Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика OMPF поринов бактерий рода YERSINIA и разработка ПЦР тест-системы для идентификации патогенных видов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика OMPF поринов бактерий рода YERSINIA и разработка ПЦР тест-системы для идентификации патогенных видов"

На правах рукописи

Стенкова Анна Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА OMPF ИОРИНОВ БАКТЕРИЙ РОДА YERSINIA И РАЗРАБОТКА ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

UU34Q9227

ВЛАДИВОСТОК - 2009

003489227

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, доцент Исаева М.П.

Официальные оппоненты:

доктор биологических корреспондент РАН Михайлов 15.В.

наук, профессор, член-

доктор биологических наук, профессор Балакирев Е.С.

Ведущая организация: Институт Цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Защита состоится «25» декабря в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (4232)31-40-50, e-mail: science@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Автореферат разослан «23» ноября 2009 г.

И.о. ученого секретаря

ЩЛ*

Диссертационного совета Д-б.н., с.н.с. Калинин В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Род Yersinia, относящийся к семейству Enterobacteriaceae, включает 14 видов бактерий. Медицинское значение однозначно установлено только для трех видов: У. pestis - возбудитель чумы, У. pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза и У. enterocolitica - возбудитель кишечного иерсиниоза. Клиническое значение других видов остается до сих пор неясным и мало освещенным (Sulakvelidze, 2000). Повсеместная распространённость, психротолерантность, варьирующая вирулентность и широкий спектр хозяев делают иерсинии модельным родом для генетических и эволюционных исследований патогенеза и экологии бактерий. Несмотря на то, что работы по ДНК-ДНК гибридизации и сравнительному анализу генов «домашнего хозяйства» показали значительную гетерогенность некоторых видов и послужили основой для характеристики недавно описанных новых видов (К. similis, У. aleksiciae, У. massiliertsis), современная идентификация иерсиний по-прежнему основана на описании фенотипических и биохимических характеристик. В связи с этим, для уточнения таксономии и прояснения филогении и эволюции рода Yersinia необходимо изучение молекулярной эволюции разных генов. На основе этих данных возможна разработка методов быстрой и точной видовой идентификации этих бактерий.

Механизмы адаптации иерсиний к различным хозяевам и различным условиям окружающей среды недостаточно изучены. Мембранные поверхностные молекулы в этом контексте представляют особый интерес, так как первыми реагируют на изменения условий окружающей среды и участвуют в процессах взаимодействия патогенного микроорганизма и хозяина. Одними из таких молекул являются неспецифические порины - доминирующие белки наружной мембраны бактерий, которые обладают уникальными структурными свойствами и функционируют как поры, регулируя проницаемость мембраны. Кроме того, некоторые порины участвуют в бактериальном патогенезе, например, адгезии и инвазии (Su et al., 1990; van Putten el al., 1998), а также индуцируют протективный ответ иммунной системой хозяина (Singh et al., 1999; Zhang et al., 1997). Для некоторых видов иерсиний были выделены и охарактеризованы OmpF- и OmpC-подобные порины (Вострикова et al., 2006). Для патогенных видов У. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica была охарактеризована первичная структура и топология OmpF порина (Гузев et al., 2005). Однако исследования были выполнены на единичных штаммах и ограниченном числе видов, что не даёт полного понимания степени разнообразия OmpF поринов и их роли в широких адаптивных возможностях представителей рода Yersinia.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было изучение полиморфизма и эволюции ompF гена и OmpF порина в пределах рода Yersinia и разработка многопраймерной ПЦР тест-системы для идентификации иерсиний и дифференциации патогенных видов. Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Генотипирование исследуемых штаммов иерсиний на основе секвенирования генов «домашнего хозяйства» - 16S рДНК и gyrB.

2. Определение нуклеотидных последовательностей, филогенетический и эволюционный анализ ompF генов 14 видов иерсиний.

3. Сравнительный анализ и компьютерное моделирование структурных вариантов OmpF поринов иерсиний.

4. Разработка и апробация многопраймерной ПЦР тест системы для идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы впервые определены нуклеотидные последовательности (НП) ompF, 16S рДНК и gyrB генов из 69 штаммов иерснний, представляющих все виды рода Yersinia. На основании этих данных проведён комплексный филогенетический и эволюционный анализ пориновых генов и выведенных аминокислотных последовательностей (АП) белков. В молекуле порина выявлены районы и сайты, испытывающие действие адаптивной эволюции. Впервые для иерсиний на примере ompF гена обнаружена внутривидовая и межвидовая внутригенная рекомбинация. Методом сравнительного моделирования получены теоретические модели пространственных структур некоторых вариантов OmpF поринов иерсиний {Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. similis, Y. rohdei, Y. frederiksenii, Y. mollaretii, Y. intermedia, У. kristensenii и Y. ruckeri).

На основе последовательностей ompF генов иерсиний разработана не имеющая аналогов многопраймерная ПЦР тест-система, позволяющая за одну реакцию идентифицировать бактерии рода Yersinia и дифференцировать патогенные для человека виды. Оптимизированы условия, определены чувствительность и специфичность реакции, исследована ее диагностическая информативность.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на: IX международном симпозиуме «Иерсинии», г. Лексингтон, США, 2006; II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», Санкт-Петербург, 2006; II Региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии», г. Владивосток, 2006; I Дальневосточном симпозиуме с международным участием «Науки о жизни», г. Владивосток, 2008.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 146 цитируемых работ. Диссертационная работа изложена на 101 странице машинописного текста и содержит 13 таблиц и 30 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы, использованные в работе, были любезно предоставлены д.м.н., проф. Шубиным Ф.Н., д.м.н., проф. Тимченко Н.Ф. (НИИ микробиологии и эпидемиологии СО РАМН, Владивосток) и д.б.н. Ракиным А.В. (Max von Pettenkofer Institute, Мюнхен, Германия). Всего было исследовано 69 штаммов иерсиний, среди которых 13 штаммов Y. enterocolitica, по 1-му штамму Y. aldovae, Y. massiliensis, Y. bercovieri, Y. pestis, Y. similis и Y. rohdei, no 4 штамма Y. aleksiciae, Y. frederiksenii и Y. ruckeri, no 5 штаммов Y. pseudotuberculosis и Y. mollaretii, 21 штамм Y. intermedia, 7 штаммов Y. kristensenii, и 10 штаммов, представляющих 7 видов условно-патогенных энтеробактерий.

Все праймеры, использованные в работе, были сконструированы с помощью программ Primer Premier 5 и Vector NTI Advance 9.1.0 с использованием НП 16S рДНК, gyrB и ompF генов иерсиний, опубликованных в базе данных GenBank (http://wvvw.ncbi.nlh.gov'). ПЦР проводили с использованием «горячего старта» при стандартных условиях для GoTaq полимеразы («Promega», США). Оптимизацию мПЦР выполняли в соответствии с алгоритмом, предложенным Henegariu et al.

(1997). Продукты амплификации разделяли в 1,5-2%-ном агарозном геле. Для определения чувствительности мПЦР использовали ДНК типовых штаммов в концентрациях от 2 нг/мкл до 2х10"7 нг/мкл. Специфичность определяли на чистых препаратах ДНК из десяти штаммов иерсиний и девяти штаммов близкородственных бактерий семейства Enterobacteriaceae. Диагностическую информативность проверяли на образцах из окружающей среды и клиническом материале.

НП и АП анализировали с помощью программ Vector NTI Advance 9 и MEGA4. Поиск гомологичных последовательностей осуществляли с помощью сервера BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). При построении филогенетических деревьев НП методом ближайших соседей (Neighbour-Joining) или методом невзвешенных парных групп с применением арифметических средних (UPGMA) использовали двух-параметрическую дистанцию Кимуры. При построении деревьев АП использовали п-дистанцию (p-distance). Достоверность филогенетических деревьев оценивали «bootstrap» тестом (1000 реплик). Действие позитивного или негативного отбора на ompF ген определяли разницей (dN-ds), где dN - число несинонимичных нуклеотидных замен на сайт, d$ - число синонимичных замен на сайт, d^ и ds были подсчитаны методом «Nei-Gojobori» (Nei, Gojobori, 1986) в программе MEGA4 (Zhang et al., 1998), a также методом, разработанным Neilsen и Yang (1998) с помощью программы SLR (Massingham, Goldman, 2005). G+C состав по 3-й позиции кодона и кодонное использование (СА1 индекс) были определены с помощью программного обеспечения CodonW 1.3 (ftp://molbiol.ox.ac.Uk/cu/codonW.tar.Z). Для определения рекомбинации использовали пакет программ RDP3 (Martin et al., 2005).

Построения пространственных структур OmpF поринов иерсиний осуществляли с помощью пакета программ МОЕт (http://wvvw.chemconip.com). Визуализацию и анализ структуры молекул проводили с помощью программы Accelrys DS Visualizer2.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Филогенетический анализ и эволюция ompF генов иерсиний

Секвенирование и филогенетический анализ 16S рДНК и gyrB генов иерсиний. Для установления филогенетического родства всех представителей рода Yersinia был проведен анализ «генов домашнего хозяйства» - 16S рДНК и gyrB. Ранее на основе 16S рДНК была показана возможность идентификации рода Yersinia (Ibrahim et al., 1993). Кроме того, этот ген использовался при описании новых видов и подвидов иерсиний (Ibrahim et al., 1996; Neubauer et al., 2000; Sprague et al., 2008). Однако ввиду высокой консервативности 16S рДНК не позволяет выявлять различие близкородственных видов иерсиний (Kotetishvili et al., 2005; Merhej et al., 2008). В качестве молекулярного маркёра для классификации бактерий используют ген gyrB, кодирующий В-субъединицу ДНК-гиразы. С помощью этого гена были генотипированы штаммы Y. frederiksenii (Demarta et al., 2004) и проведен мультилокусный анализ (MLST) 11 видов иерсиний (Kotetishvili et ai, 2005).

Использованные в работе 69 штаммов, представляющие все виды иерсиний, были выделены из разных источников и географических районов (табл. 1). ПЦР-амплификацию фрагментов 16S рДНК и gyrB генов проводили с парами праймеров BF20/BR2-22 и YgyrF/YgyrR соответственно. Полученные НП были дополнены 16S рДНК и gyrB генами иерсиний, геномы которых представлены в GenBank (http://wwvv.ncbi.nlm.nih.gov). В общей сложности 77 16S рДНК и 77 gyrB последовательностей были выравнены в программе ClustalW 2.0.10 (Larkin et al., 2007), окончательный размер НП составил 750 н.п. для 16S рДНК и 838 н.п. для gyrB.

Каждому индивидуальному нуклеотидному и аминокислотному аллелю был присвоен номер. В результате были получены 32 уникальных участка 16S рДНК гена, 49 аллелей участка gyrB гена и 21 аллель участка АП GyrB (табл. 1). Следует отметить, что данные по числу аллелей отличались от опубликованных ранее (Kotetishvili et al., 2005), что может быть связано с включением в работу новых видов (Y. similis и Y. aleksiciae) или с увеличением длины анализируемых участков 16S рДНК и gyrB генов.

Таблица 1. Распределение 16S рДНК, gyrB и ompF аллелей в роду Yersinia

Вид Штамм Информация о штамме 16S Тип аллеля (НП/АП)" gyrB ompF

Y. aldovae Y1I2 Германия 1 16/11 10/14

АТСС 35236'"' Вода, Чехословакия 1 47/21 60/14

Y. aleksiciae Y1591 Германия 2 15/1 11/15

Y. bercovieri АТСС 43970"' Кал человека, Франция 17 1/2 13/16

H632-36/85 Германия 14 1/2 12/17

Y. enterocolitica 108-C 0:3 серотип 3 2/3 1/1

subsp. palearctica 1234 0:3 серотип, РФ 3 3/4 15/18

2974/81 0:9 серотип 3 2/3 17/1

6579 0:3 серотип, РФ 3 2/3 1/1

1245 Человек, РФ, 1979 г. 3 3/4 20/2

2720/87 0:9 серотип 3 17/3 16/1

1215 Человек, РФ, 1989 г. 3 3/4 14/2

Y. enterocolitica 221 0:3 серотип, человек, Германия 4 4/4 2/3

subsp. enterocolitica 8081' 0:8 серотип, человек, США 4 4/4 18/19

WA220 4 4/4 2/3

WA221 4 4/4 19/3

WA229 4 4/4 2/3

WAP 0:8 серотип 18 18/12 21/3

Y. frederiksenii H56-36/81 0:60 серотип, Германия 5 19/5 22/20

4648 Человек, РФ, 1990 г. 5 5/6 24/21

4849 РФ 5 21/14 26/22

АТСС 3364 Р Сточные воды, Дания 19 20/13 23/23

176-36 20 5/6 25/24

Y. massiliensis' 2043 РФ 21 22/15 27/25

Y. intermedia 5631 Кал лемминга, РФ, 1980 г. 1 6/7 39/26

5934 Кал суслика, РФ, 1980 г. 1 14/7 32/27

6325 Кал лемминга, РФ, 1980 г. 1 28/7 6/7

АТСС 29909"' Моча человека 6 7/7 30/28

5373 Вода, РФ, 1990 г. 6 6/7 3/4

6390 Кал лемминга, РФ, 1980 г. 6 9/7 5/6

5593 Кал лемминга, РФ, 1980 г. 6 25/17 5/6

5986 Кал мыши, РФ, 1980 г. 6 7/7 36/29

Н357/85 0:3 серотип 6 10/7 37/30

Nr27/84 Вода, Германия 6 9/7 5/6

Н9-36/83 0:17 серотип, Германия 6 7/7 28/31

Nrl3/84 Человек, Германия 7 8/7 29/32

1948 Вода, РФ, 1990 г. 7 26/7 4/5

5828 Полёвка, РФ, 1980 г. 7 8/7 38/33

6043 Кал мыши, РФ, 1980 г. 7 27/7 40/34

5375 Вода, РФ, 1990 г. 7 8/7 4/5

5638 Кап лемминга, РФ, 1980 г. 7 6/7 3/4

6270 Кал лемминга, РФ, 1980 г. 13 14/7 31/35

6044 Кал полёвки, РФ, 1980 г. 13 24/16 35/36

Nr9/83 Человек, Германия 22 10/7 33/37

601 РФ 23 23/7 34/38

6276 Кал лемминга, РФ, 1980 г. 24 29/18 6/7

Y. kristensenii 5306 Кал бурозубки, РФ, 1980 г. 15 36/8 44/9

5862 Полёвка, РФ, 1980 г. 15 35/8 7/9

5932 Кал полёвки, РФ, 1980 г. 15 37/8 45/40

6032 Бурозубка, РФ, 1980 г. 16 34/8 7/9

5868 Кал шилохвоста, РФ, 1980 г. 16 33/8 7/9

6572 Смыв с моркови, РФ, 1992 г. 25 32/8 43/41

HI 7-36/83 0:12,25 серотип, Германия 26 38/8 46/9

ATCC 33638™ Моча человека 26 43/22 61/48

У. aleksiciaec Y332 2 15/1 47/39

6266 Кал мыши, РФ, 1980 г. 8 31/19 42/8

991 РФ 8 30/1 41/8

У. mollaretii №850/89 Вода, Германия 9 42/2 53/42

№846/89 Вода, Германия 9 40/2 50/10

H279-36/86 0.59 серотип, Германия 9 11/2 52/11

87-36/87 10 41/2 51/10

H87/82 0:3 серотип 10 39/2 48/10

ATCC 439691" Почва, США 27 11/2 49/11

Y pestis 91001T' И 12/9 8/12

C092™ Человек, США И 12/9 54/43

Pestoides F* 11 12/9 8/12

У. pseudo- 1P32953T 1 серотип, человек, Франция 11 45/9 57/44

tuberculosis IP31758T 1Ь серотип, человек, РФ, 1966 И 44/9 56/45

Yplll США 11 43/9 55/46

У rohdei H274-36/78 0:76 серотип, Германия 29 46/20 59/47

ATCC 43380" Кал собаки 30 48/20 62/47

У. ruckeri Nr 34/85 Рыба, Германия 12 13/10 9/13

H528-36/85 12 13/10 9/13

H529-36/85 Германия 12 13/10 9/13

H527-36/85 28 13/10 58/13

ATCC 29473™ Рыба 31 13/10 63/49

Y. similis Y239T Германия 32 49/9 64/50

Всего аллелей 32 49/22 64/50

Примечания:" - НП, нуклеотидная последовательность; АП, аминокислотная последовательность; ' - последовательности взяты из вепВапк; с - видовая принадлежность скорректирована с умётом генотипирования.

Фрагменты 16S рДНК и gyrB генов были объединены и использованы для построения общего филогенетического дерева методом ближайших соседей (рис. 1). Как видно из рисунка, большинство видов иерсиний формируют отдельные группы с внутригрупповым сходством более 98,8%. Штамм Y239 недавно охарактеризованного вида У. similis (Sprague et al., 2008) формирует отдельную ветвь, расположенную близко к штаммам У. pseudotuberculosis и У. pestis. В свою очередь штаммы Y. pseudotuberculosis и Y. pestis группируются вместе с межвидовым сходством более 99,9%, образуя один геномовид, что подтверждает ранее полученные результаты (Achtman et al, 1999; Kotetishvili et al., 2005). Штамм Y. frederiksenii 2043 не попадает в одну группу с остальными У. frederiksenii. Поэтому на основании филогенетического окружения (одна ветвь с Y. aleksiciae, У. bercovieri и У. mollaretii) и дополнительно проведенного BLAST анализа штамм 2043 был переопределен как У. massiliensis. Три штамма У. kristensenii (Y332, 991, 6266) попадают в группу У. aleksiciae, что вполне объяснимо ввиду недавнего выделения У. aleksiciae из У. kristensenii (Sprague, Neubauer, 2005).

Таким образом, все взятые в работу штаммы иерсиний были генотипированы на основе объединенного филогенетического дерева генов «домашнего хозяйства» - 16S рДНК и gyrB. В соответствии с филогенетическим расположением штаммов, штаммы 991, 6266 и Y332, биохимически идентифицированные как Y. kristensenii, были переопределены как Y. aleksiciae, а штамм К frederiksenii 2043 - как К massiliensis. В остальных случаях 16S рДНК-gvrß дерево соответствовало ранее описанному дереву на основе MLST данных (Kotetishvili et al2005). К наиболее генетически гетерогенным видам были отнесены Y. enterocolitica, У. frederiksenii, Y. тоllaretii, Y. kristensenii и, вопреки данным Kotetishvili et al. (2005), наибольшую внутривидовую дивергенцию (1,2%) показал вид Y. intermedia.

У. massiliensis (У. frederiksenii)

У. kristensenii

У. rohdei

У. enterocolitica

У. pseudotuberculosis

У. similis

• К enterocolitica

• У. bcrcovicri

• У.aleksiciae

• К rohdei

• У. rucken

• К intermedia •К kristensenii

• К frederiksenii

• К pestis

У. pseudotuberculosis

• К mollaretii

• У. atdovac •К similis

Рис. 1. Филогенетическое дерево иерсиний, построенное методом ближайших соседей на основании объединённых НП 16Б рДНК и %угВ генов.

s

Секвепнрование и филогенетический анализ ompF генов иерсиний. ПЦР-амплификацию и секвенирование кодирующей последовательности ompF гена иерсиний проводили в соответствии с методиками, описанными в разделе «Материалы и методы исследования». В общем, было получено 77 НП ompF генов иерсиний с учётом взятых из GenBank. Каждому индивидуальному аллелю был присвоен номер. Всего было найдено 64 индивидуальных нуклеотидных и 50 аминокислотных аллелей (табл. I). Длина ompF генов варьировала от 1080 до 1146 н.п. По длине ompF гены образовывали 12 групп, причём самые короткие НП (1080 н.п.) были найдены у У. pestis, Y. pseudotuberculosis и У. similis, а самые длинные (1146 н.п.) - у У. aldovae. Все последовательности были выравнены с помощью программы Clusta!W2. На основе полученного элаймента было построено филогенетическое дерево, которое свидетельствует о значительной дивергенции ompF гена по сравнению с объединенным деревом по 168рДНК и gyrB генам (рис. 2).

Y. pseudotuberculosis

similis

Y. pestis

XVIII

• К enlerocolitica

• К bcrcoiicri oY.aleksiciae

• Y. robdei

• V. ruckcri

в Y. intermedia

• К kristcnscnii

• Y. frederiksenii

• Y. pestis

Y. pseudotuberculosis

• Y. moUaretii

• K aldovae

• K similis •K massiliensis

Y. ruckien

Рис. 2. Филогенетическое дерево иерсиний, построенное методом ближайших соседей на основании НП отрр генов.

На основании значений генетических дистанций, на филогенетическом дереве, можно выделить 18 групп. Все пять штаммов патогенного для рыб вида У. ruckeri образуют гомогенную и достаточно отдаленную от других видов иерсиний группу V, что хорошо согласуется с данными Ibrahim et al. (1993) и Kotetishvili et al. (2005). Отдельный кластер VII также формируют штаммы У. enterocolitica. Причём внутри группы наблюдается топологически схожее с 16S-gyrB деревом разделение (100% бутстреп поддержка), отражающее современное деление вида на подвиды У. enterocolitica subsp. enterocolitica и У. enterocolitica subsp. palearctica. Интересно, что ompF гены штаммов, выделенных в России (1215, 1234, и 1245), формируют собственную ветвь (бутстреп 100%) в подвиде У. enterocolitica subsp. palearctica. Восьмая группа ompF включает штаммы трёх видов, У. pestis, У. pseudotuberculosis и У. similis. Интересно, что штамм У. pseudotuberculosis YPIII генетически располагается ближе к штаммам У. pestis, а У. similis Y239 находится на одной ветви с У. pseudotuberculosis, что явно противоречит топологии, полученной для генов «домашнего хозяйства», и предполагает наличие межвидовой рекомбинации или адаптивной эволюции в ompF гене. Штаммы У. frederiksenii по ompF гену разделяются на три отдельные группы (IX, XI, XII), где группы IX и XI соответствуют ранее охарактеризованным геномовидам lb и 1а , а группа XII - У. massiliensis, ранее относившейся к геномовиду 2 (Ursing et al., 1995). Два штамма У. aleksiciae (Y159 и Y332), образующих группу XVII, находятся на одной ветви с тремя штаммами У. mollaretii (Н279-36/85, №850/89 и АТСС 43969), образующими группу XVIII. Два других штамма У. aleksiciae (991 и 6266) - группа XVI, группируются с остальными штаммами У. mollaretii (87-36/87, Н87/82 и №846/89) - группа XV. Обнаруженное топологическое несоответствие может свидетельствовать о наличии межвидовой рекомбинации в ompF гене. Интересно, что У. aleksiciae, недавно выделенная в отдельный вид из штаммов У. kristensenii, по деревьям \bS-gyrB и tufA-tujB (Isabel et al., 2008) была генетически ближе к У. bercovieri и У. mollaretii, чем к У. kristensenii. Наибольшая дивергенция по ompF гену (так же как и по 16S-gyrB генам) обнаружена среди штаммов У. intermedia, образующих четыре группы (I-III, XIII). Интересно, что группа XIII, сформированная пятью штаммами (601, №12/84, 1948, 5375 и 5631), далеко отстоит от остальных групп У. intermedia и находится на одной ветви со штаммами У. rohdei (XIV), что указывает на возможность межвидовой рекомбинации.

В целом филогенетические взаимоотношения большинства видов иерсиний по ompF гену топологически соответствуют таковым по генам «домашнего хозяйства» с хорошей бутстреп поддержкой (75-100%). Тем не менее, для ряда видов наблюдается повышенная дивергенция с образованием генетически дистантных групп, что может быть обусловлено либо внутри/межвидовой рекомбинацией, либо действием адаптационной эволюции в пориновом гене.

Молекулярная эволюция ompF гена иерсиний. Как было показано выше, для ompF гена характерна большая дивергенция по сравнению с 16S рДНК и gyrB генами иерсиний. В среднем, нуклеотидная дивергенция для всех ompF генов составляет 0,131±0,005, что в два раза выше эволюционной дивергенции 16S рДНК и gyrB генов иерсиний (0,051 ±0,004). Установлено, что на долю вариабельных нуклеотидных сайтов приходится 40% (479/1200 н.п.), распределение которых является не равномерным вдоль ompF гена с формированием высоковариабельных и консервативных доменов (рис. 3). Как известно, для поринов энтеробактерий вариабельные участки последовательностей приходятся на наружные петли белковой

молекулы. В соответствии с доменной организацией OmpF белка Escherichia coli на НП ompF гена иерсиний были выделены 18 районов, включающих один участок, кодирующий сигнальную последовательность белка (sig.s.), девять участков, кодирующих трансмембраиные p-стренды и периплазматические петли (16'-ip по 16р), восемь участков, кодирующие наружные петли (L1-L8). При сравнительном анализе было обнаружено, что среди наружных петель иерсиний наиболее гетерогенными являются L4, L5 и L7 петли, где внутриродовое сходство составило в среднем 54±4,5%. Самый высокий уровень гомологии, наравне с консервативными доменами, обнаружен для петли L3 - 92,8±1,6%. Из трансмембранных участков наиболее дивергентными оказались 8-9р, 10-1 ip, 12-13Р (88,3±1,3%), оставшиеся районы показали сходство в среднем - 94±0,7%.

Рис.3. Распределение нуклеотвдной дивергенции по отрГ гену иерсиний. Последовательность, кодирующая сигнальный пептид ($¡§.5.), обозначена голубым цветом; участки, кодирующие р-стренды и периплазматические петли (Р1-16), - черным; наружные петли (Ь1-Ь8) - зелёным.

С целью выявления внутривидовой дивергенции отдельных участков ompF гена был проведён сравнительный анализ гена внутри видов. Так как У. similis и У. massiliensis представлены единичными штаммами, эти виды были исключены из дальнейшего анализа. Штаммы У. pestis и У. pseudotuberculosis были объединены в одну группу и рассматривались как один геномовид. На рисунке 4 изображён график, отражающий степень дивергенции участков ompF гена у 11 видов иерсиний.

■ У. bercovieri * У. enterocohtica я У. aldovae я У. aleksiciae

■ У. frederiksenii я У. intermedia

У. pestis, У. pseudo. я К ruckeri я У. rohdei

■ У. mollaretii ш У. kristensenii

11Б5 н.п.

Рис. 4. Распределение нуклеотидной дивергенции по ompF гену внутри разных видов иерсиний.

Для выявления характера эволюции ompF гена иерсиний был проведён анализ нуклеотидных последовательностей на основе расчета числа несинонимичных и синонимичных замен на сайт и ds соответственно) (Nei, 1987). Разница между этими показателями является важным критерием избирательного «давления» эволюции на общую структуру гена/белка или его отдельные участки: при dN < ds предполагается действие негативного отбора, при dN = ds - нейтральной эволюции и, при dN> ds - позитивного отбора (Hughes and Nei, 1988; Yang and Bielavvski 2000). Существуют методы, определяющие разницу между dN и ds для участка молекулы или для каждого конкретного кодирующего сайта Мы использовали оба метода для выявления нуклеотидных участков и сайтов в ompF гене иерсиний, находящихся под действием адаптивной эволюции. В связи с тем, что при филогенетическом анализе был выявлен ряд ompF аллелей, предположительно подвергшихся рекомбинации, мы исключили их из анализа и сформировали следующие группы: YE - У. enterocolitica; YP - У. pestis, У. pseudotuberculosis, Y. similis; YF - У. frederiksenii кроме АТСС33641, YK - У. kristensenii; YI1 - У. intermedia Nr27/84, 5593, 6390, 5986, №9/83, H9-36/83, ATCC 29909, H357/85, 6325, 6276; YI2 - Y. intermedia 5373, 5638, 5828, 6043; YI3 -6044, 5934, 6270; YI4 - 5631, 5375, 1948, №13/84; YB - У. bercovieri; YR - У. ruckeri\ YA - Y. aldovae. В таблице 2 представлены значения d^-ds для разных структурных участков ompF гена Вероятность отклонения от нулевой гипотезы (dN<ds, d^=ds, dN>ds) была определена Codon-based Z-тестом в программе MEGA4. Практически во всех группах иерсиний ompF ген подвержен действию негативного отбора. При анализе отдельных структурно-функциональных районов выявлено, что большинство участков также находятся под действием очищающей эволюции. Тем не менее, обнаружены участки с преобладанием несинонимичных нуклеотидных замен (позитивный отбор), локализованные в наружных петлях порина: для группы YP - в петле L2, а для группы YI1 - в петле L4.

С помощью программы SLR (Sitewise Likehood Ratio estimation) были выявлены кодирующие сайты, находящиеся под действием позитивной селекции в отобранных группах иерсиний. На рисунке 5 изображены теоретические модели OmpF поринов типовых представителей сформированных групп иерсиний (см. выше) с локализацией АК сайтов, находящихся под действием позитивной эволюции. Установлено, что в разных группах иерсиний сайты с положительной селекцией локализованы в разных наружных петлях. Так, в группе YP позитивному отбору подвержены три сайта в петле L1, один сайт в петле L2, два сайта в петле L6 и пять сайтов в петле L8. В то же время в группе YE наибольшее число сайтов, пять, находящихся под действием адаптивной эволюции, локализовано в петле L4 и по одному - в петлях L5, L6 и L8.

В результате сравнительного анализа ompF генов иерсиний было выявлено, что разные участки гена эволюционируют с разной скоростью в зависимости от структурно-функциональной организации белковой молекулы; внутривидовая дивергенция различается у разных видов не только по степени гетерогенности, но и по локализации гетерогенных участков в гене, что, возможно, обусловлено функциональными различиями одних и тех же доменов. Показано, что ompF гены иерсиний подвержены действию адаптивной эволюции. Причём, большинство участков, кодирующих как трансмембранные p-стренды так и наружные петли, испытывают «давление» очистительного отбора. В некоторых наружных петлях обнаружены сайты, находящиеся под позитивным отбором, которые у разных групп иерсиний локализованы в разных петлях. Кроме того, выявлены консервативные (без нуклеотидных замен) районы, в том числе в гетерогенных группах иерсиний.

Таблица 2. Значения в участках отрр гена у разных групп иерсиний.

УЕ УР УК УК УИ У12 У13 У14 УВ УК УА

К к к к к К -0,040 К к -0,028 к

16-1Р -0,031 -0,019 к -0,058 к -0,045 -0,091 -0,034 к К к

2-Зр -0,022 -0,023 -0,064 К 0,005 К 0,019 К к К к

4-5Р -0,045 -0,062 ; -0,021 -0,031 -0,051 -0,058 -0,011 К к К к

6-7р -0,048 -0,018 ■■ -0,116 -0,012 -0,016 -0,030 -0,030 К -0,045 К к

В-9р -0,103 -0,016; -0,153 -0,075 -0,032 -0,182 К К К К к

10-11р -0,092 -0,050 ; -0,087 -0,116 -0,080 -0,014 -0,060 к К К к

12-13Р -0,095 -0,145 -0,207 -0,028 К К -0,222 к К К к

14-150 -0,014 -0,005 0,016 0,004 '-0,109 К -0,114 -0,044 К к к

16(1 -0,085 К ; -0,120 -0,085 -0,112 К К -0,120 К -0,032 -0,250

1Л К -0,252 -0,147 К -0,100 -0,143 К К К К К

-0,115 0.098 ' -0,253 -0,043 -0,073 К -0,091 К К К. К

и -0,024 0,004 -0,032 -0,012 -0,033 К -0,094 0,015 -0,281 К К

1А -0,230 0,020 -0,077 -0,059 0,005 -0,216 -0,034 К К К. К

Ь5 -0,317 к : -0,103 -0,028 -0,095 -0,347 -0,171 0,012 0,031 К к

Ы -0,092 -0,267 -0,386 -0,057 -0,150 К. -0,125 К К к к.

Ь7 К -0,218 -0,227 0,024 -0,107 К К К. -0,120 к к

Ь8 -0,028 -0,184 -0,129 -0,049 -0,092 -0,059 -0,241 -0,228 К к к

отрр -0,069 -0,045 -0,091 -0,035 -0,044 -0,055 -0,079 -0,015 -0,028 -0,006 -0,007

Примечания: Sig.s. - участок, кодирующий сигнальную последовательность; 16-1 р по 16(3 - участки,

кодирующие трансмембранные р-стренды и периплазматические петли; 1.1-1.8 - наружные петая. «К» с жёлтым фоном - участки без нуклеотидных замен; голубой фон - негативный отбор; красный фон -позитивный отбор, белый фон - статистически не значимо (Сос1оп-Ьа5ес1

щ ¡1

1-7 УК 1.7 ТГР

Рис. 5. Теоретические трёхмерные модели 6 типов ОтрГ поринов иерсиний с а.к. сайтами, находящимися под действием позитивного отбора. Красная сфера - 99% вероятности; жёлтая сфера - 95% вероятности. Изображения получены с помощью программы Ассе1гуз 08 У^иаНгсг У2.

При изучении эволюции кодирующих генов часто определяют индексы предпочтения кодонов, G+C состав и содержание G/C в третьей позиции кодона (GC3). Предпочтение тех или иных кодонов отражает баланс между мутациями и их отбором для эффективной трансляции гена. Мы определили индекс адаптации кодонов (CAI, Codon Adaptation Index) для ompF генов иерсиний. Установлено, что чем выше значение индекса, тем выше уровень экспрессии гена (Sharp and Li, 1987). В качестве референтных, высоко экспрессируемых, генов были использованы гены 20 рибосомных белков из 11 видов иерсиний. В среднем, CAI генов рибосомных белков варьирует от 0,615 до 0,717 для всех видов. Для ompF генов значения индекса варьируют от 0,702 до 0,793. Следовательно, в ompF гене иерсиний наблюдается строгое предпочтение определённых кодонов, наравне с рибосомными генами, что свидетельствует о высоком уровне экспрессии. У бактерий по G/C составу и содержанию G и С в третьей позиции кодона иногда судят о горизонтальном переносе генов или рекомбинационных событиях между организмами (Tekaia and Yeramian, 2006; Wu et al., 2005). У иерсиний внутривидовой G/C состав и GC3 в ompF гене практически не отличается от таковых в рибосомных генах. Кроме того, не обнаружены межвидовые различия этих показателей, что свидетельствует об однородности G/C состава высоко экспрессируемых генов у иерсиний. Таким образом, из-за высокой внутриродовой гомогенности показатели G+C и GC3 не являются информативными в выявлении переноса или рекомбинации ompF генов между разными видами иерсиний.

Основываясь на результатах филогенетического анализа ompF генов иерсиний, мы предположили наличие рекомбинационных событий у некоторых штаммов и видов. Для проверки гипотезы мы использовали программный пакет RDP3, включающий наиболее популярные методы выявления рекомбинационных перестроек в генах. Четыре программных теста (RDP, MaxChi, Chimera и GENECONV) были применены для идентификации рекомбинации и локализации рекомбинационных точек в ompF гене. Всего было обнаружено четыре рекомбинационных события, поддерживаемых тремя и более программными методами, и затрагивающих штаммы У. intermedia, У. aleksiciae и У. mollaretii (рис. 6). Интересно, что во всех случаях рекомбинационная точка (431-501 н.п.) располагается в одном и том же районе, который приходится на шестой ß-стренд белковой молекулы. Филогенетическое дерево участка ompF гена от начала до рекомбинационной точки, построенное для трёх видов иерсиний и их ближайших филогенетических соседей, отражает топологию, схожую с таковой для 16S рДНК-gyrB генов. Таким образом, впервые в роду yersinia была обнаружена как внутривидовая (У. intermedia), так и межвидовая (К aleksiciae и Y. mollaretii) внутригенная рекомбинация.

2.2. Сравнительный и структурный анализ вариантов OmpF поркнов иерешшй

Анализ аминокислотных последовательностей OmpF поринов иерсиний. НП ompF генов иерсиний были транслированы (с использованием стандартного генетического кода) в АП, которые выравнивали для дальнейшего анализа.

Установлено, что АК состав OmpF поринов разных видов иерсиний остаётся практически неизменным с сохранением закономерностей в распределении основных гидрофобных и ароматических АК остатков (G, Y, F). Наибольшее сходство OmpF порины иерсиний показывают с OmpF поринами Е. coli (Chen et al., 1982) и S. marcescens (Hutsul and Worobec, 1997). Также было выполнено моделирование пространственных структур 26 вариантов поринов. В качестве прототипа была

выбрана кристаллическая структура осмопорина К. pneumoniae (OmpK. 36) (Dutzler and Schirmer, 1999). В результате сравнительного анализа построенных моделей поринов было выявлено, что наибольшая величина среднеквадратичного отклонения (RMSD) составляет 1,4 Ä. Это свидетельствует о высокой степени структурного подобия OmpF поринов иерсиний.

№27/84 6390 5593 - 5986

ш, АТСС 43969 Л Н279-3&-'86 Т. mollarelii Х1'Ш / 1— Ni

У. rohdei

■НИИ.

601 / Nrl3/84

56В1 Г. intermedia ХШ

5375

1948

Н527-36/851 X ruckeri

ом:

й.01

в

1

У- hüermedial Ш 482 1200

1 К intermedia II

У. intermedia 1 431 1163

У. пзегяшНаХШ

У mollarelii ХУШ 1 431

Ун

• У. аШккк М7

У ЫеЫаае ХУ1ш

1163

■■Ы Г mollarelii XV

Рис. 6. Рекомбинационные события в отрр генах У. ¡МегтесНа, У. а/екз/с/ае и У. тоПагеШ. Филогенетические иРвМА деревья рекомбинирующих штаммов и их ближайших соседей на основе: А - полноразмерных последовательностей отрГ генов; Б - усечённых последовательностей (1-501 н.п.) отрр генов; В - схематическое изображение рекомбинационных событий с локализацией рекомбинационных точек.

Общий аминокислотный элаймент ОшрИ лоринов иерсиний представлен 399 позициями, среди которых 93 - вариабельные сайты, что составляет 23,3% от общей длины молекулы (в два раза меньше, чем на нуклеотидном уровне). Распределение вариабельных сайтов (рис. 7) имеет неравномерный характер, наибольшая их концентрация наблюдается в области наружных петель.

Рис. 7. Гистограмма распределения вариабельных а.к. сайтов в ОтрИ поринах иерсиний. Консервативные районы, соответствующие р-стрендам, периплазматическим петлям и петле ЬЗ, обозначены чёрным цветом; вариабельные районы, соответствующие наружным петлям (Ь1, Ь2, Ь4-Ь8) - зелёным.

Для выявления уровня эволюционной дивергенции был проведён анализ всех структурно-функциональных участков молекулы. Как следует из результатов, представленных на рисунке 8, наиболее дивергентными в Отрр порине иерсиний являются петли Ь4, Ь5 и Ь7 (0,35±0,03), а наиболее консервативными - петля ЬЗ и участки sig.s., 16'-1р, 6-7Р и 12-13$ (0,028±0,01). Следует отметить, что значения дивергенции отдельных участков на нуклеотидном и аминокислотном уровнях не совпадают: если на аминокислотном уровне сохраняется высокий уровень вариабельности для трёх петель (Ь4, Ь5 и Ь7), то в случае трансмембранных Р-стрендов высоковариабельный нуклеотидный участок 12-1ЗР оказывается наименее дивергентным на аминокислотном уровне. Кроме того, обнаружены так называемые «видовые предпочтения» в отношении дивергенции по отдельным наружным петлям в сравнении с таковыми на нуклеотидном уровне, что поддерживает идею о действии разных эволюционных сил на эти участки.

(I

0,45

Рис. 8. Гистограмма эволюционной дивергенции структурно-функциональных участков ОтрР порина иерсиний.

Для выяснения присутствия и локализации антигенных детерминант OmpF порины разных видов и групп иерсиний были проанализированы на сервере Bcepred (Saha and Raghava, 2004), позволяющем предсказывать В-клеточные эпитопы. Мы использовали сочетание 4-х параметров (антигенность, подвижность, полярность и гидрофобность). Как видно из рисунка 9, в основном участки предполагаемых антигенных детерминант сосредоточены в районах наружных петель поринов. Следует отметить, что все виды иерсиний, патогенные и непатогенные, содержат предполагаемые В-клеточные эпитопы. Одни из них занимают всю петлю, тогда как другие располагаются в центре либо в основании петли.

Таким образом, нами установлено, что 1) па уровне первичной структуры белка сохраняется высокая как внутривидовая, так и межвидовая гетерогенность петельных участков молекулы; 2) несмотря на высокую вариабельность петельных участков, АК состав OmpF поринов иерсиний остаётся практически неизменным с сохранением закономерностей в распределении основных гидрофобных и ароматических АК остатков.

LI 12 L3 L4 1.5 L6 L7 LS

топология OmpF

У. uldovae У] 12 У. aleksiciae 99 J Y. bemmeri ATVC 43970 У. enterocolitis lOS-C >'. entert*ctí¡itica 80H1 У frederiksenii 4849 У. massiliemis 2043 У. intermedia ЛТСС 29909 >". mckeri Nr34/H5 У. psem/omb. IP3U53 }'. kristensenii 5S62

Рис. 9. Локализация антигенных детерминант на а.к. последовательностях ОшрР поринов иерсиний. Черным цветом выделены трансмембранные р-стренды и периплазматические петли; зелёным цветом - петли (Ы-Ь8); красным цветом - антигенные детерминанты.

Анализ участков петель OmpF вариантов. Предполагаемые районы АП петель OmpF поринов иерсиний были проанализированы с помощью программы MEGA 4. Среди 11 вариантов АП петли L1 наиболее представлен среди видов аллель с полиморфным мотивом DNAG (рис. 10). Наибольшее количество разных аллелей содержат виды Y. intermedia и У. frederiksenil. Следует отметить, что функция LI петли в бактериальных поринах практически не изучена. Считается возможным ее участие в структурной организации тримера. в частности через взаимодействие с L4 петлёй соседнего мономера (Cowan et al., 1992). Соответственно, вариации в последовательностях этих петель могут влиять на стабильность тримера. Однако особая роль в стабилизации и формировании тримера отводится петле L2, которая направлена в сторону от «своего» мономера, частично закрывая вход в пору соседнего мономера. Наибольшее количество аллелей петли L2 также содержали Y. intermedia и Y. frederiksenii. Установлено, что для всех аллелей петли L2 строго сохраняется пятый остаток глутаминовой кислоты (Е87), который эквивалентен Е71 АП OmpF £. coli и образует четыре водородные связи с R100 и R132 соседнего мономера (Phale et al., 1998).

44444455 45678901 РБСЖАССЮ УАО УЕ

а.к а.б

а. .

и

\як

VI (1,11,»») УР (XI) УМ5 УВ

УР (IX) УР(176-36) У1 (XI и) УЯН

VI (601) УМ (XVI п) УК

УМ (ХУ,Мг850/89)

УР5 (УР111,1Р31758) УРЭ (1Р32953)

3456789012345 ам^бс^о-^ уао

........э-е.. удц

у8 уе

.н.

.н.

.Т.СС0А(ЗО. .Т.СТОАО. ...а.ей-...а.ес-...а.ес-...а.ес-

.еа-

У1 (ММИ)

ур (ix)

ур (176-36)

ур (xi)

У1 (601) ук

ум (xv) ум5

У1 (хш)

ук (6572)

111111111111111111111111111111 122222222223333333333444444444 901234567890123456789012345678 СУ1\Т>УМА№ТС>М1-РУР0С031-5№50^МГб УАО

....................I......... УАЬ (XVII)

....................I......... УР (IX)

....................I......... УМ (XVIII)

УР

УРБ

. . . .5-Е .. УМ (XVI») .ОТ.АСЮ.

Л.....У. . . УР (XI)

.1.....У... VI (имм.хш)

.1.....У. . . УА1. (XV)

УК

.ей.аое. . .ОЭ.АОО..

----вт-е..

..а.......

\2

урб (урш) урб

укк

уян уь

111111111111111111111111222 22222 222 77778888888888999999999900000000001 67890123456789012 3456789012 34567890

------УТТЫ РГГС \ЛТ 5 У £N1. К УАО

Е.-.О-Б-----Т..СС1.Т----РМ...О.. УВ

£N0.5А-----------О

Е. . . 5А------.АОСУУ..-----N

Е. . .55------.Е^УУ. .-----К

•ТТТОААС\Л/.5----.О

и

222222222222222222222222 33344444444445 55555 55556 789012345678901234567890 РТО<3<Ж1?Р----------ЗЙАЬСО

.Г.....У. . . УМ (XV)

.1.....У. . . УЛН

.1..Р..У... УМ5

.Х.БР..У... УГ (МГ13/84)

.I.А...У... У1 (601)

.1.......А. УР (С092)

. . .А..............УЯК

уе 1

у1 (6325,6276) у1 (5986) уе 2

. Е.....У-УЕТТ0АиСМУ.5Т—Т.....О.. УЕ (8081)

УАО УЕ 3

. УВ (Н632-36/85) . УВ (АТСС 43970) УЕ 4 УЕ 5

Е. . . 5А------ТКОйАУ. .-----О. . .1

. .0МО.А.5---ЮРУ.СУУ..-----А. .

у1 (о у1 (но

. .<зио.А.5---ЮР5.СУУ..-----О...О.. У1 (5373,5638)

----- " •• У1 (5828,6043)

УК (6572)

. N. .ОА.----------.т.а.ы

. . .А.----------.Т.С.Е

.А.----------.Т. N. Е

ATVTAOPI.GOV .Т5---,

. .ЕЫ. .0--------------------Си-вТ. ,

. . ЕЬ. .0--------------------GL.Tr. .

. .ЕТ. .Р--------------------Си.ТТ. .

. .Е1«60Т-------------------А61. .в.

. .ЕТ. .0--------------------61..ТТ. .

. . ЕБ. .0--------------------Си.ТТ. .

. .Е5. .0--------------------GL.Tr. .

..ЕТ. .0--------------------GL.Tr. .

. .Е$. .О--------------------GL.1T. .

. .£«^£0----------------------V. .5.

. .ЕЙМСО----------------------V. .5.

. .ЕМ>МО----------------------1.05.

.. .-ЛбЕ----------------------V. .А.

.. .-ЯвЕ----------------------V. .А.

.. .-Яво----------------------1. .А.

..ЕЕ. .ОК---------------------У.ОЕ,

. .ЕТБ.Е--------------------GL.AT, .

ук ум(xv) уаи (xvii) yal (xvi) ур (xi) умб

у1 (xiii) У1 (601) уя (176-36) ур (ix) ум (xviii) ур

урб (урш.1р31758) ур$ (1р32953) улк уян

.Т..........- .Т. N. Е

.А.----------.Т.С.Е

.УС----------.Т.Е. .

.УС----------.Т.Е. .

.05----------ТТ.О. .

.ОАНСТМ-----кТР.Е. .

• ОАНеТМ-----БТЯ.Е. .

• ОАИСТМ-----РТЯ.Е. .

.МАИ(-ТН-----АТЯ.Е. .

.ОАНиТМ-----РТР.Е.Е

.ОАНкви-----РТР.Е. .

^АНиТЫ-----РТР.Е.Е

.ОАНкТК-----АТР.Е. .

.МАН1.М-----\ТР. Е . .

•ОАЭТАРС----------N

.ОАН к5АС0---ТНУ.О.N .ОА^КРУМС-^НУ.Е.. ,ОА>^РАТС--инУ.Е. . . МА^ЬГГГРАМСиУУ. Е. .

у1 о) у1 (5373) УЗ (1)1) ух (6044) У1 (II) у! (5638) ур; урэ уб уяк

уаь (xvi) у1 (xiii) у1 (n^3/84) ук

ум (xv) У1 (601) ур (xi) умб уйн

ур (ix) ур (176-36) уаи (xvii) ум (xviii) ук (6572)

и

Ь5

уао уе 4 уе 5

У1 (N,1 6) у1 (атсс29909) уак (xvii) ув уе 3

ур (176-36) ук (6572) ум (xviii) уа1 (xvi) ур (xi) умв

у1 (xiii) У1 (601) ук

ум (xv) у1*н ух о)

ух («о

ур

ур5 (урш) урб

ур (ix)

333333333333333 333333333444444 123456789012345 01ыйтстттаысе0н

.МТ-----ООМ.

. оаа-----.ом.

00 да-----.ом.

.ам.------ом<5

.оат-----.ом.

.ЫЫТ-----ОБМ.

. мат-----оом.

т.д.-.к......

. . а.-.n......

. л. -.и......

ОУУН-----УМ.

ОУУИ-----YNN.

. -а№-----

.МТ-----DDN.

,nn7-----

^АТ-----DDN.

.NN7-----00^

,-Ш-----оам.

.-ОУ-----DAN.

.-т'-----DAN.

р . ат- -с . р1б. (3

. МАТ-----ОО/Ч.

-----ddn.

уао уди

ув (н632-36/85) ув (атсс 34970) уе

ур (ix)

ур (x) ,176-36)

УМ5

у1 9

у1 (i 7)

У1 (I 8)

у1 (ii)

У1 (III)

у1 (6044)

у1 (xiii)

ук (6572)

УК

ум

УР

УРЭ (УРШ)

урэ

укк

уйн

уэ

33333333333333333 77777778888888888 34567890123456789 LLDEDTFTRANSLNTDD ..0.э...с.м. ..д...о.к.м к.а. .е.^л

.n0.....с. .

.n0...м.с.. .....ск-й..

.ук.б.

..т.е.. . .э.м.м . .о.к

.м.м .Т.к. .о.к

.м...м.ы.м

к.и..ev.rim кмо. .v. .<31. . .м.....м.м

уао

уа1 (xvii) yal (xvi) ув

2222222233 9999999900 2345678901 С-ОА5Т51АЫ

-...ыт. . . -...от.. . -...от.. .

-.,.ЕТ... ---ТОб...

---0[Х5. . .

— -N00. . .

---N00...

---ЕО.V..

---00.V..

---N0.V..

---ЕО.У..

---00.V..

---N0.V..

---ЕО.V..

---00.V.. -.к^Т. . . -.Р.МТ... -БР.ОТ... -ЭР.ОТ... -РУОРТ... -ТЛ^Л". . . -ДУРЯТ... МКРООТ...

Ь6

Рис. 10. Множественное выравнивание АП наружных петель ОшрР порина иерсиний

I - 108-С, 1215, 1234, 6579, 2720/87, 2974/81, 1245; 2 - 221, wa220, \va221, \va229, \уар; 3 - 221, т220, wa22I wa229, wap, 8081; 4 - 6579, 108-С, 2720/87, 2974/81; 5 - 1215, 1234, 1245; 6 - Н357/85, 6325, 6276; 7 - №27/84 5986, 5593, 6390; 8 - Н357/85. 29909. 6325, 6276; 9 - Н9-36/83, №9/83; 10 - №27/84. 5593, 6390, 29909. № 13/84

II - Н357/85, 6325, 6276.

уе

уе 5

ур (56-36/81) ур (xi)

ур (4648,4849) ур (176-36) умб ух 9

vi (5986) у1 10

У1 (и)

у1 (5375,1948) У1 (110 У1 (601) у1 (6044) у1 11 у1 (5631) : ук (6572) ! ук ум (xv) ум (xv»0 i ур; урэ (урш)

урэ i уте у ян

Ь7

Наиболее консервативной и функционально значимой является петля L3. Интересно, что в высоко консервативном у энтеробактерий пентапептиде PEFGG для всех иерсиний характерна замена заряженной глутаминовой кислоты на неполярный валин, что может влиять на специфичность и проводимость канала. Одними из наиболее дивергентных петель являются петли L4 и L5 (23 и 27 вариантов соответственно), для которых обнаружены продолжительные делеции и/или инсерции. Для петли L4, в зависимости от длины, были выделены две группы: группа коротких петель (8-12 а.к.), наиболее широко представленная по видам, и группа длинных петель (20-28 а.к.). Петли L6 и L7 умеренно представлены среди всего рода. Так для петли L6 найдено 19 аллельных вариантов, а для петли L7 - 16. Оба участка также содержат делеции и/или инсерции. Интересно, что для петли L6 характерны три длины полиморфного участка. Наибольшее количество вариантов последовательностей (28 аллелей) обнаружено для петли L8, которая остаётся одинаковой по длине у всех иерсиний.

Таким образом, АП наружных петель OmpF поринов иерсиний характеризуются высокой внутри- и межвидовой гетерогенностью, свидетельствуя о высокой скорости эволюции в этих участках и о функциональной значимости в адаптации иерсиний к разнообразным условиям внешней среды.

2.3. Разработка и апробация многопраймерной ПЦРдля идентификации бактерий рода Yersinia н дифференциации патогенных видов

Разработка мПЦР. Дополнительно к исследованным НП ompF генов иерсиний были добавлены НП поринов различных видов энтеробактерий из базы данных GeneBank. НП выравнивали в программе ClustalW2 и отбирали только те, гомология которых составляла не менее 60% с установленными нами ранее НП ompF генов иерсиний. При дальнейшем анализе были определены участки ompF гена для составления родо- и видоспецифических олигонуклеотидных праймеров. В результате были сконструированы шесть праймеров: два родоспецифических и четыре видоспецифических, олигонуклеотидные последовательности которых представлены в таблице 3, а локализация на рисунке 11.

Таблица 3. Нуклеотидные последовательности праймеров, размер специфических ампликонов и выявляемые микроорганизмы.

Праймер Последовательность 5'-3' Размер ампликона Специфичность

227Fmod 669R GTCTGGGCTTTGCTGGTC GCGTCGTATTTCGCACCAACG 428-465 н.п. Yersinia sp.

YP2R CTTGTTAGCGATAGTATCAGAGAAG 510 н.п. Y. pestis

YPS2R ACGTCGTCTGTCATGATTCG 756 н.п. Y. pseudotuberculosis

YER CGTTTGCAACAGCGCTGCGAT 270 н.п. Y. enterocolitica

YE2R ATCTTGGTTATCGCCATTCG 663 н.п. Y. enterocolitica subsp. palearctica

yal

YBER

yen1

YEN2

YEN3

yfr .

yin

ykr

ymol

ypes

ypsl

YPS2

yps3

ysim

ECOL

se rm

AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKOGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK AEIYNKDGNK

ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar ldlygkvdar vdlygkavjb ;vd§@

ldlygkvt

81 > F227mod tRlgfaglkJf aefgsfdygr

trlgfaglkf aefgs|dygr trlgfaglkf AEFGSFDYGR trlgfaglkf AEFGsjfDYGR trlgfaglkf AEFGSFDYGR .trlgfaglkf AEFGSFDYGR trlgfaglkf dqfgsjdygr trlgfaglkf AEFGSFDYGR trlgfaglkf AEFGSFDYGR trlgfaglkf AEFGSFDYGR trlgfaglkf AEFGSFDYGR trlgfaglkf AEFGSFDYGR trlgfaglkf AEFGSFDYGR trlgfaglkf AEFGSFDYGR TRLAFAGLKY АЛ/GSFDYGR TRLGFAGLKF AÍYGSFDY6R

WTDMLP.VFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG WTDMLPVFGG YTDMLPf WTDMLPIFGG

dsisnsdnfm dsisnsdnym oglsnsdnym dsisnsdnym dsisnsdnym dsisnsdnym dsisnsdnym dsisnsdnym dsisnsdnfm dsisnsdnfm dsisnsdnfm dsisnsonfm dsisnsdnfm dsisnsdnfm ddff dnfm

IFGG DÍ-A|S[ FGG DfYTfn

tgr5tglaty tgrstglaty tgrstglaty tgrstglaty tgrstglaty tgrstglaty tgrstglaty tgrstglaty tgrstglaty agrstglaty tgrstglaty tgrstglaty tgrstglaty tgrstglaty vgrvgglaty tgrtnglaty

rntnffglvd rntnffglvd rntnffglvd rntnffglvd rntnffglvd rntnffglvd rntnffglvd rnqnffglvd rntnffglvd rnf

rn|

rnsnffglvd rnfnffglvd

160

glnfalqyqg glnfalqyqg glnfalqyqg glnfalqyqg glnfalqyqg glnfalqycjg glnfalqyqg glnfalqyqg glnfalqyqg

glnfaLqyqg glnfaLqyqg

glnfalqyqg glnfalqyqg glnfalqyqg glnfavqylg glnfalqyqg

-ag|kei ngdgfgisst ~\kdq ngdgfgisst kdq ngdgfgisst kdq ngdgfgisst kdq ngdgfgisst го ngdgfgisst kdq ngogfgisst ngdgfglsst ngdgfgïsst

ngdgFgïi—

ngdgfgij ngdgfgk ngogfgli ngdgfgíl ngdgvggsis ----------------^kq ngdgwgïsst

YDIGYGyfFG l YDIGYGVNFG / YDIGYGVNFG / YDIGYGVNFG i YDIGYGVNFG i YDIGYGVNFG i YDIGYGVHFG / YDIGYGVfiFG / YDIGYGVfFG ,

240

_ _. ;gdk

eqk|fst--------apgBk

Îkafst--------aegdk

kffst--------aegdk

kvfst--------aegdk

кц«щр 1—t\eg»c

dfrst--------aqgnk

KMAHLTNA saegdk KOAHLNPA tcuwaegdk

dqkygst--------aegdk

dqkygst--------aegdk

dqkygst--------aegdk

dqkygst--------aegdk

dqkygst--------aegdk

§5ef5p|--------gngkk

dqklrsn---—---ergdk

ÇJO--------------j|IA

gdahd------------tia

gdasn------------tia

gdaid------------tia

gdasd------------tia

gdd--------------SVA

gdase------------tia

YE2R

IONHDLLKY VSVGTYYlFN ""•IHDLJJCY VSVGTYYfFN """.LKY VSVGgYYYFN

lky vsvgBvyVfn

_ i-KY VSVGfYYYFN

îDNHDLLKY VSVGTYYYFN JE§HDLLKY VSVGTYYfFN 'DNHDLLKY VSVGfYYVFN ¡DNHDLLKY VSVGTYYfFN "IHDLLKY VSVGTYYYFN HDLLKY VSVGFYYYFN HDLlKY VSVGTYYYFN iHDL«Y VSVGTYYYFN VDDNHDLKY VSVGTYYYFN -IG^DL»Y FEVGAlYYFN fe>L§CY VSVGT|YYFN

RANGLfTDDV VGVGLVYQF fANGLLTDDV VGVGLVYQF RANGLNTDDV VGVGLVYQF RANGLNTDDV VGVGLVYQF RNNGLNTDDV VGVGLVYQF RANSLNTDDV VGVGLVYQF RANGLNTDDV VGVGLVYQF RANGLNTDfV VpVGMVYQF "\NGLjTDDV VGVGLVYQF

tddv

nklgvgsddt katgtatddi

Рис. 11. Множественное выравнивание АП OmpF поринов и локализация праймеров для мПЦР. YAL - Y. aleksiciae Y159; YBER - Y. bercovieri ATCC43970; YEN1 - Y. enterocolitica 108-C; YEN2 - 8081 ; YEN3 - 1215; YFR - Y. frederiksenii ATCC 33641 ; YIN - Y. intermedia ATCC 29909; YKR - Y. kristensenii ATCC 33638; YMOL - Y. mollaretii ATCC 43969; YPES - Y. pestis C092; YPSl -Y. pseadotuberculosis YPÏII; YPS2 - IP31758; YPS3 - IP32953; YROH - Y. rohdei ATCC 43380; YSIM -Y. similis Y239; ECOL - E. coli К14, SERM -S. marsecens.

Оптимизация, определение чувствительности и специфичности мПЦР. Возможность использования разработанных праймеров была определена при проведении ПЦР с геномными ДНК. выделенными из чистых культур референтных штаммов иерсиний (У. pestis EV, У. pseudotuberculosis 1Р31758, У. enterocolitica subsp. enterocolitica 8081, У. enterocolitica subsp. polearctica 6579, У. intermedia 5373, У. frederiksenii 4849 и У. kristensenii 6572). В результате амплификации при стандартных условиях для всех пар праймеров были получены одиночные, специфичные фрагменты, соответствующие по длине теоретически рассчитанным (табл. 3). В многопраймерном варианте при тех же условиях результаты реакции не были удовлетворительными, так как в некоторых образцах либо отсутствовали специфические, либо появлялись неспецифические ПЦР-фрагменты. Для оптимизации условий многопраймерной ПЦР были проведены эксперименты в соответствии с алгоритмом, предложенным Henegariu et al. (1997). Так, было установлено, что изменение концентрации праймеров от 0,15 до 0,9 мкМ и температуры их отжига от 54 до 64°С не оказывает влияния на специфичность и выход конечных продуктов мПЦР. При варьировании концентрациями компонентов буферного раствора: MgCl2 (1.5; 2,0; 2,5; 3,0 мМ). Tween-20 (0,01-0,15%), Triton Х-100 (0.01-0,15%); а также рН буферного раствора (8; 8,6; 8,9), были выбраны оптимальные условия для данной системы (3 мМ MgCU. 65 мМ КС1. 0,05% Tween-20. рН 8,9) (рис. 12).

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 12. Результаты амплификации мПЦР после оптимизации. 1 - Y. enterocolitica 6579; 2- Y. pseudotuberculosis IP31758; 3 - Y. pestis EV; 4 - ДНК маркер 100 н.п.; 5 - Y. kristensenii 6572; 6 - К intermedia 5373; 1-Y. frederiksenii 4849; 8 - Escherichia coli.

Для определения чувствительности мПЦР была проведена серия экспериментов с разведениями ДНК референтных штаммов. Концентрацию ДНК переводили в копии геномов из расчёта 1 геном = 5 х 10~15 г. Было обнаружено, что У. pestis детектируется в реакции с чувствительностью от 100 копий геномов, У. pseudotuberculosis, У. enterocolitica и Yersinia sp. - от 10 копий геномов.

При создании амплификационных тест-систем для диагностических целей определяющее значение имеет специфичность реакции. Оценка специфичности мПЦР была проведена на чистых препаратах ДНК иерсиний и различных близкородственных микроорганизмов. В результате специфические продукты амплификации были выявлены при анализе одного штамма У. pestis, трёх штаммов У. enterocolitica, трёх штаммов У. pseudotuberculosis, двух штаммов У. frederiksenii, двух штаммов К kristensenii и одного штамма У. intermedia (рис. 13А, Б. В), что составило 100% от общего числа положительных образцов. При тестировании ДНК из 10 штаммов бактерий сем. Enterobacteriaceae каких-либо продуктов амплификации замечено не было (рис. 1ЗГ).

Рис. 13. Результаты специфичности мПЦР. А: У. pseudotuberculosis I - 3260; 2 - Н4901; 3 - маркер 100 н.п.; 4 - Н3747; Б; 1 - У. pestis EV; 2 - У. kristensenii 6572; 3 - У. intermedia 5373; 4 - маркер 100 н.п.; 5 - У. frederiksenii 4849; В; У. enterocolitica 1 - 1234; 2 - 108-С; 3 - маркер 100 н.п.; 4 - 6579; Г: 1 - Serratia odorífera 2389; 2 - Citrobacter freimdii 143A; 3 - Klebsiella pneumoniae 2478; 4 - K. pneumoniae 2297; 5 - E. coli 2265; 6 - маркер 100 н.п.; 1-Е. coli 2270; 8 - Pantoea agglomerans 143; 9 - P. agglomerans 143B; 10 - Enterobacter cloacae 2406; 11 - Kluyvera cryocrescem 27.

Апробация мПЦР. Диагностическая информативность разработанной мПЦР была установлена при анализе экспериментального клинического материала и образцов из окружающей среды. Была исследована кровь от четырех больных детей с диагнозом иерсиниоз. В качестве референтного метода была использована тест-система «АмплиСенс Y. enterocolitica» (Россия). На рисунке 14 представлен результат исследования образцов клинического материала. С помощью тест-системы «АмплиСенс Y. enterocolitica» были выявлены ДНК Y. enterocolitica во 2-м и 4-м образцах. В тоже время с помощью мПЦР были выявлены ДНК Y. enterocolitica subsp. palearctica в тех же самых образцах, а также ДНК Y. pseudotuberculosis в 1 -м образце и ДНК Yersinia sp. в 3-м образце. Таким образом показана принципиальная возможность использования мПЦР тест-системы в клинической практике.

Рис. 14. Тест-система «АмплиСенс У. enterocolitica» и мПЦР на клинических образцах. А: тест-система «АмплиСенс У. enterocolitica» 1 - маркер 100 н.п.; 2-«+» контроль У. enterocolitica; 3 - образец №1; 4 -образец №2; 5 - образец №3; 6 - образец №4; Б: мПЦР 1, 9 - маркеры 100 н.п.; 2 - «+» контроль У. pseudotuberculosis', 3 - «+» контроль У. enterocolitica; 4 - образец №1; 5 -образец №2; 6 - образец №3; 7 - образец №4; 8 -«+» контроль Yersinia sp.

Кроме того, была исследована возможность использования мПЦР на 53 образцах, представляющих собой смывы с различных объектов окружающей среды. Были выбраны следующие группы объектов: почва (13 образцов), вода (8 образцов), овощи (5 образцов), водоросли (13 образцов), морские организмы (14 образцов). Из литературных данных известно, что выделение образцов ДНК из объектов окружающей среды сопряжено с серьезными трудностями. Особенно это касается проб почвы (присутствие ингибиторов) и воды (фактор разбавления) (Dragon et ai, 1993; Elnifro et al., 2000). Поэтому ДНК из образцов выделяли двумя разными методами: фенол-хлороформная депротеинизация и адсорбция на Si02. В результате анализа образцов было выявлено, что оптимальным методом выделения ДНК для мПЦР является адсорбция на SiOi. Полученные результаты дают представление о распространенности бактерий рода Yersinia, а также патогенных для человека видов У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis среди исследованных образцов. Так, иерсинии отсутствовали в пяти смывах с водорослей, а в остальных были найдены ДНК Yersinia sp. Непатогенные иерсинии были обнаружены в следующих образцах: 9 образцов почвы, 5 образцов воды, 10 образцов из морских организмов, 2 смыва с овощей и 6 смывов с морских водорослей. Генетический материал Y. enterocolitica обнаружен в 4-х образцах почвы, 1-м образце водопроводной воды, 2-х образцах из морских организмов, 1-м образце из водорослей и 3-х смывах с овощей. ДНК Y. pseudotuberculosis обнаружена в 2-х образцах водопроводной воды и 2-х смывах с морских организмов. Y. pestis не обнаружена ни в одном из образцов.

Таким образом, разработанная мПЦР позволяет идентифицировать бактерии рода Yersinia с дифференциацией патогенных для человека видов У. pestis, Y. enterocolitica, У. pseudotuberculosis. С помощью этой системы можно детектировать бактерии с высокой чувствительностью - от 10 до 100 копий геномов. Показана принципиальная возможность обнаружения иерсиний в пробах крови и образцах, выделенных из окружающей среды. Следует отметить, что на сегодняшний день нет ни одного экспресс-метода, который бы выявлял непатогенные виды иерсиний в биологическом материале больного. Обнаружение генетического материала непатогенных видов иерсиний в биологических образцах больного человека будет свидетельствовать о том, что клинические проявления инфекционного заболевания вызваны непатогенным видом иерсиний. Возможно, результаты, полученные с помощью данной системы, позволят пересмотреть искусственное разнесение иерсиний на патогенные и непатогенные для человека виды и перевести некоторые непатогенные виды в разряд условно-патогенных. Данная мПЦР может быть использована также и для выявления У. pestis, которая является агентом биотерроризма №1. Систему можно рекомендовать для использования как на первых этапах экспресс диагностики У. pestis, так и для выявления возбудителя при контаминации объектов окружающей среды. Применение данного анализа в службах санэпиднадзора, при проверке пищевых продуктов, например, свинины, молока, овощей и фруктов (именно эти продукты служат источниками загрязнений бактериями У. enterocolitica и У. pseudotuberculosis'), может явиться существенным дополнением к классическим методам идентификации иерсиний.

выводы

1. Установлены нуклеотидные последовательности ompF, gyrB и 16S рДНК генов 14 видов бактерий рода Yersinia (69 штаммов). Впервые получены НП для Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. similis, Y. rohdei, Y. frederiksenii (геномовид la), Y. mollarelii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. ruckeri и Y. massiliensis. Выявлены филогенетические связи между отдельными видами иерсиний на основании 16S рДНК-gyrS и ompF генов. Для ряда видов (У. aleksiciae, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. intermedia) выявлена повышенная дивергенция с образованием генетически отдалённых групп.

2. Выявлена разная скорость эволюции участков ompF генов иерсиний, внутривидовая дивергенция различается у разных видов не только по степени гетерогенности, но и по локализации гетерогенных участков в гене. Установлены участки и кодоны, подверженные действию адаптивной эволюции.

3. Впервые на основе ompF гена в роду Yersinia обнаружена как внутривидовая (Y. intermedia), так и межвидовая (Y. aleksiciae и Y. mollaretii) внутригепная рекомбинация.

4. Определен индекс адаптации кодонов для ompF генов иерсиний (СА1=0,702-0,793), значения которого выше СА1 высоко экспрессируемых генов «домашнего хозяйства», что свидетельствует о высоком уровне экспрессии исследованного гена.

5. Обнаружено, что АК состав OmpF поринов практически одинаков у разных видов иерсиний. Установлено, что предполагаемые участки антигенных детерминант локализованы в районах наружных петель поринов. Установлен выраженный внутривидовой и межвидовой полиморфизм наружных петель (по длине, аминокислотному составу, встречаемости вариантов АП).

6. Методами сравнительного моделирования установлена высокая консервативность третичной структуры (мономера) OmpF поринов внутри рода иерсиний. Отклонения величин RMSD для Са-атомов поринов составили не более 1,4 А.

7. Разработана многопраймерная ПЦР, позволяющая идентифицировать бактерии рода Yersinia с дифференциацией патогенных для человека видов Y. pestis, Y. enterocolitica, У. pseudotuberculosis. Система позволяет детектировать иерсинии с высокой чувствительностью от 10-100 копий геномов. Показана принципиальная возможность обнаружения иерсиний в пробах крови и образцах, выделенных из окружающей среды.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Стенкова A.M., Гузев К.В., Исаева М.П. Клонирование кодирующей последовательности ompF подобного гена Yersinia enterocolitica // VII Дальневосточная молодёжная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологи. Владивосток. 2003. С. 54.

2. Исаева М.П., Лейченко Е.В., Хорошко В.И., Стародумова С.М., Гладких И.В., Стенкова A.M., Гузев К.В., Кривоногое В.В., Рассказов В.А. Разработка диагностических тест-систем на основе полимеразной цепной реакции для комплексной диагностики условно-патогенных бактерий - возбудителей

имплантант-ассоциированных и госпитальных инфекций // И региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». Владивосток. 2006. С. 109-110.

3. Стенкова A.M., Исаева М.П., Гузев К.В., Новикова О.Д., Шубин Ф.Н., Рассказов В.А. Двухраундовая ПЦР для дифференциальной диагностики Yersinia enierocolitica IIII научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные Иерсиниями». Санкт-Петербург. 2006. С.

4. Isaeva М.Р., Stenkova A.M., Shubin F.N., Rasskazov V.A. Development of a multiplex PCR for detection of Yersinia Genus with identification of pathogenic species // IX International Symposium on Yersinia. Lexington, USA. 2006. P. 86.

5. Стенкова A.M., Исаева М.П., Белякова Е.П., Рассказов B.A. Оптимизация многопраймерной ПЦР для детекции бактерий рода Yersinia и идентификации патогенных видов Y. pestis, Y. enierocolitica, Y. pseudotuberculosis // II Региональная научная конференция «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». Владивосток. 2006. С. 96.

6. Stenkova A.M., Isaeva М.Р., Rasskazov V.A. Development of a multiplex PCR procedure for detection of Yersinia Genus with identification of pathogenic species (K pestis, Y. pseudotuberculosis, and К enierocolitica) II Mol. Genetics, Microbiology and Virology. 2008. V. 23. P. 119-125.

7. Stenkova A.M., Isaeva M.P., Belaykova E.P., Guzev K.V., Shubin F.N., Rasskazov V.A. ompF gene, as putative phylogenetic marker of Yersinia species // Is1 Far-Eastern International Symposium on Life Science. Vladivostok. 2008. P. 73.

8. Isaeva M.P., Stenkova A.M., Belyakova E.P., Gusev K.V., Shubin F.N., Rakin A.V., Rasskazov V.A. Molecular organization and genetic polymorphism of non-specific porin genes of Yersinia pseudotuberculosis // 1-st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences. Vladivostok. Russia. 2008. P. 32.

9. Стенкова A.M. Молекулярные и экологические аспекты формирования гетерогенной структуры OmpF поринов непатогенных иерсиний // Вестник

10. Исаева М.П., Стенкова A.M. Набор родо- и видоспецифических олигонуклеотидных праймеров для детекции и видовой идентификации иерсиний методом мультиплексной полимеразной цепной реакции // Патент РФ №2354700. БИ. №13. 10.05.2009.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю к.м.н. Исаевой М.П. за помощь и поддержку при выполнении и оформлении данной работы. Автор глубоко признателен м.н.с. Гузеву К.В., к.х.н. Лихацкой Г.Н., к.ф-м.н. Зелепуге Е.А. и Беляковой Е.П. за оказанную помощь в выполнении отдельных этапов работы, д.б.н. Ракину A.B. и д.б.н. Шубину Ф.Н. за предоставленные бактериальные штаммы и ценные советы. Автор выражает свою искреннюю благодарность заведующему лабораторией к.б.н. В.А. Рассказову, д.х.н. Новиковой О.Д. и д.х.н. Монастырной М.М. за ценные замечания и рекомендации при оформлении данной работы.

125-127.

ДВО РАН. 2009. Т.6. С. 124-130

Соискатель:

Стенкова A.M.

Стенкова Анна Кйаайловна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА OMPF ПОРИНОВ БАКТЕРИЙ РОДА YERSINIA И РАЗРАБОТКА ПЦР ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ

АВТОРЕФЕРАТ

Тираж 100 экз. Отпечатано 21 ноября 2009 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Стенкова, Анна Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЕРСИНИЙ.

2.1.1. Классификаг\ия и таксономия.

2.1.2. Генетическое родство.

2.1.3. Эколого-эпиделшологические особенности иерсиний.

2.2. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ И ДИАГНОСТИКА ИЕРСИНИОЗОВ.

2.2.1. Клиническая значимость иерсиний.

2.2.2. Методы идентификации иерсиний.

2.3. ГЛАВНЫЕ ПОРИНЫ ГРAM-ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ.

2.3.1. Строение главных поринов.

2.3.2. Первичная и вторичная структуры OmpF-подобных поринов.

2.4. ФИЛОГЕНИЯ И ЭВОЛЮЦИЯ БЕЛКОВ

НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ БАКТЕРИЙ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И

ЭВОЛЮЦИЯ OMPF ГЕНОВ ИЕРСИНИЙ.

4.1.1. Секвенирование и филогенетический анализ 16SрДНК и gyrB генов иерсиний.

4.1.2. Секвенирование и филогенетический анализ ompFгенов иерсиний.

4.1.3. Молекулярная эволюция ompF гена иерсиний.

4.2. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ И СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ

ВАРИАНТОВ OMPF ПОРИНОВ ИЕРСИНИЙ.

4.2.1. Анализ первичной структуры OmpF поринов иерсиний.

4.2.2. Анализ петельных участков OmpF поринов иерсиний.*.

4.2.3. Построение теоретических моделей структурных вариантов OmpF поринов иерсиний.

4.3. РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ МНОГОПРАЙМЕРНОЙ ПЦР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА YERSINIA И

ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ.

4.3.1. Разработка мПЦР.

4.3.2. Оптимизация, определение чувствительности и специфичности тест-системы.

4.3.3. Апробация мПЦР.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая характеристика OMPF поринов бактерий рода YERSINIA и разработка ПЦР тест-системы для идентификации патогенных видов"

В настоящее время род Yersinia, относящийся к семейству Enterobacteriaceae, включает 14 видов бактерий: Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y enterocolitica, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. massiliensis, Y. mollaretii. Y. pestis, Y pseudotuberculosis, Y. rohdei, Y. ruckeri и Y. similis (Merhej et al, 2008; Sprague and Neubauer, 2005; Sprague et al, 2008). Медицинское значение однозначно установлено только для трех видов: Y. pestis -возбудитель чумы, Y. pseudotuberculosis - возбудитель псевдотуберкулеза и Y. enterocolitica - возбудитель кишечного иерсиниоза (Bottone, 1999). Недавние, иопуляционно-генетические исследования показали, что Y. pestis эволюционировала от Y. pseudotuberculosis всего 1500-20000 лет назад (Achtman et al., 1999). Однако экология и эпидемиология Y. pestis сильно отличаются от таковых у Y. pseudotubercidosis. Клиническое значение других видов остается до сих пор неясным и мало освещенным (Sulakvelidze, 2000). В литературе имеются отдельные сообщения о выделении непатогенных иерсиний из клинического материала (Loftus et al., 2002). Показано, что непатогенные иерсинии могут обладать некоторыми факторами патогенности, например, продуцировать энтеротоксины, вызывающие симптомы пищевого отравления (Noble et al., 1987; Смирнов, 2004). Повсеместная распространённость, психротолерантность, варьирующая вирулентность и широкий спектр хозяев создают предпосылки для использования рода Yersinia в качестве модельного рода для генетических и эволюционных исследований патогенеза и экологии бактерий.

Хотя работы по ДНК-ДНК гибридизации и сравнительному анализу генов «домашнего хозяйства», показали значительную гетерогенность некоторых видов и послужили основой для характеристики недавно описанных новых видов (У. similis, Y. aleksiciae, Y. massiliensis), современная идентификация иерсиний по-прежнему основана на описании фенотипических и биохимических характеристик. В связи с этим, для уточнения таксономии и прояснения филогении и эволюции рода Yersinia необходимо изучение молекулярной эволюции разных генов. На основе этих данных возможна разработка методов быстрой и точной видовой идентификации этих бактерии.

Несмотря на последние достижения в области патобиологии патогенных иерсиний, механизмы их адаптации к различным хозяевам и различным условиям окружающей среды ещё недостаточно изучены. Мембранные, поверхностные молекулы, в этом контексте, представляют особый интерес, так как первыми реагируют на изменения условий окружающей среды и участвуют в процессах взаимодействия патогенного микроорганизма и хозяина. Одними из таких молекул являются неспецифические порины - доминирующие белки наружной мембраны (НМ) бактерий, которые обладают уникальными структурными свойствами и функционируют как поры, регулируя проницаемость мембраны (Buchanan, 1999; Cowan et al., 1992; Jeanteur et al., 1991). Типичная пориновая субъединица состоит из 16 антипараллельных (3-тяжей, которые формируют р-бочонок с короткими переплазматическими петлями в нижней его части и длинными наружными петлями в верхней (Buchanan, 1999; Stathopoulos, 1999; Weiss et al., 1991). Три субъединицы порина образуют стабильный гомотример, который устойчив к действию детергентов и протеаз - ключевое свойство необходимое кишечным бактериям для выживания в агрессивной среде пищеварительного тракта. Как превалирующие белки НМ бактерий, некоторые порины участвуют в бактериальном патогенезе, например, адгезии и инвазии (Su et al., 1990; van Putten et al., 1998). Способность поринов создавать протективный иммунитет против бактериальных инфекций была использована для разработки некоторых вакцинных препаратов (Singh et al., 1999; Zhang et al., 1997). Для-шести видов иерсиний (К pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. frederiksenii. Y. intermedia и Y. kristensenii) были выделены и охарактеризованы OmpF- и OmpC-подобные порины (Вострикова et al, 2006). Так же для патогенных видов {Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica) были охарактеризованы первичная аминокислотная последовательность, вторичная структура- и топология OmpF порина (Гузев et al., 2005). Но эти исследования были выполнены на маленьком количестве штаммов и ограниченном числе видов, что не даёт полного понимания степени разнообразия- OmpF поринов, и их роли в широких адаптивных возможностях представителей рода Yersinia.

Целью данной работы было изучение полиморфизма и эволюции ompF гена и OmpF белка в пределах рода Yersinia и разработка многопраймерной ПЦР тест-системы для идентификации иерсиний и дифференциации патогенных видов.

В соответствии с заявленной целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Генотипирование исследуемых штаммов иерсиний на основе секвенирования генов «домашнего хозяйства» - 16S рДНК и gyrB.

2. Определение нуклеотидных последовательностей, филогенетический и эволюционный анализ ompF генов 14 видов иерсиний.

3. Сравнительный анализ и компьютерное моделирование структурных вариантов OmpF поринов иерсиний.

4. Разработка и апробация многопраймерной ПЦР тест-системы для идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Стенкова, Анна Михайловна

выводы

1. Установлены нуклеотидные последовательности ompF, gyrB и 16S рДНК генов 14 видов бактерий рода Yersinia (69 штаммов). Впервые получены НП для Y. aldovae, Y. aleksiciae, Y. bercovieri, Y. similis, Y. rohdei, Y. frederiksenii (геномовид la), Y. mollaretii. Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. ruckeri и Y. massiliensis. Выявлены филогенетические связи между отдельными видами иерсиний на основании 16S рДНК-^уг-В и ompF генов. Для ряда видов (Y. aleksiciae, Y. mollaretii, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. intermedia) выявлена повышенная дивергенция с образованием генетически отдалённых групп.

2. Выявлена разная скорость эволюции участков ompF генов иерсиний, внутривидовая дивергенция различается у разных видов не только по степени гетерогенности, но и по локализации гетерогенных участков в гене. Установлены участки и кодоны, подверженные действию адаптивной эволюции.

3. Впервые на основе ompF гена в роду Yersinia обнаружена как внутривидовая (Г. intermedia), так и межвидовая (Y. aleksiciae и Y. mollaretii) внутригенная рекомбинация.

4. Определен индекс адаптации кодонов для ompF генов иерсиний (СА1=0,702-0,793), значения которого выше CAI высоко экспрессируемых генов «домашнего хозяйства», что свидетельствует о высоком уровне экспрессии исследованного гена.

5. Обнаружено, что АК состав OmpF поринов практически одинаков у разных видов иерсиний. Установлено, что предполагаемые участки антигенных детерминант локализованы в районах наружных петель поринов. Установлен выраженный внутривидовой и межвидовой полиморфизм наружных петель (по длине, аминокислотному составу, встречаемости вариантов АП).

6. Методами сравнительного моделирования установлена высокая консервативность третичной структуры (мономера) OmpF поринов внутри рода иерсиний. Отклонения величин RMSD для Са-атомов поринов составили не более 1,4 А.

7. Разработана многопраймерная ПЦР, позволяющая идентифицировать бактерии рода Yersinia с дифференциацией патогенных для человека видов Y. pestis, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis. Система позволяет детектировать иерсинии с высокой чувствительностью от 10-100 копий геномов. Показана принципиальная возможность обнаружения иерсиний в пробах крови и образцах, выделенных из окружающей среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стенкова, Анна Михайловна, Владивосток

1. Ценева Г.Я. Иерсинии и иерсиниозы. СПб., 2006. 168с.

2. Микробиол. и Антимикроб. Химиотер. 2004. Т. 6. № 1. С. 10-21. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулёз.- Москва: Медицина, 2001. 256 с.

3. Старостина Н.А. Эпидемиологические и экологические особенности заболеваний вызываемых Yersinia frederiksenii, Yersinia kristensenii, Yersinia intermedia.- Москва, 2000. Автореф. дис. кандидата мед. наук. С. 12.

4. Сунцов В.В., Сунцова Н.И. Чума. Происхождение и эволюция эпизоотической системы (экологические, географические и социальные аспекты). Москва: КМК, 2006. 247 с.

5. Ющенко Г.В. Экологические аспекты эпидемиологии иерсиниоза ипсевдотуберкулеза. Москва, 1989. Автореф. дис. доктора мед. наук. С. 43. Achouak W., Heulin Т., Pages J-M. Multiple facets of bacterial porins // FEMS

6. Baldo L., Bordenstein S., Wernegreen J.J., Werren J.H. Widespread recombination throughout Wolbachia genomes // Mol. Biol. Evol. 2006. V. 23. P. 437-449.

7. Basle A., Rummel G., Storici P., Rosenbusch J.P., Schirmer T. Crystal structure of osmoporin OmpC from E. coli at 2.0 A // J. Mol. Biol. 2006. V. 362. P. 933-942.

8. Bennett J.S., Callaghan M.J., Derrick J.P., Maiden M.C.J. Variation in the Neisseria lactamica porin, and its relationship to meningococcal PorB // Microbiology. 2008. V. 154. P. 1525-1534.

9. Berman H.N., Westbrook K.J., Feng Z., Gilliland G.L., Bhat T.N., Weissing H., Shindyalov I.J., Bourne P.E. The protein data bank // J. Nucleic Acids Research. 2000. V. 28. P. 235-242.

10. Bissett M., Powers C., Abbot S.L., Janda M. Epidemiologic investigations of Yersinia enterocolitica and related species: sources frequency serogroup distribution // J. Clin. Microbiol. 1990. V.28. P. 910-912.

11. Biswas S., Mohammad M.M., Movileanu L., van der Berg B. Crystal structure of the outer membrane protein OpdK from Pseudomonas aeruginosa II Structure. 2008. V. 16. P. 1027-1035.

12. Biswas S., Mohammad M.M., Patel D.R., Movileanu L., van der Berg B. Structural insight into OprD substrate specificity // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V. 14. P. 1108-1109.

13. Bodilis J., Hedde M., Orange N., Barray S. OprF polymorphism as a marker of ccological niche in Pseudomonas II Environ. Microbiol. 2006. V. 8. P. 1544-1551.

14. Bottone E.J. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates // Microbes Infect. 1999. V. l.P. 323-333.

15. Breed H.J., Saxena K„ Richter O.M.H., Ludwig В., Diederichs K., Welte W. The structure of porin from Paracoccus denitrificans at 3.1 A resolution // FEBS Lett. 1997. V. 404. P. 208-210.

16. Brosig A., Nesper J., Boos W., Welte W., Dicderichs K. Crystal structure of major outer membrane protein from Thermus thermophilics HB27 // J. Mol. Biol. 2009. V. 6. P. 1445-1455.

17. Buchanan S.K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding// Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. V. 9. P.455-461.

18. Buchrieser С., Weagant S.D., Kaspar C.W. Molecular characterization of Yersinia enterocolitica by pulsed field gel electrophoresis and hybridization of DNA fragments to ail and pYP probes // Appl. Environ. Microbiol. 1994. V. 12. P. 43714379.

19. Charbit A., Gehring K., Nikaido H., Ferenci Т., Hofnung M. Maltose transport and starch binding in phage-resistant point mutants of maltoporin. Functional and topological implications //J. Mol. Biol. 1988. V. 201. P. 487-496.

20. Chen- R., Kramer C., Schmidmayr W., Chen-Schmeisser U., Henning U. Primary structure of major outer-membrane protein I (ompF protein, porin) of Escherichia* coli B/r // Biochem. J. 1982. V. 203. P. 33-43.

21. Chimento D.P., Mohanty A.K., Kadner R.J., Wiener M.C. Substrate-induced transmembrane signaling in the cobalamin transporter BtuB // Nature Struct. Biol. 2003. V. 10. P. 394-401.

22. Clement J.M., Hofnung M. Gene sequence of the X receptor, an outer-membrane protein of E. coli K-12 // Cell. 1981. V. 27. P. 507-514.

23. Clement J.M., Lepouce E., Marchal C., Hofnung M. Genetic study of a membrane protein: DNA sequence alterations due to 17 lamB point mutations affecting adsorption of phage lambda // EMBO J. 1983. V. 2. P: 77-80.

24. Cowan S.W., Schirmer Т., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structures explain functional properties, of two E., coli porins // Nature. 1992. V. 358. P: 727-733.

25. Delcour A.H. Function and modulation of bacterial porins: insight from electrophysiology. //FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 151. N. 2. P. 115-125.

26. Demarta A., De Respinis S., Dolina M., Peduzzi R. Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of 16S rDNA and gyrB genes sequence analyses // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V. 238. P. 423-428.

27. Derrick J.P., Urwin R,, Suker J., Feavers I.M., Maiden M.C.J. Structural and evolutionary inference from molecular variation in Nesseria porins // Infect. Immun. 1999. V. 67. P. 2406-2413.

28. Dolina M., Gaia V., Peduzzi R. Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of ribotyping and DNA-DNA hybridization // Contrib. Microbiol. Immunol. 1995. V. 13. P. 140-144.

29. Dolina M., Peduzzi R. Population genetics of human, animal, environmental Yersinia strains // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 2. P. 442-450.

30. Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. Quality control of polymerase chain reaction // Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications / M. McDonough. Washington: ASM Press. 1993. P. 160-168.

31. Drouin G., Prat F., Ell M., Clarke G.D.P. Detecting and characterizing gene conversions between multigene family members // Mol. Biol. Evol. 1999. V. 16. P. 1369-1390.

32. Duchene M., Schweizer A., Lottspeich F., Krauss G., Marget M., Volgel K., van Specht B.U., Domdey H. Sequence and transcriptional start site of the Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin protein F gene // J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 155-162.

33. Dutzler R., Rummel G., Alberti S., Hernandez-Alles S., Phale P.S., Rosenbusch J.P. Benedi V.J., Schirmer T. Crystal structure and functional characterization of OmpK36, the osmoporin of Klebsiella pneumoniae II Structure. 1999. V. 7. P. 425434.

34. Elnifro E., Ashshi A., Cooper R., Klapper P. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology // Clin. Microbiol. Rev. 2000. V. 13. P. 559-570.

35. Ewing W.H., Ross A.J., Brenner. D.J., Fanning G.R. Yersinia ruckeri sp. nov., the redmouth (RM) bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1978. V. 28. P. 37-44.

36. Feavers I.M., Heath A.B., Bygraves J.A., Maiden M.C. Role of horizontal genetic exchange in the antigenic variation of the class 1 outer membrane protein of Nesseria meningitidis II Mol. Microbiol. 1992. V. 6. P. 489-495.

37. Feil E.J., Spratt B.G. Recombination and the population structures of bacterial pathogens

38. Annu. Rev. Microbiol. 2001. V. 55. P. 561-590. Feng P., Identification of invasive Yersinia species using oligonucleotide probes // Mol.

39. Cell. Probes. 1992. V. 6. P. 291-297. Ferguson A.D., Chakraborty R., Smith B.S., Esser L., van der Helm D., Deisenhofer J. Structural basis of gating by the outer membrane transporter FecA // Science. 2002. V. 295. P. 1715-1719.

40. Ferguson A.D., Hofmann E., Coulton J.W., Diederichs K., Welte W. Siderophoremediated iron transport: crystal structure of FhuA with bound lipopolysaccharide //

41. Science. 1998. V. 282. P. 2215-2220.

42. Forst D., Welte W., Wacker Т., Diederichs K. Structure of the sucrose-specific porin

43. ScrY from Salmonella typhimurium and its complex with sucrose // Nature Struct.

44. Biol. 1998. V. 5. P. 37-46.

45. Fourel D., Mizushima S., Bernadac A., Pages J.-M. Specific regions of Escherichia coli

46. OmpF protein involved in antigenic and colicin receptor sites and in stabletrimerization//J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 2754-2757.

47. Grant Т., Bennett-Wood V., Robins-Browne R.M. Identification of virulence-associated characteristics in clinical isolates of Yersinia enterocolitica lacking classical virulence markers // Infect. Immun. 1998. V. 66. N. 3. P. 1113-1120.

48. Hancock R.E.W. Role of porins in outer membrane permeability // J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 929-933.

49. Hong H., Patel D.R., Tamm L.K., van den Berg B. The outer membrane protein OmpW forms an eight-stranded beta-barrel with a hydrophobic channel // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 7568-7577.

50. Hughes D. Co-evolution of the tuf genes links gene conversion with the generation of chromosomal inversions // J. Mol. Biol. 2000. V. 297. P. 355-364.

51. Hughes A.L., Nei M. Pattern of nucleotide substitution at major histocompatibility complex class I loci reveals overdominant selection // Nature. 1988. V. 335. P. 167170.

52. Jap B.K., Wallia P.J., Gehring K. Structural architecture of an outer membrane channel as determined by electron crystallography. // Nature. 1991. V. 350. N. 6314. P. 167-170

53. Jeanteur D., Lakey J.H., Pattus F. The bacterial porin superfamily: sequence alignment and structure prediction // Mol. Microbiol. 1991. V. 5. P. 2153-2164.

54. Ketchem R.R., Hu W., Cross T.A. High-resolution conformation of gramicidin A in a lipid bilayer by solid-state NMR//Science 1993. V. 261. P. 1457-1460.

55. Kotetishvili M., Kreger A., Wauters G., Morris J.G., Sulakvelidze A., Stine O.C. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species I I J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. P. 2674-2684.

56. Koornliof H.J., Smego R.A., Nicol M.Jr. Yersiniosis II: the pathogenesis of Yersinia infections // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1999. V. 18. P. 87-112.

57. Koronakis V., Scharff A., Koronakis E., Luisi В., Hughes C. Crystal structure of the bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux and protein export // Nature. 2000. V. 405. P. 914-919.

58. Mann В .J., Wood S.J. Detection of Yersinia using the polymerase chain reaction // United States Patent 5654144. 1997.http://www.freepatentsonline.com/5654144.html

59. Massingham Т., Goldman N. Detecting amino acid sites under positive selection and purifying selection // Genetics. 2005. V. 169. P. 1853-1762.

60. Martin D.P., Williamson C., Posada D. RDP2: recombination detection and analysis from sequence alignments // Bioinformatics. 2005. V. 21. P. 260-262.

61. Maynard S.J., Dowson C.G., Spratt B.G. Localized sex in bacteria // Nature. 1991. V. 349. P. 29-31.

62. Merhej V., Adekambi Т., Pagnier I., Raoult D., and Drancourt M. Yersinia massiliensis sp. nov., isolated from fresh water // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. Vol. 58. P. 779-784.

63. Meyer J.E.W., Hofnung M., Schulz G.E. Structure of maltoporin from Salmonella typhimurium ligated with a nitrophenyl-maltotrioside // J. Mol. Biol. 1997. V. 266. P. 761-775.

64. Moraes T.F., Bains M., Hancock R.E., Strynadka N.C. An arginine ladder in OprP mediates phosphate-specific transfer across the outer membrane // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. V. 14. P. 85-87.

65. Nei M. Molecular evolutionary genetics // Columbia University Press. New York. 1987. P. 73-76.

66. Neubauer H., Stojanka A., Andreas H., Ernst-J.urgen F., Hermann M. Yersinia enterocolitica 16S rDNA gene types belong to the same genospecies but form three homology groups // Int. J. Med. Microbiol. 2000. V. 290. P. 61-64.

67. Nielsen R., Yang Z. Likelihood models for detecting positive selected amino acid sites and applications to the HIV-l envelope gene // Genetics. V. 148. P. 929-936.

68. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited //

69. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. P. 593-656. Nilelin B. Studies on Yersinia enterocolitica with special reference to bacterial diagnosis and occurrence in human acute enteric disease // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1969. V. 206. P. 1.

70. Prince S.M., Achtman M., Derrick J.P. Crystal structure of the OpcA integral membrane adhesion from Neisseria meningitides II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. P. 3417-3421.

71. Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual / J. Sambrook, D. Rusell. -N.Y.: Cold Spring Harbor. 2001. P. 657.

72. Santoyo G., Romero D. Gene conversion and concerted evolution in bacterial genomes // FEMS Microbiol. Rev. 2005. V. 29. P. 169-183.

73. Schiltz E., Kreusch A., Nestel U., Schulz G.E. Primary structure of porin from Rhodobacter capsulatus II Eur. J. Biochem. 1991. V. 199. P. 587-594.

74. Schiltz G.E., Schirmer R.H. Principles of protein structure. New York: Springer, 1979. C. 106.

75. Schirmer Т., Keller T.A., Wang Y.F., Rosenbusch J.P. Structural basis for sugar translocation through maltoporin channels at 3.1 a resolution // Science. 1995. V. 267. P. 512-514.

76. Silverman J.A., Benson S.A. Bacteriophage K20 requires both the OmpF porin and lipopolysaccharide for receptor function // J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 4830-4833.

77. Singh M.s Vohra H., Kumar L., Ganguly N.K. Induction of systemic and mucosal immune response in mice immunized with porins of Salmonella typhi //J. Med. Microbiol. 1999. V. 48. P. 79-88.

78. Sharp P., Li W. The codon adaptation index a measure of directional synonymous codon usage bias, and its potential applications //Nucleic. Acids. Res. 1983. V. 15. P.1281-1295.

79. Slightom J.L., Blechl A.E., Smithies O. Human fetal G gamma- and A gamma-globin genes: complete nucleotide sequences suggest that DNA can be exchanged between these duplicated genes // Cell. 1980. V. 21. P. 627-638.

80. Smith J.M. Analyzing the mosaic structure of genes // J. Mol. Evol. 1992. V. 34. P. 126129:

81. Smith- J.E., Thai E.A. A taxonomic; study of the genus Pasteurella using a numerical technique // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1965. V. 64. P. 213.

82. Smith N.H., Smith J.M., Spratt B.G. Sequence evolution of the porB gene of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis: evidence of positive Darwinian selection //Mol. Biol. Evol. 1995. V. 12. P. 363-370.

83. Snijder H.J., Ubarretxena-Belandia I., Blaauw M., Kalk K.II., Verhij H.M., Egmond M.R., Dekker N., Dijkstra B.W. Structural evidence for dimerization-regulated activation of an integral membrane phospholipase // Nature. 1999. V. 401. P. 717721.

84. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux J.E. Structure of staphylococcal a-hemolysin, a heptameric transmembrane pore // Science. 1996. V. 274. P. 1859-1865.

85. Sprague L.D., and Neubauer H. Yersinia aleksicieae sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. Vol. 55. P. 831-835.

86. Sprague L.D., Scholz H.C. Amann S., Busse H.J. and Neubauer H. Yersinia similis sp. nov. II Int. .T. Syst. Evol. Microbiol. 2008. Vol. 58. P. 952-958.

87. Stathopoulos C. Bacterial outer membrane proteins: topological analyses and biotechnological perspectives // Membr. Cell Biol. V. 13. P. 3-21.

88. Sulakvelidze A. Yersinia other than Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, and Y. pestis: the ignored species // Microbes Infect. 2000. Vol. 2. P. 497-513.

89. Sussman J.L., Abola E.E., Lin D., Jiang J., Manning N.O., Prilusky J. The protein data bank//J. Genetica. 1999. V. 106. P. 149-158.

90. Su H., Watkins N.G., Zhang Y.X., Caldwell H.D. Chlamydia trachomatis-host cell interactions: role of the chlamydial major outer membrane protein as an adhesin // Infect. Immun. 1990. V. 58. P. 1017-1025.

91. Taguchi Y., Tsuyoshi K., Shiroishi Т., Yagi T. Molecular evolution of Cadherin-related neuronal receptor/protocadherin a (CNR/Pcdh a) gene cluster in Mus musculus subspecies // Mol. Biol. Evol. 2005. V. 22. P. 1433-1443.

92. Traurig M., Misra R. Identification of bacteriophage K20 binding regions of OmpF and lipopolysaccharide in Escherichia coli K-12 // FEMS Microbiol. Lett. 1999. V. 181. P. 101-108.

93. Trebesius K., Harmsen D., Rakin A., Schmelz J., Heesemann J1. Development of rRNA-targeted PCR and in situ hybridization with'fluorescently labeled oligonucleotides for detection of Yersinia species // J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. C. 2557-2564.

94. Vandeputte-Rutten L., Bos M.P., Nommassen J., Gros P. Crystal structure of neisserial surface protein A (NspA), a conserved outer membrane protein with vaccine potential // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 24825-24830.

95. Vandeputte-Rutten L., Kramer R.A., Kroon J., Dekker N., Egmond M.R., Gros P. Crystal structure of the outer membrane protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site // EMBO J. 2001. V. 20. P. 5033-5039.

96. Vogt J., Schulz G.E. The structure of the outer membrane protein OmpX from Escherichia coli reveals possible mechanisms of virulence // Structure. 1999. V. 7. P. 1301-1309.

97. Wang J., Cieplak P., Kollman P.A. How well does a restrained electrostatic potential (RESP) model perform in calculating conformational energies of organic and biological molecules // J. Comput. Chem. 2001. V. 21. P. 1049-1074.

98. Wauters G., Kandolo K., Janssens M. Revised biogrouping scheme of Yersinia enterocolitica 11 Contrib. Microbiol. Immunol. 1987. V. 9. P. 14-21.

99. Weiss M.S., Abele U., Weckesser J., Welte W., Schiltz E., Schulz G.E. Molecular architecture and electrostatic properties of a bacterial porin // Science 1991. V. 254. P. 1627-1630.

100. Weiss M.S., Schulz G.E. Structure of porin refined at 1.8 a resolution // J. Mol. Biol. 1992. V. 227. P. 493-509.

101. Worobey M. A novel approach to detecting and measuring recombination: new insight into evolution in viruses, bacteria, and mitochondria // Mol. Biol. Evol. 2001. V. 18. P. 1425-1434.

102. Wylie J.L., Worobec E.A. Cloning and nucleotide sequence of the Pseudomonas aeruginosa glucose-selective OprB porin gene and distribution of OprB within the family Pseudomonadaceae II Eur. J. Biochem. 1994. V. 220. P. 505-512.

103. Yang Z., Bielawski J.P. Statistical methods for detecting molecular adaptation // Trends. Ecol. Evol. 2000. V. 15. P. 496-503.

104. Yildiz O., Vinothkumar K.R., Goswami P., Kuhlbrandt W. Structure of the monomeric outer-membrane porin OmpG in the open and closed conformation // EMBO J. 2006. V. 25. P. 3702-3713.

105. Zeth K., Diederichs K. Welte W., Engelhardt H. Crystal structures of Omp32, the anion-selective porin from Comamonas acidovorans, in complex with a periplasmic peptide at 2.1 A resolution // Structure. 2000. V. 8. P. 981-992.

106. Zhang D., Yang X., Berry J., Shen C.5 McClarty G., Brunham R.C. DNA vaccination with the major outer-membrane protein gene induces acquired immunity to Chlamydia trachomatis (mouse pneumonitis) infection // J. Infect. Dis. 1997. V. 176. P. 1035-1040.

107. Zhang J., Rosenberg H.F., Nei M. Positive Darwinian selection after gene duplication in primate ribonuclease genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V.95. P. 37083713.

108. Zhang J.R., Norris S.J. Genetic variation of the Borrelia burgdorferi gene vlsE involves cassette-specific segmental gene conversion // Infect. Immun. 1998. V. 66. P. 36983704.

109. Zhang Q.Y., DeRyckere D., Lauer P., Koomcy M. Gene conversion in Nesseria gonorrhoeae: evidence for its role in pilus antigenic variation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 5366-5370.