Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические аспекты развития воспалительных заболеваний кишечника

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические аспекты развития воспалительных заболеваний кишечника"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗВИТИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА: БОЛЕЗНИ КРОНА И ЯЗВЕННОГО КОЛИТА

Специальность: 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

НАСЫХОВА

Юлия Алмазовна

3 МАЙ 2012

Санкт-Петербург - 2012

005016572

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отга» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, в лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Иващенко Татьяна Эдуардовна,

ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта» СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Горбунова Виктория Николаевна,

профессор кафедры медицинской генетики ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия»

Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрии Владимирович,

заведующий лабораторией эпигенетики

ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН,

Москва

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный

медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздравсоцразвития России

Зашита состоится «¿у » М(Х& 2012 г. в/часов на заседании диссертационного совета Д 212.232.12 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, Санкт-Петербург, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан «/ Ч> О-Пи0Л9(- 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.232.12

доктор биологических наук

Мамон Людмила Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Исследование воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), к которым относятся болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК), является одной из наиболее актуальных задач современной гастроэнтерологии. Несмотря на относительно невысокую частоту ВЗК, неуклонный рост заболеваемости БК и ЯК, смещение начала заболевания в более ранний возраст, появление тяжелых форм, учащение внекишечных проявлений делают ВЗК серьезнейшей проблемой среди патологий желудочно-кишечного тракта (Адлер, 2001; Барановский и др., 2009). Воспалительные заболевания кишечника являются социально значимой проблемой медицины, что обусловлено большими затратами на лечение, потерей трудоспособности в молодом и зрелом возрасте, частой инвалидизацией и сложностью социальной реабилитации больных (Халиф, Лоранская, 2004).

Несмотря на многолетнюю историю изучения ВЗК, этиология заболеваний остается по-прежнему неизвестной, а патогенез исследован недостаточно. В настоящее время признана точка зрения, согласно которой, в возникновении ВЗК участвуют многие внешние и внутренние факторы. На сегодняшний день накоплены данные о роли генетических факторов в развитии заболеваний, их влиянии на особенности клинической картины, и установлено более 40 генов, полиморфизм которых ассоциирован с развитием ВЗК. Прежде всего, это гены, задействованные в регуляции таких процессов как дифференцирование ТЫ7-лимфоцитов, аутофагия, поддержание целостности эпителиального барьера и иммунный ответ (Zhang et al., 2008; Thompson, Lees, 2011; van Limbergen et al., 2007; Cooney, Jewell, 2009).

Несомненную важность имеют работы, направленные на комплексную оценку вклада генетических нарушений в развитие ВЗК. Такие исследования позволят расширить представления о механизмах возникновения и прогрессирования данных тяжелых патологий желудочно-кишечного тракта. Изучение генетических маркеров развития ВЗК в будущем позволит выявлять индивидуумов с высоким риском возникновения БК и ЯК, а в дальнейшем может послужить основой для разработки профилактических мероприятий и оптимизации лечения патологий желудочно-кишечного тракта.

Цель и задачи исследования. Изучить роль аллелей генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЬ17-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера и иммунного ответа в развитии болезни Крона и язвенного колита.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования: 1. Определить частоты генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета (NOD2/CARD15)', дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов (IL-23R, STAT3, JAK2, IL-12B); аутофагии (ATG16L1, IRGM); иммунного ответа (TNFa; TNFSF15, PTPN2, PTPN22, IL-10, 1L-18RAP, MST1, IL-4, IL-4R); эпителиального барьера (IBD5), а также NKX2-3 и BTNL2 в общей группе пациентов с ВЗК, группе пациентов с БК, группе пациентов с ЯК и в популяционном контроле.

2. Провести сравнительный анализ частот генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЬ17-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также ЫКХ2-3 и ВТЫЬ2 в общей группе пациентов с ВЗК, группе пациентов с БК, группе пациентов с ЯК и в популяционном контроле.

3. Исследовать ассоциацию полиморфных вариантов генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также ЫКХ2-3 и ВТЫЬ2 с клиническими параметрами у пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом.

4. Провести поиск и идентификацию новых полиморфных вариантов в вариабельной области экзона 4, а также в экзоне 11 гена N002/С А ЯО15 у пациентов с БК.

5. Определить комплексный вклад и прогностическое значение полиморфных аллелей генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ 7-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также ЫКХ2-3 и ВТЫЫ в развитии ВЗК.

Научная новизна работы. В рамках данного исследования впервые изучено распределение частот генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета (ЫСЮ2/СА1Ю15 (2104*С/Т, 2722Ч1/С, Leu3020fsin.sC)); дифференцировки ТЬ 17-лимфоцитов (Я,-23Я (798+2778*С/Т, 1142Ю/Л), БТАТЗ (-1-13666*Т/С), .1АК2 (1358*С/А), И-12В (гз10045431*С/А)); аутофагии {ЛТС16Ы (841 *АЮ), тем (г,ч13361189*Т/С)); иммунного ответа (ТШ7а (-238*0/Л, -308*С/Л); Т^БР15 (г.ч4263839*С/А), РТРN2 (г.ч2542151*С/Т), РТРМ22 (1858*С/Т), 1Ь-10 (к3024505*С/Т), 11-18КЛР (гэ917997Ю/А), \1ST1 (1965Ю/1'), 1Ь-4 (-590*С/Т), И-4К (1727*А/С)): эпителиального барьера (¡ВО5 (г$2522057*С/С)), а также ИКХ2-3 (г.ч10883365*Л/С) и В7Ж2 (1050*С/Т) у пациентов с БК, у пациентов с Ж и популяционной выборке Северо-Западного региона РФ. Впервые был проведен анализ ассоциации полиморфизма генов с клиническими параметрами воспалительных заболеваний кишечника (форма течения БК, степень тяжести ЯК). Впервые получены результаты, свидетельствующие об ассоциации полиморфных вариантов генов ЫОЭ2/СЛ1Ю15 (1еи302()^ткС), МК2 (1358*С/А), ТШа (-308Ю/А), 1Ь-4Я (1727*А/С) с развитием БК, а также полиморфных вариантов генов т02/СА1Ю15 (2104*С/Т), К-12В (гэ10045431*С/А), МК2 (1358*С/А), ПЮМ (гз13361189*Т/С) с развитием ЯК. Впервые обнаружены достоверные различия частот генотипов и аллелей для вариантов генов ЪЮВ2/САКО15 (2722*С/С, ЪеиЗОгО/эШС), 11-10 (г,ч3024505*С/Т), 11-4К (1727*АЮ) в группах с осложненными (стриктурирующая, пенетрирующая) и воспалительной формами течения БК. Впервые у пациентов с БК в Северо-западном регионе России идентифицированы 3 новых полиморфных варианта в экзоне 4 гена Ы002/СА1Ю15. Разработана система детекции данных вариантов гена Ы002/САЯ£)15. Впервые получены результаты, свидетельствующие о роли взаимодействия генов .1ЛК2 (1358*С/А), И41{ (1727*А/С), ТИРо. (-308*С/А) в развитии БК. Впервые разработаны логические регрессионные

модели — модель прогнозирования риска развития БК и модель риска развития осложненных форм БК.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Полиморфные аллели генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов, аутофагии и иммунного ответа вовлечены в развитие воспалительных заболеваний кишечника в Северо-Западном регионе России.

• Маркерами повышенного риска развития БК являются аллели 3020*insC (NOD2/CARD15), 1358*С (JAK2), -308*А (TNFa), 1727*G (IL-4R).

• Полиморфные аллели rsl0045431*A (IL-12B), 2104*С (NOD2/CARD15), 1358*С (JAK2) и генотип rs13361189*СС (IRGM) являются маркерами повышенного риска развития язвенного колита.

• Взаимодействие аллелей генов JAK2, IL-4R, TNFa вносит вклад в формирование генетической предрасположенности к развитию болезни Крона.

• Критериями прогнозирования развития осложненных форм болезни Крона являются следующие факторы: курение, женский пол, аллели генов I727*G (IL-4R), 3020*insC (NOD2/CARD15), 2722*С (NOD2/CARD15).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2008), на Европейских конгрессах по генетике человека (Nice, 2007; Barcelona, 2008; Vienna, 2009; Gothenburg, 2010), на VI Съезде российских медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), на научных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи — в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Библиографический указатель включает 214 источников, из них 200 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 18 рисунками, содержит 3 приложения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 250 пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника (138 с заболеванием Крона и 112 с язвенным колитом), которые наблюдались на базе кафедры гастроэнтерологии и диетологии ГОУ ДПО СПбМАПО (зав. отделения - д.м.н. проф. Барановский А.Ю.) с 2004 до 2010 гг. Контрольная группа сформирована из 140 неродственных индивидуумов, не имеющих признаков ВЗК на момент сбора материала и проживающих в СевероЗападном регионе России.

Экстракция геномной ДНК из клеток лимфоцитов периферической крови.

Выделение ДНК проводилось из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989).

Анализ полиморфизма генов. Исследование полиморфизма генов NOD2/CARD15, IL-4, IL-4R, TNFa проводилось методом ПЦР-ПДРФ. Праймеры, необходимые для проведения ПЦР, подбирали с использованием программы «Oligo v.6.31» (Molecular Biology Insights Inc., США). Для анализа полиморфизма 15 генов (JAK2, IL-23R, STAT3, IL-12B, PTPN2, PTPN22, IL-10, IL-18RAP, MST1, TNFSF15, IBD5, ATG16L1, IRGM, BTNL2, NKX2-3) были использованы Taqman-пробы (Applied Biosystems). Генотипирование было проведено в лаборатории генетики Медицинского центра Университета г. Гронинген (Нидерланды) (зав. лаборатории — prof. Wijmenga С.). Поиск и идентификация новых полиморфных вариантов. Поиск новых полиморфных вариантов в экзоне 11 ив вариабельной области экзона 4 гена NOD2/CARD15 проводили с помощью метода конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP). Нуклеотидные последовательности фрагментов с измененной конформационной подвижностью были определены методом прямого секвенирования на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130x1. Статистическая обработка данных. При сравнении результатов анализа генетического полиморфизма в группах использовали критерий Фишера или критерий у2 с поправкой Бонферонни при множественных сравнениях (Животовский, 1991). Для проверки соответствия эмпирического распределения частот генотипов теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди-Вайнберга использовали критерий % (Р) по алгоритму, описанному D. Roff и P. Bentzen (1989). Анализ межгенных взаимодействий проводился биоинформатическим методом Multifactor Dimensionality Reduction (MDR). Оценку комплексного влияния клинических и генетических показателей на риск развития патологий и клинические особенности течения заболеваний проводили с помощью логистического регрессионного анализа (методом максимального правдоподобия). Обработка данных проводилась с использованием программ Microsoft Excel (Microsoft Corporation, США), STATISTICA v.6.0 (Statsoft Inc., США) и GraphPad Instat v.3.05 (GraphPad Software Inc., США), Eviews 3.1 (Quantitative Micro Software, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма гена NOD2/CARD15

Ген NOD2/CARD15 кодирует внутриклеточный рецептор, который способен распознавать специфические компоненты бактериальной клеточной стенки L-Ala, D-Glx (мурамилдипептиды, MDP) и регулировать развитие воспалительной реакции посредством активирования ядерного фактора NF-kB (Kovalenko et al., 2003).

Проведенный сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма гена NOD2/CARD15 в Северо-Западном регионе РФ установил ассоциацию варианта Leu3020finsC гена NOD2/CARD15 с развитием болезни Крона (Рисунок 1). Гомозиготный генотип 3020*insC/insC определен у 3,6% пациентов с БК и не

встречался у пациентов с ЯК и в популяционном контроле. Частота аллеля 3020*/и^С была в 2,5 раза выше среди пациентов с БК по сравнению с популяционной группой (9,1% и 3,6%, р=0,009). Согласно показателю соотношения шансов Odds ratio аллель 3020*insC гена NOD2/CARD15 повышает риск развития болезни Крона почти в 2,7 раз (OR=2,69, 95%С1: 1,26-5,71) по сравнению с индивидуумами с генотипом 3020*wt/wt. Полиморфизм Len3020finsC представляет собой инсерцию цитозина в 3020 положении нуклеотидной последовательности гена NOD2/CARD15. Данный генетический вариант приводит к сдвигу рамки считывания и образованию белка, укороченного на 33 аминокислотных остатка. Известно, что белковый продукт гена с аллелем 3020*insC характеризуется снижением функции распознавания молекул MDP, что в конечном итоге может привести к развитию патологического воспалительного процесса (Hisamutsu et al., 2003; Maeda et al., 2005).

wt/wt wt/insc insC/insC wt insC 2104*CC 2104*CT 2104*TT 2104*C 2104*T

О БК □ Контроль El ЯК □ Контроль

Рис. 1. Частоты генотипов и аллелей полиморфных вариантов Leu3020flnsC и 2104*С/Т гена NOD2/CARD15 в группах пациентов и в популяционном контроле; * - р<0,05

Результаты исследования полиморфизма 2104*С/Т гена NOD2/CARD15 показали достоверно низкую частоту редкого аллеля 2104*Т среди пациентов с ЯК (0,5%, р=0,028) и в объединенной группе пациентов с ВЗК (1,2%, р=0,037) по сравнению с популяционным контролем (3,6%) (Рисунок 1), что указывает на протективную роль аллеля 2104*Т в развитии ЯК в Северо-Западном регионе РФ. Функциональное значение полиморфного варианта 2104*С/Т не установлено, но исходя из расположения однонуклеотидной замены в LRR области, которая обладает ключевым значением в распознавании молекул MDP, можно предположить, что данный аллельный вариант приводит к изменению рецепторных свойств белка NOD2/CARD15.

Для полиморфизма 2722*G/C гена NOD2/CARD15 достоверных различий между исследованными группами обнаружено не было (р>0,05).

В ряде популяций была установлена ассоциация данных трех полиморфных вариантов с различным клиническим течением БК: возрастом манифестации болезни у взрослых, пенетрирующим и стриктурирующим течением, локализацией

воспалительного процесса (идеальная форма БК) (Hartón et al., 2003; Kobayashi et al., 2005; Wehkamp et al., 2004; Ogura et al., 2001).

60%

20% : 0%

Ш

□ 2 SNP

E31 SNP

□"дикий тип"

воспалительное

осложненное

Рис. 2. Частоты носительства аллелей 2722*С и 3020*1п$С гена №?Ш/С4Л,0/5 при различном клиническом течении БК

Проведенный анализ полиморфизма гена ЫОЭ2/СА1Ю15 среди пациентов с различными формами БК (простой (воспалительная) и осложненными (пенетрирующей, стриктурирующей)) выявил ассоциацию полиморфизма 2722 *й/С и Ьеи3020/1тС гена с развитием осложнённых форм заболевания (Рисунок 2). Показано достоверное повышение частоты гетерозиготного генотипа 2722*СС полиморфизма 2722*С/С гена ЫОВ2/САЯВ15 у пациентов при осложненных формах заболевания в сравнении с воспалительной формой БК (р=0,0495; (Ж=5,81; 95%С1:1,11-30,47). Генотип 3020*уч1/у>1 полиморфизма Ьеи3020АтС достоверно чаще встречался у больных с воспалительной формой (92,2%) в сравнении с группой больных с осложненными формами течения БК (73,7%, р=0,019; СЖ=4,21; 95%С1:1,32-13,50). Частота редкого аллеля 3020*тзС была достоверно выше в группе пациентов с осложненными формами БК, по сравнению с группой пациентов с воспалительной формой заболевания. Процент пациентов, имеющих один из двух полиморфных аллелей гена АЮЭ2/СА1Ю15 (2722*С/С и Ьеи3020АтС), среди группы с воспалительной формой БК (11%) ниже в 3 раза по сравнению с таковым у пациентов с осложненными формами БК (30,8%, р=0,018). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что редкие аллели 2722*С и 3020*1тС гена АЮ02/САК015 являются маркерами повышенного риска развития осложненных форм болезни Крона.

2.Поиск и идентификация новых полиморфных вариантов в гене АЮЪ2/САКШ5 у пациентов с болезнью Крона

Значение белка ЫСШ2/САК1)15 в реакциях иммунного ответа на компоненты бактериальной клеточной стенки, позволяет предположить, что в развитии болезни Крона помимо трех частых генетических вариантов (2104*С/Т\ 2722Ю/С, Ьеи3020/з1тС) важную роль могут играть редкие мутации гена, которые оказывают значительное функциональное влияние на формирование предрасположенности к ВЗК. В связи с этим нами был предпринят поиск новых полиморфных вариантов в

вариабельной области экзона 4 и в экзоне 11 гена, значимых для развития заболевания Крона в нашей популяции. При исследовании экзона 11 гена NOD2/CARD15 новых полиморфных вариантов гена обнаружено не было. SSCP-анализ вариабельной области экзона 4 позволил выявить 3 типа измененной подвижности фрагментов в геле. Нуклеотидные последовательности фрагментов были определены методом секвенирования на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130x1.

Секвенирование отобранных образцов с измененной подвижностью I типа позволило идентифицировать полиморфный вариант 2462+10*А/С (rs72796353), расположенный в З'-нетранслируемой области (IVS4+10AXJ) экзона 4 гена NOD2/CARD15 (Рисунок 3). Локализация в донорном сайте интрона 4 гена NOD2/CARD15 позволяет предположить возможную роль данной однонуклеотидной замены в реализации процессов сплайсинга гена. Определение нуклеотидной последовательности отобранных образцов с измененной подвижностью II типа позволило идентифицировать полиморфный вариант 2174*C/G (rs5743278), который приводит к замене аланина на глицин в 725 положении (Ala725Gly) аминокислотной последовательности белка NOD2/CARD15 (Рисунок 3). Секвенирование отобранных образцов с измененной подвижность III типа позволило идентифицировать полиморфизм 2264*C/T(rs61747625), который приводит к замене валина на аланин в 755 положении (Ala755Val) аминокислотной последовательности белка NOD2/CARD15 (Рисунок 3).

2462+ I0*A/C (rs72796353)

CTCTGTAGTGAGTGTTA/( CTGGGC

ML

ATCCCGCCAGCVGTGCACCGGG

2174*C/G (rs5743278)

2264*C/T (rs61747625)

GGAGGAGCGGCTGGC.q T CGGAAGGC'T

Рис. 3. Результаты секвенирования образцов с измененной подвижностью в геле.

Наличие идентифицированных нуклеотидных замен в гене Ы002/САЯ015 было подтверждено с помощью разработанного метода ПЦР-ПДРФ анализа. Проведенный

анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма 2462+10*А/С, 2174*С/С, 2264*С/Т гена ЖЮ2/С4ЛШ5 в исследуемых выборках не выявил достоверных различий между группой пациентов с БК и популяционной выборкой (р>0,05). 3.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов дифференцировки ТМ7-лимфоцитов {1Ь~23Я, Я'/'А ТЗ, JAK2,1Ь-12В)

ТЫ7-лимфоциты имеют ключевое значение в развитии хронических и аутоиммунных воспалительных заболеваний, а гены, ответственные за дифференцировку ТЫ7-лимфоциты (1Ь-23Я, ЗТАТЗ, МК2, К-12В), являются перспективными генами-кандидатами развития ВЗК.

Ч23Н1142'А

Рис. 4. Частоты аллелей генов дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов (JAK2, STAT3, IL-23, IL-I2B) в группах пациентов с ЯК, с БК и в популяционной выборке; * - р<0,05

Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма 1358*А/С гена JAK2 выявил достоверное повышение частоты аллеля 1358*С в объединенной группе пациентов с ВЗК (42,1%, р=0,01), в группе пациентов с БК (42,6%, р=0,02) и в группе пациентов с ЯК (41,6%, р=0,0485) по сравнению с популяционной выборкой (32,2%). Частота гомозиготного генотипа 1358*АА была достоверно ниже в объединенной группе пациентов с ВЗК (33,8%, р=0,01) и в группе пациентов с БК (31,3%, р=0,01) по сравнению с популяционным контролем (47,4%) (Рисунок 4). Полученные нами данные хорошо согласуются с результатами, полученными в исследованиях для других популяциях. В работе Prager et al. были представлены данные об ассоциации повышенной проницаемости кишечника с 1358*А/С полиморфизмом гена JAK2 и высказано предположение, что редкий аллель 1358*С гена JAK2 способствует разворачиванию воспалительной реакции, что в свою очередь определяет увеличение проницаемости стенки кишечника (Prager et al., 2011).

Проведенный анализ частот аллелей полиморфного варианта rsl0045431 *С/А гена IL-12B выявил ассоциацию редкого аллеля А с развитием язвенного колита (р=0,019) (Рисунок 3). Ген IL-12В кодирует субъединицу р40, которая входит в состав гетеродимерных цитокинов IL-12 и IL-23. Было установлено, что мутации гена IL-12B приводят к нарушению иммунных реакций, опосредованных цитокинами IL-12 и

IL-23, что в свою очередь обуславливает повышенную восприимчивость к Mycobacteria и Salmonella и может явиться причиной развития воспалительных заболеваний кишечника.

4.Сравиительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов аутофагии (ATG16L1, IRGM)

Аутофагия играет важную роль в ряде процессов (регуляция NF-kB-сигнального пути, защита от пагоген-индуцированной клеточной смерти, функционирование клеток Паннета и др.), которые потенциально вовлечены в развитие воспалительных заболеваний кишечника. Исходя из этого, гены аутофагии представляют интерес при исследовании наследственной предрасположенности к болезни Крона и язвенному колиту.

Анализ полиморфного локуса rs!3361189*Т/С гена IRGM выявил достоверное повышение частоты редкого генотипа СС (4,3%) в группе пациентов с ЯК по сравнению с контрольной группой (0%, р=0,028) и пациентами с БК (0%, р=0,045). Ген IRGM кодирует белок - иммунитет-связанную гуанозин-трифосфатазу М, осуществляющую регуляцию процесса аутофагии внутриклеточных патогенов. В настоящее время установлено, что однонуклеотидная замена rs13361189*Т/С оказывает влияние на уровень экспрессии IRGM (McCarrol et al., 2008), что вероятно определяет значение полиморфизма rsl3361189*Т/С в развитии ВЗК (Parkes et al., 2007; Meggyesi et al., 2010).

ТТ ТС СС т с

□ ЯК □ Контроль

Рис. 5. Частоты генотипов и аллелей полиморфизма га/3361189*Т/С гена ШСМ в группе пациентов с ЯК и в популяционном контроле; * - р<0,05

Сравнительный анализ распределений частот генотипов и аллелей по гену АТС16Ы в исследуемых группах пациентов (общая группа пациентов ВЗК, пациенты с БК, пациенты с ЯК) и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (р>0,05).

5.Сравнителы1ый анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма локуса 1ВЭ5

Анализ распределений частот генотипов и аллелей полиморфизма п2522057С/С локуса 1ВВ5 в исследуемых группах пациентов (общая группа пациентов ВЗК,

пациенты с БК, пациенты с ЯК) и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (р>0,05).

б.Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов иммунного ответа (ТМРп, TNFSF1S, РТРШ, РТРШ2, МБТ1, И-10, П-18 ПАР, 1Ь-4, 11-411)

Многочисленные данные указывают на ведущую роль патологического иммунного ответа в природе болезни Крона и язвенного колита. Воспалительные процессы могут служить причиной возникновения изъявлений, изменения межклеточных соединений и снижения продукции слизи, что в свою очередь позволяет антигенам свободно проникать в собственную пластинку. В связи с этим гены иммунного ответа представляют большой интерес для изучения генетической предрасположенности к ВЗК.

ТЫ Ра -238* А

ТЫРБР15 гв4263839*А

РТРN2 ГВ2542151

1727*в

Ч-18ИАР г5917991*А

\L-10 п3024505*Т

/И5П 1965*Т

И-4-590*Т

ия*™»Контроль

РТРЫ22 1858*Т

Рис. 6. Частоты полиморфных аллелей генов иммунного ответа (ТИРа, ТИР5Р15, РТРМ2, РТРN22, М5Т1, ¡1-10, 1Ь-18ЯАР, 11-4, И-4Я) в группе пациентов с БК и в популяционном контроле

Анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфизма гена ТМ^а (-238*С/А, -308*С/А) в Северо-Западном регионе РФ выявил достоверные различия для -308*С/А полиморфного варианта в объединенной группе пациентов с ВЗК и в группе пациентов с БК по сравнению с популяционной выборкой. Согласно полученным данным, редкий аллель -308*А гена ГМ*а достоверно чаще встречался в объединенной группе пациентов с ВЗК (11,2%, р=0,008) и в группе пациентов с БК (12,3%, р=0,004) по сравнению с популяционным контролем (5,4%), и согласно коэффициенту соотношения шансов повышает риск развития БК почти в 2,5 раза (СЖ=2,48; 95% С1:1,32-4,67), а также повышает общий риск развития ВЗК в 2 раза (СЖ=2,22; 95% С1:1,23-4,01). Сравнительный анализ частот генотипов полиморфизма -З08*й/А по гену ТТУРа показал, что частота генотип -І05*GG достоверно ниже в общей группа пациентов с ВЗК (79,3%,р=0,007) и в группе пациентов с БК (76,8%,

р=0,004) по сравнению с популяционной выборкой (90%), что указывает на протективный эффект данного генотипа в отношении развития БК и развития ВЗК, в целом. Известно, что нуклеотидные замены гуанина на аденин в -238 и -308 положениях промоторной области гена TNFA способны влиять на продукцию белка (Bouma et al., 1996). Полиморфизм -308*G/A значительно повышает транскрипционную активность гена, увеличивает скорость образования мРНК. Показано, что у носителей генотипа -308*А/.'А синтез белка происходит в 3 раза активнее, чем у лиц с генотипом -308* G/G. (Louis Е. et al., 1996; Bouma G. et al., 1998).

Проведенный нами сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма I727*A/G гена IL-4R показал, что редкий аллель 1727*G и гомозиготный генотип 1727*GG достоверно реже встречались в контрольной выборке (13,9% и 2,1%) по сравнению с общей группой пациентов с ВЗК (21,1%, р=0,02; 8,3%, р=0,01) и группой пациентов с БК (23,9%, р=0,003; 10,9%, р=0,003).Таким образом, редкий аллель 1727*G является аллелем риска развития БК и ВЗК в целом. Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, аллель 1727*G гена IL-4R повышает в 1,65 раз общий риск развития воспалительных заболеваний кишечника (OR=l,65, 95% CI: 1,10-2,47) и почти в 2 раза повышает риск развития болезни Крона (OR=l,94, 95% С1:1,25-3,01). Известно, что редким аллелем 1727Ю гена IL-4R кодирует белок-рецептор интерлейкина 4, обладающий пониженным сродством к внутриклеточной тирозинфосфатазе SHP-1, включающей сигнал терминации транскрипции гена IL-4. Следовательно, индивиды с /727*6'-аллелем теряют возможность к супрессии синтеза IL-4 (Zheng et al., 2003). Можно предположить, что снижение контроля супрессии синтеза провоспалительного цитокина IL-4 предрасполагает к развитию хронического воспалительного процесса. В проведенном исследовании установлено, что аллель 1727*G гена IL-4R достоверно чаще встречался в группе с осложненным течением (стриктурирующая и пенетрирующая формы) БК, чем в группе с воспалительным течением БК (р<0,0001). Вероятно, что носительство аллеля 1727*G гена IL-4R предрасполагает к более агрессивному течению заболевания и является прогностическим фактором развития осложненных форм БК.

Изучение полиморфизма rs3024505*C/T гена IL-10 в группах пациентов с воспалительной и осложненными формами течения БК позволил выявить ряд закономерностей. Показано, что генотип СТ достоверно чаще встречается среди больных с воспалительной формой БК (42,6%) по сравнению с объединенной группой пациентов с осложненными формами БК (14,3%; р=0,01), что указывает на протективную роль данного полиморфизма в формировании осложнённых форм болезни Крона.

Анализ распределений частот генотипов и аллелей полиморфизма генов TNFSF15, PTPN2, PTPN22, MST1, IL-18RAP, IL-4 в исследуемых группах пациентов (общая группа пациентов ВЗК, пациенты с БК, пациенты с ЯК) и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (р>0,05).

7. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов дополнительных генов-кандидатов ВЗК (NKX2-3, BTNL2)

Анализ распределений частот генотипов и аллелей полиморфизма генов NKX2-3, BTNL2 в исследуемых группах пациентов (общая группа пациентов ВЗК, пациенты с БК, пациенты с ЯК) и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (р>0,05).

8. Комплексный анализ роли генетических и средовых факторов в развитии ВЗК

В основе наследственной предрасположенности, как известно, лежит специфическая комбинация аллелей нескольких генов, которые оказывают влияние на развитие заболевания или же на модификацию клинических проявлений болезни. Установление взаимосвязей между полиморфными генами и фенотипическими проявлениями ВЗК является важнейшим условием для выделения ключевых звеньев патогенеза, затрагивающих определенные физиологические функции, посредством которых формируется клиническая картина заболевания. В настоящее время одними из наиболее эффективных и популярных методов анализа межгенных взаимодействий являются биоинформатический метод Multifactor Dimensionality Reduction (MDR), целью которого является моделирования межгенных взаимодействий (Moore, 2004; Motsinger et al, 2006: Moore et al, 2006) и логистический регрессионный анализ. а) Исследование межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к воспалительным заболеваниям кишечника методом MDR.

Для оценки межгенных взаимодействий с помощью метода MDR был использован алгоритм всестороннего поиска (Exhaustive search algorithm), который оценивал все возможные комбинации полиморфных локусов, выбранных для анализа межгенных взаимодействий, в отношении риска развития воспалительных заболеваний кишечника. В результате анализа взаимодействий исследованных генов в формировании предрасположенности к БК была установлена четырехлокусная модель JAK2(1358*C/A) х NOD2/CARD15 (2722Ю/С) х IL-4R(1727*A/G) х TNFa (-308*G/A), которая характеризовалась 90% воспроизводимостью и точностью предсказания 56,4 %. Согласно параметрам данной модели наиболее тесное взаимодействие установлено для генов JAK2(1358*C/A) и IL-4R(1727*A/G), меньшее по силе взаимодействие наблюдается с геном TNFa (-308*G/A). Влияние генов на развитие БК определяется дублирующими эффектами. В модель также входит ген NOD2/CARD15 (2722*G/C) с независимым от представленных генов влиянием на развитие патологии. Анализ комбинаций всех возможных вариантов сочетаний аллелей для данной 4-х локусной модели позволил установить 17 генотипов повышенного риска и 10 генотипов пониженного риска развития БК.

В результате анализа межгенных взаимодействий в развитии ЯК была определена двухлокусная модель, включающая полиморфизм -308*G/A гена TNFa и полиморфизм rs917997*G/A гена IL-18RAP. Модель обладала воспроизводимостью 100% и точностью предсказания 61,4%. Согласно полученной модели, гены TNFa (-308*G/A) и IL-18RAP (rs917997), которые вносят наибольший комплексный вклад в формирование предрасположенности к ЯК, входят в состав двух независимых и слабовзаимодействующих между собой кластеров генов. В рамках данной модели

было выявлено 5 генотипов повышенного риска и 2 генотипа пониженного риска развития ЯК.

б) Прогнозирование риска возникновения ВЗК на основе исследования полиморфизма генов-кандидатов и средовых факторов риска заболевания

Для оценки комплексного вклада генетических и средовых факторов в патогенез заболеваний, а также для определения прогностической значимости данных факторов нами использован метод логистического регрессионного анализа. Используя метод пошагового включения предикторов и расчета отношения правдоподобия оценены сочетания аллелей генов-кандидатов ВЗК, а также средовых факторов и, таким образом, были выбраны две наиболее эффективные регрессионные модели: модель, предсказывающей риск развития БК, и модель, прогнозирующая развитие осложненных форм течения БК. Для язвенного колита статистически значимых регрессионных моделей разработать не удалось.

В состав модели прогноза развития БК вошли 6 предикторов: ЫОВ2/СА1Ю15 (2104*С/Т, 2722* С/С, Ьеи3020/^тС), МК2 (1358*С/А), ГШа (-308Ю/А) и 11ЛЯ (1727*А/С). Согласно полученным данным наибольшую прогностическую ценность несет полиморфизм гена МОП2/СА1Ю15 (2104*С/Т), наименьшее значение в прогнозе БК в данной модели имеет полиморфизм МК2 (1358*С/А).

На основании показателей данной регрессионной модели получена математическая формула для оценки вероятности развития (р) заболевания Крона:

е(0,207561-0,355027»А+0,120632»В + 0,091246»С+0,205522«0 + 0,262156«£+0,1421199»Р) Р ~ 1 е(0,207561-0,355027М+0,120632»В+0,091246«С+0,205522»0 + 0,262156»Е+0,1421199«р) '

где

А — полиморфизм 2104*С/ТтепаЫ002/СА1Ю15 (2104*СС—0, 2104*СТ- 1, 2104*ТТ-2);

В — полиморфизм 1727*А/в гена 11-411 (1727*АА-0,1727*АО- 1,1727*Св-2);

С — полиморфизм 1358*С/А генаУАК2 (1358*АА - 0,1358*СА - 1,1358*СС - 2);

О — полиморфизм -308Ю/А гена TNFa (-308*вв-0, -308*вА - 1, -308*АА - 2);

Е — полиморфизм 2722*&С гена М002/СА1Ю15 (2722*вв-О, 2722ЮС- 1, 2722*СС-2);

И — полиморфизм 3020* и-I / икС гена Ы002/СА1Ю15 (3020* и* / и* - 0, 3020* и* / ¡тС - 1, 3020*

¡тС/ 1юС - 2);

е — математическая константа (численное значение: е = 2,7).

В полученную математическую формулу подставляются закодированные данные анализа полиморфизма генов-кандидатов для получения вероятности развития заболевания. Нами были условно выделены следующие группы риска развития заболевания: группа низкого риска (вероятность (р) <0,6); группа среднего риска (0,6< вероятность (р) <0,7); группа высокого риска (вероятность (р) >0,7). При анализе полиморфизма генов в группах больных и популяционного контроля, проведенном с помощью математической формулы расчета риска развития болезни Крона, 73% индивидуумов без признаков патологий ЖКТ правильно отнесены в группу низкого риска БК, 59% больных правильно отнесены в группу высокого риска развития БК.

Далее проведен анализ значения некоторых клинико-анамнестических показателей (пол, курение, возраст, возраст манифестации заболевания) и данных исследования генетического полиморфизма пациентов с БК на прогноз развития осложненных форм заболевания (стриктурирующей и пенетрирующей). Была выбрана модель, включающая 5 предикторов: пол, курение и полиморфизм генов IL4R (1727*A/G), NOD2/CARD15 (2722*G/C, Leu3020fsinsC). Согласно полученным результатам можно выделить следующие факторы прогнозирования развития осложненных форм болезни Крона: курение, женский пол, носительство редких аллелей генов 1727*G (IL-4R), 3020*insC (NOD2/CARD15), 2722*С (NOD2/CARD15).

На основании показателей данной регрессионной модели получена математическая формула для оценки вероятности развития (р) осложненных форм заболевания Крона (пенетрирующей и стриктурирующей):

е(-0,289590+0,207937»/4+0,128176«В+0,425872*С+0,249780»0+0,250953«£) Р ~ 1 е(-0,289590+0,207937»Л+0,128176»В + 0,425872«С+0,249780»0 + 0,250953«Е) '

где

А — пол (мужской — 1, женский -2);

В —полиморфизм /727*A/G гена IL-4R (1727*АА — 0,1727*AG- 1,1727*GG-2); С — курение (курящий -1; некурящий - 0);

D — полиморфизм 3020* wt / insC гена NOD2/CARD15 (3020* wt/wt- 0, 3020* wt/insC- 1, 3020* insC/ insC — 2);

E — полиморфизм 2722*G/C гена NOD2/CARD15 (2722*GG-0, 2722*GC- 1, 2722*CC - 2); e — математическая константа (численное значение: е = 2,7).

В полученную математическую формулу подставляются закодированные данные анализа полиморфизма генов-кандидатов и данные анамнестического исследования для расчета вероятности развития осложненных форм заболевания. Нами были условно выделены следующие группы риска развития осложненных форм заболевания: группа низкого риска развития осложненных форм БК (вероятность (р) <0,6); группа среднего риска развития осложненных форм БК (0,6 < вероятность (р) <0,7); группа высокого риска развития осложненной формы БК (вероятность (р) >0,7).

С помощью второй математической модели 82% пациентов с пенетрирующим и стриктурирующим характером течения БК были правильно отнесены к группе высокого риска развития осложненных форм и в 76% случаев пациенты с воспалительным течением БК были правильно включены в группу низкого риска развития осложненных форм.

Таким образом, применение методов многофакторного анализа с целью установления роли генетических и клинических показателей в прогнозировании формирования осложнённых форм БК еще раз подтвердило значение полиморфизма генов IL-4R и NOD2/CARD15, независимая ассоциация которых с развитием осложненных форм заболевания была ранее показана (Hugot et al., 2001; Zheng et al., 2003). Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у женщин болезнь Крона протекает более агрессивно, чем у мужчин, а женский пол может являться фактором

риска развития более тяжелых форм у пациентов с БК. Согласно эпидемиологическим исследованиям среди пациентов с БК преобладают женщины (Ekbom, 1991, Адлер, 2001), однако причины данного факта не установлены. Вполне вероятно, что половые различия в заболеваемости БК, а также в развитии осложненных форм заболевания обусловлены гормональными особенностями женского организма. Курение как фактор, способствующий более агрессивному течению БК, был ранее установлен в ряде исследований (Sutherland et al., 1990; Cosnes et al., 1996; Cottone, 1994). Одним из возможных механизмов влияния курения на течение БК является супрессорное воздействие никотина на функцию макрофагов (Hugot et al., 1999). С учетом этих сведений можно считать, что курение является фактором, способствующим более активному течению воспалительного процесса при БК и дальнейшему прогрессированию заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Полиморфные аллели генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов, аутофагии и иммунного ответа вовлечены в развитие воспалительных заболеваний кишечника в Северо-Западном регионе России.

2. Полиморфизм генов NOD2/CARD15, JAK2, TNFa, IL-4R независимо ассоциирован с развитием болезни Крона. Маркерами повышенного риска развития БК являются аллели 3020*insC (NOD2/CARD15), I358*C (JAK2), -308*А (TNFa), 1727Ю (IL-4R).

3. Полиморфизм генов NOD2/CARD15, JAK2, IL-I2B, IRGMнезависимо ассоциирован с развитием язвенного колита. Аллели генов rs!0045431*A (IL-12B), 2104*С (NOD2/CARD15), 1358*С (JAK2), а также генотип rsl3361189*CC {IRGM) являются маркерами повышенного риска развития язвенного колита.

4. Взаимодействие аллелей генов JAK2, IL-4R, TNFa вносит вклад в формирование генетической предрасположенности к развитию болезни Крона.

5. Критериями прогнозирования развития осложненных форм болезни Крона являются следующие факторы: курение, женский пол, аллели генов 1727*G (IL-4R), 3020*insC (NOD2/CARD15), 2722*С (NOD2/CARD15).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ в журналах, рекомендованных ВАК

1. Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Семенов Н.В., Барановский А.Ю., Баранов B.C. Генетические факторы предрасположенности к болезни Крона // Медицинская генетика. 2007. Т.6. №5. С. 35-38.

2. Насыхова Ю.А., Семенов Н.В., Харитонов А.Г., Иващенко Т.Э., Барановский А.Ю., Баранов B.C. Анализ полиморфизма генов NOD2/CARD15 и TNFa у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями желудочно-кишечного тракта // Молекулярная медицина. 2010. №3. С. 32-37.

3. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А., Харитонов А.Г., Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э. Полиморфизм гена TNF-а у пациентов с язвенным колитом // Вестник Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования. 2011. Т.З, №3. С.41-45.

в других журналах, включая тезисы

4. Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Семенов Н.В., Барановский А.Ю., Баранов B.C. Полиморфизм цитокиновых генов как маркер риска развития БК // Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. 2011. №16. С. 135-141.

5. Семенов Н.В., Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Барановский А.Ю., Баранов B.C. Роль полиморфизмов гена TNFA в предрасположенности к болезни Крона // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. Материалы 9-го международного славянобалтийского научного форума «Санкт-Петербург - Гастро-2007». 2007. № 1-2. С.99.

6. Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Семенов Н.В., Харитонов А.Г., Баранов B.C. Исследование полиморфизма гена NOD2/CARD15 при болезни Крона и неспецифическом язвенном колите//Вестник РГМУ. 2008. №2. С.316.

7. Харитонов А.Г., Кондрашина Э.А., Иващенко Т.Э., Насыхова Ю.А. Полиморфные варианты гена TNF-a у пациентов с язвенным колитом // Санкт-Петербург - Гастро-2009. 2009. №2-3. С.83.

8. Nasykhova Y., Ivaschenko Т., Semenov N., Baranov V. Crohn's disease and polymorphisms of the NOD2/CARD15 and TNFA genes // European journal of Human genetics. 2007. Vol.15, suppl. 1. P. 244

9. Nasykhova Y.A., Zhemakova A.P., Festen E.A., Ivaschenko Т.Е., Semenov N.V., Kharitonov A.G., Baranovskii A.Y., Weersma R.K., Wijmenga C., Baranov V.S.. Association study of 16 susceptibility loci with Crohn's disease in Russian population // European journal of Human genetics. 2010. Vol.18, suppl. 1. P. 254.

10. Ivashchenko Т., Nasyhova J., Ostankova J., Semenov N., Baranov V.. Polymorphism of TNFA gene promoter region and chronic inflammatory disorders // European Journal of Human Genetics. 2008. Vol. 16, suppl. 2. P. 355.

11.Nasykhova Y.A., Semenov N.V, Ivaschenko T.E, Barovskii A.Y., Baranov V.S. Study of association between polymorphism of 5 genes and Crohn's disease in Russian population // European Journal of Human Genetics. 2009. Vol. 17, suppl. 2. P. 265.

12.Nasykhova Y. A., Semenov, N. V., Kharitonov A.G., Ivashchenko Т.Е. Novel differentiating genetic markers for CD and UC // European Journal of Human Genetics. 2008. Vol. 16, suppl. 2. P. 319.

13. Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Жернакова А.П., Семенов Н.В., Харитонов А.Г., Барановский А.Ю., Баранов B.C. Роль полиморфизма генов системы JAK-STAT в развитии воспалительных заболеваний кишечника // Медицинская генетика. Материалы VI съезда российских медицинских генетиков. Ростов-на-Дону. 2010. С. 125.

14. Kharitonov A.G., Kondrashina Е.А., Baranovsky A.Y., Nasykhova Y.A., Baranov V.S. Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphism in Russian patients with ulcerative colitis. Journal of Crohn's and colitis. 2009. Vol..3. P. 129

15. Семенов H.B., Барановский А.Ю., Щукина О.Б., Кондрашина Э.А., Корниенко Е.А., Насыхова Ю.А., Иващенко Т.Э., Баранов B.C. Новые генетические маркеры болезни Крона и язвенного колита // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. -2010.-№2-3,-С.82-83.

Подписано в печать «11» апреля 2012 г. Формат 60x84/16 Бумага офсеті іая. Печать офсеті гая. Усл. печ. л. 1,-3. Тираж 100 экз. Заказ № 578

Типография «Восстания - 1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Насыхова, Юлия Алмазовна, Санкт-Петербург

61 12-3/1137

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ ИМ. Д.О.ОТТА» СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

Насыхова Юлия Алмазовна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАЗВИТИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА: БОЛЕЗНИ КРОНА И ЯЗВЕННОГО КОЛИТА

Специальность: 03.02.07 Генетика

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т.Э. Иващенко

Санкт-Петербург - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Болезнь Крона и язвенный колит. Определение........................................11

1.2. Классификация болезни Крона и язвенного колита...................................13

1.3. Этиология и патогенез воспалительных заболеваний кишечника............14

1.3.1. Инфекционная природа заболеваний................................................14

1.3.2. Нарушения эпителиального барьера.................................................14

1.3.3. Нарушение иммунного ответа...........................................................15

18

1.3.4. Факторы окружающей среды.............................................................АО

1.3.5. Роль генетического фактора в развитии ВЗК...................................19

1.4. Воспалительные заболевания кишечника как мультифакторные

.......................22

заболевания.....................................................................................

1.5. Генетические факторы воспалительных заболеваний кишечника...........26

1.5.1. Рецепторы врожденного иммунитета...............................................26

1.5.2. Гены, обеспечивающие дифференцирование ТЫ7-лимфоцитов ..30

-1/Г

1.5.3. Гены аутофагии...................................................................................^°

1.5.4. Гены, обеспечивающие поддержание целостности эпителиального

39

барьера............................................................................................................

40

1.5.5. Гены иммунного ответа......................................................................™

1.5.6. Ген .................................................................................................48

1.5.7. Ген ВШЬ2............................................................................................49

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 51

2.1. Материалы исследования..............................................................................51

53

2.2. Методы............................................................................................................

2.2.1. Экстракция геномной ДНК из лимфоцитов периферической крови

.........................53

2.2.2. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов.........54

2.2.3. Анализ полиморфизма генов с использованием Таятап-проб.....57

2.2.4. Анализ конформационного полимофизма однонитевой ДНК.......60

2.2.5. Секвенирование...................................................................................61

2.2.6. Математические методы анализа......................................................62

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................................65

3.1. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфизма исследуемых генов у больных с ВЗК и в популяционной выборке из СевероЗападного региона России....................................................................................65

3.1.1. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма гена ЫОВ2/САВ£>15.......................................................................................65

3.1.2. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов, обеспечивающих дифференцирование ТЫ 7-лимфоцитов (1Ь-23Я, БТАТЗ, МК2, И-12В).....................................................................................67

3.1.3. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полимофизма генов аутофагии (АТв1бЬ1, ШвМ).............................................................70

3.1.4. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма локуса /2Ш5...................................................................................................71

3.1.5. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма генов иммунного ответа (ТМчх, Ш^ТО, РТРЫ2, РТРЫ22, МБП, И-10, 1Ь-18МР, 11-4,1Ь-4К)...................................................................................72

3.1.6. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полимофизма генов дополнительных генов-кандидатов ВЗК (ИКХ2-3, ВТЖ2)............78

3.2. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма исследуемых генов в подгруппах пациентов с различным клиническим течением ВЗК.........................................................................................................79

3.2.1. Клиническая характеристика исследуемых групп..........................79

3.2.2. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизма исследованных генов в подгруппах пациентов с различным клиническим течением ВЗК.................................................................................................82

3.3. Поиск и идентификация новых полиморфных вариантов в гене

NOD2/CARD15 у пациентов с болезнью Крона.................................................88

3.4. Анализ роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к воспалительным заболеваниям кишечника..............92

3.5. Прогнозирование риска возникновения ВЗК на основе полиморфизма генов-кандидатов и средовых факторов риска заболевания.............................97

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ 101

118

ВЫВОДЫ............................................................................................................

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БК - болезнь Крона

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ПААГ - полиакриламидный гель

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТБЕ - буфер, состоящий из триса, борной кислоты и ЭДТА

ТЕ - буфер, состоящий из триса и ЭДТА

ТЕМЕД - Н'^',Ы,Ы-тетраметилэтилендиамин

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат Na

ЯК - язвенный колит

ЕССО (European Crohn's and Colitis Organisation) - Европейская организация по болезни Крона и язвенному колиту

GWAS (Genome-Wide Association Study) - Полногеномный анализ ассоциаций

IBD (inflammatory bowel diseases) - воспалительные заболевания кишечника INF-y (interferon gamma) - интерферон у IL (interleukine) - интерлейкин

LRR (leucine rich repeats) - повторы богатые лейцином MDP (muramildipeptid) - мурамилдипептид NF-kB (nuclear factor kappa-B) - ядерный фактор каппа В OR (odds ratio) - коэффициент соотношения шансов SDS (sodium dodecyl sulfate Na) - додецилсульфат натрия TDT (transmission disequilibrium testing) Thl7 - Т-хелперы -17

TLRs (Toll-like receptors) - То11-подобные рецепторы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), к которым относятся болезнь Крона (БК) и язвенный колит (Ж), является одной из наиболее актуальных задач современной гастроэнтерологии. Несмотря на относительно невысокую частоту ВЗК, неуклонный рост заболеваемости БК и ЯК, смещение начала заболевания в более ранний возраст, появление тяжелых форм, учащение внекишечных проявлений делают ВЗК серьезнейшей проблемой среди патологий желудочно-кишечного тракта (Адлер, 2001; Барановский и др., 2009). Воспалительные заболевания кишечника являются социально значимой проблемой медицины, что обусловлено большими затратами на лечение, потерей трудоспособности в молодом и зрелом возрасте, частой инвалидизацией и сложностью социальной реабилитации больных (Халиф, Лоранская, 2004).

Несмотря на многолетнюю историю изучения ВЗК, этиология заболеваний остается по-прежнему неизвестной, а патогенез исследован недостаточно. В настоящее время признана точка зрения, согласно которой, в возникновении ВЗК участвуют многие внешние и внутренние факторы. На сегодняшний день накоплены данные о роли генетических факторов в развитии заболеваний, их влиянии на особенности клинической картины, и установлено более 40 генов, полиморфизм которых ассоциирован с развитием ВЗК. Прежде всего, это гены, задействованные в регуляции таких процессов как дифференцирование ТЫ7-лимфоцитов, аутофагия, поддержание целостности эпителиального барьера и иммунный ответ (Zhang et al., 2008; Thompson, Lees, 2011; van Limbergen et al., 2007; Cooney, Jewell,

2009).

Несомненную важность имеют работы, направленные на комплексную оценку вклада генетических нарушений в развитие ВЗК. Такие исследования

позволят расширить представления о механизмах возникновения и прогрессирования данных тяжелых патологий желудочно-кишечниго тракта. Изучение генетических маркеров развития ВЗК в будущем позволит выявлять индивидуумов с высоким риском возникновения БК и ЯК, а в дальнейшем может послужить основой для разработки профилактических мероприятий и оптимизации лечения патологий желудочно-кишечного

тракта.

Цель и задачи исследования. Изучить роль аллелей генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера и иммунного ответа в развитии болезни Крона и язвенного колита.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Определить частоты генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета (Ы002/СА1Ю15); дифференцировки ТЫ 7-лимфоцитов (1Ь-23Я ЯТАТЗ, ЗАК2, И-12В); аутофагии (АТабЫ, ЖвМ); иммунного ответа (ТШа; ТИГ8Е15, РТРШ, РТРN22, 11-10, 11-ШАР, МБТ1, 1Ь-4, 1Ь-4Я); эпителиального барьера (Ж05), а также ЫКХ2-3 и ВТЫЬ2 в общей группе пациентов с ВЗК, группе пациентов с БК, группе пациентов с Ж и в популяционном контроле.

2. Провести сравнительный анализ частот генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ 7-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также МКХ2-3 и ВТИЬ2 в общей группе пациентов с ВЗК, группе пациентов с БК, группе пациентов с ЯК и в популяционном контроле.

3. Исследовать ассоциацию полиморфных вариантов генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также ЫКХ2-3 и ВТЖ2 с клиническими параметрами у пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом.

4. Провести поиск и идентификацию новых полиморфных вариантов в вариабельной области экзона 4, а также в экзоне 11 гена ИОВ2/СА1Ю15 у пациентов с БК.

5. Определить комплексный вклад и прогностическое значение полиморфных аллелей генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов, аутофагии, эпителиального барьера, иммунного ответа, а также ИКХ2-3 и ВТЫЬ2 в развитии ВЗК.

Научная новизна работы. В рамках данного исследования впервые изучено распределение частот генотипов и аллелей по генам рецепторов системы врожденного иммунитета (N002/0АЯО15 (2104*С/Т, . 2722*0/0, Ьеи302¡т С))\ дифференцировки ТЫ 7-лимфоцитов (1Ь-23Я (798+2778*С/Т, 1142Ю/А), БТАТЗ (-1-13666*Т/С'), МК2 (1358*С/А), И-12В 10045431 *С/А)); аутофагии (АТЫбЫ (841*А/в), ШвМ (^13361189*7/0)); иммунного ответа (7Мч* (-238*0/А, -308Ю/А); ТЫГ8Е15 (г$4263839* в/А), РТРШ (гз2542151 *С/Т), РТРЮ2 (1858*С/Т), 11-10 (г$3024505*С/Т), 1Ь-18ЯАР (Г8917997Ю/А), МШ (1965Ю/Т), 1Ь-4 (-590*С/Т), И-4Я (1727*АЮ)); эпителиального барьера (1В05 (^2522057*0/0)), а также ИКХ2-3 (га10883365*А/в) и ВТЖ2 (1050*С/Т) у пациентов с БК, у пациентов с Ж и популяционной выборке Северо-Западного региона РФ. Впервые был проведен анализ ассоциации полиморфизма генов с клиническими параметрами воспалительных заболеваний кишечника (форма течения БК, степень тяжести ЯК). Впервые получены результаты, свидетельствующие об ассоциации полиморфных вариантов генов N002/САМ) 15 (Ьеи3020^1тС), МК2 (1358*С/А), ТШа (-308Ю/А), И-4Я (1727*АЮ) с развитием БК, а также полиморфных вариантов генов Ы002/САМ)15 (2104*С/Т), И-12В (^10045431 *С/А), МК2 (1358*С/А), ЖвМ (к13361189*Т/С) с развитием ЯК. Впервые обнаружены достоверные различия частот генотипов и аллелей для вариантов генов N002/0АЯО 15 (2722*0/0, 1еи3020/э1тС), К-10

(гз3024505*С/Т), 1Ь-4Я (1727*А/в) в группах с осложненными (стриктурирующая, пенетрирующая) и воспалительной формами течения БК. Впервые у пациентов с БК в северо-западном регионе России идентифицированы 3 новых полиморфных варианта в экзоне 4 гена N002/0А1Ю15. Разработана система детекции данных вариантов гена Ы002/САМ)15. Впервые получены результаты, свидетельствующие о роли взаимодействия генов ЗАК2 (1358*С/А), ПАЯ (1727*А/О), ТМРа (-308*С/А) в развитии БК. Впервые разработаны логические регрессионные модели -модель прогнозирования риска развития БК и модель риска развития осложненных форм БК.

Практическая значимость. Анализ полиморфизма генов НСЮ2/САШ)15 (ЬеиЗ020/81тС), ЗАК2 (1358*С/А), ТМГа (-308Ю/А), 11-411 (1727*А/О), И-12В (г810045431*С/А), ЖОМ (гз13361189*Т/С), И-10 (гз3024505*С/Т) можно рекомендовать в качестве дополнительного исследования для оценки риска развития воспалительных заболеваний кишечника в Северо-Западном регионе РФ. Определены критерии прогнозирования развития осложненных форм болезни Крона, а также предложены математические модели для расчета вероятности прогрессирования заболеваний на основе данных клинического и генетического исследований. Основные положения, выносимые на защиту:

• Полиморфные аллели генов рецепторов системы врожденного иммунитета, дифференцировки ТЫ7-лимфоцитов, аутофагии и иммунного ответа вовлечены в развитие воспалительных заболеваний кишечника в Северо-Западном регионе России.

• Маркерами повышенного риска развития БК являются аллели 3020*шС (ЖВ2/СА1Ю15), 1358*С ЩК2), -308*А (ТИРа), 1727*0 (1Ь-

4К).

. Полиморфные аллели rs10045431*А (IL-12B), 2104*С (NOD2/CARD15), 1358*С (JAK2) и генотип rsl3361189*CC (IRGM) являются маркерами повышенного риска развития язвенного колита.

• Взаимодействие аллелей генов JAK2, IL-4R, TNFa вносит вклад в формирование генетической предрасположенности к развитию болезни Крона.

• Критериями прогнозирования развития осложненных форм болезни Крона являются следующие факторы: курение, женский пол, аллели генов 1727Ю (IL-4R), 3020*insC (NOD2/CARD15), 2722*С (NOD2/CARD15).

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2008), на Европейских конгрессах по генетике человека (Nice, 2007; Barcelona, 2008; Vienna, 2009; Gothenburg, 2010), на VI Съезде российских медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), на научных семинарах Лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней человека ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Библиографический указатель включает 214 источников, из них 200 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 18 рисунками, содержит 3 приложения.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Болезнь Крона и язвенный колит. Определение

Согласно современной номенклатуре болезнь Крона (БК) и язвенный колит (Ж) относятся к группе воспалительных заболеваний кишечника

(ВЗК).

Терминальный илеит (болезнь Крона) стал нозологически очерченной формой после работы Crohn et al. (1932), который подробно описал клиническую картину 14 случаев заболевания и охарактеризовал его, как «заболевание терминального отдела кишки, наблюдающееся преимущественно у взрослых в молодом возрасте и характеризующееся подострым или хроническим воспалением с некрозом и рубцеванием; изъязвление слизистой сопровождается непропорциональной реакцией соединительной ткани, которая часто ведет к стенозу кишечника, ассоциированному с формированием нескольких свищей». В дальнейшем было показано, что воспалительный процесс в рамках заболевания может распространяться на все отделы желудочно-кишечного тракта (Fahimi et al, 1963; Dyer et al., 1969; Lockhart-Mummery et al., 2006; Барановский А.Ю. и др., 2005). В 1998 году Fiocchi et al. охарактеризовал БК как мультифакториальное заболевание, вызванное взаимодействием генетических и экологических факторов. Отечественные авторы дают следующее определение: БК - хроническое рецидивирующее заболевание, характеризующееся трансмуральным гранулематозным воспалением с сегментарным поражением разных отделов пищеварительного тракта

(Ивашкин и др., 2001).

Язвенный колит (ЯК) является хроническим воспалительным

состоянием, вызывающим непрерывное воспаление слизистой оболочки толстой кишки без гранулем в биопсии, поражающим прямую кишку и различные по протяженности непрерывные участки толстой кишки. Течение

Ж характеризуется рецидивами и ремиссиями (Барановский, Щукина и др., 2009). Язвенный колит (Ж) был впервые описан как самостоятельное

заболевание Wilks и Мохоп в 1875 г.

Современная диагностика БК и ЯК основывается на комбинации клинических, гистологических, эндоскопических и рентгенологических данных. Необходимость в точном диагнозе продиктована различиями течения этих заболеваний, антагонистическим влиянием курения табака на тяжесть заболевания, разным ответом на терапию, включая особенности в выборе лечения и объеме оперативного вмешательства (проведение частичной или полной колэктомии), развитием характерных для каждого из этих заболеваний осложнений, различиями в прогнозе и обязательности длительного наблюдения.

Распространенность ВЗК в различных регионах мира варьирует и составляет для язвенного колита (Ж) - от 30 до 240 на 100 тыс. населения, а для болезни Крона (БК) — от 10 до 150 на 100 тыс. населения. Существует два возрастных пика заболеваемости ВЗК: в возрасте 20-29 лет и 60-79 лет. (Халиф, Лоранская, 2004). Распространенность ВЗК среди детей составляет 2,2-6,8 на 100 тыс. детей (Яблокова и др., 2008). Результаты эпидемиологических иссле�