то, что в результате транспозиций мутировали самые разные гены, для молекулярного анализа был выбран локус white, поскольку по сравнению с другими локусами, самая высокая частота мутагенеза была иг,!енно в локусе white. В то же" время мутации в этом локусе довольно просто детектируются по окраске глаз. Следует отметить и то обстоятельство, что наряду с мутациями в локусе white, часто происходили мутации в близлежащем локусе rst, фенотипическим проявлением которой является изменение морфологии фасеток. Локус rst находится на • Х-хромосоме проксимальнее локуса white, этот локус также присутствовал в дупликаций в 3-й хромосоме.

В этой работе были проанализировали все возникшие аллельные переходы в локусе white, а также некоторые вторичные мутации, полученные из мутантных производных первого' ряда. Происхождение' мутаций и реверсий, проанализированных в настоящей работе, приведено на рис.з. Для более точного анализа перестроек, имевших место в локусе white, была использована ресгриктная карта

,,str

w rst -w

wPds1rst

,+ ds3

,ads1

■w +ds4rst

,.ds2

yP^rst

pds3_

,,ads2

„str4

Рис. 3. Родословная проанализированных мутантных линий, полученных из мух wstr.

f-l

w., <* is" * £ ^ |

g 3; I I г г £

H "J а; ф >( ш . 1-. ,-

---1J.L

-¿3.1 -U.I

r«o

t i USM

l-s.s

- Vf

- ел

. 1Л -4Л

-4Л

-> I_1

1

. • --a.o . i.o

Рис.4. Блоты по Саузерну различных геномных рестриктов: 1 - самки w+ds4rst; 2 - самки wds1rst; 3 - самки w+ds1.

мутантного локуса wstr. Эта карта была использована для

рестриктного картирования мутантных производных, полученных из

str w .

Одним из наиболее часто встречавшихся типов мутационных переходов было двойное мутирование по локусам w и rst. На рис.4, представлены результаты блот-гибридизации геномных переваров с фрагментом локуса white дикого типа. У мутанта wds1rst (Рис.4,2),

имевшего белые грубые глаза, по-видимому," произошла делеция вставки на обоих плечах сцепленных Х-хромосом. При этом были вырезаны как правая часть вставки, так и часть локуса white, содержащая сайты по Ba-n HI (+4,8) и Hind III (+9,3), справа от вставки. Это привело к уменьшению количества фрагментов ДНК по сравнению с wstr. Таким образом, в данном случае произошло неточное вырезание. Судя-по фенотипу, какие-то транспозиционные события одновременно имели место и в локусе rst, однако, чтобы это выяснить, нужно' было провести гибридизацию с другим зондом, которого в нашем распоряжении не было.

У ревертанта w+ds^rst, полученного из мутанта, описанного выше, , цвет глаз стал похожим на дикий тип, но грубость глаз сохранилась. Сказалось, что, помимо делеции, характерной для

г!ч1

w rst,которая сохранилась на одном из плеч, на втором плече, по-видимому, произошла дополнительная делеция примерно в 300 -400 пар оснований. Эта делеция затронула участок правее предыдущей, и захватила сайт Hind III ( + 10,5 )• На результатах блот-анализа геномной ДНК по ВашН I (Рис.4,2) это отразилось в появлении более легкой полосы размером в 8,6 т.п.н. В свою очередь можно говорить о том, что такая асимметрия Х-хромосом является причиной неустойчивости локуса white. Причем, по сравнению с другими мутантными линиями, нестабильность в этой линии проявляется особенно сильно и в основном выражается в появлении с высокой частотой мух с белыми грубыми глазами. Реверсию к дикому типу в данном случае объяснить довольно сложно, поскольку в данном случае приходится говорить об участке локуса, удаленном на несколько тысяч пар оснований от кодируемого региона. Из экспериментов по трансформации мух векторами, несущими участки локуса white, был сделан вывод, что для регуляции работы гена white достаточно регуляторных участков, прилегающих к транскрибируемой области этого гена в пределах двух т.п.н. (Pirotta et al., 1985, Levis et al., 1985). Полученные нами результаты могут свидетельствовать в пользу предположения, что, возможно, проксимальнее вовлеченного в делецию участка, находится какой-то регуляторный участок, который в результате делеции приблизился к кодируемой части локуса white. Указания на существование таких участков тлеются в ряде работ

Рис.5. Блоты по Саузерну различных'геномных рестриктов: 1 - самки wpds1гst; 2 - самки у/1*32; 3 - самки 4 - самки игрс1£!2г81;.

(Peterson et al.,1994;Ceorgiev,1994).

Несколько иная картина наблюдалась у ревертантов w+ds1, у которых произошла реверсия окраски глаз, близкая к дикому типу. Здесь результаты блот-анализа (Рис.4,3)обнаружили большую делецию на сцепленных Х-хромосомах между сайтами Xba I внутри вставки и Xba I ( +13,6 ) в локусе white. Исходя из этих результатов правая граница делеции совпадает ■с границей делеции ■у ревертанта w+ds4rst. Таким образом, это уже второй случай, свидетельствующий в пользу предположения о том, что правее сайта Hind III ( +10,5 ) находится регуляторный участок гена white.

На рис. 5 представлены результаты анализа мух четырех мутантных линий, которые произошли из мух линии wpds1rst. Мухи этой линии тлели бледно-желтый цвет глаз и слегка грубые глаза. Наиболее интересными являются две линии: это исходная wpds1rst, и линия w rst. В первой из этих линий на одном плече произошли две делеции. Одна из них, размером в 4,5 т.п.н. произошла внутри вставки между сайтами рестрикции Xba I и' ВашН I вставки. Это отразилось в появлении дополнительных полос размером в 6,3 т.п.н. для рестрикции геномной ДНК по Hind III и полосы в 7,1 т.п.н. для рестрикции по BamH I. Другая делеция захватила часть вставки правее сайтов рестрикции для ВагаН I и Hind ill внутри .нее, а также захватила прилегающие районы локуса w, включая сайты Bam HI (+4,8) и Hind III (+9,3). Эта делеция также привела к появлению фрагмента в 3,0 т.п.н. при рестрикции геномной ДНК по Hind III и слабо видному фрагменту в 9,4 т.п.н. по ВаиН I. Другое же плечо сцепленной Х-хромосомы осталось без изменений. Так же, как и в случае с мутантом w+ds4rst, такое асимметричное строение плеч обусловило значительное, по сравнению с другими мутантами, количество производных за счет рекомбинаций между плечам. Одной из таких мутантных производных является линия wstr1rst. В ней на одной Х-хромосоме имеется крупная делеция внутри 'вставки и локализуется правее сайта рестрикции для Xba I. Возможно, у некоторых мух линии wpds1rst сначала произошла рекомбинация между гомологичными левыми областями вставки на сцепленных X-хромосомах, в результате которой произошло восстановление вставки на обоих плечах. Затем опять произошла делеция, но уже внутри вставки, что привело к восстановлению такого же фенотипа, что был у мух линии wstr. Одновременно, по-видимому, могли произойти

-1Л

Рис.б. Блоты по Саузерну различных геномных рестриктов: . 1 - самки 2 - самки уу4*3-5; 3 - самки уу^1*3.

какие-то делеции в локусе гв^ но анализ этого локуса ж проводился.'

Картина, полученная при анализе линий да (белые глаза) 1 «рс1з2гз1 (бледно-желтые глаза), такая же, как у мух исходно!1 линии Объяснить фенотипичекие отличия по результатам блот-

гибридизации не представляется возможным. Можно толькс предположить что при рекомбинациях имели место какие-тс перестройки в пределах сотни пар нуклеотидов в регуляторной

области. Для более полной характеристики этих изменений необходимы дальнейшие иследования структуры первичной последовательности мутантных локусов.

Были также проанализированы ревертант w+ds3, который имел цвет глаз, близкий к дикому типу, и два мутанта - wds3 и wstr3, получешх от него (Рис. 6). Мутанты w^3 имели белые глаза, а wstr3 Красно-бурые. По результатам блот-анализа видно; что у ревертанта произошло неточное вырезание части Еставки на одном плече сцепленной Х-хромосомы. При этом вырезалась также правая часть локуса white до сайта Hind III ( +9,3. ). На другом плече сцепленной Х-хромосомы вставка осталась на месте. Объяснить реверсию можно тем, что в результате' делеции произошло приближение регуляторного участка гена white к транскрибируемой области локуса. В дальнейшем, у мух линии wis3 за счет рекомбинационных процессов произошла аналогичная делеция на другом плече сцепленной Х-хромосомы, что, по-видимому, привело к утрате окраски глаз у мух линии wds3. В случае мух wstr3 произошло перемещение вставки на соседнее плечо сцепленной X-хромосомы, что привело к восстановлению исходной картины, которая была у мух исходной линии wstr.

В случае с мутантами wads1(PHc. 7,1), имевшими абрикосовый

цвет глаз, на одном плече сцепленной Х-хромосомы часть вставки

вырезалась, захватив прилегающие справа районы локуса w до сайта

EcoR I ( +9,7 ). На другом плече вставка осталась без изменений.

Здесь картина несколько похожа на ту, которая наблюдалась с

мутантом w rst, но в отличие от него делеция произошла только

на одной из сцепленных Х-хромосом. По-видимому, это и определило

такой фенотип, который является промежуточным между белыми и

красно-бурыми глазами. Аналогично ранее рассмотренному случаю с

мутантом wP^rst, в этом случае также несимметричное строение

сцепленных Х-хромосом является причиной нестабильности мутации wads1 _

В дальнейшем эта линия дала ряд мутантных производных линий, одна из которых, wstr4, имевшая красно-бурые глаза, была проанализирована (Рис.7,2). На картине, полученной в результате блот-анализа этой линии, видно, что на обеих сцепленных X-хромосомах имеются две делеции. Одна из них, размером примерно в 6,6 т.п.н., произошла внутри вставки и захватила сайты рестрикции

(5.1

Ьч :t £

fQ

(-1 tc

s t) ■oQ

-9.1

.C=8

-9.1

- <3M

■ c.c

-M

> - i,0

-e.e

■Ьл

■ г.г

- с, с

-h.4

Рис.7. Блоты по Саузерну различных геномных рестриктов: 1 - самки wadsl; 2 - самки wstr4.

EooR I, Батан I и Hind III. Вторая делеция, размером примерно в 4,4 т.п.н., произошла в регуляторной области гена white между сайтами рестрикции BamH I ( +4,8 ) и EooR I ( +9,7 ). Объяснить восстановление красно-бурой окраски глаз в этом случае довольно сложно. Один из возможных вариантов объяснения сводится к тому, что сохранился участок локуса white, примыкающий к вставке справа. В нем, по литературным данным (Pirotta et aL., 1985, Levis et al., 1985) находится энхансер гена white, за счет которых происходит увеличение уровня транскрипции по сравнению с предыдущим мутантом.

С25Э tcj

Рис.8. Нозерн-гибридизацня мРНК из самок wstr.

3. Влияние инсерции в локусе wstr на регуляцию экспрессии.

Что касается локализации инсерции относительно регуляторных лементов локуса white, то здесь ситуа'{дая выглядит довольно-таки ложно. В области внедрения вставки находятся первый экзон и ервый интрон гена, рядом находятся 5*-концевой лидерный участок РНК и промотор гена white. Для ответа на вопрос, не изменилось и строение транскрибируемой мРНК, была поставлена Нозерн-ибридизация с фрагментом локуса white, включающим ранскрибируемый регион. По результатам этой гибридизации (Рис.а) тало видно, что по сравнению с .мРНК дикого типа никаких зменений не произошло.' Из этого был сделан вывод, что вставка зходится вне транскрибируемой области гена,. возможно, перед его • эомотором. Но, поскольку вставка встроилась между промотором и кансером, то это привело к ослаблению действия знхансера, из-за зго цвет глаз не достигает интенсивности дикого типа.

4- Транскрипция некоторых производных мутантов линии wstr.

В данной работе были проанализированы линии с фенотипом глых глаз и с глазами, близким к дикому типу (Рис.9). Была зставлена Нозерн-гибридизацня РНК с фрагментом локуса white,

♦

Рис.9. Нозерн-гибридизация мРНК.из самок различных мутантшх аллелей.

приведенным в предыдущем, разделе. Результаты гибридизации показали, что РНК синтезировалась в обоих случаях, и ее размеры оставались неизмеными. Это также явилось, подтверждением предположения о том, что инсерция локализуется в регуляторной области. Различия в фенотипическом проявлении, по-видимому, объясняются различными перестройками в районе между координатами +5 и +11 карты локуса white (Levis et al.,1984). He- исключено также, что здесь имеет место влияние регуляторных белков, кодируемых генами-модификаторами.

5. Анализ других линий, несущих дупликацию в 3-й хромосоме.

Поскольку дупликация Dp(t;3)wvco находится в прицентромерной области гетерохроматина, то следует учитывать это обстоятельство при построении гипотезы о событиях, которые привели к мутации wstr. Исходя из того, что размер этой дупликации достаточно велик, можно говорить о сильной дестабилизации генома. К тому же

ts Ol

S 1

to rc

-J3.I

- C.6

Рис.ю. Блоты по Саузерну различных геномных рестриктов СаМОК ЛИНИИ у SC5 w258-45 spl;Dp(1;3) wvco,wvco.

гетерохроматин, окружающий последовательность дупликации, в основном состоит из повторяющихся последовательностей, среди которых часто встречаются мобильные генетические элементы. Таким образом, при рекомбинации между прицентромерным районом дупликации Dp(1;з) третьей хромосомы и гомологичной областью X-хромосомы, могла произойти случайная транспозиция какого-либо мобильного элемента из близлежащего участка гетерохроматина в область локуса white находящийся на Х-хромосоме. Не исключена возможность того, что перемещение вставки в область локуса white могло произойти по механизму, предложенному в работе (Thompson-Stewart, 1994).

Для сравнения, нет ли похожего процесса в других линиях, были проанализированы самки мух линии с генотипом у бс5 w258-45 spl;Dp(i;3) wvco,wvco. Оказалось, что, несмотря на такой генотип, все самки данной линии имели такую же окраску глаз, как мутантные самки wstr. , В . связи с этим ..наблюдением . можно сделать предположение, что, возможно, процесс мутагенеза при таких нарушениях хромосомного баланса вдет в каком-то определенном направлении. В дальнейшем природа мутации в линии у so5 w258-45 spl;Dp(l;3) wvco,wvo° была исследоваана с помощью блот-гибридизации. В отличие от мух wstr в этой линии наблюдались делеции во всех локусах white (Рис.10). Природа этих перестроек не до конца ясна, но, по-видимому это свидетельствует о возможной дестабилизации генома, которая возникает в ответ на внедрение крупных дупликаций.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризована нестабильная мутация white-starka, полученная спонтанно. Показано, что она вызвана инсерцией размером около 15 т.п.н. и способной к транспозициям.

2. Составлена рестриктная карта инсерции в локусе wstr. Не обнаружено сходства по сайтам рестрикции ни с одним из ранее описанных мобильных элементов.

3. С помощью молекулярно-генетического анализа изучена структура изменений в различных мутантных производных нестабильного локуса wBtr. Полученные результаты позволяют сделать предположение о существовании ранее не описанных регуляторных элементов в проксимальной области локуса white.

4. Проанализирована экспрессия мутантных аллелей локуса white. Показано, что структура транскрибируемых мРНК идентична дикому типу.

5. Показаны различные перестройки в локусе white линиий, несущих крупную дупликацию в - прицентромерном районе 3-й хромосомы. Предположено, что подобные дупликации вызывзют дестабилизацию генома.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Аслануков А.Р., Васильев В.А., Башкиров В.Н. Молекулярная природа нестабильного зллеля white-starka. Генетика, 1996, J6.4,

стр. 576 - 578.

2. Корочкин Л.И., Сергеев П.В., Башкиров В.Н., Панин В.М., Габитова Л.Б., Мартинец К., Копанцева М.Р.,' Шостак Н.Г.,. Павлова Г.В.,Барский В.Е..Дзитоева С.Г., Голубева М.В., Аслануков А.Р. Тканеспецифическая экспрессия ' гена ests у трансгенных дрозофил. Доклады академии наук, 1995, т.340, JÉ 3, стр. 433-436.

3. Aslanukov A.R., Bashkirov V.N. Analysis of some mutants, derived from unstable allele white-starka. Abstract book of 4th Russian - Swedish Symposium "New Research In Neurobiology", Moscow,1996, p.14.

4. Aslanukov A.R., Bashkirov V.N. A novel giant insertion possibly having transposon traits into the white lokus. Drosophila Information Service, 1996, in press.