Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологические основы контроля вирусных гепатитов
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологические основы контроля вирусных гепатитов"
005055733
На правах рукописи
Кюрегян Карен Каренович
Молекулярно-биологические основы контроля вирусных гепатитов
03.02:02. - Вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
2 9 НОЯ 2012
Москва 2012 г.
005055733
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» Российской академии медицинских наук
Научный консультант: член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
академик РАМН,
доктор биологических наук,
профессор
член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор
доктор биологических наук, доцент
Михайлов Михаил Иванович
Зверев Виталий Васильевич
Шахгильдян Иосиф Васильевич Карганова Галина Григорьевна
Ведущая организация
ФГУН «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора
¿/О Са г^^
Защита состоится 21 декабря 2012 г. на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 в ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова» РАМН по адресу: 142782, г.Москва, поселение Московский, пос. Институт полиомиелита
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова» РАМН
Автореферат разослан «19» ноября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Генетическое разнообразие является одним из важнейших факторов, определяющим особенности циркуляции вирусов, в том числе гепатотропных. Инфекции, вызываемые вирусами гепатита А, гепатита В и гепатита С, являются социально-значимыми в силу их широкого распространения и тяжести ассоциированного заболевания. Значимость инфекций, вызываемых вирусами гепатита дельта и вируса гепатита Е, возросла в последние годы с накоплением данных об их распространенности за пределами гиперэндемичных регионов и увеличении доли этих инфекций в структуре вирусных гепатитов. Само понятие «вирусные гепатиты» сегодня еще более сложное, чем 10 - 15 лет назад. Накапливаются сведения о влиянии гетерогенности популяций возбудителей вирусных гепатитов на развитие инфекционного и эпидемического процессов заболеваний, которые они вызывают. Применение методологического и аналитического арсенала молекулярной биологии и эпидемиологии способствует развитию понимания закономерностей циркуляции вирусов, вызывающих гепатит, и позволяет оптимизировать систему контроля этих инфекций.
Новые данные о циркуляции и генетическом разнообразии гепатотропных вирусов, полученные с помощью молекулярно-биологических методов и приемов молекулярной эпидемиологии, значительно расширяют возможности контроля вирусных гепатитов и переводят его из разряда эмпирических действий в систему, базирующуюся на знании биологических закономерностей. Так, в случае гепатита В (ГВ) на данных молекулярной диагностики базируется изучение скрытой НВзА£-негативной формы инфекции и лекарственной устойчивости вируса гепатита В (ВГВ), генотипического разнообразия и рекомбинантных форм вируса гепатита С (ВГС). Понимание заложенных в геноме вируса способов избегать негативного влияния, и, как следствие, сохранения возбудителя как биологического вида, является основой диагностики и персонифицированной терапии вирусных гепатитов.
Другим важным аспектом контроля вирусных гепатитов является надзор за инфекциями и их регистрация. Две инфекции - гепатит дельта (ГО) и гепатит Е (ГЕ) не регистрируются в Российской Федерации (РФ) как самостоятельные нозологические формы. Сведения о циркуляции вирусов ГО и ГЕ и их генетическом разнообразии на
территории РФ представляют ценность как для теоретической вирусологии, поскольку расширяют современные представления об эпидемиологии данных инфекций, так и для практического здравоохранения, так как помогают выявить группы риска и потенциальные источники инфицирования, а также указывают на необходимость внедрения и расширения диагностики ГО и ГЕ.
Полноценный эпидемиологический анализ, направленный на выявление источников и путей передачи инфекции, не возможен без анализа нуклеотидных последовательностей возбудителя. В РФ в силу большего числа случаев заболевания, географической удаленности и небольшого числа центров, способных проводить подобный анализ, оперативное применение методов молекулярной эпидемиологии при расследовании случаев гепатита А (ГА) является скорее исключением, чем правилом. Очевидно, что успешный контроль данной инфекции возможен только при создании обширной базы данных последовательностей вируса гепатита А (ВГА), циркулирующих на территории РФ, и включении молекулярных методов в систему эпидемиологического анализа случаев ГА.
Изучение многих аспектов вирусных гепатитов человека - оценки эффективности вакцинных и терапевтических препаратов, дезинфектантов, инфекционных свойств агентов, - невозможно без моделирования инфекции на животных. Альтернативой недоступной в настоящее время модели ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных является применение суррогатных моделей животных, например, инфекции игрунковых обезьян (тамаринов и мармозет), вызываемой вирусом ОВУ-В. Для ГВ удобной суррогатной моделью является инфекция, вызываемая вирусом гепатита В уток (ВГВУ). Молекулярно-биологические методы позволяют детально охарактеризовать модельные инфекции и оценить возможности их применения в системе контроля вирусных гепатитов.
Цель и задачи исследования
Цель работы - разработка комплекса мер по оптимизации системы контроля вирусных гепатитов, основанного на молекулярной диагностике и эпидемиологии данных инфекций.
Для достижения выбранной цели были поставлены и решены следующие задачи: 1. Определить распространенность скрытой ВГВ-инфекции в Российской Федерации, оценить ее значимость с точки зрения диагностики гепатита В и изучить
роль мутаций, связанных с «иммунологическим бегством», в развитии скрытой ВГВ-инфекции.
2. Провести сравнительные испытания различных тест-систем для детекции HBsAg и оценить их чувствительность при выявлении мутантных вариантов вируса гепатита В.
3. Изучить распространенность первичной лекарственной устойчивости вируса гепатита В на основании анализа частоты выявления и спектра связанных с лекарственной резистентностью мутаций в гене полимеразы вируса гепатита В у пациентов, не получавших терапию аналогами нуклеоз(т)идов.
4. Разработать систему оценки эффективности вирусной инактивации и дезинфекции с помощью модели in vivo инфекции вируса гепатита В уток.
5. Определить распространенность маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения Российской Федерации и проанализировать случаи хронического гепатита дельта в гиперэндемичном по гепатиту В регионе Российской Федерации (на примере Республики Тыва):
• Определить частоту выявления апги-ВГО и РНК BrD среди HBsAg-положительных лиц, выявленных при обследовании условно-здорового населения шести регионов Российской Федерации с различной интенсивностью циркуляции ВГВ (Московской, Свердловской, Ростовской областей, Республики Саха (Якутия), Республики Тыва, Хабаровского края);
• Изучить генотипическое разнообразие вируса гепатита дельта, циркулирующего в Республике Тыва, определить частоту коинфекции ВГВ/ВГО и клинические исходы данной коинфекции в динамическом наблюдении.
6. Изучить структуру генотипов вируса гепатита С, циркулирующего на территории Российской Федерации, и ее изменения на протяжении последних пяти лет (20072011гг.).
7. Выявить и охарактеризовать случаи межгенотипической рекомбинации вируса гепатита С.
8. Разработать суррогатную модель ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных, основанную на экспериментальном заражении игрунковых обезьян (мармозета обыкновенная, Callithrix jacchus) вирусом GBV-B, и оценить возможности применения данной модели для оценки эффективности подходов к созданию прототипной вакцины против гепатита С:
• Воспроизвести экспериментальную инфекцию GBV-B на мелких приматах (мармозета обыкновенная, Callithrix jacchus) и определить основные характеристики модельной инфекции у данного вида животных (продолжительность виремии, клинические проявления, эволюция возбудителя на протяжении инфекции);
• Создать прототипный вакцинный препарат против GBV-B-инфекции на основе химерных вирусоподобных частиц, несущих В- и Т-клеточные эпитопы капсидного белка GBV-B, встроенные в носитель (капсидный белок вируса гепатита В);
• Оценить иммуногенные и протективные свойства полученного препарата в эксперименте in vivo на игрунковых обезьянах.
9. Усовершенствовать алгоритм расшифровки вспышек гепатита А с применением молекулярно-эпидемиологического анализа, включающего выявление РНК вируса гепатита А в объектах внешней среды и сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вирусов, выделенных от заболевших и из потенциальных факторов инфицирования (объектов среды).
10. Изучить интенсивность циркуляции вируса гепатита Е на территории Российской Федерации:
• Определить частоту выявления антител к вирусу гепатита Е среди условно здорового населения шести географически удаленных регионов Российской Федерации (Московской, Свердловской, Ростовской областей, Республики Саха (Якутия), Республики Тыва, Хабаровского края);
• Выявить и охарактеризовать случаи спорадической и групповой заболеваемости ГЕ в РФ;
• Определить распространенность вируса гепатита Е среди свиней в РФ и проанализировать генетические варианты вируса, выделенные от людей и животных.
Научная новизна
На основании новых данных по молекулярной биологии и эпидемиологии вирусных гепатитов разработан комплекс мер по усовершенствованию диагностики, профилактики и надзора за этими инфекциями.
Впервые проведен анализ распространенности скрытой HBsAg-нeгaтивнoй ВГВ-инфекции среди различных когорт, относящихся к условно-здоровому населению и к группам риска инфицирования ВГВ. Впервые установлено, что частота обнаружения скрытой ВГВ-инфекции определяется чувствительностью тестов, применяемых для выявления HBsAg. С помощью серологических и молекулярных тестов доказано, что применение даже самых чувствительных на сегодня методов детекции HBsAg не позволяет выявлять все случаи ВГВ-инфекции. Впервые проведен анализ нуклеотидных последовательностей генома ВГВ, выделенных от случаев скрытой инфекции на территории РФ. Полученные результаты продемонстрировали, что основной причиной развития скрытой формы ВГВ-инфекции является не наличие мутаций в а-детерминанте HBsAg, а низкий уровень вирусной репликации и продукции HBsAg.
Впервые получены данные о распространенности мутаций в геноме ВГВ, связанных с первичной лекарственной устойчивостью вируса. Показано, что доля случаев первичной лекарственной резистентности достигает 6,2% среди пациентов с ВГВ-моноинфекцией и 10,0% - среди пациентов с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией. Проведенный впервые анализ распространенности лекарственной резистентности ВГВ в разных регионах РФ указывает на вероятность потенциального увеличения доли резистентных штаммов ВГВ в общей популяции в результате длительного применения антивирусных агентов прямого действия.
Впервые получены данные о распространенности на территории РФ инфекции ВГВ уток (ВГВУ). Описан первый отечественный штамм ВГВУ, депонированный под названием «Уфа-04» во Всероссийском государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ ВГНКИ). Проведенные исследования позволили воспроизвести и внедрить в систему оценки вирусной инактивации лабораторную модель ВГВУ-инфекции, являющейся суррогатной моделью инфекции ВГВ человека.
Впервые получены данные о распространенности маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения регионов РФ, различающихся по заболеваемости гепатитом В. Данные по частоте выявления анти-ВГО среди детей в возрасте до 10 лет являются первым документированным свидетельством защиты с помощью вакцинации против гепатита В от инфицирования ВГО.
На основании результатов пятилетнего наблюдения за структурой генотипов ВГС впервые показано увеличение доли генотипа 1а в общей структуре генотипов. Получены новые данные о циркуляции рекомбинантного варианта ВГС КК 2к/1 Ь; установлено, что все известные в настоящее время изоляты ВГС 2к/1Ь, по-видимому, являются потомками одного события рекомбинации.
Впервые воспроизведена инфекция ОВУ-В на обыкновенных мармозетах (|СаНИгЬсуасс1гия) и определены основные характеристики модельной инфекции ОВУ-В у данного вида животных - продолжительность виремии, клинические проявления, эволюция возбудителя на протяжении инфекции. Впервые разработана прототипная вакцина против модельной инфекции ОВУ-В, основанная на вирусоподобных частицах ВГВ, несущих В- и Т-клеточные эпитопы ОВУ-В, для оценки возможности применения данного подхода к созданию вакцины против гепатита С. Несмотря на недостаточные протективные свойства созданного вакцинного препарата, результаты эксперимента впервые продемонстрировали, что ОВУ-В-инфекция является ценной моделью для оценки перспективности различных подходов к созданию вакцины против гепатита С.
Впервые определена возрастная иммуноструктура вируса гепатита Е (ВГЕ) на территории Российской Федерации, выявлены возрастные группы и регионы, в которых анти-ВГЕ встречаются наиболее часто. Данные о выявлении анти-ВГЕ ^М среди условно-здорового населения являются первым прямым свидетельством о преимущественно бессимптомном протекании ВГЕ-инфекции в неэндемичных регионах. Получены новые данные о циркуляции ВГЕ среди свиней - установлено, что на большинстве обследованных свиноферм в РФ присутствует ВГЕ-инфекция, которая выявляется преимущественно у животных в возрасте 2-4 месяцев. Впервые получены данные о генотипическом разнообразии ВГЕ в регионе, установлено, что выделенные на территории РФ от людей и животных изоляты вируса принадлежат генотипу 3. Впервые продемонстрировано существование специфичных для каждого региона РФ вариантов ВГЕ.
Выявленные случаи спорадической и групповой заболеваемости гепатитом Е на неэндемичных по данной инфекции территориях, данные об интенсивной циркуляции ВГЕ среди свиней и о широкой распространенности пост-инфекционных антител к ВГЕ среди населения РФ позволяют пересмотреть существующие взгляды на эпидемиологию гепатита Е на неэндемичных территориях.
Практическая значимость
Применение молекулярно-биологического подхода позволило расшифровать крупную вспышку гепатита А в Москве и Московской области, произошедшую в 2010г. Продемонстрировано преимущество методов преданалитической подготовки образцов воды с высоким фактором концентрирования для проведения поиска ВГА в образцах воды и смывах с объектов внешней среды при расшифровке вспышек гепатита А.
Установлено, что именно чувствительность ИФА-тестов для выявления HBsAg, а также включение в список мишеней этих тестов мутантных форм является ключевым моментом при диагностике ВГВ-инфекции. Тем не менее, продемонстрировано существование случаев скрытой инфекции, несмотря на применение для определения HBsAg высокочувствительных тестов, позволяющих выявлять основные мутации, связанные с «иммунным бегством». Эти данные указывают на важность скрининга донорской крови не только на HBsAg, но и на ДНК ВГВ для максимального снижения риска посттрансфузионного гепатита В.
Доказана необходимость проведения аттестации диагностикумов для определения HBsAg с помощью панелей нативных образцов, поскольку применение рекомбинантных антигенов для этой цели менее информативно.
Полученные данные об относительно широком распространении первичной лекарственной устойчивости ВГВ позволяют рекомендовать проведение анализа на наличие лекарственной резистентности для пациентов с ХГВ до начала проведения терапии. Такой анализ обеспечит адекватный подбор препарата НОТ и позволит избежать применения заведомо неактивного противовирусного препарата.
Разработана система оценки эффективности вирус-инактивирующих препаратов, направленных против ВГВ, основанная на моделировании in vivo инфекции вируса гепатита В уток. Данная система валидирована для проведения испытаний дезинфицирующих препаратов, а также агентов для вирусной инактивации в службе крови, и включена в Методические указания по изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств 3.5.2431-08.
Продемонстрирована необходимость обязательного скрининга на антитела к ВГО всех лиц, положительных по HBsAg, а также регистрации гепатита дельта как отдельной нозологической формы в системе Государственного статистического наблюдения.
Установлено, что для рутинного генотипирования ВГС оптимальными с точки зрения чувствительности и специфичности являются системы генотипирования, мишенью которых является область core генома ВГС.
Разработана и успешно апробирована экспериментальная GBV-B инфекция у обыкновенных мармозет (Callitrix jaccus). Опыт применения данной суррогатной модели ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных продемонстрировал, что она является удобным инструментом для оценки перспективности различных подходов к созданию вакцины против ГС.
Установлена необходимость включения диагностики гепатита Е в систему дифференциальной лабораторной диагностики гепатитов на территории Российской Федерации. Создана рабочая коллекция изолятов ВГЕ, выделенных на территории Российской Федерации. Собранная коллекция изолятов ВГЕ может применяться для проведения эпидемиологического анализа случаев гепатита Е и при разработке вакцины против этой инфекции.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработан комплекс мер по оптимизации системы контроля вирусных гепатитов, основанный на применении новых технологий диагностики, изучения генетической изменчивости вирусов и разработки биологических моделей этих инфекций.
2. Существование случаев скрытой HBsAg-негативной инфекции, распространенность которой достигает 2% даже при применении тестов для определения HBsAg с чувствительностью 0,01 нг/мл, указывает на необходимость внедрения одновременного определения ДНК ВГВ и HBsAg для диагностики гепатита В. Основной причиной развития скрытой формы ВГВ-инфекции является не наличие мутаций в а-детерминанте HBsAg, а низкий уровень вирусной репликации и продукции HBsAg.
3. Первичная лекарственная устойчивость ВГВ - относительно широко распространенное явление, в связи с этим представляется целесообразным проведение скрининга на лекарственную устойчивость ВГВ до начала противовирусной терапии для выбора адекватного препарата. Анализ первичной лекарственной устойчивости в регионах РФ позволяет прогнозировать увеличение доли резистентных штаммов.
4. Экспериментальная инфекция ВГВ уток (ВГВУ) in vivo, являющаяся суррогатной моделью ВГВ-инфекции человека, является оптимальным инструментом для оценки
эффективности противовирусных препаратов разных классов, направленных на инактивацию ВГВ.
5. Необходимо введение официальной регистрации гепатита дельта как самостоятельной нозологической формы и обязательного тестирования всех позитивных по HBsAg лиц на маркеры BrD (анти-BrD, РНК ВГО) для максимально ранней диагностики этой прогностически неблагоприятной инфекции. Вакцинации новорожденных против гепатита В обеспечивает эффективную защиту от инфицирования BrD.
6. В Московском регионе наблюдается тенденция к увеличению доли генотипа 1а в структуре генотипов ВГС, при этом соотношение других генотипов вируса остается стабильным.
7. Рекомбинантная формы ВГС RF_2k/lb возникла в результате одного события рекомбинации и является устойчивой конкурентоспособной формой, циркулирующей среди инъекционных наркоманов.
8. Суррогатная модель ВГС-инфекции, основанная на экспериментальном заражении игрунковых обезьян (мармозет обыкновенных, Callithrix jaccus) вирусом GBV-B, является удобным инструментом для оценки перспективности подходов к созданию вакцины против гепатита С.
9. Выявление вирусного генетического материала в объектах внешней среды и филогенетический анализ геномных последовательностей ВГА, выделенных от заболевших и из объектов среды, должны быть включены в систему надзора за гепатитом А.
10. Значительная доля населения страны сталкивается на протяжении жизни с ВГЕ, при этом зачастую инфекция протекает бессимптомно, однако на негиперэндемичных по ГЕ территориях возможны автохтонные случаи как спорадической, так и групповой заболеваемости. Все автохтонные случаи ГЕ вызваны 3 генотипом ВГЕ.
11. ВГЕ распространен среди домашних свиней в РФ повсеместно, преимущественно инфицированы животные в возрасте 2-4 месяца, не достигшие возраста забоя. Для каждого региона РФ существуют, в рамках 3 генотипа вируса, специфичные варианты ВГЕ.
Апробация работы
Основные положения и фрагменты диссертации представлялись на 6 международных и 11 российских конференциях, конгрессах и симпозиумах: V
Российская научно-практическая конференция «Гепатит В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2003); 1 Ith International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses (Heidelberg, Germany, 2004); VI научно-практический симпозиум «Клиническая лабораторная диагностика» (Москва, 2005); 12th International Viral Symposium on Viral Hepatitis and Liver Diseases (Paris, 2006); VII Российская научно-практическая конференция «Гепатит В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2007); 15th International Symposium on Hepatitis С Virus and Related Viruses (San Antonio, USA, 2008); 13th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (Washington, USA, 2009); 16-ая Российская гастроэнтерологическая неделя (Москва, 2010г.); EASL Monothematic Conference: Delta Hepatitis (Istanbul, Turkey, 2010); 16-й Конгресс «Гепатология сегодня» (Москва, 2011); Вторая международная конференция «Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской приматологии» (Сочи-Адлер, 2011); 17-ая Российская гастроэнтерологическая неделя (Москва, 2011г.); IX Российская научно-практическая конференция «Гепатит В, С и Д - проблемы диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2011); 13-ый Международный Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург - Гастро-2011» (Санкт-Петербург, 2011); 17-й Конгресс «Гепатология сегодня» (Москва, 2012); Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012); 14th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease (Shanghai, China, 2012).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 27 работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК - 12.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов, иллюстрирована 63 таблицами и 46 рисунками. Библиография включает 439 источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Все исследования были проведены в отделе вирусных гепатитов ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова» РАМН. В исследование
были включены пациенты с хроническими вирусными гепатитами различной этиологии, лица с повышенным риском инфицирования гемотрансмиссивными инфекциями, также условно-здоровое население Российской Федерации (таблица 1). От всех лиц были получены образцы сыворотки крови и подписанное информированное согласие.
Таблица 1
Обследованные группы
Группа Регион проживания Количество обследованных
Пациенты с вирусными гепатитами
Пациенты с острым гепатитом А Москва 110
Пациенты с хроническим гепатитом В Москва, Тамбов, Саратов, Якутия, Тыва 273
Пациенты с хроническим гепатитом О Тыва 102
Пациенты с хроническим гепатитом С Москва 2 557
Пациенты с гепатитом Е Владимирская область 15
Группы повышенного риска инфицирования ВГВ
Медицинские работники 532
Инфицированные ВИЧ потребители инъекционных наркотиков Московская, Свердловская, Тамбовская, Саратовская области, Республика Якутия 837
Пациенты с хроническим гепатитом различной этиологии Московская, Свердловская, Тамбовская, Саратовская области, Республики Тыва и Якутия 309
Жители региона, гиперэндемичного по гепатиту В Республика Тыва 542
Условно-здоровое население РФ
Первичные доноры крови Московская, Свердловская, Тамбовская области, Республики Тыва и Якутия 3 232
Беременные женщины Московская обл. 500
Здоровых лиц 10 возрастных групп (< 1 года, 1 - 4 года, 5-9 лет, 10 - 14 лет, 15 -19 лет, 20 - 29 лет, 30 -39 лет, 40 - 49 лет, 50 - 59 лет и старше 60 лет), в каждой группе не менее 100 человек Московская, Ростовская, Свердловская области, Хабаровский край, Республики Тыва и Якутия 6 238
Общее количество обследованных 15 247
Помимо клинических образцов, полученных от людей, в ходе работы были исследованы образцы объектов внешней среды, а также биологический материал, полученный от животных. Для определения распространенности вируса гепатита В уток (ВГВУ) среди поголовья домашней утки были исследованы образцы сыворотки крови,
полученные от 56 взрослых птиц на ферме в поселке Малая Дубна (Московская область) и 327 трехдневных утят на ферме в поселке Благовары (г.Уфа). В образцах крови определяли ДНК ВГВУ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Изучение циркуляции ВГЕ среди свиней было основано на определении РНК ВГЕ в образцах фекалий, собранных от домашних свиней на 17 свинофермах в 6 регионах РФ. Всего были собраны и протестированы на РНК ВГЕ 1566 образцов фекалий свиней из Калининградской, Архангельской, Владимирской, Саратовской, Свердловской областей и Хабаровского края.
Определение РНК ВГА проводили в образцах воды при расследовании вспышки ГА в г. Москве в 2010г. Исследовали пять образцов воды, взятых из источников водоснабжения в цехе производства готовой пищевой продукции и в открытых водоемах Московской области (пос. Павельцево).
Во всех образцах сыворотки крови определяли серологические маркеры вирусных гепатитов с помощью сертифицированных тест-систем иммуно-ферментного анализа (ИФА) и нуклеиновые кислоты гепатотропных вирусов (ВГА, ВГВ, ВГС, BTD и ВГЕ) методом ПЦР или совмещенной с обратной транскрипцией ПЦР (ОТ-ПЦР) с праймерами к наиболее консервативным участкам вирусных геномов.
Для всех выделенных в данном исследовании вирусных изолятов проводили определение первичной нуклеотидной последовательности участков генома, наиболее репрезентативных с точки зрения генотипирования вируса и проведения филогенетического анализа. Перечень такие участков-мишеней с указанием величины и локализации в вирусном геноме приведен для каждого из анализировавшихся вирусов в таблице 2. Определение нуклеотидной последовательности анализируемых фрагментов вирусных геномов проводили методом прямого секвенирования ампликонов. Полученные нуклеотидные последовательности фрагментов вирусных геномов выравнивали друг с другом и с соответствующими им участками полных и частичных геномных последовательностей анализируемых вирусов, доступными в GenBank на момент проведения исследования, с помощью программы MEGA (версия 4.0). Поскольку для анализа (генотипирование выделенных изолятов, поиск мутаций в анализируемых регионах вирусного генома) использовались участки последовательностей, кодирующих вирусные белки, выравнивание этих участков вирусных геномов проводили в соответствии с рамкой трансляции. В качестве
референсных последовательностей для филогенетического анализа были использованы полные и частичные геномные последовательности, депонированные в базе данных GenBank. Филогенетические деревья строили по алгоритму объединения ближайших соседей (neighbour-joining, NJ) при помощи программы MEGA 4.0 и MEGA 4.1.
Таблица 2
Участки вирусных геномов, на основании нуклеотидной последовательности которых проводили генотипирование вирусов и филогенетический анализ
Вирус Участок Величина Позиция в Штамм, по которому
генома анализируемого вирусном приведена нумерация
фрагмента геноме нуклеотидных позиции (номер в базе данных GenBank)
ВГА VP 1/2 А 330 нт 2915-3245 НМ175 (М59809)
ВГВ S/P 676 нт 147-822 gD consensus (DM059405)
ВГС Core 271 нт 461-731 H77 (AF009606)
NS5B 340 нт 8276-8615 H77 (AF009606)
BrD R0 352 нт 909-1260 Miyako (AF309420)
ВГЕ ORF2 304 нт 5994-6297 Burma (M73218)
В данном исследовании были разработаны и апробированы две экспериментальных модели, являющихся суррогатными моделями инфекций, вызываемых ВГВ и ВГС. В качестве модели in vivo ВГС-инфекции была воспроизведена инфекция GBV-C на игрунковых обезьянах (Callithrix jaccus). В качестве инокулума GBV-B использовали пул сывороток инфицированного GBV-B тамарина (Sanguinus mystax), отобранных в острую фазу инфекции, любезно предоставленный доктором Jens Bukh (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, США). У зараженных внутривенно животных в течение 35 недель проводили мониторинг виремии GBV-B и уровней активности трансаминаз. С помощью разработанной суррогатной модели ВГС-инфекции на мелких приматах были приведены испытания протективных свойств химерных вирусоподобных частиц HBc/GBV-Bcore, представляющих собой кандидатную вакцину против модельной инфекции GBV-B. Химерные вирусоподобные частицы были получены нами путем встраивания участка капсидного белка модельного вируса GBV-B в капсидный белок ВГВ, выступавший в качестве носителя инородного эпитопа. Полученный рекомбинантный химерный белок экспрессировали в клетках Е. coli линии RR1 и очищали сначала в градиенте сахарозы, а затем с помощью гель-хроматографии.
Полученные вирусоподобные частицы использовали для иммунизации игрунковых обезьян с последующим заражением GBV-B.
В качестве суррогатной модели ВГВ была воспроизведена in vivo экспериментальная инфекция ВГВУ на трехдневных утятах. Заражение проводили внутрибрюшинно, вводя каждому животному одноразовым шприцом по 200 мкл инокулума, содержащего 5 log10 Ш50уток в 1 мл. Утки наблюдались в течение 3 недель, по истечении которых у птиц проводили забор крови из яремной вены и определение ДНК ВГВУ в образцах сыворотки крови. Разработанная суррогатная модель ВГВ была валидирована при проведении испытаний вирулицидной активности дезинфицирующих препаратов на основе четвертичных аммониевых соединений (ЧАС), а также испытаний вирусной инактивации в препаратах плазмы донорской крови двумя химическими агентами - метиленовым синим и смесью трибутилфосфата и холата натрия (сольвент-детергентная смесь).
Полученные в работе результаты подвергали статистической обработке по общепринятым методикам с использованием вариационной статистики с помощью стандартной программы EXCEL 2003 и программы статистической обработки данных GraphPadPism 4. Статистическая обработка данных включала: определение средних величин показателей (М); вычисление значений квадратичного отклонения (SD); выявление достоверности различий средних значений показателей в сравниваемых группах с использованием критерия Фишера и х2-квадрата с поправкой Йетса (различия оценивались как достоверные при вероятности 95%, р <0,05). Результаты исследований и их обсуждение
1. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита В 1.1 Распространенность скрытой ВГВ-инфекции
Диагностика ГВ является важнейшим методом контроля гепатита В, поскольку позволяет не только выявлять людей, нуждающихся в терапии, но и определять потенциальные источники инфекции и предотвращать передачу ВГВ при переливаниях крови или в условиях медицинского стационара. Поскольку рутинная диагностика ВГВ строится на выявлении HBsAg в образцах сыворотки крови, важной задачей является определение распространенности скрытой HBsAg-негативной инфекции и анализ ее значимости для диагностики ГВ. До начала наших исследований данные о
распространенности этой формы ВГВ-инфекции в РФ отсутствовали, хотя анализ литературы указывает на повсеместный характер ее распространения.
На первом этапе исследования для исключения HBsAg-пoлoжитeльныx случаев в группе пациентов с заболеваниями печени различной этиологии применялся тест на HBsAg с чувствительностью 0,1 нг/мл, такие тест-системы и в настоящее время применяются в рутинной диагностике ГВ. После исключения HBsAg-пoзитивныx случаев скрытая ВГВ-инфекция была обнаружена более чем у половины (52,5%) пациентов с «изолированными» анти-НВс, свидетельствующими о встрече организма с ВГВ. То есть среди лиц с заболеванием печени и серологическим свидетельством контакта с ВГВ рутинный тест на HBsAg «пропустил» инфекцию в половине случаев.
Полученные первые данные о столь широком распространении скрытой ВГВ-инфекции в РФ послужили основанием для расширения поиска этой формы инфекции с применением новых тест-систем для выявления HBsAg с чувствительностью 0,01 нг/мл (второй этап исследования). Кроме того, обследование нескольких групп населения (жителей Республики Тыва, пациентов с хроническим гепатитом различной этиологии) проводили с новыми диагностикумами на HBsAg, которые, помимо заявленной чувствительности 0,01 нг/мл, были способны выявлять ряд мутантных форм ВГВ, несущих замены в а-детерминанте (третий этап исследования). Таким образом, для выявления инфекции со стандартным серологическим профилем применяли в 10 раз более чувствительные тесты, поэтому в соответствии с рабочей гипотезой значительное количество потенциальных случаев скрытой инфекции могли быть определены как положительные по HBsAg случаи при повышении чувствительности анализа.
Было установлено, что скрытая ВГВ-инфекция достоверно чаще обнаруживается среди инъекционных наркоманов и в других группах риска по сравнению с первичными донорами крови. Таким образом, группы риска инфицирования ВГВ являются и группами риска присутствия скрытой ВГВ-инфекции, что, по-видимому, определяется большей вероятностью встречи с вирусом, которая может закончиться, наряду с другими исходами острого гепатита, и формированием скрытой инфекции.
В результате применения более чувствительных тест-систем для определения случаев ВГВ-инфекции со стандартным серологическим профилем, частота выявления скрытой ВГВ-инфекции снизилась в десятки раз (1,67%-2,0% против 52,5%) даже в
группах риска по сравнению с результатами первого этапа исследования, где для этой же цели применялась тест-система с чувствительностью 0,1 нг/мл (таблица 3).
Таким образом, в результате повышения чувствительности выявления HBsAg в 10 раз и включения в спектр мишеней тестов ряда мутантных форм НВзА§, значимость скрытой ВГВ-инфекции как диагностической проблемы значительно снижается, однако не исчезает полностью. Полученные данные указывают на сохранение значения скрытой инфекции для службы крови и указывают на важность внедрения молекулярных тестов для выявления ДНК ВГВ в донорской крови.
Таблица 3
Частота выявления скрытой ВГВ-инфекции в обследованных контингентах_
Этап исследования Чувствительность применявшихся для выявления HBsAg тест-систем ИФА Обследованные контингенты Частота выявления скрытой ВГВ-инфекции
1 0,1 нг/мл Пациенты с ХЗП* различной этиологии 52,5%
2 0,01 нг/мл Доноры крови 0,31%
Медицинские работники 0,56%
Инъекционные наркоманы 1,67%
3 0,01 нг/мл + мутантные формы HBsAg Условно здоровое население гиперэндемичного по ГВ региона (Республика Тыва) 0,42 %
Пациенты с ХГС 0
Пациенты с ХЗП различной этиологии 2%
* ХЗП - хронические заболевания печени
Необходимо отметить, что при исследовании образцов сыворотки крови, положительных по HBsAg, в некоторых случаях не удавалось выявить ДНК ВГВ, то есть встречался серологический профиль, противоположный наблюдаемому при скрытой инфекции. С подобным явлением сталкивались и другие исследователи (У с( а1., 2008) при проведении аналогичных популяционных исследований распространенности скрытой ВГВ-инфекции. Разнообразие форм ВГВ-инфекции и способов вируса сохраняться в гепатоците (включая образование ковалентно замкнутой кольцевой ДНК и интеграцию в геном клетки) определяет разнообразие сочетаний маркеров инфекции. Таким образом, для достижения максимальной чувствительности выявления ВГВ-инфекции с помощью существующих в настоящее время методов, определение HBsAg и
ДНК ВГВ должно проводиться одновременно, то есть один тест не исключает, а дополняет другой.
Помимо простой констатации факта существования скрытой ВГВ-инфекции и анализа ее распространенности в разных группах населения, важно понимать причины этого явления. Мутации в a-детерминанте, способные приводить к ее конформационным изменениям, и как следствие, к «иммунологическому бегству», были выявлены только в одном случае скрытой ВГВ-инфекции. Выявленная замена (Т118А) была описана ранее как вариант, избегающий связывания специфичными иммуноглобулинами (Carman, 1997), поэтому такой белок мог не связываться антителами, применяющимися в тест-системах для выявления HBsAg. Еще в одном случае скрытой ВГВ-инфекции был выявлен изолят, имеющий серотип aywl, не характерный для РФ. По паспорту применявшейся для выявления HBsAg тест-системы такой серотип должен выявляться, однако можно предположить, что при низкой концентрации антигена в образце его выявление будет неоптимальным. В этом образце, как и во всех остальных, полученных от лиц со скрытой ВГВ-инфекцией (за исключением мутантного изолята с заменой Т118А), вирусная нагрузка была низкой, менее 1000 копий/мл. По-видимому, с низкой активностью репликации ВГВ связан невысокий уровень продукции HBsAg, и как следствие, его низкая концентрация в крови, приводящая к отрицательному результату в ИФА-тестах.
Анализ последовательностей Р-гена не позволил определить какие-либо замены, связанные со снижением репликативной активности ВГВ. Изоляты ВГВ, выделенные от случаев скрытой и HBsAg-позитивной инфекции не отличались по частоте и характеру синонимичных и несинонимичных замен в гене полимеразы ВГВ. Ни в S-гене, ни в Р-гене изолятов ВГВ, выделенных от лиц со скрытой инфекцией, не обнаруживали особые мутационные профили, связанные с низкой вирусной нагрузкой и слабой продукцией HBsAg. Вполне возможно, ведущее значение в формировании скрытой формы ВГВ-инфекции имеют не свойства вируса, а особенности иммунологического ответа организма, обеспечивающие значительное подавление вирусной репликации и секреции HBsAg, но позволяющие вирусу избегать полной элиминации. 1.2 Распространенность первичной лекарственной устойчивости ВГВ
Анализ изолятов ВГВ, выделенных из сывороток крови пациентов с моноинфекцией ВГВ и с коинфекцией ВГВ/ВИЧ, был направлен на поиск
аминокислотных замен в вирусной полимеразе, связанных с развитием лекарственной устойчивости ВГВ. Нами было установлено, что примерно у 6% пациентов с моноинфекцией ВГВ и у 10% пациентов с коинфекцией ВГВ/ВИЧ выделяются лекарственно-устойчивые варианты ВГВ, несмотря на то, что для проведения противовирусной терапии у данных лиц аналоги нуклеоз(т)идов не использовались.
При анализе аминокислотных замен в полимеразе ВГВ были выявлены две группы мутаций. К первой группе относились замены, для которых роль в развитии лекарственной резистентности вируса была подтверждена клиническими наблюдениями, то есть фенотип этих вариантов ВГВ был известен. Вторую группу мутаций образовали ранее не опубликованные аминокислотные замены в позициях, ассоциированных с развитием лекарственной устойчивости при появлении в них других аминокислотных остатков, отличных от «дикого» типа. Эти мутации были определены нами как потенциально значимые с точки зрения лекарственной резистентности. Для определения степени вероятности реализации резистентного фенотипа был проведен анализ характеристик заменяющих аминокислот (класса, полярности) в сравнении с известным фенотипом («диким» типом или резистентным штаммом) (таблица 4).
Оказалось, что в некоторых позициях, определяющих развитие резистентности (например, rt204), даже консервативные с химической точки зрения аминокислотные замены приводят к смене фенотипа. В других позициях изменения фенотипа связаны с заменой на аминокислоту другого класса/полярности. По-видимому, сам факт наличия аминокислотных замен в критических позициях определяет риск развития лекарственной устойчивости ВГВ, независимо от того, к одному классу относятся исходная и заменяющая аминокислоты, или к разным.
Полученные нами данные по распространенности первичной лекарственной устойчивости в РФ сходны с показателями, наблюдаемыми в Европейских странах и США (Nagasaki, 2007; Tumaet, 2011; Zöllner, 2004), или несколько превышают их (Mirandola, 2011). Следует отметить, что наши данные получены при обследовании значительно больших когорт пациентов в регионах, где терапия ХГВ агентами прямого действия началась проводиться гораздо позднее, чем в США и Западной Европе.
В настоящее время в РФ для лечения ХГВ зарегистрировано 3 аналога нуклеоз(т)идов: ламивудин (1998 г.), энтекавир (2007 г.) и телбивудин (2007 г.), а в качестве компонента антиретровирусной терапии зарегистрирован тенофовир, активный
в отношении не только ВИЧ, но и ВГВ. Следует отметить, что были выявлены резистентные варианты ВГВ, устойчивые как к препаратам, не применяющимся на территории РФ для терапии ХГВ (адефовир, тенофовир), так и к препаратам, применение которых для лечения ХГВ начато относительно недавно (3-4 года). Полученные данные свидетельствуют о том, что в популяции всегда присутствуют резистентные варианты вируса, и их появление не обязательно связано с отбором
мутантных вариантов под действием противовирусной терапии.
Таблица 4
Характеристика аминокислот в позициях домена обратной транскриптазы ВГВ
Позиция «Дикий» вариант ВГВ Значимая аа замена Выявленная потенциально-значимая аа замена Вероятность развития лекарственной устойчивости при выявленной потенциально значимой замене
82 Ь алифатическая неполярная Р гетероцикличе екая неполярная М алифатическая неполярная невысокая
179 Ь алифатическая неполярная Р гетероцикличе екая неполярная Б алифатическая полярная высокая
184 Т алифатическая полярная I алифатическая неполярная Р гетероциклическая неполярная высокая
204 М алифатическая неполярная I алифатическая неполярная Ь алифатическая неполярная неопределенная
213 Б алифатическая полярная Р ароматическая неполярная Т/У Алифатическая/аро матическая полярная высокая
214 V алифатическая неполярная У ароматическая полярная А алифатическая неполярная невысокая
Результаты анализа распространенности первичной лекарственной устойчивости ВГВ в обследованных регионах показали, что в Московском регионе, где терапия ХГВ нуклеоз(т)идными аналогами внедрена гораздо раньше, чем на остальной территории РФ, такие мутантные варианты ВГВ встречаются достоверно чаще. Повышенная частота выявления первичной лекарственной устойчивости среди не получавших терапию пациентов в Московском регионе, по-видимому, связана с более интенсивной циркуляцией таких вариантов ВГВ на данной территории. Данное наблюдение позволяет ожидать рост распространенности резистентных вариантов ВГВ и в других регионах РФ, с увеличением в них количества пациентов, получающих такую противовирусную терапию. Полученные данные о распространенности первичной лекарственной устойчивости позволяют рекомендовать проведение анализа на наличие лекарственной резистентности для пациентов с ХГВ до начала проведения терапии, чтобы избежать применения заведомо неактивного противовирусного препарата. Включение в систему ведения пациентов с ХГВ анализа резистентности ВГВ позволит вовремя переключать пациентов на другой, более эффективный препарат (как это делается при антиретровирусной терапии) и не допускать развития клинических проявлений резистентности.
2. Контроль эффективности препаратов, направленных против ВГВ и ВГС, с помощью экспериментальных модельных инфекций
2.1 Разработка системы оценки вируцидной активности дезинфицирующих средств с помощью модели /я vivo инфекции вируса гепатита В уток
Наряду с вакцинацией против ГВ, неспецифическая профилактика инфицирования ВГВ (а также ВГС и ВИЧ) является важнейшим инструментом для снижения заболеваемости, в том числе связанной со случаями нозокомиальной инфекции. Одной из задач нашего исследования являлась разработка суррогатной модели ВГВ-инфекции для оценки эффективности вирусной инактивации с помощью различных химических агентов, как в службе крови, так и в дезинфектологии. Выбор вируса гепатита В уток (ВГВУ) в качестве модельного вируса был обусловлен тем, что домашняя утка как лабораторное животное имеет ряд очевидных преимуществ по сравнению с другими животными, восприимчивыми к инфицированию соответствующими вид-специфичными гепаднавирусами (сурки, североамериканские луговые собачки, цапли и т.д.). Для ВГВУ доказана сходная с ВГВ человека кинетика
инактивации под действием различных противовирусных агентов. Кроме того, именно этот вирус в качестве модельного применяется для оценки вирулицидной активности в США и странах Западной Европы. Поскольку данные о циркуляции ВГВУ в РФ отсутствовали, также как и опыт экспериментального воспроизведения данной инфекции, до начала отработки ее модели необходимо было установить распространенность вируса среди поголовья домашней утки. При экспериментальном воспроизведении ВГВУ-инфекции перед нами стояло несколько вопросов - необходимо ли предварительное определение ВГВУ среди включенных в опыт птиц, поступивших из утиных хозяйств, какова оптимальная длительность эксперимента при оценке эффективности вирусной инактивации, сколько животных необходимо включать в каждую опытную группу, и какой способ инфицирования наиболее адекватен.
Оказалось, что ВГВУ в РФ распространен широко, частота его выявления достигает 20% среди утят в возрасте 3-5 дней (возраст, наиболее подходящий, по данным литературы, для экспериментального заражения, поскольку приводит к развитию хронической инфекции). Изолят ВГВУ, выделенный от утят, поступивших из крупного утиного хозяйства в Башкирии, был депонирован под именем «Уфа-04». Была проанализирована нуклеотидная последовательность Ы-коииеного участка Р-гена изолята ВГВУ, что позволило подтвердить его принадлежность к группе Европейских вариантов ВГВУ, определена инфекционная активность в Ш50 для утят, и вирусный материал был лиофилизован для дальнейших экспериментов по воспроизведению модельной инфекции.
Полученные данные о распространенности ВГВУ среди домашних уток позволили сделать вывод о необходимости первоначального определения ДНК ВГВУ у утят при закладке опытов по моделированию этой инфекции. В опытах по экспериментальному заражению трехдневных утят было установлено, что к 3 неделе после инфицирования ВГВУ-инфекция развивается у большинства зараженных птиц. Результаты опыта по сравнению эффективности внутривенного и внутрибрюшинного заражения ВГВУ показали, что эффективность обоих способов сопоставима, поэтому, учитывая удобство и меньшую травматичность для опытных животных второго способа, можно рекомендовать именно его для проведения опытов по моделированию ВГВУ-инфекции. Таким образом, полученные результаты позволили разработать методику
экспериментального воспроизведения ВГВУ-инфекции и применять полученную модельную инфекцию для изучения эффективности вирусной инактивации.
Опыт проведения экспериментов по оценке вирулицидной активности дезинфицирующих препаратов, а также вирусной инактивации в донорской плазме показал одну важную особенность. После проведения инактивации модельного вируса в обработанном материале может выявляться ДНК ВГВУ даже если вирус потерял полностью инфекционные свойства, что подтверждается отсутствием случаев заражения после введения этого материала восприимчивым животным. Обработка противовирусным препаратом в низкой концентрации может приводить к потере вирусом инфекционных свойств вследствие частичной или полной дезинтеграции вириона, однако полной деградации вирусной ДНК при этом не происходит. В связи с этим крайне важно проводить исследования по оценке эффективности вирусной инактивации с помощью чувствительного вирусологического метода, позволяющего определить потерю вирусом инфекционных свойств.
Полученные нами данные свидетельствуют о необходимости проведения экспериментального заражения уток с использованием материала, подвергнутого противовирусной обработке, и недопустимости простого определения ДНК модельного вируса в этом материале. Так, в эксперименте по определению вирулицидной активности в отношении ВГВ дезинфектанта на основе четвертичных аммониевых соединений, разница между концентрацией препарата, приводящей к потере ВГВУ инфекционных свойств и концентрацией, приводящей к исчезновению ДНК модельного вируса в обработанном материале, была десятикратной. Таким образом, моделирование инфекции ВГВУ как метод оценки эффективности вирусной инактивации оказалось в 10 раз чувствительнее метода прямого определения вирусной ДНК в обработанном дезинфектантом материале.
Результаты, полученные при проведении испытаний различных методов инактивации ВГВ (дезинфекция, инактивация вируса в препаратах донорской плазмы) с помощью экспериментальной ВГВУ-инфекции, подтвердили пригодность данной суррогатной модели ВГВ-инфекции для оценки эффективности способов предотвращения передачи ВГВ в условиях медицинского стационара и в службе крови, основанных на применении вирулицидных химических агентов.
2.2 Разработка суррогатной модели ВГС-ннфекцни и оценка возможностей ее применения
Наряду с суррогатной моделью ВГВ-инфекции нами была воспроизведена на игрунковых обезьянах инфекция ОВУ-В, являющаяся суррогатной моделью для ВГС-инфекции. Поиск модели ВГС на мелких лабораторных животных ведется давно, и выбор ОВУ-В обусловлен таксономической близостью этого вируса к ВГС и его подтвержденной гепатотропностью. Нами был проведен успешный эксперимент по заражению ОВУ-В мармозет (СаИШгга ]асскиз) - мелких приматов, близких тамаринам, но, в отличие от последних, не являющихся редкими животными и относительно легко размножающихся в неволе.
Результаты эксперимента продемонстрировали, что ОВУ-В вызывает у мармозет острый самопрекращающийся гепатит, при этом основные характеристики инфекции (продолжительность виремии, уровни вирусной нагрузки) сходны с наблюдавшимися другими авторами у тамаринов (рисунок 1). У обоих животных наблюдали выраженный подъем активности печеночного фермента, изоцитрат дегидрогеназы, при этом пик подъема происходил за 2-3 недели до исчезновения виремии. Полученные данные свидетельствуют о том, что разрушение гепатоцитов может играть роль в элиминации ОВУ-В.
Результаты экспериментального заражения мармозет ОВУ-В продемонстрировали, что эти животные также восприимчивы к данной инфекции, как и тамарины, и могут использоваться для ее моделирования. Одной из основных характеристик инфекции ОВУ-В у мармозет и тамаринов является полная элиминация инфекции, обычно не позднее 20-й недели инфекции, что несколько ограничивает значимость этого вируса как суррогатной модели для ГС. Вероятно, исследования с применением генетически модифицированных клонов ОВУ-В или животных, подвергшихся иммуносупрессии, позволят преодолеть ограничения данной модели.
Успешное экспериментальное воспроизведение инфекции ОВУ-В на мармозетах позволило провести опыт по оценке иммуногенных и протективных свойств химерных вирусоподобных частиц, созданных нами в качестве вакцинного препарата против модельной инфекции. Любой подход к созданию вакцины против ГС наталкивается на отсутствие модели ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных. Поэтому выбранную нами стратегию конструирования вакцины против ГС было решено сначала
испытать при создании аналогичного вакцинного препарата против вВУ-В и испытать его свойства в опыте на мармозетах.
Мармозета Ml
Недели после заражения
Мармозета М2
-+ + + + + + + + + -
Недели после заражения
Рисунок 1. Течение острой GBV-B-инфекции у мармозет (Callithrix jacchus). Титры РНК GBV-B (копии/мл) отображены вертикальными столбцами; ♦ - уровни активности сывороточной изоцитрат дегидрогеназы (ICD) (Е/мл). Результаты качественного определения РНК GBV-B в образцах сыворотки крови в ОТ-ПЦР приведены над графиками: (+) - положительные и (-) - отрицательные образцы.
В качестве носителя для капсидного белка GBV-B был выбран капсидный белок ВГВ. Рекомбинантный капсидный белок ВГВ при экспрессии в Е. coli образует вирусоподобные частицы, такие частицы являются оптимальным носителем для многих инородных В- и Т-клеточных эпитопов, обеспечивая их презентацию иммунным клеткам организма. Фрагмент генома GBV-B, кодирующий укороченный капсидный белок (аа 1-110) встраивали в 3'-терминальную часть укороченного гена core ВГВ, клонированного в свою очередь в экспрессионный вектор. Полученная плазмида давала
относительно высокие уровни экспрессии рекомбинантного белка в Е. coli, с формированием полных «зрелых» частиц.
Химерные вирусоподобные частицы (ВПЧ) очищали в градиенте плотности сахарозы с последующей очисткой пиковых фракций методом гель-хроматографии. На рисунке 2 приведены изображения полиакриламидного геля и иммуноблота с моноклональными антителами к НВс, подтверждающие эффективную очистку рекомбинантного белка. На рисунке 3 приведено изображение полученных вирусоподобных частиц IIBc/GBV-Bcore при электронной микроскопии (х200 ООО).
А. Б.
KDa М 1 2 3 1 2 3 М kDa
Рисунок 2. Экспрессия в E.coli и очистка химерных вирусоподобных частиц HBc/GBV-Bcore.
А - PAAG; Б - Иммуноблот с моноклональными анти-НВс. 1 - клеточный лизат; 2 - очищенный белок HBc/GBV-Bcore (молекулярная масса приблизительно 30 kDa); 3 - очищенный НВс без вставки (молекулрная масса приблизительно 16,5 kDa); М — маркер молекулярной массы белка.
Рисунок 3. Очищенные вирусоподобные частицы НВс/ОВУ-Всоге при электронной микроскопии (х200 ООО).
Полученный белок использовали для иммунизации трех мармозет обыкновенных (С. /асс/шя) с использованием в качестве адъюванта гидроокиси алюминия (примерно 0.1 мг А1203/животное), с последующим заражением иммунизированных животных вВУ-В. Для иммунизации мармозет применяли большие дозы вакцинного препарата -
три иммунизации по 100 мкг на животное массой в среднем 300 г, с последующими двумя бустерными дозами по 200 мкг на животное. Выраженный гуморальный и клеточный иммунный ответ на иммунизацию наблюдали только у одного из трех животных, оно же оказалось защищенным от развития инфекции вВУ-В при последующем экспериментальном заражении (рисунок 4). У этого животного отмечали кратковременную виремию (до 2 недель) после заражения, что сходно с двухнедельной репликацией ОВУ-В, наблюдавшейся В.Веатев с соавторами у тамарина, зараженного повторно после перенесенной инфекции ОВУ-В (Веатеэ е1 а1., 2001). У двух других мармозет, слабо ответивших на иммунизацию, при последующем заражении йВУ-В развилась инфекция, однако подъем трансаминаз оказался менее выраженным, чем у животного, получавшего при иммунизации плацебо (рисунок 4). По-видимому, даже слабый ответ на вводившийся вакцинный препарат, не обеспечивший защиту от заражения, способствовал уменьшению патогенного влияния инфекции.
Животное 1
-3 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Недели п.и.
Животное 3
ш
с; <
-3 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Недели п.и.
20 с; 15 5 Ю К-" 5 < 0
Животное 2
+ + + + + + -
20- 251
+ + + Н ь + - + - -
15 ц 20
10 ш 2 1510 -
5 н 6: 5
0 > 1 —,-.— .—.— < 0 -
■3 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Недели п.и.
Животное 4*
+ + + ++-- - - "'
-3 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Недели п.и.
Рисунок 4. Инфекционные профили иммунизированных мармозет, зараженных ОВУ-В.
* Животное 4 - отрицательный контроль при иммунизации. Результаты качественного определения РНК ОВУ-В в образцах сыворотки крови в ОТ-ПЦР приведены над графиками: (+) - положительные и (-) - отрицательные образцы. П.И. - после инфицирования
Полученные в данном эксперименте результаты, с одной стороны, продемонстрировали недостаточные протективные свойства созданного вакцинного препарата и указали на необходимость создания других конструкций в качестве прототипа вакцины против ГС, возможно, несущих мозаичные эпитопы других вирусных белков. С другой стороны, было показано, что экспериментальное моделирование инфекции вВУ-В на мармозетах является ценным вспомогательным инструментом для разработки вакцины против ГС, что позволяет рекомендовать такую суррогатную модель для использования в подобных работах. 3. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита С 3.1 Определение генотипа ВГС
Одной из основных характеристик ВГС является его генетическая неоднородность, отражением этого служит наличие 11 основных генотипов, более 100 субтипов и множество квазивариантов. Как известно, более 10 лет назад в результате быстрого распространения в общей популяции ВГС генотипа За произошло значительное изменение структуры генотипов ВГС в РФ (КаПшпа й а1., 2001). Задачей нашего исследования являлось определение, насколько сформировавшаяся после широкого распространения генотипа За структура генотипов ВГС стабильна на протяжении последних 5 лет.
Итоги пятилетнего наблюдения за структурой генотипов ВГС продемонстрировали ее относительную стабильность. Доминировал генотип За, вторым по значимости был генотип 1Ь, и минорным являлся генотип 2а, при этом для каждого из этих генотипов отсутствовали достоверные различия между показателями частоты выявления в разные годы (рисунок 5). Однако для генотипа 1а была выявлена тенденция к увеличению его доли в общей структуре генотипов ВГС, частота выявления этого генотипа за 5 лет выросла в 7 раз, с 1,1% в 2007 году до 7,7% в 2011 году (р<0,05). Насколько нам известно, это первое свидетельство увеличения распространенности генотипа 1а в РФ, встречавшегося ранее довольно редко. Вероятно, увеличение доли генотипа 1а в структуре генотипов ВГС в Московском регионе связано с завозом инфекции из стран Западной Европы, где этот генотип является доминирующим, и последующим распространением в группах риска инфицирования ВГС. Именно так произошло внедрение в общую популяцию генотипа За, завезенного из Центральной
Азии, и, в меньших масштабах, генотипа 4 в странах Западной Европы, завезенного иммигрантами из Северной Африки и Ближнего Востока (Kamal et al., 2011).
2007 2008
В коинфекция □ не типир.
Рисунок 5. Структура генотипов ВГС в г. Москве в 2007 - 2011 гг.
3.2 Межгенотипическая рекомбинация ВГС
Наряду с изучением структуры генотипов ВГС, нами был проведен направленный поиск случаев рекомбинации ВГС. Для этого анализировали нуклеотидные последовательности двух наиболее удаленных друг от друга кодирующих участков генома ВГС, core и NS5B. В анализ включали две группы изолятов ВГС - с генотипом, неопределяемым рутинным методом, а также выделенные от лиц с высокой
вероятностью многократного инфицирования ВГС (инъекционных наркоманов). Всего было проанализировано 136 изолятов ВГС, из них в 4 случаях удалось выявить рекомбинантную форму RF_2k/lb. Другие рекомбинантные варианты обнаружены не были, что подтверждает сложившееся мнение о том, что рекомбинация ВГС - явление весьма редкое, случайное и не представляет собой существенного значения для эволюции вируса. С другой стороны, выявление 4 изолятов RF_2k/lb свидетельствует об относительно широкой распространенности этого штамма. Высокая степень сходства последовательностей участка NS2, где была обнаружена точка перекреста, с аналогичными последовательностями других изолятов RF_2k/lb, выделенных в России, Узбекистане, Ирландии, а также одинаковое для всех изолятов расположение точки рекомбинации в позиции 3180±20 нуклеотидов, указывают на принадлежность к одному рекомбинантному штамму, возникшему в результате одного события рекомбинации. В пользу этого наблюдения свидетельствует и группирование на соответствующих филогенетических деревьях последовательностей участков core и NS5B всех изолятов RF_2k/lb.
Данные об эпидемиологии этого штамма RF_2k/lb ограничены, однако выделяют его преимущественно от пациентов, имеющих в анамнезе инъекционную наркоманию (Kalinina et al., 2002; Moreau et al., 2006; Kurbanov et al., 2008). Все четыре пациента, от которых был выделен штамм RF_2k/lb в нашем исследовании, также являлись потребителями инъекционных наркотиков. По-видимому, данный рекомбинантный вариант в настоящее время циркулирует только в этой группе риска.
Анализ вирусной нагрузки ВГС у пациентов, инфицированных RF_2k/lb, показал довольно высокие уровни (от 9,6 х105до 8,6х10б копий/мл), что указывает на отсутствие снижения вирусной репликации у данного рекомбинантного варианта. Кроме того, высокие показатели вирусной нагрузки RF_2k/lb свидетельствуют о возможности передачи этого штамма не только при внутривенном введении наркотика, когда, как правило, происходит попадание в организм большой инфицирующей дозы, но и при реализации других путей передачи, сопряженных с меньшей инфицирующей дозой. Таким образом, рекомбинантный вариант ВГС RF_2k/lb представляет собой самостоятельную конкурентоспособную форму, имеющую потенциал к более широкому распространению.
4. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита дельта 4.1 Распространенность маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения Российской Федерации
Изучение распространенности маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения было проведено в шести регионах РФ, различающихся уровнями заболеваемости ГВ (Московская область, Ростовская область, Свердловская область, Хабаровский край). Результаты выявления маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения шести регионов РФ приведены в таблице 5.
В трех регионах - Свердловской области, Хабаровском крае, Якутии, - частота выявления анти-ВГО среди условно-здорового населения оказалась довольно высокой, от 5,0% до 16,7% (таблица 5). Ни в одном случае не была выявлена РНК ВГО, что указывает на отсутствие активной репликации вируса. Для ВГО не характерна спонтанная элиминация при сохранении ВГВ-инфекции; обычно в результате одновременного инфицирования ВГВ и ВГО развивается острый гепатит, который заканчивается элиминацией обоих вирусов, т.е. происходит сероконверсия как по НВзА§, так и по НОА§. Таким образом, присутствие в сыворотке крови пациента НВбА§ и анти-ВГО свидетельствует с высокой долей вероятности о сохранении в организме ВГО, даже при невыявляемо низком уровне виремии ВГО.
Таблица 5
Частота выявления маркеров инфицирования ВГО среди HBsAg-пoлoжитeльныx лиц _
Регион HBsAg- Анти-ВГО РНК ВГО
позитивных N % N %
лица, N
Московская обл. 17 0 0
Ростовская обл. 16 0 0
Свердловская обл. 12 2 16,7% 0
Республика Саха (Якутия) 24 3 12,5% 0 -
Республика Тыва 58 27 46,6% 14 24,1%
Хабаровский край 20 1 5,0% 0 -
Полученные данные о циркуляции ВГО среди условно-здорового населения РФ указывают на необходимость тестирования всех лиц, у которых выявляется HBsAg, на маркеры гепатита дельта, с целью своевременного выявления такую прогностически неблагоприятную коинфекцию. Поскольку при коинфекции ВГВ/ВГО патогенез определяется преимущественно ВГО, а подходы к терапии ХГВ и гепатита дельта
принципиально отличаются (агенты прямого действия, активные против ВГВ, не эффективны в отношении ВГО), ранняя диагностика ВГО-инфекции является критическим фактором успешной терапии.
Анти-ВГО были определены почти у половины (46,6%) позитивных по НВвАз лиц, выявленных при обследовании условно-здорового населения Республики Тыва. Полученные данные свидетельствуют о том, что Тыва является гиперэндемичным регионом по гепатиту дельта. Результаты выявления РНК ВГО показали, что у половины лиц с анти-ВГО присутствует активная репликация вируса. Было установлено, что самыми пораженными ВГО являются лица в возрасте от 30 до 50 лет.
Среди детей в возрасте 0-9 лет случаи выявления анти-ВГО отсутствовали. Массовая вакцинация новорожденных против ГВ в данном регионе была начата в 1998г., соответственно, все обследованные дети в возрасте до 10 лет были вакцинированы против ГВ. Отсутствие случаев ВГО-инфекции в этой возрастной группе в гиперэндемичном регионе является четким свидетельством того, что массовая вакцинация новорожденных против ГВ обеспечивает защиту от инфицирования ВГО. Полученные данные позволяют предполагать в будущем значительное снижение интенсивности циркуляции ВГО и количества случаев инфицирования в этом неблагополучном регионе и в стране в целом. Однако в настоящее время в Республике Тыва проживает большое число пациентов с хроническим гепатитом дельта, в большинстве случаев недиагнострованным, и эта проблема требует внедрения в регионе специальных программ по мониторингу и терапии гепатита дельта.
Все выявленные в Республике Тыва изоляты ВГО относились к генотипу 1, наиболее распространенному в Евразии. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участка вирусного генома 110, наиболее часто используемого для геношпирования вируса и представляющего примерно пятую часть вирусного генома, продемонстрировал группирование тывинских изолятов ВГО со штаммами, выделенными в Европейской части России, Якутии и в Восточной Европе (рисунок 6).
Большая часть изолятов, выделенных в Республике Тыва, образовывали несколько кластеров с относительно высокой степенью сходства внутри кластера (95% -98%), что указывает на длительную циркуляцию вируса на данной территории и инфицирование внутри региона, местными штаммами. В отличие от Якутии, где наряду
с генотипом 1 довольно широко распространен генотип 2 (КапшвМпа е1 а1., 2001), на территории Республики Тыва нами был выделен только 1 генотип вируса.
AJ583872. <ffi- 5 5(Cameooo) AJ583873 <ff г-56<Сашегооп) AJ583878 dFr-70(Esypt) AF008375 Egypt AJ583874.diT-59(Egypt) M84917 Lebanon
AJ583879 dFr-71 (Central African RebubliC
AJ583881 dFr-74(Dcmocr*nc Rrpabhc of Cceeo)
AJ583867.dfr-4(.Gbma)
U819 89. Ethiopia
AF008 347. Ttekish-O1
AF008309 Aibania-02
AF008 320 Greek-19
AF008333 Archangel©»
AF0O8319 Romania
AJ309878. Ya-72 4
Tm.M
Tm.9J
M.S8629 Naura
Tvv».81
Us 1988. SoiBeli»
AJ309876. V»-51
AF008374 Jbwsia
AJ309872 Y»-12
AJ583 876. t£Fi-65<Rotiiania)
Tvva.25
AJ583875 .dFr-65(Ron»nia)
Tyva.84
Tyva.107
. .109 Tyva.7 Tyva.40 10—Г Tj-va.53 Tvra.90 Tyva.29 Tyva.71 ,-1—Trva.39 4 1—Tyva-Зв U— Тута. 46 — Тт.Я
Af008371US-23 AJ58 3869 dFr-46(FnuKe) AF008372 .Fraich-02 DO 1075 US-1 AF008420. Italy-3 5 AF008 373 Afghanistan X85253.Cagliwi
AF309420. Mivako ABO15444.01£3- 25 ABO15443.Ofc2 -05 ABO 15445,Ok4-15 ABO 15446 OkS-Ol AB015447,Ok6-21 AB015442 Okinawa (Ok) 1-18 AF018077.T»»-nn-TW-2b AJ309868. Ya-13 AJ 309879. Yefcvit-26 AJ309869.Ya-29 AJ3098 77. Y»-704 AJ309880. Yakut-62 AJ309875 Y»-«3 AJ309874.Y»-24 5 X60193Jap*»-S UI9598Tarw*a-3 AF104264 TW2476 AJ58387I fffr-48'.C!uu«o<7n) AJ583S87 dFr-202G(Ivoiy Con-st) AJ583884 <{Fi-1594< A neola) AJ583S68 dFr-45(Caiu«oon) AJ583 883 <IFr-2066<CamerooQ) AJ583?85.dFr-1843(Gabon) AJ5 838 82.dFr-644(Ccag«>) A3583S89 <3Fr-2204(lvoiy Coa*») AJ583890 dFc-230I(Ivofv Coast) AJ583886 <!Fr-1953(Cairiefooa) AJ583880.dFr-73(Ivorv Соам) AJ5838 77.dFi-69(Ghaaibia) AJ583883 ctFr-91<4Malj)
II
J" AJ583870 dFi-47(Guu»a) AJ583891 <iFr-23i 7(G«inef 4 L22061. Colombi a AB03 7949 VnzD8624 AB037948 VnzD8349 AB037947.VuzD8375 L22063 Peru-1 L22064P«ii-2
III
Рисунок 6. Филогенетическое дерево на основании нуклеотидных последовательностей 3'-терминального участка гена НО вируса гепатита О (Ш), 353 п.о.); изоляты из Республики Тыва обозначены Тууа и выделены жирным шрифтом. Генотипы ВГО 1, 2 и 3 указаны римскими цифрами.
0.00
5. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита А
В системе надзора за гепатитом А применение молекулярно-биологического анализа не является рутинным методом расшифровки вспышек и спорадических случаев заболевания. В результате этого во многих случаях источник и факторы передачи
инфекции остаются невыявленными, а время для купирования вспышек с помощью адекватной дезинфекции и экстренной вакцинации в очаге остается упущенным. Кроме того, ограниченные сведения о циркулирующих в РФ штаммах ВГА затрудняют выявление эпидемических вариантов и прогноз подъема заболеваемости.
Анализ изолятов ВГА, выделенных от заболевших ГА в Москве в январе 2010г., был направлен на определение причины резкого подъема заболеваемости в конце декабря 2009г. - начале января 2010г. Необходимо было установить, вспышка ли это, и если да, что является ее источником. Для анализа степени сходства между изолятами ВГА был выбран участок вирусного генома УР1/2А величиной 330 пар оснований, который используется для подобных целей в большинстве лабораторий мира. Поскольку из 50 анализировавшихся изолятов ВГА 48 оказались идентичными между собой (рисунок 7), был сделан вывод об общем источнике инфицирования, и, следовательно, о существовании вспышки ГА.
Эпидемиологический анализ, проведенный сотрудниками Роспотребнадзора, позволил предположить в качестве фактора инфицирования салатную продукцию из сети гастрономов. При проведении эпидемиологического расследования на территории цеха по производству салатов была обнаружена несанкционированная скважина глубиной всего 16 метров, а в образцах воды, поступавшей из этой колонки, как до водоподготовки, так и после водоподготовки, была выявлена РНК ВГА. Среди персонала цеха салатной продукции были выявлены 9 заболевших ГА, у 5 из них удалось определить РНК ВГА и определить ее нуклеотидную последовательность.
Идентичность изолятов ВГА, выделенных из воды и у сотрудников предприятия, изолятам, выделенным от заболевших потребителей салатной продукции (рисунок 7), позволили сделать предположение о том, что первоначальным фактором инфицирования послужила контаминированная вода, которая использовалась для мытья котлов и овощей в цехе приготовления салатов. Далее контамшшрованный салат был распространен по гастрономам сети, и стал причиной пищевой вспышки в Москве. Полученные данные свидетельствуют о том, что изначально данная вспышка имела водный характер.
Опыт расшифровки вспышки ГА показал важность применения высокочувствительного метода выявления РНК ВГА в образцах воды. Стандартный метод концентрирования образцов воды с помощью ПЭГ не дал положительного
результата при поиске вируса, однако концентрирование образцов с помощью магнитных частиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния (производства Научно-исследовательского института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН). Данный метод позволил сконцентрировать образцы воды объемом 3 л до 1 мл, то есть в 3000 раз, что на порядок превышает фактор концентрирования с помощью ПЭГ. По-видимому, именно высокий фактор концентрирования явился причиной успеха выявления РНК ВГА в анализировавшихся образцах воды.
Рисунок 7. Филогенетические взаимоотношения изолятов ВГА, выделенных от заболевших ГА и из образцов воды.
Двузначным номерами
обозначены изоляты ВГА от заболевших гепатитом А в Москве; префиксом х5 - изоляты ВГА от заболевших сотрудников предприятия пищевой
промышленности; Water последовательности ВГА,
выделенные из образцов воды, взятых на территории предприятия пищевой
промышленности. Прототипные изоляты ВГА из GenBank приведены с указанием их номеров в базе данных. Длина ветвей отражает степень отличия нуклеотидной
последовательности вирусов в соответствии с приведённой шкалой.
Именно вспышки определяют в настоящее время в РФ уровень заболеваемости ГА. Поэтому, помимо создания программы массовой вакцинации против ГА, внедрение стандартизованного алгоритма расследования вспышек ГА, сочетающего в себе эпидемиологический анализ и молекулярные методы исследования, является необходимым условием успешного контроля за ГА. Данный алгоритм должен включать в себя следующие этапы:
1. Опрос заболевших для выявления потенциальных факторов риска инфицирования.
2. Обязательный сбор образцов сыворотки крови от заболевших для определения анти-ВГА ^М и РНК ВГА.
3. Сбор образцов воды и смывов с объектов внешней среды, на потенциальную контаминацию которых указывают результаты эпидемиологического анализа. Концентрирование образцов воды и смывов с помощью методов, дающих высокий фактор концентрирования (более 1000). Определение в концентрированных образцах РНК ВГА.
4. Определение нуклеотидной последовательности участка генома ВГА УР1/2А для всех изолятов вируса, выделенных от заболевших и из образцов окружающей среды, и сравнение их между собой для установления взаимоотношений между ними.
6. Молекулярно-биологические основы контроля вирусного гепатита Е
6.1 Частота выявления антител к вирусу гепатита Е среди условно здорового
населения
Для определения интенсивности циркуляции ВГЕ на территории РФ нами была определена частота выявления постинфекционных анти-ВГЕ в разных возрастных группах населения. Была изучена популяция условно-здорового населения 6 регионов РФ, географически удаленных друг от друга и отличающихся климатическими условиями (Московская область, Ростовская область, Хабаровский край, Республика Саха (Якутия), Республика Тыва, Свердловская область). Для определения анти-ВГЕ у населения 6 регионов методом случайной выборки были отобраны 6292 образцов сыворотки крови лиц 3-х возрастных групп: моложе 20 лет - 3122, от 20 до 60 лет - 2449 и старше 60 лет - 721 образцов сыворотки крови. Соотношение мужчин и женщин для 6 регионов составило 1:1,3. Такие выборки представляются репрезентативными для экстраполяции полученных данных на население страны в целом.
Было установлено, что средняя частота выявления анти-ВГЕ в РФ составляет 4,1%, что соответствует данным, полученным при обследовании условно-здорового населения стран Западной Европы и Японии (Вои1гош11е й а1., 2007 ; Ьорег-^шегск) й а1., 2007; ГакаЬа$Ы й а1., 2010), а также показателям, полученным ранее в некоторых регионах РФ среди первичных доноров крови (Кузьменко с соавт., 2004; Быстрова с соавт., 2010). Нами были отмечены различия по частоте выявления анти-ВГЕ в обследованных регионах, что указывает на разную интенсивность циркуляции ВГЕ на этих территориях. Достоверно чаще по сравнению с другими регионами анти-ВГЕ выявляли среди населения Московской области, где этот показатель в среднем составил 7,5%. Эти данные позволяют предположить существование отдельных территорий в РФ, которые можно рассматривать как эндемичные по ВГЕ-инфекции. Помимо территориальных различий в распространенности анти-ВГЕ, были отмечена значительная гетерогенность возрастной структуры популяционного иммунитета к ВГЕ. Во всех шести обследованных регионах наблюдали резкий подъем частоты выявления анти-ВГЕ среди лиц старше 60 лет (рисунок 8). Величина данного показателя в старшей возрастной группе варьировала в разных регионах, от 8,3% в Свердловской области до 28,2% в Московской области, однако тенденция к его резкому увеличению была отмечена в каждом регионе.
Выявленный нами подъем частоты выявления анти-ВГЕ среди пожилых лиц может свидетельствовать, аналогично ситуации с ГА, о преимущественной циркуляции ВГЕ в старших возрастных группах. Обращает на себя внимание тот факт, что в Московской области частота выявления анти-ВГЕ среди лиц старше 60 лет достигает 28,2%, т.е. как минимум каждый четвертый житель Московской области сталкивается на протяжении своей жизни с ВГЕ. Полученные данные определенно указывают на интенсивную циркуляцию вируса в регионе среди лиц старших возрастных групп.
Результаты анализа структуры популяционного иммунитета к ВГЕ указывают на довольно широкую распространенность ВГЕ-инфекции в РФ, несмотря на отсутствие регистрируемой заболеваемости. Среди лиц с анти-ВГЕ класса 1§0 нами были выявлены 29 человек с анти-ВГЕ класса 1§М, что свидетельствуют о наличии у них текущей ВГЕ-инфекции. Все случаи ВГЕ-инфекции, выявленные в нашем исследовании среди условно-здорового населения, были бессимптомными, что позволяет сделать предположение о преимущественно скрытой циркуляции ВГЕ в РФ. Анализ анкетных
данных лиц с анти-ВГЕ ^М не выявил случаев поездки в гиперэндемичные по ГЕ регионы, равно как и желтухи в анамнезе. Это позволило с большой долей вероятности предполагать автохтонный характер инфекции.
[ до 19 лет ; 20- 59 лет I > 60 лет
Рисунок 8. Частота выявления анти-ВГЕ ^О в разных возрастных группах условно-здорового населения: до 19 лет, 20-59 лет и старше 60 лет
I - Московская область, 2 - Ростовская область, 3 - Свердловская область, 4 — Республика Саха (Якутия), 5 - Республика Тыва, 6 - Хабаровский край, 7 - среднее значение по РФ.
При анализе образцов сыворотки крови, положительных по анти-ВГЕ IgG, только в одном случае удалось выявить РНК ВГЕ. Такой результат согласуется с наблюдениями о коротком периоде виремии ВГЕ и сообщениями об относительно редком выявлении вирусной РНК в крови у лиц, имеющих анти-ВГЕ IgM (Maylin et al., 2012). Таким образом, диагностика ГЕ должна быть основана на определении анти-ВГЕ IgM в сыворотке крови и выявлении РНК ВГЕ в образцах фекалий. Анализ варианта ВГЕ, выделенного в данном исследовании, показал его принадлежность генотипу 3 ВГЕ (субтип Зс), что подтверждает автохтонный характер инфекции.
Случаи текущей ВГЕ-инфекции среди условно-здорового населения были выявлены во всех изученных регионах и практически во всех возрастных группах, что указывает на повсеместное распространение латентной ВГЕ-инфекции. По-видимому,
такая скрытая циркуляция ВГЕ обеспечивает формирование значительной прослойки, иммунной к ВГЕ.
6.2 Случаи спорадической и групповой заболеваемости ГЕ в РФ
Помимо бессимптомных случаев ВГЕ-инфекции, нам удалось описать и клинически выраженные случаи ГЕ на территории РФ, которые представляли собой весь спектр проявлений данной инфекции, наблюдаемых в гиперэндемичных регионах -спорадические случаи острого гепатита, фульминантное течение заболевания, вспышка инфекции. Все случаи ГЕ были описаны в течение двух лет на территории одного региона (Владимирской области). В большинстве случаев клинически выраженный ГЕ наблюдался у лиц старшего возраста, средний возраст лиц, вовлеченных во вспышку в г. Коврове составил примерно 67 лет. Пациенту, умершему вследствие фульминантного ГЕ, было 76 лет.
Изученная нами вспышка ГЕ в г. Коврове является первым, по нашим данным, случаем групповой заболеваемости ГЕ, сходной с наблюдаемыми в гиперэндемичных странах. Ранее на неэндемичных территориях были описаны случаи одновременного заболевания нескольких человек ГЕ в результате употребления в пищу мяса инфицированного животного (свиньи или оленя), однако анализировавшийся нами групповая заболеваемость имела принципиально другой характер. Эпидемиологический анализ позволил исключить инфицирование ВГЕ в результате употребления в пищу мяса зараженных животных, и указал на высокую вероятность водного пути передачи инфекции. Косвенно на это также указывает высокая частота выявления анти-ВГЕ среди лиц, живших в тех же подъездах, что и заболевшие, то есть получавших воду по той же ветке водопровода. Этот показатель (26,8%) более чем в 2 раза превышал частоту обнаружения анти-ВГЕ ^О у лиц, обследованных до вспышки гепатита ГЕ. Необходимо отметить, что и до вспышки частота выявления анти-ВГЕ среди населения г. Ковров составляла 12,3%, что указывает на продолжительную и интенсивную циркуляцию вируса на данной территории.
Все случаи ГЕ, выявленные во Владимирской области, были вызваны ВГЕ субтипа Зе, однако различия в нуклеотидной последовательности между изолятами вируса, выделенными при расследовании вспышки в 2009г., и от спорадических случаев, выявленных в 2008г., указывают на отсутствие связи между ними (рисунок 9).
AF455784 II.3g SlSlkalill.2 S1 30kalin.2 5107kalin.l L 5109kalin. 1
|483 5khab. 1 - 4892khab. 1
'/'> r Human sporadic case 1 Vladimir L Human sporadic ease 2 Vladimir - AB094231 3e
-AB073911 3e
- Vladimir fulminant sporadic case I - Kovrov outbreak Zem - Kovrov outbreak Iv
- Kovrov outbreak Pik
5354arch.2
5376arch,2 53 74areh.2 5353arch.2
49S2khab.3
- S320arch.l I 5435arch.3
-5S12arclv3 "961 S525arch.3 - 4196ekat.2 ^ 4194ekat.2 -4173ekat.l
- 4357ekat.3 4172ekat. 1 4352ekat.3 -4178ekat. 1 - 4I98ekal.2
- 4199ekat.2 4156ekat.l 4191 ekat. I 441 Osar. 1 4591sar.3 3990vlad 3951 vlad
DQ4S0072 China HEV type IV ЛВ097811 Japan HKV typel\ M74506 HEV2 Mexico
AY723745 India HEV type IV AY594199 China HEV type IV M73218 Burma H. E virus type I D103 30 Burma HEVNE8L type I
051830 Nepal HEVTK15/92 type I X99441 India HEV type I
-X98292 India hev037 type I
M80581 Pakistan HEV type I "China HEV type I 093 China HEV type I 77 China HEV type 1
Рисунок 9. Филогенетические взаимоотношения изолятов ВГЕ, выделенных от заболевших ГЕ людей и от свиней. Жирным шрифтом обозначены изоляты ВГЕ, выделенные от заболевших людей. Использованы следующие обозначения, изоляты, выделенные от случаев
спорадического ГЕ - Human sporadic case, изоляты, выделенные во время вспышки ГЕ — Kovrov outbreak, изолят, выделенный от пациента с фульмннантным ГЕ - Vladimir fulminant sporadic case. Для обозначения региона выделения ВГЕ свиней использованы следующие обозначения: Архангельская область - arcli, Владимирская область - vlad, Калининградская область - kalin, Саратовская область - sar, Свердловская область - ekat, Хабаровский край - khab. Прототипные изоляты ВГЕ из GenBank приведены с указанием их номеров в базе данных. Анализ частичной нуклеотидной
последовательности проводился в ОРС 2 РНК ВГЕ (300 нт, 5996-6295 нумерация по прототипному изоляту Burme - М73128). Числа в узлах дерева - процент bootstrap-псевдорепликатов, поддерживаемых данную группу (приведены только достоверные значения > 70%). Длина ветвей отражает степень отличия нуклеотидной последовательности вирусов в соответствии с приведённой шкалой.
Наоборот, между изолятами ВГЕ, выделенными при расследовании вспышки, наблюдалась высокая степень сходства (более 95%), что и позволило, наряду с данными эпидемиологического анализа, сделать вывод об общем источнике инфекции. Обращает на себя внимание тот факт, что случай фульминантного ГЕ по данным эпидемиологического анализа не имел очевидной связи со случаем групповой заболеваемости в г. Ковров, однако выделенный изолят ВГЕ оказался очень близок ковровским изолятам вируса (рисунок 9). Учитывая гот факт, что и г. Владимир, где был зарегистрирован случай фульминантного ГЕ, и г. Ковров расположены на одной реке (р. Клязьма), откуда проводится водозабор для населения обоих городов, такое генетическое сходство может указывать на происхождение ВГЕ из одного источника.
Выделение на одной территории на протяжении двух лет двух различных вариантов ВГЕ, принадлежащих к одному субтипу, указывает на широкое распространение вируса в регионе. Учитывая доказанную зоонозную природу ВГЕ на неэндемичных территориях, и роль свиней как резервуара инфекции, нами были проанализированы последовательности изолятов ВГЕ, выделенных от свиней во Владимирской области. Оказалось, что случаи заболевания людей ГЕ не имеют никакой связи с вариантами ВГЕ, обнаруженными нами у свиней. Выделенные от людей и животных изоляты ВГЕ принадлежали одному, третьему генотипу, но относились к разным субтипам вируса (рисунок 9). Тем не менее, поскольку исследования ВГЕ среди свиней во Владимирской области проводилось на одной, самой крупной ферме области, нельзя исключить вероятность циркуляции среди свиней данного региона ВГЕ, сходного с выделенными от человека изолятами. 6.3 Циркуляция вируса гепатита Е среди свиней в РФ
Для того, чтобы оценить роль свиней как потенциального резервуара ВГЕ на территории РФ, нами были обследованы 17 крупных свиноферм в шести географически удаленных друг от друга регионах - Владимирской, Свердловской, Саратовской, Калининградской, Архангельской областях и Хабаровском крае. Всего было обследовано более 1300 животных, что позволяет рассматривать полученные данные как репрезентативные для РФ в целом.
Для определения распространенности ВГЕ-инфекции среди свиней необходимо знать, в каком возрасте преимущественно эта инфекция поражает животных. В связи с этим первым этапом исследования являлось определение возраста свиней, в котором
наиболее часто регистрируется выделение ВГЕ с фекалиями. Возрастной интервал выявления ВГЕ-инфекции составил от 4 до 21 недели жизни, при этом наибольшая частота выявления (более чем у 50% обследованных животных) отмечена в возрасте 2-4 месяца. Полученные результаты указали на целесообразность обследования животных именно этого возраста для поиска ВГЕ. Нам не удалось выявить РНК ВГЕ в образцах фекалий от животных старше 5 месяцев, однако у поросят в возрасте 4-5 месяцев частота выявления РНК ВГЕ составила 15,8%. По-видимому, большинство животных в РФ, достигающих возраста забоя, уже не имеют ВГЕ-инфекции, поскольку переносят ее в раннем периоде, однако полностью исключить возможность наличия инфекции у животных в возрасте 8 месяцев не представляется возможным.
Нами была установлена частота выявления РНК ВГЕ у свиней в возрасте 2-4 месяцев в б регионах РФ. Она варьировала в широком интервале в зависимости от региона (от 8,8% до 60,5%) и от фермы (от 0 до 49,45%), где проводилось исследование (рисунок 10). Из 17 обследованных нами свиноферм только на трех не была выявлена циркуляция ВГЕ.
Рисунок 10. Частота выявления РНК ВГЕ у свиней в возрасте 2-4 месяца в шести обследованных регионах РФ.
Обнаружение ВГЕ у свиней в различных географически удаленных друг от друга регионах РФ позволяет сделать предположение о повсеместном распространении вируса
среди свиней на территории страны. Полученные данные подтверждают потенциальную значимость свиней как резервуара ВГЕ, поскольку, даже если вероятность употребления в пищу мяса инфицированных животных не очень высока, животные могут служить источником вируса, попадающего в окружающую среду, в том числе в источники водоснабжения.
Необходимо отметить, что до настоящего времени данные о генетическом разнообразии ВГЕ в РФ практически отсутствовали и были ограничены описанием нескольких изолятов, выделенных свиней (Михайлов с соавт., 2007). Нами был проведен анализ частичной нуклеотидной последовательности 46 изолятов ВГЕ, полученных с 14 свиноферм в 6 регионах РФ, что составило 18,5% от всех изолятов ВГЕ свиней, выделенных в нашем исследовании. Для анализа использовалась нуклеотидная последовательность 5'-участка области открытой рамки считывания 2 генома ВГЕ, для которой в ОепВапк имеется наибольшее количество референсных последовательностей, выделенных в разных регионах мира. Для анализа были отобраны варианты ВГЕ, различающиеся между собой не менее чем на 1%, чтобы избежать анализа дублирующих последовательностей.
Все выявленные нами изоляты ВГЕ относились к 3 генотипу. Выделенные в каждом регионе изоляты ВГЕ, как правило, образовывали на филогенетическом дереве самостоятельные кластеры с показателями достоверности филогенетического группирования 98-100%, и не группировались с референсными последовательностями из ОепВапк (рисунок 9), что свидетельствует о циркуляции самостоятельных вариантов ВГЕ 3 генотипа в каждом регионе. Изучение молекулярной эпидемиологии ВГЕ в разных регионах мира показало, что различные субтипы ВГЕ 3 генотипа мало отличаются по своим биологическим и эпидемиологическим свойствам, и их разделение носит условный характер, не имеющий под собой биологической основы. Однако группирование изолятов 3 генотипа ВГЕ на субтипы может быть удобным при расследовании заболеваемости ВГЕ на неэндемичной территории с точки зрения выявления потенциального источника инфицирования.
Подобное "картирование" территорий Российской Федерации может помочь в будущем при расшифровке случаев ГЕ у людей. Учитывая вероятность зоонозной природы ВГЕ-инфекции, сравнение выделенных от пациентов изолятов ВГЕ с имеющимися в базе данных изолятами ВГЕ свиней, характерными для конкретного
региона, позволит сделать заключение о возможном источнике инфицирования. Кроме того, создание базы данных изолятов ВГЕ может послужить основой для создания отечественной вакцины против ГЕ, основанной на штаммах вируса, циркулирующих на территории РФ.
Выводы
1. Современные молекулярно-биологические методы диагностики, изучения генетической изменчивости вирусов и разработки биологических моделей вирусных гепатитов дали возможность получить как фундаментальные знания о поведении вирусных популяций (распространенность и спектр мутантных форм, характеристика скрытых форм инфекции), так и знания прикладного характера (система оценки эффективности противовирусных препаратов, усовершенствование алгоритма лабораторной диагностики и расшифровки вспышек гепатита), что позволило разработать комплекс мер по оптимизации системы контроля вирусных гепатитов.
2. Для оптимизации контроля вирусного гепатита В диагностика данной инфекции должна строиться на одновременном определении ДНК ВГВ и HBsAg. На необходимость этого указывает существование случаев скрытой HBsAg-нeгaтивнoй инфекции, распространенность которой достигает 2% даже при применении тестов для определения HBsAg с чувствительностью 0,01 нг/мл. Основной причиной развития скрытой формы ВГВ-инфекции является не наличие мутаций в я-детерминанте HBsAg, а низкий уровень вирусной репликации и продукции HBsAg.
3. Частота выявления мутаций, связанных с первичной лекарственной устойчивостью ВГВ, составляет 6,2% среди пациентов с ВГВ-моноинфекцией и 10,0% - среди пациентов с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности проведения скрининга на лекарственную устойчивость ВГВ до начала противовирусной терапии для выбора адекватного препарата. Анализ первичной лекарственной устойчивости в регионах РФ позволяет связать данное явление с продолжительностью применения противовирусных препаратов в том или ином регионе, и прогнозировать увеличение доли резистентных штаммов со временем.
4. Существование крайне неблагополучных по гепатиту дельта регионов, таких, как Республика Тыва, где 46,6% инфицированных ВГВ имеют маркеры коинфекции ВГО, указывает на необходимость введения официальной регистрации гепатита дельта как самостоятельной нозологической формы и обязательного тестирования всех позитивных
по HBsAg лиц на маркеры ВГО (анти-ВГО, РНК ВГО) для максимально ранней диагностики этой прогностически неблагоприятной инфекции. Отсутствие случаев выявления анти-ВГО среди детей моложе 10 лет свидетельствует об эффективной защите от инфицирования ВГО с помощью вакцинации новорожденных против гепатита В.
5. В Московском регионе наблюдается тенденция к увеличению доли генотипа 1а в структуре генотипов ВГС, от 1,1% до 7,7% (р<0,05), при этом соотношение генотипов Ib, 2а и За остается стабильным. Среди инъекционных наркоманов отмечена циркуляция рекомбинантной формы ВГС RF_2k/lb, являющейся устойчивой конкурентоспособной формой. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента кодирующего участка NS2, в котором находится точка рекомбинации, позволил установить принадлежность всех известных изолятов RF_2k/lb к одному рекомбинантному штамму ВГС, возникшему в результате одного события рекомбинации.
6. Разработана система оценки эффективности противовирусных препаратов, направленных против ВГВ и ВГС, с помощью суррогатных инфекций in vivo. Для испытания противовирусной активности препаратов разных классов, направленных против ВГВ, разработана и успешно апробирована модель инфекции ВГВ уток. В качестве суррогатной модели ВГС воспроизведена модель GBV-B-инфекции игрунковых обезьян, в эксперименте in vivo продемонстрировано, что она является удобным инструментом для оценки перспективности подходов к созданию вакцины против гепатита С.
7. Молекулярно-эпидемиологический анализ случаев гепатита А, ассоциированных с резким подъемом заболеваемости в г. Москва в декабре 2009 - январе 2010 гг., позволил доказать развитие пищевой вспышки данной инфекции. Выявление РНК ВГА в образцах воды, взятых на пищевом предприятии, позволило установить изначально водный характер вспышки с последующей реализацией пищевого пути передачи инфекции. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости внедрения чувствительных методов выявления вирусного генетического материала в объектах внешней среды в систему надзора за гепатитом А.
8. Частота выявления анти-ВГЕ IgG среди условно-здорового населения РФ составляет в среднем 4,1%, при этом наблюдается резкое (до 28%) увеличение частоты выявления
анти-ВГЕ IgG среди лиц старше 60 лет. Полученные результаты свидетельствуют о том, что значительная доля населения страны сталкивается на протяжении жизни с ВГЕ. Впервые определены молекулярно-эпидемиологические характеристики автохтонных случаев групповой заболеваемости ГЕ на негиперэндемичной территории, получены данные, опровергающие существующее мнение об отсутствии вспышечной заболеваемости вне стран с жарким климатом. Установлено, что все изоляты ВГЕ, выделенные на территории РФ от людей и животных, принадлежат генотипу 3. ВГЕ распространен среди домашних свиней в РФ повсеместно, преимущественно инфицированы животные в возрасте 2-4 месяца, не достигшие возраста забоя. Анализ нуклеотидных последовательностей ВГЕ показал существование специфичных для каждого региона вариантов ВГЕ.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации
1. Kyuregyan К.К., Polescluik V.F., Zamyatina N.A., Isaeva O.V., Michailov M.I., Ross S., Biikh J., Roggendorf M., Viazov S. Acute GB virus infection of marmosets is accompanied by mutations in the NS5A protein // J. Virus Research. - 2005. - N114. -P.154-157.
2. Полещук В.Ф., Гуляева T.B., Титова И.П., Замятина H.A., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Обыкновенная игрунка - как модель вирусных гепатитов // Материалы Российской научной конференции: «Перспективы и направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях», Адлер- Сочи.-2006. - С.69-72.
3. Идрисова JI.P., Абдурахманов Д.Т., Лопаткина Т.Н., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Распространенность и клиническое значение латентной HBV-инфекции у больных хроническими заболеваниями печени // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2006.- №6.-С.66-72.
4. Ганина A.A., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Дмитриев П.Н., Потятынник О.Н. Частота выявления скрытой ВГВ-инфекции среди доноров крови и в группах риска инфицирования ВГВ // Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика. Материалы 7-ой научно-практической конференции.-М.-2007.-С.16-18.
5. Зотова A.B., Попова O.E., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Клушкина В.В., Вазыхова Ф.Г., Алексеева М.Н., Потятынник О.Н., Михайлов М.И. Распространённость вирусных гепатитов В и С среди оленеводов-кочевников в Республике Саха (Якутия) // Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика. Материалы 7-ой научно-практической конференции.-М.-2007,-С.28-29.
6. Идрисова JI.P., Лопаткина Т.Н., Кюрегян К.К., Мухин H.A., Михайлов М.И. Частота выявления и клиническое значение латентной HBV- инфекции у больных с хроническим заболеванием печени // Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика. Материалы 7-ой научно-практической конференции.-М.-2007.-С.34-35.
7. Полещук В.Ф., Замятина H.A., Петраков A.B., Кюрегян К.К., Попова O.E., Михайлов М.И. Изменения биохимических показателей крови у мармозет при экспериментальных гепатитах // Вирусные гепатиты - эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика .Материалы 7-ой научно- практической конференции. - М.-2007.-С.55-57.
8. Зотова A.B., Попова O.E., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Михайлов М.И. Распространенность вирусных гепатитов В и С среди населения оленеводов- кочевников в Республике Саха (Якутия) // Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ, Т.24- М.,2007.-С.181-183.
9. Полещук В.Ф., Кюрегян К.К., Замятина H.A., Гуляева Т.В., Петраков A.B., Попова O.E., Михайлов М.И. Моделирование гепатита Е на тамаринах (Saguinus mystax), мармозетах (Callithrix jacchus) и на яванских макаках (M.fascicularis) // Мир вирусных гепатитов. - 2008,- № 2.-С.2-5.
10. Жуман Авад А., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Михайлов М.И. Сравнительная характеристика двух тестов, предназначенных для качественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови и плазмы, основанных на применении двух разных методов детекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008.- № 8.-С.213-216.
11. Ганина A.A., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Дмитриев П.Н., Марданлы С.Г., Михайлов М.И. Частота выявления «скрытого» гепатита В среди лиц с наркотической зависимостью и доноров крови // Наркология. - 2008.- № 9.-С.70-74.
12. Ажигирова М.А., Дереза T.JL, Ципилева Т.А.. Орлова МЛ., Исаева О.В., Попова О.В., Потятынник О.Н., Кюрегян К.К., Михайлов М.И., Тетерина Т.А. Экспериментальное исследование инактивациии вируса в плазме крови с использованием метиленового синего // Гематология и трасфузиология.- 2008.- № 3.-С.54-56.
13. Солонин С.А., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Груздев К.Н., Михайлов М.И. Циркуляция вируса гепатита Е в свиноводческом хозяйстве // Мир вирусных гепатитов,-2009.-№ 1.-С.26-30.
14. Михайлов М.И., Малинникова Е.Ю., Кюрегян К.К., и др. Групповая заболеваемость гепатитом Е в г. Коврове Владимирской области (предварительное сообщение) // Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им. М.П.Чумакова, Т.26. - М.-2009.-С.239-245.
15. Цыганова Е.В., Знойко О.О., Солонин С.А., Петракова Н.В., Талло Т., Петрова Т., Мальков И.Г., Исаева О.В., Кюрегян К.К., Малинникова Е.Ю., Михайлов М.И., Видель А., Исагулянц М.Г., Малышев H.A. Описание клинического случая острого гепатита с ретроспективным обнаружением маркёров вирусов гепатитов Е и С // Мир вирусных гепатитов. - 2010. - № 1. - С. 29-36.
16. Малинникова Е.Ю., Лисицина Е.В., Кюрегян К.К., Исаева O.E., Каштанов Д.В., Морозов И.А., Ильченко JI. Ю., Михайлов М.И. Случай фульминантного автохтонного гепатита Е в неэндемичном регионе // Мир вирусных гепатитов. - 2010. - № 1. — С. 1928.
17. Viazov S, Ross SS, Kyuregyan KK, Timm J, Neumann-Haefelin С, Isaeva OV, Popova OE, Dmitriev PN, EI Sharkawi F, Thimme R, Michailov MI, Roggendorf M. Hepatitis С Virus Recombinants Are Rare Even Among Intravenous Drug Users // Journal of Medical Virology.-Vol. 82. -Issue 2. -2010.-P.232-238.
18. Попова O.E., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Исаева О.В., Кожанова Т.В., Дмитриев П.Н., Салчак Л.К., Глушко Э.А., Сарыглар A.A., Ооржак Н.Д., Ооржак А.Д., Михайлов М.И. Эпидемиологический и молекулярно-биологический анализ причин подъема заболеваемости гепатитом в республике Тыва в 2008 году // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии,- 2010.- № 3.-С.23-26.
19. Солонин С.А., Мальцева Н.С., Троценко O.E., Исаева О.В., Кюрегян К.К., Михайлов М.И., Попова O.E., Кожанова Т.В., Ott В.А., Каравянская Т.Н. Циркуляция вируса гепатита Е на территории Хабаровского края // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2010. — Т.1.-С.31-36.
20. Громова Н.И., Гордейчук И.В., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Клинико-эпидемиологические аспекты латентной HBV-инфекции // Кремлевская медицина. Клинический вестник.- 2010. -№3. C-2S-28.
21. Солонин С.А., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Гепатит Е у беременных (современное состояние проблемы) // Клинические перспективы гастроэнтерологии и гепатологии.- 2010. - № 3.-C.33-37.
22. Зотова A.B., Кюрегян К.К., Алексеева М.Н., Михайлов М.И. Инфицирование вирусом гепатита С коренного (эвенков) и некоренного населения Южной Якутии // Мир вирусных гепатитов. - 2010. - № 2..-С.20-23.
23. Кожанова Т.В., Исаева О.В., Клушкина В.В., Ооржак Н.Д., Саян P.M., Алексеева М.Н., Миронова Н.И., Громова Н.И., Знойко О.О., Цыкина М.Н., Ильченко Л.Ю., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Распространенность первичной лекарственной устойчивости вируса гепатита В к аналогам нуклеозидов и нуклеотидов у инфицированных вирусом пациентов в различных регионах России //Эпидемиология и вакцинопрофнлактнка.-2011.-№1 (56).-С.17-21.
24. Малинникова Е.Ю., Зайцев О.В., Исаева О.В., Кюрегян К.К., Ильченко Л.Ю., Михайлов М.И. Сравнительная клиническая характеристика гепатитов Е и А при групповой заболеваемости //Инфекционные болезни.- 2011.- т.9, №4.-С.11-16.
25. Кожанова Т.В., Исаева О.В., Клушкина В.В., Ооржак Н.Д., Саян P.M., Алексеева М.Н., Миронова Н.И., Громова Н.И., Знойко О.О., Цыкина М.Н., Ильченко Л.Ю., Кюрегян К.К., Михайлов М.И. Первичная лекарственная резистентность вируса гепатита В к аналогам нуклеоз(т)идов у ВГВ-инфицированных пациентов // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2011. - №18.-С.41-47.
26. Морозов И.А., Ильченко Л.Ю., Кюрегян К.К., Тотолян Г.Г., Федоров И.Г., Гордейчук И.В., Княженцева А.К., Михайлов М.И., Петренко Н.В., Патюков A.B., Сторожаков Г.И. Латентная HBV-инфекция и алгоритм ее выявления у пациентов с хроническими заболеваниями печени // В мире вирусных гепатитов. - 2011. -№1.-С.19-26.
27. Ильченко Л.Ю., Кожанова Т.В., Кюрегян К.К., Исаева О.В., Замятина H.A., Гордейчук И.В., Клушкина В.В., Гордейчук И.Н., Сарыглар A.A., Сонам-Байыр Я.Д., сарыг-Хаа О.Н., ооржак Н.Д., Саян P.M., Михайлов М.И. Клинико-биохимическая и вирусологическая характеристика хронической дельта-инфекции у пациентов, проживающих в Республике Тыва // В мире вирусных гепатитов. - 2011. -№2-3 .-С. 19-32.
Благодарности
Считаю своим приятным долгом выразить глубокую признательность за содействие в проведении исследований, внимание к работе, ценные рекомендации и теплое отношение моему научному консультанту и Учителю - доктору медицинских наук, профессору, член-корреспонденту РАМН Михаилу Ивановичу Михайлову. Благодарю за активную помощь в исследованиях, результатом которых явилась данная работа, сотрудников отдела вирусных гепатитов ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН: д.м.н., профессора Ильченко Л.Ю., к.б.н. Исаеву О.В., к.м.н. Попову O.E., к.м.н. Кожанову Т.В., к.м.н. Гордейчука И.В., к.м.н. Солонина С.А., к.м.н. Громову Н.И., к.м.н. Малинникову Е.Ю., к.м.н. Полещук В.Ф., Гуляеву Н.В., д.м.н., профессора И.А.Морозова. Искренне признателен сотрудникам следующих учреждений за плодотворное сотрудничество:
ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России - д.х.н. Ажигирова М.А.; ФГУ ВНИИЗЖ - д.б.н., профессор Груздев К.Н.; Институт вирусологии Университета Дуйсбург - Эссен (Германия): д.б.н. вязов С.О., профессор М.Роггендорф; ФГУН Хабаровский НИИЭМ Роспотребнадзора - директор, д.м.н. Троценко O.E.; Управление Роспотребнадзора по Свердловской области - д.м.н. Романенко В.В.; Управление Роспотребнадзора по Республике Тыва - Ооржак Н.Д. Глубокую признательность выражаю учёному секретарю Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, к.б.н. O.A. Медведкиной.
Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 100 Экз. Заказ № 1403 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кюрегян, Карен Каренович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Гепатит В.
1.1.1. Эпидемиология гепатита В.
1.1.2. Вирус гепатита В.
1.1.3. Диагностика гепатита В.
1.1.4. Скрытая ВГВ-инфекция.
1.1.5. Профилактика гепатита В.
1.1.6. Терапия гепатита В.
1.2. Гепатит дельта.
1.2.1. Клинические особенности, диагностика и терапия гепатита дельта.
1.2.2. Вирус гепатита дельта.
1.2.3. Эпидемиология гепатита дельта.
1.3. Гепатит С.
1.3.1. Эпидемиология гепатита С.
1.3.2. Вирус гепатита С.
1.3.3. Диагностика гепатита С.
1.3.4. Моделирование ВГС-инфекции.
1.4. Гепатит А.
1.4.1. Эпидемиология гепатита А.
1.4.2. Вирус гепатита А.
1.4.3. Профилактика инфицирования ВГА.
1.4.4. Надзор за циркуляцией вируса гепатита А с помощью методов молекулярно-биологического анализа.
1.5. Гепатит Е.
1.5.1. Клинические особенности и диагностика гепатита Е.
1.5.2. Вирус гепатита Е.
1.5.3. Эпидемиология гепатита Е.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Обследованные группы лиц.
2.1.1. Пациенты с хроническим гепатитом В.
2.1.2. Лица, относящиеся к группам повышенного риска инфицирования ВГВ.
2.1.3. Пациенты с хроническим гепатитом дельта.
2.1.4. Пациенты с хроническим гепатитом С.
2.1.5. Пациенты с гепатитом А.
2.1.6. Пациенты с гепатитом Е.
2.1.7. Лица, относящиеся к условно-здоровому населению РФ.
2.2. Образцы, полученные от животных.
2.2.1. Образцы сывороток крови домашний уток.
2.2.2. Образцы фекалий свиней.
2.2.3. Образцы воды.
2.3. Методы исследований.
2.3.1. Сбор и преаналитическая обработка образцов.
2.3.1.1. Образцы сыворотки крови.
2.3.1.2. Образцы биопсии печени.
2.3.1.3. Образцы фекалий.
2.3.1.4. Хранение образцов и данных.
2.3.2. Серологические маркеры вирусных гепатитов.
2.3.3. Выделение нуклеиновых кислот.
2.3.3.1. Выделение нуклеиновых кислот из образцов сыворотки крови
2.3.3.2. Выделение нуклеиновых кислот из образцов фекальных экстрактов.
2.3.3.3. Выделение нуклеиновых кислот из образцов биопсии печени
2.3.3.4. Выделение нуклеиновых кислот из образцов воды.
2.3.4. Молекулярные маркеры вирусных гепатитов.
2.3.4.1. Выявление РНК ВГА.
2.3.4.2. Выявление ДНК ВГВ.
2.3.4.3. Выявление ДНК ВГВ уток.
2.3.4.4. Выявление РНК ВГ0.
2.3.4.5. Выявление РНК ВГС.
2.3.4.6. Определение генотипа ВГС.
2.3.4.7. Выявление РНК GBV-B.
2.3.4.8. Выявление РНК ВГЕ.
2.3.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2.3.6. Анализ нуклеотидных последовательностей.
2.3.7. Создание химерных вирусоподобных частиц HBc/GBV-Bcore
2.3.8. Моделирование инфекции GBV-C на игрунковых обезьянах
2.3.9. Моделирование инфекции ВГВУ.
2.3.10. Методы статистического анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 3. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНТРОЛЯ
ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В.
3.1. Выявление ВГВ-инфекции.
3.1.1. Распространенность скрытой ВГВ-инфекции.
3.1.2. Контроль чувствительности тест-систем для выявления HBsAg
3.2. Терапия гепатита В.
3.2.1. Распространенность первичной лекарственной устойчивости
3.3. Контроль эффективности противовирусных препаратов, направленных против ВГВ.
3.3.1. Разработка системы оценки вируцидной активности дезинфицирующих средств с помощью модели in vivo инфекции вируса гепатита В уток.
3.3.2. Оценка эффективности вирусной инактивации в препаратах плазмы крови донорской крови с помощью модели in vivo инфекции вируса гепатита В уток.
Глава 4. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНТРОЛЯ
ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА ДЕЛЬТА.
4.1. Распространенность маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения Российской Федерации.
4.2. Анализ случаев хронического гепатита дельта в Республике Тыва.
Глава 5. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНТРОЛЯ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С.
Глава 7.
5.1. Определение генотипа ВГС.
5.2. Межгенотипическая рекомбинация ВГС.
5.3. Разработка суррогатной модели ВГС-инфекции и оценка возможностей ее применения.
Глава 6. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНТРОЛЯ
ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА А.
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОНТРОЛЯ
ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА Е.
Частота выявления антител к вирусу гепатита Е среди условно здорового населения.
7.2. Циркуляция вируса гепатита Е среди свиней в РФ.
7.3. Случаи спорадической и групповой заболеваемости ГЕ в РФ
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологические основы контроля вирусных гепатитов"
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Генетическое разнообразие является одним из важнейших факторов, определяющим особенности циркуляции вирусов, в том числе гепатотропных. Инфекции, вызываемые вирусами гепатита А, гепатита В и гепатита С, являются социально-значимыми в силу их широкого распространения и тяжести ассоциированного заболевания. Значимость инфекций, вызываемых вирусами гепатита дельта и вируса гепатита Е, возросла в последние годы с накоплением данных об их распространенности за пределами гиперэндемичных регионов и увеличении доли этих инфекций в структуре вирусных гепатитов. Само понятие «вирусные гепатиты» сегодня еще более сложное, чем 10 - 15 лет назад. Накапливаются сведения о влиянии гетерогенности популяций возбудителей вирусных гепатитов на развитие инфекционного и эпидемического процессов заболеваний, которые они вызывают. Применение методологического и аналитического арсенала молекулярной биологии и эпидемиологии способствует развитию понимания закономерностей циркуляции вирусов, вызывающих гепатит, и позволяет оптимизировать систему контроля этих инфекций. Следует отметить, что за пределами данной работы оставлены вирусы, роль которых в развитии заболевания печени не доказана - TTV, SEN, GBV-C (вирус гепатита G).
Новые данные о циркуляции и генетическом разнообразии гепатотропных вирусов, полученные с помощью молекулярно-биологических методов и приемов молекулярной эпидемиологии, значительно расширяют возможности контроля вирусных гепатитов и переводят его из разряда эмпирических действий в систему, базирующуюся на знании биологических закономерностей. Так, в случае гепатита В (ГВ) на данных молекулярной диагностики базируется изучение скрытой HBsAg-негативной формы инфекции и лекарственной устойчивости вируса гепатита В (ВГВ), генотипического разнообразия и рекомбинантных форм вируса гепатита С (ВГС). Понимание заложенных в геноме вируса способов избегать негативного влияния, и, как следствие, сохранения возбудителя как биологического вида, является основой диагностики и персонифицированной терапии вирусных гепатитов.
Другим важным аспектом контроля вирусных гепатитов является надзор за инфекциями и их регистрация. Две инфекции - гепатит дельта (ГО) и гепатит Е (ГЕ) не регистрируются в Российской Федерации (РФ) как самостоятельные нозологические формы. Сведения о циркуляции вирусов ГО и ГЕ и их генетическом разнообразии на территории РФ представляют ценность как для теоретической вирусологии, поскольку расширяют современные представления об эпидемиологии данных инфекций, так и для практического здравоохранения, так как помогают выявить группы риска и потенциальные источники инфицирования, а также указывают на необходимость внедрения и расширения диагностики ГО и ГЕ.
Полноценный эпидемиологический анализ, направленный на выявление источников и путей передачи инфекции, не возможен без анализа нуклеотидных последовательностей возбудителя. В РФ в силу большего числа случаев заболевания, географической удаленности и небольшого числа центров, способных проводить подобный анализ, оперативное применение методов молекулярной эпидемиологии при расследовании случаев гепатита А (ГА) является скорее исключением, чем правилом. Очевидно, что успешный контроль данной инфекции возможен только при создании обширной базы данных последовательностей вируса гепатита А (ВГА), циркулирующих на территории РФ, и включении молекулярных методов в систему эпидемиологического анализа случаев ГА.
Изучение многих аспектов вирусных гепатитов человека - оценки эффективности вакцинных и терапевтических препаратов, дезинфектантов, инфекционных свойств агентов, - невозможно без моделирования инфекции на животных. Альтернативой недоступной в настоящее время модели ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных является применение суррогатных моделей животных, например, инфекции игрунковых обезьян тамаринов и мармозет), вызываемой вирусом GBV-B. Для ГВ удобной суррогатной моделью является инфекция, вызываемая вирусом гепатита В уток (ВГВУ). Молекулярно-биологические методы позволяют детально охарактеризовать модельные инфекции и оценить возможности их применения в системе контроля вирусных гепатитов.
Перечисленные нерешенные проблемы в системе контроля инфекций, вызываемых гепатотропными вирусами, определили актуальность настоящей работы, ее цель и задачи.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цель работы - разработка комплекса мер по оптимизации системы контроля вирусных гепатитов, основанного на молекулярной диагностике и эпидемиологии данных инфекций.
Для достижения выбранной цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Определить распространенность скрытой ВГВ-инфекции в Российской Федерации, оценить ее значимость с точки зрения диагностики гепатита В и изучить роль мутаций, связанных с «иммунологическим бегством», в развитии скрытой ВГВ-инфекции.
2. Провести сравнительные испытания различных тест-систем для детекции HBsAg и оценить их чувствительность при выявлении мутантных вариантов вируса гепатита В.
3. Изучить распространенность первичной лекарственной устойчивости вируса гепатита В на основании анализа частоты выявления и спектра связанных с лекарственной резистентностью мутаций в гене полимеразы вируса гепатита В у пациентов, не получавших терапию аналогами нуклеоз(т)идов.
4. Разработать систему оценки эффективности вирусной инактивации и дезинфекции с помощью модели irt vivo инфекции вируса гепатита В уток.
5. Определить распространенность маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения Российской Федерации и проанализировать случаи хронического гепатита дельта в гиперэндемичном по гепатиту В регионе Российской Федерации (на примере Республики Тыва):
• Определить частоту выявления анти-ВГО и РНК В ГО среди НВзАд-положительных лиц, выявленных при обследовании условно-здорового населения шести регионов Российской Федерации с различной интенсивностью циркуляции ВГВ (Московской, Свердловской, Ростовской областей, Республики Саха (Якутия), Республики Тыва, Хабаровского края);
• Изучить генотипическое разнообразие вируса гепатита дельта, циркулирующего в Республике Тыва, определить частоту коинфекции ВГВ/ВГО и клинические исходы данной коинфекции в динамическом наблюдении.
6. Изучить структуру генотипов вируса гепатита С, циркулирующего на территории Российской Федерации, и ее изменения на протяжении последних пяти лет (2007-2011 гг.).
7. Выявить и охарактеризовать случаи межгенотипической рекомбинации вируса гепатита С.
8. Разработать суррогатную модель ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных, основанную на экспериментальном заражении игрунковых обезьян (мармозета обыкновенная, Са11ИИг1х /асскт) вирусом вВУ-В, и оценить возможности применения данной модели для оценки эффективности подходов к созданию прототипной вакцины против гепатита С:
• Воспроизвести экспериментальную инфекцию ОВУ-В на мелких приматах (мармозета обыкновенная, СаНиЬпх ]асскин) и определить основные характеристики модельной инфекции у данного вида животных (продолжительность виремии, клинические проявления, эволюция возбудителя на протяжении инфекции);
• Создать прототипный вакцинный препарат против GBV-B-инфекции на основе химерных вирусоподобных частиц, несущих В- и Т-клеточные эпитопы капсидного белка GBV-B, встроенные в носитель (капсидный белок вируса гепатита В);
• Оценить иммуногенные и протективные свойства полученного препарата в эксперименте in vivo на игрунковых обезьянах.
9. Усовершенствовать алгоритм расшифровки вспышек гепатита А с применением молекулярно-эпидемиологического анализа, включающего выявление РНК вируса гепатита А в объектах внешней среды и сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вирусов, выделенных от заболевших и из потенциальных факторов инфицирования (объектов среды).
10. Изучить интенсивность циркуляции вируса гепатита Е на территории Российской Федерации:
• Определить частоту выявления антител к вирусу гепатита Е среди условно здорового населения шести географически удаленных регионов Российской Федерации (Московской, Свердловской, Ростовской областей, Республики Саха (Якутия), Республики Тыва, Хабаровского края);
• Выявить и охарактеризовать случаи спорадической и групповой заболеваемости ГЕ в РФ;
• Определить распространенность вируса гепатита Е среди свиней в РФ и проанализировать генетические варианты вируса, выделенные от людей и животных.
Научная новизна
На основании новых данных по молекулярной биологии и эпидемиологии вирусных гепатитов разработан комплекс мер по усовершенствованию диагностики, профилактики и надзора за этими инфекциями.
Впервые проведен анализ распространенности скрытой HBsAg-негативной ВГВ-инфекции среди различных когорт, относящихся к условно-здоровому населению и к группам риска инфицирования ВГВ. Впервые установлено, что частота обнаружения скрытой ВГВ-инфекции определяется чувствительностью тестов, применяемых для выявления HBsAg. С помощью серологических и молекулярных тестов доказано, что применение даже самых чувствительных на сегодня методов детекции HBsAg не позволяет выявлять все случаи ВГВ-инфекции. Впервые проведен анализ нуклеотидных последовательностей генома ВГВ, выделенных от случаев скрытой инфекции на территории РФ. Полученные результаты продемонстрировали, что основной причиной развития скрытой формы ВГВ-инфекции является не наличие мутаций в а-детерминанте HBsAg, а низкий уровень вирусной репликации и продукции HBsAg.
Впервые получены данные о распространенности мутаций в геноме ВГВ, связанных с первичной лекарственной устойчивостью вируса. Показано, что доля случаев первичной лекарственной резистентности достигает 6,2% среди пациентов с ВГВ-моноинфекцией и 10,0% - среди пациентов с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией. Проведенный впервые анализ распространенности лекарственной резистентности ВГВ в разных регионах РФ указывает на вероятность потенциального увеличения доли резистентных штаммов ВГВ в общей популяции в результате длительного применения антивирусных агентов прямого действия.
Впервые получены данные о распространенности на территории РФ инфекции ВГВ уток (ВГВУ). Описан первый отечественный штамм ВГВУ, депонированный под названием «Уфа-04» во Всероссийском государственном Центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГБУ ВГНКИ). Проведенные исследования позволили воспроизвести и внедрить в систему оценки вирусной инактивации лабораторную модель ВГВУ-инфекции, являющейся суррогатной моделью инфекции ВГВ человека.
Впервые получены данные о распространенности маркеров гепатита дельта среди условно-здорового населения регионов РФ, различающихся по заболеваемости гепатитом В. Данные по частоте выявления анти-ВГО среди детей в возрасте до 10 лет являются первым документированным свидетельством защиты с помощью вакцинации против гепатита В от инфицирования ВГЭ.
На основании результатов пятилетнего наблюдения за структурой генотипов ВГС впервые показано увеличение доли генотипа 1а в общей структуре генотипов. Получены новые данные о циркуляции рекомбинантного варианта ВГС КР2к/1Ь; установлено, что все известные в настоящее время изоляты ВГС 2к/1Ь, по-видимому, являются потомками одного события рекомбинации.
Впервые воспроизведена инфекция ОВУ-В на обыкновенных мармозетах (СаНИпх }асскин) и определены основные характеристики модельной инфекции ОВУ-В у данного вида животных - продолжительность виремии, клинические проявления, эволюция возбудителя на протяжении инфекции. Впервые разработана прототипная вакцина против модельной инфекции ОВУ-В, основанная на вирусоподобных частицах ВГВ, несущих В-и Т-клеточные эпитопы ОВУ-В, для оценки возможности применения данного подхода к созданию вакцины против гепатита С. Несмотря на недостаточные протективные свойства созданного вакцинного препарата, результаты эксперимента впервые продемонстрировали, что вВУ-В-инфекция является ценной моделью для оценки перспективности различных подходов к созданию вакцины против гепатита С.
Впервые определена возрастная иммуноструктура вируса гепатита Е (ВГЕ) на территории Российской Федерации, выявлены возрастные группы и регионы, в которых анти-ВГЕ встречаются наиболее часто. Данные о выявлении анти-ВГЕ ^М среди условно-здорового населения являются первым прямым свидетельством о преимущественно бессимптомном протекании ВГЕ-инфекции в неэндемичных регионах. Получены новые данные о циркуляции ВГЕ среди свиней - установлено, что на большинстве обследованных свиноферм в РФ присутствует ВГЕ-инфекция, которая выявляется преимущественно у животных в возрасте 2-4 месяцев. Впервые получены данные о генотипическом разнообразии ВГЕ в регионе, установлено, что выделенные на территории РФ от людей и животных изоляты вируса принадлежат генотипу 3. Впервые продемонстрировано существование специфичных для каждого региона РФ вариантов ВГЕ.
Выявленные случаи спорадической и групповой заболеваемости гепатитом Е на неэндемичных по данной инфекции территориях, данные об интенсивной циркуляции ВГЕ среди свиней и о широкой распространенности пост-инфекционных антител к ВГЕ среди населения РФ позволяют пересмотреть существующие взгляды на эпидемиологию гепатита Е на неэндемичных территориях. Практическая значимость
Применение молекулярно-биологического подхода позволило расшифровать крупную вспышку гепатита А в Москве и Московской области, произошедшую в 2010г. Продемонстрировано преимущество методов преданалитической подготовки образцов воды с высоким фактором концентрирования для проведения поиска ВГА в образцах воды и смывах с объектов внешней среды при расшифровке вспышек гепатита А.
Установлено, что именно чувствительность ИФА-тестов для выявления HBsAg, а также включение в список мишеней этих тестов мутантных форм является ключевым моментом при диагностике ВГВ-инфекции. Тем не менее, продемонстрировано существование случаев скрытой инфекции, несмотря на применение для определения HBsAg высокочувствительных тестов, позволяющих выявлять основные мутации, связанные с «иммунным бегством». Эти данные указывают на важность скрининга донорской крови не только на HBsAg, но и на ДНК ВГВ для максимального снижения риска посттрансфузионного гепатита В.
Доказана необходимость проведения аттестации диагностикумов для определения HBsAg с помощью панелей нативных образцов, поскольку применение рекомбинантных антигенов для этой цели менее информативно.
Полученные данные об относительно широком распространении первичной лекарственной устойчивости ВГВ позволяют рекомендовать проведение анализа на наличие лекарственной резистентности для пациентов с ХГВ до начала проведения терапии. Такой анализ обеспечит адекватный подбор препарата ИОТ и позволит избежать применения заведомо неактивного противовирусного препарата.
Разработана система оценки эффективности вирус-инактивирующих препаратов, направленных против ВГВ, основанная на моделировании in vivo инфекции вируса гепатита В уток. Данная система валидирована для проведения испытаний дезинфицирующих препаратов, а также агентов для вирусной инактивации в службе крови, и включена в Методические указания по изучению и оценке вирулицидной активности дезинфицирующих средств 3.5.2431-08.
Продемонстрирована необходимость обязательного скрининга на антитела к ВГО всех лиц, положительных по HBsAg, а также регистрации гепатита дельта как отдельной нозологической формы в системе Государственного статистического наблюдения.
Установлено, что для рутинного генотипирования ВГС оптимальными с точки зрения чувствительности и специфичности являются системы генотипирования, мишенью которых является область core генома ВГС.
Разработана и успешно апробирована экспериментальная GBV-B инфекция у обыкновенных мармозет (Callitrix jaccus). Опыт применения данной суррогатной модели ВГС-инфекции на мелких лабораторных животных продемонстрировал, что она является удобным инструментом для оценки перспективности различных подходов к созданию вакцины против ГС.
Установлена необходимость включения диагностики гепатита Е в систему дифференциальной лабораторной диагностики гепатитов на территории Российской Федерации. Создана рабочая коллекция изолятов ВГЕ, выделенных на территории Российской Федерации. Собранная коллекция изолятов ВГЕ может применяться для проведения эпидемиологического анализа случаев гепатита Е и при разработке вакцины против этой инфекции.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработан комплекс мер по оптимизации системы контроля вирусных гепатитов, основанный на применении новых технологий диагностики, изучения генетической изменчивости вирусов и разработки биологических моделей этих инфекций.
2. Существование случаев скрытой HBsAg-негативной инфекции, распространенность которой достигает 2% даже при применении тестов для определения HBsAg с чувствительностью 0,01 нг/мл, указывает на необходимость внедрения одновременного определения ДНК ВГВ и HBsAg для диагностики гепатита В. Основной причиной развития скрытой формы ВГВ-инфекции является не наличие мутаций в a-детерминанте HBsAg, а низкий уровень вирусной репликации и продукции HBsAg.
3. Первичная лекарственная устойчивость ВГВ - относительно широко распространенное явление, в связи с этим представляется целесообразным проведение скрининга на лекарственную устойчивость ВГВ до начала противовирусной терапии для выбора адекватного препарата. Анализ первичной лекарственной устойчивости в регионах РФ позволяет прогнозировать увеличение доли резистентных штаммов.
4. Экспериментальная инфекция ВГВ уток (ВГВУ) in vivo, являющаяся суррогатной моделью ВГВ-инфекции человека, является оптимальным инструментом для оценки эффективности противовирусных препаратов разных классов, направленных на инактивацию ВГВ.
5. Необходимо введение официальной регистрации гепатита дельта как самостоятельной нозологической формы и обязательного тестирования всех позитивных по НВвАд лиц на маркеры ВГО (анти-ВГО, РНК ВГБ) для максимально ранней диагностики этой прогностически неблагоприятной инфекции. Вакцинации новорожденных против гепатита В обеспечивает эффективную защиту от инфицирования ВГО.
6. В Московском регионе наблюдается тенденция к увеличению доли генотипа 1а в структуре генотипов ВГС, при этом соотношение других генотипов вируса остается стабильным.
7. Рекомбинантная формы ВГС ИР2к/1Ь возникла в результате одного события рекомбинации и является устойчивой конкурентоспособной формой, циркулирующей среди инъекционных наркоманов.
8. Суррогатная модель ВГС-инфекции, основанная на экспериментальном заражении игрунковых обезьян (мармозет обыкновенных, СаИШпх /ассш) вирусом вВУ-В, является удобным инструментом для оценки перспективности подходов к созданию вакцины против гепатита С.
9. Выявление вирусного генетического материала в объектах внешней среды и филогенетический анализ геномных последовательностей ВГА, выделенных от заболевших и из объектов среды, должны быть включены в систему надзора за гепатитом А.
10. Значительная доля населения страны сталкивается на протяжении жизни с ВГЕ, при этом зачастую инфекция протекает бессимптомно, однако на негиперэндемичных по ГЕ территориях возможны автохтонные случаи как спорадической, так и групповой заболеваемости. Все автохтонные случаи ГЕ вызваны 3 генотипом ВГЕ.
11. ВГЕ распространен среди домашних свиней в РФ повсеместно, преимущественно инфицированы животные в возрасте 2-4 месяца, не достигшие возраста забоя. Для каждого региона РФ существуют, в рамках 3 генотипа вируса, специфичные варианты ВГЕ.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кюрегян, Карен Каренович
ВЫВОДЫ
1. Современные молекулярно-биологические методы диагностики, изучения генетической изменчивости вирусов и разработки биологических моделей вирусных гепатитов дали возможность получить как фундаментальные знания о поведении вирусных популяций (распространенность и спектр мутантных форм, характеристика скрытых форм инфекции), так и знания прикладного характера (система оценки эффективности противовирусных препаратов, усовершенствование алгоритма лабораторной диагностики и расшифровки вспышек гепатита), что позволило разработать комплекс мер по оптимизации системы контроля вирусных гепатитов.
2. Для оптимизации контроля вирусного гепатита В диагностика данной инфекции должна строиться на одновременном определении ДНК ВГВ и HBsAg. На необходимость этого указывает существование случаев скрытой НВзАд-негативной инфекции, распространенность которой достигает 2% даже при применении тестов для определения HBsAg с чувствительностью 0,01 нг/мл. Основной причиной развития скрытой формы ВГВ-инфекции является не наличие мутаций в ¿/-детерминанте HBsAg, а низкий уровень вирусной репликации и продукции HBsAg.
3. Частота выявления мутаций, связанных с первичной лекарственной устойчивостью ВГВ, составляет 6,2% среди пациентов с ВГВ-моноинфекцией и 10,0% - среди пациентов с ВГВ/ВИЧ-коинфекцией. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности проведения скрининга на лекарственную устойчивость ВГВ до начала противовирусной терапии для выбора адекватного препарата. Анализ первичной лекарственной устойчивости в регионах РФ позволяет связать данное явление с продолжительностью применения противовирусных препаратов в том или ином регионе, и прогнозировать увеличение доли резистентных штаммов со временем.
4. Существование крайне неблагополучных по гепатиту дельта регионов, таких, как Республика Тыва, где 46,6% инфицированных ВГВ имеют маркеры коинфекции ВГО, указывает на необходимость введения официальной регистрации гепатита дельта как самостоятельной нозологической формы и обязательного тестирования всех позитивных по HBsAg лиц на маркеры ВГО (анти-ВГО, РНК ВГО) для максимально ранней диагностики этой прогностически неблагоприятной инфекции. Отсутствие случаев выявления анти-ВГБ среди детей моложе 10 лет свидетельствует об эффективной защите от инфицирования ВГО с помощью вакцинации новорожденных против гепатита В.
5. В Московском регионе наблюдается тенденция к увеличению доли генотипа 1а в структуре генотипов ВГС, от 1,1% до 7,7% (р<0,05), при этом соотношение генотипов Ib, 2а и За остается стабильным. Среди инъекционных наркоманов отмечена циркуляция рекомбинантной формы ВГС RF2k/lb, являющейся устойчивой конкурентоспособной формой. Анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента кодирующего участка NS2, в котором находится точка рекомбинации, позволил установить принадлежность всех известных изолятов RF2k/lb к одному рекомбинантному штамму ВГС, возникшему в результате одного события рекомбинации.
6. Разработана система оценки эффективности противовирусных препаратов, направленных против ВГВ и ВГС, с помощью суррогатных инфекций in vivo. Для испытания противовирусной активности препаратов разных классов, направленных против ВГВ, разработана и успешно апробирована модель инфекции ВГВ уток. В качестве суррогатной модели ВГС воспроизведена модель GBV-B-инфекции игрунковых обезьян, в эксперименте in vivo продемонстрировано, что она является удобным инструментом для оценки перспективности подходов к созданию вакцины против гепатита С.
7. Молекулярно-эпидемиологический анализ случаев гепатита А, ассоциированных с резким подъемом заболеваемости в г. Москва в декабре 2009 - январе 2010 гг., позволил доказать развитие пищевой вспышки данной инфекции. Выявление РНК ВГА в образцах воды, взятых на пищевом предприятии, позволило установить изначально водный характер вспышки с последующей реализацией пищевого пути передачи инфекции. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости внедрения чувствительных методов выявления вирусного генетического материала в объектах внешней среды в систему надзора за гепатитом А.
8. Частота выявления анти-ВГЕ среди условно-здорового населения РФ составляет в среднем 4,1%, при этом наблюдается резкое (до 28%) увеличение частоты выявления анти-ВГЕ среди лиц старше 60 лет. Полученные результаты свидетельствуют о том, что значительная доля населения страны сталкивается на протяжении жизни с ВГЕ. Впервые определены молекулярно-эпидемиологические характеристики автохтонных случаев групповой заболеваемости ГЕ на негиперэндемичной территории, получены данные, опровергающие существующее мнение об отсутствии вспышечной заболеваемости вне стран с жарким климатом. Установлено, что все изоляты ВГЕ, выделенные на территории РФ от людей и животных, принадлежат генотипу 3. ВГЕ распространен среди домашних свиней в РФ повсеместно, преимущественно инфицированы животные в возрасте 2-4 месяца, не достигшие возраста забоя. Анализ нуклеотидных последовательностей ВГЕ показал существование специфичных для каждого региона вариантов ВГЕ.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кюрегян, Карен Каренович, Москва
1. Абдурахманов Д.Т. Хронический гепатит дельта: клинико-морфологическая характеристика, течение и исходы. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2004.-N 4.-С.14-17, 2009.
2. Балаян М.С., Михайлов М.И. Энциколопедический словарь — Вирусные гепатиты. — М.: Амипресс, 1999.
3. Быстрова Т.Н., Полянина A.B., Княгина О.Н. Характеристика гепатит Е инфекции на территории с умеренным климатом // Медицинский альманах. - 2010. - №2. - С. 236-239.
4. Вакцины и вакцинация: Национальное руководство / под редакцией В.В.Зверева, Б.Ф.Семенова, Р.М.Хаитова. М.: ГЭОТАР-Медиа,2001. -880с.
5. Вирусные гепатиты в Российской Федерации. Аналитический обзор. 8 выпуск / Под ред. В.И.Покровского, А.Б.Жебруна. СПб.: ФБУН НИИЭМ имени Пастера, 2011. - 116с.
6. Галимова С.Ф., Маевская М.В., Ивашкин В.Т. Новый аналог нуклеозидов телбивудин в лечении хронического гепатита В // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. 2007. - № 5. - С. 55-60.
7. Горчакова О.В., Эсауленко Е.В., Мукомолов СЛ. Длительность циркуляции РНК вируса в крови больных гепатитом А. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. - N 5. - С. 20-23.
8. Кузьменко Е.В., Вахнина Л.Н. К вопросу о частоте обнаружения антител к вирусу гепатита Е у населения неэндемичных регионов на примере Магаданской области // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2004. - №5. - С. 67-68.
9. Ю.Михайлов М.И., Замятина H.A., Полещук В.Ф. Приматные модели вирусных гепатитов человека. Вопросы вирусологии, 2006.-N 4.-С.6-13.
10. Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Г. Энтеральные вирусные гепатиты (этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика). — М.: ВУНМЦ Росздрава, 2007.
11. Мукомолов СЛ., Парков Р.В, Давидкин И и др. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика вспышки гепатита А средиработников сети продовольственных магазинов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2008. - N 4. - С. 42-45.
12. Полещук В.Ф., Михайлов М.И., Замятина Н.А. Приматные модели вирусных гепатитов человека // Вопросы вирусологии. 2006. - №4. -С. 6-13.
13. Н.Фёдорова О. Е. Балаян М.С., Михайлов М. И. и др. Гепатит Е в неэндемичном районе антитела к вирусу гепатита Е в различных группах населения // Вопросы вирусологии. - 1996. - №41. - С. 104107.
14. Шаханина И.Л., Остова Л.А. Экономический ущерб от гепатита А в Российской Федерации. Эпидемиология и инфекционные болезни, 1999.-N 4.-С.22-24
15. Шахгильдян И. В., Михайлов М. И., Онищенко Г. Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). Москва, ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2003. — 384 с.
16. Abe К, Hayakawa Е, Sminov AV, Rossina AL, Ding X, Huy TT, Sata T, Uchaikin VF. Molecular epidemiology of hepatitis В, C, D and E viruses among children in Moscow, Russia. J Clin Virol. 2004 May;30(l):57-61.
17. Abou-Jaoude G, Molina S, Maurel P, Sureau C. Myristoylation signal transfer from the large to the middle or the small HBV envelope protein leads to a loss of HDV particles infectivity. Virology 2007; 365: 204-09.
18. Adlhoch C, Wolf A, Meisel H, Kaiser M, Ellerbrok H, Pauli G. High HEV presence in four different wild boar populations in East and West Germany. Vet Microbiol. 2009 Nov 18;139(3-4):270-8. Epub 2009 Jun 26.
19. Aggarwal R., Kini D., Sofat S. et al. Duration of viraemia and faecal viral excretion in acute hepatitis E // Lancet. 2000. - Vol. 356. - P. 1081-1082.
20. Ahn SH, Yuen L, Han KH, Littlejohn M, Chang HY, Damerow H, Ayres A, Heo J, Locarnini S, Revill PA. Molecular and clinical characteristics of hepatitis B virus in Korea. J Med Virol. 2010 Jul;82(7):l 126-34.
21. Aitken C.K. h ap. Consecutive infections and clearances of different hepatitis C virus genotypes in an injecting drug user // J. Clin. Virol. 2008. T. 41. №4. C. 293-296.
22. Alter M.J. Epidemiology of hepatitis C virus infection // World J. Gastroenterol. 2007. T. 13. № 17. C. 2436-2441.
23. Alter M.J. h The natural history of community-acquired hepatitis C in the United States. The Sentinel Counties Chronic non-A, non-B Hepatitis Study Team // N. Engl. J. Med. 1992. T. 327. № 27. C. 1899-1905.
24. Andernach IE, Nolte C, Pape JW, Muller CP. Slave trade and hepatitis B virus genotypes and subgenotypes in Haiti and Africa. Emerg Infect Dis. 2009 Aug; 15(8): 1222-8.
25. Andre F., Van Damme P., Safary A et al. Inactivated Hepatitis A Vaccine: immunogenicity, efficacy, safety and review of official recommendations for use // Expert Rev.Vaccines. — 2002. — Vol. 1(1). — P. 9-23
26. Arauz-Ruiz, P., Sundqvist, L., Garcia, Z., Taylor, L., Visona, K., Morder, H., Magnius, L.O., 2001. Presumed common source outbreaks of hepatitis A in an endemic area confirmed by limited sequencing within the VP1 region. J.Med. Virol. 65, 456-499.
27. Armstrong GL, Wasley A, Simard EP, McQuillan GM, Kuhnert WL, Alter MJ. The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1999 through 2002. Ann Intern Med. 2006 May 16;144(10):705-14.
28. Atmar, R. L., T. G. Metcalf, F. H. Neill, and M. K. Estes. 1993. Detection of enteric viruses in oysters by using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 59:631-635.
29. Balayan M.S., Andjaparidze A.G., Savinskaya S.S.et al. Evidence for a virus in non-A, non-B hepatitis transmitted via the fecal-oral route // Intervirology. 1983.-Vol. 20.-P. 23-31.
30. Banatvala J, Van Damme P, Oehen S. Lifelong protection against hepatitis B: the role of vaccine immunogenicity in immune memory. Vaccine 2000;19:877-85.
31. Banks M, Bendall R, Grierson S, Heath G, Mitchell J, Dalton H. Human and porcine hepatitis E virus strains, United Kingdom. Emerg Infect Dis. 2004 May;10(5):953-5.
32. Barrera A, Guerra B, Notvall L, Lanford RE. Mapping of the hepatitis B virus pre-Sl domain involved in receptor recognition. J Virol 2005; 79: 9786-98.
33. Bartenschlager R. The hepatitis C virus replicon system: from basic research to clinical application. J Hepatol 2005; 43: 210-216.
34. Bartholomeusz A., Locarnini S.A. Antiviral daig resistance: clinical consequences and molecular aspect // Semin Liver Dis. 2006. - Vol. 26. -P. 162-170.
35. Batts W, Yun S, Hedrick R, Winton J. A novel member of the family Hepeviridae from cutthroat trout (Oncorhynchus clarkii). Virus Res. 2011 Jun;158(l-2):116-23.
36. Beames, B., Chavez, D., Guerra, B., Notvall, L., Brasky, K.M., Lanford, R.E., 2000. Development of a primary tamarin hepatocyte culture system for GB virus-B: a surrogate model for hepatitis C vims. J. Virol. 74, 1176411772.
37. Beames, B., Chavez, D., Lanford, R.E., 2001. GB virus B as a model for hepatitis C virus. ILAR J. 42, 152-160.
38. Becher P., Orlich M., Thiel H.J. RNA recombination between persisting pestivims and a vaccine strain: generation of cytopathogenic virus and induction of lethal disease // J. Virol. 2001. T. 75. № 14. C. 6256-6264.
39. Beck J., Nassal M. Hepatitis B virus replication // World J. Gastroenterol. — 2007. Vol. 1. —P. 48-64.
40. Bellecave P., Gouttenoire J., Gajer M. et al. Hepatitis B and C virus coinfection: a novel model system reveals the absence of direct viral interference // Hepatology. — 2009. — Vol. 1. — P. 46-55.
41. Beneduce F, Pisani G, Divizia M, Pana A, Morace G. Complete nucleotide sequence of a cytopathic hepatitis A virus strain isolated in Italy. Virus Res. 1995 May;36(2-3):299-309.
42. Beniwal M., Kumar A., Kar P. Prevalence and severity of acute viral hepatitis and fulminant hepatitis during pregnancy: A prospective study from north India // Indian J. Med. Microbiol. 2003. - Vol. 21. - P. 184185.
43. Bi SL, Purdy MA, McCaustland KA, Margolis HS, Bradley DW. The sequence of hepatitis E virus isolated directly from a single source during an outbreak in China. Virus Res. 1993 Jun;28(3):233-47.
44. Bilic I., Jaskulska B., Basic A. et al. Sequence analysis and comparison of avian hepatitis E viruses from Australia and Europe indicate the existence of different genotypes // J. Gen. Virol. 2009. - Vol. 90. - P. 863-873.
45. Bock C.T., Schwinn C., Locarnini S. et al. Structural organization of the hepatitis B virus minichromosome // J. Mol. Biol. — 2001. — Vol. 1. — P.183-196.
46. Borresen ML, Olsen OR, Ladefoged K, et al. Hepatitis D outbreak among children in a hepatitis B hyper-endemic settlement in Greenland. J Viral Hepat 2010; 17: 162-70.
47. Boutrouille A., Bakkali-Kassimi L., Cruciere C. et al. Prevalence of antihepatitis E virus antibodies in French blood donors // J. Clin. Microbiol. -2007. Vol. 45. - P. 2009-2010.
48. Brechot C. Pathogenesis of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma: old and new paradigms // Gastroenterology. — 2004. — Vol. 5. — P. 56-61.
49. Breum S.O., Hjulsager C.K., de Deus N. et al. Hepatitis E virus is highly prevalent in the Danish pig population // Vet Microbiol. 2010 May 10.
50. Bright, H., Carroll, A.R., Watts, P.A., Fenton, R.J., 2004. Development of a GB virus B marmoset model and its validation with a novel series of hepatitis C virus NS3 protease inhibitors. J. Virol. 78, 2062-2071.
51. Brown, E.A., Jansen, R.W., Lemon, S.M., 1989. Characterization of a simian hepatitis A virus (HAV): antigenic and genetic comparison with human HAV. J. Virol. 63, 4932-4937.
52. Bukh, J., Apgar, C.L., Govindarajan, S., Purcell, R.H., 2001. Host range studies of GB virus-B hepatitis agent, the closest relative of hepatitis C virus, in New World monkeys and chimpanzees. J. Med. Virol. 65, 694-697.
53. Pumpens P, Grens E. HBV core particles as a carrier for B cell/T cell epitopes. Intervirology. 2001;44(2-3):98-l 14.
54. Bukh, J., Apgar, C.L., Yanagi, M., 1999. Toward a surrogate model for hepatitis C virus: an infectious molecular clone of the GB virus-B hepatitis agent. Virology 262,470^178.
55. Cacciola I., Pollicino T., Squadrito G. et al. Occult hepatitis B virus infection in patients with chronic hepatitis C liver disease // N. Engl. J. Med. — 1999. — Vol. 1. — P. 22-26.
56. Candotti D, Lin CK, Belkhiri D, Sakuldamrongpanich T, Biswas S, Lin S, Teo D, Ayob Y, Allain JP. Occult hepatitis B infection in blood donors from South East Asia: molecular characterisation and potential mechanisms of occurrence. Gut. 2012 Jan 20.
57. Carman W.F. The clinical significance of surface antigen variants of hepatitis B virus // J. Viral Hepat. — 1997. — Vol. 4. — P. 11-20.
58. Casey JL, Brown TL, Colan EJ, Wignall FS, Gerin JL. A genotype of hepatitis D virus that occurs in northern South America. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 9016-20.
59. Casey JL, Niro GA, Engle RE, et al. Hepatitis B virus (HBV)/hepatitis D virus (HDV) coinfection in outbreaks of acute hepatitis in the Peruvian Amazon basin: the roles of HDV genotype III and HBV genotype F. J Infect Dis 1996; 174: 920-26.
60. CasteInau C, Le Gal F, Ripault MP, et al. Efficacy of peginterferon alpha-2b in chronic hepatitis delta: relevance of quantitative RT-PCR for follow-up. Hepatology 2006; 44: 728-35.
61. CDC. Surveillance for acute viral hepatitis—United States, 2008
62. Chan S.W. h ;jp. Analysis of a new hepatitis C virus type and its phylogenetic relationship to existing variants // J. Gen. Virol. 1992. T. 73 (Pt 5). C. 1131-1141.
63. Chandra V., Kar-Roy A., Kumari S. et al. The hepatitis E virus ORF3 protein modulates epidermal growth factor receptor trafficking, STAT3 translocation, and the acute-phase response // J. Virol. 2008. - Vol. 82. -P. 7100-7110.
64. Chang M.-H. Breakthrough HBV infection in vaccinated children in Taiwan: surveillance for HBV mutants. Review. Antiviral Therapy 2010, 15:463-469.
65. Chang, S. F., Netter, H. J., Bruns, M., Schneider, R„ Froelich, K. & Will, H. (1999). A new avian hepadnavirus infecting snow geese (Anser caerulescens) produces a signicant fraction of virions containing singlestranded DNA. Virology 262, 39±54.
66. Chaves SS, Groeger J, Helgenberger L, Auerbach SB, Bialek SR, Hu DJ, Drobeniuc J. Improved anamnestic response among adolescents boosted with a higher dose of the hepatitis B vaccine. Vaccine. 2010 Apr l;28(16):2860-4.
67. Chayama K, Tsubota A, Koida I, Arase Y, Saitoh S, Ikeda K, Kumada H. Nucleotide sequence of hepatitis C virus (type 3b) isolated from a Japanese patient with chronic hepatitis C. J Gen Virol. 1994 Dec;75 ( Pt 12):3623-8.
68. Chironna M, Grottola A, Lanave C, Villa E, Barbuti S, Quarto M. Genetic analysis of HAV strains recovered from patients with acute hepatitis from Southern Italy. J Med Virol. 2003 Jul;70(3):343-9.
69. Chisari F.V., Pasquinelli C., Shoenberger J.M., et al. Hepatitis C vims core and E2 protein expression in transgenic mice // Hepatology. — 1997. — Vol. 3. —P. 719-727.
70. Chobe LP, Lole KS, Arankalle VA. Full genome sequence and analysis of Indian swine hepatitis E virus isolate of genotype 4. Vet Microbiol. 2006 May 31; 114(3-4):240-51. Epub 2006 Feb 2.
71. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome Science 1989;244:359-362. // J. Hepatol. 2002. T. 36. № 5. C. 582-585.
72. Christensen P.B., Engle R.E., Jacobsen S.E. High prevalence of hepatitis E antibodies among Danish prisoners and drug users // J. Med. Virol. 2002. -Vol. 66.-P. 49-55.
73. Clemente-Casares P., Pina S., Buti M. et al. Hepatitis E virus epidemiology in industrialized countries // Emerg. Infect. Dis. 2003. - Vol. 9. - P. 448454.
74. Cohen JI, Ticehurst JR, Purcell RH, Buckler-White A, Baroudy BM. Complete nucleotide sequence of wild-type hepatitis A virus: comparison with different strains of hepatitis A virus and other picornaviruses. J Virol. 1987 Jan;61(l):50-9.
75. Cohen, L., Benichou, D., Martin, A., 2002. Analysis of deletion mutants indicates that the 2A polypeptide of hepatitis A virus participates in virion morphogenesis. J. Virol. 76, 7495-7505.
76. Colina, R; Casane, D; Vasquez, S; Garcia-Aguirre, L; Chunga, A; Romero, H; Khan, B; Cristina, J. Evidence of intratypic recombination in natural populations of hepatitis C virus. J Gen Virol. 2004;85:31-37.
77. Colson P., Borentain P., Queyriaux B. et al. Pig Liver Sausage as a Source of Hepatitis E Virus Transmission to Humans // J. Infect. Dis. 2010 Aug 9.
78. Costa-Mattioli, M., Domingo, E., Cristina, J., 2006. Analysis of sequential hepatitis A virus strains reveals coexistence of distinct viral subpopulations. J. Gen. Virol. 87, 115-118.
79. Cova L., Zoulim F.,2004. Duck hepatitis B virus model in the study of hepatitis B virus. Methods in molecular medicine, vol.96: Hepatitis B anb D protocols, volume 2, 261-26.
80. Cristina J, Costa-Mattioli M. Genetic variability and molecular evolution of hepatitis A virus. Virus Res. 2007 Aug; 127(2): 151-7.
81. Cristina, J; Colina, R. Evidence of structural genomic region recombination in Hepatitis C virus. Virology J.2006;3:53-56.
82. Cross TJ, Rizzi P, Horner M, et al. The increasing prevalence of hepatitis delta vims (HDV) infection in South London. J Med Virol 2008; 80: 277-82.
83. Dalekos G.N., Zervou E., Elisaf M. Et al. Antibodies to hepatitis E virus among several populations in Greece: increased prevalence in a hemodialysis unit // Transfusion 1998. - Vol. 38. - P. 589-595.
84. Dalton H.R., Fellows H.J., Gane E. J. et al. Hepatitis E in New Zealand. // Gastroenterol. Hepatol. 2007. - Vol. 22. - P. 1236-1240.
85. Dalton H.R., Stableforth W., Hazeldine S. et al. Autochthonous hepatitis E in Southwest England: a comparison with hepatitis A // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2008. - Vol. 27. - P. 579-585.
86. Davaalkham D, Ojima T, Uehara R, Watanabe M, Oki I, Endo K, Takahashi M, Okamoto H, Nakamura Y. Analysis of hepatitis B surface antigen mutations in Mongolia: molecular epidemiology and implications for mass vaccination. Arch Virol. 2007;152(3):575-84.
87. Demetriou VL, Kyriakou E, Kostrikis LG. Near-full genome characterisation of two natural intergenotypic 2k/lb recombinant hepatitis C virus isolates. Adv Virol. 2011;2011:710438.
88. Dentiger, C. M., W. A. Bower, O. V. Nainan, S. M. Cotter, G. Myers, L. M. Dubusky, S. Fowler, E. D. Salehi, and B. P. Bell. 2001. An outbreak of hepatitis A associated with green onions. J. Infect. Dis. 183:1273-1276.
89. Dentinger CM, McMahon BJ, Butler JC, Dunaway CE, Zanis CL, Bulkow LR, et al. Persistence of antibody to hepatitis B and protection from disease among Alaska natives immunized at birth. Pediatr Infect Dis J 2005;24:786-92.
90. Deny P. Hepatitis delta virus genetic variability: from genotypes I, II, III to eight major clades? Curr Top Microbiol Immunol 2006; 307: 151-71.
91. Di Bartolo I., Martelli F., Inglese N. et al. Widespread diffusion of genotype 3 hepatitis E virus among farming swine in Northern Italy // Vet. Microbiol. 2008. - Vol. 132. - P. 47-55.
92. Di Lello FA, Pineiro Y Leone FG, Munoz G, Campos RH. Diversity of hepatitis B and C viruses in Chile. J Med Virol. 2009 Nov;81(l 1):1887-94.
93. Dolja V.V., Carrington G. C. Hepatitis E virus // Semin. Virol. 1992. -Vol. 3.-P. 315-326.
94. Drobeniuc J., Favorov M.O., Shapiro C.N. et al. Hepatitis E virus antibody prevalence among persons who work with swine // J. Infect. Dis. -2001.-Vol. 184.-P. 1594-1597.
95. Drobeniuc J., Meng J., Reuter G. et al. Serologic assays specific to immunoglobulin M antibodies against hepatitis E virus: pangenotypic evaluation of performances // Clin. Infect. Dis. 2010. - Vol.51 (3):e24-7.
96. Ducancelle A., Payan C., Nicand E. et al. Intrafamilial hepatitis E in France // J. Clin. Virol. 2007. - Vol. 39. - P. 51-53.
97. EASL International Consensus Conference on Hepatitis C. Consensus Statement. 1999. Hepatology 30:956-961.
98. El-Sherif A., Abou-Shady M„ Abou-Zeid H. et al. Antibody to hepatitis B core antigen as a screening test for occult hepatitis B virus infection in Egyptian chronic hepatitis C patients // J. Gastroenterol. — 2009. — Vol.4. —P. 359-364.
99. Emerson S.U., Anderson D., Arankalle V.A. et al., Hepevirus. In: Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., Desselberger U., Ball L.A., eds. Virus Taxonomy, VHIth Report of the ICTV. London: Elsevier /Academic Press. 2004. - P. 851-855.
100. Emerson S.U., Arankalle V.A., Purcell R.H. Thermal stability of hepatitis E virus // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 930-933.
101. Emerson S.U., Pureell R.H. Hepatitis E viais // Rev. Med. Virol. -2003.-Vol. 13.-P. 145-54.
102. Endo K, Takahashi M, Masuko K, Inoue K, Akahane Y, Okamoto H. Full-length sequences of subgenotype IIIA and IIIB hepatitis A virus isolates: characterization of genotype III HAV genomes. Virus Res. 2007 Jun;126(l-2): 116-27.
103. Engelke M, Mills K, Seitz S, et al. Characterization of a hepatitis B and hepatitis delta virus receptor binding site. Hepatology 2006; 43: 750-60.
104. Esteban J.I. h .zip. Transmission of hepatitis C virus by a cardiac surgeon//N. Engl. J. Med. 1996. T. 334. № 9. C. 555-560.
105. Farci P, Roskams T, Chessa L, et al. Long-term benefit of interferon alpha therapy of chronic hepatitis D: regression of advanced hepatic fibrosis. Gastroenterology 2004; 126: 1740-49.
106. Farci P. Delta hepatitis: an update. J Hepatol 2003; 39 (suppl 1): S212-19.
107. Fattovich G, Boscaro S, Noventa F, et al. Influence of hepatitis delta virus infection on progression to cirrhosis in chronic hepatitis type B. J Infect Dis 1987; 155: 931-35.
108. Feagins A.R., Opriessnig T., Guenette D.K. et al. Detection and characterization of infectious Hepatitis E virus from commercial pig livers sold in local grocery stores in the USA // J. Gen. Virol. 2007. - Vol. 88. -P. 912-917.
109. Femández-Barredo S., Galiana C., Garcia A. et al. Prevalence and genetic characterization of hepatitis E virus in paired samples of feces and serum from naturally infected pigs // Can. J. Vet. Res. 2007. - Vol. 71. - P. 236-240.
110. Fitzsimons D, Francois G, Hall A, et al: Long-term efficacy of hepatitis B vaccine, booster policy, and impact of hepatitis B virus mutants. Vaccine 2005; 23(32):4158-4166.
111. Flodgren E, Bengtsson S, Knutsson M, et al. Recent high incidence of fulminant hepatitis in Samara, Russia: molecular analysis of prevailing hepatitis B and D virus strains. J Clin Microbiol 2000; 38: 3311-16.
112. Floreani A, Baldo V, Cristofoletti M, et al: Long-term persistence of anti-HBs after vaccination against HBV: an 18 year experience in health care workers. Vaccine 2004; 22(5-6):607-610.
113. Fogeda M, de Ory F, Avellón A, Echevarría JM. Differential diagnosis of hepatitis E virus, cytomegalovirus and Epstein-Barr virus infection in patients with suspected hepatitis E. J Clin Virol, 2009 Jul;45(3):259-61
114. Forgách P, Nowotny N, Erdélyi K, Boncz A, Zentai J, Szucs G, Reuter G, Bakonyi T. Detection of hepatitis E virus in samples of animal origin collected in Hungary. Vet Microbiol. 2010 Jul 14;143(2-4):106-16. Epub 2009 Nov 18.
115. Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR et al. 2002. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Med 347:975982.
116. Fu H., Li L., Zhu Y. et al. Hepatitis E vims infection among animals and humans in Xinjiang, China: possibility of swine to human transmission of sporadic hepatitis E in an endemic area // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2010. -Vol. 82.-P. 961-966.
117. Fujiwara K, Yokosuka O, Fukai K, Imazeki F, Saisho H, Omata M. Analysis of full-length hepatitis A virus genome in sera from patients with fulminant and self-limited acute type A hepatitis. J Hepatol. 2001 Jul;35(l):l 12-9.
118. Gaeta GB, Stroffolini T, Chiaramonte M, et al. Chronic hepatitis D: a vanishing Disease? An Italian multicenter study. Hepatology 2000; 32: 82427.
119. Galiana C., Fernández-Barredo S., Pérez-Gracia M.T. Prevalence of hepatitis E virus (HEV) and risk factors in pig workers and blood donors // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2010 May 28.
120. Ganem D., Prince A.M. Hepatitis B virus infection — natural history and clinical consequences // N. Engl. J. Med. — 2004. — Vol. 11. — P. 1118-1129.
121. Gerlich W.H., Brener C., Saniewski M. et al. Occult hepatitis B virus infection: detection and significance // Dig Dis. — 2010. — Vol. 1. — P.l 16-125.
122. Ghany MG, Strader DB, Thomas DL et al. 2009. Diagnosis, management and treatment of hepatitis C: an update. Hepatology 49:13351374.
123. Glebe D. Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol 2007 January 7; 13(1): 14-21.
124. Gosert, R., Egger, D., Bienz, K.A., 2000. A cytopathic and a cell culture adapted hepatitis A virus strain differ in cell killing but not in intracellular membrane rearrangements. Virology 266, 157-169.
125. Gouvea V, Snellings N, Popek MJ, Longer CF, Innis BL. Hepatitis E virus: complete genome sequence and phylogenetic analysis of a Nepali isolate. Virus Res. 1998 Sep;57(l):21-6.
126. Govindarajan S, Chin KP, Redeker AG, Peters RL. Fulminant B viral hepatitis: role of delta agent. Gastroenterology 1984; 86: 1417-20.
127. Gowland P, Fontana S, Niederhauser C, Taleghani BM. Molecular and serologic tracing of a transfusion-transmitted hepatitis A virus. Transfusion. 2004 Nov;44(l 1): 1555-61.
128. Graff J, Normann A, Feinstone SM, Flehmig B. Nucleotide sequence of wild-type hepatitis A virus GBM in comparison with two cell culture-adapted variants. J Virol. 1994 Jan;68(l):548-54.
129. Griffin S.D.C. h ap. The p7 protein of hepatitis C virus forms an ion channel that is blocked by the antiviral drug, Amantadine // FEBS Lett. 2003. T. 535. № 1-3. C. 34-38.
130. Gudima S, Chang J, Moraleda G, Azvolinsky A, Taylor J. Parameters of human hepatitis delta vims genome replication: the quantity, quality, and intracellular distribution of viral proteins and RNA. J Virol 2002; 76: 370919.
131. Hadler SC, De Monzon M, Ponzetto A, et al. Delta virus infectionand severe hepatitis. An epidemic in the Yucpa Indians of Venezuela. Ann Intern Med 1984; 100: 339-44.
132. Hadziyannis SJ, Sette H Jr., Morgan TR et al. 2004. Peginterferon-alpha. 2a and ribavirin combination therapy in chronic hepatitis C: a randomized study of treatment duration and ribavirin dose. Ann Intern Med 140:346-355.
133. Halbur P.G. Attempt to transmit swine hepatitis E virus (HEV) by consumption of fresh and frozen pork loin or liver NPB 04-087 http://www.pork.org/FileLibrary/ResearchDocuments/04-087-HALBUR-ISU.pdf
134. Hamatake R.K., Lau J.Y.N. Hepatitis B and D protocols // Humana press Inc.— 2004. — Vol. 1.
135. Hammitt L.L., Bulkow L., Hennessy T.W. et al. Persistence of antibody to hepatitis A virus 10 years after vaccination among children and adults//J Infect Dis. — 2008. — Vol. 198(12). —P. 1776-1782.
136. Hass M., Hannoun C., Kalinina T. et al. Functional analysis of hepatitis B virus reactivating in hepatitis B surface antigen-negative individuals // Hepatology. — 2005. — Vol. 1. — P. 93-103
137. Heidrich B, Deterding K, Tillmann HL, Raupach R, Manns MP, Wedemeyer H. Virological and clinical characteristics of delta hepatitis in Central Europe. J Viral Hepat 2009; 16: 883-94.
138. Hepatitis B virus. Edited by Lai C.L. & Locarnini S. 2-nd edition. — International Medical Press Ltd, 2008.
139. Higashi Y. h ap. Dynamics of genome change in the E2/NS1 region of hepatitis C virus in vivo //Virology. 1993. T. 197. № 2. C. 659-668.
140. Hmaied F, Legrand-Abravanel F, Nicot F, Garrigues N, Chapuy-Regaud S, Dubois M, Njouom R, Izopet J, Pasquier C. Full-length genome sequences of hepatitis C virus subtype 4f. J Gen Virol. 2007 Nov;88(Pt 11):2985-90.
141. Hollinger F.B. Hepatitis B virus infection and transfusion medicine: science and the occult // Transfusion. — 2008. — Vol. 5. — P. 1001-1026.
142. Hollinger, F.B., Emerson, S.U., 2001. Hepatitis A virus. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), Field's Virology, 4th ed. Lippincott/Williams & Wilkins, Philadelphia, pp. 799-840.
143. Holsen D.S., Harthug S., Myrmel H. Prevalence of antibodies to hepatitis C virus and association with intravenous drug abuse and tattooing in a national prison in Norway // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1993. T. 12. № 9. C. 673-676.
144. Hsu M. h ap- Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.2003. T. 100. № 12. C. 7271-7276.
145. Huang CC, Nguyen D, Fernandez J, Yun KY, Fiy KE, Bradley DW, Tam AW, Reyes GR. Molecular cloning and sequencing of the Mexico isolate of hepatitis E virus (HEV). Virology. 1992 Dec;191(2):550-8.
146. Huang F.F., Sun Z.F., Emerson S.U. et al. Determination and analysis of the complete genomic sequence of avian hepatitis E virus (avian HEV) and attempts to infect rhesus monkeys with avian HEV // J. Gen. Virol.2004.-Vol. 85.-P. 1609-1618.
147. Hubschen JM, Mugabo J, Peltier CA, Karasi JC, Sausy A, Kirpach P, Arendt V, Muller CP. Exceptional genetic variability of hepatitis B virus indicates that Rwanda is east of an emerging African genotype E/Al divide. J Med Virol. 2009 Mar;81(3):435-40.
148. Hughes SA, Wedemeyer H, Harrison PM. Hepatitis delta virus. Lancet. 2011 Jul 2;378(9785):73-85.
149. Iizuka H., Ohmura K., Ishijima A. Correlation between anti-HBc titers and HBV DNA in blood units without detectable HBsAg // Vox Sang. — 1992. —Vol. 2. —P. 107-111.
150. Imazeki F, Omata M, Ohto M. Complete nucleotide sequence of hepatitis delta virus RNA in Japan. Nucleic Acids Res. 1991 Oct 11;19(19):5439.
151. Ivaniushina V, Radjef N, Alexeeva M, Gault E, Semenov S, Salhi M, Kiselev O, Deny P. Hepatitis delta virus genotypes I and II cocirculate in an endemic area of Yakutia, Russia. J Gen Virol. 2001 Nov;82(Pt 11):2709-18.
152. Jack AD, Hall AJ, Maine N, et al: What level of hepatitis B antibody is protective. J Infect Dis 1999; 179(2):489-492.
153. Jacob, J.R., Lin, K.C., Tennant, B.C., Mansfield, K.G., 2004. GB virus B infection of the common marmoset (Callithrix jaccus) and associated liver pathology. J. Gen. Virol. 85, 2525-2533.
154. Jacobson IM, McHutchison JG, Dusheiko G et al. 2011. Telaprevir for previously untreated chronic hepatitis^C virus infection. N Engl J Med 364:2405-2416.
155. Jameel S., Zafrullah M., Ozdener M.H. et al. Expression in animal cells and characterization of the hepatitis E virus structural proteins // J. Virol. 1996. - Vol. 70. - P. 207-216.
156. Jansen, R.W., Siegl, G., Lemon, S.M., 1990. Molecular epidemiology of human hepatitis A virus defined by an antigen-capture polymerase chain reaction method. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2867-2871.
157. Jensen DM, Morgan TR, Marcellin P et al. 2006. Early identification of HCV genotype 1 patients responding to 24 weeks peginterferon alpha-2a (40 kd)/ribavirin therapy. Hepatology 43:954-960.
158. Johne R., Plenge-Bonig A., Hess M. et al. Detection of a novel hepatitis E-like virus in faeces of wild rats using a nested broad-spectrum RT-PCR // J. Gen. Virol. 2010. - Vol. 91. - P. 750-758.
159. Kaldor J.M. h ^p. Risk factors for hepatitis C virus infection in blood donors: a case-control study // Med. J. Aust. 1992. T. 157. № 4. C. 227-230.
160. Kalinina O, Norder H, Magnius LO. Full-length open reading frame of a recombinant hepatitis C vims strain from St Petersburg: proposed mechanism for its formation. J Gen Virol. 2004 Jul;85(Pt 7): 1853-7.
161. Kalinina O, Norder H, Vetrov T, Zhdanov K, Barzunova M, Plotnikova V, Mukomolov S, Magnius LO. Shift in predominating subtype of HCV from lb to 3a in St. Petersburg mediated by increase in injecting dmg use. J Med Virol. 2001 Nov;65(3):517-24.
162. Kalinina, O; Norder, H; Mukomolov, S; Magnius, LO. A natural intergenotypic recombinant of hepatitis C virus identified in St. Petersburg. J Virol. 2002;76:4034-4043.
163. Kamal SM. Hepatitis C virus genotype 4 therapy: progress and challenges.Liver Int. 2011 Jan; 31 Suppl 1:45-52.
164. Kamar N., Selves J., Mansuy J.M. et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients // N. Engl. J. Med. 2008. - Vol. 358.-P. 811-817.
165. Kao J. Diagnosis of hepatitis B virus infection through serological and virological markers // Expert Rev Gastroenterol Hepatol. — 2008. — Vol. 4. — P. 553-562.
166. Kapoor A, Simmonds P, Gerold G, Qaisar N, Jain K, Henriquez JA, Firth C, Hirschberg DL, Rice CM, Shields S, Lipkin WI. Characterization of a canine homolog of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jul 12;108(28):11608-13.
167. Kato N. h ^p. Molecular cloning of the human hepatitis C virus genome from Japanese patients with non-A, non-B hepatitis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. T. 87. № 24. C. 9524-9528.
168. Keeffe EB. Is hepatitis A more severe in patients with chronic hepatitis B and other chronic liver diseases? Am J Gastroenterol. 1995; 90:201-5.
169. Kim KM, Eo SJ, Gwak GY, Choi MS, Lee JH, Koh KC, Yoo BC, Paik SW. Comparison of the Clinical Features of Hepatitis A between HBsAg-Positive and HBsAg-Negative Patients. Gut Liver. 2011 Dec;5(4):500-5.
170. Kimbi G.C., Kramvis A., Kew M.C. Integration of hepatitis B vims DNA into chromosomal DNA during acute hepatitis B // World J. Gastroenterol. —2005. — Vol. 41. — P. 6416-6421.
171. Kos A, Dijkema R, Arnberg AC, van der Meide PH, Schellekens H. The hepatitis delta (delta) vims possesses a circular RNA. Nature. 1986 Oct 9-15;323(6088):558-60.
172. Kramvis A, Restorp K, Norder H, Botha JF, Magnius LO, Kew MC. Full genome analysis of hepatitis B virus genotype E strains from Southwestern Africa and Madagascar reveals low genetic variability. J Med Virol. 2005 Sep;77(l):47-52.
173. Krushkal J, Li WH. Substitution rates in hepatitis delta virus. J Mol Evol 1995; 41: 721-26.
174. Kuniholm M.H., Purcell R.H., McQuillan G.M. et al. Epidemiology of hepatitis E virus in the United States: results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, 1988-1994 // J. Infect. Dis. 2009. -Vol. 200.-P. 48-56.
175. Kurihara C, Ishiyama N, Nishiyama Y, Fukushi S, Kageyama T, Katayama K, Miura S. Molecular characterization of hepatitis C virus genotype 2a from the entire sequences of four isolates. J Med Virol. 2001 Aug;64(4):466-75.
176. Lai MM. RNA replication without RNA-dependent RNA polymerase: surprises from hepatitis delta virus. J Virol 2005; 79: 7951-58.
177. Lanford, R.E., Chavez, D., Notvall, L., Brasky, K.M., 2003. Comparison of tamarins and marmosets as hosts for GBV-B infections and the effect of immunosuppression on duration of viremia. Virology 311, 7280.
178. Lau D., Bleibel W. Current status of antiviral therapy for hepatitis B 11 Therap. Advan. Gastroenterol. 2008. - Vol. 1. - P. 61-75.
179. Le Gal F, Gault E, Ripault MP, et al. Eighth major clade for hepatitis delta virus. Emerg Infect Dis 2006; 12: 1447-50.
180. Lee CM, Bih FY, Chao YC, Govindarajan S, Lai MM. Evolution of hepatitis delta virus RNA during chronic infection. Virology. 1992 May;188(l):265-73.
181. Lee CM, Changchien CS, Chung JC, Liaw YF. Characterization of a new genotype II hepatitis delta virus from Taiwan. J Med Virol. 1996 Jun;49(2): 145-54.
182. Leistner C.M., Gruen-Bernhard S., Glebe D. Role of glycosaminoglycans for binding and infection of hepatitis B virus // Cell. Microbiol. —2008. —Vol. 1, —P. 122-133.
183. Lemon SM. The natural history of hepatitis A: the potential for transmission by transfusion of blood or blood products. Vox Sang. 1994;67 Suppl 4:19-23; discussion 24-6.
184. Lemez-Ville M. h ,qp. Detection of hepatitis C virus in the semen of infected men // Lancet. 2000. T. 356. № 9223. C. 42-43.
185. Lesbordes JL, Ravisse P, Georges AJ, et al. Studies on the role of HDV in an outbreak of fulminant hepatitis in Bangui (Central African Republic). Prog Clin Biol Res 1987; 234: 451-59.
186. Lewis H.C., Wichmann O., Duizer E. Transmission routes and risk factors for autochthonous hepatitis E virus infection in Europe: a systematic review//Epidemiol. Infect. 2010. - Vol. 138.-P. 145-166.
187. Li M.W., How W., Liu K.Z. Character of HBV (hepatitis B virus) polymerase gene rtM204V/I and rtL180M mutation in patients with lamivudine resistance // J. Zhejiang Univ. Sci. 2007. - Vol. 6. - P. 664667.
188. Li T.C., Chijiwa K., Sera N. et al. Hepatitis E vims transmission from wild boar meat // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11. - P. 1958-1960.
189. Li W, Sun Q, She R, Wang D, Duan X, Yin J, Ding Y. Experimental infection of Mongolian gerbils by a genotype 4 strain of swine hepatitis E virus. J Med Virol. 2009 Sep;81(9):1591-6.
190. Li YJ, Macnaughton T, Gao L, Lai MM. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with diff erent nuclear bodies. J Virol 2006; 80: 6478-86.
191. Lindh M., Uhnoo I., Blackberg J. Treatment of chronic hepatitis B infection: An update of Swedish recommendations // Scand. J. Infect. Dis. -2008.-Vol. 40.-P. 436-450.
192. Ling R., Ahmed M. Selection of mutation in hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine // J. Hepatol. 2006. - Vol. 24. - P. 711-713.
193. Liu W, Zhai J, Liu J, Xie Y. Identification of recombination between subgenotypes IA and IB of hepatitis A virus. Virus Genes. 2010 Apr;40(2):222-4.
194. Locarnini S. Primary resistance, multidrug resistance, and cross-resistance pathways in HBV as a consequence of treatment failure // Hepatol. Int.-2008.-Vol. 2.-P. 147-151.
195. Lohmann V, Korner F, Dobierzewska A, Bartenschlager R. Mutations in hepatitis C virus RNAs conferring cell culture adaptation. J Virol 2001; 75: 1437-1449.
196. Lohmann V, Korner F, Koch J, Herian U, Theilmann L, Bartenschlager R. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line. Science 1999; 285: 110-113.
197. Lok A., Brian J., McMahon L. Chronic Hepatitis B // Hepatol. 2007. - Vol. 45.-P. 1225-1241.
198. Lopez-Izquierdo R., Udaondo M.A., Zarzosa P. et al. Seroprevalence of viral hepatitis in a representative general population of an urban public health area in Castilia y Leon (Spain) // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. -2007.-Vol. 25.-P. 317-323.
199. Lu L, Ching KZ, de Paula VS, Nakano T, Siegl G, Weitz M, Robertson BH. Characterization of the complete genomic sequence of genotype II hepatitis A virus (CF53/Berne isolate). J Gen Virol. 2004 Oct;85(Pt 10):2943-52.
200. Lu L., Li C., Hagedom C.H. Phylogenetic analysis of global hepatitis E virus sequences: genetic diversity, subtypes and zoonosis // Rev. Med. Virol. 2006. - Vol. 16. - P. 5-36
201. Luo K., Hou J., Wang Z. et al . Prevalence of naturally occurring surface gene variants of hepatitis B virus in nonimmunized surface antigen-negative Chinese carriers // Hepatology. — 2001. — Vol. 5. — P. 10271034.
202. Makino S, Chang MF, Shieh CK, Kamahora T, Vannier DM, Govindarajan S, Lai MM. Molecular cloning and sequencing of a human hepatitis delta (delta) virus RNA. Nature. 1987 Sep 24-30;329(6137):343-6.
203. Mandart, E., Kay, A. & Galibert, F. (1984). Nucleotide sequence of a cloned duck hepatitis virus genome: comparison with woodchuck and human hepatitis B virus sequences. Journal of Virology 49, 782±792.
204. Manns MP, McHutchinson JG, Gordon SC et al. 2001. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomized trial. Lancet 358:958965.
205. Manock SR, Kelley PM, Hyams KC, et al. An outbreak of fulminant hepatitis delta in the Waorani, an indigenous people of the Amazon basin of Ecuador. Am J Trop Med Hyg 2000; 63: 209-13.
206. Mansell C.J., Locarnini S.A. Epidemiology of hepatitis C in the East // Semin. Liver Dis. 1995. T. 15. № 1. C. 15-32.
207. Martell M. n up. Hepatitis C vims (HCV) circulates as a population of different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV genome distribution//J. Virol. 1992. T. 66. № 5. c. 3225-3229.
208. Martin, A., Lemon, S.M., 2002. The molecular biology of hepatitis A virus. In: Ou, J.H. (Ed.), Hepatitis Viruses. Kluwer Academic Publishers, pp. 23-50.
209. Martin, A., Lemon, S.M., 2006. Hepatitis A virus: from discovery to vaccines. Hepatology 43, S164-S172.
210. Marusawa H., Uemoto S., Hijikata M. et al. Latent hepatitis B virus infection in healthy individuals with antibodies to hepatitis B core antigen // Hepatology. — 2000. — Vol. 2. — P. 488-495.
211. Masuda J., Yano K., Tamada Y. et al. Acute hepatitis E of a man who consumed wild boar meat prior to the onset of illness in Nagasaki // Japan Hepatol. Res. 2005. - Vol. 31. - P. 178-183.
212. Mathurin P, Thibault V, Kadidja K, et al. Replication status and histological features of patients with triple (B, C, D) and dual (B, C) hepatic infections. J Viral Hepat 2000; 7: 15-22.
213. Matsuoka S., Moriyama K., Nirei K. et al. Influence of occult hepatitis B virus coinfection on the incidence of fibrosis and hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis C // Intervirology. — 2008. — Vol. 5. — P. 352-361.
214. Mattes, F., Tong, S., Teubner, K. & Blum, H. E. (1990). Complete nucleotide sequence of a German duck hepatitis B virus. Nucleic Acids Research 18, 6140.
215. Maylin S, Stephan R, Molina JM, Peraldi MN, Scieux C, Nicand E, Simon F, Delaugerre C. Prevalence of antibodies and RNA genome of hepatitis E virus in a cohort of French immunocompromised. J Clin Virol. 2012 Jan 29. Epub ahead of print.
216. Mbayed VA, Barbini L, Lopez JL, Campos RH. Phylogenetic analysis of the hepatitis B virus (HBV) genotype F including Argentine isolates. Arch Virol. 2001; 146(9): 1803-10.
217. McCreary C., Martelli F., Grierson S. et al. Excretion of hepatitis E virus by pigs of different ages and its presence in slurry stores in the United Kingdom // Vet. Rec. 2008. - Vol. 163. - P. 261 - 265.
218. McHutchison JG, Gordon SC, Schiff ER et al. 1998. Interferon alfa-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. N Engl J Med 339:1485-1492.
219. McMahon B.J., Hoick P., Bulkow L., Snowball M. Serologic and clinical outcomes of 1536 Alaska Natives chronically infected with hepatitis B virus // Ann. Intern. Med. — 2001. — Vol. 9. — P. 759-768.
220. Mederacke I, Bremer B, Heidrich B, et al. Establishment of a novel quantitative hepatitis D virus (HDV) RNA assay using the Cobas TaqMan platform to study HDV RNA kinetics. J Clin Microbiol 2010; 48: 2022-29.
221. Meng X.J. Hepatitis E virus: animal reservoirs and zoonotic risk // Vet. Microbiol. 2010. - Vol. 140. - P. 256-265.
222. Meng X.J., Dea S., Engle R.E. et al. Prevalence of antibodies to the hepatitis E virus in pigs from countries where hepatitis E is common or is rare in the human population // J. Med. Virol. 1999. - Vol. 59. - P. 297302.
223. Meng X.J., Shivaprasad H.L., Payne C. Hepatitis E virus infections. In: Saif M et al., eds. Diseases of Poultry, 12th edn. Ames, IA: Blackwell Publishing Press. 2008. - P. 443-452.
224. Meng X.J., Wiseman B.,Elvinger F. et al. Prevalence of antibodies to hepatitis E virus in veterinarians working with swine and in normal blood donors in the United States and other countries // J. Clin. Microbiol. 2002. -Vol. 40.-P. 117-122.
225. Mercer DF, Schiller DE, Elliott JF et al. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers. Nat Med 2001; 7: 927-933.
226. Middleman AB, Kozinetz CA, Robertson LM, et al: The effect of late doses on the achievement of seroprotection and antibody titer levels with hepatitis B immunization among adolescents. Pediatrics 2001; 107(5): 10651069.
227. Minuk G.Y., Sun A., Sun D.F. et al. Serological evidence of hepatitis E virus infection in an indigenous North American population // Can. J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 21. - P. 439-442.
228. Moradpour D, Penin F, Rice CM. Replication of hepatitis C virus. Nat Rev Microbiol 2007; 5: 453-463.
229. Moreau I, Hegarty S, Levis J, Sheehy P, Crosbie O, Kenny-Walsh E, Fanning LJ. Serendipitous identification of natural intergenotypic recombinants of hepatitis C in Ireland. Virol J. 2006 Nov 15;3:95.
230. Morel V, Descamps V, François C, Fournier C, Brochot E, Capron D, Duverlie G, Castelain S. Emergence of a genomic variant of the recombinant 2k/lb strain during a mixed Hepatitis C infection: a case report. J Clin Virol. 2010 Apr;47(4):3 82-6.
231. Morsica G. h ,ap. Acute self-limiting hepatitis C after possible sexual exposure: sequence analysis of the E-2 region of the infected patient and sexual partner// Scand. J. Infect. Dis. 2001. T. 33. № 2. C. 116-120.
232. Mulyanto, Depamede SN, Surayah K, et al. A nationwide molecular epidemiological study on hepatitis B virus in Indonesia: identification of two novel subgenotypes, B8 and C7. Arch Virol 2009; 154: 1047-59.
233. Mulyanto, Depamede SN, Surayah K, Tjahyono AA, Jirintai, Nagashima S, Takahashi M, Okamoto H. Identification and characterization of novel hepatitis B virus subgenotype C10 in Nusa Tenggara, Indonesia. Arch Virol. 2010 May;155(5):705-15.
234. Nagasaki F., Nitsuna H. The high of the emergene of entecavir-resistance mutants among patients infected with lamivudine-resistance hepatitis virus // J. Exp.Med. 2007. - Vol. 213. - P. 181-186.
235. Nagayama K, Kurosaki M, Enomoto N, Maekawa SY, Miyasaka Y, Tazawa J, Izumi N, Marumo F, Sato C. Time-related changes in full-length hepatitis C virus sequences and hepatitis activity. Virology. 1999 Oct 10;263(l):244-53.
236. Nainan, O.V., Armstrong, G.L., Han, X., Williams, L.T., Bell, B.P., Margolis, H.S., 2005. Hepatitis A molecular epidemiology in the United States, 1996-1997: sources of infection and implications of vaccination policy. J. Infect. Dis. 191, 957-963.
237. Nainan, O.V., Margolis, H.S., Robertson, B.H., Balayan, M., Brinton, M.A., 1991. Sequence analysis of a new hepatitis A virus naturally infecting cynomolgus macaques {Macaca fascicular is). J. Gen. Virol. 72, 1685-1689.
238. Nainan, O.V., Xia, G.,Vaughan, G., Margolis, H.S., 2006. Diagnosis of Hepatitis A virus infection: a molecular approach. Clin. Microbiol. Rev. 19, 63-79.
239. Najarian R, Caput D, Gee W, Potter SJ, Renard A, Merryweather J, Van Nest G, Dina D. Primary structure and gene organization of human hepatitis A virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1985 May;82(9):2627-31.
240. Nakajima E., Fujii H., Moriyama K. et al. Glyl45 to Arg substitution in HBs antigen of immune escape mutant of hepatitis B virus // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1992. — Vol. 3. — P. 1152-1157.
241. Nakano T, Shapiro CN, Hadler SC, Casey JL, Mizokami M, Orito E, Robertson BH. Characterization of hepatitis D virus genotype III among Yucpa Indians in Venezuela. J Gen Virol. 2001 Sep;82(Pt 9):2183-9.
242. Nakao H, Okamoto H, Tokita H, Inoue T, Iizuka H, Pozzato G, Mishiro S. Full-length genomic sequence of a hepatitis C virus genotype 2c isolate (BEBE1) and the 2c-specific PCR primers. Arch Virol. 1996;141(3-4):701-4.
243. Navaneethan U., Al Mohajer M., Shata M.T. Hepatitis E and pregnancy: understanding the pathogenesis // Liver. Int. 2008. - Vol. 28. -P. 1190-1199.
244. Nguyen VT, McLaws ML, Dore GJ. Highly endemic hepatitis B infection in rural Vietnam. J Gastroenterol Hepatol 2007; 22: 2093-100.
245. NIH Consensus and State-of-the-Science Statements. Management of Hepatitis C. 2002. 19:1-46.
246. Ning H., Yu S., Zhu Y. et al. Genotype 3 hepatitis E has been widespread in pig farms of Shanghai suburbs // Vet. Microbiol. 2008. -Vol. 126.-P. 257-263.
247. Nishizawa T, Takahashi M, Mizuo H, Miyajima H, Gotanda Y, Okamoto H. Characterization of Japanese swine and human hepatitis E virus isolates of genotype IV with 99 % identity over the entire genome. J Gen Virol. 2003 May;84(Pt 5): 1245-51.
248. Noppornpanth S., Lien T.X., Poovorawan Y., Smits S.L., Osterhaus A.D.M.E., Haagmans B.L. 2006. Identification of naturally occurring recombinant genotype 2/6 hepatitis C virus. J Virol. 80:7569-77.
249. Ogata N. Zanetti A.R., Yu M. et al. Infectivity and pathogenicity in chimpanzees of a surface gene mutant of hepatitis B virus that emerged in a vaccinated infant // J.Infect. Dis. — 1997. — Vol. 3. — P. 511-523.
250. Ogata N. h ,np. Nucleotide sequence and mutation rate of the H strain of hepatitis C virus // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. T. 88. № 8. C. 3392-3396.
251. Ohno T. and Mizokami M. Genotyping with type-specific primers that can type HCV types 1-6. Methods in molecular medicine, Vol.19: Hepatitis C protocols. 1998, p: 159-164.
252. Okamoto H, Takahashi M, Nishizawa T, Fukai K, Muramatsu U, Yoshikawa A. Analysis of the complete genome of indigenous swine hepatitis E vims isolated in Japan. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Dec 21;289(5):929-36.
253. Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M. Typing hepatitis B vims by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes.J Gen Virol. 1988 Oct; 69 (Pt 10):2575-83.
254. Okamoto H. Hepatitis E vims cell culture models. Vims Res. 2011 Oct;161(l):65-77.
255. Okamoto H. h aP- Genetic drift of hepatitis C vims during an 8.2-year infection in a chimpanzee: variability and stability // Virology. 1992. T. 190. № 2. C. 894-899.
256. Okamoto H. h Ap. Nucleotide sequence of the genomic RNA of hepatitis C vims isolated from a human carrier: comparison with reported isolates for conserved and divergent regions // J. Gen. Virol. 1991. T. 72 ( Pt 11). C. 2697-2704.
257. Okamoto H., Omi S., Wang Y. et al. The loss of subtypic determinants in alleles, d/y or w/r, on hepatitis B surface antigen // Mol. Immunol. — 1989.— Vol. 2. — P.-97-205.
258. Okamoto H., Takahashi M., Nishizawa T. et al. Analysis of the complete genome of indigenous swine hepatitis E vims isolated in Japan // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - Vol. 289. - P. 929-936.
259. Oliveira LC, Comacio SM, Santos Jde F. Seroprevalence of hepatitis A immunity among brazilian adult patients with liver cirrhosis: is HAV vaccination necessary? Braz J Infect Dis. 2011 Jun;15(3):268-71.
260. Onozawa M., Hashino S., Darmanin S. HB vaccination in the prevention of viral reactivation in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation recipients with previous HBV infection // Biol. Blood Marrow Transplant. —2008. — Vol. 11. — P. 1226-1230.
261. Orito E, Mizokami M, Ina Y, Moriyama EN, Kameshima N, Yamamoto M, Gojobori T. Host-independent evolution and a genetic classification of the hepadnavirus family based on nucleotide sequences. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 7059-7062.
262. Pan M, Yang X, Zhou L, Ge X, Guo X, Liu J, Zhang D, Yang H. Duck Hepatitis A Virus Possesses a Distinct Type IV Internal Ribosome Entry Site Element of Picornavirus. J Virol. 2012 Jan;86(2):l 129-44.
263. Paul AV, Tada H, von der Helm K, Wissel T, Kiehn R, Wimmer E, Deinhardt F. The entire nucleotide sequence of the genome of human hepatitis A virus (isolate MBB). Virus Res. 1987 Aug;8(2): 153-71.
264. Pavio N., Meng X.J., Renou C. Zoonotic hepatitis E: animal reservoirs and emerging risks // Vet. Res. 2010. - Vol. 41. - P. 1-20.
265. Pavlovic D. h ap. The hepatitis C virus p7 protein forms an ion channel that is inhibited by long-alkyl-chain iminosugar derivatives // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. T. 100. № 10. C. 6104-6108.
266. Pei Y, Yoo D. Genetic characterization and sequence heterogeneity of a Canadian isolate of Swine hepatitis E virus. J Clin Microbiol. 2002 Nov;40(ll):4021-9.
267. Penin F. h op. Conservation of the conformation and positive charges of hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein hypervariable region 1 points to a role in cell attachment//J. Virol. 2001. T. 75. № 12. C. 5703-5710.
268. Peralta B., Biarne's M., Ordo'n~ez G. et al. Evidence of widespread infection of avian hepatitis E virus (avian HEV) in chickens from Spain // Vet. Microbiol. 2009. - Vol. 137. - P. 31-36.
269. Peralta B., Mateu E., Casas M. et al. Genetic characterization of the complete coding regions of genotype 3 hepatitis E vims isolated from Spanish swine herds // Vims Res. 2009. - Vol. 139. - P. 111-116.
270. Petersen KM, Bulkow LR, McMahon BJ, Zanis C, Getty M, Peters H, et al. Duration of hepatitis B immunity in low risk children receiving hepatitis B vaccinations from birth. Pediatr Infect Dis J 2004;23:650-5.
271. Piccolo P, Lenci I, Telesca C, et al, for the Help B Free Network Investigators. Patterns of chronic hepatitis B in Central Italy: a cross-sectional study. Eur J Public Health 2009; published online Nov 2. DOI: 10.1093/eurpub/ckp 168.
272. Pillonel J. h ,qp. Trends in residual risk of transfusion-transmitted viral infections in France between 1992 and 2000 // Transfusion. 2002. T. 42. № 8. C. 980-988.
273. Pina S., Buti M., Cotrina M. et al. HEV identified in serum from humans with acute hepatitis and in sewage of animal origin in Spain // J. Hepatol. 2000. - Vol. 33. - P. 826-838.
274. Pollicino T., Raimondo G., Navarra G., et al. Occult hepatitis B virus in liver tissue of individuals without hepatic disease // J. Hepatol. — 2008. — Vol. 5. —P. 743-746.
275. Ponzetto A, Hoyer BH, Popper H, Engle R, Purcell RH, Gerin JL. Titration of the infectivity of hepatitis D virus in chimpanzees. J Infect Dis 1987; 155: 72-78.
276. Poordad F, McCone J Jr., Bacon BR et al. 2011. Boceprevir for untreated chronic HCV genotype 1 infection. N Engl J Med 364:1195-1206.
277. Pugh J.C., Ijaz M.K., Suchmann D.B., 1999. Use of surrogate models for testing efficacy of disinfectants against HBV. Am. J. Infect. Control 27, 375-376.
278. Purcell R.H., Emerson S.U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease // J. Hepatol. 2008. - Vol. 48. - P. 494-503.
279. Quer J. h £p. Sexual transmission of hepatitis C virus from a patient with chronic disease to his sex partner after removal of an intrauterine device // Sex Transm Dis. 2003. T. 30. № 5. C. 470-471.
280. Razafindratsimandresy R, Dubot A, Ramarokoto CE, Iehle C, Soares JL, Rousset D. Hepatitis C virus infection and genotypes in Antananarivo, Madagascar. J Med Virol. 2007 Aug;79(8): 1082-8.
281. Reiss G, Keeffe EB. Review article: hepatitis vaccination in patients with chronic liver disease. Aliment Pharmacol Ther. 2004; 19:715-27.
282. Reuter G., Fodor D., Forgach P. et al. Molecular epidemiology of hepatitis E virus in Hungary: endemic, food-borne zoonosis // Orv. Hetil. -2009.-Vol. 150.-P. 415-421.
283. Rico-Hesse, R„ Pallansch, M.A., Nottay, B.K., Kew, O.M., 1987. Geographic distribution of wild poliovims type 1 genotypes. Virology 160, 311-322.
284. Rizzetto M, Canese MG, Aricoo S, et al. Immunofluorescence detection of new antigen-antibody system (delta/anti-delta) associated to hepatitis B virus in liver and in serum of HBsAg carriers. Gut 1977; 18: 997-1003.
285. Rizzetto M. Hepatitis D: thirty years after. J Hepatol 2009; 50: 104350.
286. Robertson, B.H., Khanna, B., Nainan, O.V., Margolis, H.S., 1991. Epidemiologic patterns of wild-type hepatitis A virus determined by genetic variation. J. Infect. Dis. 163, 286-292.
287. Romeo R, Del Ninno E, Rumi M, et al. A 28-year study of the course of hepatitis Delta infection: a risk factor for cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Gastroenterology 2009; 136: 1629-38.
288. Rosenblum L, Darrow W, Witte J, et al. Sexual practices in the transmission of hepatitis B virus and prevalence of hepatitis delta virus infection in female prostitutes in the United States. JAMA 1992; 267: 247781.
289. Ross R.S. h ap. Transmission of hepatitis C virus from a patient to an anesthesiology assistant to five patients // N. Engl. J. Med. 2000. T. 343. № 25. C. 1851-1854.
290. Rutjes S.A., Lodder W.J., Lodder-Verschoor F. et al. Sources of hepatitis E virus genotype 3 in The Netherlands // Emerg. Infect. Dis. -2009.-Vol. 15.-P. 381-387.
291. Sagnelli E, Coppola N, Scolastico C, et al. Virologic and clinical expressions of reciprocal inhibitory effect of hepatitis B, C, and delta viruses in patients with chronic hepatitis. Hepatology 2000; 32: 1106-10.
292. Sagnelli E, Stroffolini T, Ascione A, et al. Decrease in HDV endemicity in Italy. J Hepatol 1997; 26: 20-24.
293. Sakai A. h Ap. The p7 polypeptide of hepatitis C virus is critical for infectivity and contains functionally important genotype-specific sequences //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. T. 100. № 20. C. 11646-11651.
294. Sakamoto M, Akahane Y, Tsuda F, Tanaka T, Woodfield DG, Okamoto H. Entire nucleotide sequence and characterization of a hepatitis C virus of genotype V/3a. J Gen Virol. 1994 Jul;75 (Pt 7):1761-8.
295. Sakano C, Morita Y, Shiono M., et al. Prevalence of hepatitis E virus (HEV) infection in wild boars (Susscrofaleucomystax) and pigs in Gunma Prefecture, Japan // J. Vet. Med. Sci. 2009. - Vol. 71. - P. 21-25.
296. Sakugawa H, Nakasone H, Nakayoshi T, Kawakami Y, Miyazato S, Kinjo F, Saito A, Ma SP, Hotta H, Kinoshita M. Hepatitis delta virus genotype lib predominates in an endemic area, Okinawa, Japan. J Med Virol. 1999 Aug;58(4):366-72.
297. Sakugawa H, Nakasone H, Shokita H, et al. Seroepidemiological study of hepatitis delta virus infection in Okinawa, Japan. J Med Virol 1995; 45:312-15.
298. Salehi-Ashtiani K, Luptak A, Litovchick A, Szostak JW. A genomewide search for ribozymes reveals an HDV-like sequence in the human CPEB3 gene. Science 2006; 313: 1788-92.
299. Samandari T, Fiore AE, Negus S, Williams JL, Kuhnert W, McMahon BJ, et al. Differences in response to a hepatitis B vaccine booster dose among Alaskan children and adolescents vaccinated during infancy. Pediatrics 2007;120:e373-81.
300. Samokhvalov EI, Hijikata M, Gylka RI, Lvov DK, Mishiro S. Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis C virus variant (isolate name VAT96) representing a new subtype within the genotype 2 (arbitrarily 2k). Virus Genes. 2000;20(2): 183-7.
301. Sanchez, G., Bosch, A., Gomez-Mariano, G., Domingo, E., Pinto, R.M., 2003. Evidence for quasispecies distributions in the human hepatitis A virus genome. Virology 315, 34-42.
302. Sanchez, G., Pinto R. M., Vanaclocha H„ and Bosch A. 2002. Molecular characterization of hepatitis A virus isolates from a transcontinental shellfish-borne outbreak. J. Clin. Microbiol. 40:4148-4155.
303. Saracco G, Rosina F, Brunetto MR, et al. Rapidly progressive HBsAg-positive hepatitis in Italy. The role of hepatitis delta virus infection. J Hepatol 1987; 5: 274-81.
304. Sauerbrei A., Schacke M., Schultz U. et all Alternative metods for validation of cell culture infection with duck hepatitis B virus. J Virol Methods. 2005; 129 (2): 178-185.
305. Schielke A., Sachs K., Lierz M. et al. Detection of hepatitis E virus in wild boars of rural and urban regions in Germany and whole genome characterization of an endemic strain // Virol J. 2009. - Vol. 6:58.
306. Schodel F., Weimer T., Femholz D. et al., 1991. The biology of avian hepatitis B viruses. Molecular biology of the hepatitis B viruses (McLahlan,A., ed) CRC Press, Boca Raton, FL., 53-80.
307. Seminati C., Mateu E., Peralta B. et al. Distribution of hepatitis E virus infection and its prevalence in pigs on commercial farms in Spain // Vet. J.-2008.-Vol. 175.-P. 130-132.
308. Shakil AO, Hadziyannis S, Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM, Gerin JL, Casey JL. Geographic distribution and genetic variability of hepatitis delta virus genotype I. Virology. 1997 Jul 21;234(l):160-7.
309. Sheldon J., Soriano V. Hepatitis B virus escape mutants induced by antiviral therapy // J. Antimicrob. Chemother. — 2008. — Vol. 4. — P. 766-768.
310. Shepard C.W., Finelli L., Alter M.J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection // Lancet Infect Dis. 2005. T. 5. № 9. C. 558-567.
311. Shih S. Functional significance of naturally occurring hepatitis B virus variants. (In Hepatitis B virus. Human virus guides. Edited by CI. Lai & S. Locarnini). International medical press, 2002.
312. Shliakhtenko L, Plotnikova V, Levakova I, Rubis L, Solovieva E, Mukomolov S. Modern epidemiology of hepatitis A in the north-western region of the Russian Federation. J Viral Hepat. 2008 Oct; 15 Suppl 2:38-42.
313. Simmonds P. Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus—15 years on. J Gen Virol. 2004 Nov;85(Pt 11):3173-88.
314. Simmonds P. h ap. A proposed system for the nomenclature of hepatitis C viral genotypes // Hepatology. 1994. T. 19. № 5. C. 1321-1324.
315. Singh S., Mohanty A., Joshi Y. et al. Mother-to-child transmission of hepatitis E virus infection // Indian. J. Pediatr. 2003. - Vol. 70. - P. 37-39.
316. Smedile A, Lavarini C, Farci P, et al. Epidemiologic patterns of infection with the hepatitis B virus-associated delta agent in Italy. Am J Epidemiol 1983; 117: 223-29.
317. Soriano V., Sheldon J., Ramos B. Confronting chronic hepatitis B virus infection in HIV: new diagnostic tools and more weapons // AIDS. -2006.-Vol. 20.-P. 451-453.
318. Spada E., Genovese D., Tosti M.E. et al. An outbreak of hepatitis A virus infection with a high case-fatality rate among injecting drug users // J. Hepatol. — 2005. — Vol. 43(6). — P.958-964.
319. Sprengel, R„ Kaleta, E. F. & Will, H. (1988). Isolation and characterization of a hepatitis B virus endemic in herons. Journal of Virology 62, 3832±3839.
320. Sprengel, R., Schneider, R., Marion, P. L., Fernholz, D., Wildner, G. & Will, H. (1991). Comparative sequence analysis of defective and infectious avian hepadnaviruses. Nucleic Acids Research 19, 4289.
321. Stapleton JT, Foung S, Muerhoff AS, Bukh J, Simmonds P. The GB viruses: a review and proposed classification of GBV-A, GBV-C (HGV), and GBV-D in genus Pegivirus within the family Flaviviridae. J Gen Virol. 2011 Feb;92(Pt 2):233-46.
322. Stene-Johansen, K., K. Skaug, H. Blystad, B. Grinde, et al. 1998. A unique hepatitis A virus strain caused an epidemic in Norway associated with intravenous drug abuse. Scand. J. Infect. Dis. 30:35-38.
323. Su CW, Huang YH, Huo TI, et al. Genotypes and viremia of hepatitis B and D vimses are associated with outcomes of chronic hepatitis D patients. Gastroenterology 2006; 130: 1625-35.
324. Sureau C. The role of the HBV envelope proteins in the HDV replication cycle. Curr Top Microbiol Immunol 2006; 307: 113-31.
325. Tagawa M., Yamaguchi T., Yokosuka O. et al., 2000. Inactivation of hepadnavims by electrolyzed water. J. Antimicrob. Chemother. 46, 363 -368.
326. Takahashi K, Iwata K, Watanabe N, Hatahara T, Ohta Y, Baba K, Mishiro S. Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis E vims strain that maybe indigenous to Japan. Virology. 2001 Aug 15;287(1):9-12.
327. Takahashi M., Tamura K., Hoshino Y. et al. A nationwide survey of hepatitis E vims infection in the general population of Japan // J. Med. Virol. -2010.-Vol. 82.-P. 271-281.
328. Takamizawa A. h ¿jp. Stmcture and organization of the hepatitis C vims genome isolated from human earners // J. Virol. 1991. T. 65. № 3. C. 1105-1113.
329. Tallon LA, Love DC, Moore ZS, Sobsey MD. Recovery and sequence analysis of hepatitis a virus from springwater implicated in an outbreak of acute viral hepatitis. Appl Environ Microbiol. 2008 Oct;74(19):6158-60. Epub 2008 Aug 15.
330. Tam AW, Smith MM, Guerra ME, Huang CC, Bradley DW, Fry KE, Reyes GR. Hepatitis E virus (HEV): molecular cloning and sequencing of the full-length viral genome. Virology. 1991 Nov;185(l):120-31.
331. Taucher C., Berger A., Mandl C.W. A trans-complementing recombination trap demonstrates a low propensity of flaviviruses for intermolecular recombination // J. Virol. 2010. T. 84. № 1. C. 599-611.
332. Tei S., Kitajima N., Ohara S. et al. Consumption of uncooked deer meat as a risk factor for hepatitis E virus infection: an age- and sex-matched case-control study // J. Med. Virol. 2004. - Vol. 74. - P. 67-70.
333. Tesar, M., Jia, X.Y., Summers, D.F., Ehrenfeld, E., 1993. Analysis of a potential myristoylation site in hepatitis A virus capsid protein VP4. Virology 194, 616-626.
334. Thomas F, Nicot F, Sandres-Saune K, Dubois M, Legrand-Abravanel F, Alric L, Peron JM, Pasquier C, Izopet J. Genetic diversity of HCV genotype 2 strains in south western France. J Med Virol. 2007 Jan;79(l):26-34.
335. Thomas H.C., Lemon S.M., Zuckerman A.J. Viral hepatitis. Third edition., 2005. Wiley-Blackwell. 896 C.
336. Ticehurst J. Identification and characterization of hepatitis E virus. In: Hollinger FB, Lemon SM, Margolis H, eds. Hepatitis and Liver Disease.Baltimore: Williams & Wilkins.- 1991.-P. 501-513.
337. Tillmann H.L. Antiviral therapy and resistance with hepatitis B virus infection // World J. Gastroenterol. 2007. - Vol. 13. - P. 125-140.
338. Timm J, Neukamm M, Kuntzen T, Kim AY, Chung RT, Brander C, Lauer GM, Walker BD, Allen TM. Characterization of full-length hepatitis C vims genotype 4 sequences. J Viral Hepat. 2007 May;14(5):330-7.
339. Tjon GM, Gotz H, Koek AG, de Zwart O, Mertens PL, Coutinho RA, Bmisten SM. An outbreak of hepatitis A among homeless dmg users in Rotterdam, The Netherlands. J Med Virol. 2005 Nov;77(3):360-6.
340. Tolou H.J. h flp. Evidence for recombination in natural populations of dengue virus type 1 based on the analysis of complete genome sequences // J. Gen. Virol. 2001. T. 82. № Pt 6. C. 1283-1290.
341. Tong, S., Mattes, F., Teubner, K. & Blum, H. E. (1990). Complete nucleotide sequence of a Chinese duck hepatitis B virus (DHBV S18-B). Nucleic Acids Research 18, 6139.
342. Tryatni M., Ey P.L., Tra T.et al., 2001. Sequence comparison of an Astralian DHV strain with other avian hepadnaviruses. J. Gen. Virol. 82, 373-378.
343. Tsarev SA, Emerson SU, Balayan MS, Ticehurst J, Purcell RH. Simian hepatitis A virus (HAV) strain AGM-27: comparison of genome structure and growth in cell culture with other HAV strains. J Gen Virol. 1991 Jul;72 ( Pt 7): 1677-83.
344. Tsarev SA, Emerson SU, Reyes GR, Tsareva TS, Legters LJ, Malik IA, Iqbal M, Purcell RH. Characterization of a prototype strain of hepatitis E virus. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jan 15;89(2):559-63.
345. Tsatsralt-Od B, Takahashi M, Endo K, et al. Infection with hepatitis A, B, C, and delta viruses among patients with acute hepatitis in Mongolia. J Med Virol 2006; 78: 542-50.
346. Twiddy S.S., Holmes E.C. The extent of homologous recombination in members of the genus Flavivirus // J. Gen. Virol. 2003. T. 84. № Pt 2. C. 429-440.
347. Tyagi S., Korkaya H., Zafrullah M. et al. The phosphorylated form of the ORF3 protein of hepatitis E virus interacts with its non-glycosylated form of the major capsid protein, ORF2 // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 22759-22767.
348. Uchida, M„ Esumi, M. & Shikata, T. (1989). Molecular cloning and sequence analysis of duck hepatitis B virus genome of a new variant isolated from Shanghai ducks. Virology 173, 600±606.
349. Vasickova P., Psikal I., Widen F. et al. Detection and genetic characterisation of Hepatitis E virus in Czech pig production herds // Res. Vet. Sci. 2009. - Vol. 87. - P. 143-148.
350. Vickery K., Deva A.K., Zou J. et al., 1999. Inactivation of duck hepatitis B virus by a hyrogen peroxide gas plasma sterilization system: laboratory and "in use" testing. J.Hospital Infection 41, 317-322.
351. Villar, L.M., Lampe, E., Meyer, A., Gaspar, A.M., 2004. Genetic variability of hepatitis A virus isolates in Rio de Janeiro: implications for the vaccination of school children. Braz. J. Med. Biol. Res. 37, 1779-1787.
352. Vitral C.L., Pinto M.A., Lewis-Ximenes L.L. et al. Serological evidence of hepatitis E virus infection in different animal species from the Southeast of Brasil // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2005. - Vol. 100. - P. 117-122.
353. Wagner A.A., Denis F., Weinbreck P. et al. Serological pattern 'antihepatitis B core alone' in HIV or hepatitis C virus-infected patients is not fully explained by hepatitis B surface antigen mutants // AIDS. — 2004. — Vol. 3. —P. 569-571.
354. Wakita T, Pietschmann T, Kato T et al. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome. Nat Med 2005; 11:791-796.
355. Wang KS, Choo QL, Weiner AJ, et al. Structure, sequence and expression of the hepatitis delta (delta) viral genome. Nature 1986; 323: 508-14.
356. Wang Y, Okamoto H, Tsuda F, Nagayama R, Tao QM, Mishiro S. Prevalence, genotypes, and an isolate (HC-C2) of hepatitis C virus in Chinese patients with liver disease. J Med Virol. 1993 Jul;40(3):254-60.
357. Wang Y., Ling R., Erker J.C. et al. A divergent genotype of hepatitis E virus in Chinese patients with acute hepatitis // J. Gen. Virol. 1999. -Vol. 80.-P. 169-177.
358. Wang C.-Y., Giambrone J., Smith B. Development of viral disinfectant assays for duck hepatitis B virus using cell culture/PCR. J. Virol. Methods, 2002, 106, pp. 39-50.
359. Wedemeyer H, Heidrich B, Manns MP. Hepatitis D virus infection— not a vanishing disease in Europe! Hepatology 2007; 45: 1331-32.
360. Wedemeyer H, Yurdaydin C, Dalekos GN, et al. Peginterferon plus adefovir versus either drug alone for hepatitus delta. N Engl J Med 2011 ; 364:322-31.
361. Willems M. h /tp. Liver transplantation and hepatitis C // Transpl. Int. 2002. T. 15. № 2-3. C. 61-72.
362. Williams T.P., Kasomdorkbua C., Halbur P.G. et al. Evidence of extrahepatic sites of replication of the hepatitis E virus in a swine model // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 3040-3046.
363. Williams V, Brichler S, Radjef N, et al. Hepatitis delta virus proteins repress hepatitis B virus enhancers and activate the alpha/beta interferon-inducible MxA gene. J Gen Virol 2009; 90: 2759-67.
364. Withers M.R., Correa M.T., Morrow M. et al. Antibody levels to hepatitis E virus in North Carolina swine workers, non-swine workers, swine, and murids // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2002. - Vol. 66. - P. 384388.
365. Worobey M., Holmes E.C. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses // J. Gen. Virol. 1999. T. 80 ( Pt 10). C. 2535-2543.
366. Worobey M., Holmes E.C. Homologous recombination in GB virus C/hepatitis G virus // Mol. Biol. Evol. 2001. T. 18. № 2. C. 254-261.
367. Wu JC, Chen CM, Sheen I J, Lee SD, Tzeng HM, Choo KB. Evidence of transmission of hepatitis D virus to spouses from sequence analysis of the viral genome. Hepatology 1995; 22: 1656-60.
368. Wu JC, Chiang TY, Sheen IJ. Characterization and phylogenetic analysis of a novel hepatitis D virus strain discovered by restriction fragment length polymorphism analysis. J Gen Virol. 1998 May;79 (Pt 5):1105-13.
369. Xia YP, Yeh CT, Ou JH, Lai MM. Characterization of nuclear targeting signal of hepatitis delta antigen: nuclear transport as a protein complex. J Virol 1992; 66: 914-21.
370. Xie ZC, Riezu-Boj JI, Lasarte JJ et al. Transmission of hepatitis C virus infection to tree shrews. Virology 1998; 244: 513-520.
371. Xing L., Kato K., Li T. et al. Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes // Virology. 1999. - Vol. 265. - P. 35-45.
372. Xu Z, Liu Y, Xu T, Chen L, Si L, Wang Y, Ren X, Zhong Y, Zhao J, Xu D. Acute hepatitis B infection associated with drug-resistant hepatitis B virus. J Clin Virol. 2010 Aug;48(4):270-4. Epub 2010 Jun 26.
373. Yamada K., Takahashi M., Hoshino Y. et al. ORF3 protein of hepatitis E virus is essential for virion release from infected cells // J. Gen. Virol. 2009. - Vol. 90.-P. 1880-1891.
374. Yamada N, Tanihara K, Mizokami M, Ohba K, Takada A, Tsutsumi M, Date T. Full-length sequence of the genome of hepatitis C virus type 3a: comparative study with different genotypes. J Gen Virol. 1994 Nov;75 ( Pt ll):3279-84.
375. Yanagi M, St Claire M, Shapiro M, Emerson SU, Purcell RH, Bukh J. Transcripts of a chimeric cDNA clone of hepatitis C virus genotype 1 b are infectious in vivo. Virology. 1998 Apr 25;244(1): 161-72.
376. Yotsuyanagi H., Hino K., Kimura S. et al. Frequent presence of HBV in the sera of HBsAg-negative, anti-HBc-positive blood donors // Transfusion. —2001. — Vol. 9. — P. 1093-1099.
377. Zaaijer HL, Boot HJ, van Swieten P, Koppelman MH, Cuypers HT. HBsAg-negative mono-infection with hepatitis B virus genotype G. J Viral Hepat. 2011 Nov;18(l l):815-9. doi: 10.111 l/j,1365-2893.2010.01397.x. Epub 2010 Nov 29.
378. Zachou K, Yurdaydin C, Drebber U, et al, for the HIDT-1 Study Group. Quantitative HBsAg and HDV-RNA levels in chronic delta hepatitis. Liver Int 2010; 30: 430-37.
379. Zhang W., Yang S., Ren L. et al. Hepatitis E virus infection in central China reveals no evidence of cross-species transmission between human and swine in this area // PLoS One. 2009. - Vol. 4 (12):e8156.
380. Zhang YY, Tsega E, Hansson BG. Phylogenetic analysis of hepatitis D viruses indicating a new genotype I subgroup among African isolates. J Clin Microbiol. 1996 Dec;34(12):3023-30.
381. Zhao C., Ma Z., Harrison T.J. et al. A novel genotype of hepatitis E virus prevalent among farmed rabbits in China // J. Med. Virol. 2009. -Vol. 81. P.- 1371-1379.
382. Zhong J, Gastaminza P, Cheng G et al. Robust hepatitis C virus infection in vitro. Proc Natl Acad Sei U S A 2005; 102:9294-9299.
383. Zöllner B., Petersen J., Puchhammer-Stöck E. Viral features of lamivudine resistant hepatitis B genotypes A and D // Hepatol. 2004. -Vol. 39.-P. 42-50.
-
Кюрегян, Карен Каренович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2012
-
ВАК 03.00.06
- Клинико-морфологическое исследование различных вариантов хронической HCV+HBV-инфекции
- Особенности вируса гепатита C в острой и хронической стадиях инфекции и дифференциация стадий
- Новые вирусы гепатита В птиц
- Разработка методов диагностики болезней и технологического контроля биопрепаратов на основе моноклональных антител при чуме, парвовирусном энтерите и аденовирусном гепатите плотоядных
- Этиологическая структура острых вирусных гепатитов и распространенность НВ-вирусной инфекции у городского населения Приамурья
