Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге

Калинина, Ольга Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге"

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

КАЛИНИНА Ольга Викторовна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВАРИАНТОВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ

(03.00.06 - вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандитата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2000

Работа выполнена в Санкт-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологи им.Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук С.Л. Мукомолов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор О.К. Кузнецов

доктор биологических наук В.И. Евтушенко

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт эпидемиологии микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, РАМН.

Защита диссертации состоится .!-?.У-?.*:.О?!?¡9 2000 г. в .//...час <й{^мин на заседали диссертационного совета Д.001.46.01 при НИИ гриппа РАМН по адресу: Санкп Петербург, ул. Профессора Попова, д. 15/17.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ гриппа РАМН.

Автореферат разослан «. Ш.» ......2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.Е. Покровская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Гепатит С (ГС) является одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всем мире, включая Россию. Это связано с широким распространением инфекции и частыми ее неблагоприятными исходами с развитием хронического гепатита, цирроза печени и гепатокарциномы. При отсутствии эффективных методов специфической профилактики и лечения ГС предотвращение распространения инфекции явялется основной задачей в борьбе с данным заболеванием.

Одной из особенностей вируса ГС (ВГС) является его высокая генетическая вариабельность. Современная классификация включает 6 генотипов и более 100 субтипов ВГС (Бттопёз Р., 1999). Определение генотипов ВГС имеет большое значение для практической медицины, так как позволяет решать задачи эпидемиологического надзора за инфекцией, прогнозирования исходов заболевания и выработки тактики противовирусной терапии.

Известно, что генотипы 1, 2 и 3 наиболее распространены, при этом тот или иной их субтип доминирует в разных географических зонах. О распространнености различных генотипов и субтипов ВГС в отдельных регионах Россини до сих пор имеется небольшое количество сообщений. В этих работах было отмечено доминирование субтипа 16, которое сохраняется до настоящего времени согласно недавно опубликованным данным (Вязов С.О. и др., 1996; Львов Д.К. и др., 1996, 1997; Мукомолов С.Л. и др., 1996; Утгоу Б. е1 а]., 1997; Кузин С.Н. и др., 1999; БЬ^оу А. е1 а1., 1999). В отношении распространения других субтипов вируса ГС в доступной литературе имеются ограниченные и весьма противоречивые сведения.

Несмотря на то, что определение генотипов ВГС помогает в решении ряда задач эпидемиологии, информация о конкретном геноварианте изолята ВГС не является абсолютным доказательством общности источника инфекции, конкретных путей распространения возбудителя, поскольку не несет сведений о генетических взаимоотношениях между различными вариантами ВГС. Такие материалы можно получить лишь при изучении молекулярно-генетической характеристики каждого изолята вируса.

Международный генетический банк ЕМВЬ (ОепеВапк) постоянно пополняется данными о нуклеотидных последовательностях различных участков генома новых изолятов ВГС, выделяемых в разных географических зонах. Эта информация позволяет уточнять принадлежность каждого изолята к конкретному субтипу и определять новые субтипы ВГС с помощью филогенетического анализа. Сравнение результатов генотипирования, выполненных на различных участках генома изолятов ВГС, до сих пор не выявило генетических рекомбинаций (Биптопск Р, 1999). В то же время, в некоторых исследованиях методом ПЦР с использованием типоспецифических праймеров было обнаружено в образцах сыворотки крови одновременное присутствие нескольких изолятов ВГС, принадлежавших к разным генотипам (/апш Ь. & а1., 1994; воишау I. е1 а1., 1995; БЬепв Ь. е1 а!., 1995; №$Ыгопо А. Й а1., 1997; Львов Д. и др., 1997; Тарасов К., 1998). Однако эти данные не были подтверждены при анализе нуклеотидных последовательностей (Х^агоу Я. й а1., 2000). Таким образом, вопросы о существовании смешанной инфекции, обусловленной одновременно несколькими гено/субтипами ВГС, и формирования новых генетических вариантов вируса за счет рекомбинации между геномами разных субтипов остаются неясными.

Количество публикаций, посвященных анализу нуклеотидных последовательностей российских изолятов ВГС, весьма ограничено (Васильев В.Б. и

др., 1994; \Ча7.оу Б. й а!., 1997; Тарасов К.В., 1998), и лишь в одной из них был проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей изолятов ВГС субтипа 16, который показал отсутствие тесных генетических взаимоотношений между российскими изолятами (ЛЯагоу Б. й а1., 1997).

Цель исследования: охарактеризовать варианты ВГС, циркулирующие в Санкт-Петербурге, и установить особенности их распространения среди различных групп населения города с помощью молекулярно-геиетических методов.

Задачи исследования

1. Оценить эффективность использования праймеров из различных областей генома ВГС при выявлении РНК ВГС в образцах сыворотки крови методом обратно-транскриптазной и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

2. Провести генотипирование вариантов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге, с помощью анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции участков генома ВГС, амплифицированных в полимеразной цепной реакции (РС11-11РЬР).

3. Определить нуклеотидные последовательности фрагмента Ы85В области генома изолятов ВГС различных генотипов методом лимитированного ссквенирования.

4. Изучить особенности распространения и генетические взаимоотношения между изолятами ВГС различных субтипов, циркулирующих среди больных ГС и анти-ВГС-позитивных пациентов отделений гемодиализа, на основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из ЫБ5В области генома.

5. Установить возможность смешанной инфекции, обусловленной различными вариантами возбудителя, а также генетической рекомбинации между изолятами, принадлежащими к разным субтипам ВГС.

6. Показать преимущества использования молекулярно-генетических методов при решении задач эпидемиологического надзора за вирусным гепатитом С.

Научная новизна

Впервые на основании лимитированного секвенирования участков генома и анализа нуклеотидных последовательностей изолятов изучена генетическая структура популяции ВГС на территории Санкт-Петербурга.

Получены новые данные о распространении субтипов 1а, 16, За среди различных категорий инфицированных лиц, включая пациентов из групп риска. Впервые в Санкт-Петербурге выявлены субтипы 2а, 2с и 4а.

У больных ГС, поступавших на лечение в инфекционные отделения стационаров города, показано доминирование ВГС субтипа За. Впервые на основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка Ш5В области генома, установлено, что в Санкт-Петербурге сформировались варианты ВГС субтипа За, отличные от европейских и азиатских вариантов данного субтипа. У анти-ВГС позитивных пациентов отделений гемодиализа показано преобладание вариантов ВГС субтипа 16 и установлены пути их распространения. В одном из отделений гемодиализа выявлен «внутрибольничный» вариант данного субтипа.

На основе анализа нуклеотидных последовательностей получены убедительные доказательства смешанной инфекции, обусловленной разными вариантами возбудителя, и возможности генетической рекомбинации между изолятами ВГС различных генотипов.

Впервые в России выявлены изоляты ВГС субтипа 2к, который был зарегестрирован в качестве нового субтипа генотипа 2 в международном банке данных (2000 г.) и ранее выявлялся только в Молдавии.

Практическое значение

Результаты работы свидетельствуют о необходимости внедрения молекулярно-енетических методов в эпидемиологический надзор за вирусным гепатитом С. В ходе [сследования был апробирован модифицированный метод PCR-RFLP, который может !ыть рекомендован для слежения за циркуляцией субтипов/генотипов ВГС среди различных категорий населения. Внедрение метода лимитированного секвенирования юзволит быстро проводить филогенетический анализ нуклеотидных юследоватсльностей генома изолятов ВГС для выявления возможных источников [нфекции и факторов передачи с целью предотвращения дальнейшего распространения ¡озбудителя. Результаты работы включены в аналитический обзор «Вирусные гепатиты ! Российской Федерации, вып.З», а также используются в учебном процессе в СПб ШИЭМ им. Пастера (1-й и 2-й учебные семинары для врачей-эпидемиологов Эпидемиология вирусных гепатитов и эпидемиологический надзор за этими тфекциями в современный период», СПб, 1999, 2000). Полученные результаты [спользуются в работе кафедр и клиник инфекционных болезней Военно-медицинской .кадемии и Санкт-Петербургского медицинского университета им. акад. И.П.Павлова.

Положения, выносимые на защиту . В настоящее время в Санкт-Петербурге циркулируют 7 субтипов вируса ГС: 1а, 16, 2а, 2с, 2к, За и 4а. При этом субтип За доминирует у больных ГС, поступавших на лечение в инфекционные отделения стационаров города. В то же время ВГС субтипа 16 продолжает оставаться наиболее распространенным у пациентов отделений хронического гемодиализа. !. Наряду с разнообразными вариантами вируса ГС субтипа 16, встречающимися у больных ГС и родственными европейским и азиатским вариантам ВГС, в Санкт-Петербурге сформировались собственные варианты ВГС субтипа За, отличные от большинства европейских и азиатских вариантов данного субтипа. В отделениях хронического гемодиализа возможно формирование «внутригоспитального» варианта ВГС субтипа 16, отличающегося от вариантов этого субтипа, выявляемых у больных инфекционных стационаров. I. При гепатите С существует смешанная инфекция, обусловленная несколькими субтипами вируса, а также возможна рекомбинация между геномами изолятов, принадлежащих к различным генотипам ВГС.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Международном симпозиуме (Эпидемиология и здравоохранение» (Ханой, 1995), 9-й Международном конгрессе по шфекционным болезням (Буэнос-Айрес, 2000), 10-м Международном симпозиуме по шрусным гепатитам и болезням печени (Атланта, 2000), 5-й Российской гастро-иггерологической неделе (Москва, 1999), 3-й и 4-й Российских научно-практических гонференциях «Гепатиты В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» Москва, 1999), на научно-практической конференции «Гепатит С» (Москва, 2000), на аседаниях Санкт-Петербургского научного общества эпидемиологов и микробиологов ) 1999-2000 гг. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 150 страницах, содержит 12 таблиц и 21 рисунок, жшочает введение, 7 глав (обзор литературы, материалы и методы, 4 главы результатов «следования, обсуждение и выводы), приложение и список литературы. Список штературы включает 197 работ отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Образцы сыворотки крови

В работе изучено 716 образцов сыворотки крови, полученных от пациентов инфекционных отделений стационаров и отделений хронического гемодиализа (ОГД) Санкт-Петербурга. Всс образцы содержали антитела к ВГС (анти-ВГС). Определение анти-ВГС проводили с использованием иммуноферментных тест-систем 3 поколения anti-HCV (НПФ "Аквапаст», С.Петербург), HCV Monolisa (Sanofi Diagnostic Pasteur, France) или UBI HCV EIA 4.0 (Organon Teunika, Netherlands) совместно с научным сотрудником В. А. Плотниковой (лаборатория вирусных гепатитов Санкт-Петеребургского НИИЭМ им. Пастера).

Образцы сыворотки крови, полученные от 294 пациентов инфекционных отделений стационаров с диагнозом ГС, были предоставлены д.м.н. К.В.Ждановым (Военно-медицинская академия), врачом-инфекционистом Т.А.Ветровым (городская инфекционная больница N30 им. С.П.Боткина), к.м.н. Т.Г.Дмитриевой (детская инфекционная больница N3). В анамнезе 130 больных имелись указания на внутривенное употребление наркотических средств. 65 больных обращалось за медицинской помощью в течение 6 месяцев, предшествовавших заболеванию, и могли быть инфицированы в медицинских учреждениях, включая 24 пациента детских отделений гемодиализа (14), нефрологии (4) и гематологии (6). Также изучен 61 образец сыворотки крови больных хроническим ГС, которые были предоставлены Медицинским факультетом Якутского Государственного Университета (к.м.н. М.Н.Алексеева). В коллекции из Якутии было 27 образцов сыворотки крови, полученных от мужчин, и 34 - от женщин, возраст пациентов варьировал от 16 до 65 лет. Помимо образцов сыворотки крови взрослых больных в коллекцию входило 3 образца сыворотки крови детей в возрасте от 8 до 14 лет. В работе также были использованы 25 образцов биоптатов печеночной ткани, полученных от пациентов инфекционного отделения Военно-Медицинской Академии (д.м.н. К.В.Жданов).

361 образец сыворотки крови был получен от 151 пациента трех отделений хронического гемодиализа (врач М.В.Борзанова): Городского центра гемокоррекции (ОГД-1), отделения хронического гемодиализа больницы N26 (ОГД-2) и отделения хронического гемодиализа больницы им. И.И.Мечникова (ОГД-3). За каждым пациентом в каждой смене была закреплена своя диализная машина. В течение периода наблюдения забор крови проводили у всех пациентов в ОГД-1 трижды (октябрь 199 8, апрель и ноябрь 1999) и по 2 раза (апрель и ноябрь 1999) в ОГД-2 и -3. В анамнезе большинства пациентов имелись указания на оперативные медицинские вмешательства, в то же время отсутствовали указания на внутривенное использование наркотических препаратов. Все пациенты были неоднократно госпитализированы в различные клиники города, в связи с чем установить время и место их инфицирования ВГС не представлялось возможным. Поэтому, всех пациентов, в образцах сыворотки крови которых при первом обследовании были обнаружены анти-ВГС, считали хронически инфицированными вирусом ГС. Все сотрудники трех ОГД регулярно обследовались на анти-ВГС. При первом обследовании одна медсестра, работавшая в ОГД-3, оказалась позитивной по анти-ВГС. У остального медицинского персонала анти-ВГС обнаружены не были в течение всего периода наблюдения.

Выделение РНК ВГС из сыворотки крови

Кровь отбирали в стерильные полипропиленовые пробирки и центрифугировали ри 2000 об.мин в течение 15 мин. Полученную сыворотку аликвотировали по 100 мкл стерильные полипропиленовые микропробирки типа эппендорф (в дальнейшем -икропробирка) и хранили при - 20°С. Тотальную РНК выделяли из 100 мкл сыворотки рови, используя гуанидинизотиоционат-фенол-хлороформный метод с одификациями (Garson J. at el., 1990), а также коммерческий набор реагентов фирмы (iaGene. Осадок РНК растворяли в 20 мкл стерильной свободной от РНКаз воде, [олученный образец тотальной РНК хранили при -20°С.

Амплификация фрагментов генома ВГС

Все стадии амплификации, включая синтез кДНК, проводили в режиме втоматической амплификации в полипропиленовых тонкостенных пробирках для [икропроб однократного применения объемом 0,5 мл в DNAThermal Cycler (Perkin ;imer 9600 или PTC-100, MJ Research, Inc.).

Синтез кДНК на матрице РНК ВГС

Для постановки реакции обратной транскрипции использовали 5 мкл выделенной оталыюй РНК. Синтез кДНК на матрице РНК ВГС осуществляли, используя 100U >ермента обратной транскриптазы Superscriptll (GIBCO-BRL, Md.) и 0,1U А2бо лучайных гексаоксирибонуклеотидных праймеров (Boerhinger Mannheim) в 20 мкл еакционной смеси, содержавшей 200 мМ каждого dNTP, 50 мМ Tris-HCl рН8.3,40 гпМ ICI, 10 mM MgCl2, 10 шМ DTT, 10U RNAzin (ингибитор РНКаз). Реакцию проводили в ечение 2 часов при 42°С. В случае генотипирования методом PCR-RFLP для получения ДНК в реакции обратной транскрипции использовали внешний обратный праймер tuv-2 вместо случайных гексаоксирибонуклеотидных праймеров.

Амплификация кДНК методом «гнездной» ПЦР

Полученная кДНК служила матрицей для проведения первой стадии ПЦР. Для ювышения чувствительности и контроля специфичности во всех случаях проводили (гнездную»-ПЦР с внутренними праймерами по отношению к праймерам, 1спользуемым на первой стадии ПЦР, при этом матрицей являлся амплификат, юлученный после первой стадии реакции. Каждую стадию ПЦР проводили в ггандартпых условиях с использованием 2.5U AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer 3etus, Branchburg, NJ, USA) или 2.5U Taq-полимеразы («Биотех», Москва) в 50 мкл >еакционной смеси, содержавшей 30 мМ Трис HCl рН8.8, 16.3 мМ сульфата аммония, ).01% Nonidet P40-Tvveen 20 и 10 мМ каждого dNTP. К каждой паре праймеров путем титрования была подобрана оптимальная концентрация йонов Mg2+, которая составила 1ля обеих пар праймеров из 5'UTR и 5'UTR/core областей генома 1,5 мМ на реакцию, 1ля обеих пар праймеров из NS5B области - 2,5 мМ. При ПЦР-амплификации шализируемых участков генома (5'UTR, 5'UTR/core и NS5B) были использованы универсальные праймеры, в которые были включены «вырожденные» тоследовательности, что позволяло отжиг этих праймеров на матрице всех вариантов ЗГС независимо от генотипа. Приведенные ниже позиции всех праймеров ;оответствуют нуклеотидной последовательности генотипа lb штамма HCV-HB с здентификационным номером L02836 в банке данных EMBL.

На первой стадии ПЦР 5 мкл кДНК амплифицировали, используя 50 пМ внешних праймеров, которыми были: a) stuvl в позиции 32 и stuv2 в позиции 309 из наиболее консервативной 5'UTR области генома (Stuyver L. et al., 1993), термальный профиль: начальная денатурация 94°С 3 мин; 40 циклов с денатурацией при 94°С 20 сек, отжиг/полимеризация при 70°С 90 сек; б) hep-101 в позиции 8258 и hep-120 в позиции

8687 внутри NS5B области генома (Norder Н. et al.,1998), термальный профиль: начальная денатурация 94°С 3 мин; 40 циклов с денатурацией при 94°С 15 сек, отжиг при 55°С 15 сек, полимеризация при 70°С 30 сек.; завершающий синтез при 70°С 4 мин.; в) 32-sense в позиции 28 и 186-antisense в позиции 758 из 5'UTR/CORE областей генома ВГС (Stuyver L. et al., 1993; Okamoto H. et al, 1992), термальный профиль: начальная денатурация 94°С 3 мин; 40 циклов с денатурацией при 94°С 20 сек, отжиг при 55°С 20сек, полимеризация при 70°С 60 сек, завершающий синтез при 70°С 4 мин.

На второй стадии ПЦР 5 мкл амплификата, полученного на первой стадии ПЦР, добавляли к 45 мкл реакционной смеси, содержавшей 80 пМ внутренних праймеров, которыми были: a) stuv3-sense в позиции 67 и stuv4-antisense в позиции 281 в 5'UTR области генома (Stuyver L. et al., 1993), термальный профиль не отличался от первой стадии ПЦР в этой области генома; б) hep-101 and hep-105-antisense в позиции 8616 внутри NS5B области генома (Norder Н. et al., 1998), термальный профиль: начальная денатурация 94°С 3 мин; 40 циклов с денатурацией при 94°С 10 сек, отжиг при 55°С Юсек, полимеризация при 70°С 20 сек.; завершающий синтез при 70°С 4 мин.; B)stuvl-sense и 186-antisense из 5'UTR/CORE областей генома ВГС, термальный профиль: начальная денатурация 94°С 3 мин: 40 циклов с денатурацией при 94 С 20 сек, отжиг/полимеризация при 70°С 90 сек, завершающий синтез при 70°С 4 мин.

Амплифицированные фрагменты идентифицировали в 2% агарозном геле (Sigma) с добавлением бромистого этидия и визуализировали в ультрафиолетовом свете при длине волны 200нм. В качестве маркера молекулярных масс использовали ДНК фага фХ174/НаеШ. Положительным на наличие РНК ВГС считали образец, содержавший амплифицированные фрагменты следующего размера в зависимости от использованных праймеров: stuvl/stuv2 - 304 п.о., stuv3/stuv4 - 240 п.о., hep-101/hep-120 - 467 п.о., hep-101/hcp-105 - 383 п.о., 32/186 - 750 п.о., stuvl/186 - 730 п.о. Объем проведенных исследований представлен в таблице 1.

Таблица 1.

Объем проведенных исследований

Методы исследования Области генома ВГС Всего

5'UTR core NS5B

Гнездная ПЦР 585 61 170 816

PCR-RFLP 128 .* - 128

Лимитированный сиквенс 61 61 162 284

Всего 774 122 332 1228

* - исследования не проводились

Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции амплифииированных участков генома ВГС (PCR-RFLP)

В данной работе использовали модифицированный метод PCR-RFLP (Thiers V. et al., 1997), который позволяет идентифицировать наиболее часто встречающиеся в Европе субтипы ВГС - 1а, 16, 2, За и 4/5. Метод основан на рестрикции амплифицированного фрагмента из 5'UTR области генома ВГС с использованием трех мелкощепящих эндонуклеаз (рестриктаз) - BstNl, BstUl и Sau3a. После ОТ-ПЦР с праймерами stuv3/stuv4 три порции амплифицированного фрагмента (240-241 п.о.) подвергали рестрикции в течение 2 часов с каждой из упомянутых рестриктаз в отдельности (из расчета 2U фермента на реакцию) согласно инструкциям'

производителя (Boerhinger Mannheim). Фрагменты рестрикции разделяли в 3% высокоразрешающем агарозном геле (Metaphor-FMC BioProducts-Rockland ME), который позволяет идентифицировать фрагменты, состоящие из 50-250 пар нуклеотидов. В качестве маркера молекулярных масс использовали стандартный 100 bp DNA ladder (Promega). Сравнительный анализ полученных электрофорсграмм амплифицированных фрагментов, обработанных рестриктазами BstNl, BstUl и Sau3a, позволял сделать заключение о субтипах/генотипах ВГС.

Определение нуклеотидных последовательностей участков генома ВГС

методом лимитированного секвенирования

Учитывая цель данного исследования, для секвенирования был выбран участок внутри NS5B области генома (праймер hep-105), для которого в GenBank широко представлены сиквенсы всех субтипов ВГС из различных стран мира. Для изучения возможности рекомбинации между геномами изолятов разных субтипов ВГС, а также для верификации результатов генотипирования, полученных методом PCR-RFLP, проводили дополнительно определение нуклеотидных последовательностей на участке 5'UTR/core области генома ВГС (праймеры stuvl/186).

Все амплификаты перед секвенированием были очищены с использованием коммерческого набора реагентов GFX PCR DNA and Gel Band purification kit (Amersham Pharmacia Biotech) согласно прилагаемой инструкции. Реакция лимитированного секвенирования была выполнена с использованием BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Kits (PE Biosystems, version 2.0) с 4 пмоль праймера (hepl05, stuvl, 186). Гель-электрофорез проводили на автоматических секвенаторах ABI PRISM 377 и 310 (Applied Biosystems).

Анализ нуклеотидных последовательностей

Сиквенсы ДНК читали, собирали и обрабатывали с помощью пакета программ LASERGENE (DNA STAR Inc., Madison, WI). Множественное выравнивание полученных сиквенсов ДНК по соответствующим участкам 130 сиквенсов ВГС (таблица 3) и GBV-B из GenBank, выполняли с помощью программы Clustal X. Филогенетический анализ был выполнен методами neighbor-joining (метод объединения ближайших соседей) и UPGMA (невзвешенный парногрупповой метод) (программа NEIGHBOR), используя Kimura's two parameter (двухпараметрический метод коррекции) (программа DNASIST) из пакета PIIYLIP версия 3.53 (Felsenstein А., 1993; Вейр Б., 1995). При этом GBV-B вирус служил внешней группой по отношению ко всем субтипам ВГС. Обработку полученного филогенетического дерева проводили с помощью программы TREETOOL версии 1.0 в GDE версии 2.2 (Genetic Data Environment, Milipore Imaging Systems, Ann Arbor, MI). Чтобы подтвердить достоверность совпадения кластеров на филогенетическом дереве, проводили бутстрэпинг (bootstrap) на 200 повторах аналогичных деревьев (репликатов) с использованием программ SEQBOOT и CONSENSE из пакета PHYLIP версии 3.53. В результате получали величины (процент бутстрэпинга), которые показывают сколько раз стоящая справа от узла группа изолятов появлялась среди 200 репликатов бутстрэпинга. Значение бутстрэпинга >70 соответствовало достоверности филогенетической группировки при вероятности >95% (р< 0,05).

Статистическая обработка результатов проведена с использованием пакета программ Microsoft Excel 6.0. Определяли показатель средних величин (М), стандартную ошибку средних величин этих показателей (т), достоверность различий показателей в сравниваемых группах с использованием t-критерия Стьюдента; различия считались достоверными при вероятности >95% (р< 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящая работа велась в трех основных направлениях: определение субтипов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге; выявление генетических взаимоотношений между изолятами ВГС, выделенными от анти-ВГС позитивных пациентов различных стационаров; изучение возможности смешанной инфекции, обусловленной различными вариантами вируса ГС, а также существования рекомбинации между геномами изолятов ВГС различных генотипов.

1. Определение субтипов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге

Для изучения распространенности генотипов/субтипов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге, было использовано два метода: PCR-RFLP и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей из NS5B области генома.

Методы генотипирования изолятов ВГС основаны на применении ОТ-ПЦР. Одним из важнейших условий ее успешного проведения является выбор праймеров и области генома для амплификации. Это определило целесообразность оценки эффективности использования праймеров из трех областей (5'UTR, core, NS5B) генома, наиболее часто используемых для генотипирования изолятов ВГС, при выявлении РНК ВГС. Для этого было произвольно отобрано 60 образцов сыворотки крови, полученных от анти-ВГС позитивных пациентов инфекционных отделений стационаров города. РНК ВГС была выявлена в 50 (83%) из 60 образцов методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров из 5'UTR области генома, в 48 (80%) - из 5'UTR/core и в 41 (68%) - из NS5B области. Ни в одном образце, который оказался РНК ВГС-негативным при использовании праймеров из 5'UTR области, РНК ВГС также не была выявлена с помощью двух других наборов праймеров. Из приведенных результатов видно, что использование праймеров из 5'UTR области генома ВГС наиболее эффективно при выявлении РНК ВГС в образцах сыворотки крови методом ОТ-ПЦР.

Учитывая изложенное, а также данные литературы, для проведения генотипирования изолятов ВГС был выбран метод PCR-RFLP в модификации V. Thiers et al. (1997), основанный на амплификации фрагмента из 5'UTR области генома ВГС. Данный метод позволяет дифференцировать три основных субтипа ВГС (1а, 16 и За), которые, как было показано ранее, наиболее распространены на большей части европейской территории, включая Россию, а также генотипы 2 и 4/5.

С помощью данного метода было проведено генотипирование изолятов ВГС из образцов сыворотки крови, полученных от 72 больных ГС, которые находились на лечении в инфекционных отделениях стационаров Санкт-Петербурга с ноября 1998 по февраль 1999 г. (табл. 2).

Полученные результаты свидетельствовали о явном доминировании субтипа За (65%) среди основной популяции Санкт-Петербурга независимо от способа заражения (см. табл. 2). Субтип 16 занимал только второе место (19%). Эти данные противоречили опубликованным ранее материалам, согласно которым в Санкт-Петербурге доминировал генотип 1 (субтип 16) (Мукомолов СЛ. и др., 1996; Тарасов К.В., 1998; Созина И.А., 1999). Помимо указанных субтипов ВГС, но в меньшем числе случаев, с помощью метода PCR-RFLP были выявлены субтип 1а и генотип 4/5 (по 2% каждый), а также генотип 2 (8%). При этом только у трех лиц, употреблявших внутривенно наркотические средства (ВВН), в образцах сыворотки крови было выявлено присутствие более чем одного субтипа ВГС (За и 1а/1б).

Таблица 2.

Распределение субтипов/генотипов ВГС, выделенных от больных ГС инфекционных отделений стационаров Санкт-Петербурга (по данным РСЯ-Ш-ЪР)

Способ заражения Число пациентов Субтипы /генотипы ВГС Число пациентов с более чем одним субтипом ВГС

1а 16 2 За 4/5

ВВН 37 „* 4 - 30 - 3

Мед. ман. 12 - 3 4 5 - -

Другие 23 1 7 2 12 1 -

Всего 72 (100%) 1 (2%) 14 (19%) 6 (8%) 47 (65%) 1 (2%) 3 (4%)

Примечание: Мед. ман. - медицинские манипуляции; Другие - способ заражения не известен;

* данный вариант не обнаружен.

Установленное несоответствие между результатами распространения субтипов ВГС на территории Санкт-Петербурга, полученными в данном исследовании и опубликованными ранее, показало необходимость проведения генотипирования большего количества изолятов ВГС. С учетом того, что метод PCR-RFLP позволял дифферинцировать лишь три субтипа ВГС 1а, 16 и За, а разделение генотипов 2 и 4/5 на субтипы было невозможно, для определения генотипов в этой части исследования было проведено секвенирование участка NS5B области генома (8222-8502 п.о.) с последующим филогенетическим анализом полученных данных.

Для филогенетического анализа было отобрано 150 изолятов ВГС, включая 103 изолята, полученных от больных ГС инфекционных отделений стационаров Санкт-Петербурга на протяжении января-ноября 1999 года, и 47 изолятов, полученных от анти-ВГС позитивных пациентов ОГД, наблюдение за которыми проводилось в то же время. Принадлежность Санкт-Петербургских изолятов ВГС к определенным субтипам была установлена при включении в филогенетический анализ 130 сиквенсов практически всех известных генотипов и субтипов ВГС, находящихся в GenBank. В результате было выявлено 6 субтипов ВГС, циркулировавших в 1999г. на территории Санкт-Петербурга: 1а, 16, 2а, 2с, За и 4а. При этом наблюдалось значительное различие в их распространении в зависимости от вероятных путей инфицирования пациентов. Среди больных ГС, представлявших основное население Санкт-Петербурга, было выявлено пять субтипов: la, lb, 2а, За. и 4а. В то же время, среди анти-ВГС позитивных пациентов ОГД - только три: 16,2с и За (табл. 3).

В этой части исследования в основной популяции Санкт-Петербурга ВГС субтипа За также доминировал, и его доля составляла 50% (см. табл. 3). Субтип 16 занимал, аналогично данным, получешшм методом PCR-RFLP, также лишь второе место (39%). Ранее в России не было отмечено превалирования ВГС субтипа За среди ВВН (Viazov S. et al.,1997). Лишь в последние годы появились сообщения о том, что ВГС субтипа За стал доминировать в указанной группе (Созина И., 1999). В нашем исследовании 55% ВВН были инфицированы ВГС субтипа За, что полностью согласуется с данными, полученными в большинстве европейских стран (Watson J. et al., 1996; Berg Т. et al., 1997; Martinot-Peignoux M. et al., 1999; Naoumov N.. 1999; Trepo C., Pradat P., 1999). С другой стороны, эти авторы не отмечали доминирования ВГС субтипа За среди лиц, не употребляющих внутривенно наркотические средства (не-ВВН). Последние были инфицированы в большинстве случаев ВГС генотипа 1. Важно , отметить, что результаты настоящего исследования выявили доминирование ВГС субтипа За в обеих группах пациентов: как среди ВВН, так и среди не-ВВН.

Таблица 3.

Распределение субтипов ВГС, циркулировавших в Санкт-Петербурге в 1999г., по данным филогенетического анализа нуклсотидных последовательностей из N558

области генома

Происхождение Число пациентов субтипы ВГС Более чем один субтип

1а lb 2а 2с За 4а

Инфекционные отделения стационаров не-ВВН 54* 2 22 4 - 25* 1 -

ВВН 49 2 18 .** - 27 . 2

Всего 103* (100%) 4 (4%) 40 (39%) 4 (4%) - 52* (50%) 1 (1%) 2 (2%)

Отделения гемодиализа огд-1 22 22 - - - -

ОГД-2 20 - 15 - 2 3 - -

огд-з 5 - 5 - - - - - -

Всего 47 (100%) - 42 (89%) - 2 (4%) 3 (7%) - -

Всего 150 (100%) 4 (3%) 82 (54,3%) 4 (3%) 2 (1,5%) 55* (36%) 1 (0,7%) 2 (1,5%)

Примечание: * один образец получен от медсестры из ОГД-3; ** данный вариант не обнаружен

Анализ возрастных данных пациентов показал, что 56% из них составляли лица моложе 20 лет. При этом 62% лиц этого возраста были инфицированы ВГС субтипа За и лишь 32% - ВГС субтипа 16. Доля пациентов в возрасте от 21 до 40 лет составила 38%. Лишь 6% пациентов принадлежали к группе старше 41 года. У пациентов старше 21 года ВГС субтипа 16 оставался превалирующим (47%), а вирусом ГС субтипа За было инфицировано 35% из них.

Дополнительный анализ частоты выявления того или иного субтипа ВГС в возрастных группах в зависимости от вероятного способа заражения выявил важную особенность. Вирусом ГС субтипа За было инфицировано большинство ВВН независимо от возраста. В то же время, среди не-ВВН субтип За доминировал лишь у лиц моложе 20 лет (67%). Большинство пациентов старше 21 года было инфицировано ВГС субтипа 16, тогда как ВГС субтипа За был обнаружен лишь у 26%.

Как следует из представленных данных, ВГС субтипа За, по-видимому, достаточно давно циркулирует среди ВВН. Об этом свидетельствует высокая частота его обнаружения среди всех возрастных групп ВВН. С другой стороны, субтип 16 до сих пор, хотя и незначительно, превалирует среди пациентов старше 21 года с парентеральным или неустановленным способами заражения.

Высокая частота (62%) распространения ВГС субтипа За среди молодых людей независимо от внугривешюго употребления наркотических средств и данные о том, что в 1998-1999 годах в Санкт-Петербурге лица 15-29 лет составляли 85% всех пациентов с острым ГС, указывают на то, что ВГС субтипа За стал относительно недавно интенсивно циркулировать в основной популяции Санкт-Петербурга. Последнее связано, по-видимому, с катастрофическим распространением среди молодежи внутривенного употребления наркотических средств, как одного из наиболее важных способов передачи ВГС на сегодняшний день.

Наряду с субтипами За и 16 в городе были обнаружены еще три других субтипа ВГС, однако частота их выявления была невелика: для субтипов 1а и 2а она составила по 4%, для субтипа 4а - 1%. Ранее в Санкт-Петербурге уже было отмечено циркулирование субтипа 1а и генотипа 2, но использованные в предыдущих исследованиях методы генотипирования не позволяли дифференцировать субтипы

внутри генотипа 2. В настоящей работе впервые с помощью филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из NS5B области генома был определен конкретный субтип а генотипа 2, который циркулировал среди основного населения. ВГС субтипа 1а был обнаружен в обеих группах больных ГС как среди ВВП, так и среди не-ВВН. В то же время, вирусом ГС субтипа 2а были инфицированы четыре пациента, отрицавшие употребление наркотических средств внутривенно, при этом три из них имели парентеральные вмешательства в медицинских учереждениях в течение 6 месяцев до начала заболевания.

Впервые в Санкт-Петербурге, а также в России, был выявлен ВГС субтипа 4а у пациента 17 лет с острым ГС (см. табл. 3). Филогенетический анализ показал родство данного изолята ВГС с изолятом из Эритреи. Однако путь инфицирования данного пациента не ясен (в анамнезе отсутствовали указания на какие-либо парентеральные вмешательства в медицинских учереждениях и употребление наркотических средств внутривенно). Тем не менее, сам факт выявления субтипа 4а в Санкт-Петербурге свидетельствует о том, что новые субтипы, не характерные даже для европейского континента, могут проникать в популяцию пока еще неустановленными путями.

Полученные материалы дополнительно подтверждают факт перераспределения в доминировании субтипов ВГС в Санкт-Петербурге на протяжении последних лет, а также демонстрируют, что проникновение каждого субтипа ВГС в популяцию происходит определенными путями. В дальнейшем при возможности быстрого распространения среди какой-то определенной группы населения конкретный субтип ВГС может распространиться и за пределы этой группы, что можно видеть на примере распространения ВГС субтипа За в Санкт-Петербурге.

Распределение вариантов ВГС среди анти-ВГС позитивных пациентов всех ОГД отличалось от такового у больных ГС инфекционных отделений (см. табл. 3). В этой группе доминирующим был субтип 16 (89%), что соответствует ранее опубликованным данным, включая результаты, полученные в России (Pawlotsky J. et al., 1995; Watson J. et al., 1996; Berg Т. et al., 1997; Martinot-Peignoux M. et al., 1999; Naoumov N.V., 1999; Trepo С., Pradat P., 1999; Зубкин M. и др., 2000). В работе М. Зубкина и др. (2000) также было отмечено, что среди пациентов ОГД Москвы наряду с ВГС субтипа 16 распространены с одинаково невысокой частотой субтипы 1а, 2а и За (9%). В противоположность этому, в настоящей работе все пациенты ОГД-1 и ОГД-3 были инфицированы только ВГС субтипа 16. Лишь у пациентов ОГД-2 помимо основного субтипа 16 было выявлено дополнительно два других субтипа - 2с (4%) и За (7%). ВГС субтипа 2с не был обнаружен у пациентов инфекционных отделений стационаров Санкт-Петербурга, также ранее не сообщалось о выявлении этого субтипа на территории европейской части России. Только недавно, в 1999 г., появилось единственное сообщение, в котором данный субтип был выявлен у двух доноров крови из Западной Сибири: в Сургуте и Новосибирске (Самохвалов Е. и др., 1999).

Таким образом, получешше результаты демонстрируют циркуляцию различных вариантов ВГС в Санкт-Петербурге. С помощью метода PCR-RFLP в Санкт-Петербурге помимо субтипов 1а, 16, За и генотипа 2, был выявлен изолят ВГС, принадлежавший к генотипу 4/5. Филогенетический анализ уточнил субтипы генотипа 2, а также определил конкретный субтип в случае генотипов 4/5, которыми оказался субтип 4а. На основании полученных данных были выявлены особенности распространения субтипов ВГС среди различных групп населения Санкт-Петербурга. В основной группе населения Санкт-Петербурга, включая лиц не-ВВН и ВВН, в последние два года ВГС субтипа За стал доминирующим вариантом. Несмотря на то, что в настоящее время в основной популяции Санкт-Петербурга ВГС субтипа За приходит на смену ВГС

субтипа 16, последний до сих пор остается доминирующим вариантом вируса среди пациентов ОГД, поскольку ОГД являются обособленными учреждениями, где может поддерживаться циркуляция определенных субтипов ВГС. В пользу этого говорит обнаружение только у пациентов ОГД вируса ГС субтипа 2с - варианта вируса не характерного для европейской части России. Факты выявления сразу нескольких, ранее не типичных, субтипов ВГС (4а и 2с) в Санкт-Петербурге свидетельствуют о необходимости слежения за циркуляцией вариантов ВГС в интересах эпидемиологического надзора за вирусным ГС.

2. Определение генетических взаимоотношений между изолятами ВГС, выделенными от анти-ВГС позитивных пациентов различных стационаров

Определение субтипа ВГС не дает исчерпывающей характеристики как самого изолята, так и его взаимоотношений с другими изолятами вируса.

В мировой литературе имеются значительные материалы о генетических взаимоотношениях между различными изолятами ВГС. Большое количество нуклеотидных последовательностей из различных участков генома ВГС внесено в GenBank, что облегчает слежение за распространением различных вариантов ВГС и определение его новых субтипов.

В настоящем исследовании был проведен филогенетический анализ 258 п.о. из NS5B области генома 150 Санкт-Петербургских изолятов ВГС (рис. 1).

Рис. 1. Радиальное филогенетическое дерево, построенное на основании 258 п.о. из NS5B области генома ВГС методом neighbor-joining (метод объединения по принципу ближайшего соседа) с помощью пакета программ PHYLIP версия 3.53. Данное дерево состоит из 280 изолятов ВГС, в том числе 150 изолятов ВГС, выделенных от анти-ВГС позитивных пациентов инфекционных отделений и отделений хронического гемодиализа Санкт-Петербурга.

5а

Для каждого субтипа с помощью программы BLAST (PubMed) были отобраны наиболее близкородственные сиквенсы из GenBank. Поскольку, при отборе сиквенсов из GenBank было установлено, что единственный доступный для анализа сиквенс российского изолята ВГС с идентификационным номером AF176573 не входил в число 40, а в большинстве случаев даже в 50 близкородственных изолятов, было решено не использовать его при построении филогенетического дерева. На рисунке 1 представлено радиальное филогенетическое дерево, на котором размещены все гено/субтипы вариантов ВГС, циркулировавшие в Санкт-Петербурге в 1999 г.: 1а, 16, 2а, 2с, За и 4а.

Филогенетический анализ выявил, что большинство (38 из 55) Санкт-Петербургских изолятов ВГС, принадлежавших к субтипу За, формировали общий четкий кластер, в котором изоляты от ВВН были перемешены с изолятами от не-ВВН, включая изоляты от медицинского персонала различных стационаров и пациентов, которые до появления симптомов заболевания находились на лечении в больницах города (рис. 2). Это явилось не только дополнительным доказательством того, что в последние годы субтип За начал активно распространяться вне группы ВВН, но также свидетельством формирования в Санкт-Петербурге собственных вариантов ВГС субтипа За, отличных от европейских и азиатских изолятов ВГС данного субтипа. В то же время, никакой специальной кластеризации между Санкт-Петербургскими изолятами ВГС субтипа 16, выделенными от больных ГС инфекционных отделений стационаров, не наблюдалось (рис. 3).

На основании анализа генетических взаимоотношений между конкретными отдельными изолятами ВГС можно установить не только общность источника инфекции, но также определить возможные пути передачи вируса. Последнее особенно актуально при изучении причин распространения ВГС в отделениях гемодиализа. Пациенты отделений гемодиализа относятся к группе риска по заболеваемости вирусным ГС, так как их заражение может происходить множественными путями. До сих пор, в мире постоянно отмечают вспышки ВГС-инфекции в отделениях гемодиализа.

В настоящем исследовании были изучены особенности распространения вируса ГС в трех ОГД на основе анализа генетических взаимоотношений между всеми изолятами ВГС, выделенными от анти-ВГС позитивных пациентов. Уникальная ситуация сложилась в ОГД-1. Частота выявления анти-ВГС среди пациентов этого отделения в период годичного проспективного наблюдения увеличилась практически вдвое и составила 48,3%. У 23 анти-ВГС позитивных пациентов была выявлена РНК ВГС методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров из 5'UTR/core области генома. У 22 из 23 изолятов ВГС были определены нуклеотидные последовательности участка NS5B области генома и установлено, что все эти изоляты ВГС принадлежат к субтипу 16. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей выявил, что 17 из 22 изолятов формировали обособленный четкий кластер, который не группировался с другими кластерами, образованными изолятами ВГС из Санкт-Петербурга. Четыре из оставшихся пяти изолятов ВГС также формировали два небольших кластера, в которые входили по одному изоляту от пациентов с хроническим и острым ГС. Шесть из указанных 17 изолятов ВГС имели полную гомологию (100%) нуклеотидных последовательностей, включая один изолят, выделенный от пациента, который только в период наблюдения стал анти-ВГС-позитивным (см. рис. 3).

Рис. 2. Часть филогенетического дерева, полученного с помощью метода ЦРвМЛ, соответствует ветви, формирующей субтип За. Цифры над отдельными узлами показывают процент бутстрэшшга. Наименование и происхождение изолятов ВГС указаны справа от каждой ветви.

Рис. 3. Часть филогенетического дерева, полученного с помощью метода иРвМА, соответствует ветви, формирующей субтип 16. Цифры, указанные над отдельными узлами, показывают процент бутстрэпинга. Наименование и происхождение изолятов ВГС указаны справа от каждой ветви. N8 - пациенты ОГД, которые стали анти-ВГС позитивными в период наблюдения.

Еще 5 из 17 изолятов были получены от пациентов, инфицированных ВГС в период наблюдения. Все эти изоляты входили в более мелкие кластеры, которые включали изоляты ВГС, полученные от пациентов с хроническим ГС. При сопоставлении этих данных со схемой распределения пациентов по гсмодиализным машинам и сменам прохождения процедуры была выявлена следующая картина. Все анти-ВГС-позитивные пациенты проходили диализ только в одном из двух залов. Пациенты, изоляты которых имели явное родство, могли быть в разных сменах, но получать диализ на одной установке (например, N160 и N105, N122 и N172); в одной смене, но получать диализ на разных машинах (например, N120 и N148); а также в разных сменах и получать диализ на разных машинах (например, N104 и N132).

Изложенное позволяет сделать заключение о том, что распространение ВГС происходило, по-видимому, не только за счет недостаточной стерилизации диализных машин, но и за счет недостаточного соблюдения персоналом мер предосторожности во время процедуры гемодиализа. Распространение возбудителя среди пациентов, прикрепленных к разным диализным машинам и получавших процедуру в разные смены, указывает на то, что существуют другие, неустановленные пуги и факторы передачи ВГС в ОГД. Аналогичные данные были получены в ОГД-2 и ОГД-3.

Дополнительно необходимо отметить генетические особенности вариантов ВГС, циркулирующих в ОГД-1. Идентичность нуклеотидных последовательностей у всех 17 изолятов ВГС субтипа 16, формировавших общий кластер, составила не менее 95,5%, а у 15 из них превышала 98,4%. Эти данные говорят о том, что все эти изоляты ВГС произошли от одного общего предшественника. Согласно анамнезу, 9 из 17 пациешгов стали анти-ВГС-позитивными уже несколько лет назад: с 1995 - N110, с 1996 - N116, с 1997 - N160, N165, с 1998 - N105, N117, N146, N115, N118. Учитывая, что скорость мутаций в NS5B области позволяет определять давнее родство между изолятами ВГС, приведенные данные указывают на то, что геноварианты ВГС субтипа 16 стали циркулировать в ОГД достаточно давно. Принимая во внимание, что 17 изолятов ВГС формировали на филогенетическом дереве отчетливый кластер, не группировавшийся с другими Санкт-Петербургскими изолятами ВГС, можно сделать заключение о том, что к моменту исследования в данном отделении хронического гемодиализа сформировался, так называемый, «внутригоспитальный» вариант ВГС, который может достаточно долго циркулировать в условиях, благоприятствующих его поддержанию.

Таким образом, определение и анализ нуклеотидных последовательностей вариантов ВГС являются необходимыми источниками информации для установления реальных взаимоотношений между изолятами ВГС, циркулирующими на определенном пространстве, и для определения путей распространения ВГС-инфекции.

3. Изучение возможности смешанной инфекции, обусловленной различными вариантами ВГС, и рекомбинации между геномами изолятов ВГС разных

генотипов.

Специальное исследование было проведено с целью подтверждения результатов генотипирования, полученных методом PCR-RFLP, а также для поиска возможных рекомбинантов ВГС. Ряд исследователей отмечают возможность инфицирования пациентов более чем одним суб/генотипом ВГС, что свидетельствует об отсутствии защиты против суперинфекции другим вариантом ВГС (Farci P. et al., 1992, Jarvis L. et al., 1994). Последнее позволяет предположить возможность рекомбинации между геномами разных субтипов ВГС и формирование новых геновариантов вируса. Однако сравнение ряда сиквенсов из NS5, NS4, El и core областей генома изолятов ВГС от одних и тех же пациентов пока не привело к получению четких доказательств в пользу

наличия рекомбинации между вариантами ВГС (вттопсЬ Р. с1 а1., 1999).

В данном исследовании в 3 из 72 образцов сыворотки крови при гено-типировании методом РСЛ-ЯРЬ? было определено одновременное присутствие более чем одного генотипа вируса ГС. Во всех случаях были выявлены генотипы За и 1.

Для подтверждения результатов генотипирования, полученных методом РСЯ-ЯРЬР, были определены нуклеотидные последовательности из ЬТБ5В и 5'иТЯ/соге областей генома изолятов ВГС из 20 образцов сыворотки крови. Полное совпадение результатов генотшшрования, полученных обоими методами, наблюдалось в 17 из 20 образцах независимо от генотипа. Расхождение было выявлено только в трех случаях:

1. в образце, полученном от пациента N700, при анализе нуклеотидных последовательностей из N858 и 5'1Гте/Согс участков генома был определен субтип 16, тогда как метод РСК-Ш-ЪР показал наличие в образце ВГС субтипа1а.

2. в образце, полученном от пациента N687, методом РСИ-ИБГР и при анализе нуклеотидных последовательностей из 5'ШТ1/Соге участка генома был определен ВГС генотипа 2. В то же время, нуклеотидные последовательности участка N858 области генома соответствовали субтипу 16. Первичный филогенетический анализ показал, что данный вариант ВГС не группировался с изолятами ВГС субтипов субтипов 2а и 2с, циркулировавших в Санкт-Петербурге.

3. в образце, полученном от пациента N648, методом РСЯ-Ш-ЪР и с помощью анализа нуклеотидных последовательностей из 5'ита/Соге участка генома ВГС удалось зафиксировать одновременное присутствие двух субтипов ВГС За и 1а/1б. При анализе нуклеотидных последовательностей из N858 области был выявлен только один субтип 16.

Таким образом, результаты определения основных генотипов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге, полученные при использовании метода РСЯ-ИРГ-Р, полностью совпали с данными анализа нуклеотидных последовательностей из б'иТЯУсоге области генома. Высокое совпадение (95%) результатов также наблюдалась при определении субтипов ВГС.

Наблюдаемое полное расхождение в одном из 20 случаев (пациент N687) между данными генотипирования, полученными на основе анализа нуклеотидных последовательностей из двух различных районов генома ВГС, могло быть объяснено наличием рекомбинации между участками геномов ВГС различных субтипов. В связи с чем, представлялось важным продолжить поиск аналогичных вариантов ВГС.

В данное исследование были включены 28 образцов сыворотки крови, полученных от анти-ВГС позитивных пациентов, включая все три образца (N648, N747 и N796), изоляты ВГС из которых формировали единую ветвь вместе с изолятом N687 на филогенетическом дереве, построенном на участке из N858 области генома. Остальные 25 образцов сыворотки крови были отобраны произвольно (рис. 4 и 5).

Филогенетический анализ участка 5'иТК/соге области генома выявил дополнительно еще два изолята (N747 и N796) с аналогичной генетической характеристикой, у которых нуклеотидные последовательности из N858 области генома соответствовали субтипу 16, а из 5'иГО/соге области - генотипу 2. При этом включение в филогенетический анализ дополнительных нуклеотидных последовательностей изолятов, принадлежавших практически ко всем известным субтипам генотипа 2, позволило определить, что все эти три изолята ВГС (N687, N747 и N796) по 5'иТ11/соге области принадлежали к только что описанному новому субтипу 2к, Данные изоляты формировали единый общий кластер на обоих филогенетических деревьях (N858 и 5'и'Ш/соге), что явилось дополнительным подтверждением возможности рекомбинации.

Рис. 4. Филогенетическое дерево, полученное с помощью кластерного анализа нуклсотидных последовательностей (300 п.о.) из N5513 области генома изолятов ВГС (программа Ме^Л^пт, пакет Ьаэе^епе). Цифры и буквы на ветвях обозначают генотип/субтип ВГС. На концах ветвей указаны наименования клонов ВГС, зарегестрированных в банке ЕМВЬ, и Санкт-Петербургских изолятов в соответствии с идентификационным номером пациента.

Рис. 5. Филогенетическое дерево, полученное с помощью кластерного анализа нуклеотидных последовательностей (630 п.о.) из 5'иТН/соге области генома изолятов ВГС (программа Ме;*АН£гдт, пакет Ьаэе^епе). Цифры и буквы на ветвях обозначают генотип/субтип ВГС. На концах ветвей указаны наименования клонов ВГС, зарегестрированных в банке ЕМВЬ, и изолятов из Санкт-Петербурга в соответствии с идентификационным номером пациента.

Таким образом, полученные данные убедительно доказывают факт существования смешанной инфекции, обусловленной разными генотипами ВГС, а также свидетельствуют о возможности рекомбинации между геномами изолятов ВГС различных генотипов. При этом впервые на территории России был выявлен субтип 2к, недавно обнаруженный в Молдавии и зарегестрированный в качестве нового субтипа генотипа 2 в международном банке данных ЕМВЬ (ОепВапк).

ВЫВОДЫ

1. В Санкт-Петербурге выявлена циркуляция семи субтипов возбудителя: 1а, 16, 2а, 2с, 2к, За и 4а по данным метода лимитированного секвенирования №5В и 5'1Ш1/соге областей генома изолятов вируса ГС. При этом ВГС субтипа За (50%) являлся доминирующим у больных вирусным ГС, находившихся на лечении в инфекционных отделениях стационаров, а ВГС субтипа 16 (89%) превалировал у пациентов отделений хронического гемодиализа.

2. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из 1Ч85В области генома вируса ГС определены генетические взаимоотношения между изолятами вируса, распространенными в Санкт-Петербурге и в мире. Установлено, что в городе сформировались варианты вируса ГС субтипа За, отличные от европейских и азиатских изолятов данного субтипа. В одном из трех отделений хронического гемодиализа сформировался «внутригоспитальный» вариант вируса ГС субтипа 16, которым оказались инфицированы 17 из 22 РНК ВГС позитивных пациентов.

3. В образцах сыворотки крови трех больных вирусным ГС анализ нуклеотидных последовательностей из Ы85В и 5'ЦТК/соге областей генома показал одновременное присутствие двух субтипов вируса (16 и 2к, соответственно), что свидетельствует как о смешанной инфекции, вызванной разными вариантами возбудителя, так и о вероятности рекомбинации между геномами вариантов ВГС, принадлежащих к разным генотипам.

4. Метод РСЯ-КРЬР, основанный на использовании праймеров из 5'ШТ1 области генома и трех рсстриктаз (ВвИЛ, Вб1Ы1 и БаиЗа), позволяет выявлять основные субтипы/генотипы вируса ГС, циркулирующие в России. Совпадение результатов при определении субтинов/гснотипов с помощью данного метода РСЯ-КРЬР и лимитированного секвенирования составляет 95%/100%.

5. Использование праймеров из 5'ЩИ области генома обеспечивает наиболее эффективное выявление РНК ВГС в исследуемых образцах сыворотки кров! методом ОТ-ПЦР по сравнению с праймерами из 5'1ГГО/соге или №5В областей.

6. Молекулярно-генетические методы исследования необходимы для получение достоверной информации о путях распространения вируса ГС и взаимосвязи межд) отдельными случаями заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Kalinina О., Mukomolov S., Noskin L., Shevelev I., Noskov F. Detection of RNA HCV in sera from patients with acute hepatitis С by RT-PCR. Abstracts.International Symposium "Epidemiology and Public Health", Hanoi, 1995, p. 45.

2. Т.Дмитриева, О.Калинина, Ф.Носков. Использование метода определения авидности антител для диагностики вирусного гепатита С у детей. // Гепатит В, С и D -проблемы диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. Ш-й науч.-практ. конф. с междунар. участием - М., 1999, с. 63.

3. К.Жданов, Ю.Лобзин, С.Мукомолов, В.Чирский, В.Плотникова, О.Калинина. Особенности течения различных клинических форм гепатита С у лиц молодого возраста. // Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. Ш-й науч.-практ. конф. с междунар. участием. - М., 1999, с. 73.

4. О.Калинина, Н.Железнова, И.Малкова, С.Мукомолов. Генотипирование вируса гепатита С методом полиморфизма длин рестрикции. // Гепатит В, С и D - проблемы диагностики, лечения и профилактики: Тез. докл. Ш-й науч.-практ. конф. с междунар. участием - М., 1999, с. 95.

5. O.Kalinina, T.Dmitrieva, S.Mukomolov. Evaluation of IgG antibodies avidity and detection of RNA HCV for diagnosis of hepatitis С viral infection in children. // 9th International congress on infectious diseases, April 10-13, 2000, Buenos Aires, Argentina, nl0510.

6. K.Zhdanov, I. Lobzin, S. Mukomolov, V.Chirsky, O.Kalinina and D.Gusev. Clinical and histological correlations in HCV infection. 10th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease, April 9-13, 2000, Atlanta, USA, p.64.

7. S.Mukomolov, I.Sozina, O.Kalinina, V. Plotnikova, A.Kolobov. Study of hepatitis С virus genotypes distribution in several regions of Russian Federation. // A virology meeting of three societies, Stockholm, February 3-5, 2000, p. 39.

8. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор (3-й выпуск) под.ред. А.Б.Жебруна, Санкт-Петербург, 2000, с. 135-162.

Отпечатано 09.11.2000г. Тир. 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калинина, Ольга Викторовна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Современные представления о вирусе гепатита С и методах его детекции

1.1.1. Молекулярная биология вируса гепатита С

1.1.2. Методы выявления ВГС

1.2. Молекулярная эпидемиология гепатита С

1.2.1. Вариабельность вирусного генома. Генотипы ВГС

1.2.2. Генотипы и генетическая гетерогенность ВГС как эпидемиологические маркеры

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге"

Гепатит С является одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всем мире, включая Россию. Это связано с широким распространением инфекции и частыми ее неблагоприятными исходами с развитием хронического гепатита, цирроза печени, а в дальнейшем гепатокарциномы. При отсутствии эффективных методов специфической профилактики и лечения ГС предотвращение распространения инфекции является основной задачей в борьбе с данным заболеванием.

Одной из особенностей вируса ГС является его высокая генетическая вариабельность, на основании которой была создана концепция генотипов. Современная классификация насчитывает 6 генотипов и более 100 субтипов ВГС (Simmonds Р, 1999). Определение генотипов ВГС имеет большое значение для практической медицины, так как позволяет решать задачи эпидемиологического надзора за инфекцией, прогнозирования исходов заболевания и выработки тактики противовирусной терапии (Соринсон С.Н., 1998; Mondelli M.U. et al., 1999; ZeinN., 2000).

Известно, что генотипы 1, 2 и 3 наиболее распространены, при этом тот или иной их субтип доминирует в разных географических зонах (Simmonds P. et al., 1999). В Европе преобладает субтип 16, в США преимущественно распространен субтип la (Mahaney К. et al., 1994; Nousbaum J. et al., 1995; Zein N. et al., 1996). В Японии отмечена достаточно высокая циркуляция генотипов 1 (субтип 16) и 2 (Nousbaum J., 1998). Субтип За занимает, как правило, второе или третье место по частоте встречаемости в этих географических зонах (Lee С. et al., 1992; Simmonds P., 1999; Mondelli M. et al., 1999). Наряду с этим генотипы 4, 5 и 6 имеют более локальное распространение. Генотип 4 превалирует в Северной Африке и некоторых странах Среднего Востока, а генотип 5 был выявлен только в Южной Африке (Simmonds P. et al., 1993а; Bukh J. et al., 1995b). В состав генотипа 6 в настоящее время включены генотипы 7, 8, 9 и 11, 7 и с учетом этого, данный генотип широко распространен на территории всей Юго-Восточной Азии (Okamoto Н. et al., 1996; Tokita Н. et al., 1996; Simmonds P. et al., 1995, 1999). Во всем мире продолжают следить за циркуляцией вариантов вируса ГС в популяции, что позволяет выявлять смену доминирующих субтипов (Ross R. et al., 2000).

О распространенности различных генотипов и субтипов ВГС в отдельных регионах России до сих пор имеется небольшое количество публикаций. Во всех этих работах было отмечено доминирование субтипа 16 (Вязов С. и др., 1996; Львов Д. и др., 1996, 1997, Мукомолов С. и др., 1996; Viazov S. et al., 1997), которое сохраняется до настоящего времени согласно недавно опубликованным данным (Кузин С. и др., 1999, Shustov A. et al., 1999). В отношении распространения других субтипов вируса ГС в доступной литературе имеются ограниченные и весьма противоречивые сведения.

Разработано несколько методов быстрого определения генотипов ВГС. Стандартизованной является тест-система INNO-LiPA (Innogenetics, Belgium). Тем не менее, в мире получили широкое распространение методы, основанные на использовании ПЦР: либо с типоспецифическими праймерами (Okamoto Н. et al., 1992), либо с последующим проведением рестрикции полученных амплификатов (PCR-RFLP). Последний метод позволяет дифференцировать все шесть генотипов и основные субтипы генотипов 1, 2 и 3 в зависимости от количества используемых рестриктаз (Davidson F. et al.,1995).

В России для генотипирования изолятов ВГС в основном используют метод, предложенный Н. Okamoto (1992; 1996), который позволяет дифференцировать лишь пять субтипов ВГС: 1а, 16,2а, 26 и За.

Несмотря на то, что определение генотипов ВГС помогает в решении ряда задач эпидемиологии, знание о конкретном генотипе выделенного изолята ВГС не является абсолютным доказательством общности источника инфекции, конкретных путей распространения возбудителя, поскольку оно не несет информации о генетических взаимоотношениях между различными вариантами 8

ВГС. Такие данные можно получить лишь при изучении молекулярно-генетической характеристики каждого изолята вируса. Дополнительно эти данные могут оказаться полезными при конструировании вакцин против ВГС.

Международный генетический банк EMBL (GeneBank) постоянно пополняется данными о новых нулеотидных последовательностях различных участков генома изолятов ВГС, выделенных в разных географических зонах. Доступность этой информации позволяет уточнять с помощью филогенетического анализа принадлежность каждого изолята к конкретному субтипу, охарактеризовывать новые субтипы ВГС.

В настоящее время имеется всего несколько публикаций, посвященных анализу нуклеотидных последовательностей российских изолятов ВГС (Васильев В. и др., 1994; Viazov S. et al., 1997; Тарасов К., 1998). При этом только в одной работе был проведен филогенетический анализ изолятов ВГС субтипа 16, который показал отсутствие какой-либо специальной кластеризации между российскими изолятами (Viazov S. et al., 1997).

Сравнение результатов генотипирования, выполненных на различных участках генома одного и того же изолята ВГС, до сих пор не выявило возможность генетической рекомбинации между геномами разных изолятов (Simmonds P. et al., 1999). В тоже время, в ряде исследований с помощью ПЦР с типоспецифическими праймерами было выявлено одновременное присутствие двух изолятов ВГС, принадлежащих к разным генотипам, в образцах сыворотки крови (Jarvis L. et al., 1994; Gournay J. et al., 1995; Sheng L. et al., 1995; Nishizono A. et al., 1997; Львов Д. и др., 1997; Тарасов К., 1998).

Таким образом, внедрение методов, позволяющих получать информацию о молекулярно-генетической характеристике циркулирующих вариантов вируса ГС, может открыть широкие перспективы развития молекулярной эпидемиологии ГС, а также глубже понять процесс формирования новых генетических разновидностей возбудителя. 9

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

Цель: Охарактеризовать варианты ВГС, циркулирующие в Санкт

Петербурге, и установить особенности их распространения среди различных групп населения города с помощью молекулярно-генетических методов.

Задачи исследования:

3. Определить нуклеотидные последовательности фрагмента NS5B области генома изолятов ВГС различных генотипов методом лимитированного секвенирования.

4. Изучить особенности распространения и генетические взаимоотношения между изолятами ВГС различных субтипов ВГС, циркулирующих среди больных ГС и анти-ВГС-позитивных пациентов отделений гемодиализа, на основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из NS5B области генома.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые на основе лимитированного секвенирования участков генома и анализа нуклеотидных последовательностей изолятов изучена генетическая

10 структура популяции ВГС на территории Санкт-Петербурга.

У больных ГС, поступавших на лечение в инфекционные отделения стационаров города, показано доминирование ВГС субтипа За. Впервые на основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка NS5B области генома, установлено, что в Санкт-Петербурге сформировались варианты ВГС субтипа За, отличные от европейских и азиатских вариантов данного субтипа. У анти-ВГС позитивных пациентов отделений гемодиализа показано преобладание вариантов ВГС субтипа 16 и установлены пути их распространения. В одном из отделений гемодиализа выявлен «внутрибольничный» вариант данного субтипа.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Результаты исследования свидетельствуют о необходимости внедрения молекулярно-генетических методов в эпидемиологический надзор за вирусным гепатитом С. В ходе исследования был апробирован модифицированный метод PCR-RFLP, который может быть рекомендован для слежения за циркуляцией субтипов/генотипов ВГС среди различных категорий населения. Внедрение метода лимитированного секвенирования позволит быстро проводить филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генома изолятов

ВГС для выявления возможных источников инфекции и факторов передачи с целью предотвращения дальнейшего распространения возбудителя. Результаты работы включены в аналитический обзор «Вирусные гепатиты в Российской Федерации, вып.З», а также используются в учебном процессе в СПб НИИЭМ им. Пастера (1-й и 2-й учебные семинары для врачей-эпидемиологов «Эпидемиология вирусных гепатитов и эпидемиологический надзор за этими инфекциями в современный период», СПб, 1999, 2000). Полученные результаты используются в работе кафедр и клиник инфекционных болезней Военно-Медицинской Академии и Санкт-Петербургского Медицинского Университета им. Акад. И.П. Павлова.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В настоящее время в Санкт-Петербурге циркулирует 7 субтипов вируса ГС: 1а, 16, 2а, 2с, 2к, За и 4а. При этом субтип За доминирует у больных ГС, поступавших на лечение в инфекционные отделения стационаров города. В то же время ВГС субтипа 16 продолжает оставаться наиболее распространенным у пациентов отделений хронического гемодиализа.

2. Наряду с разнообразными вариантами вируса ГС субтипа 16, встречающимися у больных ГС и родственными европейским и азиатским вариантам ВГС, в Санкт-Петербурге сформировались собственные варианты ВГС субтипа За, отличные от большинства европейских и азиатских вариантов данного субтипа. В отделениях хронического гемодиализа возможно формирование «внутригоспитального» варианта ВГС субтипа 16, отличающегося от вариантов этого субтипа, выявляемых у больных инфекционных стационаров.

3. При гепатите С существует смешанная инфекция, обусловленная несколькими субтипами вируса, а также возможна рекомбинация между геномами изолятов, принадлежащих к различным генотипам ВГС.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Калинина, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ

1. В Санкт-Петербурге выявлена циркуляция семи субтипов возбудителя: 1а, 16, 2а, 2с, 2к, За и 4а по данным метода лимитированного секвенирования NS5B и 5'UTR/core областей генома изолятов вируса ГС. При этом ВГС субтипа За (50%) являлся доминирующим у больных вирусным ГС, находившихся на лечении в инфекционных отделениях стационаров, а ВГС субтипа 16 (89%) превалировал у пациентов отделений хронического гемодиализа.

2. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей из NS5B области генома вируса ГС определены генетические взаимоотношения между изолятами вируса, распространенными в Санкт-Петербурге и в мире. Установлено, что в городе сформировались варианты вируса ГС субтипа За, отличные от европейских и азиатских изолятов данного субтипа. В одном из трех отделений хронического гемодиализа сформировался «внутригоспитальный» вариант вируса ГС субтипа 16, которым оказались инфицированы 17 из 22 РНК ВГС позитивных пациентов.

3. В образцах сыворотки крови трех больных вирусным ГС анализ нуклеотидных последовательностей из NS5B и 5'UTR/core областей генома показал одновременное присутствие двух субтипов вируса (16 и 2к, соответственно), что свидетельствует как о смешанной инфекции, вызванной разными вариантами возбудителя, так и о вероятности рекомбинации между геномами вариантов ВГС, принадлежащих к разным генотипам.

4. Метод PCR-RFLP, основанный на использовании праймеров из 5'UTR области генома и трех рестриктаз (BstUl, BstNl и Sau3a), позволяет выявлять основные субтипы/генотипы вируса ГС, циркулирующие в России. Совпадение результатов при определении субтипов/генотипов с помощью

122 данного метода PCR-RFLP и лимитированного секвенирования составляет 95%/100%.

5. Использование праймеров из 5'UTR области генома обеспечивает наиболее эффективное выявление РНК ВГС в исследуемых образцах сыворотки крови методом ОТ-ПЦР по сравнению с праймерами из 5'UTR/core или NS5B областей.

6. Молекулярно-генетические методы исследования необходимы для получения достоверной информации о путях распространения вируса ГС и взаимосвязи между отдельными случаями заболевания.

123

1.3. Заключение

Таким образом, одной из особенностей вируса ГС является его высокая генетическая вариабельность. Современная классификация насчитывает 6 генотипов и более 100 субтипов ВГС (Simmonds Р, 1999). Определение генотипов ВГС имеет большое значение для практической медицины, так как позволяет контролировать циркуляцию различных вариантов вируса на конкретной территории, решать практические задачи эпидемиологического надзора за инфекцией, прогнозировать исход заболеваний и вырабатывать тактику противовирусной терапии. Раработаны различные методы генотипирования ВГС. Наиболее простыми и доступными являются методы, основанные на постановке ОТ-ПЦР (ОТ-ПЦР с типоспецифическими праймерами, PCR-RFLP).

Информация о принадлежности выделенного изолята ВГС к конкретному генотипу не всегда является доказательством общности источника инфекции и путей распространения возбудителя. Изучение молекулярно-генетической характеристики каждого изолята вируса и информация о генетических взаимоотношениях между различными вариантами ВГС позволяет более четко отвечать на поставленные эпидемиологические вопросы.

Неясными остаются вопросы о существовании смешанной инфекции, вызванной одновременно несколькими гено/субтипами вируса ГС, и о возможности генетической рекомбинации между геномами разных изолятов ВГС.

В связи с указанным, необходимо определение вариантов ВГС, циркулирующих среди населения, и их углубленное изучение с помощью молекулярно-генетических методов исследования.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Образцы сыворотки крови

В работе изучено 716 образцов сыворотки крови, полученных от пациентов инфекционных отделений стационаров и отделений хронического гемодиализа Санкт-Петербурга. Определение антител к вирусу ГС проводили с использованием иммуноферментных тест-систем 3 поколения anti-HCV (НПФ "Аквапаст», С.Петербург), HCV Monolisa (Sanofi Diagnostic Pasteur, France) или UBI HCV EIA 4.0 (Organon Teknika, Netherlands) совместно с научным сотрудником В.А. Плотниковой (лаборатория вирусных гепатитов Санкт-Петеребургского НИИЭМ им. Пастера).

Образцы сыворотки крови, полученные от 294 пациентов инфекционных отделений стационаров с диагнозом вирусный ГС, были предоставлены д.м.н. К.В.Ждановым (Военно-Медицинская Академия), врачом-инфекционистом Т.А.Ветровым (Городская инфекционная больница N30 им. С.П.Боткина), к.м.н. Т.Г.Дмитриевой (Детская инфекционная больница N3). В анамнезе 130 больных имелись указания на внутривенное употребление наркотических средств. 65 больных обращалось за медицинской помощью в течение 6 месяцев, предшествовавших заболеванию, и могли быть инфицированы в медицинских учреждениях, включая 24 пациента детских отделений гемодиализа (14), нефрологии (4) и гематологии (6). Распределение обследованных пациентов по полу, возрасту и предполагаемым путям заражения ВГС представлено в таблице 1. Также изучен 61 образец сыворотки крови больных хроническим ГС, которые были предоставлены Медицинским факультетом Якутского Государственного Университета (к.м.н. М.Н.Алексеева). В коллекции из Якутии было 27 образцов сыворотки крови, полученных от мужчин, и 34 - от женщин, возраст пациентов варьировал от 16 до 65 лет. Помимо образцов сыворотки крови взрослых больных в коллекцию входило 3 образца сыворотки крови детей в возрасте от 8 до 14 лет.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калинина, Ольга Викторовна, Санкт-Петербург

1. Афанасьев А.Ю., Зубов С.В., Юданов Ю.Е., Кривопустова А.В. ИФА-диагностика в разграничении гепатита С острого и хронического течения.// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии, 1995, т5, N3, приложение 1, с. 12.

2. Васильев В.Б., Вязов С.О., Котова Е.И., Носиков В.В. Определение последовательностей нуклеотидов российского варианта ВГС.// Мол. Биол., 1994, N1, с.33-37.

3. Вейр Б. Анализ генетических данных.// Москва, Мир, 1995, 399 с.

4. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор (2выпуск) под ред. Жебруна А.Б., С.-Петербург, 1999, с.167-193.

5. Кузин С.Н., Мажуль Л.А., Снегирев И.Б. и др. Генотипы вируса гепатита С у больных гемофилией.// Вопросы вирусологии, 1996, N 2, с.63-65.

6. Зубкин М.Л., Селиванов Н.А., Стаханова В.М. и др. Распространенность и особенности инфицирования вирусами гепатитов В и С в условиях лечения гемодиализом.// Вопросы вирусологии, 2000, N1, с. 10-13.

7. Зубов С.В., Соринсон С.Н., Жданов Ю.Е., Афанасьев А.Ю. Серологический профиль в разные фазы гепатита С.// В кн. Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. СПб, 1995, с.86.

8. Киселев О.И., Яковлев А.А., Виноградова Е.Н. и др. Распространение генотипов вируса гепатита С в Санкт-Петербурге и их клиническая характеристика.// В сб.: Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции, СПб, «ССЗ», 1997, т. 1, с.53-61.

9. Кузин С.Н., Лисицина Е.В., Самохвалов Е.И и др. Распространение гепатита С и отдельных генотипов вируса гепатита С в регионе с умеренной активностью эпидемического процесса. // Вопросы вирусологии, 1999, N2, с.79-82.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия.// «Высшая школа», Москва, 1973, 342 с.129

11. Львов Д.К., Миширо С., Селиванов Н.А. и др. Распространение генотипов вируса гепатита С, циркулирующих на территориях Северо-Западной и Центральной частей России.// Вопросы вирусологии, 1995, N6, с.251-253.

12. Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Миширо С. и др. Закономерности распространения вируса гепатита С и его генотипов в России и странах СНГ.// Вопросы вирусологии, 1997, N4, с.157-161.

13. Мукомолов С.Л., Валькова И.В., Чайка Н.А. Вирусные гепатиты.// СПб., 1992, 97с.

14. Мукомолов С.Л., Колобов А.А., Плотникова В.А. и др. Использование метода серотипирования для определения генотипов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге.// Тезисы междун. Фальк симпозиума N92, СПб, 1996, с.266.

15. Мукомолов С.Л., Яковлев А.А., Колобов А.А., Плотникова В.А. и др. Диагностическое значение определения антител класса IgM к ядерному белку вируса гепатита С.// В кн. Вирусные гепатиты и другие актуальные инфекции, СПб, 1997, т. 1, с.61-70.

16. Самохвалов Е.И., Кузин С.Н., Вязов С.О., Львов Д.К. «Итальянский» генотип 2с вируса гепатита С на территории России.// Тезисы докл. Шей науч-практ.конф. с межд. уч., М., 1999, с.201.

17. Созина И.А. Разработка и использование метода определения генотип-специфических антител к вирусу гепатита С.// Автореф. канд. мед. наук., Санкт-Петербург, 1998,20с.

18. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты в клинической практике.// Теза, СПб, 1996, с. 204-234.

19. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. 2-ое издание. Теза, СПб, 1998, с.210-244.

20. Тарасов К.В. Генодиагностика и генотипирование вируса гепатита С.// Автореф. канд. мед. наук., Санкт-Петербург, 1998, 18с.130

21. Шахгильдян И.В., Кузин С.Н., Вязов С.О. и др. Эпидемиология гепатита С в России и других странах СНГ. Роль естественных путей передачи вируса гепатита С.// Новые направления в гепатологии: Тезисы межд. Фальк сипмозиума N92, С-Петербург, 1996, с.441.

22. Andonov A. and Chaudhary R.K. Subtyping of hepatitis С virus isolates by a line probe assay using hybridization.// J.Clin.Microbiol., 1995, 33, n.l: p.254-256.

23. Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., and Jacobsen H. Nonstructural protein 3 of the hepatitis С virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions.// J.Virol., 1993, 67, n.7: p.3835-3844.

24. Ben-Ari Z., Pappo O., Zemel R., Мог E., and Tur-Kaspa R. Association of lamivndine resistance in recurrent hepatitis В after liver transplantation with advanced hepatic fibrosis.// Transplantation, 1999, 68, n.2: p.232-236.

25. Berenguer M. and Wright T.L. Is the hepatocyte a Trojan horse for hepatitis С virus? comment.// Gut, 1998, 42, n.4: p.456-458.

26. Berg Т., Hopf U., Stark K., Baumgarten R., Lobeck H., and Schreier E. Distribution of hepatitis С virus genotypes in German patients with chronic hepatitis C: correlation with clinical and virological parameters.// J.Hepatol., 1997, 26, n.3: p.484-491.

27. Bernier L., Willems В., Delage G., and Murphy D.G. Identification of numerous hepatitis С virus genotypes in Montreal, Canada.// J.Clin.Microbiol., 1996, 34, n.ll: p.2815-2818.

28. Biasin M., Fiordalisi G., Zanella I., Cavicchini A., Marchelle G., and Infantolino D. A DNA hybridization method for typing hepatitis С vims genotype 2c.// J.Virol.Methods, 1997, 65, n.2: p.307-315.

29. Blight K., Trowbridge R., Rowland R., and Gowans E. Detection of hepatitis С virus RNA by in situ hybridization.// Liver, 1992, 12, n.4 Pt 2: p.286-289.

30. Blumberg B. S., Alter H.J., and Visnich S. Landmark article Feb 15, 1965: A "new" antigen in leukemia sera. By Baruch S. Blumberg, Harvey J. Alter, and Sam Visnich.// JAMA, 1984, 252, n.2: p.252-257.

31. Bresters D., Reesink H.W., Cuypers H.T., Jansen P.L., Mauser-Bunschoten E.P., van der Poel CL, and Lelie P.N. Sensitivity of an anti-HCV core peptide ELISA.// J.Med.Virol., 1992b, 37, n.3: p.187-191.132

32. Biikh J., Miller R.H., and Purcell R.H. Biology and genetic heterogeneity of hepatitis С virus.// Clin.Exp.Rheumatol., 1995a, 13 Suppl 13:S3-7, p.S3-S7.

33. Bukh J., Miller R.H., and Purcell R.H. Genetic heterogeneity of hepatitis С virus: quasispecies and genotypes.// Semin.Liver Dis., 1995b, 15, n.l: p.41-63.

34. Bukh J., Miller R.H., and Purcell R.H. Genetic heterogeneity of the hepatitis С virus.//Princess.Takamatsu.Symp., 1995c, 25:75-91, p.75-91.

35. Bukh J., Purcell R.H., and Miller R.H. Sequence analysis of the core gene of 14 hepatitis С virus genotypes.// Proc.Natl.Acad.Sei.U.S.A., 1994, 91, n.17: p.8239-8243.

36. Burjel L., Daglio M., Ghioni G., Manzin A., Pereira M., Ribeiro L., Solforosi L., Taborda M., and Thomas C. Characterization of hepatitis С virus genotypes in an hemodialysis unit in Paysandu, Uruguay.// Rev.Argent.Microbiol., 1998, 30, n.4: p.190-194.

37. Cha T. A., Beall E., Irvine В., Kolberg J., Chien D., Kuo G., and Urdea M.S. At least five related, but distinct, hepatitis С viral genotypes exist.// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1992, 89, n.15: p.7144-7148.

38. Chan S. W., McOmish F., Holmes E.C., Dow В., Peutherer J.F., Follett E., Yap P.L., and Simmonds P. Analysis of a new hepatitis С virus type and its phylogenetic relationship to existing variants.// J.Gen.Virol., 1992, 73, n.Pt 5: p.1131-1141.

39. Chang M. Chronic hepatitis virus infection in children.// J.Gastroenterol. Hepatol., 1998, 13,n.5: p.541-548.

40. Choo Q. L., Kuo G., Weiner A.J., Overby L.R., Bradley D.W., and Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.// Science, 1989, 244, n.4902: p.359-362.

41. Choo Q. L., Richman K.H., Han J.H., Berger K., Lee C., Dong C., Gallegos C., Coit D., Medina-Selby R., and Barr P.J. Genetic organization and diversity of the hepatitis С virus.//Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1991, 88, n.6: p.2451-2455.133

42. Colombo M. The role of hepatitis С virus in hepatocellular carcinoma.// Recent.Results.Cancer Res., 1998,154:337-44, p.337-344.

43. Damen M., Cuypers H.T., Zaaijer H.L., Reesink H. W., Schaasberg W.P., Gerlich W.H., Niesters H.G., and Lelie P.N. International collaborative study on the second EUROHEP HCV-RNA reference panel.// J.Virol.Methods, 1996, 58, n.l-2: p.175-185.

44. De F. R. Molecular virology of the hepatitis С virus.// J.Hepatol., 1999, 31 Suppl 1:47-53, p.47-53.

45. De F. R. and Steinkuhler C. Structure and function of the hepatitis С virus NS3-NS4A serine proteinase.// Curr.Top.Microbiol.Immunol.2000.;242.: 149.-69., 242:149-69, p.149-169.

46. Di G. A., D'Antonio D., Parrati G., Iacone A., Di G.R., Salemme L., and Pizzigallo E. Comparative analysis of two systems for HCV genotyping.// New Microbiol, 1998, 21, n.2: p.203-208.

47. Diago M., Zapater R., Tuset C., Carbonell P., Gonzalez C, Cors R., and Casas E. Intrafamily transmission of hepatitis С virus: sexual and non-sexual contacts see comments.//J.Hepatol., 1996, 25, n.2: p. 125-128.

48. Ding J., Akira Т., Noriko Y., Mikihiro Т., and Takayasu D. Study of hepatitis С virus genotype in Guizhou area of southwestern China.// Chin.Med.J.(Engl), 1998, 111, n.2: p.128-131.

49. Esteban R. Epidemiology of hepatitis С virus infection.// J.Hepatol., 1993, 17 Suppl 3:S67-71, p.S67-S71.

50. Eugene R. and Medina M.and Rizwana S. New perspectives in the diagnosis of hepatitis C. 19(sl)(Seminars in Liver Disease), 3-15,1999.

51. Farci P., Alter H.J., Govindarajan S., Wong D.C., Engle R., Lesniewski R.R., Mushahwar I.K., Desai S.M., Miller R.H., and Ogata N. Lack of protective immunity against reinfection with hepatitis С virus.// Science, 1992, 258, n.5079: p.135-140.

52. Farci P., Orgiana G., and Purcell R.H. Immunity elicited by hepatitis С virus.// Clin.Exp.Rheumatol., 1995, 13 Suppl 13.S9-12, p.S9-12.

53. Farci P. and Purcell R.H. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes and quasispecies In Process Citation.// Semin.Liver Dis.2000.;20.(l.):103.-26., 20, n.l: p.103-126.

54. Feinstone S. M., Kapikian A.Z., and Purceli R.H. Hepatitis A: detection by immune electron microscopy of a viruslike antigen associated with acute illness.// Science, 1973,182, n.116: p.1026-1028.135

55. Fournillier J. A., Cahour A., Escriou N., Girad M., and Wychowski C. Processing of the El glycoprotein of hepatitis С virus expressed in mammalian cells.// J.Gen.Virol., 1996, 77, n.Pt 5: p.1055-1064.

56. Fried M. W„ Shindo ML, Fong T.L., Fox P.C., Hoofnagle J.H., and Di B.A. Absence of hepatitis С viral RNA from saliva and semen of patients with chronic hepatitis С see comments.// Gastroenterology, 1992, 102, n.4 Pt 1: p.1306-1308.

57. Galan F., Perez-Gracia M.T., Lozano A., Benavides В., Fernandez-Ruiz E., and Rodriguez-Iglesias M.A. A 3-year follow-up of HCV-RNA viraemia in haemodialysis patients.//Nephrol.Dial.Transplant, 1998, 13, n.5: p.1211-1214.

58. Garson J. A., Ring C., Tuke P., and Tedder R.S. Enhanced detection by PCR of hepatitis С virus RNA letter.// Lancet, 1990, 336, n.8719: p.878-879

59. Gerken G., Knolle P., Jakobs S., and Meyer zum Buschenfelde KH. Quantification and genotyping of serum HCV-RNA in patients with chronic hepatitis С undergoing interferon treatment.// Arch.Virol., 1997, 142, n.3: p.459-464.

60. Gournay J., Marcellin P., Martinot-Peignoux M., Degott C., Gabriel F., Courtois F., Branger M., Wild A.M., Erlinger S., and Benhamou J.P. Hepatitis С vims genotypes in French blood donors.// J.Med. Virol., 1995, 45, n.4: p.399-404.

61. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M., and Rice C.M. Expression and identification of hepatitis С virus polyprotein cleavage products.// J.Virol., 1993, 67, n.3: p.1385-1395.136

62. Gretch D. R. Diagnostic tests for hepatitis CM Hepatology, 1997, 26, n.3, Suppll: p.43S-47S.

63. Haydon G. H., Jarvis L.M., Blair C.S., Simmonds P., Harrison D.J., Simpson K.J., and Hayes P.C. Clinical significance of intrahepatic hepatitis С virus levels in patients with chronic HCV infection see comments.// Gut, 1998, 42, n.4: p.570-575.

64. Healey C. J., Smith D.B., Walker J.L., Holmes E.C., Fleming K.A., Chapman R.W., and Simmonds P. Acute hepatitis С infection after sexual exposure.// Gut, 1995, 36, n.l: p.148-150.

65. Heinz F. X. Comparative molecular biology of flaviviruses and hepatitis С virus.//Arch.Virol.Suppl., 1992, 4:163-71, p.163-171.

66. Hijikata M., Kato N., Ootsuyama Y., Nakagawa M., and Shimotohno K. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis С virus genome by in vitro processing analysis.// Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 1991, 88, n.13: p.5547-5551.

67. Hohne M., Schreier E., and Roggendorf M. Sequence variability in the env-coding region of hepatitis С virus isolated from patients infected during a single source outbreak.// Arch.Virol., 1994,137, n.1-2: p.25-34.

68. Ни K. Q., Yu C.H., and Vierling J.M. Direct detection of circulating hepatitis С virus RNA using probes from the 5' untranslated region.// J.Clin.Invest., 1992, 89, n.6: p.2040-2045.

69. Jarvis L. M., Watson H.G., McOmish F., Peutherer J.F., Ludlam C.A., and Simmonds P. Frequent reinfection and reactivation of hepatitis С vims genotypes in multitransfused hemophiliacs.// J.Infect.Dis., 1994, 170, n.4: p.1018-1022.

70. Jiang W., Gu S., and Hu Y. Genotyping of HCV isolates from different populations in Shanghai by using second generation line probe assay.// Chung.Hua.Kan.Tsang.Ping.Tsa.Chih., 1999, 7, n.l: p.29-30.

71. Kaito M., Watanabe S., Tsukiyama-Kohara K., Yamaguchi K., Kobayashi Y., Konishi M., Yokoi M., Ishida S., Suzuki S., and Kohara M. Hepatitis С virus particle detected by immunoelectron microscopic study.// J.Gen.Virol., 1994, 75, n.Pt 7: p.1755-1760.

72. Kaneko S., Murakami S., Unoura M., and Kobayashi K. Quantitation of hepatitis С virus RNA by competitive polymerase chain reaction.// J.Med.Virol, 1992, 37, n.4: p.278-282.

73. Kao J. H., Lin H.H., Chen P.J., Lai M.Y., Wang Т.Н., Mizokami M., and Chen D.S. Serotyping of hepatitis С virus in chronic type С hepatitis in Taiwan: correlation with genotypes.// J.Gastroenterol., 1996, 31, n.2: p.224-227.

74. Karachristos A., Linardopoulos S., Ergazaki M., and Spandidos D.A. Detection and analysis of hepatitis С virus by a combined RT-PCR method: variation in the 5' non-coding region of the viral genome.// J.Med.Microbiol., 1995, 42, n.5: p.367-371.

75. Kato N., Ootsuyama Y., Ohkoshi S., Nakazawa Т., Mori S., Hijikata M., and Shimotohno K. Distribution of plural HCV types in Japan.// Biochem.Biophys.Res.Commun., 1991, 181, n.l: p.279-285.

76. Kato N., Ootsuyama Y., Ohkoshi S., Nakazawa Т., Sekiya H., Hijikata M., and Shimotohno K. Characterization of hypervariable regions in the putative envelope protein of hepatitis С virus.// Biochem.Biophys.Res.Commun., 1992, 189, n.l: p.119-127.

77. Khan R. U., Tong C.Y., Bloom S„ Gilmore I.T., Toh C.H., Bolton-Maggs P.H., Beeching N.J., and Hart C.A. Evaluation of two simplified methods for genotyping hepatitis С virus.// J.Med.Virol., 1997, 52, n.l: p.35-41.

78. Kolykhalov A. A., Feinstone S.M., and Rice C.M. Identification of a highly conserved sequence element at the 3' terminus of hepatitis С vims genome RNA.// J.Virol., 1996, 70, n.6: p.3363-3371.

79. Lee С. M., Govindarajan S., and Lai M.M. Molecular cloning and sequence analysis of an isolate of hepatitis С virus from Southern California, U.S.A.// J.Formos.Med.Assoc., 1992, 91, n.2: p.174-179.

80. Lin C., Lindenbach B.D., Pragai B.M., McCourt D.W., and Rice C.M. Processing in the hepatitis С virus E2-NS2 region: identification of p7 and two distinct E2-specific products with different С termini.// J.Virol., 1994a, 68, n.8: p.5063-5073.140

81. Lin С., Pragai B.M., Grakoui A., Xu J., and Rice C.M. Hepatitis С virus NS3 serine proteinase: trans-cleavage requirements and processing kinetics.// J.Virol., 1994b, 68, n.12: p.8147-8157.

82. Mahaney K., Tedeschi V., Maertens G., Di B.A., Vergalla J., Hoofnagle J.H., and Sallie R. Genotypic analysis of hepatitis С virus in American patients see comments.//Hepatology, 1994, 20, n.6: p. 1405-1411.

83. Marino N., Di P.M., Moschitta P., Balocchini E., Chionne P., Spada E., Rapicetta M., Stroffolini Т., and Mazzotta F. Intrafamily spread of hepatitis С virus infection.//New Microbiol., 1994, 17, n.2: p. 147-150.

84. Matsuura Y., Harada Т., Makimura M., Sato M., Aizaki H., Suzuki Т., and Miyamura T. Characterization of HCV structural proteins expressed in various animal cells.// Intervirology, 1994, 37, n.2: p. 114-118.

85. Miyakawa Y., Okamoto H., and Mayumi M. Classifying hepatitis С vims genotypes.//Mol.Med.Today, 1995, 1, n.l: p.20-25.

86. Mizokami ML, Gojobori Т., Ohba K., Ikeo K., Ge X.M., Ohno Т., Orito E., and Lau J.Y. Hepatitis С vims types 7, 8 and 9 should be classified as type 6 subtypes.//J.Hepatol., 1996, 24, n.5: p.622-624.

87. Mizushima H., Hijikata M., Tanji Y., Kimura K., and Shimotohno K. Analysis of N-terminal processing of hepatitis С vims nonstructural protein 2.// J.Virol., 1994, 68, n.4: p.2731-2734.

88. Mondelli M. U. and Silini E. Clinical significance of hepatitis С virus genotypes.// J.Hepatol., 1999, 31 Suppl 1:65-70, p.65 -70.

89. Mori S., Kato N., Yagyu A., Tanaka Т., Ikeda Y., Petchclai В., Chiewsilp P., Kurimura Т., and Shimotohno K. A new type of hepatitis С virus in patients in Thailand.// Biochem.Biophys.Res.Commun., 1992, 183, n.l: p.334-342.

90. Morikawa Т., Nakata K., Hamasaki K., Tsuruta S., Kato Y., Nakao K, Ohtsubo Т., and Eguchi K. Prevalence and characterization of hepatitis С virus in hemodialysis patients see comments.// Intern.Med., 1999, 38, n.8: p.626-631.

91. Muller H. M., Pfaff E., Goeser Т., Kallinowski В., Solbach C., and Theilmann L. Peripheral blood leukocytes serve as a possible extrahepatic site for hepatitis С virus replication.// J.Gen. Virol., 1993, 74, n.Pt 4: p.669-676.142

92. Murphy D. G., Willems В., Vincelette J., Bernier L., Cote J., and Delage G. Biological and clinicopathological features associated with hepatitis С virus type 5 infections.//J.Hepatol., 1996, 24, n.l: p.109-113.

93. Nakao Т., Enomoto N., Takada N., Takada A., and Date T. Typing of hepatitis С virus genomes by restriction fragment length polymorphism.// J.Gen.Virol., 1991, 72, n.Pt 9: p.2105-2112.

94. Naoumov N. V. Hepatitis С virus infection in Eastern Europe.// J.Hepatol., 1999,31 Suppl 1:84-7, p.84-87.

95. Nishizono A., Terao H., Shutoh R., Nasu M., Mifune K., Wun B.J., Montas В., and Fernandez F.S. Genotyping of hepatitis С virus in the Dominican Republic.// Am.J.Trop.Med.Hyg., 1997, 57, n.6: p.719-722.

96. Norder H., Bergstrom A., Uhnoo I., Alden J., Weiss L., Czajkowski J., and Magnius L. Confirmation of nosocomial transmission of hepatitis С virus by phylogenetic analysis of the NS5-B region.// J.Clin.Microbiol., 1998, 36, n.10: p.3066-3069.

97. Nousbaum J. B. Genomic subtypes of hepatitis С virus: epidemiology, diagnosis and clinical consequences.// Bull.Soc.Pathol.Exot., 1998, 91, n.l: p.29-33.

98. Nousbaum J. В., Pol S., Nalpas В., Landais P., Berthelot P., and Brechot C. Hepatitis С virus type lb (II) infection in France and Italy. Collaborative Study Group see comments.//Ann.Intern.Med., 1995,122, n.3: p.161-168.

99. Okamoto H. and Mishiro S. Genetic heterogeneity of hepatitis С vims.// Intervirology, 1994, 37, n.2: p.68-76.

100. Park Y. S., Lee K.O., Oh M.J., and Chai Y.G. Distribution of genotypes in the 5' untranslated region of hepatitis С vims in Korea.// J.Med.Microbiol., 1998, 47, n.7: p.643-647.

101. Pawlotsky J. M., Germanidis G., Neumann A.U., Pellerin M., Frainais P.O., and Dhumeaux D. Interferon resistance of hepatitis С virus genotype lb: relationship to nonstmctural 5A gene quasispecies mutations.// J.Virol., 1998, 72, n.4: p.2795-2805.

102. Pereira B. J. Hepatitis С virus infection in dialysis: a continuing problem.// Artif.Organs, 1999, 23, n.l: p.51-60.

103. Perrin S. and Gilliland G. Site-specific mutagenesis using asymmetric polymerase chain reaction and a single mutant primer.// Nucleic.Acids.Res., 1990, 18, n.24: p.7433-7438.

104. Poch О., Sauvaget L, Delarue M., and Tordo N. Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements.// EMBO J., 1989, 8, п. 12: p.3867-3874.

105. Power J. P., Lawlor E., Davidson F., Holmes E.C., Yap P.L., and Simmonds P. Molecular epidemiology of an outbreak of infection with hepatitis С virus in recipients of anti-D immunoglobulin see comments.// Lancet, 1995, 345, n.8959: p.1211-1213.

106. Ross R. S., Viazov S., Renzing-Kohler K., and Roggendorf M. Changes in the epidemiology of hepatitis С infection in Germany: shift in the predominance of hepatitis С subtypes.// J.Med.Virol.2000.Feb.;60.(2.):122.-5., 60, n.2: p.122-125.

107. Samokhvalov EI, Hijikata M, Gylka RI, Lvov DK, Mishiro S. Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis С virus variant (isolate name VAT96) representing a new subtype within the genotype 27/ Virus Genes, 2000, 20, n.2: p.183-187.

108. Santolini E., Migliaccio G., and La M.N. Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С vims core protein.// J.Virol., 1994, 68, n.6: p.3631-3641.146

109. Selby M. J., Glazer E., Masiarz F., and Houghton M. Complex processing and protein:protein interactions in the E2:NS2 region of HCV.// Virology, 1994, 204, n.l: p.114-122.

110. Seme K., Poljak ML, Zuzec-Resek S., Debeljak M., Dove P., and Koren S. Molecular evidence for nosocomial spread of two different hepatitis С virus strains in one hemodialysis unit.// Nephron, 1997, 77, n.3: p.273-278.

111. Shah H. A., Jafri W., Malik I., Prescott L., and Simmonds P. Hepatitis С virus (HCV) genotypes and chronic liver disease in Pakistan.// J.Gastroenterol.Hepatol., 1997,12, n.ll: p.758-761.

112. Sheng L., Willems M., Peerlinck K., Vermylen J., and Yap S.H. Hepatitis С virus genotypes in Belgian hemophiliacs.//J.Med.Virol., 1995, 45, n.2: p.211-214.

113. Shih С. M., Lo S.J., Miyamura Т., Chen S.Y., and Lee Y.H. Suppression of hepatitis В virus expression and replication by hepatitis С virus core protein in HuH-7 cells.// J.Virol., 1993, 67, n.10: p.5823-5832.

114. Shustov A., Mishin V., Kisselev N., Ossipove L. et al. The prevalence, subtype distribution and molecular variability of hepatitis С virus (HCV) in the territory of Western Siberia. Xlth Intern. Congress of Virology, 1999, Sydney, Australia, p.279.

115. Silini E., Bono F., Cividini A., Cerino A., Maccabruni A., Tinelli C., Bruno S., Bellobuono A., and Mondelli M. Molecular epidemiology of hepatitis С virus infection among intravenous drug users.// J.Hepatol., 1995b, 22, n.6: p.691-695.

116. Simmonds P. Viral heterogeneity of the hepatitis С virus.// J.Hepatol., 1999, 31 Suppl 1:54-60, p.54-60.

117. Smith D. B. and Simmonds P. Review: molecular epidemiology of hepatitis С virus.//J.Gastroenterol.Hepatol., 1997,12,n.7: p. 522-527.

118. Stuyver L., Rossau R., Wyseur A., Duhamel M., Vanderborght В., Van H.H., and Maertens G. Typing of hepatitis С virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay.// J.Gen.Virol., 1993, 74, n.Pt 6: p.1093-1102.

119. Takada N., Takase S., Takada A., and Date T. HCV genotypes in different countries letter.// Lancet, 1992, 339, n.8796: p.808.

120. Tanaka Т., Kato N., Cho M.J., Sugiyama K, and Shimotohno K. Structure of the 3' terminus of the hepatitis С virus genome.// J.Virol., 1996, 70, n.5: p.3307-3312.148

121. Tanji Y., Hijikata M., Hirowatari Y., and Shimotohno K. Hepatitis С virus polyprotein processing: kinetics and mutagenic analysis of serine proteinase-dependent cleavage.// J.Virol., 1994a, 68, n.12: p.8418-8422.

122. Tanji Y., Hijikata M., Hirowatari Y., and Shimotohno K. Identification of the domain required for trans-cleavage activity of hepatitis С viral serine proteinase.// Gene, 1994b, 145, n.2: p.215-219.

123. Tanji Y., Kaneko Т., Satoh S., and Shimotohno K. Phosphorylation of hepatitis С virus-encoded nonstructural protein NS5A.// J.Virol., 1995, 69, n.7: p.3980-3986.

124. Terada S., Kawanishi K., and Katayama K. Minimal hepatitis С infectivity in semen letter.// Ann.Intern.Med., 1992, 117, n.2: p. 171-172.

125. Tomei L., Failla C., Santolini E., De F.R., and La M.N. NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis С vims polyprotein.// J.Virol., 1993, 67, n.7: p.4017-4026.

126. Trepo C. and Pradat P. Hepatitis С vims infection in Western Europe.// J.Hepatol., 1999, 31 Suppl 1:80-3, p.80-83.

127. Viazov S., Widell A., and Nordenfelt E. Mixed infection with two types of hepatitis С vims is probably a rare event.// Infection 2000.Jan.-Feb.;28.(l.):21.-5., 28, n.l: p.21-25.150

128. Watson J. P., Brind A.M., Chapman C.E., Bates C.L., Gould F.K., Johnson S.J., Burt A.D., Ferguson J., Simmonds P., and Bassendine M.F. Hepatitis С virus: epidemiology and genotypes in the north east of England.// Gut, 1996, 38, n.2: p.269-276.

129. Weiner A. J., Christopherson C., Hall J.E., Bonino F., Saracco G., Bmnetto M.R., Crawford K., Marion C.D., Crawford K.A., and Venkatakrishna S. Sequence variation in hepatitis С viral isolates.// J.Hepatol., 1991, 13 Suppl 4:S614, p.S6-14.

130. Widell A., Zhang Y.Y., Andersson-Gare В., and Hammarstrom L. At least three hepatitis С virus strains implicated in Swedish and Danish patients with intravenous immunoglobulin-associated hepatitis CM Transfusion, 1997, 37, n.3: p.313-320.

131. Zein N. N. Clinical significance of hepatitis С vims genotypes.// Clin.Microbiol.Rev.2000.Apr.;13.(2.):223.-35., 13, n.2: p.223-235.

132. Zeuzem S., Scheuermann E.H., Waschk D., Lee J.H., Blaser C., Franke A., and Roth W.K. Phylogenetic analysis of hepatitis С virus isolates from hemodialysis patients.// Kidney Int., 1996a, 49, n.3: p.896-902.

133. Zeuzem S., Teuber G., Lee J.H., Ruster В., and Roth W.K. Risk factors for the transmission of hepatitis CM J.Hepatol., 1996b, 24, n.2 Suppl: p.3-10.

Информация о работе

Калинина, Ольга Викторовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2000
ВАК 03.00.06

Диссертация

Молекулярно-генетическая характеристика вариантов вируса гепатита С, циркулирующих в Санкт-Петербурге - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы