Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ ДНК междиска политенных хромосом дрозофилы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ ДНК междиска политенных хромосом дрозофилы"

я

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Р Г Б 0 и Институт цитологии и генетики

На правах рукописи УДК 575.1:595.773.4

МОЛЕКУЛЯРГО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ДНК МЕЯЩИСКА ПОЛИТЕННЫХ ХРОМОСОМ ДРОЗОФИЛЫ.

Генетика - 03.00.15

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1994

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск

Научный руководитель - доктор биологических наук

И.Ф.Жимулев

Институт цитологии и генетики СО РАН. г.Новосибирск

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Л.В.Высоцкая,

Новосибирский государственный университет, г.Новосибирск

кандидат биологических наук с.с.Богачев

Институт цитологии и генетики СО РАН, Г.Новосибирск

Ведущее учреждение институт биологии развития

им. Н.К.Кольцова, РАН, г.Москва

Защита состоится "/^."января 1995г. на > ^ л ■У*'-* заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева,10.

С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

/

Автореферат разослан ¿-¡¿а^'СЛ 994г.

/ ' *

Ученый секретарь у

специализированного совета —

доктор биологических наук " А.Д.Груздев

Актуальность проблемы. Принципы структурно-функциональной организации интерфазных хромосом до сих пор во многом не понятны. Их изучение является одной из главных задач современной биологии. Политенные хромосомы двукрылых, которые рассматриваются в качестве модели интерфазной хромосомы, открывают большие возможности в этом направлении. Большие размеры хромосом и относительно высокая специфичность дискового рисунка позволяют легко идентифицировать отдельные хромосомы и их районы. Исследования на политенных хромосомах позволили достичь значительного прогресса в понимании генетической организации отдельных хромомеров (дисков) и особенностей их функционирования. Однако до сих пор почти ничего не известно о функциях межхромомеров (междисков). Роль междисков может быть определена в результате анализа их молекулярной организации. Однако малые размеры меас-дисков, низкое содержание ДНК в них и отсутствие адекватных методов не позволяют точно соотнести между собой молекулярные и цитологические данные для этих районов.

Метод Р-трансформации генома дрозофилы искусственно созданными фрагментами ДНК с известными молекулярно-генетическими характеристиками (Spradling, Rubin, 1982! Rubin, Spradling, 1983) В сочетании с электронно- микроскопическим (ЭМ)анализом трансформированных районов хромосом открывает новые возможности для решения вопросов структурно-функциональной организации полигенных хромосом. С использованием этого подхода была показана принципиальная возможность обнаружения новых морфологических структур, образованных материалом Р-транспозоков, и изучения их стуктурно- функциональных особенностей в составе хромосом (Semeshin et al., 1986). Учитывая эти факты', проблему точной привязки молекулярных и цитологических структур в районах междисков можно было бы решить следующим образом. С помощью ЭМ картирования трансформированных районов хромосом, выявить те из них, в которых встройка транспозона произошла в район междиска. Затем, используя молекулярные методы, клонировать ДНК междиска, прилегающую к встроенному фрагменту, и исследовать ее молекулярно-. генетическую организацию.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является клонирование и молекулярно-генетический анализ ДНК из района междиска. в связи с этим были поставлены следующие конкретные за-

дачи исследования:

1. Провести электронно-микроскопический (ЭМ) анализ трансформированных районов политенных хромосом и определить в них локализацию встроек Р-транспозонов.

2. Получить библиотеку геномных фрагментов ДНК одной из трансформированных линий мух, содержащей встройку транспозона в районе междиска.

3. Провести скрининг этой библиотеки с помощью меченых фрагментов ДНК транспозона для получения клонов, содержащих материал транспозона и прилежащего к нему междиска;

4. Определить нуклеотидную последовательность ДНК из района междиска и провести ее молекулярно- генетический анализ. Научная новизна. В настоящей работе впервые проведенно детальное ЭМ картирование 10 районов политенных хромосом слюнных желез гомозиготных линий ОгоБорЬИа ше1аподаз1ег, содержащих Р-транспозоны с определенными молекулярно-генетическими характеристиками. На основании результатов этого картирования было показано преимущественное встраивание транспозонов в районы междисков и предложен новый подход к клонированию ДНК из районов междисков. Впервые- клонирована и частично охарактеризована на молекулярно-генетическом уровне ДНК из района мекдиска 61С7/С8 хромосомы 3.

Практическая ценность. На основании результатов, полученных в данной" работе, предложен новый подход к клонированию ДНК из районов междисков, что имеет существенное значение для дальнейшего анализа структурно- функциональной организации интерфазных хромосом и эукариотического генома в целом. Апробация работы. Основные результаты данного исследования докладывались на 6-ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), 6-ом Всесоюзном совещании по генетике дрозофилы (Одесса, 1939), 10-м Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Гродно, 1990), 7-м Международном совещании "Молекулярная биология и биология развития дрозофилы" (Крит, Греция, 1990), 7-м Всесоюзном совещании "Структура и функции хромосом" (Пущино, 1991).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в пяти научных публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, которые содержат обзор литературы, описание материалов и методов, результаты и обсуждение, а также выводов и списка цитируемой литературы. Общий объем работы 142 страницы, 6 таблиц и 24 рисунка.

Материалы и методы Линии мух. Использованные линии мух описаны в нескольких статьях (Rubin, Spradling, 1983; Bonner et al.,1984; Hoffman, Corees, 1984, 1986; Simon et al., 1985).

Метод электронно-микроскопического картирования. Приготовление препаратов для ЭМ анализа проводили по методу, описанному в статье Семешина с соавторами (Семешин и др.. 1979). При ЭМ картировании районов политенных хромосом использовали правила, предложенные В.Ф.Семетиным (Семешин, Жимулев, 1989; Semeshin et al., 1989).

Геномные библиотеки и клоны. В работе была использована библиотека, приготовленная из геномной ДНК линии мух Oregoa-R, клонированной в фаговый вектор EMBL4 (предоставлена проф. Ф.Кафа-тосом). Геномные клоны генов актина и алкогольдегидрогеназы получены от проф. М.Эшбернера, клон гена white получен от проф. В.Пирротта.

Молекулярные методы. Все молекулярные методы, связанные с выделением и анализом нуклеиновых кислот, а также получением геномных библиотек выполняли,- в основном, по руководству Маниа-тиса и др. (Maniatis et al.. 1982).

Гибридизация in situ. Приготовление препаратов политенных хромосом слюнных желез и их гибридизацию с Немечеными ДНК выполняли по стандартным методикам (Gall, Paídae, 1971; Ather-ton. Gall. 1972).

Секвенирование JlffiC. Фрагменты ДНК были клонированы в плазмид-ном векторе pUCl8 и секвенированы по методу Максама-Гилберта (Maxam, Gilbert, 1980). Для анализа нуклеотидкых последовательностей использовали компьютерные программы context и repeat (Solovyev, Rogozin, 1986).

Результаты и обсуждение

1. Электронно-микроскопический анализ морфологических структур в трансформирование -районах политенных хромосом.

С помощью ЭМ была изучена морфология районов хромосом 10 трансформированных линий мух, гомозиготных по встройкам экзогенных фрагментов ДНК. Эти линии были получены в различных лабораториях США с использованием векторов, включащих ДНК Р-элемента, и содержат встройки Р-транспозонов в различных районах хромосом (Таблица 1).' При выполнении ЭМ экспериментов картирование исследуемых районов хромосом проводили согласно правил, предложенных В.Ф.Семешиным (Семешин, Жимулев, 1989; Seme-shin et al., 1989), где, кроме особенностей приготовления препаратов и анализа хромосом, учитывались также особенности естественного пуфообразования в изучаемых районах (Таблица 1).

Молекулярно-генетическая организация встроенных фрагментов ДНК приведена на Рис.1.

В результате проведенного ЭМ анализа было показано, что в трансформированных районах образуются новые морфологические структуры. Так, если гены, входящие в состав транспозонов, находятся в неактивном состоянии, в семи районах из десяти наблюдается образование новых тонких дисков. Толщина этих дисков прямо коррелирует с размерами встроенных конструкций (Таблица 2). При активации генов в части транспозонов, материал новых дисков-декомпаятизуется либо полностью, либо частично, в зависимости от их генетической организации. Кроме того, было отмечено удлинение мёвдисковых районов, прилежащих к новым дискам, по сравнению с этими же районами в хромосомах контрольных линий мух (Таблица 2). Одним из возможных объяснений этого феномена может быть декомпактизация ДНК Р-элемента, которая ограничивает по краям материал транспозонов. Известно, что полный Р-элемент и его дериваты могут постоянно транскрибироваться вй всех тканях и на всех стадиях развития дрозофилы (Laski et al., 1986). Их встраивание в геном может происходить в любой из двух возможных ориентаций (O'Hare, Rubin, 1983), но поскольку у этого элемента имеется собственный слабый промотор, то транскрипция идет только в одном направлении (Karess, Rubin, 1984; O'Kane, Gehring, 1987). Активность промотора зависит от

Таблица 1. Краткая характеристика трансформированных линий мух, использованных лля ЭМ анализа.

Линия мух Хромосома? район встпойки Р-вектор Литературный источник Пуффирование в районе встройки

АсШ1136^ hs82B Adh 3L;61C 3R;82B РП25.1 Bonner et al., 1984 а PS1-4 Нет на PSt-l0a

28Х-С 28X-F 28-term 2R;42F X: 1B 3R-.97A рб.1 Hoffman, Corcea,1984, 1986 Нет на PS1-100 б Слабое на PS1-10 0,(5 96Е1-4 на PS2-7

HBA194 НВЛ73 НВД59 НВЛ23 3R;84E X; 12E X; 8E Xs 9E рб.1 Simon et al., 1985 а,о Слабое на PS1-10 PS6-106 а,б Слабое на PS1-10 pse-io6

R310V1 3R;93AB рб.1 Rubin., Suradlinnr. 1983 Нет.в 93А

Примечания: * - отмечены плечи хромосом. Х-левое и ^правое. Определение стадий личиночного развития проводили по данным: а - гЫгшИеу, ■ 1974; б - Ве1уаеуа et а1., 1974; в - АаЫжгпег, 1975. •

хромосомного окружения й может регулироваться энхансерными элементами (О'Капе, СеЬг:тй, 1987). На ната взгляд, прямое доказательство участия Р-элемента в формировании междисков получено в работе Семешина с соавторами (ЗетевЫл ег а1., 1989). Было показано, что встраивание Р-элемента в диск 10А1-2 приводит к растеплению последнего на две части за счет образования нового менщиска.

Таким образом, встраивание экзогенных фрагментов ДНК с известными молекулярно-генетическими характеристиками может приводить к образованию в хромосомах отдельных новых дисков. Это возможно только в том случае, если встраивание транспозо-нов произошло в районы междисков или очень близко к ним. Материал новых дисков содержит, по-видимому, только ДНК этих тран-спозонов. На основании полученных данных можно считать, что использованный в данной работе комплексный подход, который ос-

Adh

28X

НЖН RXXbBH SA

M

б В/ХЬ X s

--Ы............

гу

сНВД

ГУ

- - 10 - -S/X в

I 000000"!

В/Вд ХЪ Н --»

Г S/X Н S/X Н S/X Н S/X н

R310.

')bz±HÍZZZ±H¿3Eb-{Í3E

I--------------54----------

[ гу j - rosy I 00000 — hsp70

- p-элемвнт

□

- «hite (ЗС)

- а:Adh 6:hspl8.5

Btß-gal r:pBS322

Рис.i Молекулярно-генетические карты фрагментов ДНК, встроенных в районы хромосом трансформированных линий дрозофилы. Конструкция: а - Adh113 (Bonner et al.,1984), б - 28X (HoXfman, Corees, 1986), в - сНВД {Simon et al., 1985),г - R310.1 (Rubin, Spradline, 1983). Сайты рестрикции: B-BamHI, Bg-BglII, H-Hind.III, R-EcoRI, S-SalGI, X-Xhol, Xb-Xbal; B/Bg, /X, S/Xb - сайты соединения соответствующих рестриктаз. Размер фрагментов в т.п.н. отмечен под каждой схемой. Стрелками отмечено направление транскрипции; треугольником отмечен район делений в промоторном участке гена hsp70.

нован на электронно-микроскопическом картирований трансформированных районов хромосом, позволяет наиболее полно выявить соответствие молекулярных и цитологических структур в районах междисков. это дает возможность клонировать ДНК междисков и исследовать их молекулярно-генетическую организацию.

н

Таблица 2. Характеристики морфологических структур в районах встраивания транспозонов.

Транспозон (размер в т.п.н.) Линия мух Район встройки Новый диск Толщина ноеого диска(мкм) Удлинение междиска (мкм)

28Х-С 43А1-2 - 0,25

28Х 28Х-Р 1В10/В11 + 0,08-0,02 0,18

(10) 281;еп1] 96Р1 /ТЗ-4 + данных нет данных нет

АсЩ113 (5) лап*3610 61С7/С8 82В4/С1-2 + + 0,06*0,02 0,0б±0,02 0,25 0,21

НВД194 84Е8/Е9 + данных нет данных нет

сНВА НВД73 12Е1-2/Е8-9 - - 0,25

(18) НВД59 8ЕЗ-4/Е7-8 - - 0,18

НВД23 9С1-2Д>4 + 0,12^,02 0,15

Ю10.1 (54) Е310.1 93А7/В1-2 + 0,67-0,1 (комплекс дисков) 0,06

2. Клонирование и молекулятао-генетический анализ ДНК из района междиска 61С7/С8 хромосомы 3.

Для клонирования была использована одна из трансформированных линий мух, содержащая встройку транспозона в районе междиска 61С7/С8 левого плеча хромосомы 3 (Рис.2). Б составе этого транспозона находиться уникальный сайт рестрикции Есой1, который делит конструкцию на две части (Рис.1а). Одна часть представлена фрагментом Р-элемента со стороны его 5'-конца. Другая часть представлена структурной частью гена алкогольдегидрогеназы (Лс?л), "сшитой" с промотором гена теплового шока, и 3'-фрагментом Р-элемента. Стратегия клонирования ДНК из района междиска (Рис.3) включала получение геномной библиотеки данной трансформированной линии мух в фаговом векторе по ЕсоМ-сайтам, которая была скринирована с помощью двух зондов, 32Р-меченых ДНК гена и<*л и Р-элемента. В результате был выделен клон, который содержит фрагмент ДНК с материалом части транспозона и междиска (Рис.За). Сайт встраивания транспозона и последовательность из междиска были определены в результате

61

А, ¡В с о

1А111|А1 АПАШ МП

ЧТ1 Жг

/ Л У\Т

Рис.2 Район 61С хромосомы 3, РБ 4-5. а - карта Бриджеса; б -линия в,г - линия в - без теплового шока,

г - 3 мин. теплового шока. Стрелкой обозначен новый диск 61С7*. Полоса соответствует 1,5 мкм.

секвенирования части этого фрагмента, включающей ДНК ■ Р-:' элемента и междиска. Поскольку точное положение встройки в междиске неизвестно, возникает необходимость в получении последовательности ДНК с обеих сторон от встройки. Для этого был проведен скрининг геномной библиотеки нормальной лабораторной линии мух Огедоп-в (получена от проф. Ф.Кафатоса) с использованием ДНК из междиска в качестве зонда (Рис.За.б). В результате был получен клон, содержащий геномный фрагмент ДНК разме-

ром около 12 т.п.н. с полной последовательностью из меадиска, не содержащей встройки траыспозона (Рис.Зв). Результаты гибридизации in situ подтвердили происхождение данного фрагмента из района 61С хромосомы 3 (Рис.4а). Кроме того, с использованием этого метода было показано, что сайты мечения ДНК как всего фрагмента, так и последовательности из района меядиска являются единственными в хромосомном наборе (Рис.4а-в). Уникальность последовательности ДНК из района меядиска в геноме была также подтверзщена методом Саузерн-блот гибридизации с геномной ДНК мух.

Я ЗА

|_ОООО : .А

-г-В

Н R

Рис.3 Рестрикционные карты клонов, содержащих ДНК из меадиска 61С7/С8. а - фрагмент ДНК размером 4,2 т.п.н. из линии мух Adhhs61c, содержащий структурную часть Adh гена (прямая линия), промотор гена теплового шока hsp?o (кружки), 3 -конец Р-элемента (темный прямоугольник) и материал из района междиска (волнистая линия), б - фрагмент ДНК, использованный как зонд для скрининга геномной библиотеки Огедол-кдшвьл. в - фрагмент ДНК размером 12,3 т.п.н., полученный после скрининга геномной библиотеки мух Oregon-R. Горизонтальными стрелками указано направление к теломере (Г) и центромере (С); вертикальными стрелками отмечен сайт встраивания Р-транспозона в линии Adhhs6ic. Сайты рестрикции: A-AvaII, B-BamHI, H-HiadIII, Р-Pstl, R-EcoRi, S-Saioi. Размеры фрагментов даны в т.п.н..

В результате экспериментов с использованием методов Саузерн-блот гибридизации и гибридизации in situ в пределах фраг-

Рис.4 Локализация последовательностей ДНК из района междиска 61С7/С8 методом гибридизации in situ, а - метка в районе 61С линии мух Огедоп-В после гибридизации с фрагментом 12 т.п.н.; б - гибридизация 0,9 т.п.н. BamHI-Pstl фрагмента (Рис.Зв): длинными и короткими стрелками отмечены гранулы серебра диста-льнее и проксимальнее пуфа, образованного материалом нового диска в линии Adhbs61c, соответственно, в - гибридизация 1,7 т.п.н. Pstl-SalGI фрагмента (Рис.Зв): треугольником отмечены гранулы серебра проксимальнее пуфа в линии Adhhs6ic (выделен

квадратной скобкой)._

мента 12 т.п.н. были определены субфрагменты, которые содержат сайт встраивания транспозона в трансформированной линии мух или примыкают к нему, а также была определена их ориентация относительно теломеры и центромеры хромосомы (Рис.Зв, 4б,в).

Как уже отмечалось, точное положение встройки транспозона в районе мекдиска неизвестно. В связи с этим возникает необхо-

димость в определении первичной последовательности ДНК мевдис-ка с обеих сторон от встройки. С этой целью было отсеквениро-вано 1289 п.н. из фрагмента BamHI-Hindlll размером 3,8 т.п.я., содержащего нативную мендисковую последовательность (Рис.Зв). После сравнения данной последовательности с последовательностью фрагмента ДНК из трансформированной линии мух (см. выше), оказалось, что мы определили в районе междиска 497 пар нуклео-тидов дистальнее и 792 пары нуклеогидов проксимальное сайта инсерции транспозона (Рис.5).

Некоторые особенности организации данной последовательности могут быть отмечены. 1) Последовательность обогащена АТ-парами. Наибольшее их число приходится на район, примерно, в 600 п.н. между 470 и 1095 парами нуклеотидов и составляет 57$ (Рис.5). Кроме того, обнаружены участки ДНК длиной 12 п.н. и более, в которых содержание АТ-пар составляет больше 80$. Хотя в целом, для последовательности этот показатель составляет -53,58, что достаточно близко к среднему параметру для Droso-phiia meianogaster, который, по данным М. Эшбернера (Ashbur-пег, 1989), оценивается в 52,25!. 2) При поиске последовательностей, гомологичных междисковой ДНК, в Банке нуклеотидных последовательностей ЕМБЬ не было обнаружено существенной гомологии ни с одной из них. 3) С помощью компьютерного анализа по программе REPEAT (Solovyev, Rogozin. 1986) в меэщисковой последовательности было выявлено значительное количество несовершенных прямых и инвертированных повторов, часто образующих мотивы, длиной от 8 до 50 пн со степенью гомологии 40% и выше, которые преимущественно располагаются в нескольких районах длиной 150-200 п.н.. Схематично расположение этих районов представлено на Рис.6. Необходимо отметить также наличие в последовательности гомопуриновых/гомопиримидиновых районов. Кроме того, исследование последовательности с помощью программы CONTEXT (Solovyev, Rogozin, 1986) позволило также выявить некоторые возможные функциональные (регуляторные) последовательности из разных организмов, которые, как правило располагаются в районах, насыщенных повторами (Рис.6). 4) Были обнаружены две перекрывашиеся открытые рамки считывания длиной 354 п.н. и 555 п.н. (Рис.5,6). провели сравнительный анализ частот использования кодонов в этих рамках со средними частотами, кото

рые были определеш для открытых рамок считывания с суммарной длиной в 269 т.п.н., кодируицих белки у дрозофилы (Asiiburner, 1989). Частоты использования кодонов в обеих рамках отличаются от тех, которые определены для дрозофилы. Скорее всего, это указывает на то, что обе рамки не функциональны, хотя не исключена возможность того, что они могут кодировать полипептиды с редко встречающимся у дрозофилы набором аминокислот.

Таким образом, проведенный нами анализ первичной последовательности позволяет сделать предположения 1) о возможном участии междисковой ДНК в регуляторных процессах, например, транскрипции и/или репликации и 2) возможной транскрипционной активности междиска,-Мы провели предварительные исследования, касающиеся проверки этих предположений.

В результате Нозерн-блот гибридизации меченой ДНК из района междиска 61С7/С8 с поли(А)+ РНК из личинок дрозофилы не было обнаружено четких гибридизационных сигналов. Слабые зоны гибридизации, полученные после длительных экспозиций (25 суток и больше), не позволяют, на наш взгляд, интерпретировать их как доказательство транскрипционной активности междиска, хотя и не отрицают ее вообще. Так, можно предположить, что синтезируемая РНК представлена небольшим количеством копий и подвергается быстрому гидролизу. В междиске может идти синтез поли (А)~ РНК и, следовательно, в проведенных экспериментах этот класс РНК не входит в анализ. Таким образом, мекдисковая ДНК, скорее всего,не содержит белок-кодирупцих последовательностей. Однако для окончательного решения вопроса о транскрипционной активности данного междиска необходимы дополнительные исследования с применением более чувствительных методов.

Полученные в работе данные позволяют предположить кроме транскрипционной активности междисков их участие в процессах генетической регуляции. В этой связи представляет определенный интерес исследование возможного взаимодействия последовательности ДНК из мевдиска 61С7/С8 с негистоновыми белками, которые, как правило, участвуют в этих процессах и по некоторым биохимическим данным входят в состав хромосомного каркаса или ядерного матрикса (см.для обзора: Георгиев, 1989; Mirkovitch et al.,1987; Cook, 1989). Мы провели предварительные эксперименты по выделению фрагментов ДНК, связанных с ядерным матрик-

GCCCCGCAACATTTTTATTGTTCCGTAGATTACAACACATAGGAAAACGCGAGAAGAGCT 61 2r«~ GAAAAATTTTCGTTGTCGAGGAGGAGAGTGCGCTICACACCGAAATATCAGTATACTGAT 121

GTGACAAAATGCAAAAGTAGCACAGATACAAATGCAGATAGGGATACTCTTCTCGCAGTC 181

TTCGAAAAAGAAGGCGTCTGGAAGGGGATCGACTGGAAGGGGCAGTGTCGGTTTGMTGT 241

GGAATGCCGTTTTGTAAGTTICTTATGCATGCGACTTCAAACATAGTTCGGCATCGAAAC 301

TTTCTAGCACACCGACACACATACGAACGCGATCCAGCCGACACACACACACACACGCAC 361

GCAGCCACACACTTAAGCGACTTTCGAAAGGTACAACITTTTACGAAGTCGCTGCC1CGG 421 " S R__

CCGCTGIGCAGCCGACGCCACTGCCGCTGCCGCTGTCGCIGCCTCIGTCGACITCGAAII 481 v 1r<—

CCAACGCCAAGATGAAAgASgSSSSCAAAAGAAAAGAAATATTCATTCAGTAAAATTTCA

TAGCIGCAGCCGCATGGTTGTGCCGCTCTCGCTGCTCTTGCTTTTCGCGCAACAAACCGG 601 2 AACGAGAAACACATAAATATAAAAGTGTGAACATTGGCGCACATATAAAAACTTAAAACT

filcTTAACTTGAGCAACATGAACAATAACACCGGAAGCGGTTCCAGCGAAGAGGTTCCA 721

AGGAGAGCAGACACAACCGCAirCCAGAAAGTTTAAATAACGCTGGAAGGAGGGGGAAAG 781

TGGAAAACIAAACTCGAACTCGAACTCAGTGTGCCAGTGTAIGTGIGTGGAATGCAGAAG

841 1 «-1

AGGAAGAAGCAGCAGCAGCAGAATAAGCAGCGAATAGAAAATATGTCTTCAAACTGGTTT 901

TTCGGTTTMAGACTGTCGICGTCGGCCAA3CGGGTTCCAITGACATCCGAACGAAJUUU 961 R

ATAATGCCTAACCTTCGATGGGAACACTCGTAAGTCGGAATTCGAAGTCCGCCATGCACA 1021

CACAACGCCGTTTATTGGCTGAAATTGGATGCTGTGTGTATGTGCGGTTATTIAGAAATT 1081

CGAAATTGAATTTCAGGGIATGCGCGGCCACCCAGAAATTCAAATTAAAATTTTCAAGCG 1141

CGAGCCATACGACCGAGCGTAAATIITTGAGACCCGTTTCATTCTTCCCGACTCGACGAT 1201

CCTAACCTTCACTGAGAACAGGAGTTAGCCAGCCAGAACGCGATTGGAACGATCGGACGG 1261

ACACTAGTCGCCCGCCAATACAAGCGCAC

Рис.5 Нуклеотидная последовательность ДНК из района междиска 61С7/С8 линии мух Oregon-R. Открытые рамки считывания 1 и 2 обозначены стрелками 1 и 2, соответственно. Отмечены сайт встраивания р-транспозона в линии Adhhs6ic (треугольник) и окта-мер, дуплицирушийся при этом•(волнистая линия). Сайты рестрикции: P-Pstli R-EcoRI; S-SalGI.

3 * ** 4 оо о

в 7

-1-—I-1-1-Г-Г-1-1-1-п

300 600 S00 1289

0РС2

555 п.н. 0PCI

354 П.Н.

Рис.6 Организация последовательности ДНК из междиска 61С7/С8. 1 - районы, которые преимуществен- но содержат прямые и инвертированные повторы; 2 - районы возможного образования z-ДНК; 3 - районы возможного присоединения топоизомеразы II: 4 - возможные сайты автономной репликации (ABS); 5 - возможные районы присоединения к ядерному матриксу (T-SAR боксы); 6 - сайт встройки транспозона в линии Adhhs61c. ОРС - открытые рамки, сом, из ядер личинок а-го возраста дрозофилы по методу Разина и Яровой (1986) и их гибридизации с клонами из района междиска 61С7/С8 методом дот-блоттинга. Можно отметить, что 32Р- меченые фрагменты ДНК матрикса специфично гибридизуются с клонами из междиска 61С7/С8. Кроме того, мы предприняли попытку клонировать фрагменты матриксной ДНК, гомологичные последовательности из междиска 61С7/С8. Для этого использовали пересеваемую культуру клеток дрозофилы Кс. Ядра этих клеток, из которых предварительно были удалены гистоны, обрабатывали рестриктазой и выделяли связанную с ядерным матриксом ДНК. Полученные фрагменты клонировали в фаговом векторе. После скрининга данной библиотеки 32Р-меченой ДНК фрагмента Banfll - HindiII размером 3,8 т.п.н. из района междиска (Рис.3.в) был выявлен рекомби-нантный фаговый клон,который содержал фрагмент ДНК размером около 2 г.п.н.. Оказалось, что он также располагается вблизи от сайта инсерции транспозона в линии Adhhs61c.

Таким образом, проведенные исследования позволяют предполагать возможную Связь ДНК из района междиска с белками ядерного матрикса. Какие белки участвуют в образовании связи и как

это связано с функциями междиска, пока не известно. Можно предположить, например, участие междисков или части их в регуляции процессов репликации и транскрипции. Однако в настоящее время еще нет достаточного фактического материала, чтобы обсуждать эти вопросы столь глубоко. Наверняка для этого необходимо изучение нескольких междисков. Мы надеемся, что подход к клонированию и анализу ДНК междисков, который предложен в данной работе, позволит это сделать.

ВЫВОДЫ

1. Реализован новый подход к изучению молекулярно-генетической организации мездисков, основанный на электронно-микроскопическом картировании районов политенных хромосом, содержащих Р-транспозоны. Показано, что в 7 из 10 исследованных трансформированных линий мух, встройки Р-транспозонов произошли в районы мездисков.

2. На основании этого подхода получена геномная библиотека трансформированной лиеии мух и впервые клонирована ДНК, входящая в состав одного из междисков.

3. Анализ первичной последовательности ДНК из междиска выявил следующие особенности ее организации:

а) Последовательность является уникальной в составе хромосом дрозофилы.

б) Обогащенность АТ- парами. В целом для последовательности этот показатель составляет 53,5%. Однако в ее пределах выявляются участки размером 12 пн и более, в которых содержание АТ-пар составляет более 80$.

в) Выявлены районы, насыщенные несовершенными прямыми и инвертированными повторами различной длины.

г) В последовательности обнаружены возможные регуляторные сайты транскрипции и репликации, характерные для эукариот.

д) Обнаружены две короткие открытые рамки считывания. Частоты использования кодонов в обеих рамках отличаются от тех, которые характерны для дрозофилы.

4. Последовательность из района междиска 61С7/С8 относится к ДНК ядерного матрикса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Semeshin V.P..Demakov S.A.,Perez Alonso M..Belyaeva E.S., Bonner J. J. .Zhinmlev X.F. Electron microscopical analysis oí Drosophila polytene chromosomes. V. Characteristics of struc tures formed by transposed. DNA segments of mobile elements// Chromosoma. - 1989.- Vol. 97, N 5. - P.396-412.

2. Семешин В.Ф..Демаков С.А..Жимулев И.Ф. Характеристика структур политенных хромосом дрозофилы, образуемых транспозируемы-ми фрагментами ДНК// Генетика. - 1989. -Т. 25, N11. - С. 1968-1978.

3. Семешин В.Ф..Демаков С.А.,Алонсо М.П.,Жимулев И.Ф. Формирование междисков из материала ДНК Р-элемента в политенных хромосомах дрозофилы// Генетика. - 1990. - Т. 26,N3.- С. 448-456.

4. Демаков С.А..Семешин В.Ф.,Жимулев И.Ф. Клонирование и моле-кулярно-генетический анализ ДНК междиска политенной хромосомы Дрозофилы// Докл. АН СССР. - 1991. - Т. 317i N4.- С. 989-992.

5. Demakov S.A. .Semeahin. V.F.,Zhimulev I.P. Cloning and molecular genetic analysis oí Drosophila melanogaster interband DNA// Mol. Gen. Genet. - 1993. - Vol. 238. - P. 437-443.