Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая диагностика малярии

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая диагностика малярии"

На правах рукописи

Гринев Александр Борисович

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МАЛЯРИИ: ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИМИЗАЦИИ

03.02.07 -генетика 03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2013

2 8 НОЯ 2013

005540380

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

Чебышев Николай Васильевич академик РАО, профессор, доктор медицинских

наук, профессор кафедры биологии и общей генетики ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И. М. Сеченова».

Токмалаев Анатолий Карпович заслуженный врач РФ, профессор, доктор

медицинских наук, профессор кафедры инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Официальные оппоненты:

Щипков Валерий Петрович академик РАМТН, профессор, доктор

медицинских наук, профессор кафедры

биологии и общей генетики ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»,

Царёв Виктор Николаевич доктор медицинских наук, профессор,

заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, иммунологии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова»

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный

исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится ч.'/З » 2013 года в /'^Т часов на заседании

диссертационного совета Д 212.203 в ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198 Москва, улица Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УНИБЦ ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» (117198 Москва, улица Миклухо-Маклая, 6) и на сайте www.njdn.ru

Автореферат размещен на сайте www.vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан «/Ь » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н., доцент

Гигани Ольга Борисовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы диссертационного исследования

Малярия является одной из наиболее серьезных и трудноразрешимых проблем в странах с тропическим и субтропическим климатом [Ярилин A.A. 2010 г.]. Число больных, зарегистрированных в 101 стране мира, составляет 216 млн. (ВОЗ,2011), из них 81% - в странах Африки; умирает за год до 900 тыс. больных малярией, 91% из них также в странах Африки; 86% умерших от малярии в мире составляют дети до 5 лет. Наибольший процент летальных исходов - до 98%, приходится на тропическую малярию, вызываемую Plasmodium falciparum.

В период проведения настоящего диссертационного исследования, по данным Федерального бюджетного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», было зарегистрировано 115 обращений с диагнозом малярия: в 2010 г. - 48, в 2011 г. - 32, в 2012 году -35 обращений. Из этих данных следует, что, несмотря на тот факт, что количество обращений с диагнозом малярия в год не постоянно, оно, так или иначе, не опускается ниже определенного минимального уровня. В данных условиях проблемы ранней постановки точного диагноза и адекватного лечения выходят на первый план. Известно, что поздняя диагностика тропической малярии приводит тяжёлым клиническим последствиям - к развитию наиболее опасной церебральной формы, инфекционно-токсическому шоку и других смертельных осложнений. Поздняя диагностика трёхдневной малярии ведёт к серьёзным эпидемиологическим последствиям - созданию условий для возникновения в городе случаев малярии вторичных от завозных.

В настоящее время существуют различные методы, направленные на выявление наличия малярийных паразитов в крови больного. Прежде всего, это микроскопическое исследование мазка крови больного, которое на сегодняшний день является «золотым стандартом» диагностики малярии [Stephanie Р. Johnstonata 1.]. Подобное исследование позволяет обнаружить паразитов в те-

чение полутора-двух часов после забора крови, однако этот метод не лишен некоторых недостатков: относительно низкая эффективность при незначительном количестве паразитов в мазке крови или, если они присутствуют на пороге чувствительности метода, а также трудность дифференциальной диагностики вида паразита на стадии юного трофозоита.

Наряду с микроскопическим исследованием препаратов крови в настоящее время используются так называемые экспресс - тесты [Рабинович С.А. и др. 2006 г.]. Это удобный и быстрый способ постановки диагноза, особенно в случаях отсутствия квалифицированной медицинской помощи. Однако и этот вид диагностического исследования имеет определенные ограничения в эффективности, так как экспресс-тесты пока разработаны не для всех видов паразитов и значительно уступают в чувствительности стандартным паразито-логическим исследованиям препаратов крови.

В последние десятилетия в практику диагностики инфекционных болезней, в том числе и малярии, вошли высокоэффективные и чувствительные молекулярно-генетические методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Источниками ДНК плазмодиев малярии для ПЦР могут служить: кровь, собранная на бумажный фильтр, препарат «толстая капля».

Представляют научный и практический интерес методы, позволяющие определить наличие генетических отклонений у лиц, подвергшихся инфекции несколькими патогенами (в частности, микст-инфекции P.falciparum и Эп-штейн-Барр - вирусом) не только на молекулярно-биологическом уровне (метод ПЦР), а также на цитогенетическом уровне. В этом плане важное место отводят методам метафазного кариотипирования и флуоресцентной гибридизации in situ - FISH (Fluorescence in situ hybridization).

Для качественного улучшения диагностики малярии в современных условиях, наряду с использованием стандартных методов постановки диагноза, актуальным становится разработка и внедрение в практику точных молекулярно-

генетических и цитогенетических методов, что поможет значительно эффективнее решать существующие научные и практические проблемы, связанные с малярийной инфекцией.

Цель исследования

Оптимизация проведения молекулярно-генетических методов диагностики малярии и анализ возможности генетических перестановок при микст-инфекции завозной малярии и вируса Эпштейн-Барр с помощью современных цитогенетических методов.

Задачи исследования

1) Изучение эффективности и совершенствование существующего метода проведения Nested PCR с препаратом «толстая капля» в качестве источника ДНК малярийного плазмодия.

2) Разработка и изучение возможности применения в практике диагностики малярии метода Nested PCR с эритроцитарным сгустком в качестве источника ДНК паразита.

3) Сравнительный анализ эффективности и трудозатратности при проведении Nested PCR с разными источниками ДНК малярийного плазмодия.

4) Выявление Эпштейн-Барр вирусной инфекции у больных малярией при помощи метода ПЦР.

5) Анализ кариотипа больного малярией на предмет наличия у него специфичных для лимфомы Беркитта генетических изменений (транслокаций).

База исследования.

Информационной и методической базой для проведения исследования являлись:

1) Городская клиническая инфекционная больница №2 г. Москвы.

2) Федеральное бюджетное учреждение здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве».

3) Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» Российской академии медицинских наук.

Научная новизна диссертационного исследования.

1) Показана высокая эффективность и специфичность метода ПЦР для диагностики малярии.

2) Впервые применён метод выделения ДНК паразита из эритроцитарного сгустка для постановки Nested ПЦР с целью диагностики малярии. Показана высокая эффективность и сравнительно незначительная трудозатратность при использования данного биосубстрата.

3) Впервые проведено исследование кариотипа Эпштейн-Барр вирус — позитивных больных завозной малярией на территории Москвы на наличие транслокаций, выявляемых при диагностике лимфомы Беркитта. Транслокаций, характерных для эндемичной лимфомы Беркитта, у больных завозной малярией и в группе контроля не обнаружено.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Метод Nested PCR с эритроцитарным сгустком в качестве источника ДНК паразита, предложенный в данной работе, может быть внедрен в практическую диагностику малярии с целью улучшения точности и достоверности постановки диагноза.

Полученная в результате проведенной работы информация может быть полезна для полноты понимания процессов происходящих в организме больно-

го при сочетании двух патогенов - Эпштейн-Барр вируса герпеса человека и малярийных плазмодиев.

Результаты диссертационной работы нашли применение в учебном процессе на кафедре биологии и общей генетики ГОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ» и кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ФГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов». Предложенная модификация метода Nested PCR использовалась для уточнения видовой принадлежности в диагностике отдельных случаев завозной малярии в ИКБ 2.

Апробация диссертации.

Апробация диссертации проведена на научной конференции кафедры биологии и общей генетики ГОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ» (июль 2013 г.).

Материалы диссертации были доложены на Первой молодежной научно-практической школы-конференции по естественным, техническим, медицинским наукам и биотехнологиям в Российском университете дружбы народов (июнь 2013 г.)

Публикации по теме диссертации.

По теме диссертации опубликовано 3 статьи, из них 2 в журналах, поименованных в перечне ВАК России.

Диссертация написана на 111 листах и состоит из титульного листа; оглавления; введения, отражающего цели и задачи исследования; обзора литературы по проблематике диссертации; обзора используемых материалов и методов; изложения оригинальных собственных материалов; выводов; обсуждения результатов; библиографического списка, составленного в соответствии с «ГОСТ Р 7.0.5 - 2008 - Библиографическая ссылка» и состоящего из 157 ис-

точников (в числе которых 44 российских и 133 иностранных); иллюстративного материала состоящего из 26 рисунков и 5 таблиц и списка сокращений.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы.

Методика постановки ПЦР для диагностики малярии.

В настоящем исследовании сравнивали эффективность ПЦР с ДНК, выделенной из препарата «толстая капля», и ПЦР с ДНК, выделенной из сгустка крови, образовавшегося при центрифугировании. Кровь больных малярией и препараты «толстая капля» были взяты на базе ГКИБ №2 и частично в пара-зитологической лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве». Весь материал был собран в период с 2010 по 2012 год. Для приготовления сгустка крови свежую кровь набирали в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА. Использовали вакуумные пробирки с напылением ЭДТА на стенках. Собранные пробы крови центрифугировали 5 минут/5000 оборотов, с целью разделения материала на фракции. Образовавшийся эритроцитарный сгусток служил исходным материалом для дальнейшего выделения из него ДНК малярийного паразита. В дальнейшем выделение и очистку ДНК проводили с помощью коммерческого набора «Комплект для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови» фирмы «Литех», с той лишь разницей, что в реакцию, вместо пробы плазмы, добавляли 25 мкл. образовавшейся после центрифугирования эритроцитарной массы. Этот материал в пробирках «эпендорф» оставляли в морозильной камере при температуре -20°Сдо постановки реакции ПЦР. При этом материал, по нашим наблюдениям не терял своих качеств до 3-х лет.

Для выделения ДНК паразита из препарата «толстая капля» на предметное стекло с пробой крови в ламинар-боксе наносилось 20 мкл. фосфатного буфера (PBS), для чего использовали быстрорастворимые таблетки PBS фирмы Sigma согласно инструкции. Образовавшуюся после суспендирования буфе-

ром массу собирали стерильным скальпелем и переносили в пробирку «эпен-дорф», добавляя 80 мкл. буфера PBS. Дальнейшее выделение ни чем не отличалось от описанного ранее в литературе.

К стандартной реакционной смеси первого цикла (19 мкл.) добавляли прай-меры, соответствующие роду возбудителя, в количестве одного мкл. Во второй цикл амплификации добавлялись видоспецифичные праймеры, 4 мкл. продукта первого цикла вместо 5, а также 14 мкл. деионизированной воды вместо 13, в остальном состав рабочей смеси тот же. Характеристики прайме-ров, описанные в специализированной литературе нами не изменялись. Амплификацию проводили в амплификаторах «Терцик 2» и «Bio Rad». Режим амплификации также был описан ранее и нами не изменялся. После прохождения обоих циклов амплификации образцы окрашивали бромистым этидием (возможно использование уже окрашенной полимеразы) и подвергали электрофорезу в электрофоретической установке «Bio Rad», с последующей детекцией в ультрафиолете на системе гель - документации «Chemi Doc XRS Plus» фирмы «Bio Rad».

Методика постановки ПЦР для диагностики вируса Эпштейн-Барр.

Для выделения ДНК вируса Эпштейн-Барр из плазмы больного использовали коммерческий набор «Комплект для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови» фирмы «ООО НПФ «Литех». В готовый реакционный набор «Эбарпол» фирмы «ООО НПФ «Литех» вносится растворитель и 5 мкл. выделенной ДНК. Готовую реакционную смесь помещали в амплификатор. Амплификацию проводили в соответствии с указаниями фирмы производителя реакционного набора. После подвергали электрофорезу в электрофоретической установке «Bio Rad» с последующей детекцией в ультрафиолете на системе гель - документации «Chemi Doc XRS Plus» фирмы «Bio Rad».

Методика постановки FISH анализа.

Для флуоресцентной гибридизации in situ использовали зонды фирмы Abbot Vysis LSI IGH/MYC/CEP 8 Tri-Color Dual Fusion Probes, каталожный номер: 05J75-001. Данный набор включает в себя ДНК зонды, Dapi II (противовыцве-тающий реагент) и набор реагентов для постгибридизационного отмывания препаратов. ДНК — пробы предназначены для идентификации транслокации t(8;14)(q24;q32) . ДНК- зонды, входящие в набор, предварительно денатурированы и прямо мечены флуоресцентными красителями. Гибридизацию in situ проводили в соответствии с протоколом, рекомендуемым фирмой - производителем.

Перед идентификацией хромосом на препарат наносили противовыцветаю-щий реагент Dapi II. Микроскопический анализ проводили при увеличении 100X10 с использованием флуоресцентного микроскопа фирмы Nikon, оборудованного соответствующим набором фильтров фирмы Vysis и системой автоматического анализа изображения, разработанной фирмой Microptic.

Результаты исследования:

1. Характеристика завозной малярии в городе Москве в период 2010 —

2012 г.г.

1.1. Частота и видовая структура завоза малярии из разных эндемичных

регионов мира.

За время проведения исследований - с 2010 по 2012 г.г., обстановка по малярии в г. Москве была не постоянна. В этот период Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве» было зарегистрировано 115 обращений с диагнозом малярия. Общие закономерности заболеваемости завозной малярией отражены в рисунках 1,2, 3.

Рисунок 1: Количество обращений с диагнозом малярия во время проведения исследований по данным федерального бюджетного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве».

Несмотря на разное число зарегистрированных больных малярией по годам наблюдений (рис.1), общим было преобладание завоза малярии из стран Тропической Африки, особенно инфекции P.falciparum - до 17 случаев в год, в то время как инфекция другими видами плазмодиев регистрировалась в меньшем количестве (рис. 2, 3).

Страны тропического и субтропического региона Азии

Страны Африки

Индия и граничащие с ней страны

• Страны СНГ и граничащие с ними страны

Другие страны

Рисунок 2.Число завозных случаев малярии из разных регионов мира в период проведения исследований.

Ниже приведен рисунок 3, отражающий динамику заболеваемости различными видами малярии за обозначенные временные периоды.

Период! Период 2 Период 3

Plasmodium falciparum Plasmodium vivax Plasmodium malariae Plasmodium ovale Plasmodium

falciparum+Plasmodium vivax

Рис. 3. Динамика заболеваемости различными видами паразитов за обозначенные временные периоды.

Из приведенного выше графика (рис.3) следует, что наибольшее количество обращений с диагнозом тропическая малярия было зарегистрировано в первый период наблюдений. Следующей по частоте после P. falciparum- малярии была трехдневная малярия (P.vivax). Уровни заболеваемости другими видами малярии или случаи микст-инвазий были относительно редки и не превышали 2 случаев в год.

1.2. Возрастная структура больных завозной малярией.

В исследовании возрастной структуры изучаемой группы была произведена выборка из 72 человек, что составляет примерно 63 % от общего количества обращений, о которых имелись точные данные о возрасте больного. Общая возрастная структура отражена в рисунке 4, из которого видно, что возраст в изучаемой группе колебался в пределах от 16 до 76 лет, более половины из них (43) были в возрасте от 21 года до 39 лет.

5

4 -".....

3 '

2 •'

: 11 HI Ml ими

Рисунок 4. Возрастная структура исследованных больных.

2. Применение метода Nested PCR для диагностики малярии.

Метод полимеразной цепной реакции отличается от всех существующих методов диагностики малярии наивысшей чувствительностью. Источниками ДНК для ПЦР могут служить: препарат «толстая капля», сгусток, образован-

ный после центрифугирования цельной венозной крови, или иные биосубстраты.

2.1. Применение Nested PCR с использованием в качестве источника ДНК препарата «толстая капля».

В группу образцов ДНК, полученных из препарата «толстая капля», было включено 76 положительных на наличие малярийных плазмодиев проб, собранных Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», а также полученных в клинической лаборатории Инфекционной клинической больницы №2 города Москвы. Самые «старые» препараты «толстая капля» были датированы 1995 годом, самые «свежие» - 2012 годом. Препараты подбирались в процессе слепой выборки. Некоторые образцы были окрашены и ранее подвергались микроско-пированию, некоторые сохранялись в качестве дубликатов и окрашены не были. Разницы в эффективности проведения Nested PCR по окрашенной и неокрашенной «толстой капле» в описываемой нами выборке выявлено не было. Качество препарата «толстая капля» оценивали по 3-х бальной шкале. Препарат оценивался в 3 балла, если он был хорошо сохранившимся, с крупным и ровным кровяным диском, нормальной толщиной слоя крови, диаметром от 1,5 до 3 см. В случае, если диаметр кровяного диска был Зсм и более, в пробу забиралась его часть с целью исключения контаминации образца чужеродными объектами. Препарат с кровяным диском менее 2 см, имеющий нестертые следы иммерсионного масла и малой толщиной кровяного диска оценивался в 2 балла. Если препарат представлял собой тонкий кровяной след, частично нарушенный при удалении иммерсионного масла, или разрушенный механическим путем, качество препарата оценивалось в 1 балл.

Исходя из полученных данных, с целью математического подтверждения зависимости полученного результата проведения Nested PCR от качества препарата высчитывался коэффициент корреляции Пирсона по формуле:

„ __ЩХУ] - M\X]M\Y)_

П,х У" -

' у/{М[Х*] - - (М[У\Г)

Где М - математическое ожидание, Х- качество капли по трехбалльной шкале, Y - прохождение реакции (0-не прошла, 1 прошла)

Из 76 образцов ДНК ложноотрицательный результат показали 18, что составляет 23.7 % от общего количества образцов выделенных из препарата «толстая капля». Результат Nested PCR был положительным в 58 случаях (что составляет 76.3 % от общего количества образцов, выделенных из препарата «толстая капля»). Коэффициент корреляции между качеством препарата и результативностью Nested PCR составил 0.7552 (диапазон от -1 до 1), точность вычисления - 0,1.

Кроме того, была произведена статистическая проверка гипотезы о зависимости результата Nested PCR от качества препарата «толстая капля». В качестве проверочного метода нами был использован критерий знаков G по следующему алгоритму:

- Определяется направленность изменений в сравниваемых наблюдениях.

- Подсчитывается общее число парных наблюдений, имеющих различия (п).

- Подсчитывается меньшее число однозначных результатов сравнения, обозначаемых как Z.

- Z сравнивается по специальной таблице (приведена ниже) с критическими значениями для данного п.

Во всех подсчетах Z была равна нулю, а р <0,01.Эти данные позволяют утверждать, что результат проведения Nested PCR в значительной степени зависит от качества препарата «толстая капля».

2.2. Применение Nested PCR с использованием в качестве источника ДНК эритроцитарного сгустка.

За период проведения набора материала для настоящего исследования (конец 2011 года до начала 2013 года) в ИКБ №2 г. Москвы с диагнозом малярия поступил 31 человек. Из них удалось изучить биосубстрат 22 пациентов (то есть у 74% от общего количества больных), от которых было получено 49 проб ДНК.

Из 49 протестированных проб только 1 проба дала ложноотрицательный результат. Дважды был поставлен неверный диагноз, однако при перестановке этой же пробы видовой диагноз в обоих случаях был подтвержден. Возможное объяснение данного феномена заключается в высокой температуре окружающей среды при проведении первых двух реакций, что, как известно, отрицательно сказывается на качестве проведения реакции Nested PCR, как в целом, так и корректной работе праймеров, в частности.

2.3.Сравнительный анализ диагностической эффективности проведения Nested PCR по препарату «толстая капля» и эритроцитарному сгустку.

Основные результаты сравнения эффективности методик представлены в таблице 1. Из данной таблицы следует, что всего было исследовано 125 образцов ДНК, из них 76 были выделены из препарата «толстая капля», 49 - из эритроцитарного сгустка.

Таблица 1. Результаты сравнения эффективности Nested PCR по препарату «толстая капля» и эритроцитарному сгустку.

Общее ко- Процент Ложноотрицательный Соответствие результа-

личество (%) от об- результат там микроскопии

образцов щего ко- Всего Процент

личества образцов, образцов (%) от общего количества образцов, Общее количество образцов Процент (%) от общего количества образцов,

Всего исследо- 125 100 19 15,2 106 84,8

вано образцов

ДНК

Из общего коли- 76 60,8 18 14,4 58 46,4

чества по ДНК

из препарата

«толстая капля»

исследовано об-

разцов

Из общего коли- 49 39,2 1 0,8 48 38,4

чества по ДНК

из эритроцитар-

ного сгустка ис-

следовано об-

разцов

К преимуществам «толстой капли» как источника ДНК можно отнести: возможность ретроспективной диагностики, простоту и доступность методики выделения и очистки ДНК, отсутствие необходимости причинений дополнительных неудобств больному, т.к. не надо отдельно производить забор крови для ПЦР, относительно высокую точность и чувствительность метода, в случае, если капля соответствует задаваемым параметрам. Однако стоит отметить, что методика ПЦР, построенная на использовании в качестве источника

ДНК «толстой капли», имеет существенный недостаток - большую зависимость результатов от качества препарата «толстая капля».

Рассматривая методику Nested PCR с использованием ДНК, полученной из эритроцитарного сгустка, стоит отметить, что единственным ее недостатком является некоторая длительность процесса выделения и очистки ДНК, на что требуется около 45-60 минут, но мы считаем это практически не существенным. В то же время, если выделение и очистка ДНК проведены правильно, возможность ложноотрицательного результата сводится к нулю. Эта методика не требует причинения дополнительных неудобств больному, т.к. забор крови производится в любом случае для проведения биохимических, серологических и других клинических исследований. При сохранения пробирки, содержащей этот сгусток при температуре -70-80°С, вполне реальна возможность ретроспективной диагностики, т.к. ДНК паразита в сгустке сохранит свои качества в течение трех лет. Таким образом, впервые применённый метод выделения ДНК паразита из эритроцитарного сгустка для постановки Nested ПЦР с целью диагностики малярии показал высокую диагностическую эффективность и сравнительно незначительную трудозатратность.

2.3.Анализ на наличие / отсутствие транслокаций (8;14)(q24;q32) у носителей малярийных паразитов и ЭБВ.

В связи с тем, что одной из задач настоящего исследования являлся анализ наличия либо отсутствия транслокаций у пациентов, болеющих малярией и имеющих вирус Эпштейн-Барр в латентной фазе, нами была произведена слепая выборка, представляющая собой группу из восьми пациентов, имеющих диагноз малярия и ЭБВ. В выборку были включены 3 человека больные тропической малярией, 4 человека больные малярией вызванной P.vivax, и 1 человек, болеющий малярией, вызванной P.malariae. С целью обеспечения объективности исследования нами также была изучена группа добровольцев,

состоящая из 4 человек, имеющих ЭБВ в латентной стадии, но не болеющие ни одним из видов малярии.

Генетический материал исследуемой группы, и группы контроля изучали методом FISH, что было вызвано плохим качеством B-клеточных культур у больных малярией, закономерно обусловленное общим напряженным состоянием иммунной системы больных. Количество метафазных пластинок в культурах, полученных от больных малярией, было недостаточным для подтверждения положительного или отрицательного диагноза, кроме того, качество единичных пластинок было очень низким. В связи с тем, что методика FISH позволяет определять наличие или отсутствие транслокаций по интерфазным ядрам, необходимость в изучении метафазных пластинок была устранена. В ходе проведения FISH анализа просматривалось не менее 100 интерфазных ядер с целью исключения вероятности не обнаружения искомых транслокаций в случае, если они были бы мозаичны. Всего в ходе данного исследования было просмотрено более 1200 интерфазных ядер, а также несколько метафазных пластинок. В ходе исследования транслокаций, характерных для эндемичной лимфомы Беркитта, у больных завозной малярией и в группе контроля не обнаружено.

Выводы.

1. Применение метода Nested PCR для диагностики завозной малярии в Москве, учитывая незначительное количество больных, представляется оправданным.

2. Имеется зависимость результативности проведения Nested PCR от качества используемого для эти целей препарата «толстая капля».

3. Метод выделения ДНК из эритроцитарного сгустка для проведения Nested PCR превосходит в чувствительности аналогичный метод с использованием «толстой капли».

4. Транслокаций, характерных для эндемичной лимфомы Беркитта, в исследуемой группе больных завозной малярией и группе контроля, не обнаружено.

5. Сочетанная инфекция ЭБВ и малярии не всегда является достаточным условием для прохождения транслокационных процессов в В-клетках.

Практические рекомендации

1. Для улучшения точности и достоверности постановки диагноза малярии, особенно завозимой из эндемичных регионов, целесообразно применять метод Nsted PCR.

2. В качестве источника ДНК паразита рекомендуется использовать эритроцитарный сгусток, получаемый при проведении других клинико-лабораторных исследований крови больного.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гринев А.Б. Сочетанная инфекция: тропическая малярия и лимфома Бер-китта // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2012. №2. С. 47-49.

2. Гринев А.Б., Токмалаев А.К., Чебышев Н.В. и соавт. Методологические особенности выделения ДНК для постановки Nested PCR с целью дифференциальной диагностики малярии // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2013. №2. С. 30-33.

3. Гринев А.Б., Седова М.В., Бегунова C.B. Малярия - вчера, сегодня, завтра. Точные диагностические системы // Материалы первой молодежной школы конференции по естественным, техническим и медицинским наукам и биотехнологиям. Июнь 2013. С. 198-199.

Гринев Александр Борисович (Россия) «МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МАЛЯРИИ: ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИМИЗАЦИИ»

В данной работе была изучена эффективность существующих методов проведения Nested PCR по препарату «толстая капля», предложен новый метод выделение ДНК для Nested PCR при диагностике малярии, изучены кариотипы группы больных с вирусом Эп-штейн-Барр и малярией. Диссертация состоит из титульного листа; оглавления; введения; обзора литературы по проблематике диссертации; обзора используемых материалов и методов; изложения оригинальных собственных материалов; обсуждения результатов; выводов; и библиографического списка. В диссертации продемонстрировано, что применение метода Nested PCR для диагностики завозной малярии в Москве, учитывая незначительное количество больных, представляется оправданным, имеется зависимость результативности проведения Nested PCR от качества препарата «толстая капля», метод выделения ДНК описанный в диссертации для проведения Nested PCR превосходит в чувствительности метод проведения Nested PCR по «толстой капле», наличия ЭБВ и малярии не всегда является достаточным условием для прохождения транслокационных процессов в В-клетках.

Ключевые слова: малярия, Nested PCR, транслокации, метод, диагностика.

Grinev Aleksander Borisovich (Russian Federation) «МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МАЛЯРИИ: ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИМИЗАЦИИ»

Recent work is devoted to analyzing the effectiveness of methods of carrying out Nested PCR using blood smear, to a new method of getting DNA for nested PCR in diagnostics of malaria, to studying of new careotypes of people with Epstein Barr virus. This dissertation consists of the title-page, contents, introduction, review of the literature on the dissertation problems, review of used methods and materials, discussion of the results and conclusions and of the list of literature. It is stated that the usage of Nested PCR for diagnosing malaria in Moscow, taking into consideration a small amount of patients, is still useful. It was also shown that there is an interconnection between the results of Nested PCR and the quality of the blood smear. Moreover, the method of carrying out Nested PCR described in this dissertation proved to be more accurate that the method based on the blood smear. It is also noted that presence of Epstein Barr virus and malaria is not always enough for translocation processes in B-cells.

Key words: malaria, Nested PCR, translocations, method, diagnostics

Подписано в печать: 12.11.2013 Объём: 1 п. л. Тираж: 100 экз. Заказ № 219 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул. Бауманская, д. 33, стр. 1 +7(495)979-98-99, www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гринев, Александр Борисович, Москва

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«Первый Московский государственный медицинский

университет им. И.М. Сеченова» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 04201365803 На правах рукописи

УДК: 575.2+579.25

Гринев Александр Борисович

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МАЛЯРИИ:

ЭФФЕКТИВНОСТЬ И ВОЗМОЖНОСТИ ОПТИМИЗАЦИИ

03.02.07 (03.00.15) -генетика 03.02.03 — микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Академик РАО, доктор медицинских наук,

профессор

Чебышев Николай Васильевич

Доктор медицинских наук, профессор, заслуженный врач РФ Токмалаев Анатолий Карпович

МОСКВА 2013

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................................4

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................5

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................12

Глава 1. Современные проблемы диагностики малярии.........................12

1.1. Световая микроскопия...............................................................13

1.2. Диагностические экспресс - тесты для диагностики малярии..........14

1.3. ПЦР как метод точной диагностики малярии................................16

Глава.2. Эндемичная лимфома Беркитта как результат микст-инфекции вируса Эпштейн-Барр и Plasmodium falciparum....................................21

2.1. Вирус Эпштейн-Барр как кофактор в патогенезисе лимфомы Беркитта.23

2.2. Варианты воздействия Plasmodium falciparum на патогенез лимфомы Беркитта.........................................................................25

2.3. Генетические перестройки при эндемичной лимфоме Беркитта.........29

2.3.1. V (D) J рекомбинация............................................................30

2.3.2. Транслокация с - myc/IgH......................................................31

ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ...................................35

Глава 3. Материалы и методы исследования.......................................35

3.1. Материалы.............................................................................35

3.2. Реактивы и оборудование..........................................................37

3.3. Методы.................................................................................42

Глава 4. Характеристика завозной малярии в городе Москве в период 2010 -

2012 г.г........................................................................................57

4.1. Частота и видовая структура завоза малярии из разных эндемичных регионов мира..............................................................................57

4.2. Возрастная структура больных завозной малярией..........................66

Глава 5. Применение метода Nested PCR для диагностики малярии...........67

5.1. Применение Nested PCR с использованием в качестве источника ДНК препарата «толстая капля»...............................................................67

5.2. Применение Nested PCR с использованием в качестве источника ДНК эритроцитарного сгустка...............................................................72

5.3. Сравнительный анализ диагностической эффективности проведения Nested PCR по препарату «толстая капля» и эритроцитарному сгустку.. .77

Глава 6. Анализ на наличие / отсутствие транслокаций (8;14)(q24;q32) у

носителей малярийных паразитов и ЭБВ...........................................80

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................85

Выводы....................................................................................90

Практические рекомендации..........................................................90

Список используемой литературы...................................................91

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

DNA Star- DNASTAR Inc.

FISH- метод метафазного кариотипирования и флуоресцентной гибридизации

IgH - Immunoglobulin heavy chain LMP1 - Latent membrane protein 1 LPS - Bacteria llipopolysaccharide

NCBI- National Center for Biotechnology Information PBS - фосфатный буфер

Pfemp - Plasmodium falciparum eukaryotic membrane protein PCR - Polymerase chain reaction RPMI - Roswell Park Memorial Institute TP A - Tissue plasminogen activator

V (D) J рекомбинация - от названий участков, которые подвергаются реорганизации:V-variable, D- diversity, J-joining

ЛБ - лимфома Беркитта

ПЦР - полимеразная цепная реакция

рДНК - рибосономальная ДНК

ТАЕ буфер - трис-ацетатный буфер

ТЭС - телячья эмбриональная сыворотка

ЭБВ - вирус Эпштейн- Барр

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы диссертационного исследования

Малярия является одной из наиболее серьезных и трудноразрешимых проблем в странах с тропическим и субтропическим климатом [42]. Число больных зарегистрированных в 101 стране мира составляет 216 млн. (ВОЗ,2011), из них 81% - в странах Африки; умирает за год до 900 тыс. больных малярией, 91% из них также в странах Африки; 86% умерших от малярии в мире составляют дети до 5 лет. Наибольший процент летальных исходов - до 98% приходится на тропическую малярию, вызываемую Plasmodium falciparum.

В период проведения настоящего диссертационного исследования, по данным Федерального бюджетного учреждения здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве», было зарегистрировано 115 обращений с диагнозом малярия. При этом в 2010 году было зарегистрировано 48 обращений, в 2011 таких обращений было 32, а в 2012 году 35. Из этих данных следует, что, несмотря на тот факт, что количество обращений с диагнозом малярия в год не постоянно, оно, так или иначе, не опускается ниже определенного минимального уровня. В данных условиях проблемы ранней постановки точного диагноза и адекватного лечения выходят на первый план. Известно, что поздняя диагностика тропической малярии приводит тяжёлым клиническим последствиям - к развитию наиболее опасной - церебральной формы, инфекционно-токсическому шоку и других смертельных осложнений. Поздняя диагностика трёхдневной малярии ведёт к серьёзным эпидемиологическим последствиям - созданию условий для возникновения в городе случаев малярии вторичных от завозных.

В настоящее время существуют различные методики, направленные на выявление наличия малярийных паразитов в крови больного. Прежде всего,

это микроскопическое исследование мазка крови больного, которое является на сегодняшний день «золотым стандартом» диагностики в маляриологи [27,148]. Подобное исследование позволяет обнаружить паразитов в течение полутора-двух часов после забора крови, однако этот метод не лишен некоторых недостатков: относительно низкая эффективность при незначительном количестве паразитов в мазке крови или, если они присутствуют на пороге чувствительности метода, а также трудность дифференциальной диагностики вида паразита на стадии юного трофозоита.

Наряду с микроскопическим исследованием препаратов крови в настоящее время используются так называемые экспресс - тесты [35]. Это удобный и быстрый способ постановки диагноза, особенно в случаях отсутствия квалифицированной медицинской помощи. Однако и этот вид диагностического исследования имеет определенные ограничения в эффективности, так как экспресс-тесты пока разработаны не для всех видов паразитов и значительно уступают в чувствительности стандартным паразитологическим исследованиям препаратов крови.

В последние десятилетия в практику диагностики инфекционных болезней, в том числе и малярии, вошли высокоэффективные и чувствительные молекулярно-генетические методы на основе полимеразной цепной реакции (далее ПЦР). Источниками ДНК плазмодиев малярии для ПЦР могут служить: препарат «толстая капля», сгусток, образованный после центрифугирования цельной венозной крови, или кровь, собранная на бумажный фильтр.

Кроме того, представляют научный и практический интерес методы, позволяющие определить наличие генетических отклонений не только на молекулярно-биологическом уровне (метод ПЦР), а на цитогенетическом уровне. В этом плане важное место отводят методам метафазного

кариотипирования и флуоресцентной гибридизации in situ - FISH

(Fluorescence in situ hybridization). Последний метод превосходит первый в чувствительности и точности, следовательно - в адекватности диагностики.

Для качественного улучшения диагностики малярии в современных условиях, наряду с использованием стандартных методов постановки диагноза, актуальным становится разработка и внедрение в практику точных молекулярно-генетических и цитогенетических методов, что поможет значительно эффективнее решать существующие научные и практические проблемы маляриологии.

Цель исследования

Оптимизация проведения молекулярно-генетических методов диагностики малярии и анализ возможности генетических перестановок при микст-инфекции завозной малярии и вируса Эпштейн-Барр с помощью современных цитогенетических методов.

Задачи исследования

1) Изучение эффективности и совершенствование существующего метода проведения Nested PCR с препаратом «толстая капля» в качестве источника ДНК малярийного плазмодия.

2) Разработка и изучение возможности применения в практике диагностики малярии метода Nested PCR с эритроцитарным сгустком в качестве источника ДНК паразита.

3) Сравнительный анализ эффективности и трудозатратности при проведении Nested PCR с разными источниками ДНК малярийного плазмодия.

4) Выявление Эпштейн-Барр вирусной инфекции у больных малярией при помощи метода ПЦР.

5) Анализ кариотипа больного малярией на предмет наличия у него специфичных для лимфомы Беркитта генетических изменений (транслокаций).

Объект и предмет исследования.

Объектом исследования являлись граждане, больные завозной малярией, проходящие лечение в Городской клинической инфекционной Больнице №2 г. Москвы.

Предметом исследования являлись:

1) Кровь больного, взятая в виде препарата «толстая капля».

2) Венозная кровь больного, взятая в пробирке с этилендиаминтетрауксусной кислотой (далее ЭДТА) в качестве антикоагулянта.

3) Венозная кровь больного, взятая в пробирку с гепарином в качестве антикоагулянта.

4) Плазма больного в пробирке Эпендорф.

Теоретическая и методологическая основа исследования.

Теоретической основой для данного диссертационного исследования послужили публикации, в зарубежных и в российских научных периодических изданиях. Исходя из изучения данного материала, был сделан вывод о недостаточной изученности, поднимаемой диссертационным исследованием, проблематики на изучаемой территории.

В качестве методологической основы исследования были использованы как общенаучные методы, такие как эксперимент и анализ набранного

материала, так и специфические методы исследования: ПЦР, микроскопическая диагностика, FISH.

База исследования.

Информационной и методической базой для проведения исследования являлись:

1) Городская клиническая инфекционная больница №2 г. Москвы.

2) Федеральное бюджетное учреждение здравоохранения «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Москве».

3) Федеральное государственное бюджетное учреждение «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» Российской академии медицинских наук.

Научная новизна диссертационного исследования.

1) Показана высокая эффективность и специфичность метода ПЦР для диагностики малярии.

2) Впервые применён метод выделения ДНК паразита из эритроцитарного сгустка для постановки Nested ПЦР с целью диагностики малярии. Показана высокая эффективность и сравнительно незначительная трудозатратность при использования данного биосубстрата.

3) Впервые проведено исследование кариотипа Эпштейн-Барр вирус — позитивных больных завозной малярией на территории Москвы на наличие транслокаций, выявляемых при диагностике лимфомы Беркитта. Транслокаций, характерных для эндемичной лимфомы Беркитта, у больных завозной малярией и в группе контроля, не обнаружено.

Положения, выносимые на защиту.

1) Впервые в разработан метод выделения ДНК из эритроцитарного сгустка, образованного после центрифугирования крови больного, для проведения реакции ПЦР.

2) Установлено, что метод выделения ДНК из эритроцитарного сгустка превосходит метод выделения ДНК из препарата «толстая капля» в точности и достоверности результата.

3) Полученные результаты работы послужили основанием для внесения дополнения в методику диагностики малярии при помощи Nested PCR по препарату «толстая капля».

4) Продемонстрирована зависимость реакции Nested PCR от качества препарата «толстая капля».

5) Показано, что при наличии микст-инфекции вируса Эпштейн-Барр и завозной малярии, вызванной Plasmodium falciparum и другими видами малярийных паразитов, у больных, зарегистрированных в городе Москве, не наблюдались специфичные для данной микст-инфекции транслокации, характерные в эндемичных очагах малярии.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Метод Nsted PCR с эритроцитарным сгустком в качестве источника ДНК паразита, предложенный в данной работе, может быть внедрен в практическую диагностику малярии с целью улучшения точности и достоверности постановки диагноза. Полученная в результате проведенной работы информация может быть полезна для полноты понимания процессов происходящих в организме больного при сочетании двух патогенов -Эпштейн-Барр вируса герпеса человека и малярийных плазмодиев.

Результаты диссертационной работы нашли применение в учебном процессе на кафедре биологии и общей генетики ГОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава РФ» и кафедре инфекционных болезней с курсом эпидемиологии ФГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов». Предложенная модификация метода Nested PCR использовалась для уточнения видовой принадлежности в диагностике отдельных случаев завозной малярии в ИКБ 2. Апробация диссертации.

Апробация диссертации проведена на научной конференции кафедры биологии и общей генетики Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова ( июль 2013 г.).

Материалы диссертации были доложены на Первой молодежной научно-практической школы-конференции по естественным, техническим, медицинским наукам и биотехнологиям в Российском университете дружбы народов (июнь 2013 г.)

Публикации по теме диссертации.

По теме диссертации опубликовано 3 статьи, из них 2 в журналах, поименованных в перечне ВАК России.

Диссертация написана на 111 листах и состоит из титульного листа; оглавления; введения, отражающего цели и задачи исследования; обзора литературы по проблематике диссертации; обзора используемых материалов и методов; изложения оригинальных собственных материалов; выводов; обсуждения результатов; библиографического списка, составленного в соответствии с «ГОСТ Р 7.0.5 - 2008 - Библиографическая ссылка» и состоящего из 157 источников (в числе которых 44 российских и 133 иностранных); иллюстративного материала состоящего из 26 рисунков и 5 таблиц и списка сокращений.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Современные проблемы диагностики малярии.

Диагностика малярии как отрасль медицинского теоретического и практического знания является одним из приоритетных направлений во всей паразитологической диагностической практике. Существует множество публикаций, поднимающих и освещающих различные проблемы маляриологии, среди которых важное место занимают вопросы диагностики малярии, т.к. от корректного диагноза зависит адекватность оказываемого лечения, соответственно и прогноз исхода болезни [19,20,30]. Вопрос корректной и быстрой диагностики стоит наиболее остро в случаях, когда у больного предполагается диагноз «тропическая малярия», вызываемая Plasmodium falciparum [48,52,59]. Это связанно, прежде всего, с тем, что именно при тропической малярии развиваются наиболее тяжелые и злокачественные формы болезни: например церебральная форма малярии, нередко являющаяся причиной смерти больного [30,148].

Современная диагностическая практика имеет множество методов, позволяющих с большей или меньшей скоростью и точностью определить вид возбудителя, вызвавшего у пациента малярию. В рамках данной работы будут рассмотрены наиболее важные, используемые в практической медицине: микроскопическое исследование толстой капли и мазка крови больного на стекле, методы диагностики при помощи экспресс - тестов и методы диагностики малярии, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.1. Световая микроскопия.

На сегодняшний день световая микроскопия остается «золотым стандартом» лабораторной диагностики малярии[148]. Этот метод, успешно применяющийся на протяжении длительного времени, обоснованно считался основным и, по мнению многих авторов, таковым может надолго остаться в практике маляриологических исследований, даже несмотря на разработку и внедрение новых альтернативных методов диагностики [119]. Согласно методическим указаниям по паразитологической диагностике малярии, подготовленным и изданным Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского Первого Московского государственного медицинского университета им.И.М Сеченова, целью исследования препаратов крови является обнаружение бесполых и половых форм возбудителя. Для этого используют препараты крови, приготовленные методом «тонкого мазка» и «толстой капли», окрашенные в соответствии с методикой Романовского-Гимза. Микроскопическое изучение препарата «толстая капля» является основным методом, т.к. он позволяет обнаружить малярийных плазмодиев, в том числе и при низкой паразитемии, что достигается большим, по сравнению с «тонким мазком», �