Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ генов фотоавтотрофности цианобактерии Synechocystis sp. 6803

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ генов фотоавтотрофности цианобактерии Synechocystis sp. 6803"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИИСТИТУТ ОМЦЕЙ ГЕНЕТИКИ пм. Н. И. ВАВИЛОВА

На правах рукописи УДК 582.232.7:581.132:577.113:579.251

ГАДЖИЕВ АКИФ ГУСЕЙН оглы

ЮАЕКУАЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ ФОТОАВТОТРОФНОСТИ ЦИАНОБАКТЕРИИ ЗУМЕСНОСУЗПБ ер. 6803

03.00.15-ГЕНЕТИКА

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор,

член-корр. РАН С.В.Шестаков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В.Д.Филлипов

кандидат биологических наук В.М.Андрианов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Центр " Биоинженерия "

Защита состоится "-"- 1992 г. в - часов

на заседании специализированного Ученого совета Д002.49.01 при Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва, В-ззз, ул. Губкина, 3).

О диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН.

Автореферат разослан "-"- 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

Актуальность проблемы. Одним из актуальных вопросов современной биологии является изучение фундаментальных и тонких механизмов фотосинтеза - процесса, преобразующего солнечную энергию в хзашческую и обеспечивающего энергетические потребности живых организмов. Расшифровка механизмов фотосинтеза позволит разработать биотехнические системы эффективного использования солнечной энергии. В связи с этим большой интерес представляет исследование структурно-функциональной организации фотосинтетического аппарата. Одним из перспективных объектов генетического изучения оксигенного фотосинтеза являются цианобактерии. Во-первых, структура фотосинтетического аппарата цианобактерий и высших растений практически идентична. Во-вторых, прокариотический тип строения клетки, способность некоторых штвжюв к генетической трансформации делают возможным применение методов генетической инженерии к цианобактериям, что пока остается сложной проблемой для высших растений. Благодаря способности к фотогвтеротройному росту цианобактерия БупесПосувив вр.рсс 6803 может служить модельным объектом для получения фотосинтетических мутантов и клонирования генов фотосинтеза

В последние годы был достигнут значительный прогресс в изучении структурно-функциональной организации фотосистемы 11: выявлены и секвенированы гены, ответственные за функционирование реакционного центра и кислород-выдоляпке го комплекса. Определена полная нуклеотидн'ая последовательность хлоропластных ДНК табака, риса,ряда других растений

Важную роль в исследовании аппарата фотосинтеза играют генетические методы, позволяющие выделить гены, осуществить кх молекулярный анализ и с помощью метода сайт-направленного мутагенеза выяснить функциональное значение отдельных участков белковых продуктов ФС II. Однако не менее продуктивным является метод

малэкулярно-генетического анализа спонтанных или индуцированных мутантов. На основе фототипической комплементации Фотосинтатаческих мутантов могут быть выявлены гены, ответственные га различные компонента аппарата фотосинтеза.

Актуальной задачей остается исследование структурно -функциональной организации белков комплекса фотосистемыП. В частности, 'важно выяснить функциональную организацию цитохрома ЬБ69' ^ДЯЦего в реакционный центр «CII. ; Установлено, что кодирующие цитохроы ъ5бд гены рвЬВ и реъ? входят в один онеров, в котором также идентифицированы две открытые рамки считывания рем, и psbJ, функция которых еще не изучена. Неясным остается также вопрос о функциях ряда других peb-генов.

Ц?л)ь работы. Данная работа посвящена: I .Лолекулярвд- генетическому анализу группы фотосинтетических мутантов цианобактерии Sjmeohooyetio 6803 дефектных по генам рвъв и рвЪР фотосистемыП. 2.Клонированию и секвенированнв нового гена , контролирующего способность у цианобактерии к фотоавтотрофному росту. 3. Изучению экспрессии этого гена в клетках в.coli и выяснению наличия его гомологии с ядерной ДНК растений.

Научная новизна и практическая ценность. Определена природа мутаций у четырех фотосинтетических мутантов Synschocyatie 6803, с нарушениями в кластере генов psbsr. Выявлены функционально значимые участка и отдельные аминокислоты в продуктах генов реьв и рвы\ необходимые для функционирования фотосистемы II. Определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК Synechocyatia 6803, восстанавливающего фотосинтетическую активность у ФСГ- мутанта и не имеющего гомологии с известными генами фотосинтеза. Обнаружена открытая рамка . трансляции размером 326 аминокислотных остатков. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности данной рамки но имеют гомологии с известными белковыми и . генными

послбдомташкзетямй i ^.гласно швь data, base квиу-ршг)

на 1991 год). Показало, что 0РС326 является транскрибируемым ln títo геном. Обнаружены гомологичные 0РС326 последовательности в ядерной ДНК ржи. Эти данные дают возможность осуществить поиск аналогичного гена у высших растений. Проведена экспрессия гена 0РС326 в клетках Б.coli. Получен белковый продукт 0РС326, который может быть использован для иммунохимического анализа продукта данного гена . Объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литератур«.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали бактериологически чистую культуру дикого типа Synechocyetie ер, PCO 6803 из коллекции Пастеровского института ( Франция ), а также штаюш Е.coll JMI09 ( recAl endàl gyr96 thl" hadRl7 eupE44 relAl Г . F/traD36 proAB+ laglg Z- М15/ ) И MH1 ( araD139, lacX74, galU, galK, her", hme+, etrA ).

Выделение плазмидной ДНК из В', col 1 а также ее дальнейшую обработку 'рестриктазами. ДНК-лигэтой, щелочной фосфвтазой, электрофоретический анализ и элюцию фрагментов ДНК, перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры, мечение ДНК. зондов методом "рассеянного" праймирования и 5'- кинирования, блот - гибридизацию проводили по общепринятым методикам ( Маниатис и др., 1984). Секвенирование ДНК проводили по методу Сенгера. Ферменты получены из НПО "Фермент". ( г.Вильнюс ).

Выделение препарата ДНК ' из цианобактерии Synechocyetis 6803 проводили по методу ( Crigorieva, Sheatakov, 1982' .Ядерную и хлоропластную ДНК из проростков ржи выделяли по стандартным методикам ( Гло'вер, 1988).

В целях выделения тотальной РНК к осажденным клеткам цианобактерии добавляли ратвор I ( 200 мМ Tri'a-HCL pH 8,0; 20 мМ

ЭДТА; 20 мЫ азида натрия ). Суспензию центрифугировали при 6000 оО/мин. Осадок ресуспендировали в растворе 2 ( 8% сахароза; 5* Triton Х-100; б мМ ЭЛТА; 50 мМ Trio-HCL рН7 ) дважды далротеиниэировали смесью фенол-хлороформ ( 1:1 ). Верхнюю фазу наслаивали на градиент плотности CaCL и центрифугировали 90 минут при 260000g. Содержащий РНК осадок растворяли в O.OIM Trie-HCL рН7,б. Поскольку метод дает относительно низкий выход РНК мы ввели ряд методических модификаций. Клетки обрабатывали в течении 20 минут при комнатной температуре раствором stet, содержащим лизоцим и затем & минут 10% раствором додецилсульфата натрия. Лизат депротешшзировали смесью фенол-хлороформ и сушрнатант наслаивали на градиент плотности CaCL. Этот метод позволил увеличить выход РНК в несколько раз.

Активирование сефарозы ВгСй, пришивку к ней IgQ, а также аффинную хроматографию с использованием полученного носителя, проводили по стандартной методике описанной в каталоге фирмы Pharmacia за 1988 г. ,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Н. Анализ природа генетических повреждений у рвЪЕР мутантов

цианобактерии Synochocyetie 6803. II.I Конструирование мини-банков ДНК мутантних штаммов.

Для работы использовали дефектные по рвЬЕР-генаы мутанты, полученные на кафедре генетики и селекции МГУ. Характеристика мутантных штаммов Synechooyatle 6803 приведена в табл.1. Клетки штамма дикого типа, выращенные фотогетеротрофно, активно выделяют 02 в реакции Хилла, тогда как уровень выделения 02 У ФС~- мутантов значительно ниже, что свидетельствует о нарушении фотосинтетического переноса электронов в ФСП.

С целью выяснения молекулярной природы повреждений мы определили нуклеотидную последовательность выделенных из мутантов

фрагментов ДНК, содержащих рвЬЕРЫ кластер. Для этого били сконструированы мини - банки хромосомной ДНК мутантных штаммов БупесНосувНв 6803.

Таблица I. Свойства СО - мутантов Syneehocyetis 6803

Штамм Время генерации Выделение 0, Ф695

Фото-трофия Фото- гетеро трофия мкм/мг Хл/час

дикий тип 18 20 19.3 +

SK9 нет роста 20 0.8 -

SK7 нет роста 18 I

NF8 нет роста 20 0.5 -

N73 нет роста 19 0.7 -

ф695 ~ надичие ™кэ флуоресценшш хлорофилла (-77°К) при 695 нм, характеризующего активность фотосистемы II.

Ранее ЬСтанбековой (1992 г.), было показано, что.рвЬЕР кластер локализован в Smai - EcoRi. фрагменте хромосомной ДНК размером 2,1 т.п.н. Поэтому мы обрабатывали хромосомную ДНК мутантных штаммов эндонуклеазачи Smai - EcoRi и проводили электрофоретическое разделение образупцихся фрагментов ДНК в 0,6» легкоплавкой агарозе. Элюированные фрагменты размером 1,9 т.п.н.- 2,3 т.п.н. лигировали с вектором FUC19, обработанным эндонуклеазами Smai - EcoRi и щело.чной бактериальной фосфатазой. Продуктами лигирования трансформировали компетентную культуру клеток E.coli JU 109 и отбирали клоны, устойчивые к ампициллину.

Полученные из клэток мутантов !Л?3, NF8, SK7, SK9 клонотеки содержали каждая около 1000 клонов.

¿та! ^^ ^ ^КНеТ_

Рис.1 рестрикционная карта фрагмента 2,1 т.п.н..

1,2,3,4,5,6- номера синтезированных олигонуклеотидов. вта1, АСС1, КЪв1, ЕсоЯ1 - 9НДОНуклвазЫ.

11.2 идентификация плазмид, содержащих кластер генов рвЬЕРЫ.

С цальв идентификации клонов , содержащих рэкомбинштшо шшзмкди о кластером генов pabKP, проводила гшзридазащш in Bitu о р32-мвчэннымн олигояуклеоташыми зондами I н 2 ( рис п

I

Бонда синтезировали . на основании данных нуклеотидной последовательности рвЬЕ? кластера из иташа дикого типа Byneohocyotio 6803 (Pakraoi at el., 1988). 8онд ( включал последовательность в началэ гена рвЪВ, а зонд 2 содержал последовательность конца гена рвы». По результатам гибридизации отбирали те клоны, которые давали сигналы о обоими зондами. Для каждого из мутантов было получено не менее десяти таких клонов. Выделенные рвкомбшвнтные плазмиды обрабатывали эндонуклеаземи EcoRi-Hindi II и подвергали электрофореточескому разделению в 0,6 % агйрозном геле. Текши образом было установлено, что рекомбинантные плазмиды содержат вставки размером 2,1 т.п.н., что соответствовало ожидаемым размерам EcoRi-6mai фрагмента хромосомной ДНК, содержащего рвЬЕР гены.

11.3 Опред0ле1ше нуклеотидной последовательности мутантных генов рвЬВ и рвЬР.

Для определения нуклеотидной последовательности мутантаых генов рвЬЕ и рвьр была синтезированы четыре олигонуклеотидаых зонда ( зонды 3,4,5,6 рис.1). Сиквенс проводили по методу Сенгера на плазмиде рис19 очищенной в градиенте плотности OeOI. На рисунка 2 показаны «результаты сиквенса мутантных генов рвЬВ и peb?.

У мутанта SK9 выявлена делеция триплета ТТТ, кодирующего аминокислоту фенил ал анин в положении 37 в гене рвЬВ. В гене рвьв обнаружена замена пролина на лейцин у мутанта к?3 в результате транзиции С - Т. У мутантов МР8 hsk? мутации лежат в гене рвьг: у мутанта NP8 выявлена замена валила на фенилаланин в 30 положении

30 40

тто ТТТ АТТ ест ССТ ТСС ТТЗ ТТТ втс АСС АСС

д Ьеи Р1ш Не А1а С1у Тгр Ьеи Рйе Уа1 Бег ТЛг

БК9 РзЬЕ

30 39

Ы ТТО ТТТ АТТ ССТ ССТ ТСС ТТС СТО АСС АСС

Ьеи РЬе 11е А1а С1у Тгр Ьеи 7а1 Бег Ни»

N78

60 70

Д ССТ САА САС ТТО ССС АТТ СТС САС САА ССС ТАС

Агв С1п С1и Ьеи Рго Не Ьеи С1л С1и Аге Туг №3 раЬЕ

60 70

и ССТ САА САО ТТС СТО АТТ СТО САС САА ССС ТАС

Аг8 С1п С1и Ьеи Ьеи Но Ьеи Ып С1и Агв Туг

26 36

ОСС СТО ССС ТСТ СТС ТТС ТТТ СТО ССС ССС АТС А1а Уа1 Рго Бег Уа1 РЬе РЬе Уа1 С1у А1а 11е

26 36

ССС СТС ССС ТСТ ТТС ТТС ТТТ СТС КС ССС АТС А1а Уа1 Рго Бег РЬе РЬе РИе Уа1 С1у А1а Не

МБР

рвЬР

Рио .2 Локализация мутации в генах рвьв и рвЬР у мутантов БК9 ; НГЗ, кре.д-нуклеотидная последовательность участка дикой копии гена. II - ыуклеотидная последовательность мутантного участеа этого же гена.

( рис.2) в результате замены а на т. а у мутанта 8К7 произошел сдвиг рамка в результате вставки аденкна отт - аАТТ в положении 22.

Ранее была изучена ( 8Ь.ик1а, Stanbela>va, ВЬевгакоу, Ракгаа!, 1992) мутация, Срб обусловленная возникновением стоп-кодона в результате замены Т на А в 245 положении гена реЪЕ. В клетках втого мутанта отсутствует цитохром ь&б9, также как и белок о2, хотя другие белки фотосистемы И 01, ср4Э, ор47 присутствуют в тилакоидной мембране. На основании этих данных было высказано предположение о том, что цитохром Ь55д участвует в стабилизации белка 02 и циклическом переносе электронов.

Бели анализировать исследованные в нашей работе мутации в раЬ? гене в отношении этих двух функций цйтохрома ъББ9,то можно сделать следующие предположения:

Замена валина на фенилаланин в продукте гена рвЬР у мутанта вероятно,затрагивает трансмембранный сегмент и приводит к нарушению укладки полипептида в мембране и,в конечном счете, к утрате цйтохрома ьБ59 . К потере обеих функций цйтохрома ьБбд приводит и мутация , выявленная у мутанта БК7.

У мутантов и БК9 мутации локализованы в гене рвЬЕ,

кодирующем большую субъединицу . цйтохрома Ь^д. Изучение природы мутации НРЗ указывает на то, что пролин в положении 63 участвует в функционировании цйтохрома ЬБ59. Анализ спектра низкотемпературной флуоресценции клеток мутанта БК9 свидетельствует об отсутствие у него функции фотосистемыП. По-видимому, делеция кодона ТТТ, ответственного за включение фенилаланина ( положительно заряженной аминокислоты )5 может привести к изменению пространственной структуры С-концевого участка продукта гена рвЬВ, в результате чего нарушается укладка белка в мембране. Не исключено также, что фенилаланин в положении 37 играет важную роль в функционировании цйтохрома ъБбд.

Можно предполагать, что утрата фенил аланина у мутанта 8К9 и

замена пралина на лейцин у мутанта N73, приходящиеся на С-концевую область продукта гена рвЬЕ, связаны о нарушением у цитохроыа b6gC| функции переноса электронов. .

III. Ыолекулярно-генетический анализ гена, контролирующего способность к фотоавтотрофюму росту.

IИ.I Определение нуклеотидаой последовательности фрагмента ДНК трансформирующего мутант SKI8. В работе Г. Станбековой (1991г) был выделен дефектный по фотосинтезу мутант SKI8, способность которого к фотоавтотрофеоыу росту восстанавливалась при трансформации EaoRi -фрагментом (размером 1,4 т.п.н.) из геномного банка штамма дикого типа Synechocyetis 6803. Поскольку втот фрагмент не имеет гомологии с известными генами фотосистемы II было выдвинуто предположение, что у мутанта вк18 затронут ранее неизвестный ген, контролируиций способность к фотоавтотрофному росту. В целях идентификации этого гена нами была определена первичная структура фрагмента ДНК размером 1,4 т.п.я.. Стратегия секванирования приведена на рис.3. Внутри Еоой1- фрагмента было обнаружено два сайта для рестриктази Ара1. Субфрагменты размером 0,4 т.п.н. ( Ара1 -Ара1 ) и 0,8 т.п.н. (Ара1 -BCoRi). ngwm затупления концов были клонированы в вектор пиэшрю. В результате секвенирования внутри фрагмента размером 0,4 т.п.н. было обнаругэно два сайта для эндонуклеазы ВврШI, разделенные 78 нуклеотидами. После определения нуклеотидаой последовательности фрагмента размером 0,3 т.п.н. (EcoRl-BspMII ) был получен полный сиквенс BcoRi-фрагмента размером 1411 п.н.Д'рис 4).

На основе компьютерного анализа по программа " fcgene " в нуклеотидаой последовательности фрагмента 141I п.н. были обнаружены четыре открытых рамки считывания с размерами 978, 468, 168 и 78 пер

I

II

нуклеотидов. Для выявления искомого гена была проведена работа по более точному определению района локализации мутации и установлено, что мутант SKI8 трансформируется фрагментами EaoRi-BspUi 1.(310 п.н.) и Ара1-Ара1 ( 460 п.н. ). Таким образом, мутация локализована в фрагменте Ара1-ВарМ1 размером 161 п.н..О этим участком перекрывается только одна открытая рамка считывания ОРС 326. Сравнение нуклеотидной последовательности 0PC32S с банком генов ДНК за I991 год ( embl oenbank data base ) не обнаружило гомологии ни с одним из ранее клонированных генов. Следовательно, у мутанта SKI8 нарушен новый, ранее не идентефицированный ген , контролирующий, процесс фотосинтеза.

.111.2 Клонирование и секвенирование мутантного гена 0РС326

С целью идентификации мутации в штамме SK18 нами совместно с Г.Станбековой было осуществлено клонирование и секвенирование фрагмента ДНК, содержащего мутантную копию ОРС 326. Был выделен мини - банк генов.хромосомной ДНК в плазмиде PUCI9 и клонирован фрагмент хромосомной ДНК размером !,4 т.п.н. с мутантной копией 0РС326. Для точного определения природы мутации был проклонирован субфрагмент 0,46 т.п.н., полученный после обработки эндонуклеазой Ара1. При сравнении идентифицированной последовательности мутантного гена с сиквенсом этого же участка у штамма дикого типа была обнаружена замена о на А в положении 177 (рис. 5), ведущая к образованию стоп-кодона. Таким образом, в- результате данной мутации происходит остановка синтеза полипептидной цепи продукта 0РС326 после первых 27 аминокислотных' остатков.

Рис.3 Рэстрикционкый анализ фрагмента хромосомной ДНК Вупбс1юсув1;1в 6803 трансформирующего мутант ВК18. Стрелками указаны направление и протяженность секвенированных участков.

ОРС 84

ОРС156

ОРС 326

,ОРС,28

ЕсоР! Ара! ВэрМН Ара1 ЕсоР1

I ' ' Ъшшшяшшш1шшшштшштшт I 1/11

1411 П. Н.

ЕсоЖ ВэрМИ

310 п.н. Ара! Ара!

460 п.н.

1 5' ОААТТСААаАССТАСАСАААТАОСТТАААЛТаАаААССТМСТОАаАААГТААСТААОТ'Г

оирэгб

МОКНТНЙРЯ б1 ТТСТАААТТТТООТТТОСаааСОСаАССОТСАСОАТОаоТАААССОАСААОССООТТГТа АЬАРЗЬЬМОАЬХУЬОНТРЗА 121 ОССТТТАОСТТТТТСТТТОСТОАТОООООСССГОАИ'ТАТСТСООСААТАСАССОТСООС

ъартбесзкъъх/оз ii? и ъ у n о э 181 СТТаОСТТТСАССОАООААСААААОСТАСТСТТОСААТССТСССИ"РТаОТСААССААТС УЬВЕТРЫНОНЯЯЬЬНЕКТУК 241 статстсоатоааюстттаассатсааааттостоостаттссааааоааотасаттаа НРЬНКЯЕЕТТША1ЕБМЬАТЬ 301 АСОТССССТССООААССОааААСАААСОТАСАСООСОАТСОААОАААТОСТСООТАСССТ сЕРРтнььнРЕОУаньаутт 361 ООАТОААСОСТтсОСССТТАСТОСОТССООААОАСТАСООСААТСТСОАООТОАССАС ТОЕЬЗОУОЬ01111НРЕТКаЬ 421 ОАСТОСТОАОСРАТСаСОСОТАСОТСТаСАААТСААСАТСААСССТОАААСОААСОАаТТ

ЕХЫАРЬАОБРАЕЕАаЬОРНО 481 АОАААТТАТСаССССССТСаСССаИССССТССССАОаАССССОООСТОСААССССАТаА

а-11|А1осуп1атьаьввААА

541 ОСАААТТТТСОСОАТСаАСООТСТАОАТАСССАААСССТаАССТТАОАСОААОСАОСаОО окр156

ЕМНОРКИТКУБЬЕТЬБАОТЕ 601 саоаатосоосссссаааааасасоаааотттссстсоаааттстотсаосооооассоа ур0вртьтн0ь18ь5руаа0 661 АОТАОСссААаитттАсс^аАстсваслвттиггтссотаАвтссаа'гавсаасаоА

ь б v б и р с08уау1йьз<1р8а 721 АТТСОАССАТТОССОСССАООТСААФСаоТОаатаАСАШТСОССТСАОТОААТТТАОТОС

наукеуанаьн<}1«ее<за а б б 781 саатосстатааасааотаосссасостстосатсаасттааооааоаооососсаасоо

у I ь т> ъ

841 ТТАТАТСТТООАгаТОСОТААСААОССОаСТОООТТАСТССАООСТССТАТТОАСАТТОО • . I .К Э К И.Ь'Ь а Р Р К 8 * А Р I Б М А ИЬЯЬРЕЗТХУУТУ. ЯЙОНОРК 901 ТСОаТТСТаСТТАССООАААССАССАТТОТСТАСАСССГТААТСОССАААОССААСССАА КМНИОЗЬУМ

01?р28

ЕКРЗЬР'ИОЕЗАТВйРРОаУО 961 СОААААОТТТТСАСТОССАААТООАОАААОСОСОАССОАТСаСССОТТТаОТООТОТТОО.

(5Р0УС(30(ЗН11Р8!13?А(} * 1021 ТСМССАООТТАСТСССАОТаССАОСОАААТТТТАаССаСАаСТТТОСАаОАТААТСАОС

Рис.4. Нуклеотиднвя последовательность фрагмента хромосомной ДНК Бупес1юсувив 6803, трансформирующего мутант БК18 к фотоавтотроф-ности.

"í 4

Д TAT СТО ООО ААТ АСА ООО ТОО ООО ТТО GOT ТТО А00

Туг Leu Oly Авп Thr Pro Ser Ala Leu Ala Phe Thr

y TAT ОТО ООО ААТ ACA O00 TAO 000 ТТО ОСТ ТТО АОО

Туг Leu Gly Авп Thr Pro »

рис Б. Нуклеотидная последовательность учаотка гена 0РС326 из клеток втамма дикого типа (Д) и мутанта 8KI8 (U).

II 1.3 Гибридизация фрагмента ДИК,содержащего ОРС 326 о тотальной и хлоропластной ДНК ржи.

Поскольку фотосинтетический аппарат цианобактерий сходен о таковым у высших растений мы предприняли попытку выяснить наличие гомологии гена 0РС326 о хлоропластной и ядерной ДНК ржи. Хлорогшастную и ядерную ДНК обрабатывали эндонуклеазами • EooRi -Hindi 11 и фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 0.6S агарозном геле. Затем проводили блот - гибридизацию с Р32 меченным фрагментом ДНК цианобактерии, содержащим 0РС326. Результаты приведены на рисунке 6. На радиоавтографе обнаруживаются две полосы гибридизации: одна на уровне фрагмента размером 16 т.п.н. другая на уровне фрагмента размером 2 т.п.н.. С хлоропластной ДНК ржи положительных сигналов гибридизации не обнаружено, что подтверждает отсутствие гомологии, о выявленной с помощью комьютерного анализа последовательностью 0РС326. Таким образом, могло полагать, что в ядерной ДНК растений имеется последовательность гомологичная гену 0РС326, обнаруженному в геноме цианобактерии SynechocyBtie 6803.

III.4 Гибридизация фрагмента ДНК, содержащего 0РС326, с тотальной РНК Synechocyetis 6803

С целью выяснения вопроса о том, экспрессируется ли 0РС326 ь клетках цианобактерий, мы исследовали возможность Нозерн блот-гибридизации фрагмента ДНК, содержащего 0PC32S, с тотальной

рио.6 рио.7

Pao б Блот-гибридизация ядерной и хлоропластной ДНК ржя, обработанных эндонуклеазами BooRl -Hindi 11, о фрагментом хромосомной ДНК Syxieohooyetlo 6803, содержащим 0РС326. а) Ядерная ДНК б) Хлоропластная ДНК в) Дик фага обработанная EcoRi-Hindi 11. г) Радиоавтограф

Рис.7 Блот-гибркдизация фрагмента Uli п.н., включающего ген рвХ1, с тотальной РНК из Synechocyetíb 6803. а) РНК, выделенная методом I. б) РНК, выделенная методом II. в) Радиоавтограф.

клеточной РНК из клеток Synechocystls 6803.

Тотальную клеточную РНК подвергали электрофоре тическом;/ разделению в формальдегидном агарозном-гело, осуществляли перенос на нитроцеллшозный фильтр и проводили гибридизацию о 32Р-мвченньм фрагментом хромосомной ДНК (1,4 т.п.н.), содержащим 0РС326. Результаты гибридизации приведены на рисунке 7 . Фрагмент 1,4 т.п.н. дает один положительный сигнал на уровне полосы, соответствующей молекуле размером около одной, тысячи оснований. РНК такого размера соответствует транскрипту 0РС326. Следовательно, можно предположить, что 0FC326 является геном, который транскрибируется в клетках synechocyetie 6803. Этот ген, кодирующий белок с молекулярной массой 32кД, был обозначен как ген рзХ1,

IV.1 Клонирование гена рвП в вектор экспрессии.

I

Для обнаружения продукта гена рвХ1 в клетках цианобактерии необходимо получить антитела к этому белку. С целью последующего получения препарата антител к продукту гена рвХ1 мы осуществили клонирование данного гена в векторе pucL2."i, который эксцрерсируется в клетках в.coli. Этот вектор был предоставлен нам из институте Биоорганической химии. Работа по клонированию была проведена в лаборатории белков светочувствительных систем под руководством профессора Абдулаева Н.Г.

В плазмиде pucL2.I имеется фрагмент, кодирувдий участок А белка, ответственный за связывание его с иммуноглобулином о (IgG), При этом образующийся полипептид содержит также и сигнальную последовательность, обеспечивающую секрецию химерного белка. В этой плазмиде между последовательностью, кодирующей А-белок и полилинкером находится последовательность, кодирующая пептид Aep-Aep-Aep-Lie- , которнй узнается специфической энтеропептидазой и

1ссг

ВсгпН! Мсо1 РэЯ ЕсоЩ БЫ Крп2Л

¡'щНШ Тод! ЕсоШ

фрагмент Клен&оа

ДНК

гюлимеразы I

ВатН1 Р&!1

ЕсоР1 БШ Крп2.1

ЕсоШ

кЕсоИ

ДНК лигага

ФогаТд

НтсИП БрЪ1

ХЬа1 Бта!

1ас 1

ВотН} РвИ

:соЯ1

Есо Ш |Рб»1 ГЕсоМ РэЯ Есо га

ТД ДНК

лигаза

Рис.8 Клонирование С-концевого Фрагмента гена рзХ1 ь экспрессирущия вектор РЦ012.1 .

расщепляется по связи Lia-x.

О целью получения химерного Л белка соеданеннного о продуктом гена рвХ1 фрагмент цианобактериальной ДНК EcoRi-E00RI ( размером 1411 п.н.) был обработан эндонуклеазой Tagi таким образом, чтобы получить недорестрицированный фрагмент размером 1,1 т.п.н., содержащий часть белка кодируемого геном реХ1.При помощи компьютерной программы ШASTIR было установлено i что отщепленная W-концэвая область белка раХ1 ( примерно 7-0 ^аминокислот) обладает очень слабыми антигенными свойствами. Образуемый legi конец. ДНК тушиш о помощью Кленовского фрагмента ДНК шшмеразы I, и клонировали а векторе PUCI9 по сайтам Бши-EcoRi .Цромэнуточкоэ кдокираваниа было предпринято о целью получения удобного оайта для клонирования . в плазмиду puoL2.I. без нарушения рамки считывания с белком А, что позволяет получить химерный белок.Схема клонирования приведена на рисунке 8 . Полученная в результате клонирования плазьшда была названа рЬ2рХ1.

IV,2 Получение химерного белка, содержащего участок продукта гена poll.

Полученным после литерования препаратом ДНК трансформировали компетентные клетки шташа шы E.coii и высевали на агаризованнув среду, содержащую ампициллин.Рекоыбинантныэ клоны отбирали на основе гкбридизиции in ei tu о фрагментом ДНК 1,1 т.п.н., меченным 32f. Клетки единичного клона подращивали в среде lb. В культуру добавляли изопропилтиогалактозид ( 200 мг) для индукции экспрессии Ъбо-промотора и инкубировали в течении 6 часов при температуре теплового шока"( 42°0) для облегчения секреции химерного белка. Клетки осаждали, а надосадочную жидкость, содержащую белок, пропускали через аСЙинную колонку с igG-сефарозой для очистки химерного белка. Белок влюиравади с колонки IM уксусной кислотой

с-• •;-г—«г—1

■ ^^ - ■ ь —

Рис. 9 Бкз-электрофорез химерного белка после очистки его на колонке с сефарозой. а) химерный белок после алвции на колонке. б) С-концевая область белка, кодируемого геном рвХ1 после отщепления А белка и рехрамотографга.

рн 3,8. Как показали результата эСв-влектрсфзроза, проведенного о препаратом, полученным посла хроматографии хююрный волок получается практически чистим и не нуждается б дальнойвай очистке ( рис.9 ). Суммарный выход химерного белка составлял около 10-15 мг. на лятр среда.

Выделенный химерный белок подвергали протеолизу знтеропептидазой, расщеплявдей связь Lie-a 1п, с отделенном А белка. Полный протеолиз наступал примерно после 16 часов инкубации. После протеолиза полученную фракции вновь наносили на колонку с lgO-сефарозой для того, чтобы получить фракцию белкового продукта гена рсХ1.( рио.9). Как видно из рисунка 9, в собранной фракции ирвсутствует только синтезированный большой фрагмент белка, кодируемого геном рвХ1. Этот белковый препарэт используется для получения антитела, предназначенного для иммунохимичэского

детектирования продукта гэна рвХ1 в клетках цианобактерий.

»

ВЫВОДЫ

1. Клонированы а секвеиированы фрагменты хромосомной Л11К Syneohocyetis 6803, .содержащие гены реЬЕР у четырех мутантов дефектных по фотосинтезу.

2. На основе молекулярного анализа мутантных генов рвЬЕ и рвър выявлены функционально значимые районы и отдельные аминокислота в болыаой я малой субъединицах цитохрома ь55д, необходимые для функционирования фотосистемы II.

3. Клонирован и секвенирован фрагмент хромосомной ДНК SynsohooyetiB 6803, восстанавливающий способность к фотоавтотрофному росту у мутанта SKI8. Обнаружена открытая рамка считывания 0РС326 ( ген рзХ1), кодирущая белок с мол .массой 32кД и не имеющая гомологии с известными генами фотосинтеза.

4. Мутация а гена paXi выражается заменой сврина в положении 28 на стоп-кодон.

б. Фрагмент хромосомной ДНК Synechocyatia 6803, содержащий рвХ1 глбридизуется с ядерной ДНК ржи.

6. Данные, по гибридизации фрагмента ДНК, содержащего геи раХ1 с тотальной РНК Synechocyatia 6803 свидетельствуют о том, что 0РСЗ:;6 экспрессируатся в клетках иианобактерий.

7. Осуществлена экспрессия участка гена paxi в клетках в.coli. Получен белковый продукт, который может быть 'использован для шмунохимического анализа ч продукта гена 0РС326 в клетках цианобактерий.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Elanstoya I.V., Krmakova 3., Stanbetova 0., Oadzier A., Brown Ы., Karbuaheva E.A., Bhahnabatyan L.Q., Cheanavlchene J.A., Bhestakov S., H Molecular-genetlo analysis of genes, encoding the proteins of photoeystem II in the cyanobadteriun Synechocyatie ep.poo 6803 Abstr. of Int. Вушр. on Photosynthesis and Photobiotechnology, Puehino, I99I, p.81

2. Sheatakov 8., Stanbelcora 0., OadzieT A., Xlanslcaya I.V.,

" Cloning and nucleotide seguenoe of gene controlling photoautofcrophy in the cyanobacteriua Synechocyatie ap.PCO 6800 " Ifolecular Microbiology, in press.

3. Гаджиев А.Г., Ермакова C.D., Еланская И.В., АОдуллаев Н.Г., Шестаков С,В., " Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК цианобактерии Synechocyetis ap.PCO 6803, восстанавливающего фотосинтетическую активность у мутанта по фотосинтезу" Тезисы

11 Всесоюзный симгозвук; • Теоретическая % пр^адяне соквк^а молекулярной биологии. Самарканд,"1991г.

4. Flanekaya I., Broim Н., Oadshisy i., KmaJcovu s., Stanbekova 0., Shentakov S. Moleoular analysis of genes involved In photosynthesis in cyanobaoteriitn auneehocyetis 6803. Abet. Workshop Irs PJar,' Molecular Biology and Biotechnology, Moscow, 1992.