Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Уральском федеральном округе Российской Федерации

Умпелева, Татьяна Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Уральском федеральном округе Российской Федерации
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Уральском федеральном округе Российской Федерации"

На правах рукописи

УМПЕЛЕВА Татьяна Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫЗГТУБЕРКУЛЕЗОМ В УРАЛЬСКОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.02.03 — Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 г МАЙ 2014

005548416

Екатеринбург» - 2014

005548416

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» и в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Нарвская Ольга Викторовна доктор медицинских наук, профессор Скорняков Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России Шурыгин Александр Анатольевич

доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Немцева Наталия Вячеславовна

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Южно-Уральский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

Защита состоится "27" июня 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 280 92 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (Мтк/Аумау. iegm.ru).

Автореферат разослан "_"_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Туберкулез остается актуальной проблемой российского здравоохранения. Согласно официальным данным в Уральском федеральном округе (ФО) в 2012 г. показатель заболеваемости туберкулезом на 27,2% превысил средний по России (68,1 на 100 тыс. населения). Растет число инфицированных штаммами Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (20,8% в 2012 г. против 16,1% в 2009 г.), обладающих резистентностью, по меньшей мере, к двум наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам (ПТП) — изониазиду и рифампицину (Скорняков С.Н., 2013).

Микробиологический мониторинг возбудителя туберкулеза в современных условиях основан на анализе специфических нуклеотидных последовательностей хромосомной ДНК М. tuberculosis с использованием сполиготипирования, MIRU-VNTR- и IS61 /O-RFLP-типирования и других методов исследования геномного полиморфизма микобактерий (van Embden J. et al., 1993; Kamerbeek J. et al., 1997; Supply P. et al., 2006).

Соотношение генотипов в популяциях М. tuberculosis может существенно различаться в разных странах и географических регионах мира (Kremer К. et al., 2005; Iwamoto Т. et al., 2007; Comas I., et al, 2009; Mokrousov I. et al„ 2008). При этом следует учитывать, что, вследствие недостаточной проработки критериев принадлежности к генетическому семейству (линии), классификация изолятов М. tuberculosis на основе сопоставления их профилей сполиготипирования и MIRU-VNTR-типирования с имеющимися в компьютерных базах данных1 условна.

1 SITVITWEB (http.7/www.pasteur-guadeloupe.fr:8081 /STTV1T ONLINE/) и MIRU-VNTR/j/itv (http://vvww.miru-vntrplus.or|2)

Степень разработанности темы исследования

В настоящее время генетически неоднородная российская популяция возбудителя туберкулеза насчитывает около 200 сполиготипов, представляющих более 20 генетических семейств/линий, среди которых доминирует эпидемиологически и клинически значимый генотип Beijing (Нарвская О.В., 2003; Мокроусов И.В. и др., 2012). Однако сведения о структуре субпопуляций возбудителя туберкулеза на территориях России неполны. В научной литературе имеются единичные публикации, посвященные генотипической характеристике возбудителя туберкулеза в Уральском ФО. Так, в 2001 —2002 гг. проведено исследование 98 уральских изолятов М. tuberculosis с использованием MIRU-VNTR-типирования (12 локусов MJRU) и показано доминирование изолятов, отнесенных к генетическому семейству W-Beijing (54,3%) (Kovalev S. et al., 2005). В этой работе у 15,2% изолятов впервые был идентифицирован новый генотип, получивший наименование URAL.

Цель исследования - изучить региональные особенности генетической структуры популяции М. tuberculosis в современных условиях и разработать схему генотипирования возбудителя туберкулеза в Уральском ФО РФ.

Задачи исследования:

1. Провести генотипирование клинических изолятов М. tuberculosis, полученных в Уральском ФО РФ, с использованием ПЦР-тест-системы «Амплитуб-Beijing» и методов MIRU-VNTR-, IS6770-RFLP и сполиготипирования.

2. Определить лекарственную чувствительность и мутации, обусловливающие устойчивость возбудителя туберкулеза к рифампицину и изониазиду, у М. tuberculosis различных генотипов.

3. Оценить распространенность и эпидемиологическую значимость М. tuberculosis различных генотипов в исследуемых когортах больных.

4. Разработать оптимальную схему генотипирования клинических изолятов М. tuberculosis с учетом особенностей современной структуры популяции возбудителя туберкулеза в Уральском ФО РФ.

Научная новизна работы

Впервые, с использованием стандартизированных молекулярно-генетических методов (MIRU-VNTR-типирования, сполиготипирования, RFLP-IS6/70-THnHpoBaHHfl) и ПЦР-тест-систем «Амшплуб-Beijing» и «ТБ-Биочип (MDR)», получена комплексная генотипическая характеристика клинических изолятов М. tuberculosis в Уральском ФО РФ.

Установлено, что среди клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Уральском ФО РФ доминируют представители генотипа Beijing, обладающие МЛУ за счет мутаций Ser531—>Leu и Ser315—»Thrl в генах гроВ и katG, соответственно.

Впервые с помощью сполиготипирования проведен анализ структуры DR области хромосомы 80 уральских изолятов М. tuberculosis группы non-Beijing и установлена принадлежность 74 из них к 37 сполиготипам 15 генетических семейств, представленных в международной компьютерной базе данных SITVITWEB; описано 6 ранее не известных сполиготипов.

Теоритическая и практическая значимость работы

Полученные экспериментальные данные расширяют информацию о генетической структуре популяции возбудителя туберкулеза на территории Урала.

В лаборатории экспериментальных и диагностических методов исследования Федерального государственного бюджетного учреждения «Уральский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России) создана и поддерживается коллекция, включающая на начало 2013 года 823 клинических изолята и образцы ДНК М. tuberculosis 714 больных туберкулезом в Уральском ФО РФ.

Сполигопрофили и MIRU-VNTR профили 83 изолятов М. tuberculosis включены в международную, постоянно обновляемую компьютерную базу данных SITVITWEB и SITVIT 2 (Institut Pasteur de la Guadeloupe).

Разработана научно обоснованная схема генотипирования возбудителя туберкулеза в Уральском ФО РФ, согласно которой на первом этапе осуществляется дифференциация М. tuberculosis на группы Beijmg/non-Beijing и определение мутаций устойчивости к основным Ulli с использованием ДНК, выделенной из клинического материала; последующее MIRU-VNTR-типирование изолятов М. tuberculosis генотипа Beijing проводится с использованием 9 локусов, изолятов других генотипов (non-Beijing) - 15 локусов и сполиготипирования.

С использованием предложенной схемы в ФГБУ «УНИИФ» проводится эпидемиологический анализ путей распространения туберкулеза, выделяются группы риска больных по развитию лекарственно-устойчивого заболевания, а также оценивается эффективность противоэпидемических мер, проводимых в очагах инфекции и на территории стационара ФГБУ «УНИИФ».

Материалы исследования используются в учебном процессе в ФГБУ «УНИИФ» и на кафедре фтизиатрии и пульмонологии Уральского государственного медицинского университета.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Популяция М. tuberculosis в Уральском ФО РФ генетически неоднородна и представлена штаммами глобально распространенных генетических групп/семейств, среди которых доминирует Beijing.

2. Штаммы М. tuberculosis генотипа Beijing играют ключевую роль в распространении возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью в Уральском ФО РФ.

3. Устойчивость изолятов М. tuberculosis Beijing к рифампицину и изониазиду ассоциирована с сочетанием замен r/wßSer531—>Leu и toGSer315—>Thrl. В группе non-Beijing выявлена ассоциация МЛУ, обусловленная сочетанием замен rpoßAsp516—«-Val, forfGSer315—>Thrl и inhA_T\5, с принадлежностью изолятов ксполиготипу81Т252 семействаLAM.

4. Разработанная схема генотипирования клинических изолятов М. tuberculosis эффективна для проведения микробиологического мониторинга возбудителя туберкулеза на территории Уральского ФО РФ.

Апробация работы и публикации

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных конференциях: 18-20 октября 2012 г., г. Санкт-Петербург: 1-й Конгресс Национальной Ассоциации фтизиатров «Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации»; 17-22 марта 2013 г., г. Берлин: Седьмой симпозиум имени Р. Коха и И.И. Мечникова; 23-25 апреля 2013 г., г. Екатеринбург: региональная научно-практическая конференция с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений»; 24 сентября 2013 г., г. Екатеринбург: научная сессия с международным участием «Фундаментальные исследования - практической фтизиатрии».

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации

Основной текст диссертации изложен на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав собственных исследований, заключения, приложений. Диссертация иллюстрирована 24 таблицами и 12 рисунками. Список литературы содержит 186 источников, в том числе 43 - отечественных и 141 - зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора

Работа выполнена по плану НИР «Лечебно-диагностические и организационные технологии повышения медико-социальной эффективности специализированной и высокотехнологичной медицинской помощи больным туберкулезом основных локализаций» № гос. регистрации 01200953414 ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России.

Основные результаты получены лично автором. Выделение ДНК из клинического материала, постановка качественной ПЦР проведены совместно с сотрудниками лаборатории ГБУЗ СО «ПТД». Сполиготипирование, IS6110-RFLP-типирование и компьютерная обработка данных проведены совместно с А.А. Вязовой и Д.А. Старковой (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург). Присвоение обозначений SIT/MIT профилям генотипирования изолятов и определение их принадлежности к генетическим линям согласно SITVITWEB и SITVIT2 проведено Nalin Rastogi и David Couvin в институте Пастера Гваделупы (Institut Pasteur de la Guadeloupe).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Изучено 178 клинических изолятов М. tuberculosis, полученных от впервые выявленных больных туберкулезом в 2009-2011 г.г.: 63 - в лаборатории микробиологии ГБУЗ СО «ПТД» и 115 - в лаборатории экспериментальных и диагностических методов исследования ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России; 78 изолятов, полученных от ранее леченных больных туберкулезом в 20092011 г.г. в лаборатории экспериментальных и диагностических методов исследования ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России; 90 образцов ДНК, выделенных из клинического материала в лаборатории микробиологии ГБУЗ СО «ПТД» в 2012 г.

Культивирование М. tuberculosis осуществляли общепринятым методом на среде Левенштейна-Йенсена, чувствительность микробных культур к ПТП определяли непрямым методом абсолютных концентраций (Приказ Минздрава РФ №109 от 21.03.2003). Колонии М. tuberculosis суспендировали в растворе, содержащем 9% NaCl и 20% глицерина. Часть суспензии сохраняли в пробирках для последующего генотипирования, другие инкубировали при 95 °С 30 мин для лизирования клеток, затем осаждали при 3000 g, 1 мин. Супернатант использовали в качестве препарата ДНК для постановки ПЦР.

Для дифференциации изолятов на группы Beijing и non-Beijing методом ПЦР использовали ПЦР-тест-систему «Амплитуб-Beijing», ООО «Синтол», г. Москва. ПЦР выполняли в режиме реального времени на приборе iCiclerQ5 (BioRad, США). Определение мутаций в генах rpoB, katG и inhA, обусловливающих устойчивость к рифампицину и изониазиду, проводили с использованием тест-системы «ТБ-Биочип (MDR)», ООО «Биочип-ИМБ», г. Москва.

Генотипирование изолятов М. tuberculosis проводили методом MIRU-VNTR, используя 15 локусов: Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, QUBI lb, ETRA, Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156 (Supply P. et al., 2006) и дополнительно три гипервариабельных локуса VNTR4120, VNTR3820, VNTR3232 (Iwamoto Т. et al., 2007) для изолятов генотипа Beijing. Для постановки ПЦР использовали реактивы ООО «Интерлабсервис», г. Москва и праймеры (Supply Р. et al., 2006; Iwamoto et al., 2007), ООО «Синтол», г. Москва. ПЦР осуществляли в термоциклере «Терцик», ООО «ДНК технология». Продукт ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, результаты визуализировали с помощью системы документации гелей «GelDoc», BioRad, США.

Сполиготипирование (Kamerbeek et al., 1997) и ISá/ /O-RFLP-типирование (van Embden J et al., 1993) проводили на базе лаборатории молекулярной микробиологии ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург. Принадлежность к генетической группе/линии (lineage, clade) определяли путем сравнения полученных профилей изолятов с имеющимися в компьютерных базах данных: «MLRU-VNTRp/z¿s» URL: http://wvw.miru-vntrplus.org, в международной базе данных SITVITWEB URL: http://\vww.pasteiir-guadeloupe.fr:8081/SITVIT ONLINE/ и ее обновленной версии SITVIT2, включавшей на момент сравнения около 40 тысяч профилей сполиготипирования. Профили IS6770-RFLP сравнивали с представленными в базе данных ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, г. Санкт-Петербург. Для количественной оценки вариабельности генетических

локусов и дискриминирующей способности схем генотипирования рассчитывали индекс разнообразия Хантера-Гастона (Hunter Gaston Diversity Index, HGDI) согласно ITRIJ:http://w\vw.hpa-bioinformatics.org.uk/cgi-bin/DICI/DICT.pl.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного пакета Statistica 10 (Statsoft Inc.). Связи между группами анализировали с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (х2) с поправкой Йетса; статистически значимьши считали различия при р <0.05. Полученные данные представлены в виде таблиц и диаграмм.

Результаты исследования и их обсуждение

Генотипическая характеристика пзолятов М. tuberculosis, полученных от больных туберкулезом в Уральском федеральном округе

Российской Федерации

С помощью ПЦР-тест-системы «Амплитуб-Beijing» определена принадлежность 178 культур М. tuberculosis, выделенных от вновь выявленных больных туберкулезом, к генетическим группам Beijing и non-Beijing, включавшим 98 (55,1%) и 75 изолятов, соответственно. Таким образом, доля штаммов Beijing, доминирующих в популяции М. tuberculosis Уральского региона, остается практически неизменной (54,3% в 2001 -2002 гг.) на протяжении 10 лет (срок наблюдения) (Kovalev S. et al., 2005). В пяти случаях результаты ПЦР были неоднозначны, однако последующее MIRU-VNTR-типирование по 15 локусам позволило отнести все пять изолятов к группе non-Beijing, которая включала 80 (44,9%) изолятов.

Анализ результатов MIRU-VNTR-типирования (15 локусов) 178 изолятов М. tuberculosis выявил 107 типов (MIT) MIRU-VNTR-профилей, причем 43 (40,2%) из них - у изолятов группы Beijing. MIRU-VNTR-профили (п=64) 80 изолятов группы non-Beijing представляли пять генетических групп: LAM (12,9%), URAL (11,8%), Haarlem (7,9%), Tur, S (Таблица 1).

Поскольку база данных «МIRU-VNTRp/ws» не является обновляемой и содержит информацию о MIRU-VNTR профилях только 186 изолятов, определить принадлежность к генетической линии 20 изолятов non-Beijing не удалось (Unknown). Для более полной характеристики вариабельности этой группы изолятов необходимо было дополнительно использовать другой метод генотипирования - сполиготипирование.

Анализ структуры DR-области хромосомы всех изолятов non-Beijing методом сполиготипирования позволил выделить 43 сполиготипа (SIT), представленных 1-9 изолятами. Шесть изолятов имели сполигопрофили (orphan), которые не представлены в базе данных SITVITWEB. Как видно из таблицы 1, большинство неклассифицированных согласно MIRU-VNTR/?/;« изолятов (Unknown) по результатам сполиготипирования были отнесены к генетическим семействам (линиям) Т, которые доминируют в популяциях М. tuberculosis стран Западной Европы и ряда территорий европейской части России (Dubiley S. et al., 2010, Demay С. et al., 2012). Относительно небольшую долю каждого из этих глобально распространенных генотипов в структуре популяции возбудителя туберкулеза на Урале можно объяснить его относительной удаленностью от европейской части континента.

Среди полиморфной группы изолятов URAL(H3) преобладали представители сполиготипов SIT262 (42,9%) и SIT35 (33,3%) (Таблица 1). Одним из критериев принадлежности изолятов к генотипу URAL (третий по частоте встречаемости в изученной популяции М. tuberculosis) до недавнего времени считали наличие не менее шести повторов в локусе MIRU10 (Kovalev S. et al., 2005). В настоящем исследовании были выявлены изоляты, содержащие пять повторов в данном локусе. Недавно описано присутствие трех и четырех повторов в локусе MIRU10 у штаммов, циркулирующих на территории Сибири (Огарков О. Б. и др., 2008) и в Киргизии (Mokrousov I. et al., 2008). Таким образом, существенный полиморфизм данного локуса не позволяет использовать его в качестве маркера принадлежности изолята к генотипу URAL.

Таблица 1. Генотипы клинических изолятов non-Beijing

Генетическая группа согласно MIRU-VNTRplus, число изолятов (%) MIRU-VNTR-тип (МГГ) согласно SITVITWEB Генетическое семейство (линия) согласно SITVITWEB Сполиготип (SIT) согласно SITVITWEB

LAM 23 (12,9%) 248 (3) 140 (3) 245 (2) 247 orphan (14) Т5 RUS (7) 254 (6), 496

LAM9 (7) 252 (4), 42 (2) 150

LAM5 (2) 1337

LAM4 60

T1 (3) 264, 2540, 53

T4 40

Unknown 560

S orphan

URAL 21 (11,8%) 244 (2) 253 (2) 250 249 (2) 251 (2) 252 (2) orphan(10) H3 (20) 262 (9), 35 (7), 762, 3781, orphan (2)

H4 SIT291

Unknown 20(11,2%) 316 255 247 (2) 256 (4) 257 (2) orphan (10) Tl(8) 53 (2), 732, 1580, 156 (3), 1597

T1 RUS2 (2) 280, orphan

T4 40

T 73

T5 44

Unknown (2) 3152

T2(4) 2252(3), orphan

H3 50

Haarlem 14 (7,9%) 246 (2) orphan (12) H1(3) 531 (2), 47

XI (3) 708 (2), orphan

H3 294

Unknown (7) 46(3), 237,3169, 56, 65

SI (0,56%) orphan S 1253

Tur 1 (0,56%) orphan Unknown 560

В скобках указано число изолятов, превышающее 1.

Из 80 изолятов группы non-Beijing лишь 28 (35%) формировали 12 кластеров MIRU-VNTR.

Анализ профилей MIRU-VNTR-типирования (15 локусов) изолятов группы Beijing подтвердил их принадлежность к данному генотипу, причем 65 (66,3%) из 98 изолятов входили в состав 10 кластеров. Самый многочисленный из кластеров - Bj23 (числовой профиль 442333564475372) включал 32 (32,7%) изолята Beijing, которые отличало наличие 7 повторов в локусах MIRU26 и QUB26 (Рисунок 1).

4423í3464d=55S: 10 141; АО 10 14 13 5 1214

Д4:гзз5б4455зб:

Рисунок 1 - Минимальное охватывающее древо (Minimum spanning tree) профилей MIRU-VNTR (15 локусов) 65 клинических изолятов М. tuberculosis Beijing вновь выявленных больных туберкулезом.

Размеры узлов пропорциональны числу изолятов в составе MIRU-VNTR-кластера. Числовой профиль (число повторов в каждом из 15 локусов - Mtub04, ETRC, MIRU04, MIRU40, MIRU10, M1RU16, Mtub21, QUB1 lb, ETRA, Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB4156) показан в 1-й строке у каждого узла; ниже построчно приведены числовые профили для трех

гипервариабельных локусов (VNTR4120, VNTR3820, VNTR3232) и профили IS6770-RFLP, обозначены жирным шрифтом. Цифры в скобках обозначают число изолятов, превьппающее 1.

Полученные данные свидетельствуют об активной диссеминации штаммов М. tuberculosis генотипа Beijing на территории Уральского региона.

Дискриминирующая способность (HGDI) 15 «классических» локусов (Supply Р., 2006) для типирования изолятов данного семейства составила 0,885. Самые большие значения HGDI (0,651 и 0,603) имели локусы MIRU26 и QUB26 соответственно. Локусы MRU31, Mtub21, QUBllb, MIRU40 имели невысокую степень полиморфизма, значения HGDI: 0,243, 0,190, 0,173 и 0,155 соответственно. Для остальных локусов HGDI не превышал 0,100.

Использование трех дополнительных гипервариабельных локусов (Ivvamoto Т. et al., 2007) у 52 из 65 изолятов позволило разбить 7 из 10 МПШ-VNTR-кластеров Beijing и существенно повысило дискриминирующую способность 15-локусного MIRU-VNTR-типирования (HGDI=0,944). Например, в пределах кластера Bj23 было выделено несколько субкластеров с разным количеством повторов в гипервариабельных локусах (Рисунок 1).

\S6110-RFLP-типирование 45 изолятов М. tuberculosis Beijing углубило дифференциацию в пределах MIRU-VNTR-кластеров: выявлено 17 близкородственных (коэффициент сходства 83%) типов IS5770-RFLP-профилей, которые различались как по количеству (15-19), так и по молекулярной массе фрагментов рестрикции хромосомной ДНК, содержащих участок последовательности инсерционного элемента IS6110. Пятнадцать (88%) из 17 вариантов профилей рестрикции IS6110 были индивидуальны (т.е. обнаружены у одного изолята), остальные представляли два крупных кластера: АО и ВО, включавших 5 и 25 изолятов с идентичными профилями рестрикции, соответственно. Ранее было описано доминирование генотипов АО и B0(W148) в популяции М. tuberculosis Beijing на территории России (Нарвская О.В., 2003, Мокроусов И.В., 2008). Особый интерес представлял самый многочисленный

(55,6%) IS61 /O-RFLP-кластер ВО, поскольку, показано, что штаммы данного генотипа отличает повышенная вирулентность, которая проявляется высокой способностью к распространению (трансмиссивность), в т.ч. в стационарах, ассоциацией с МЛУ и тяжелым течением туберкулеза (Нарвская О.В., 2003; Kurepina N. et al., 2001; Bifani J. et al., 2002; Kubica T. et al., 2004).

Генотипирование 78 изолятов ранее леченных больных, было проведено с помощью ПЦР-тест-системы «Амплитуб-Beijing» и последующего MIRU-VNTR-типирования с использованием 6 наиболее дискриминирующих (MIRU26, QUB26, Mtub21, Qubllb, MIRU31, MIRU40) из 15 локусов для изолятов генотипа Beijing и 15 локусов (Supply Р. et al, 2006) - для группы non-Beijing. Установлено доминирование изолятов возбудителя генотипа Beijing, доля которых (80,8%) существенно превышала таковую (55,1%) в группе вновь выявленных больных (р=0,0002).

Отношение к противотуберкулезным препаратам клинических изолятов М. tuberculosis

Ассоциация между МЛУ, определенной культуральным методом, и принадлежностью к генотипу Beijing выявлена у клинических изолятов М. tuberculosis вновь выявленных и ранее леченных больных (Таблица 2).

Таблица 2. Отношение к противотуберкулезным препаратам клинических изолятов М. tuberculosis вновь выявленных (1) и ранее леченных больных (2) генотипов Beijing и non-Beijing.

Генотип М. tuberculosis Число изолятов (%)

группа 1 группа 2

ЛЧ МЛУ Всего ЛЧ МЛУ Всего

Beijing 30 (30,6%) 46 (46,9%) 98 1 (1,1%) 53 (84,1%) 63

non-Beijing 46 (57,5%) 15(18,8%) 80 2(13,3%) 8 (53,3%) 15

Всего 76 (42,7%) 61 (34,3%) 178 3 (3,8%) 61 (78,2%) 78

Как видно из таблицы 2, доля МЛУ изолятов М. tuberculosis (независимо от их принадлежности к Beijing или non-Beijing) в группе 2 (78,2%) превышала таковую в группе 1 (34,3%), причем доля JI4 изолятов была существенно меньшей (3,84%) чем в группе 1 (42,7%), что свидетельствовало о недостаточной эффективности проводимой противотуберкулезной терапии. Вместе с тем, частота МЛУ среди изолятов Beijing превышала данный показатель для изолятов non-Beijing в обеих группах и была в 1,8 раза больше в группе 2.

Определение мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду проведено у 174 из 178 изолятов М. tuberculosis вновь выявленных больных.

Как видно из таблицы 3, мутации в генах rpoB, katG и/или inhA, обусловливающие МЛУ, выявлены у 72 (41,4 %) изолятов М. tuberculosis, причем 57 (79,2%) из них принадлежали к группе Beijing. У подавляющего большинства МЛУ изолятов Beijing (п=53) устойчивость к рифампицину и изониазиду была обусловлена заменами Ser531—»Leu и Ser315—>Thr в генах rpoB и katG, соответственно, что согласуются с данными, полученными в других регионах России (Нарвская О.В., 2003; Маничева А.О. и др., 2011; Вязовая A.A. и др., 2012; Дымова М.А. и др., 2013). Ранее показано, что эти хромосомные мутации, формирующие МЛУ М. tuberculosis, обеспечивают устойчивость к высоким концентрациям данных препаратов in vitro, не снижая жизнеспособности и вирулентности микроорганизма (Нарвская О.В., 2003).

Около половины из 15 МЛУ изолятов М. tuberculosis группы non-Beijing принадлежали к генетическому семейству LAM (Таблица 3). При этом была выявлена зависимость между принадлежностью к SIT252 и сочетанием мутации r/7oZ?Asp516—»Val (устойчивость к рифампицину) с двойной мутацией (устойчивость к изониазиду): katG Ser315—»Thrl и шЫ_Т15 (р=0,006). Подобное сочетание мутаций ранее описано у штаммов М. tuberculosis SIT252 (LAM) в Псковской области (Вязовая A.A. и др., 2012, Mokrousov I. et al., 2012) и в Санкт-Петербурге (Маничева А.О. и др., 2011); мутация rpoB Asp516—>Val

также была характерна для штаммов LAM в Тульской области (Ignatova A. et al., 2006).

Таблица 3. Мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду у клинических изолятов М. tuberculosis различных генотипов, полученных от вновь выявленных больных туберкулезом

Генотип MIRU-VNTR Число изолятов (число изолятов, несущих мутации) Мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду

Ül Tí Я 2 й'г о 2? и •se 1 J3 Tía S ¿ н ■§ а В-5 ■эЗ О W tí SS 3*3 Л Ü> к со В-5 r Í «о 1 — Ti TI —i 5 u tS и ^ Ö &.S p. 5 5 S3 ■< ÍZJ ад о M <u я if ■C 3 э t 00 Л о CI 1 •e 3 КЛ -5 03 t T ~ ■О m ^ &&1 1 "5

Beijing 97 (57) 53 i 2 1

non-Beijing 77(15) 4 5 2 1 1 1 1

LAM 21(7) I 5 1

ffi(URAL) 21(6) 1 2 1 1 1

Haarlem 14(1) 1

Tur KD 1

S 1(1)

Unknown 19(0)

До настоящего времени существование связи между принадлежностью к генетическому семейству H3(URAL) и лекарственной устойчивостью штаммов М. tuberculosis отмечено не было (Mokrousov I., 2012). В данной работе установлена зависимость между наличием мутации устойчивости к изониазиду fa?/GSer315—>Thrl и принадлежностью к сполиготипу SIT262 генотипа URAL (р= 0,0139). МЛУ изоляты данной группы характеризовало разнообразие мутаций в гене гроВ, ответственных за устойчивость к рифампицину (Таблица 3).

Оптимизация схемы генотипировання изолятов М. tuberculosis, выделенных в Уральском ФО РФ

Выявление ДНК М. tuberculosis методом ПЦР в режиме реального времени с помощью тест-системы «Амплитуб-Beijing» непосредственно в образцах клинического материала позволило установить принадлежность

возбудителя к группам Beijing или non-Beijing. Принадлежность к данным группам определила оптимальный набор дискриминирующих локусов для MIRU-VNTR-типирования клинических изолятов М. tuberculosis.

Для генотипирования изолятов non-Beijing наиболее эффективным было использование 15 локусов (Supply P. et al., 2006) (HGDI=0,994), особенно в сочетании со сполиготипированием (HGDI=0,970).

Сравнительная оценка эффективности различных схем MIRU-VNTR-типирования 86 (из 98) изолятов М. tuberculosis группы Beijing представлена в таблице 4. В результате было определено минимальное количество дискриминирующих локусов (HGDI не менее 0,100 для каждого локуса): MIRU26, QUB26, MIRU31, Mtub21, QUBllb, MIRU40. Использование данного набора из 6 локусов незначительно снижало (HGDI=0,875) уровень дискриминации изолятов (HGDI=0,885), достигнутый при использовании 15 «классических» локусов. Напротив, включение трех дополнительных локусов позволило существенно повысить дискриминирующую способность минимальной 6-локусной схемы типирования (HGDI=0,939), сделав ее сопоставимой по эффективности с наиболее дискриминирующей схемой включавшей максимальное число локусов (HGDI=0,944) (Таблица 4).

Таблица 4. Дискриминирующая способность различных схем MIRU-VNTR-типирования уральских изолятов М. tuberculosis генотипа Beijing

oí н « „ Z « 2 п Р ° CQ 1 » § ft

Схема MRU-VNTR-типирования ЧИСЛ( MIRU-V1 профил 1 ё 5 « 1 § о н СП о S а § s U со HGD

6 локусов" 35 9 2-28 0,875

15 локусов [Supply Р., 2006] 41 8 2-28 0,885

6 локусов" + 3 локуса [Iwamoto Т., 20071 50 11 2-20 0,939

15 локусов [Supply Р., 20061+ 3 локуса [Iwamoto Т., 20071 56 9 2-20 0,944

*6 локусов (МШШ6, QUB26, Mtub21, Qubl lb, MIRU31, MIRU40).

Последующее ISdy/O-RFLP-тнпирование, повысившее степень дифференциации изолятов М. tuberculosis, не может бьггь рекомендовано для широкого применения, поскольку является наиболее дорогостоящим и трудоемким методом генотипирования, доступным лишь специализированным лабораториям.

Вместе с тем, анализ профилей IS6/70-RFLP позволил доказать принадлежность более двух десятков уральских изолятов Beijing (MIRU-VNTR-кластеры Bj23, BjlO и Bj3) к эпидемиологически и клинически значимому в России клону ВО (Мокроусов И.В. и др., 2012).

Таким образом, предложенная для практического применения схема генотипирования уральских изолятов Beijing включает минимальный набор из 6 локусов стандартной схемы (МПШ26, QUB26, Mtub21, Qubllb, MIRU31, MIRU40) и 3 дополнительных локуса (VNTR4120, VNTR3820, VNTR3232) (Рисунок 2).

пцр

клинический материал; чистые культуры М. tuberculosis

Beijing

MIRU-VNTR-типирование

6 локусов [Supply R et al, 2006]: MIRU26, QU326, Mtub21, Qubllb,MIRU31, MIRU40 3 локуса [Iwamoto I et aL, 2007]: VNTM120, VNTR3820, VNTR3232

чистые культуры M. tuberculosis

сполиготипирование чистые культуры М. tuberculosis

MIRU-VNTR-типирование

15 локусов [Supply Р. et al, 2006]: Mtub04, ETRQ MIRU04, M1RU40, MIRU10, MIRU16, Mtub21, QUBllb, ETRA Mtub30, MIRU26, MIRU31, Mtub39, QUB26, QUB41S6

чистые культуры M. tuberculosis

Рисунок 2 — Схема генотипирования уральских изолятов М. tuberculosis генотипа Beijing.

Заключение

Популяция М. tuberculosis Уральского региона неоднородна по всем исследованным молекулярно-генетическим маркерам (MIRU-VNTR- локусы, DR-область хромосомы, IS6110, гены устойчивости к ПТП: rpoB, katG, inhA). Установлено доминирование генотипа Beijing, доля которого составила около 55% и была практически неизменной на протяжении последнего десятилетия. При этом у изолятов Beijing МЛУ, обусловленная сочетанием мутаций rpoB Ser531—>Leu и katG Ser315—»Thrl, встречалась в 2,5 раза чаще, чем у изолятов non-Beijing в группах вновь выявленных и ранее леченных больных. Использование ISó//0-RFLP-TnnHpoBaHM для характеристики изолятов Beijing позволило доказать принадлежность более двух десятков уральских изолятов Beijing к эпидемиологически и клинически значимому в России клону ВО.

Группа non-Beijing была представлена изолятами различных MIRU-VNTR-типов и сполиготипов, среди которых преобладали представители нескольких глобально-распространенных генетических групп (согласно MIRU-VNTR/7/м^/семейств (согласно SITVITWEB), соответственно: LAM (LAM9, T5_RUS) - 12,9%; Ural (НЗ) - 11,8%; Haarlem (Hl, X) - 7,9%. При этом третья по численности (11,2%) неклассифицированная (по данным MIRU-VNTR-типирования) группа изолятов (Unknown) согласно SITVITWEB принадлежала к генетическому семейству Т - одному из самых распространенных в мире.

Среди изолятов LAM 30,4% были мультирезистентными за счет характерного сочетания мутаций rpoB Asp516—»Val и katG Ser315—>Thrl, /иЫ_Т15, причем выявлена ассоциация данных замен с кластером SIT252.

Доля мультирезистентных изолятов генотипа URAL(H3) составила 28,6%. При этом данный генотип, в отличие от других, был наиболее гетерогенным по спектру мутаций в гене rpoB у МЛУ изолятов. Выявлена ассоциация сполиготипа SIT262 с наличием мутации устойчивости к изониазиду katGSer315—»Thrl.

В настоящей работе показано, что идентификация эпидемиологически и клинически значимого мультирезистентного к 11111 варианта М tuberculosis Beijing возможна уже в первые дни лабораторного исследования материала больных с использованием ПЦР в формате реального времени в комбинации с молекулярно-генетическими методами определения лекарственной чувствительности возбудителя. Последующее генотипирование изолятов М. tuberculosis целесообразно проводить, используя стандартизированные молекулярно-генетические методы основанные на ПЦР, как наиболее доступные и недорогие. Так, для изолятов группы non-Beijing следует использовать MIRU-VNTR-типирование (15 стандартных локусов) и сполиготипирование, для изолятов генотипа Beijing -MIRU-VNTR-типирование на основе 6 высоко дискриминирующих стандартных локусов, что позволит классифицировать изоляты с использованием международных баз данных; дальнейшее оценка полиморфизма трех гипервариабельных локусов повысит дискриминирующую способность типирования.

Выводы

1. Установлено, что популяция М. tuberculosis в Уральском ФО РФ генетически неоднородна и представлена штаммами глобально распространенных генетических групп (линий), среди которых, по данным MIRU-VNTR-типирования, превалировали Beijing (55,1%), LAM (12,9%), URAL (11,8%) и Haarlem (7,9%).

2. Показано, что среди изолятов М. tuberculosis, обладающих МЛУ, в группах вновь выявленных и ранее леченных больных доминировали изоляты генотипа Beijing (86,9% и 75,4% соответственно).

3. Определено, что В распространении на Урале туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью ведущую роль играют штаммы М. tuberculosis генотипа Beijing, для которых характерно сочетание мутаций rpoB Ser531—»Leu и katG Ser315-»Thrl.

4. В группе изолятов М. tuberculosis non-Beijing вьивлена ассоциация МЛУ, обусловленной сочетанием замен rpoB Asp516—»Val, katG Ser315—>Thrl и inhA_T\5, с принадлежностью ксполиготипу SIT252 (LAM).

5. Двухэтапная схема генотипирования М. tuberculosis, основанная на использовании метода ПЦР, позволяет определить принадлежность возбудителя к группам Beijing и non-Beijing непосредственно в клиническом материале и дифференцировать изоляты по 9 (HGDI=0,939) и 15 локусам MIRU-VNTR (HGDI=0,994) соответственно. Сполиготипирование может быть использовано для дополнительной дифференциации изолятов non-Beijing.

Практические рекомендации

1. Двухэтапная схема генотипирования М. tuberculosis может быть рекомендована для микробиологического мониторинга возбудителя туберкулеза, при проведении эпидемиологического надзора, эпидемиологической диагностики в очагах (оперативный эпидемиологический анализ) и научных исследований в Уральском ФО РФ.

2. При размещении пациентов в противотуберкулезном стационаре следует учитывать данные о генотипе и спектре мутаций лекарственной устойчивости изолятов М. tuberculosis.

Публикации соискателя по теме диссертационной работы

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Умпелева Т.В. Молекулярно-генешческая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих на территории Уральского региона России / Т.В. Умпелева, М.А. Кравченко, Н.И. Еремеева, А.А. Вязовая, О.В. Нарвская //Инфекция и Иммунитет. - 2013. -Т.З. - №1. — С. 21-28.

2. Умпелева Т.В. Генотипирование изолятов Mycobacterium tuberculosis группы non-Beijing, циркулирующих в Уральском регионе / Т.В. Умпелева, А.А. Вязовая, М.А. Кравченко, Н.И. Еремеева, О.В. Нарвская. // Уральский медицинский журнал. - 2013. - №2. - С. 150-154.

3. Еремеева Н.И. Современное состояние проблемы тестирования туберкулоцидных режимов применения дезсредств / Н.И. Еремеева, В.В. Каншцев, М.А. Кравченко, Д.В. Вахрушева, Т.В. Умпелева //Уральский медицинский журнал №2,2013.-С. 155-160.

Публикации в других журналах и сборниках

4. Умпелева Т.В. Генотипирование изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных жителей г. Екатеринбурга / Т.В. Умпелева, М.А. Кравченко, Н.И. Еремеева, Е.Ю. Камаев. // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Москва. - 2010. — Т.1 — С.188-190.

5. Умпелева Т.В. Генотипирование изолятов Mycobacterium tuberculosis (МБТ), выделенных от больных туберкулезом в процессе химиотерапии / Т.В. Умпелева, М.А. Кравченко, Д.В. Вахрушева, RH. Еремеева, Е.Ю. Камаев. // Материалы Всероссийская конференция с международным участием «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом»,- Санкт-Петербург. - 2010.- С.234-235.

6. Умпелева Т.В. Молекулярно-генетаческая характеристика Mycobacterium tuberculosis, циркулирующих на территории Екатеринбурга / Т.В. Умпелева, М.А. Кравченко, H.H. Еремеева, Е.Ю. Камаев // Материалы Всероссийской научно-практической конференция «Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом». - Санкт-Петербург. - 2011.-С.114-115.

7. Еремеева Н.И. Оценка возможности применения дезсредств на основе катионных поверхностно-активных веществ во фтизиатрической практике / НИ. Еремеева, В.В. Каншцев, М.А. Кравченко, Д.В. Вахрушева, Т.В. Умпелева, К.В. Бобровская // Материалы 1го Конгресса Ассоциации «Национальная Ассоциация фтизиатров» «Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации». - Санкт-Петербург. -2012,- С. 241-242

8. Умпелева Т.В. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, циркулирующих в Уральском регионе / Т.В. Умпелева, М.А. Кравченко, НИ. Еремеева // Материалы 1го Конгресса Ассоциации «Национальная Ассоциация фтизиатров» «Актуальные проблемы и перспекгавы развитая противотуберкулезной службы в Российской Федерации». - Санкт-Петербург, 2012,- С. 262-263.

9. Еремеева НИ. Экспериментальная оценка устойчивости лекарственно-чувствительных культур Mycobacterium tuberculosis разных генетических кластеров к воздействию дезинфицирующих средств на основе катионных поверхностно-активных веществ / НИ. Еремеева, В.В. Каншцев, М.А. Кравченко, Д.В. Вахрушева, Т.В. Умпелева // Медицинский академический журнал, Приложение, ноябрь 2012 г. — С.316-318.

10. Умпелева Т.В. Роль Mycobacterium tuberculosis генотипов Beijing и non-Beijing в распространении мультирезистентного туберкулеза в Уральском регионе / Т.В. Умпелева, А.Ю. Якушкина // Материалы международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций». Санкт-Петербург, 2013.

Список сокращений, использованных в автореферате

JI4 - лекарственная чувствительность

МЛУ — множественная лекарственная устойчивость

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПТП - противотуберкулезный препарат

MIRU — mycobacterial interspersed repetitive units (микобактериальные вставочные повторяющиеся единицы)

VNTR - variable number of tandem repeats (вариабельное число тандемных повторов)

RFLP - restriction fragment length polymorphism (полиморфизм длин фрагментов рестрикции)

QUB - queen's university of Belfast (королевский университет в Белфасте)

ETR - exact tandem repeat - точные прямые повторы

УМПЕЛЕВА Татьяна Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ В УРАЛЬСКОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.02.03 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать^(р^ррмат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ ([$ Набор компьютерный

Подписано в печать 25.04.2014. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,6 Тираж 120 экз. Заказ № 1192

Отпечатано в типографии ИПЦ УрФУ 620000, Екатеринбург, ул. Тургенева, 4

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Умпелева, Татьяна Валерьевна, Екатеринбург

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ УРАЛЬСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФТИЗИОПУЛЬМОНОЛОГИИ

04201458910 тт

На правах рукописи

Умпелева Татьяна Валерьевна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ

ИЗОЛЯТОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ В УРАЛЬСКОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: Нарвская Ольга Викторовна,

доктор медицинских наук, профессор Скорняков Сергей Николаевич, доктор медицинских наук, профессор

Екатеринбург - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................10

1.1. Методы генотипирования М. tuberculosis...................................................10

1.1.1.IS67 7 0-RFLP-ranHpoBaHHe...............................................................12

1.1.2. Сполиготипирование........................................................................14

1.1.3. MIRU-VNTR-типирование...............................................................17

1.2. Молекулярно-генетические исследования М. tuberculosis в России.......22

1.2.1. Генотипирование клинических изолятов М. tuberculosis..............22

1.2.2. Лекарственная устойчивость клинических изолятов

М. tuberculosis..............................................................................................29

1.2.3. Геномный полиморфизм, клиническая и эпидемиологическая значимость штаммов М. tuberculosis генетического семейства Beijing...........................................................................................................32

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.............................38

2.1. Материал исследования.................................................................................38

2.2. Микробиологические исследования............................................................38

2.3. Сбор и подготовка образцов биомассы М. tuberculosis для генотипирования...............................................................................................Т....39

2.4. Молекулярно-генетические методы типирования клинических изолятов М. tuberculosis........................................................................................................40

2.4.1. Генотипирование с использованием тест-системы "Амплитуб-Beijing"..........................................................................................................40

2.4.2. MIRU-VNTR-типирование...............................................................40

2.4.3. Сполиготипирование........................................................................43

2.4.4. IS6770-RFLP-TmrapoBaHHe...............................................................45

2.4.5. Определение мутаций устойчивости к рифампицину и изониазиду у клинических изолятов М. tuberculosis...........................,...51

2.5 Статистическая обработка результатов............................................51

ГЛАВА 3. ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ М. TUBERCULOSIS, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ В УРАЛЬСКОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ...52

3.1. Генотипы клинических изолятов non-Beijing, полученных от впервые выявленных больных туберкулезом....................................................................55

3.2. Геномный полиморфизм изолятов Beijing, полученных от впервые выявленных больных туберкулезом....................................................................64

3.3. Генотипы изолятов М. tuberculosis, полученных от ранее леченных

больных туберкулезом.........................................................................................71

ГЛАВА 4. ОТНОШЕНИЕ К ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫМ ПРЕПАРАТАМ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ М. TUBERCULOSIS..........................................78

4.1. Характеристика лекарственной чувствительности клинических изолятов М. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первого ряда...............78

4.2. Мутации устойчивости к рифампицину и изониазиду у клинических

изолятов М. tuberculosis...................................................................................Л...91

ГЛАВА 5. СХЕМА ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ М. TUBERCULOSIS В УРАЛЬСКОМ ФЕДЕРАЛЬНОМ ОКРУГЕ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ............................................................................99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................107

ВЫВОДЫ.............................................................................................................109

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.............................................................110

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ...............................111

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............................................112

ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................136

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Туберкулез остается актуальной проблемой российского здравоохранения.

Согласно официальным данным в Уральском федеральном округе в,2012 г. показатель заболеваемости туберкулезом на 27,2% превысил средний по России (68,1 на 100 тыс. населения). Растет число инфицированных штаммами Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) (20,8% в 2012 г. против 16,1% в 2009 г.), обладающих резистентностью, по меньшей мере, к двум наиболее эффективным противотуберкулезным препаратам (ПТП) - изониазиду и рифампицину [36].

Микробиологический мониторинг возбудителя туберкулеза в современных условиях основан на анализе специфических нуклеотидных последовательностей хромосомной ДНК М. tuberculosis с использованием сполиготипирования, MIRU-VNTR- и /&5//0-КРЪР-типирования и других методов исследования геномного полиморфизма микобактерий [99, 106, 165, 172]. В последнее десятилетие были разработаны технологии определения мутаций, ассоциированных с лекарственной устойчивостью (ЛУ) М. tuberculosis к ПТП [3,180].

Соотношение генотипов в популяциях возбудителя туберкулеза может существенно различаться в разных странах и географических регионах мира [112, 99, 69, 135]. При этом следует учитывать, что, вследствие недостаточной проработки критериев принадлежности к генетическому семейству (линии), классификация изолятов М. tuberculosis на основе сопоставления их профилей сполиготипирования и MIRU-VNTR-типирования с имеющимися в компьютерных базах данных SITVITWEB [185] и MIRU-VNTR^/w [186] условна.

Степень разработанности темы исследования

В научной литературе имеются единичные публикации, посвященные генотипической характеристике возбудителя туберкулеза в Уральском ФО. Так, в 2001 - 2002 гг. проведено исследование 98 уральских изолятов М. tuberculosis с использованием MIRU-VNTR-типирования (12 локусов MIRU: 2,4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40) и показано доминирование изолятов, отнесенных к генетическому семейству W-Beijing (54,3%) [109]. В этой работе у 15,2% изолятов впервые был идентифицирован новый генотип, получивший наименование URAL. Позднее были описаны особенности сполигопрофиля штаммов данного генотипа [137].

Задачи исследования

1. Провести генотипирование клинических изолятов М tuberculosis, полученных в Уральском ФО РФ, с использованием ПЦР-тест-системы «Амплитуб-Beijing» и методов M1RU-VNTR-, IS<5770-RFLP-и сполиготипирования.

Научная новизна работы

Впервые, с использованием стандартизированных молекулярно-генетических методов (MIRU-VNTR-типирования, сполиготипирования, RFLP-IS6/70-THnnpoBaHHH) и ПЦР-тест-систем «Амплитуб-Beijing» и «ТБ-Биочип (MDR)», получена комплексная генотипическая характеристика клинических изолятов М. tuberculosis в Уральском ФО РФ.

Установлено, что среди клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Уральском ФО РФ доминируют представители генотипа Beijing, обладающие МЛУ за счет мутаций Ser531—»Leu и Ser315—>Thr в генах гроВ и katG, соответственно.

Теоретическая и практическая значимость работы

Сполигопрофили и MIRU-VNTR профили 83 изолятов М. tuberculosis включены в международную, постоянно обновляемую компьютерную базу данных SITVTTWEB и SITVIT 2 (Institut Pasteur de la Guadeloupe).

Разработана научно обоснованная схема генотипирования возбудителя туберкулеза в Уральском ФО РФ, согласно которой на первом этапе осуществляется дифференциация М. tuberculosis на группы Beijing/non-Beijing и определение мутаций устойчивости к основным ПТП с использованием ДНК, выделенной из клинического материала; последующее MIRU-VNTR-типирование изолятов М. tuberculosis генотипа Beijing проводится с использованием 9 локусов, изолятов других генотипов (non-Beijing) - 15 локусов и сполиготипирования.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

3. Устойчивость изолятов М. tuberculosis Beijing к рифампицину и изониазиду ассоциирована с сочетанием замен rpoB Ser531—»Leu и katG Ser315—>Thrl. В группе non-Beijing выявлена ассоциация МЛУ, обусловленная сочетанием замен r/?a£?Asp516—>Val, katGSer315—>Thrl и

inhA_TI 5, с принадлежностью изолятов к сполиготипу SIT252 семейства LAM.

Апробация работы и публикации Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных конференциях: 18-20 октября 2012 г., г. Санкт-Петербург: 1-й Конгресс Национальной Ассоциации фтизиатров «Актуальные проблемы и перспективы развития противотуберкулезной службы в Российской Федерации»; 17-22 марта 2013 г., г. Берлин: Седьмой симпозиум имени Р. Коха и И.И. Мечникова; 23-25 апреля 2013 г., г. Екатеринбург: региональная научно-практическая конференция с международным участием «Пути повышения качества и эффективности деятельности противотуберкулезных учреждений»; 24 сентября 2013 г., г. Екатеринбург: научная сессия с международным участием «Фундаментальные исследования — практической фтизиатрии».

Структура и объем диссертации

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора Работа выполнена по плану НИР «Лечебно-диагностические и организационные технологии повышения медико-социальной эффективности специализированной и высокотехнологичной медицинской помощи больным туберкулезом основных локализаций» № гос. регистрации 01200953414 ФГБУ «УНИИФ» Минздрава России.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Методы генотипирования М. tuberculosis

Разработка и применение молекулярно-генетических методов лабораторной диагностики во фтизиатрии открывают большие перспективы для совершенствования контроля над распространением туберкулеза. Еще до недавнего времени доказать передачу возбудителя от человека к человеку было невыполнимой задачей. Только с появлением методов молекулярной генетики стало возможным выявлять сходство/различия между отдельными штаммами М. tuberculosis, то есть проводить генотипирование. Так возникло новое направление - молекулярная эпидемиология туберкулеза. Молекулярно-эпидемиологические исследования опираются на данные, полученные с помощью методов генотипирования для решения следующих ключевых задач:

- Выявление и оценка эпидемической опасности очагов туберкулезной инфекции и путей ее распространения. Генотипирование позволяет выявить штамм в конкретном очаге и дифференцировать его от прочих, эпидемиологически не связанных штаммов. В последние годы, в связи с ростом числа случаев туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, становится особо актуальной проблема выявления и предотвращения трансмиссии мультирезистентных штаммов [30, 55, 91, 94, 150].

- Разграничение случаев экзогенной инфекции и эндогенной реактивации туберкулеза. Рецидив туберкулеза через несколько лет после перенесенного заболевания может быть следствием как реактивации латентной инфекции, так и экзогенного инфицирования микобактериями туберкулеза. При наличии изолятов М. tuberculosis, выделенных в оба периода заболевания, с помощью генотипирования можно доказать, вызвано

повторное заболевание тем же штаммом возбудителя, что и предыдущее, или другим [124, 160].

- Выявление случаев лабораторной контаминации. Проведение

♦

генотипирования М. tuberculosis позволяет выявлять ложноположительные результаты культивирования, частота которых может составлять 0,1 - 3% [103, 129, 130, 153].

Таким образом, ключевой вопрос генотипирования - представляют ли клинические изоляты М. tuberculosis определенный штамм? При этом под термином «изолят» понимают чистую культуру бактерий, выделенную от какого-либо конкретного источника. Под «штаммом» понимают один или несколько изолятов, при генотипировании которых с использованием определенной системы типирования получают идентичные результаты. В пределах большинства биологических видов существуют значительные генетические различия между отдельными особями (штаммами), что можно доказать при использовании достаточно дискриминирующих методов генотипирования. Эпидемиологически не связанные изоляты, при использовании одного и того же метода генотипирования, будут иметь разные генотипы. Напротив, эпидемиологически связанные изоляты, имеющие общий источник происхождения, имеют идентичные или почти идентичные паттерны генотипирования и представляют собой один штамм [175].

Благодаря полной расшифровке нуклеотидных последовательностей генома многих лабораторных штаммов и клинических изолятов М. tuberculosis [68], стало известно, что, хотя данный вид и является чрезвычайно консервативным, существуют полиморфные участки, которые могут быть использованы для внутривидовой дифференциации возбудителя туберкулеза. За последние десятилетия предложено больше десятка методов генотипирования, различающихся между собой как по технической составляющей, так и по тому, какой полиморфный участок исследуется [110,

152]. Такое многообразие ставит проблему выбора, поскольку каждый метод имеет свои преимущества и недостатки.

Одним из основных критериев при выборе метода генотипирования является его дискриминирующая спос

Информация о работе

Умпелева, Татьяна Валерьевна
кандидата биологических наук
Екатеринбург, 2014
ВАК 03.02.03

Диссертация

Молекулярно-генетическая характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Уральском федеральном округе Российской Федерации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы