Транспозиция мобильных элементов: создание моделей и выявление новых генов регуляции транскрипции

Георгиев, Павел Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Транспозиция мобильных элементов: создание моделей и выявление новых генов регуляции транскрипции
ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Транспозиция мобильных элементов: создание моделей и выявление новых генов регуляции транскрипции"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ии. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

Р Г Б ОД

На правах рукописи

1 3 МАП 1336

ГЕОРГИЕВ Павел Георгиевич

РАН СП ОЗИЦИЯ МОБИЛЬНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ: СОЗДАНИЕ МОДЕЛЕЙ И ВЫЯВЛЕНИЕ НОВЫХ ГЕНОВ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ

Специальность 03.00.26 "Молекулярная генетика"

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 1996 г.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Л.И. КОРОЧКИН

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Е.М. СВЕРДЛОВ

доктор биологических неук' ¿.И. КИМ

Ведущая организация:

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва

Защита состоится "¿V "■Л/О'г? 1996 г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5-

С диссертацией в виде научного доклада мохно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энтельгардта до адресу 117984, г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Диссертация в виде научного доклада разослана Ч.-^" апреля 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фармакологических " ® * ГРАБОВСКАЯ

ВВЕДЕНИЕ

Одно из центральных направлений сегодняшней биологии - это :зучение механизмов регуляции основных генетических процессов, ■аких,. как транскрипция, репликация, рекомбинация, . у |укариотических организмов. Хотя за последние годы получен богатый |кспериментальный материал, особенно о природе цис- и транс— егуляторных элементов транскрипции, многие вопросы остаются 1ткрытыми. В частности, это — вопрос о природе дистанционных заимодействий в геноме.

[обильных генетических элементов (мгэ), расположение которых на ромосомах вариирует у разных организмов, относящихся к одному :иду. Мгэ разделяются на рад классов, с различной стратегией ранспозиции. При этом мгэ часто используют системы репликации и ранскрипцки хозяина для реализации своей программы транспозиции, 'яд мгэ несет в своем геноме элементы контроля соответствующих истем. Именно поэтому они оказывают сильное влияние на работу тех ■енов, рядом с которыми они внедряются.

По той же причине мгэ могут служить ценным инструментом не олько для изучения процессов транспозиции, но и для познания общих акономерностей регуляции главных генетических процессов. Для этого еобходимо создание адэкватных генетических моделей. Наконец, нсерции мобильных элементов можно использовать и для выявления и локирования новых генов.

Настоящая работа к была в своей первой части направлена на оэдание такого рода моделей. Ее вторая часть была ориентирована на ыяснение ряда закономерностей контроля транскрипции у эукариотов и ыявление генов, управляющих этими процессами. Объектом сследования служила дрозсфала, ТУгозорЬ-Иа. тпе\апоёазХег.

На первом этапе работы было разработано две системы. Первая, -истема продленной нестабильности, получена на базе скрещивания Вух лабораторных линий, зсР^мР^ и РИ4. В результате у потомства «■ ктивировался инсерционвый мутагенез, который продолжался в течение алее 30 поколений и был вызван транспозициями нового нового мгэ, азванного Сталкером (БТаНгег). Последний относится к мгэ етровирусного типа, имеющим длинные концевые повторы. Он активно еремещается в потомстве и вызывает ряд мутаций в известных и новых енах. Система была с успехом использована для выявления новых егуляторных генов.

Другая система получена при индукции в линиях с продленно нестабильностью гибридного дисгенеза Р-Ы типа. В результате ' был получено большое число супер-нестаОилькых мутаций в разных локусах Показано, что супер- нестабильные мутации возникает1 в результат внедрения химерного мобильного элемента, состоящего it расположенных по краям двух копий одннакових дефектных Р элемекто и заключенных между ними геномных последовательностей, которы могут быть собраны дазсе из разных хромосомных участков Супер-нестабильные мутации далее использовались для изучени, контроля процессов транскрипции.

Второй этап работы - это выявление и исследование новых генов участвующих в контроле экспрессии другах генов. Нутации в них был: в основном получены в системе 'с продленной нестабильностью Наибольший интерес представляют гены модификатор мдг4 (modifier о. mcLg4), mocî(jru3g4 ), и группа генов знхансеров yellow (enhancers о. yellow. 1, 2, 3. 4. 5 и б), е(у)1-6. Нутации в первом модифицирую1 фенотипическое проявление мутаций в разных локусах, вызванных мг: ретровирусного типа; мдг4 (или gypsy). Мутации в генах e(y)1-t усиливают фенотипическое проявление мутаций в локусе yellow имеющих разное происхождение.

Установлено, что продукт гена moiifmûg4) взаимодействует i продуктом гена suppressor of Eatry wing, suÇBw), фактором активирующим транскрипцию мдг4 и связывающимся с его энхансером При этом энхансер мдг4 подавляет действие всех других знхансеров которые расположены по другую сторону от промотора по отношению ] энхансеру мдг4- Этот феномен обозначается как феномен инсуляции Мутация, инактивируицая ген mocl(mûg4), ведет к нарушению инсудяцш и одновременно к прямому ингабирукщему действию белка su(Hw) hi некоторые промоторы. Установлена роль структурных доменов белю su(Bw) в инсуляции и прямом ингибироваяии. Далее показано, чт< инактивация локуса moû(miîg4) может привести к ранее не описанном; явлению негативной трансвекции, в результате которой регуляторны! район, с которым связывается белок su(Hw), одновременно подавляв*! транскрипцию с промоторов, расположенных на двух гомологичны: хромосомах.

На системе супер-нестабильных мутаций найдено, что действие Н( транскрипцию регуляторных белковых факторов, связывающихся ( анхансерами, зависит от их окружения. У . разных аллелей локус! yellow, полученных в супер- нестабильной системе, белковые продукт!

su(Hw) и mod(mi3g4) могут оказывать самое разное, как по знаку, так и по интенсивности, влияние на экспрессии гена yelloa.

Выяснена функция трех генов группы энхансеров уеНош. Белки е(у)1, е(у)2 и е(у)3 участвует в обеспечении взаимодействий между удаленными участками ДНК. Мутации в любом из трех генов, кодирующих эти белки, ведут к резкому усилению фенотипического проявления мутаций в локусе zeste, белковый продукт которого участвует в формировании таких взаимодействий. Продукты генов е(у)1, е(у)2 и е(у)3 полностью компенсируют утрату белка zeste.

Актуальность проблемы. Регуляция работы гена - важнейшая задача современной молекулярной биологии и генетики. В частности таково наименование одного из направлений Российской ГН'Ш "Приоритетные направления генетики". Многие вопросы остаются нерешенными. Неясно как осуществляется взаимодействие между множественными ядерными факторами, взаимодействующими с разными цис-регуляторными элементами одного гена. Существуют ли другие классы факторов, кроме уже изученных, которые участвуют в контроле транскрипции, и, если да, то какова их природа и природа кодирующих их генов? Все эти вопросы имеют большое научное и практическое значение. Крайне существенным является создание адэкватных моделей для проведения исследований на выше перечисленных направлениях.

Научная новизна и практическая ценность. Данная работа проведена с целью дать ответ на некоторые из перечисленных вопросов. Все полученные результаты являются оригинальными. Система продленной нестабильности - одна, из первых систем, где удалось вызвать перемещения мгэ ретровирусного типа. Большая группа супернестабильных мутаций, полученная в работе • отличается и по свойствам, и по механизму от известных в литературе. Раскрыта химерная природа вызывающих их инсерций. Описана серия новых генов, участвующих в контроле транскрипции, причем по механизму действия кодируемые ими белки отличаются от известных факторов. В частности, обнаружены три гена, продукты которых участвуют в организации дистанционных взаимодействий в геномеI. Созданы новые -системы' для. изучения контроля транскрипции. Описан феномен мутационного подавления инсуляции и феномен негативной трансвекции.

Полученные в работе результаты легли в основу целого ряда

исследований, ведущихся сейчас в России и за рубехоы. Так, осуществлено клонирование части открытых генов и ведется работа по клонированию остальных. Широко используются и модельные системы для изучения транскрипции и рекомбинации.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на

следующих симпозиумах и конференциях: "Проблемы молекулярной и популяциовной генетики" (Москва, 1988); XVI Международный генетический конгресс (Торонто, Канада, 1988); VI Всесоюзное совещание по проблемам биологии и генетики дрозофилы (Одесса, 1989); Конференция-конкурс ИНБ (Москва, 1990), 10-ый..двусторонний советско-французский симпозиум "Физйко-химические основы жизни" (Киев, 1990) > VII Всесоюзный симпозиум "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), Конференция по генетике в Институте Дх- Хопкинса (Балтимор, США, 1992).

Представленные в диссертации исследования были награждены Премией им. Коха Европейской Академии Наук в 1993 г.

На основании результатов, полученных в настоящем исследовании, автор выиграл грант Медицинского Института ~ Ховарда Хьпза для проведения дальнейших исследований по открытым в работе генам.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 25 статей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. СИСТЕМА ПРОДЛЕННОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ

Путем скрещивания двух стабильных линия DrosopflíZcx slanogaster были получены линии, в которых в течение длительного ремени и с высокой частотой тел инсерционный мутагенез, вызванный гремещениями мобильного элемента ретровирусного типа, названного галкером. В системе был получен ряд мутаций в новых локусах, эторые, как было далее установлено, участвуют в регуляции

ПЯИП) Г U * М 11Ч М ЛОЧНТЛГ В .

этя значительная доля всех мутаций у D.melanogaater связана с всерцией мобильных элементов, перемещения последних происходят эсьма редко (ве более на генерации). Транспозиции

ктивируются после некоторых скрещиваний, ведущих к так называемому ябридному дисгенезу (Н. Kldwall). Хорошо изучены два типа югенеза, Р-Н и I-R, связанные с активацией транспозиций Р и I цементов, соответственно. Дисгенез возникает при скрещивании выцов, несущих в геноме активные копии данного мгэ, и самок, ашенных их. В течение нескольких поколений после скрещиваний [юисходят активные перемещения мгэ, которые далее затухают, ггересными, но недостаточно охарактеризованными относительно элекулярвых механизмов являются система отбора приспособленных -обей (В.А. Гвоздев) и система с транспозиционными взрывами (Т.Н. эрасимова), где наблюдались перемещения многих мгэ. Поиск новых 1стем с активными транспозициями мгэ представлял несомненный гтерес. Параллельно' с ..нашими работами появились сообщения об 1стивации транспозиций и других мгэ (А. Ким, М.Б. Евгеньев и др.).

злучение системы продленной нестабильности. Был проведен ряд

хрещнваний между лабораторными линиями J3r030ph.lT.CL melanogaster. В »зультате было обнаружено, что в потомстве от скрещивания линий "seШшаС fсокр. tв00) и Df(1)Pga-liZ/PU4.y3lasc8ámB (сокр. FU4) . эчиная со второго—третьего поколения, возникает мутагенез, идущий частотой около (1-2)х10~^. Некоторые из опытов по индукции гтагенеза приведены в табл. 1.

Табл. 1. Мутагенез в потомстве после.скрещивания линий waG и Ш4.

N он. По-коле-ние СКРЕЩИВАНИЕ Ç X 0* Общее число мух (х10 ) Число независимых мутаций в клетках: Частота мутаций (Х10"э)

зародышев.|соматич.

1. Р ш00/ш00 FÜ4/Y аС , аС aG „, F1 ш /ш w /Y __ aG, aG aG F2 tu /ш w /Y F3 то же F4 то же F5 то же 3.2 3-9 8.5 6.6 2.1 0 0 2 0 8 5 5 4 4 1 <о.з 0.5 1.5 1.4 2.4

2. Р Df/Fil4 уР°/Г F1 wcG/FU4 vf^/Y F2 vPZ/uP0 F3 то же F4 то же 4-8 12-9 8.0 0 0 11 . 11 10 6 <0.2 1.7 2.0

3- Р Df/íU4 vfG/Y F1 VPG/FU4 FU4/Y* F2 waC/FU4 uPG/Y —, aG, aG aG „ F3 vi /w w /Y F4 то же 5-1 7-8 9-1 2 2 3 5 6 4 0.8 1.0 1.1

4- FIS bV w^/Y F30 w^/uP0 w^/Y 12.3 10.8 5 1 6 0 0.5 0.6

ВСЕГО (данные 6 опытов) КОНТРОЛЬ (линия шaG) 140.2 46.3 83 68 2 0 1.1 0.04

Учитывались X хромосомные и доминантные аутосомные мутации. В опыте 4 собирали не мутировавших мух из F15 или РЗО (после исходного скрещивания), размножали их в течение трех генераций и анализировали на появление мутаций в этот период времени. Все скрещивания с 13-го (или с 28-го) были индивидуальными, что исключало наличие предсуществующих рецессивных мутаций. Контрольные наблюдения велись в то же время, что и анализ скрещиваний. В другие периоды частота мутагенеза в линии была еще ниже.

Мутагенез, полученный в данной системе, характеризуется следующими свойствами. 1) Нестабильность поддерживается в течение многих поколений после индуцирующего скрещивания: частота мутаций после 30-го поколения снижается лишь в 2-3 раза. 2) Мутагенез активируется независимо от направления исходного скрещивания. 3) Мутации возникают как в зародышевых, так и в' соматических клетках (на что указывает появление мозаиков). По этим параметрам мутагенез в нащей системе отличается от мутагенеза при Р-Н или 1-Й дисгенезе.

(утация в локусе yellow, возникшая в системе, вызвана новым мгэ :талкером. Одно из мутационных событий, произошедших в система,

5ыл переход у2 аллеля в y'U?, т.е. нулевой аллель. С помощью блот-анализа было показано, что в рвйоне локуса yellow в добавление к зставке мдг4. ответственной за у2 мутацию, появляется новая шсерция в районе второго экзона. Этот район был проклонлрован из геномной библиотеки ДНК линии y1u1 scD1 иР° в фаге X EMBL4 с использованием в качестве пробы фрагмента локуса yellow. Оказалось, что вставка действительно локализована во втором экзоне и имеет размер около 7 тпн. Ее рестриктная карта дана на рис. 1.

— _ -------------... — orf.TTnr

далее ишш оцроделыиа ay jcwjoo l^av*1-"1 * •—----------

аа стыках вставки и последовательности хозяина (рис.2). Оказалось, что вставка ограничена по краям классическими длинными прямыми повторами, размером 406 пн- Следовательно, вставка относится к мгэ ретровирусного типа. Этот новый мгэ был назван Сталкером (Stalteer)-

Блот гибридизация геномной ДНК разных линий D. melanogaster с разными фрагментами Сталкера показала, что Сталкер представлен несколькими десятками копий в геноме всех линий и его внутренние последовательности довольно гомогенттн во всех копиях.

В системе продленной нестабильности происходят активные перемещения Сталкера. Следующая серия опытов проведена для изучения локализации Сталкера методом гибридизации in situ. Большинство лабораторных линий D. melanogaster, в том числе ИМ, содержат лишь 1-3 эухроматиновые копии Сталкера, хотя в гетерохроматине (хромоцентре) их всегда много. В отличие от других, линия иР^ содержит около 50 эухроматиновых копий Сталкера (рис. 3)-

Перемещения Сталкера исследовались на X хромосоме. У разных особей из линии tiF3 расположение. Сталкера по длине X хромосомы практически идентично. Однако, после скрещивания с линией FH4 начинаются перемещения Сталкера. Некоторые примеры приведены в табл. 2.

Видно, что расположение Сталкера в X хромосомах из мутантов отличается от такового в исходной линии. Происходит внедрение . Сталкера в новые места и несколько реже потеря копий Сталкера. Внутри суб-линий также выявляется гетерогенность в расположении Сталкера, т.е. перемещения последнего,Происходят значительно чаще, чем появляются мутации.

a-4.TR |

6--l.TR

ЗЧ-ТЯ

Рис. 1. Рестриктная карта

локуса уеНош в линии

,1и1П1сС у ас ш .

Сайты рестрикции: В-ВсшШ1,, С-С1а1, Н-ИСшЦИ, К-КрпХ, Р-РзО:. Н-ЕсоМ, Б-гасл:, и-руин, У-ЕсоНV.

Цифры-координаты комплекса асГюеТе-зсиХе. стрелки-акзоны' гена уеНош.

6-4.TR

ТАТАССТСАСАС ТСС

1 ЕТСТДССАТАТТССАСТААТСТАСССТААСААТАСААТАСАТСАТТСССТАТААСАТАССС б1 ТСААТАСАТТСТСАСАСТТТСТСАТААТАААТАТАААТАТАСАААТАТАСАААААСАССА 121 ССАААААСТАССТААССАСТССАСССССССАСТААТАССАТСТААСССТТАТАСАТААСС 181 ССАТСССССАСССТСССААТССТСАССАТССАСТТТССАаСТСААСОХЗСТСААТСССТТС 241 ТССАТССАЬАТСТАТАТСТАТЛААТСТААСТААСААТАСАТАСАТАТААССААТСТАТСТ 301 ССССТТАССТСААСССА^СтаСАССАСАСТТТСАТСАтаССАА1АААСАСАТТСАААСАС 361 АССАСАССТТСТСАССТСССАААССАААТСТАТТАСАТСТАтаАСА! ТТССССАССС ТСАСЯХХК;ТСТСАОАСТСТСТСТСТОТСаЖТСТСТСТСССТС!МТСТОССАСССТСТТТ

ТААТАТГСАСААСТСААТСАСТАСАТАТА^таССТСАТТТСТТТАААААСССАСТС

[ТСТАССАТАТТСС........................ТСТА1ТАСА] ТСС5 ССССААТ

<--:—

Рис. 2. Нуклеотпдная последовательность длинного концевого повтора (ДКП) Сталкера.

Стрелки указывает последовательности, относящиеся к гену уеНош, и направление его транскрипции. Подчеркнута удвоенная нуклеотпдная последовательность хозяйской ДНК (3 пн). В квадратных скобках — первый ДКП Сталкера (полная последовательность) и второй ДШ (только начало и конец, так как последовательность первого и второго ДКП идентичны). В пределах ДКП жирным шрифтом выделены короткие обращенные повторы по -краям ' ДКП и ААТААА сигнал полиаденилирования- Внутри "тела" Сталкера выделены участок, комплементарный 3'-концу тРНК, и олигопуриновый блок. Эти характерные для ретровирусов последовательности играют важную роль в обратной транскрипции.

.v-. >Vfi .О \ Ч"

с. \

i V ->* -,Al t^

V V? у . ii

» -W - ).

•»-A '

Рис. 3. Гибридизация In situ Сталкера с политенными хромосомами разных линий D. melcmogaster.

1-Oregon R. 2-угзс0,ш'с. 3-у1u13C01w'a. В качестве проб использовались фрагменты BamHI-Pstl, включающий левую часть Сталкера и прилегающую область гена yellow, внутренний Htrcdlll фрагмент и EcoRI фрагмент, включающий правую часть Сталкера и прилегающую область гена yellow. Со всеми пробами получен одинаковый результат, что указывает на принадлежность всех чвстей вставки одному и тому же мгэ.

Интересно, что когда в линии возникает новая мутация, то как правило, в той области где локализуется мутировавший локус, одновременно появляется ранее отсутствовавшая там копия Сталкера. Очевидно, значительная часть мутаций, происходящих в системе связано с внедрением Сталкера.

Мутации, вызванные внедрением Сталкера: выявление новых генов. В системе продленной нестабильности возникает много разных мутаций. При этом можно наблюдать предпочтительное их прявление в некоторых локусах. Так например, в локусе уеНош было получено 23 независимых мутации (из общего числа 151) в локусе иЛНе - 16, forlte(l - 13, Иа1г1еэз - 12 и т.д.

Наряду с мутациями в известных локусах, был получен ряд мутаций в ранее неизвестных генах (Табл. 3). В таблице (нижняя часть) приведены также мутации, полученные позднее при совмещении системы продленной нестабильности с гибридным дисгенезом (см.

Табл. 2. Локализация Сталкера в X хромосоме разных лцний О.

т£\апаервХег, поддерживаемых в гомозиготном состоянии.

Линии САЙТ ы г И Б Р И Д И 3 А Ц И И Число

12 3 456789 1011121314151б17181920л£^\, ВАВСАСБВАСЕЛСОВВЕАВЕАСЕАБЕЛСАВВРЮЕСРВРАУАСС ВЕВ|оытии

2 1 аС ¡Ггс «1 ■ в в в в в ■вв

1и1 1 аС ! вв вв в в в в 7 8

в в ввв в в в 8

■ В > I вв в вв вв в в ■ ■ в ■ в в в в ввв в ввв в ■ в в в ВВВ' ввв вв в 7 5 6 8

^зс59и^ 1 в в в в в в в вв 6

■ в< в в в в в вв 4

я 1 в в в в в вв в в в в в в в ввв вв 5 5

в ■ в в в ■ в в в вв 5

2 + аС 1Г вс ш упц? ■ в ■ в в в в в в в в в в в в в в вв в в в в в В в В в Е : в в в в в в в в 5 6 5 4

2 + аС 1ГЗС ш Вт**1 в в в в в в ■ в . ■ в ' в в в в в в в в в в в вВ .В .В .В в ввв ввв ввв 5' 7 -3 3

/зс59" 1 ! в в в в. ! в в в в в в в в ввв ■вв 3 1 1

1 в в в 1 . в вв вв в вв в в ввв ввв 3 6

Для каждой мутантной линии анализировалось несколько особей.

I Черные квадраты указывают места локализации Сталкера. Двойные

блоки соответствуют районам, в которых расположены мутировавшие локусы (подчеркнуты). Для локусов у и ас (ЗАВ) этот факт не информативен, так как в этом районе в »ичии ш" уже есть Сталкер.

• следующий раздел). Отбор мутаций велся по модификации у2 или асВ1

фенотипа. В результате было получено 7 мутаций, влияющих на у-, и 4 мутации, влияющие на вс-фенотип. Можно было ожидать, что, по крайней мере, некоторые из тпгг возникли в генах, контролирующих экспрессию данных локусов.

Мутация в локусе, названном модификатор мдг4, тос1(тс1&4). вызывает усиление у^ фенотипа до полной депигментации и частичную супрессию ее01 фенотипа. Мутация тоб.(ш1^4)вообще влияет на разные аллели, индуцированные мдг4» из чего сделано предположения.

Локус и символ Генетич. локализ. Число мутаций Присутствие Сталкера Сайты гибридизации (мгэ)

enhancer of yellow 2 e( y)2 1-36.2 1 1(1) ' ЮС (St)

supressor of scute su(sc) 1-50.0 4 3(3) 13Е (St)

enhancer of yellow 1 е(У )1 1-57.9 2 2(2) 16В (St)

enhancer of yellow 3 e(y)3 1-62.2 1 1(1) 18CD (St)

modifier of mdg4 mod(mäg,4) 3-70.7 1 1(1) 93D (St)

pseucloscute рас 1-9-8j 12.5 1 . -

enhancer of yellow 6 e(y)6 1-37-2 3 — ЮР (P)

mlcrochaete тс 1-53.454-3 2 — —

enhancer of yellow 4 e(y)4 1-58.1 1 — 16B (P)

enhancer of yellow 5 e(y)5 1-59.2 3 17C (P)

В шишей части таблицы приведены мутации, полученные в следующем разделе.

Все мутации в локусе были нестабильны и сопровождались инверсиями. В связи с этим локализация гена определена неточно.

что этот ген контролирует транскрипции мдг4- Нутации в локусах энхансерах yellow, е(у)1. 2. 3. 45 и- б. усиливают фенотип у-мутаций, вызванных разными мобильными элементами. В то же время они не влияют на мутации в других локусах, индуцированных мдг4-Возможно, продукты этих генов участвуют в регуляции экспрессии гена yellow. Остальные две мутации (тс и psc) влияют на фенотип зс-аллелей.

Все мутации, полученные в системе продленной нестабильности, возникали одновременно с появлением Сталкера в соответствующем районе хромосом (табл. 3). что предполагает роль транспозиций Сталкера в их возникновении. Таким •образом. Сталкер можно использовать для клонирования найденных генов.

2. СИСТЕМА СУПЕР-НЕСТАБИЛЬНЫХ. МУТАЦИЙ.

Индукция гибридного дисгенеэа Р-М типа в линиях с продленной нестабильностью привела к возникновению многочисленных супернестабильных аллелей в разных локусах. Они дают мутационные переходы с частотой свыше 0,02 и характеризуются рядом необычных свойств. В частности, у производных аллелей выявляется исключительное многообразие фенотипов, а также у ряда из них происходят обратимые взаиыопереходы. Супер-нестабильность зависит от действия транспозазы Р элемента.

При гибридном дисгенезе Р-М типа (Ы. Kidwell), а также в природных популяциях (М.Д. Голубовский) V. melanogaater могут иногда возникать супер-нестабильные мутации, которые характеризуются чрезвычайно высокой частотой дальнейших мутационных изменений. Классический пример - мутация зпш, вызванная внедрением двух копий Р элемента (W- Engels). В присутствии белка транспозазы одна из копий Р элемента может вырезаться с частотой, достигающей .90%,

р |

давая в соотношении 1:1 мутацию зп или реверсию зп , в зависимости от того, какая копия вырезается. Возникновение супер-нестабильных аллелей - редкое событие. В данном разделе описан метод их воспроизводимого получения с высокой частотой при помощи индукции гибридного дисгенеза Р-М типа в системе с продленной нестабильностью.

Получение супер-нестабильных мутаций. Супер-нестабильные аллели

_ 2 D1 aG*

были получены в потомстве от скрещивания самок линии узе w

(сокр. vf**, где * означает, что данная линия обладала продленной

нестабильностью) или ее производных и самцов линии (сильная Р

линия). Схема скрещиваний приведена на рис. 4. Среди 36 полученных

нестабильных мутаций две в локусе singed были супер-нестабильными,

давая реверсии или мутационные изменения более, чем у 256 особей.

Четыре других, в локусах singed. wtiite. oceXXilезэ и новом локусе,

названном рзеиОо-Ьеайех (рзЬ), приобрели супер-нестабильность через

5-7 поколений.

На первом этапе наиболее детально среди них была изучена супер-нестабильная система в локусе осеЫИезз (ос), для которой проанализировано около 2.7x10 особей. В ходе этих наблюдений появилось много новых нестабильных аллелей в других локусах. 53 мутации (около _ 10%) • оказались супер-вестабильными. Они

Itt: Pi's F2: F3:

FO: F1: F2:

ИНДУКЦИЯ МУТАГЕНЕЗА

о uPx d1 я pa* j 5c.

<? ur^ X СГШ

* oG» cfw

tfvT'lx )

"*" oG*, . 5 ш (лг) x

ОТБОР МУТАЦИЙ (26.650 особей)

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ (Xй) НА НЕСТАБИЛЬНОСТЬ

х о* Лг(Р)

} ЙТО) х с/ЛПР)

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ

36 НЕСТАБИЛЬНЫХ МУТАЦИЙ

ап |ап|

П^Л lin

ос pbx

I I

[ос] Pbx

2B-IV 3-ап

5 ХХ/Т(Ы) х d* Х^/ПР)

5 ХХ/ПР) х о* Х^/УЧР)

5 ХХ/ТШ) хо'/яц)

£ ХХ/Г(Р) X d'X^/TiP)

272,400

0-6

0-1

|рас|-7* -4*

ctw

Рис. 4. Схеыа получения супер— нестабильных мутаций.

Жирным шрифтом обозначены супернестабильные аллели. В рамках мутации, обладающие характерными свойствами, описанными ниже. Цифры-число неза-

мутаций § данном локусе. Данная мутация изучена менее детально-(Р ^ (М)-цит^ипы .

ш" (О после с линией

линия ания

2 "

концентрировались в локусах yellow (6), white (29), singed (7), и двух новых Х-хроыосомных локусах, нйзванных на основании фенотипа мутаций pseudo-scute, рос. и cut-wing. ctw. Около половины этих мутаций имели ряд необычных свойств, которые описаны далее на примере ос-аллелей.

Свойства супер-нестабильных мутаций на примере мутаций в локусе

осеНИезз. Фенотип ос-мутации — отсутствие глазков, оцеллярных

щетинок и измененная форма головной капсулы. Исходная мутация ос появилась в третьем поколении после индукции дисгенеза. Затем в линии осР появилось несколько аллелей типа осшх^а. Потомство одного из таких мутантов обрело свойство супер-нестабильности, даввя с

ОС ОС" ОС

Смещенные

парные i 7 о.2 6.8 о.оео.з аллели

ос™" ос""""» ОСw

S4 Стабилизированные аллели

ос**

I»

jl.O |о.1_|о.2 . |

ОСР_.ос""*"" ocmod»S ocmo<iM3 ослюЧл4

Парные hVl0!/!1^0-7 аллели L^e j/ze I |

ОС

•bit

ОС

вЪ21

ОС 'b3t_ . oceb41

ОС

Смещенные ц парные аг i.i а,«леди II

ОС*

|о2 Jo.o

nrtw яя"

ОС" ОС'

STABILIZED ALLELES . „ „„

ОС—

иптпднпй судер-нестаби пьноа

Рис. 5. Мутационные переходы ос-системе.

Цифры обозначают частоту мутационных изменений (х10~2); указаны □арные, смещенные парные н стабилизированные аллели.

высокой частотой производные типа ос'

аЬ

Так возникла первая

супер-нестабильная осио<ЗаТ линия, давшая затем мнохество супер-нестабильных производных (рис. 5).

Анализ исходной супер-нестабильной линии выявил ряд характерных свойств, общих для разных супер-нестабильных аллелей. Во-первых, среди ее производных получено огромное разнообразие фенотипов, их полный спектр от дикого типа до полной инактивации гена (рис. 5, 6). Среди лих (по возрастание мутантного фенотипа):

Б1Г «» 1

ос (дикий тип), ос , ос , ос (увеличение угла между оцеллярньши щетинками), осшо<*а, осто<1*> (потеря одной или двух оцедлярных щетинок), ос®8, (потеря глазков). осюЬ, ос8®. освЬ, ос03, (прогрессирующие изменения Форш головной капсулы) и осеЬ (то же, что и ос , но без каких-либо вариаций фенотипа у разных особей). Большинство аллелей можно обнаружить среди супер-нестабильных '

(табл. 4). Это не ' характерно для супер-нестабильных аллелей, возникающих в чистом Р—11 дисгенезе, где число мутационных изменений, как правило, ограничено.

Во-вторых, интересно, что линии, имеющие один и тот же фенотип могут существенно различаться по характеру мутагенеза, его частоте

« moda-221 — вЬ-22 mb-222— w

еа-23 —- w-231 -

■1-21

■ mb-221 %

-modb-231 1

aa-111 1-111 moda-111 aa-12

ab-321 aa-321

►moda

* L^t

en213(1r2) /

• w-311

ma-32 moda-31 ea-3/ aw-3 I —modb-33 w

w-321 ma-311 í t

в локусе осе!Шезз: производные

Рис. б. Супер-нестабильность подсистемы.

Приведены только индексы мутаций (фенотип и номер), характеризующие данную ос-мутацив. О - исходная система (см. рис. 5); 1-5 производные суб-системы: символы в рамках - " исходные мутации для данной суб-системы; жирный шрифт - аллели с частотой мутационных изменений выше 0,1; полыми буквами обозначены аллели с частотой переходов выше 0,01; индексы, без цифр - аллели, изученные менее детально. Двойными стрелками обозначены парные аллели. Частоты мутационных изменений некоторых аллелей даны в табл. 4-

и специфичности изменений. Поэтому каждую мутацию следует описывать

по этим двум параметрам. Примеры можно найти в табл. 4-

Третьим важным свойством системы является обратнмсть

■ зЬ

мутационных, переходов. Так например, .мутация ос , полученная • в исходной системе, далее может переходить обратно в осто(^а аллель, по всем свойствам не отличимый от исходного ост<х3а аллеля (рис. 5)-Такие аллели названы "парными аллелями".

Табл. 4. Мутационные изменения в некоторых ос-линиях.

Линия, Число Мутационные изменения к данному Частота

индекс и иссле- ос-фенотипу и частота мут.из-

происх.(в дован. соответствующего мутационного менений

скобках) хром. перехода (х10 3). (Х10^)

+ moda modb sa eb ea

11 (еа) 3390 1 6 - 0.6 - 1,6 0.4

22 (зЬ) 1764 7 0.5 - 4 - 1.2

w + 1 modb mb sa sb

231 (еа) 855 56 - 4 2 6.2

311 (та) 792 - 4 - 13 1.7

321 (та) 727 - - 17 1 14 3.2

42 (mb) 507 - - 12 20 3.2

1 + sw moda та mb еа ab еа eb

211 (за) 1087 - 58 _ _ - 10 6.8

421 (ЗЬ) 1940 - 15 — — - - 18 7.5 5 4.6

431 (mb) 1604 2 3 1.5 16 - 2.2

moda BW w та mb ea sb ea

31 (sw) 509 170 7 17 9 - - - 20,3

431 (1) 952 - — — - 26 - 2.6

52 (зш) 1531 75 - — 8 - 27 2 11,3

roodb BW v mb sb

231 (ш) 278 32 84 44 32 19,2

33 (зш) 521 - 55 - - 5.5

па sw w 1 moda sa

12 (еа) 1323 3 22 - 7 21 5.3

311 (moda 952 150 59 3-10 22,2

юЪ + BW w 1 moda sb

221 (тоОа 605 65 — 157 3 - 22,5

43 (w.l) 1680 - 22 - 258 28,0

531 (1) 444 - — 340 10 35,0

еа + w moda та

12 (та) 1223 _ 64 31 9.5

311 (ш) 1060 18 2S0 — — 26,8

321 (т) 305 50 - 290 34,0

Sb + w 1 moda mb

22 (вш) 1225 320 - 4 13 33,Т

321 (ш) 489 — 92 — - 9.2

421 (тй) 761 — 32 tffl - 14,0

еа + w 1 та mb ea

1 (това 559 120 _ — 20 - 14 15,4

523 (moda 595 - 240 96 • - 29 - 36,5

eb 8 лин. 1293 Мутационных изменения нет <0.08

Обычно только одна производная ос-мутация дает парные аллели с исходной. Остальные переходы необратимы. Однако, для новых производных существуют свои обратимые переходы, которые названы "смещенными парными аллелями" относительно исходной пары. Почти все супер-нестабильные ос-мутации образуют парные аллели и имеют многие смещенные парные аллели. Наконец, практически все супернестабильные мутации в системе дают также более или "менее стабильные производные -"стабилизированные аллели" (табл. 4, рис. 5, 6).

Супер-нестабильные мутации в локусе чЛИе. Весьма сходными

свойствами обладает и супер-нестабильная система, полученная в локусе иЛ^е (рис. 7). Супер-нестабильные аллели в локусе имеют те же характерные особенности, что и супер—нестабильные ос мутации. Среди них выявляются все возможные «/-фенотипы. Практически в каждом случае можно выявить обратимые изменения - парные аллели и смещенные парные аллели, равно как и стабилизированные производные.

Роль Р элемента в поддержании супер-нестабильности. Описанные выше опыты, в которых проводились скрещивания с ХХ/У(Н) или 1Х/Т{Р) самками, показали важность гибридного Р-Н дисгенеза для поддержания супер-нестабильности. Для подтверждения атого вывода были проведены опыты по конструированию с помощью двойной рекомбинации X—хромосом,

ар11 доО

содержащих один из ш-аллелей (ш или ш ) в комбинации с

мутацией зпш. Полученные -пинии не содержали автономных копий Р элемента. Мутация зпШ вызвана инсерцией двух дефектных копий Р элемента, что делает ее гипермутабильной (см. выше).

В этих линиях ни ш- ни зп-мутации не изменяются. Однако, после скрещивания с самцами линии я,, или РГгу+Д2-3](99В) в обоих локусах возникает высокий уровень мутагенеза. Интересно, что хотя частота ш-мутаций в этих опытах варьировала, спектр мутагенеза оставался неизменным, т.е. специфичность мутационных изменений зависит от собственной структуры мутантного локуса. Аналогичные результаты были получены в опытах с супер-нестабильными ос- и у-мутациями.

Следовательно, активная транспозаза Р элемента необходима дом поддержания супер-нестабильности. При этом выяснилась еще одна важная особенность мутагенеза в нашей системе. Как известно, Р элемент в линии Р[гу+Д2-33(99В) лишен нитрона и поэтому активная транспозаза образуется как в зародышевых, тек и в соматических клетках. Действительно, изменения зп-ыутацнй часто носили мозаичный

Рис. Т. Супер-нестабильные мутации в лсжусе иЛ11е.

Числа - частота мутационных изменений (х10~2); числа в скобках -общая частота мутационных изменений в данной линии. Линии с частотой выше 5x10'2 обозначены жирным шрифтом; с частотой изменений выше 1x10"2 полыми буквами. Жирные стрелки - события, происходящие с частотой >5x10" , промежуточные - >0.5x10" . Значение символов и - белые глаза, ру - бледно желтые, 1у - светло желтые, у - желтые, ра - бледно абрикосовые, а - абрикосовые, ай -абрикосовые ровертант, + - глаза с нормальной окраской.

характер. Напротив, в супер-нестабильных аллелях мозаики отсутствовали. Следовательно, изменения в локусе уеНош происходили только в зародышевых клетках, и, иными славами, для них присутствие активной транспоэазы необходимо, но недостаточно.

Как отмечалось выше, полученные нами . супер-нестабильные мутации отличаются по ряду свойств от обычных и гидар-мутаби.тгьиыт аллелей, получаемых обычно при Р-Ц дисгенезе. Они больше напоминают случаи спонтанно возникавшей супер-нестабильности, описанные Голубовским и сотр. Природа последних, однако, остается неясной.

Наша система позволяет получать такие мутации воспроизводимо и с высокой частотой. что составляет более 10% всех мутаций

после активирующих скрещиваний. Молекулярная природа их описана в следующем разделе.

3. СУПЕР-НЕСТАБИЛЬНОСТЬ В ЛОКУСЕ УЕШЛГ

Супер-нестабильные мутации, полученные в локусе yellow характеризовались особым многообразием фенотипов и большим числом взаимных пререходов. Показано, что супер-нестабильные мутации вызваны внедрением химерного мобильного элемента, содержащего на концах две идентичные дефектные копии Р элемента, ориентированные в одном или противоположных направлениях. Между ними находится последовательность I, состоящая из уникальных (в основном) и повторяющихся фрагментов генома, которые могут происходить из одного или даже разных участков X хромосомы. Мутационные изменения в супер-иествбильных аллелях происходят за счет делеций в X и Р элементах и инверсий, в основе которых лежит рекомбинация. Мутации, при которых сохраняется супер-нестабильность, как правило, связаны с изменениями во внутренних районах инсерции, ее цис-регуляторных элементах.

Исследование супер-нестабильных мутаций в локусэ yellow проводилось как на генетическом, так и• на молекулярном уровне. Молекулярный анализ показал участие в супер-нестабильности особого типа химерных элементов, состоящих из геномных последовательностей ■ окруженных одинаковыми дефектными копиями Р элемента. Ранее были описаны две мутации, вызванные инсерцией Р элемента и * прилежащей уникальной последовательности (Tsubota and Bang-Vu, 1992; Heslip et al., 1992). Они существенно отличаются от описанных в нвшей работе.

Получение супер-нестабильных мутаций в локусе yellow; Супер-

нестабильная система в локусе yellow была получена на фоне супернестабильных мутаций в локусе ocellilesз. В последней происходило распространение супер-нестабильности на новые локусы- В частности, появилось б независимых супер-нестабильных аллелей в локусе yellow. Один из них, названный у^33, и его производные были детально изучены. Оказалось, что в основном для этой системы характерны те же самые свойства, что для ос системы, но при этом имеется ряд особенностей.

Табл. 5. Классификация основнх аллелей, выявленных в супер-нестабильноа системе в локусе yellow.

Пигментация щетинок -

грудные брюшные символ

Ь+ 2(3) + + - (0-2)+ + - 5+ 4+ 5+ (2-3)+ + - р п ъ V 1

1(2) + 3+ w0

- - ш

_____Пя™опта1}ия_толо_и крыльев_____

6+ +D 5+ 4+ *т 3+ 2+ 1+__ 2 0__ Г

+г d

,,+Сз ♦та , da

У У У у У У —

у .Dps Vtpa у+яр5 у^рз .vdp3 -

y+Dna У+пз +ипз у у+1яз у0ПЗ Z713 -

- У+ьз У+тЬз у+1Ьа ydb3 -

,,2уз ,,/уз

— . — — У У

.1з

Пигментация крыльев сильнее, чем тела

У+шЬэ y+mwbSy+lwba

Пигментированы только крылья

У+шз у+тшз у+1шз _ _

Значение символов: DM-dark, m-middle, Z-light. 2-mutation of {/^ type, i-nutation of у type, p-pale, п-notum, b-body, v-variable, uib-winga>body, ш-wings. 5+ - интенсивность пигментации аллеля дикого типа, О -нулевого мутанта. В каждом индексе мутации 1-2 первые буквы характеризуют пигментацию щетинок, следующие (если есть)-пигментацию тела и крыльев; последняя буква з-принадлежность к супер-нестабильной системе.

Вариабельность yellow аллелей. Прежде всего, вариабильность

фенотипов здесь особенно высока. Даже при учете лишь основных признаков (пигментация тела, крыльев и разных типов -щетинок) выявлется 32 различных фенотипа (табл. 5), а если учитывать пигментацию других отделов (например, основания антен, арист, полового гребешка и др.), то число различна! фенотипичоских комбинаций возрастает до 100 и выше. Можно наблюдать как полное подавление функции гена в определенных зонах кутикулы, так и его супер-экспрессию.

Особенности мутационных перегодов в локусе уеНав. Другая

особенность системы состоят в существовании "подсистем", каждая из которых содержит группу из двух-пяти "основных" аллелей, между которыми происходят взаимные превращения (рис. 8). Такие группы основных аллелей подсистем являются еквивалентоы парных аллелей. Основные аллели дают и необратимые мутационные изменения. Среди них много стабилизированных производных. Типичный представитель

Рис. а. Супер-нестабильная сястеыа в локусе yelT.au>.

Приведены иутационные переходы в трех детально изученных подсистемах. Нутационные переходы в подсистеме^ обозначены стрелками: толстыми, если частота перехода выше 5x10" ; средними -от 0-5И0"3 до 5x10" ; тонкими - менее 0-5x10" . Числа рядои со стрелкой - частота данного нутационного изиенения. В рамках -основные аллели подсистем. В скобках — частота всех мутационных изменений для данного аллеля (х10 ). 1, 2, 3 - ноиера суб-систеи.

стабилизированных аллелей-1/'3 аллель, или полная инактивация локуса yellow.

Кроме того, встречаются и необратимые супер-нестабильные мутации, не дающие возврата к основным аллелям данной подсистемы. Некоторые из них далее становятся исходными для образования новых подсистем. Так, мутационное изменение в y^s—>у<^3 в подсистеме 1 привело к образованию подсистемы 2, а аллель подсистемы 1 стал

родоначальником подсистемы 3 (рис. 8). Взаимопереходы от одной системы к другой происходят с частотой около Было получено

много других подсистем, во они детально не исследовались.

Общие данные по структуре инсерций в локусе yellow. Были проведены опыты по блот гибридизации геноыной ДНК из 25 разных супернестабильных линий с пробами, содержащими фрагменты гена yellow. Оказалось, что все исследованные мутации содержат инсерцию игв мдг4 на расстоянии 700 пн от начала транскрипции гена yellow подобно исходной мутации у^. Далее проводился анализ всех других областей гена yellow на присутствие дополнительных вставок. Единственное изменение карты было обнаружено в районе, локализованном между точкой инсерции мдг4 и началом транскрипции гена yellow. Вставка происходила в рестриктный фрагмент fftndlll- BamSL (рис. 9), который далее и использовали как пробу.

Размер инсерции следует из опытов, проведенных с другими рестрикхныыи эндонукле а з ами. Наибольшие размеры получены после рестрикции ffprcl и ВатНХ. Согласно этим данный, размер инсерции колеблется в пределах от 1,2 тпн (два аллеля у23) до более, чем 20 тпн, в случав мутации у+а3 (рис. 9). При обработке другими вндопуклеазами выяснилось, что концы вставки сходны у разных аллелей. Все они содержат сайты рестрикции для Blnaill я Xhol рестриктаз. Выявляется два типа вставок, различающихся по размеру одного из концевых рестриктных фрагментов (рис. 9), причем один из типов (I) преобладает над другим (XX).

Для дальнейшего анализа было отобрано по одному аллелю со вставкой X и XX типа: у+пз (X тип), содержащий вставку максимального размера (21 тпн), и у*В, первый по времени появления аллель XX типа со вставкой размером 3,3 тпн. Оба по фенотипу близки к дикому типу, что указывает на восстановление экспрессии yellow. Действительно, при проведении Northern блот гибридизации с РНК, полученной из куколок, размер и интенсивность транскрипта yellow были одинаковы для линий Oregon. у+ПЗ и у*3 (рис. 10).

Р2? Н\У+пя

ГЕНОМНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

1 kb

gypsy (mdg4)

su(Hw) b. s.

Рис. 9. Рестриктная карта и общая структура локуса уеХХот и краев вставок, вызывавших супер-нестабильные мутации.

Полосы со стрелками - копии дефектного Р элемента и их направление. Более толстые отрезки стрелки» указывающей направление транскрипции -экзоны уеХХош, более тонкий - интрон- Еа — энхансеры крыльев (w), тела (Ь) и щетинок (br); su(Hw) b.s. - область связывания белка su(Hw). В мдг4 стрелки указывают ДКП и их направление. Сайты рестрикции: B-BamHI. G-BgIII. H-HindllX. K-Kpnl. P-Pstl. R-EcoRI. X-XhoJ.

: -

<1.6 kb

Рис. lO. Блот гибридизация "Northern" меченой пробы гена уеХХош с поли(А)+ РНК, наделенной на стадии куколки из линий у+3 (1.) , у+пз (2) и Oregon (3).

Меченая проба гена уеХХош гибридизуется с 1.9 тпн РНК, характерной для гена уеХХош. Как контроль использовали пробу гена газ2, которая гибридизуется с 1,6 тпн РНК.

"t'TXS "¿TtS

Структура у вставки. Мухи линии у имеют нормальную

пигментацию тела и крыльев и желтые щетинки на груди и ногах. Из ДНК поело недорестрикцни SonlIIa получена библиотека в фаге X-DASH. С помощью HlndlXI-Bantftt пробы отобрано пять перекрывающихся клонов, захватывающих оба конца вставки. Была построена рестриктная карта вставки (рис. 11).

Ввиду больших размеров вставки мы ограничились секвенированием ее концевых участков (рис. 11А). Видно, что встраивание инсерции произошло за 69 пн перед сайтом кэпироваяия локуса yellow, причем оно сопровождалось делецией участка локуса длиной 78 пн, от -146 до -70 пн. По краям инсерции нет какой-либо дупликации хозяйских последовательностей. Инсерция начинается (если идти по направлению транскрипции гена yellow) о дефектной копии Р влемеита. Вначале идет 3*-конец Р элемента, содержащий 347 3'-концевых нуклеотидов. Далее последовательность Р элемента прерывается вставкой чужого декануклеотида (TAGCTACAAA) и завершается 830 5'-концевыми нуклеотидами Р элемента. Таким образом, начало вставки представлено ориентированной в противоположном по отношению к локусу yellow направлении дефектной копии Р элемента длиной 1187 пн.

На другом конце вставки расположена другая дефектная копия Р элемента, имеющая точно такую же структуру и такую же ориентацию, как первая. Эти две копии далее обозначаются как Р1 (дистальный по отношению к промотору yellow) и Р2 (проксимальный) элементы. Оба Р элемента не окружены дупликациями мишени.

Между дефектными копиями Р элемента располагается протяженная, длиной около 20 тин последовательность (рис. 11В), принадлежащая геномной ДНК, как следует из опытов по гибридизации ее фрагментов с рестриктировэнной геномной ДНК (рве. 12). Она была обозначена как элемент X. Как видно из рис. 12, концевые фрагменты вставки (1 и 4) гибридизуются с серией полос ДНК, причем ДНК из разных линий имеет сходный, но не идентичный набор полос. Остальные фрагменты инсерта гибридизуются либо только с одной, либо с двумя полосами ДНК дикого типа. При этом, расположение полос одинаково дня разных линий.

Чтобы определить, откуда произошли эти фрагменты, проводили in situ гибридизацию с полигонными хромосомами. Оказалось, что в тех случаях, когда фрагмент дает одну полосу при блот гибридизации, он связывается с одним участком X ' хромосомы. Если' при блот гибридизации выявляется две полосы, то такой фрагмент клонированной ДНК соответствует двум различным участкам X хромосомы. Так, SacI проба (а), гибридизупцаяся с двумя полосами, связывается с

1 Jtb

HP 1 Р PR р PHXKQ С SPR QBC PK P R H

J ,lll, I, l,H J I, I,II II 4J I I,

P? ' 1 I *3 I Is I <7 ' a 'o I

3 ' „ . ■ S PS S PR PXCPSQQ QRHPQH 2 RCH 4 R

11 ,1 ,1 .11, ILJJJULLJI Ml, 11,1-lg.

' ' 11 ' ' 13 ' • 15 1 1 17 ' ' 19 kb

' ' X .......................

Pec. 11. Структура встестся y+na. i

A. Структура концов вставил у*па. Приведены последовательности на границах ыюяду Р элементе»* н локусогд yellow я центральной частью вставки (X). Числа показывает ноггора зуклеотндов Р элемента» по которые .проягасгала внутренняя далецяя а встроился декануклеотид..

B. Структура центральной части вставка. В-БсглЯХ, C-Sacl, G-BgiXI, H-fflndXII. К-гГрп1. P-Pstl. R-ECOHI, S-SaII. Х-Яш1. 1, 2, 3 и A - рестргастнна фрагменты, использованные дня анализа концевых участков X; а н Ъ - рестрзкпше фрагменты, использованные для анализа центральной части X я гибрядлзации in aitu.

.4.3

-4J

-9.4 -6.6

-2.3 -2.0

<0.9

-2-3 -2.0

<1.5

<1.0 I

■ -4 J

-23 -2.0

I <1.0

1 2 3 4 5

9 10 11

Рис. 12. Блот гибридизация геномное ДНК с фрагментами вставки у

к. Выявление повторяющейся последовательности.

прилегающей

к Р1.

Гибридизация проводилась с ДНК -»ини» у' (1), Canton S (2), Oregon. (3), У*" (4) и у*"' (5), обработанными эндонуклеазами PstX и Sacl. Пробой слухил P3tl фрагмент 1 (см. рис. 11).

В. Выявление повторяющейся последовательности, прилегающей к Р2. Гибридизация проводилась с ДНК линий у ( 1, 5, 9 ), Oregon (2, 6, 10)у*' (3, 7, 11), У+п* (4) и Canton S (5), обработанными эндонуклеазами PstI и Sacl. Один и тот же фильтр последовательно гибридизовали с пробами 2, ffindilll-EcoRI, (1-3), 3, EcoKI-SacI, (4-8) и 4, SacI-EcoRI. (9-11). отмеченными на рис. 11.

<1А

В=

кЛ«»'-

л л 11F11A

+ns

Рис. 13.- Гибридизация in situ .фрагментов вставки у хромосомами линии Oregon.

Гибридизацию проводили с фрагментами а (А) и Ъ

показаны на рис. 11. Стрелки указывают места гибридизации.

с политенными

(В), которые

областями хромосом 1А и 11Р. Проба Sacl (Ъ), тоже дающая две полосы, связывается с областями 11Р и 11А (рис. 13)-

Таким образом, инсерт в у+пв аллеле состоит, по крайней мере, из трех фрагментов геномной ДНК из разных участков X хромосомы: 1А, 11F и 11Л. Иными словами, вставка является химерным мобильным элементом нового типа, содержащим по краям идентичные и однонаправленные копии дефектного Р элемента и внутри протяженный блок хозяйских последовательностей из разных участков генома.

Структура у*3 вставки. Далее было осуществлено клонирование вставки из у+3 аллеля. Последний имеет дикий фенотип. Влот гибридизация выявляет вставку размером 5.4 тпн в том же районе, что и в предыдущем случае. Поэтому для ее клонирования использована та же проба. На рис. 14 приведена карта, полученная на основании анализа клонов и проверенная с помощью блот гибридизации с геномной ДНК. Вся вставка была просеквенирована.

Как видно из рис. 14. вставка находится строго в том же месте, что и в у+па, и сопровождается той же делецией в локусе yellow. Она также содержит на концах две дефектные копии Р элемента. Р1 копия точно совпадает по последовательности и ориентации с Р1 в у Однако Р2 имеет ориентацию противоположную Р1. Нуклеотидная последовательность Р2 совпадает с таковой для Р1. за исключением того, что в Р2 отсутствуют четыре 5* концевых нуклеотида. Поскольку у'3 аллель произошел из мутации, относящейся к семейству у+ПЗ, то следовательно, при этом должны были произойти изменение ориентации Р2 элемента и деления четырех пн, но без утраты самого Р2-

Центрадьная часть вставки у*3 оказалось отличной от таковой в у+аз, что следует из полного отсутствия гибридизации между ними. Итак, третьим событием является полная замена элемента X на новую, тоже геномную последовательность. В ней Вtndlll-EcoRI фрагмент, прилегающий к Р1. содержит повторяющуюся последовательность, отличную от той. которая обнаружена в у+п3 • Рядом с Р2 повторов не выявлено.

Новая уникальная последовательность захвачена из области 1А X

хромосомы. ДНК линии у~ас, содержащая делеци», которая захватывает

более, чем 5 тпн, в да стальном направлении от локуса yellow, не

дает гибридизации с центральными фрагментами вставки, в отличие' от

d314

линии Oregon ВС. С другой стороны, ДНК из линии у с делецией,

которая распространяется лишь на 3 тпн от локуса yellow. гибридизуется нормально. Следовательно, сложная вставка у

заменилась на фрагмент ДНК, расположенный в геноме на расстоянии в несколько тпн от места вставки. Далеция этого сегмента - генома в линии у~ас не влият на жизнеспособность мух.

Анализ нуклаотидной последовательности открывает в составе вставки короткую открытую рамку считывания. Перед ней ' находится типичный ТАТА-бокс, верятно, выполняющий функцию промотора (см. рис. 15). За нею находится характерный сайт полиаденилирования, ДАТААА. При Northern блот гибридизации соответствующая проба активно гибридизуется с транскриптом размером около 300 н. дайной. Эта поли(А)+ РНК выявляется на стадии куколки, когда происходит экспрессия и гена yell ош. Как ухе отмечалось, продукт этого транскрипта не является жизненно важным.

Природа мутационных переходов в линиях у+пз и у*в.

Далее был

проведен анализ нескольких производных аллелей, возникающих - при

___ +тиз

индукции мутагенеза в линии у после скрещивания с продуцентом

транспозазы Р[гу+Д2-3](99В). Наиболее часто появляются аллели с

ослабленной пигментацией тела и крыльев, у+ЕШЗ и у+гюз. они

относились к классу стабилизированных аллелей. Блот гибридизация с

геномной ДИК указывает на то. что изменения затрагивают только

область Р2. Чтобы установить точную природу изменений, проводили

ПЦР клонирование с помощью соответствующих олигопуклаотгидов и

последующим секвенированием. Видно, что в проанализированных трех

-/-дода +1лвз

у и одном у аллелях происходят внутренние долации Р2 с

сохранением на концах по 13—16 пн и иногда с появлением внутри

коротких дополнительных последовательностей (рис. 16).

Н R Н Р HR

I I I I

МРШС

Р2

Р1 а

CATGATG....CATCATGlGTrCATCATTTT...

...TTTTGGAGGl (-4)ATGTTAT....CATCATG

yellow

cattggcc..

Рис. 14. Карта вставки у

Обозначение сайтов рестрикции - как в рис. 12. Толстые фрагменты, использованные как пробы при блогг гибридизации. ■ Стрелка указывает положение транскрипта. Приведены нуклеотидные последовательности на границах Р элементов с X и с уеНош.

р1 «1спшль (5* —«пс1) СТТСАТСАТТ ТТСССАТТТС АССГГТСЛССТ АССАСССЛАА

ТССАААСТСА СТССТССССС ААСАТСССАА (1АТААААТАА АТТТССАСАС СТСТТСАААА АААААААААС ттсатсхггас гсссасааса тсстсссах: лсатстстос ОТСТОТСТСТ ОССТСЮССТ СГГСТСТОТТС СТТСаСССТА ТАТААТСАСС СТААССАСТа СТТТААСААС ТСАААССССА АТТСАААСТТ ОААСАССАСА АССССТАААА АССА.ССАОАА АСТССАТТТТ САААТАТАТА ТТТТТТТАСА ТТТГГТТТТА ТАССТТТТ(5А АААЛТСТТСа АССТТТТТТА ССААТТСТТТ ОСАТТСАСАТ ААТСАССАТТ ТССССАТТСС АТТААТТСАТ АТАСЛТААТТ ССССАААААА САААТАААТС САААСААССА АААТАЭТТСТ ААСАААССТА АЛАТАЛААСТ ОЛААЛСТСЛА АСТССААСТС йЛАААЛАТСТ ССАААСТААА СААСАССААС ТААТ/СААСААТААСААСААС ааастатссс СССССТТААА ААСАС(ЗСААА АТАСАААСТЙ САТТТСААТА АААСААААТТ СААТТТССТС АТТАААТТТТ ТТССССТТТТ ТТТаТЛСОАС АТСАТТТАСТ ТТАТТТТТТТ ТТИТСТТЮ СТАОААССТТ С5ААСЗСАСССА СТТйЛСТТТС ААААЯТСТСА ТТААААТСТА ТОАЛААЛТСЙ САСГТАСССА ААААСТТССА вТАССАОСАТ ТОААСТСОСС ТАСОАЛСААС ААЯААСАЛСА АТСАСАТСТС ААААЮСТТС ТСААССГТСТА АСТАСАССАА ААТТАААААА ТАТТАСАААТ ТИСаХКАА ТСССАЙАААА АСАААСТААС САСССААССТ СААСТТААСО АТСТСТАС«; СТТТТААТТО вТАЛСАТСТС АТТТСАТАТТ ТТАТТА£ГГ<ЗС СГТСССАПТСС ААСАйлТТТС СТТАТШТХ ТТлТАТАСт» СйлТлЭОСЛС ТАЗТТСАААА ТАТТТТСТТА 7ЛСТАТ7ЛЛЛ ТТС1АТТТАСТ ТСТТСТСОСТ ТААААТАТАГ ТТТТТАТТСА ААСТТАТАСТ ГГГТААТСГТТ ТААССТААТО ОТТАААСТАА АААТТТССТС ТОСАСОЗАСС ТССТААССТТ ССТТТАЛАТА ТАСТТТТТТА ТССААЛАДАТ ССАССОЗССа АйеттАССаА ТСТСТСТГГС АААААЖССТ ТТТТ<ЗСАТАС АСАТССАСАС АБААСТСТСТ

МоЬА1аЬузС1пАгдАгдАгдЬвиУа13вг11вА1аТЬгУа13вгА1аАзр1Хв5вгУа1РЬвТуг бААЛТ ЛТСССААААСААССААОАСОССТАСТТТСТАТТССААСАПТААПТССССАТАТАТСАСТТТТТТАТ АзпСузЬвиПвТЬгА1а5вгХлиУа1ЬвиС1иАзрУа1АзпА1аАгдАгдЗвгЬвиЬузН1эС1и11в аастстсттаттассссттсастссттстссаасасотсаатссссссссаассттаааасасоааатс Агд11вРгоС1и5вгС1иАХаСХиА1аЬуз5вгТЬгС1уАгдН1зТуг11еЗвгРЬвРгоУа1РЬвС1у ССААТТССТаААТСССААССТаЛАССТААААССАССССТАСАСАСТАТАТТТССТТТССССТТТТТОСС

С1пМаЬАэпАгдС1п11в11а11вС1п11аА1аСузН1зТЬгАгд---

САААТОААТССТСААЛТТАТААТАСАААТТОСАТОССЛСАСССССТААААС СТААССАААА ААХААЛ1САА САССАСТССС ТТТТТАССОА ТТТСГГААТ<ЗС ТСАТССАСТТ ОСАСАСТСАЙ АСАААААССА ТСаГГТСАТА ТТаЗОАСТОТ АСААССААСА АОХАТТГвТ СТАТААААТА ААТТАТТАСА СТАССТТСГГА АТААТААПАС СТАЛТСААСТ ТТАТТТТААТ ААСАТТААТТ ТТТАТАТТАТ ТАТССААСАА ТАТАТАССТА САТАТТГАГТ АИТАААТТС ТТАТТАСТАА АТТТАТТАТГ АТТТАТТАТТ АГГАААГТСТ ЛТТССТОСАТ ТАААСТААТТ ТТАСАТТСГГС ТСССАЕАПТТ (ЗТССТАСАСА АТСТСТААЕА СТТСТТААСА ССТТАТССТТ ТАСССАТТТА ТТСААСАТАА ТААССААСАС (ЗААСТТАСАА ААСПТСТСТ ТТССТТаГГА ССТАСЛАССА АССАСААААТ АТТАССТАТГ ТТТСА)ЗАТТГ ТТТТТТТТГГ ТТТСАААТСЗА АТААТАТСТТ САССТСАТТС атаасстсса ССААСССТСТ ТСТСТСАСОЗ ААСААССТТА САСССССТСТ (зсосаасаат астасалс(за АПТвССТАТА аттатаастт ТТСТТОАСТС АСАСЗАСТТАТ «ЗСТТТТССС таттсггсас стстст«:тт тт&зазстст тссааттааа СТААСТТСАА СГТСТСТАСС ттт(ЗСАЕААА «ЗТетТ(ЗССА сстсассттс стсаттстта сттссттстт таггтатссс СТАСТССССА ааасттсттт оасаастоал СвССАОСАОС САОАСТТОСЛ САСААТТСАА ААТСТТАААА (ПТАТССГСА АСАССОСТСТ СТТСССАТАС АСАСАААААА ААТААТСССа СТСА01ЛААА ААААААТСОА ТАТЛСТТГТС САТТАТАААА ОЗАТТСССТС ОЗАТТАСПТ АААТТТЛСГГ СКАГГГАТАА САТТСТСТТТ ТТААТСТСТА АТ7ТТАСТАТ СТАССТАСАА ССГЛСТССЛС АСЛТСАТТТТ ТСТТТААПТА <3(5АТТАСТТТ СССТОХТАа АЛАСТСАЛАА АСТТААСТСТ (ХЗССЛАТТТС ААТСТССТТТ ТАТСТСХГГГТ ТСЛАТСАААА ТОЗТТТААТА ССТТТТСТАС ТСвААЛСССа СТТСОССАТТ ССТСССТСТА СТТТССТСАТ ССТТТТТСОА сслттттсса СТТАГЗСТТСА СТАТСССТТТ САТТССАТТв сатсссссат ттааасассс саастаттса ТСССССТССТГ (КТАТАТАСС саасоатсса СССТТТЛТТТ (ХССХСТАСО СЛТСАТОССС ААТТСАСТТГ ОССТСССТАА АТАААТТСТС АДАСвССССС АЮЛСАКАТТ смАаАТЕАСА сдссАААТсс ААйАТТтссл сставаэста ТАМОСТаЛС ТТАССААСТТ ААССТабСАА сссстсатас СТСАСАСССА ТСАСАДАССА (загасала«: СТСААСАСАА ТАТСАСТ1АС ТААСС1АТТТТ АТТТАААГТС ААААТАГАТА ТТСТТААТТТ ААТААТТТСТ ТСССТТТТАТ ААГГГГСОМ СААДТААСАТ ААССТССГТСС в Р2 в1емя»Ъ (З'-вх!)

Рис. 15. Нуклеотидная последовательность внутренней части встанет в аллеЛе у*3 а авянокисвотная последовательность ве^юятко кодируемого ею белка.

Жирный шрифтом выделены предположительные ТАТА-бокс и сигналы полиаденилирования, а также чикросатадлит (ТС)_ рядом с Р1.

Рве. 16. Молекулярный янплгге» производных у+пз аллеля.

Ресхриктная карта части вставки (ср.. с рис. 14), в.- которой происходят изменения при мутационных переходах. Толстые линии -пробы, использованные при блот гибридизации. Сверху - делеции Р2; приведены определенные с помощью ПЦР анализа остаточные последовательности Р2- Тонкие линии внизу - делеции ' в центральной зоне вставки. ' Стрелки показывают положение и направление олигонуклеотидов для ПЦР.

Далее исследовали природу пяти независимых производных у^3

аллелей, по фенотипу схожих с желтые тело и крылья и нормальная

окраска щетинок. Эти аллели сохраняли высокую нестабильность. По

данным блот гибридизации все пять имели делецию во второй половине

центральной части вставки, в то время как Р элементы оставались

нетронутыми. У трех делеция иывлп размер 6,2 тин, а у двух других -

5 тли. По одному .производному из каждой группы было' взято на ПЦР

клонирование и сиквешарование. Оказалось, что 3' концы делеций

совпадает, а различаются они по 5* концам, которые отстоят друг от

друга на 1,2 тпн (рис. 16).

Далее тем же способом проводился анализ производных у*3 +1з

аплеля. Были получены две у мутации со сниженной пигментацией.

Блот гибридизация и ПЦР клонирование с сиквенироважием показали,

что в этих случаях происходила инверсия центральной части вставки и

почти полная делеция ?2 (рис. 17)- Был также праведен анализ двух

11 +з 12

производных аллелей, у и у , которые оказались связаны с инверсией внутренней части инсерции между двумя Р элементами.

У*Ы1 CATQATQAAATAACATA TTATTTCATCATQ

CATQATGAAA

ATGTTATTTCATCATQ

H R H P HR

инверсии h

Ш=вЛ

,+s

ырнк

782-2954 .» 602-2534 J^* 52Э-27Э1 У*" ' 212-2578 У1*' •1420-2902 yrf«e«

\yallow

CATGATGAAATAACAT gttatttaac ATGTTATTTCATCAF3 У*

CATGATGAAATAACA

TTATGTTATTTCATCATG У

Рис. 17. Молекулярный анализ производных у+3 аллеля.

Приведена карта исходной у*' мутации. В верхней части рисунка -каоты аллелей, вызванных инверсией X между концами Р элементов. У и у*' вызваны инверсией X, у и у*1*2 инверсией и

делецией Р2. Приведены определенные с помощью . ПЦР анализа нуклеотидные последовательности остатков Р элемента. В нижней части рисунка — делеционные производные у**. Все точки разрыва амплифицированы ПЦР и секвенированы, для точной локализации границ делеций (указаны числами у концов линий, обозначающих.делеции).

Наконец, проанализированы четыре у^3 и один у*23 аллель, которые вызваны делециями в центральной области инсерта- Точные границы их мало вариируют. Отличие состоит в том, что все у^3 аллели теряют промоторную область гена, находящегося во вставке, тогда как в у аллеле эта область не делетироввна (рис. 17).

Природа некоторых других нутационных переходов в системе. Следующей задачей молекулярного анализа являлось выяснение некоторых общих закономерностей мутагенеза в супер-нестабильных аллелях. Прежде всего было изучено поведение концевых Р элементов вставки. С помощью выше описанных методов показано, что во всех нутациях, где сохранялась супер-нестабильность, сохранялись и Р элементы. С другой стороны, все проанализированные стабилизированные аллели связаны с делецией хотя бы одного из Р элементов-

Как отмечалось выше, общий размер вставки вариирует в очень ютроких пределах и, как правило, он намного превышает размер двух ■ дефектных Р элементов. Лишь в двух случаях мутации у^3 размер целой вставки оказался точно равным размеру одного дефектного Р элемента. Вставка была нроклонирована и определена ее нуклеотидная последовтельность. Оказалось, что она представлена одной дефектной копией Р элемента, идентичной описанной выше. Очевидво. в этих двух случаях произошло вырезание инсерции за счет рекомбинации между двумя концевыми Р элементами.

Общие выводы из молекулярного анализа вставок. Возникает вопрос о механизме мутационных переходов, особенно обратимых изменений. В случае сохранения супер-нестабильности изменения затрагивают только внутренние районы инсерции. Очевидно, для ее сохранения существенно иметь на концах оба Р элемента.

Хотя большинство нестабильных мутаций связано только с изменениями внутренней области инсерта, они ведут к огромному разнообразию фенотипов. Последнее не удивительно, поскольку в эту область могут попадать разные блоки ДНК, включая цис-регуляторные элементы. Действительно, их существование во вставках прямо продемонстрировано для производных у и у Делеции в у ведут к подавлению экспрессии уеХХош в теле и крыльях и усилению в щетинках, т.е. в этой области явно присутствуют и усиливающие, и ослабляющие транскрипцию' элементы. Усиливающие транскрипцию элементы есть и во вставке у*3, где делеции ослабляют экспрессию гена уеНош.

Особый механизм лежит в основе подавления экспрессии гена уеНош в случае внутренних делеций Р2. Как показано в вашей недавней работе (X. Оганесян и П. Георгиев, неопублик, данные), если концы Р элемента сближены за счет внутренней делеции и находятся рядом с промотором уеНош, они приобретают свойство сильного ингибитора транскрипции.

Кроме делеций во внутренних районах инее рта и Р2, были обнаружены инверсии центральной вставки между концами Р1 и Р2. Они носят обратимый характер и являются одной из причин возникновения парных аллелей.

Можно предположить, что в основе ряда''Мутационных изменений лежат процессы рекомбинации и генной конверсии между химерным Р-Х элементом, расположенным в л оку се уеНош и другим, сходным, но не идентичным элементом в какой-то другой области генома. Таким

образом мотет происходить захват новых последовательностей, расположенных в других участках генома и формирование X из разных частей последнего. Участие конверсии может быть вторым (кроме инверсий) фактором, обуславливающим обратимость ряда мутационных переходов в системе.'

Система супер-нестабильных мутаций в локусе yellow открывает некоторые новые возможности в изучении регуляции транскрипции. На ней легко получать in vivo самые разнообразные конструкции, находящиеся в том же месте генома (исключение эффекта положения) и определяющие практически любой тип экспрессии гена-мишени. Этот же ПрСЦССС Г-ТС^СТ ИГраТЬ Бохную рОЛЬ В аВОйшЦип, формпруи ilpííf.'1'пчиCíOl

любой тип контроля данного гена.

Л. РОЛЕ. ГЕНА МОДИФИКАТОРА цдг4 В РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ

Продукт обнаруженного в работе гена mad(müg4) в кооперации с белком su(Hw) может контролировать транскрипцию докусов, расположенных по соседству с мдгД. Комплекс двух белков обладает свойствами инсулятораj т.е. он препятствует действию на промотор всех регуляторных элементов расположенных по другую сторону от места присоединения комплекса к ДНК. Гипоморфная мутация mod(m3g4)1u1 ведет к почти полной потере эффекта инсуляции. Остаточная инсуляцин зависит от Н-концевого ацидного домена белка ец(Ня). В то же время белок ви(Нн), не связанный более с белком mod(rat3g4), начинает прямо ингибировать некоторые близь лежащие промоторы. Падение концентрации белка su(Hn) или удаление С-концевого ацидного домена даже из части молекул su(Ни) полностью снимает это внгибирование. В некоторых 'случаях белок su(Hn), лишенный С—концевого ацидного домена, прибретает свойство активатора транскрипции. В зависимости от друют, рядом расположенных регуляторных последовательностей^ белки su(Hw) и mod(mdg4) могут менять свое действие по знаку и силе эффекта.

Один из генов, выявленных в системе продленной нестабильности был ген mad(m3g4), мутации в котором изменяли в разных направлениях фенотип мутаций в различных локусах, вызванных инсерциями мдг4-Ножно было думать;.что продукт этого гена участвует в контроле экспрессии мдг4- В опытах Т.И. Герасимовой и В. Корсеса было установлено, что мутация mod(rndg4) существенно снижает уровень транскрипции мдг4. Как показано в лабораториях D.B. Ильина и В.

Корсеса, транскрипция мдг4 контролируется энхансером, расположенным в лидерной последовательности рядом с 5'-ДКП и состоящим из 12 повторяющихся блоков, октвмеров. С каждым из этих блоков может связываться активирующий транскрипцию мдг4 фактор, продукт гена au(Hw). В нашей работе показано, что в отсутствие белка au(Hw) мутация mocl(mtlg4) 'u' не проявляется, т.е. действие белка mod(mdg4) реализуется через посредство белка su(Hw) за счет образования комплекса белка mod(n>dg4) с белком su(Hw). В данном разделе приводится детальный генетический анализ взаимодействия продуктов генов mod(mclg4) и su(Hw) и их участив в контроле транскрипции на различных системах.

Все эффекты мутаций в локусе moC(m3g4) реализуются через белок su(Hw). В этой главе описывается взаимодействие мутации

mod(mc]g4j1u1 с .различными мутациями, вызванными внедрением мдг4. Мутация mod(im]g4) является пшоморфной и ведет к существенному снижению концентрации белка mod(rodg4). Так комбинации мутации mod(tnc]g4 с нехваткой соответствующей области хромосомы,

Df(3R)GC14, всегда имеют тот же фенотип, что и вта мутация в гомозиготе. Это положение нашло подтверждение в работе Т.И. Герасимовой и др. (1995) по клонированию гена mod(mdg4).

Во всех случаях сильные мутации в локусе sи(Ни>) в гомозиготе полностью с у пре с сиру ют все мутации, зависящие от мдг4. При атом дополнительное введение мутации mod(m3g4)1u1 не влияет на фенотип. Таким образом, утрата продукта гена wxl(mcJg,4) реализуется только в присутствии полноценного белка su(Hw). Примеры, подтверждающие это положение, можно найти во всех приводимых ниже экспериментах.

Влияние мутации uux3(mas4)1u1 на фенотип {/^ плие яя в присутствии разных мутаций в локусе зи(Нш). В первой серии опытов велся

детальный анализ действия мутации modfmdg4Jна фенотип мутации j/^, вызванной внедрением мдг4 за 700 пя перед стартом транскрипции yellow. Она характеризуется подавлением экспрессии yellow в теле и крыльях при сохранении ее в щетинках. Энхансеры гена yellow, отвечающие за его экспрессию в крыльях и теле, расположены перед точкой инсерции мдг4. тогда как щетиночный энхансер - после нее, в нитроне гена, т.е. -имеет место типичная инсуляция дистальных энхансеров продуктом гена ви(Иш), связывающимся с енхансером мдг4.

При введении мутации nod(me3g4)1u1 происходит полное выключение гена yellow, возникает нулевой фенотип. Таким образом, удаление

Табл. б. Влияние мутаций в локусах moá(mág4) и su(Bw) на Фенотип у2 алделя.

Генотип линии

Фенотип yellow

Аллели зи(Вю) и их характеристика

зи (BwJ

mad (mlg4)

1U1

Тело, крылья

Щетинки

Гр

H I Бр

Ткр |

+/+

+/+ т/т

1 о

5 о

suffftojgg -потеря или su/su +/+ зи(Вш)~' инактива- su/su т/т su(Bw)_ция бедка su/+_т/т

5 5 2

5 5 5

5 О 5 О 5_О

„/3

Юхсниже- su/su

белка

SU/+

+/+ ai/zi т/т

5 ч

5 О * О í Ó

зи(Вш)

еР

ухудшение su/su +/+ 3 5 5-5 5 1 связывания зи/зи т/т 5 5 5 5 5 0 с ДНК_зи/ + т/т_2_5 5 5 5_0_

зи(ВшЧе7 нет Д0"8®8 зи/зи +/+ 4 арягч лейциновых зи/зи т/т 4 зи(Вшыодний зи/+ т/т ■_2

5 1 5 1-2

5_О

. нет С- зи/зи +/+ Л 5 5 5 5 1 su(Hw)J ацидного зи/зи т/т 2 5 5 5 5 1 _домена__su/+_т/т__1_5 5 5 5_О

мпп нет N- зи/зи +/+ 1 5 5 5 5 0

su(Bw)a IUU ацидного su/su т/т Л 2 2 4 5 0

домена зи/+ т/т 1 1 12 2 0

Сокращения: ОА-основания антен, Гр-грудные, Н-но*ные, Бр-брюшные, Кр-крыловые, щетинки; зи - данный в графе зи(Нха) аллель, т -mod(mdg4)íu ; жирные цифры даны в случаях, когда мутация mod('mdg4^,u, изменяет экспрессию уеХХаш.

белка mod(mdg4) из комплекса с белком su(Hw) придает последнему способность ингибировать транскрипцию гена уеХХат не только в теле и крыльях, но и щетинках, энхансер для которых не инсулируется (табл. 6).

Для выяснения деталей взаимодействия белков su(Hw) и mod(mdg4) были проведены опыты с разными мутациями гена зи(Вш). Белок bu(Hw) состоит, по данным В. Корсеса, из С—концевого ацидного домена, домена, содержащего "лейциновые молнии", домена, связывающегося с ДНК с помощью "цинковых пальцев", и N-концевого ацидного домена.

V ТО Q1

Сильные мутации, зи(Ви>) (делеция гена), зи(Еш) и зи(Вш) (повреждение доиена, связывающего ДНК), конструкция (делеция обоих ацидных доменов), полностью супрессируют у2 фенотип до нормы и делают его не чувствительным к мутации mod(mág4) . Интересно, что хотя эти мутации рецессивны, в гетерозиготе они

полностью сулрессируют действие mod(mclg4_)'u' в щетинках и частично

в теле и крыльях, т.е. прямое ингибирование сильно зависит от

концентрации белка au(Hw) (табл. 6). ТЗ

Аллель зи(ЫшУ , 10-кратное снижение концентрации активного

белка au(Hw), только частично супрессирует у фенотип в крыльях и теле, но его комбинация с мутацией mod(mdg4)полностью супрессирует мутантный фенотип. В гетерозиготе выявляется лишь очонь слабое подавление у-фенотипа в щетинках, вызванного mod(mc3g4)^u^. Ингибирование акспрессии yellow в щетинках, таким

образом, сильно зависит от концентрации su(Hw).

Мутация зи(Иш) является слабой. Она лишь частично нарушает связывание белка с ДНК. Она слабо супрессирует у-фенотип в теле и

крыльях, но в комбинации с mxxl(mclg4)1u1 аллелей вызывает полную

е2

супрессию. Интересно, что в гетерозиготе мутация аи(Нш) в

комбинации с mod(mclg4)iU' аллелем действует так же, как и сильные

мутации первой группы. Иными словами, белок su(Hw) в отсутствие

белка mo<l(mdg4) становится полностью не функциональным. еТ

Мутации su(Uw) (делеция С-концевого ацидного домена и лейциновых молний) и конструкция su(Hw)ii2S3 (делеция только домена лейциновых молний) сильно, но не полностью сулрессируют у^ фенотип. Мутация mod(mt3g4)1U1 дополнительного действия не оказывает. Можно думать, что домен лейциновых молний нужен для взаимодействия двух белков.

Мутацию su(Hw)^, потеря С-концевого ацидного домена, сама по себе не влияет на у2-фенотип и лишь слегка его сулрессируют в присутствии мутации mad(mclg4). В гетерозиготе она полностью подавляют ингибирующее действие mod(mc3g4 на пигментацию

щетинок. Таким образом, С-концевой ацидный домен играет важную роль в прямом ингибировании акспрессии гена yellow в щетинках.

Конструкция зиОЯш)^10® - ато делеция N-ацидного домена белка su(Hw). Подобно su(Hw)^ аллелю она не супрессирует j/^ Фенотип в гомозиготе. С другой стороны, комбинация гомозиготы 8и(Нш)^1°° с mod(mdg4)^u^ ведет к значительной супрессии у фенотипа в теле и крыльях. В отличие от делении С-концевого ацидного домена, мутация suCUw)^100 только слегка супрессирует ингибитррное действие mocl(m(3g4)1u1 на пигментацию щетинок (табл. 6).

Влияние мутация в генах su(Hw) и mod(mlg4) на фенотипическое проявление друтах мутаций гена yellow. Анализ некоторых у-мутаций позволяет ответить на ряд дополнительных вопросов.

Табл. Т. Влияние комбинация мутаций в локусах su(Hw) и mod(mdg4) на различные мутации и конструкция yellow.

Генотип

у, индекс и природа

зи(Нт)

mtxl(mlg4)

__i§llow_<$egoTiin_

Тело, Ще- OA

у2™'. y2PR2 Внедрение мга жокея или /юЬо в внхансер цдг4 + + eu(BwA su(Hw)J moa(m0g4)1u1 moa(mcJ^4)1u1 3 0 3 A 5 0 5 5 _

уР^78 Конструкция с утратой 2/3 Bjuauuopa мдг4 + 8U(BW)J/+ mod(m3s4)1u1 mod(mcJR4)'u' A A 5 5 3 5 -

всзв Внедрение мдг4 за геном yellow * + 8U(BW)J moa(mlg4)1u1 тоа(тЗк4)1и1 5 5 5 5 1-4 5 5 0 ?

уР^ббО Конструкция с мдг4 в нитроне + той(тая4)1и1 5 г 0/5 о

+TVUL

Внедрение hobo в интрон гена yellow и одновременная дупликация гена yellao

au(Hw)

bu(UW )J

ou(Uw)

morJ(mds4) +

moa(nx3g4) y-

moa(m3g4) -t

тоа(тсЩ4)

1u1

1VLl

1U1

5 5

0-3/5 0

1-2/5 1-2/5

4/5 4/5

5/5

Основные обозначения те же, что в табл. 6. Цифры перед знаком / -пигментация грудпш: я ножных щетинок, после / - крыловых и абдоминальных.

Две частичные реверсии мутации у^,. ведущие к усилению пигментации тела и крыльев до 3+. вызваны внедрением в энхансер мдг4 других иге (жокая и НоЬо). Их комбинация с гюа(т1е4)^и1 ведет к полная утрате гоа~,«нтации не только щетинок, но также тела и крыльев. Следовательно, прямое ингибирующее действие енхансера мдг4 в отсутствие балка той(тс1/;4) ведет к инактивации всех енхансеров гена уеНою, прагоам разделение внхансера ыдг4 на две части ннороднимн последовательностями, ослабляя инсуляцию, ве влияет на ингибирование в отсутствие белка гххЦв&1*4) (табл. 7).

Конструкция уР0-76'5 (р. БпгШ1) содержит ген уеИси» и идг4, у которого в внхансере имеется не 12, а только 4 сайта связывания. Фенотип линии напоминает таковой у линии у2*^*. Однако, мутация тосЗ(1ясЗ£4)^и'1 оказывает очень слабое действие на фенотип.

Следовательно, число сайтов связывания белка su(Hw) весьма существенно для проявления аффекта мутации mod(nulg4).

зв

Мутация ас вызвана внедрением мдг4 за на расстоянии 3 тпн за геном yellow. Экспрессия yellow в ней не изменена. Однако, комбинация с mod(mi3g4)1u* ведет к снижению пигментации щетинок до уровня 1-4 (табл. 7). Следовательно ингибирующее действие внхансера мдг4 проявляется на расстоянии в несколько тпн, хотя и уменьшается с увеличением расстояния от промотора гена.

Во всех ранее перечисленных опытах обнаружена необычная

экспрессия гена yellow в основаниях антен (OA) (табл. 6). Сильные

мутации su(Uw) усиливают мутантный фенотип в OA. Ранее описана

полная реверсия у^, вызванная заменой анхансера цдг4 на жокей, +2ЫС

у . Однако и в ней экспрессия yellow в OA не восстанавливается.

Это можно объяснить существованием еще одного, ранее неизвестного

энхансера гена yellow, отвечающего за избирательную его экспрессию

в OA, расположенного в области внедрения мдг4> что и приводит к его

ЗВ

инактивации. Мутация зс позволяет исследовать экспрессию гена yellow в OA, поскольку инсерция мдг4 не нарушает структуры OA энхансера в этой мутации. Введение мутации mod(mdg4приводит к полному подавлению экспрессии yellow в OA, даже более сильному, чем в щетинках (табл. 7).

Исследовали также действие мутации modfmdg4 Jна экспрессию . конструкций, в которых мдг4 находится в разных участках гена yellow. Наибольший интерес представляет конструкция у^660, где мдг4 внедрен между промотором и щетиночныы внхансером, блокируя действие последнего на промотор. Введение мутации mod(mdg4)^U^ приводит к практически полной инактивации гена yellow (табл. 7) -Следовательно, в отсутствие белка mod(mdg4) белок su(Hw) подавляет эффект всех энхансеров, т.е., вероятно, мишенью его действия является промотор.

Возникает вопрос, каков механизм действия белка su(Hw) с удаленным С-концевым ацидным доменом. Или он просто теряет ннгибирующую активность, или он может приобретать способность активировать транскрипцию? Частичный ответ на этот вопрос получен в

+TU1

опытах с у аллелем, полученным в системе с продленной нестабильностью. Он возник из у^ аллеля в результате дополнительного внедрения ига hobo в интрон yellow и одновременной дупликацией района гена yellow между hobo элементами. Фенотипически у+ГШ выражается в частичном подавлении экспрессии yellow в щетинках, не зависящем от действия внхансера мдг4 и белка su(Hw):

сильные мутации в локусв зи(Нш) не восстанавливают экспрессию гона yellow. С другой стороны. мутация ' mod(mtJg4)1ut полностью ингибировало последнюю (прямое ингибирование). Между тем, мутация bu(Hw)J резко усиливала экспрессию гена yellow в щетинках, независимо от присутствия или отсутствия мутации mod(mlg<1) (Табл. 7).

Таким образом, лишенный С-кояцевого ацидного дсмена белок

bu(Hw) может становится активаторм транскрипции с тех промоторов.

где он в отсутствие белка rood(mdg4) выступает в роли ингибитора.

Без С-концевого ацидного домена белок su(Hw) сохраняет свое

активирующее действие даже после удаления белка mod(mdg4).

Существенно, что дополнительное удаление из белка eu(Hw) домена с

еТ

лейциновыми молниями (нутация bu(Bw) ) еще более усиливает

активирующее действие белка su(Hw).

Дополнительные данные о его активирующей роли получены при

анализе комбинаций мутации у2 с е(у)1и1 или е(у)Зи1. которые о

усиливают мутантный у фенотип (происходит депигментация щетинок, см. гл. 1). Сильные зи(ВшJ-мутацки не влияют на пигментацию щетинок в этой комбинации мутаций, тогда как мутации su(llw)^ (частично), и

.»у _ _ _

su(Rvj) (полностью) восстанавливают нормальную пигментацию

щетинок. Нутация mod(m<3g4)1a1, как и в предыдущем случае, на эту активацию транскрипции не влияет.

Супрессиружадее влияние мутации mod(tm3g4) на мутации в локусах cut и scute. Изучено действие мутаций macl(mJg4)1u1 и разных мутаций в локуса su(Hw) на ct® аллель, возникший в результате внедрения мдо-4 между промотором и внхансером, который регулирует экспрессию гена cut в крыловом пмапшальяом диске. Этот анхансер расположенным на расстоянии около 100 тпн перед промотором гена, причем ивсорция мдг4 находится вблизи внхансера. Фенотип этой мутации ("обрезанные крылья") совпадает с таковым после делении соответствующего внхапсера. В описании ct мутаций мы различаем четыре главных фенотипов: + (дикий тип). ctn (небольшая вырезка на концах крыльев), ctPN (вырезки вдоль краев крыльев) и ct^ (обрезанные крылья). Мутации полностью супрессируются сильными su(Bw) мутациями. Однако, в отличие от у мутаций. ct^ аллель супрессируется мутацией mod(mlg4до ctn фенотипа (Табл. 8).

Сильные мутации зи(Нт) в комбинации с mo(l(mclg4)1uJ активны даже в гетероэитоге, полностью подавляя мутантный фенотип. Слабые мутации 3u(Bw)J и su(Bw)^100 слегка супрессирует ct^ фенотип до

Табл.8.Влияние мутация в локусах зи(Еш) и mod(mdg4) на фенотипы мутаций в локусах achaete, scute и cut, вызванных инсерциеа мдг4.

Генотип

sи(Нш)

moa(wdg4)

Bin'

Фенотип

ПО ПВ Оц ПН Ск

ДЦ Кр OA

su(Bw) +

su(Bw) sa(Bv>) su(Bw)

su(Bw)' su(Bw)

v.2 v.2 v.2

e2 e2 e2 j

su(Bm) зи(Вш)'

el eT,

mod(mdg4)

lul

su(Bw) /+

su(Bw

su(Bw)J±

su(Bwy^/+

su(BwfOAU/+

su(Bw)Jf su(Bw) . su(Bw)J/+

зи(Вш)*1ии/+ e7

siodOndg^.)'"! mod(mdg4)

modf^Jg^b'"? moa(mdg,4)

+ - ' lul mod(tntlg4)

mod(m3g4)

mod(mdg4) +

mocJ(m3g4) mod(mclg4)

Ш1 1u1

1u1 1U1

mad(tMjg4)Vfl!l mod(mdg4)

P«

moQ(m6g4) mocl(mcig4)

1u1 1U1

SO 90 90 90 1

50 50+90 1

+ + + + 4

+ + + 50 4

90 90 50 50 1

+ + + + 4

+ + + 50 4

+ + + .50 3

+ + + + 4

+ + + 50 3

+ + + + 4

+ + + 50 4

90 90 90 90 1

90 90 10 50 1

50 90 10 50 1

90 90 90 90 1

+ + + + 4

+10 +50 4

90 90 +50 1

50 50 +10 2

50 50+10 1

4 4

2 1

2 +

+ +

2 +

1 +

+ + ■+

3 2 2

3 +

2 2 2

^ фенотипы:

Щетинки: ПО-передние орбитальные, ПВ-поствертикальные, Оц-оцеллярные. ПН-передние ното-плевральные. Ск-скутеллярные, ДЦ-дорзо-центральные, Кр-крыловые. ОА-основания антен. 90, 50, 10 - данный тип щетинок отсутствует у более, чем у указанного числом процента всех проанализированных мух. Цифры 1—4 - число дополнительных щетинок данного типа- ч—цикия тип.

ct**1*. Таким образом, N-концевой и С-концевой ацидные домены могут в данном случае заменять друг' друга. В комбинации с maci(mdg4) 'u' в отличие от зи(Вш)^ дает полную супрессию (табл. 8). Сходные результаты были получены при анализе мутаций в ' комплексе achaete-scute (AS-C), который состоит из четырех генов. Ген achaete (ас) отвечает за развитие волосков, и дорзоцвнтральных щетинок. Локус scute отвечает за развитие всех остальных щетинок-

В исследованной мутации scD' мдг-4 внедряется на расстоянии 20 тпн перед локусом scute, отделяя ген от ряда его экхансеров. Другая изученная мутация, Ни>\ вызвана инсерцией мдг4 примерно в середине

структурного гена ас, в результате чего ас транскрипт укорочен, но

белковый продукт функционально активен. Она ведет к

супер-экспрессии гена acfiaete: гомозиготные самки имеют около 90

дополнительных волосков на крыльях и дополнительные щетинки на

голове, груди, щитке и 0А. Очевидно, мдг4 инсулирует ген от

действия сайлеисера.

Мутации зс®' полностью супрессируется сильными su(Hw)

аллелями. Мутация mod(mclg4),u1 ведет к частичной супрессии sc

фенотипа. Интересно, что в гетерозиготе зи.(Вш) /+ мутация mod(nüg4),tl1 практически полностью супрессирует sc фенотип, иными словами на данной системе белки su(Hw) и mod(mdg4) действуют сивергически в подавлении экспрессии гена acute анхансером мдг4 (табл. 8).

Мутация зи(!1и>оказывает слабое действие на зс®' аллель, но в комбинации с mtxl(mt3g4)полностью супрессирует мутацию. Гетерозиготе su(Hw)e2/+imoa(mOg4)1u1/mod(m3g4)'"' полностью супрессирует мутантный ас®1 фенотип, как сильные зи(Нш) мутации.

Долация С- или N-коицевого ацидного домена не влияет на ас фенотип, тогда как удаление обоих ацидных доменов в зи(Ви>/*оЛО . вызывает полную супрессию. зч(Вш)^^® полностью подавляет проявление sc®' в происутствин mocJ(mlg4) 'u'. зи(Вш)^ не влияет на acD1 Фенотип и даже несколько снижает эффект мутации mod(mdg4) (табл. 8). Эти данные свидетельствуют о том, что для проявления инсулируицего эффекта после удаления белка mod(mdg4) нужен только

N-концевой ацидный домен. Наконец, mod(rmlg4)не влияет на эффект pf _

su(Bid) мутации, что свидетельствует о роли домена с лейциновыми

молниями в связывании с белком ood(rodg4).

В заключение проводились опыты с мутацией Яш', влияющей на

экспрессию локуса achaete (табл. 8). Сильные мутации su(Bw)

полностью супрессируют Яш' эффект. mod0ra3g4.)'u' тоже обладает

ТЗ е2

супрессаруххцим действием. Мутации 3U(Bw)J и sa(Bw) как в гомо-, так и в гетерозиготе в комбинации с mo(3(mJg4) 'u' подавляют мутантный Hw1 фенотип. Делеция любого из ацидных доменов лишь слабо супрессирует мутацию Вш1. Комбинация ви.(Ви>)^10° и mod(mJg4)1и1 ■ ведет к полной супрессии, а su(Bto)^ в сочетании с mod(mög4 почти не имеет эффекта.

Таким образом, балок Dod(mdg4) играет важную роль в инсуляции, и его удаление частично ш полностью супрессирует изученные мутации. Остаточная инсуляция зависит от присутствия N-концевого ацидного домена и исчезает при утрате последнего. Прямым

ингибирующим действием на промоторы генов cut. scute и achaete белек au(Hw) после удаления белка mod(mdg4)> очевидно, не обладает.

Влияние присутствия других регуляторных элементов на действие генов ви(Ви>) и тос1(1КЗё4). . . Как отмечалось ваше, в системе супер-

нестабильных мутаций выявляется множество разных аллелей в локусе

Табл. 9. Влияние мутаций зи(Вш)2 и mocl(me3g4)1u1 на у-фенотипы у разных супер-нестабильных аллелей.

N У- Суб- ИЗМЕНЕНИЯ ПИГМЕНТАЦИИ КУТИКУЛЫ

экс- фено- сис- Крылья Щетинки

пер. тип тема Тело Гр| Бр КН KB Нж

1 У2

у23

-11—11— -55—55—55—55—55-

XX I X I I I

- -11—11— -55—55—55—55—55-хх х х х х х

у263 з

у203 5

о 8 § о

-01—13—13—02—131 1 I 1 1

-11—11-X X

-11—11— -01—12—11—00—11-

У20 5 -У23

У23

11—11— -55—55—55—35—55-

ох ох

11-11-

11-11-ох ох

у*шйз 1

у +гьз 1.3

-22—55-

8J 81

8х 8х

-33—33-

-55—55—55—35—55-

8| 1 I I |

-45—55—55—35—45-00—22—55—55—22-8i ffi 8i 81

I Ш о § 8

-00—22—45—23—12-

Цифры на

линиях означают

максимальный и

минимальный

уровни окраски

для данного

аллеля. Символ

о-деиствие

нутации зи(Еш)?

х-тоа(тс%4 )

на у-фенотип.

Символы.

расположенные

над линией,- -

супрессия,

увеличение

пигментации

соответствует

числу символов;

символы,

расположенные

под линией, —

усиление

мутантного

фенотипа

(ослабление

пигментации).

Символы х и о -

вариации

эффекта мутации

для данного

аллеля.

Совращения:

Гр-грудные,

Бр-брюшные,

КН-крыловые

наружные,

КВ-кршгавые

внутренние,

Нж-ножные

щетинки.

уеНош. Во всех них присутствует мдг4 (см. гл. 3). а также нестабильная инсерция, имеющая переменнный состав и разный размер и несущая серию регуляторных последовательностей, комбинации которых в разных аллелях и определяют в значительной мере фенотипическое разнообразие.

Было проведено сравнение действия мутаций зи(Нш) и вюй(тЗ£4) на фенотип разных у аллелей. У части аллелей

(У03 .

у*3, у""3 и у*13) ни та, ни другая мутация не влияли на у фенотип, поскольку весь контроль был взят на себя цис-регуляторными элементами вставки. Однако на многие у-аллели мутации зи(Нш) и тос1(т1в4)1и1 имели фенотнпически отличное действие.

а ряда суиер-ыастаишшБЫХ аллегой (табл. 9. ошгтн 2. 3) наблюдаются классические ответы (см. опыт 1): полная супрессия мутантного фенотипа под действием мутации зи(Нш) я усиление у-фенотипа под действием мутации тсх1(тй{^4)1и1. Однако, многие

аллели дают необычный ответ на выше указанные мутации. Мутация

ви.(В\о) супрессирует у-фенотип в теле и крыльях, но мутация теряет усиливающее действие (опыты 4, 5). Наоборот, тсх1(т^4)^и1 может усиливать у-фенотип обычным образом, а зи(Вш)^ иметь лишь слабый супрессирующий эффект (опыт 6). Обе мутации, зи(Пхп)2 и тоа(т0ё4)1и1, могут изменять у-фенотип в однсы

направлении, или усиливать его (опыты 7. 8), или супрессировать

р _

(опыт 9)- В первом случае зи(Пш) усиливает у-фенотип, тогда как во втором мутация супрессирует его, что прямо

противоположно их обычному действию-

Очевидно, что наличие во вставках различных цис-регуляторных элементов ведет к связыванию . белковых факторов, которые взаимодействуют с белками аи(Нч») я той(4*154) таким образен, что полностью меняют их активности.

Выявление цис-регудяторгаи элементов, менявших ответ на мутации в

локусах ви(Вш) я тос1(т^4). Выше приведен молекулярный анализ

__-гпз *з

некоторых мутационных переходов, происходящих в аллелях у и у

Для этих аллелей также было проведено определение эффекта мутаций

ви(Ва)^ н тсх1(тЗ^)41и1. На ряс. 18 изображены схематически

молекулярные изменения, происходящие в локусе уеНош, и приведены

данные но действию выше указанных мутаций.

Мутация у+лз выражается в подавлении экспрессии гена уеНош в

части щетинок, тогда как в теле и крыльях пигментация нормальная.

Мутация зи(Вю) , выключающая действие белка вu(Hw), ведет к

w.b

MEn/S P2

-o-©—

En ьг. I

Su(Hw)

P1 pr En P2 л ,__

€>-I 5 5 О 2 б б б I

ц У"

транскр.

12 2 g g g g g] L-> ■ ■ y*8

LZ та

5_б

б_б

Su(Hw)

Рис. 18. Ипиянир мутаций (ял(Е\п)2 и тоа(якЗ£-4)1и1 на экспрессии

уеНав в некоторых сущзр-нестаОидыщх производных у+аз и у+а.

Показаны схвиатически (не в масштабе) изменения« происходящие в локуса уеНсш при данных мутациях (си. рис. 16 и 17). В -изменение у-фенотип^и1под влиянием ви(Вш) ; В - то ха, но под влиянием тсх1(тс1ё4) " . Расположение символов и их значение - как в табл. 906 означены Р элементы (Р1, Р2), промотор гена вставки (Рг), анхаисеры (Во), сайлансеры (Б), сайты связывания ви(Нф), делеции и начала транскрипции. II — последовательность, нарушающая инсуляцшо. Сокращения: Т-тело, К-крылья; Гр-грудные, Бр-брвшные, КН-крыловые наружные, КЫ-крылоные внутренние, Нх-нохныэ щетинки.

частичному подавлению экспрессии гена yellow в теле и крыльях, т.е. сайт связывания eu(Hw) в новом окружении не инсулирует энхансеры тела и крыльев, а каким-то образом активирует транскрипцию гена yellow в соответствующих частях кутикулы. Мутация mod(mclg4) действует в том же направлении, но с меньшей интенсивностью. Таким образом, комплекс белков su(Hw)-mod(mdg4) выступает в качестве активатора транскрипции.

Производные мутации у^3 возникают в результате делеции в 3' половине инсерта. Две из них, более короткие, несмотря на типичный у2 фенотип, обляпают пяряпоксяльным ответом на мутацию su(Bw) : вместо восстановления пигмоптации тела и крыльев происходит полная репрессия ее во всех частях кутикулы. То же самое имеет место при действии мутации moO(me3g4)1u^.

В трех других у23 производных, где деления распространяется еще на 1.2 тпн в 5' направлении, происходит полное восстановление обычного типа ответа на мутации зи(Нт) и mod(mclg4) Следовательно, в 1,2 тпн фрагменте находится регуляторный элемент, который блокирует действие энхвнсеров гена yellow и взаимодействует с белковым комплексом su(Hw)-rood(mdg4) так, что последний полностью меняет свои свойства.

Фенотип мутации у*8 не чувствителен к мутациям su(Hw) и mod(4x3g4)1u1. Следовательно, некие элементы вставки либо блокируют инсуляцию, либо сами активируют транскрипцию yellow. Делении части внутренней вставки до некоторой степени восстанавливают действие области связывания su(Hw) как инсулятора. Интересно, однако, что при этом мутация mod(mdg4)1u1 не оказывает никакого влияния на транскрипцию yellow.

Лишь в том случае, если делеция распространяется далее в 5' направлении и захватывает промотор гена, располагающегося во вставка, происходит резкое изменение в аффекте мутации mocJ(tKJg4)1u1. Появляется ее обычное ингибирутацее действие на экспрессию yellow во всех зонах кутикулы. Вероятно, действие белка bu(Hw) переключается с промотора yellow на ближайший промотор вставки, и лишь удаление последнего восстанавливает иютгбируюсцоо действие внхансера мдг4 на промотор yellow.

Характер взаимодействия белков su(Hw) и mod(ndg4) и их роль в регуляции транскрипции. Полученные в данном разделе данные

позволяют сделать ряд выводов о механизме действия белковых продуктов генов зи(Вш) и moa(mOg4) (рис. 19)- Комплекс двух белков.

связываясь с ДНК, осуществляет инсуляцшз, для которой пеобходпмо присутствие хотя-бы одного (любого) ацидвого домена еи(Н\у). Удаление шой(ш<154) подавляет инсуляцию во всех случаях. Остаточная инсуляцня зависит только от Л-концевого ацидного домена ви(Н«0-

Другой эффект белка ви(Нш), который осуществляется в отсутствие белка то<1(тс^4). это прямое ингибироввние некоторых промоторов, например, промотора уеНош. Проявление его требует достаточно высокой концентрации ви(Н1#) и в основном определяется С-концевым ацидным доменом последнего. Более того, лишенный С-концевого ацвдного домена вц(Нф) может в ряде случаев активировть экспрессию гена вне зависимости от присутствия белка тос! () -

Связывание то(1(тс1£4) с ви(Нф) происходит, по-видимому, при участии ' домена лейциновой молнии. Получены указания на роль той(т<^4) в усилении специфического связывания белка ви(Н\у) с ДНК.

1П ч/п

©© <ш) ©

4 Г

анхансеры промотор

область связывания белка зи(Нн)

' транскрипционная машина

^ ^ | ^ факторы транскрипции

@ Оелок зи(Ня)

Рис. 19 Схема разных типов воздействия знтпнсера мдг4 на тран скрипцию.

Жирные стрелки - инактивация промотора, тонкие линии — действие

активаторов, поперечная линия — инсуляция. 1-нормальная

транскрипция в отсутствие белка ви(Н»г); 2-инсуляцня; Э-ингнбироввпие промотора и 4-блок ивсуляции, вызванные удалением белка то<1(тс^4).

Наконец, следует отметить, что инсуляция является весьма сложным процессом. В наших недавних работах показано, что она зависит от функционирования ряда других белков, как например, продуктов генов zeste. е(у)1. е(у)2 и е(у)3. Яркий пример получен в настоящей работе, где один из цис-элементов инсерта, входящий в состав 1,2 тпн фрагмента, полностью меняет свойства домена, связывающего su(Hw), превращая его из инсулятора в активатор транскрипции. Механизм этого феномена требует специального изучения. Ясно, однако, что это может быть только следствием связывания с данным элементом новых белков, которые, взаимодействуя с комплексом au(Hw)-mod(nxlg4), меняют его свойства.

5. ГЕН МОДИФИКАТОР ЦДГ4 И ПРОЦЕССЫ ТРАНСВЕКЦИИ

Показано, что мутация в локусе mcxS(mag4) подавляет позитивную трансвекцию, связанную с транс активацией промотора yellow энхансером, расположенным в гомологичной X хромосоме. Также описано явление транс инактивации экспрессии нормального гена yellow белком su(Hw), связанным с энхансером мдг4 в гомологичной хромосоме в отсутствие белка mod(mdg4). В этом случае один энхансер мдг4 подавляет транскрипцию гена yellow одновременно в двух гомологичных хромосомах.

У V. melanogaater известно явление, названное трансвекцией, которое характеризуется взаимодействием между регуляторными элементами, входящими в состав гомологичных хромосом. Одним из наиболее хорошо молекулярно изученных случаев трансвекции является система с локусом yellow. Показано, что в гетерозиготных j/Vy5915 самках восстанавливается нормальная пигментация, т.е. происходит

5gh ?

внутрилокусная комплементация. Мутация у возникла из у аллеля в

результате вырезания области мдг4. включая его энхансер, а также

59Ь

части гена yellow, захватывающей промотор. Поэтому аллель у имеет нулевой фенотип. Изучение разных производных мутаций показало, что механизм комплементации следующий: сохраненный в У59* энхансер локуса yellow транс активирует находящийся в гомологичной X хромосоме (у2 аллель) промотор yellow, обеспечивая нормальную транскрипцию (В. Корсес). Мы исследовали'роль гена raod(mûg4 ) в этом процессе.

Мутация mod(mdg4)1u1 блокирует позитивную трансвекции. Введение мутации mod(mclg4)1u1B гетерозиготу полностью подавляет

экспрессию гена yellow: происходит депигментация всех зон кутикулы (табл. 10). Таким образом, удаление белка mod(mdg4) из комплекса с белком su(IIw) блокирует не только действие ра сполохе иных на своей хромосоме энхансеров, но и нарушает взаимодействие с энхансером гомологичной хромосомы, т.е. происходит подавление позитивной трансвекции. Это, очевидно, связано с прямым действием на промотор.

Выли проведены опыты с частичными у^ ревертантаии, t/^^' и у2РЙ2^ гда анхансер мдг4 расщеплен внедрением других мобильных элементов. Оказалось, что такой анхансер такте способен осуществлять полный блок позитивной трансвекции (табл. 10).

Наконец, было исследовано влияние удаления одного ацидного домена из белка su(Bw) (мутация su(Bw)^). При этом происходит существенное восстановление транс-активации экспрессии гена yellow. Интересно, что даже в гетерозиготе su(Bw)^/su(Bw)* сохраняется, хотя и в небольшой степени, эффект позитивной трансвекции, тогда как в гетерозиготе su(Bw)v/su(Bw) он отсутствует (табл. 10). Возможно, лишенный ацидного домена белок зи(Вш) конкурирует с нормальным белком, препятствуя его негативному воздействию.

Негативная трансвекции. Нутация mod(mclg4)1u1 способна вызывать

еще один интересный феномен, названный негативной трансвекцией, а именно транс-инактивацию работы локуса yellow. Он заключается в том, что введение мутации moel(inclg4)1u1 в гетерозиготу приводит к частичной инактивации экспрессии yellow в хромосоме, относящейся к дикому типу (табл. 11). Снижается пигментация кутикулы ножных щетинок и почти полностью подавляется пигментация оснований антен (OA). Хотя аффект и не очень сильный, он вполне достоверен.

Таким образом, удаление белка mod(mdg4) из комплекса с белком su(Hw) ведет к тому, что энхансер мдг4 почти полностью выключает действие на промотор yellow энхансера, контролирующего экспрессию в OA, расположенного в гомологичной X хромосоме. В меньшей степени это касается энхансера для щетинок.

Более сильно негативная .трансвекция проявляется в гетерозиготе Аллель у+2ЫС возник из / в результате внедрения в мдг4" копии жокея с одновременной делецией энхансера мдг4- Поэтому, в

.pun .pUC fall

частности, в гомозиготе у /у мутация mod(utclg4) не влияет на уровень пигментации. Однако в гетерозиготе

мутация

Табл. 10. Ингибирование трансвекции мутацией тоа(тЗ{>4)

1и1

ГЕНОТИП Пигмептация Тело» Шети-крылья! нки ___0_____0__ 1 5 0 О

у [ тоа(та%4) зи(Иш)

59Ь 590 и и * ..

у^/у* + + у2/^ modfшdR4),u, +

//У5913 у^/у590 тас1(так4)1и1 + 5 5 0 5

у2РК'/у59Ь \ 1 </т1/и59Ь тоаж*)1»1 + 2 5 5 5 0 0

У2/у2 тоа(тав-4)Ы1 еи(Нш)ь/+ у2/у59Ь тоа(так4)1и1 ви.(Вт)"/+ 2 5 2 5

тоа(юО£4)1и1 ви(Нш)^ у2/у59Ь тоа(тЩ4)1и1 зи(Ню^ 1 5 3-4 5

у^/у2 тоа(тОё4)1и1 ви(Иш //у59* тоа(тОё4)1и1 зи(Пш)3/+ 1 5 2 5

Те же результаты пблучены с мутацией у к . Жирным шрифтом отмечены случаи позитивной трансвекции и ее подавления мутацией тоастае^)1"'1.

Табл. 11. Негативная трансвекции в локусе уеНаш.

ГЕНОТИП Пигментация

Щетинки Волоски ОА

У Другие мутации Гр Нж Бр Кр

5 5 5 5 5 5 5 3 5 5 5 1

1?/у+гас иоа(тае4)1и1 5 5 5 5 5 1 3 14 3 1 0 5 5 5 5 5 1

3 2 4 3 2 0 3 1 4 3 2 0 5 2 5 4 2 0

и69,и*2ис тоагта*)™ 0 О 1 1 О 0

1?/у+2ЫС: ъоас^)?1 + аи(Н\вг/'+ 5 5 5 5 5 1

Сокращения: Гр-грудные. Нж-яожные, Бр-брюппшо. Кр-крыловые щетинки; ОА-основания антен.

гиргшы шрифтом выделены случаи с негативной трансвекцией.

mod(mclg4)^u^ вызывает резкое понижение экспрессии гена yellow в щетинках, особенно ножных, в волосках. Это усиление транс инактивации связано, возиохно. с улучшением взаимодействия между гомологичными хромосомами благодаря присутствию в обеих последовательностей мдг4-

Нутация ' modfrndg-i.) 'u' также снижает пигментацию щетинок у

+2UC *

гетерозиготных самок, содержащих у в один из у-вллелей, с

активным вяхансером , (табл. 11). Негативную трансвекцию - можно наблюдать и в том случае, если мдг ' 4 находится ва расстоянии в несколько тин от локуса yellow, как в случае мутации зс^ ' (табл. 11), хотя вффект при этом несколько слабее. Он сильнее всего проявляется в ножных щетинках и волосках.

Я,

\jr\

У*

J*í"Vn|ьг-'

yellcnv

Z5ÍI

Jockev

Jocf

9 Белок mod(m0g4) • Белок ви(Ня)

Рве. 20. Схематическое изображение .влияния мутации mod(mdg4)^u1 ыа трансвекцию.

1 - Трансвекция в системе у2/*/5^. 2 - Черные стрелки -

транскрипция н ее активация, полые стрелки — иштибирование.

Негативная трансвекция, очевидно, является результатом действия ацидных доменов белка su(Hw) либо на промотор гена yellow в определенных типах клеток, либо на некоторые енхансеры этого гена. Дате относительно небольшое снижение концентрации ацидных доменов в гетерозиготе зи(Пполностью ее подавляет (табл. 11).

Интересно, что наиболее сильный эффект получен в случае аллеля

69 2 _

у , производного у , у которого происходит удаление промотора

yelloto при сохранении лнтактного энхансера мдг4 и всех энхансеров

69 +2UC

гена yellow. У самок в гетерозиготе у /у происходит почти

полная инактивация гена yellow в щетинках при введении мутации mod(mdg4)1u1 (табл. 11). Таким образом, удаление своего промотора при сохранении энхансеров резко усиливает транс-инактивацию промотора в гомологичной хромосоме, что указывает на промотор как на объект действия белка su(Hw) в отсутствие белка mod(mdg4)-

В заключение следует подчеркнуть, что в системе негативной трансвекции один энхансер мдг4 подавляет работу одновременно двух промоторов на своей и гомологичной хромосоме. Для объяснения этого приходится допустить образование, по крайней мере, тройного комплекса, вовлекающего участки обеих X хромосом.

Блок позитивной трансвекции и негативная трансвекция схематически изображены на рис. 206. РОЛЬ ГЕНОВ ЭНХАНСЕРОВ YELLffl 1, 2 И 3 В ОРГАНИЗАЦИИ ДАЛЬНИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ГЕНОМЕ

Гены е(у)1, е(у)2 и е(у)3 резко усиливают действие нулевого аллеля zeste на экспрессии локуса white, вплоть ' до уровня 3+-(желтые глаза), что соответствует экспрессии white, лишенного своего энхансера. Действие белков е(у)1-3 сходно с таковым белка zeste. Комбинации мутаций в двух докусах е(у) обычно детальны. Вероятно, эти локусы представляют собою семейство генов, участвующих в организации взаимодействий между удаленными участками ДНК.

До настоящего времени был известен один ген, zeste, белковый продукт которого может участвовать в организации дальних взаимодействий, в частности, между энхансёром и промотором гена white (V. Pirrotta). Белок zeste способен связываться с ДНК, а также образовывать мультиыерные белковые комплексы, стягивая последовательности ДНК. Обнаружено, что гены е(у)1. е(у)2 и е(у)3 ,

выявленные в системе продленной нестабильности, кооперируют с геном zeste в контроле экспрессии white, в частности, в обеспечении контакта между энхансером и промотором последнего. Предполагается их участие в организации дальних взаимодействий в геноме дрозофилы.

Кооперации мутаций в локусах enhancer of yellow 1, 2 и 3 с разными мутациями в локусе zeste. Мутация zv'^rtl ведет к полной утрате белка zea te. При атом, в отличие от точечных мутаций z' и z0^, она очень слабо влияет на акспрессию локуса white, являющегося тест системой для z мутаций. Эффект особенно слабо выражен у самцов и. кроме того, он суцрессируется при 18°С. Дополнительное введение мутации o(y)1u1. efили в(у)Зи1 существенно усиливает ингибироввние окспрессии гена white (табл. 12). Эффект сильнее проявляется у гомозиготных по комбинации мутаций самок, где пигментация глаз снижается до 3+ (желтый цвет глаз), что характерно для мух с полной делецней анхансера гена white. Самый сильный аффект получен для мутации е(у)Зи1. При 18°С аффект мутаций усиливается. Мутации в локусах е(у)4. е(у)5 и е(у)6 не влияют на пигментацию глаз в комбинации с аллелем.

Таким образом, продукты трех локусов, е(у)1. е(у)2 и е(у)3. кооперируются с белком zeste в регуляции вкспрессии гена white и. возможно выполняют сходные функции.

Табл. 12. Взаимодействие между мутациями в локусах

enhancers of yellow и zeste.

Аллели е(у)1-6

,u1

е(у)1 е(у

е(у)4.5 или 6P1

Пигментация глаз (выражена в +) при 25°С (18°С)

zv77h

о h о ?

wt wt 9 (10) 8 (9)

wt wt 5 (5) 3 (3)

wt wt 8 (7) 4 (3)

wt wt 4 (4) 3 (3)

wt wt 9 (10) 8 (9)

zl Z°F z1. яР*. -Орб R1 zOp6R1

z0p6Ri^ о о о /zX о

3 (3) wt(wt) 3 (5) 6 (10) 10

3 (3) 9 19) 3 (3) 4 (7) 7

3 (3) 9 (9) 3 (3) 3 (5) 4

- - - -

Обозначения мутантных ш фенотипов: wt-дикий тип, (10+)-красные глаза с коричневыми точками, (9-»-)-коричневатые, (8+-)-коричневые, (7+)-светло-коричневые. (6+)-темно-оранжевые, (5+)-оранжевые, (4+-)-оранхево-желтые, (3+)-желтые, (2+)-бледно желтые, (1+)-желтоватые, (О)-белые глаза, или нулевой фенотип. Жирными цифрами обозначены случаи, когда е(у) мутации влияют на экспрессию yellow.

Далее был. проведен анализ взаимодействия нутаций е(у)1и' и еСу^з"' с другими z аллелями, которые обладают более сильным действием на w фенотип, л', z0^36 (аминокислотные замены, влжякщио на специфичность действия белка zestej и ¡РР^^ (подученный нами частичный ревертант мутации . Мутации е(у)1и1 и е(у)Зи

усиливают действие z-мутацнй, но, поскольку последние часто сами сильно подавляют экспрессию white, эффект не всегда сильно вырахен. Дело в том, что никакие комбинации не снижают экспрессию white ниже 3+ (желтые глаза). Остаточный уровень экспрессии зависит от последовательностей ДНК, расположенных рядом с промотором гена white, причем на него не влияет белок zeste. Наиболее сильно проявляется взаимодействие двух генов в случае аллеля. При

этом аллель е(у)Зи' усиливает w фенотип в большей мере, чем efyj?u' (табл. 12).

В комбинациях с zv77tl мутация е(у)Зи1 проявляет доминантное действие. е(у) мутации являются рецессивными. Мы попытались

выяснить, не будет ли введение мутации в локусе zeste делать их доминантными. Чтобы усилить эффект были использованы, кроме аллеля, также гетерозиготы по локусу white. Оказалось, что в комбинации с zu777i мутация е(у)Зи1 обладает довольно выраженным доминантным эффектом. У мутации е(у)1и' доминантное действие не проявляется (Табл. 13)-

Таким образом, видимо даже незначительное снижение количества белка е(у)3 ведет к появлению видимого эффекта.

Белки е(у) 1 и е(у)3 вероятно связывается с ДНК в местах отличных от мест связывания белка zeste. Возникает вопрос, связываются ли

продукты генов е(у)1. 2 m 3 непосредственно с теми же регуляторными районами ДНК, что и белок zeste. Для ответа на вопрос проводили опыты на ш аллелях, имеющих делеции или жнсерции в местах связывания белка zeste, т.е. в области энхансера- Мутация ш3^' возникла в результате инсерции мобильного элемента roo (или В104) в зону энхансера. При этом произошло разрушение сайта связывания zeste в районе энхансера. Нутации w3^ и ш3^ представляют собою делециц сайта связывания белка zeste и части энхансера. Поскольку во всех- случаях часть энхансера сохранена, экспрессия white снижается только до 6+.

Любые z мутации естественно не оказывают никакого влияния на эти ш аллели. В то же время, мутации е(у)1и^ и е(у)Зи' снижают

Табл. 13. Доминантное действие мутации е(у)Зи^ в комбинации

Табл. 14. Действие мутаций в локусах е(у)1 и е(у)3 на ш аллели, лишенные сайтов связывания белка zeste.

Аллели white Пигментация глаз при 25°С (18°С)

+/+|е(у)1/+ е(у)3/+

ш+/ш+ ша,/ш+ wbf/w+ 8 8 6 8 8 5 6 6 4

Обозначения те же, что в табл. 12.

Нутации в локусах е(у)1, е(у)3 или z Пигментация глаз при 25°С у самок

wsp1 шзрг wsp4

+ Любой z аллель e(y)iu1 e(y)3u1 6 6 6 6 6 6 2 3 3 3 4 5

Обозначения - те же, что в табл. 12.

экспрессию white в ш3Р аллелях вплоть до 3+ (Табл. 14) Исключением является комбинация - е(у)1и^, где более сильное подавление

экспрессии зависит, очевидно, от дополнительного действия roo.

Таким образом, белки е(у)1 and е(у)3 действуют независимо от белка zeste и имеют, вероятно, собственные места связывания с ДНК, расположенные недалеко от мест связывания белка zeste. Действие мутации еСу^з"' значительно менее выражено, чем таковое для e(y)1u1 аллеля, особенно в случае w3^ аллеля, хотя обычно имеет место обратная ситуация (см. предыдущие разделы). Это можно объяснить, если допустить, что делеция ш3^ также частично разрушает сайт связывания белка е(у)3, но не е(у)1. Можно с большой долей вероятности считать, что белки е(у)1 и е(у)3 обладают теми же функциями в организации взаимодействия между внхансером и промотором, что и белок zeste, но действуют независимо, связываясь с другими последовательностями ДНК.

Белки е(у) 1, 2 и 3 относятся к одному семейству необходимых, но взаимно заменяемых белков. Для дальнейшего выяснения значимости белков е(у)1, 2 и 3 изучено совместное действие мутаций в двух локусах внхансеров yellow. Оказалось, что две комбинации e(y)1u1—e(y)3?i1 и е(у_)2"'- e(y)3u1 полностью леталъны. Самцы с генотипом efyjíu'-efy)2u' имеют очень низкую жизнеспособность и стерильны. Кроме того, они имеют 'многочисленные морфологические дефекты. Наконец, мутация е(у)1и^ резко усиливает все фенотипические изменения, вызванные аллелем е(у.)2^'- Следовательно, белковые продукты трех генов е(у) выполняют важные общие функции в

регуляции экспрессии генов. При этом белки взаимо заменяемы и, таким образом, вероятно, относятся к одному и тому же семейству.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты работы легли в основу целого ряда исследований, ведущихся как в группе автора, так и в других лабораториях-

В Институте биологии гена РАН ведутся работы по клонированию и молекулярному изучению генов е(у)1. е(у)2 и е(у)3. Два из них, е(у)2 и е(у)1, ухе проклонированы, определены их нуклеотидные последовательности и выведены аминокислотные последовательности кодируемых белков. Оказалось, что белок е(у)1 это TAF-40, фактор, связывающий сидящие на промоторе белки ТВР с белками-активаторами на энхансерах. Следовательно, впервые, открываются возможности изучения in vivo роли ТАР белков. е(у)1 - новый белок без очевидных гомологий с известными. Ведется работа по их наработке и изучению взаимодействия е(у)1 с ДНК (А. Солдатов, Е- Набирочкина и П. Георгиев, готовится к печати). Установлена роль е(у) генов в регуляции работы ряда других генов (P. Georgiev et al., in press).

В лаборатории В. Корсеса (Университет Дхонса Хопкинса, Балтимор, США) совместно с Институтом биологии гена проведено клонирование и изучение гена mod(mcig4) на полученных нами линиях (Т. Gerasimova et аХ., 1995)- В совместной работе этих двух Институтов осуществлено также клонирование обнаруженного в супернестабильной системе нового гомеотического гена lawc (С. Петрук, О. Симонова, А- Солдатов и Т. Герасимова, не опублик-).

Дальнейшие исследования супер-нестабильных мутаций позволило обнаружить феномен двойной супер-нестабильности у двух рядом р а сполохе иных локусов, yellow и scute. Молекулярный анализ этой системы позволил установить механизмы захвата геномных последовательностей химерным элементом за счет инверсий и генной конверсии, а также продемонстрировать роль белков zeste, е(у)1, е(у)2 и е(у)3 в определении специфичности внутри-хромосомной рекомбинации (P. Georgiev et al. 1996, submitted).

Недавно в нашей группе на одной из линий, дрозофилы, также полученной при исследовании явления супер-нестабильности, обнаружен феномен сверх-дальних взаимодействий (на мегабазном уровне), участвующих в контроле транскрипции (не опублик-).

Таким образом, описанные в диссертации исследования положили начало новому направлению, изучению не-традиционннх факторов контроля генетических процессов и кодирующих их генов.

выводы

1. Разработана система продленной нестабильности, возникающая после скрещивания линий y^scE"i/iaG и FU4. В ней происходят активные перемещения нового мобильного элемента ретровирусного типа, названного Сталкером. По ряду параметров она отличается от известных систем нестабильности: перемещения Сталкера происходят в течение десятков поколений, индукция транспозиций не зависит от направления скрещиваний.

2. В системе с продленной нестабильностью транспозиции и вызванный ими мутагенез носят сайт-специфический характер. В ней выявлен и охарактеризован ряд новых генов, в частности генов, белковые продукты которых участвуют в контроле транскрипции. Среди них: modifier of ia3g4; enhancers of yellow, 1-6-, suppressor of scute и другие.

3. Разработана система получения супер-нестабильных мутаций в разных лакусах путем индукции Р-Ц дисгенеза в линиях с продленной нестабильностью. Супер-нестабильные мутации в локусах ocelliless. white и yellow детально охарактеризованы, и показано, что для них типично многообразие возникающих аллелей, наличие обратимых мутационных переходов, возникновение новых супер-нестабильных и стабилизированных производных.

4. На примере локуса yellow показано, что супер-нестабильные мутации вызваны химерными инсерциями, состоящими из двух идентичных дефектных копий Р элемента и заключенных . между ними геномных последовательностей, которые происходят из одного или разных мест X хромосомы. Набор геномных последовательностей может меняться.

5. Мутагенез в супер-нестабильных аллелях происходит за счет инверсий и делеций как во внутренних областях химерной инсерции, так и в Р элементах. Делении в Р элементах ведут к стабилизации аллелей. Супер-нестабильвость сохраняется при инверсиях и изменениях в элементе X. Многообразие мутационных событий обуславливает разнообразие фенотипов.

6. Установлено, что продукт одного из генов, обнаруженных в системе продленной нестабильности, белок пюЛ(1н1|»Л), образует комплекс с белком зи(Ни), который, как известно, связывается с знхансером мдг4. Этот комплекс подавляет транскрипцию путем инсуляции. Удаление из него белка тсх1(пб§4) нарушает инсуляцию. При этом появляется прямое ингабируицее действие белка зи(Нл) на некоторые промоторы. Последний эффект зависит от С-концевого ацидного домена белка еи(Нда), тогда как его Я-концевой ацидный

тосЦпк^)-

7. Мутации в гене тпсх1(т^4) .вызывают блок позитивной трансвекции- Кроне того, они вызывают новый феномен, негативную трансвекцию, т.е. транс-инактивацию гена уеНсю знхансером мдг4, расположенным на гомологичной хромосоме. Таким образом, один цис-регулнторный элемент может одновременно блокировать два промотора, расположенных в двух гомологичных хромосомах.

8. На примере супер-нестабильных у-мутаций показано, что одни а те же белка, зи(Нл) и пкх1(в*1§4), связываясь с знхансером мдг4, могут вследствие присутствия ряда дополнительных регуляторных элементов резко менять свое влияние на экспрессию гена уеИспв, превращаясь из ингибиторов в активаторы и наоборот. Выявлены элементы геномной ДНК, отвечающие за некоторое из таких изменений.

9. Три новых гена, также полученные в системе с продленной аестебильносты», е(у)1. е(у)2 и е(у)3. согласно генетическим цанным, участвуют в организации дистанционных взаимодействий в хромосомах. Их мутации резко усиливают действие нулевых гезХе аллелей на экспрессию локуса wh.ltе. Показано, что продукты этих генов принимают участие в образовании контактов между знхансером и промотором гена иЛ^е.

10. Таким образом, две разработанные системы дестабилизации генома сами по себе являются удобными моделями для изучения регуляции транскрипции, и одновременно в них удается выявить новые гены, участвующие в контроле транскрипции, в частности на уровне шсуляции и обеспечения дальних взаимодействий в хромосомах.

ПУБЛИКАЦИИ ПО TOJtE ДИССЕРТАЦИИ в российских журналах:

1. Георгиев П.Г., Симонова O.E., Герасимова Т.И.' 1988. Новый тип нестабильности генома у Drosoptitla melanogaster. Генетика Т.24. N-5, С.867-877- -

2. Георгиев П.Г., Герасимова Т.И. 1989- Выявление новых" генов, участвующих в транс-регуляции локуса yellow и МДГ-4 у Drosoptitla melanogaster. Генетика Т.25. N.8, С.1409-1419-

3- Георгиев II.IV 1990. Взаимодействие мутаций комплекса achaete-scute (AS-C) и et -аллеля локуса cut у дрозофилы. Генетика Т.26, К.8, С.1523-1526. -

4- Георгиев П.Г., Елагин В.А. 1990. Супернестабильные системы у DrÖ3ophila melanogaster: анализ мутаций в локусе осеИИезз. Генетика Т-26, N.8, С-1416-1426.

Ь. Георгиев П.Г., Елагин В.А. 1990. Возникновение новых супернестабильных мутаций в линиях Drosoptitla melanogaster с исходной супернестабильностью в локусе осеИИезз. Генетика Т.26, N.9. С.1564-1572. -

6. Герасимова Т.И., Симонова О.Б., Георгиев П.Г., Киселев С.Л. 1990. Транспозиции нового мобильного элемента Сталкера в системе продленной нестабильности у Drosoptitla melanogaster. Докл. АН СССР, Т.310, N.6, С-1474-1479- ---

7. Георгиев П.Г., Герасимова Т.И.- 1990. Генетический анализ новых мутаций, влияющих на фенотипическое проявление аллелей комплекса achaete-scute у Drosoptitla melanogaster. Генетика Т.26, N-7, С.1221-1229- ~

8. Георгиев П.Г. 1990. Получение супернестабильных мутаций у дрозофилы после индукции Р-Н гибридного дисгенеза в линиях, , содержащих мобильный Сталкер- Докл. АН СССР, Т.310, N.6, С.1470-1474.

9- Ладвищенко А.Б., Могила В.А., Георгиев П.Г., Буфф Е.М., Симонова 0.Б., Герасимова Т.И- 1990. Супернестабильные системы у Drosoptitla melanogaster: анализ мутаций в локусах singed и cut. Генетика Т-26, N.26, С.1133-1143-

10. Симонова 0.Б., Кузин Б.А., Георгиев П.Г., Герасимова Т.И. 1992. Новая регуляторная мутация Dr030ph.ila melanogater. Генетика Т.28, N2, С.164-167- -

11. Крачинска Б., Георгиев П.Г., Лобанов А.П., Самарина О.П. 1992. .Молекулярный анализ супернестабильных мутаций в локусе yellow Drosaphila melanogaster. Генетика T.28, N3, С.13-23.

12. Георгиев П.Г., Елагин Б.А., Буфф Е-М- 1992. Свойства, супернестабильных мутаций в локусе yellow Drosaphila melanogaster. Генетика Т.28, N4, С.98-107. !

1i- Георгиев П.Г., Елагин В.А., Козицина М.В. 1992. Генетический анализ влияния мутаций в локусах suppressor of Hairy owing и modifier of mdg4 на фенотипическое проявления супернестабильных аллелей в локусе yellow. Генетика Т.28, N.8, С.69-74-

14- Георгиев П.Г., Козицина vi.В.' 1992. Влияние мутаций в генах suCBw) и mod(tnäg4) на трансвекцию между аллелями локуса yellow у Dr030phila melanogaster. Генетика T.28. N.9, С.66-74-

15- Георгиев П.Г., Абрамова Н-А- 1992. Новые гены, • взаимодействующие с геном zeste у 'Drosaphila melanogaster. Генетика Т.28, N.10, С.67-74-

16. Козипына М.В., Георгиев П.Г. 1992. Получение и анализ новых мутаций гена mod(mûg4) у Drosaphila melanogaster. Генетика Т.28, N.10, С.75-82.

17- Козицина М-В-, Абрамова Н.А., Георгиев П.Г. 1992.

Взаимодействие генов е(у)1 и е(у)3 с геном yellow у Vrosoptilla melanogaster. Генетика Т.28. N.11, С.59-67-

18. Георгиев II.Г., Козицина Н-В. 1993- Генетический анализ взаимодействия мутаций в двух генах, контролирующих экспрессию МДГ4. Генетика Т.29, N.8, С.1322-1344-

в международных журналах:

19- Georglev P.G., Gerasimova T.I. 1989- Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosopfiita melanogaster. Mol. Gen. Genet. V.220, P.121-126-

20. Georglev P.G., Kiselev iJ.L., Simonova O.B., Gerasimova T.I. 1990. A novel transposition system in Vrosoptilla melanogaster depending on the Stallter mobile genetic element. ЕЫВ0 J-, V-9, P-2037-2044-

21. Georglev P.G., Yelagin V. 1992. Super-unstable mutations associated with P-tt hybrid dysgenesis in Vrosoptilla melanogaster. Genetica, V-87, N.1, P.17-29.

'¿'¿. Georgiev P.G., Gerasimova T.I. 1992. Genes Involved in the development of bristles and hairs in Vrosoptilla melanogaster. Genetica, V.87, P.31-35.

Zi. Georglev P.G. 1994. Identification of mutations In three genes that interact with zeste in the control of white gene expression In Vrosoptilla melanogaster. Genetics, V.138, P.733-739-

24. Georgiev P.G., Corces V.G. 199b- The su(Hw) protein bound to gypsy sequences In one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V-92, P.5184-5188.

■¿b. Georgiev P7C.1 Kozycina M. 1996. Interaction between

suppressor of Ealry wing and modifier of mi3g4 gene products in transcription control. Genetics, V.140, in press.

Информация о работе

Георгиев, Павел Георгиевич
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.26

Автореферат

Похожие работы