Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологические аспекты естественной и индуцированной устойчивости растений к вирусам
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологические аспекты естественной и индуцированной устойчивости растений к вирусам"
РТВ ол
Национальна академш наук Украши 1нститут М1кроб!ологп \ в!русологи 1М. Д. К. Заболотного
На правах рукопису
КОВАЛЕНКО Олексш Григорович
М0ЛЕКУЛЯРН0-Б10Л0ПЧН1 АСПЕКТИ ПРИРОДНОТ ТА 1НДУКОВАНОГ СТ1ЙКОСТ1 РОСЛИН
ДО В1РУС1В
03.00.06 — вфусолопя
Автореферат дисертаци на здобуття наукового ступеня доктора бтлопчних наук
КиТв 1996
Дисертащею е рукогшс.
Робота виконана у в1ддш фггопатогенних в1рус1в 1нсти-туту мжробюлоги I шрусологп ¡м. Д. К. Заболотного НЛН Украшн.
Офипшп опонентн: доктор бюлопчних наук, професор МЕНДЖУЛ М. I.,
доктор бюлопчних паук, професор, МАЛЮТА С. С.,
доктор бюлопчних наук, професор академж АВШ Украиш МУС16ИКО М. М.
Проводка оргашзащя: 1нститут агроекологи I бютехнологп УААН (м. Кн11з).
Захист вЬдбудеться 18 грудня 1926 року о 1С год. на зась данш спещал!зовано'1 вчено! ради Д 01.81.01 при 1нститут1 мжробюлогп \ в1русологп ¡м. Д. К. Заболотного НАН Украпш за адресою:
232143 КиТв 143, вул. Заболотного, 154.
3 дисертащею можна ознайомитись у б1блюте1и 1нституту мжробюлоги 1 в1русологи ¡и. Д. К. Заболотного НАН Ук-раТни.
Автореферат роз1'сланий «—»-У——19Э£ Р
Учении секретар спец:'гл:зовано1 вчено! ради
кандидат бюлопчних наук ПУР1Ш Л. М.
БАТАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Аитудльшсть i стач вробдами. В умовах сучасного ) нтенсшшого зем-леробства i рослинництва одним ia найб!лъш вачиивих фактор1в, як1 обмеиують урожайн1сть с1льськсгосподарських культур, в nipycHi хво-роби. Спричикяючи масов! еп1ф1тот11, особливо в регионах а пом!рним та теплим [Шматом, який сприяе висок!й активноот! комах-перэносни-KiB, серед 1ншах uätureHia aipycK 5а сбоев шк!дл;з1ст;о часто z\'"o-дять на перше м!сце, випереджаючи ф!топатоген1й гркби. 0ок1льки за-стосування х1м!чних sacoöiB щодо BipyciB малоефективна та загострюв проблеми охорони довмлля, в розробц! заходхв боротьби з в1русюши хворобами рослин все б1лыпого значения набувае селекдтя ст!йких до BipyciB сортis. 1нтерес до проблем BipycQCTiKKOCTi особливо spie за OCTEHHi роки ЗЗВДЯКИ Сурхливому рОЗЕСЯ молекулярно! 6iojorii i 6io-технологП рослин. Швидкий поступ цих наук в1дкрив ков! можливост! прискореного виведення нових форм рослш методами юптинно']' та ген-hoi 1нженерП. Водночзс зросла актуальн1сть досл1д>;ень молекулярно-б!олог1чних i генетичних основ природно! та 1ндуковано1 BipycocTiü-ocTi, п!энання яккх g необх1днои передумовою рац1онально'1 селекцП рослин на BipycccTiiiKicTb, а такс.к винайденнл ноэих екологачко не-ек1ддивих 3£scoöiB активацП 'ix захисних мехатгнйЕ.
На пер!од до 1971 року, коли булл започатковая! автором досл1-дження за uisi темою, в1домост! про механ1амк в1русост!йкост1 рослин обмежувались к1лькома публ!кац1ями, як! стосуззлись переважно вкявлення антив1русних чикник!в (Sela, Applebaum, 1962;Loebenstein, Ross, 1963), патогенезасоц1йованих (PR) С1лк1б (Sianinaszi et al., 1970; Van Loon, Van Kamen, 1970), активност! терм1напышх оксидаэ фен1л-пропано!дного нляху (Farkas, Solomosy, 1965; Van Loon.Geelen, 1971) при локально 1нфэкцП, а такая 1нд у ковано"] ст!йкост1 (Yarwo-od 1960; Ross, 1961) та И 1ндуктор1в (Gicherman, Loebestein, 1969; Stein, Loebenstein, 1S70) у надчутливих (НЧ) рослин-хазя1н!в. А про фактори стшкост! роелкн при системних в!русних 1нфе1сц1ях i, особливо екстремэльно! BipycociÜKOCTi (ЕВС), эа виняткои окремих, супе-речливих результат1в (Липсиц, Князев, 1971; Köhler, 1959; Atkinson, Matthews, 1970), з л^ератури н!чого не було в!доыо. Проте, потреби науки i практики висували нагальну HeoöxiflHicTb глибокого i всеб1ч-нс .-о досл1дхекня природнкк та 1ндукованих махан1ашв в1русоот1йкос-Ti, особливо у рослин родини SoJanaceae, до яко'1 належать так! важ-див! продозольч! i техн1чн! культури, як картопля, тютюн i тоиат.
Мота з завдапня дослхдтень. Мета наш! рсботи полагала в тому, що5 у пор12нялъноиу аспект! на р!эних р!внях оргатэацП кл!тишшх по.т/ляц1н все01чно вивчити взазмов1дношення предстазник!в ро1ех (X-в1рус кэртоял1, ХВК)-, 1оЬата (вхрус тютюново! мозаики, БТМ)- 1 1о-зро (в!руо бронгозсст! тамат1в, ВЗТ, Випуа*/1г1с!ае)-чииз э рослина-ми, то мзззть екстрс-мальну ст1йтсть, надчутлиЕЮть (НЧ) 1 оприйнят-лгаисть до них та реагують на 1нокуляц1н оубл1м1напьноя, локальною або сксгеиком !кфекц1ею, а також виявити можлив! механ1зыи 1 чинни-ки пркродко! та шдуковано! в!русаст!йкос:т1.
У в1лпов1дносг1 з поставлено^ иетою було необх1дно:
1) дати пор!вкяльну характеристику високо!, осоОлиео экстремально!, ст!йкост! картоплг до ХВК 1 ВТМ 1 досл!дити 1х ломлив! ме-хан!зьм;
2) вивчити взаемозв'язок мхж в!руо1ндукованою НЧ-реакщею, ло-кгиазац1е& в'русно! !н$екцП (ЛВ1) та 1дукованою в1русост1йк:стю (1БС) у надчутливих рослин, а також встановити 1х можлив1 чинники;
3) досиЦдити нриродну та 1ндуковану от1йк1сть до ВБТ у рослин №со11апа та Н фактори, а також моиливоот1 одержання форм рослин, стхйких до цього в1русу;
4) серед природних та синтетичних сполук - 1ндуктор!в !нтерфе-рону виявити 1ндукторк в1русоот!йкоот1 рослин та ЕИВЧИТИ СПОСОбИ IX дИ; на приклад! др1кдиових манашв р1зко! будови встановити взае-мозв'язок мхи структурою 1 антивирусно» активн!стю пол!оахарид!в, а також можливост! !х практичного викоркстання;
5) вкявити роль специфично! б1лок-вуглеводно! взавмод!! в реа-д1зацП механ!ам1в ст1йкос?1 рослин до в!руо1в.
Наукова новизна ройоти. При виконанн! дослхджень автором одержано нов1 результата, на основ1 яккх було вперше:
- доведено принципов! в!дм!нност! у взаеыов!дношекнях ХВК ! ВТЫ з ЕВС-формами картошИ та ьиж даними в!русами залежно в!д от1йкоот! рослин до Х-в!русу; '
- ьсгановлено специф1чн!сть генетичних дегеркпнант, як1 контро-люють екстремальну ст1йк!сть картопл! до ХВК ! ВТ).!:
- показано вхдсутисть к1льк1сного зв'зку т.*. некротизац1вю тканкни, ЛВ1 та 1ВС у нздчутливих до в1рус1в рослин;
- виявлено нов! Рй-б1лки у двох вид!в дурману;
- всгановлено природну та !ндуковану з1русост1йк1сть, а також два тили ан?ив1русних фактор1в у надчутливих рослин на ргвн! 13о-дъованнх протопласИв;
_ о _ ,
- о ™
- виявлэно неспециф1чну IBC та ï'i mchkjikbI чинники у рослин при. системой некротичн1Й ВБТ-1нфекцП;
- у представник!в Nicatlana встаковлено значку гетерогенность популяц!й за реакщею на 1нокуляц1ю ВБТ i дояори ст!йкост! до ньсго;
- виявлено швидку ел1м1нац1ю ВБТ у кзду;я1й культур! тютюну;
- винайдено hobî неспецкф!чн1 1ндуктори bipycoctiiikocti рослин
1 biî2ti-h0 ,n_!tî i? w't ïx ^ 11 *
- досл!длено структуры! особливсст! та ме:<ак!змп захг.сно! дП ан!онних 1 нейтральних пол1сахарид1в як !ндуктор!в резистентност!;
- показало заяежйоть активное?! i характеру д!! гл1комоко- та гл!копол1мер1з в1д ïx структурних характеристик;
На основ! акал!зу одержгних результатов i даких л!тератури:
- запропоновано нову г!потэзу про природу ЕВС картопл! до ХЕК;
- основано б1лок-вуглеводну концепц!ю " ф1тов!русологП та роз-роблено рецептор-гндукторну модель Шц1ацП механ1зм!в BipycocTin-KooTi у НЧ-рослин.
Наукогд-практична цЬпнсть роботя. Впершо проведене грунтовке пор!вняльне вивчення Бзаеу.ав1дносень BipyciB р1зикх таксоном1чних грул з рослинаш-хазяшачи, pismira за ст!йк!стю до nipycHoï хяфек-цП, маг важливе теоретичке значения, оск!льки воно абагачуе 1сиую-ч1 уязлення про можлив1 механ1змя BipycocTlfntocTi рослин, а тако» вхдкриваз перспективи для розробки новик П1дхсд1з до отЕсрення форм рослин, стЛйких до BipycHiîx захворюЕань, i sacoOiB активацП эахио-них механ!зм!в, особливо у с!льськогогподарських культур>як1 .у своему арсенал! не маить ст1йккх до BipyciB copTiB.
Практичне значения маить:
- розроблекий i п!дтверджений експериментаяьно принцип аикорис-тання в1рус1ндукованих соматичких чиншяив, як! киникають при сио-темн!й некротичн!й хнфекцП, для См-ворення ст1йккх до BipyciB ферм рослин за допомогою культури ТКЗНИКИ;
- эзхищен! авторськими св1доцтвами та патентами: способи оздоровления картоши в1д 3ipyciB i в!дбору И з!русост!иких форм; способи та технолог1я одержання актив!русних препарат1в на ochobI кор-моеих дрЪодив; ке:,ялексний антив!русний 3aci6 широкого спектра дП;
- видан! практичн! рекомеядацИ для сэлекц1онер!э; -
- одержан! г1бркдк, клоки та сорт тютану, cTirati до ВБТ;
- методики приготування 1нокулш1в та Ифкування !зольованих npoTopmaoTiB кзртопл! ХЕК i ВТМ;
- НобШзован! на сферой! манани як a$iHHi сорбенти.
Конкретна участь аятора в os&iwamii результат!!!. Основнкй екс-перименгальний матер!ал одержано автором особисто та разом is cniB-роб!тниками, як1 Сули залучен1 до робота в ход1 виюнання планових эавдань досл1дницько'1 групи, керовано! дисертантом. Бивчення структура полЮахарид1в було эд!йонено дисертантом спХльно э д.х.н. О.С. Шашковим (1н-т орган1чно! xiMi'i РАН, Москва), д.б.н. Г.А. Е1товсь-кою (Х1м1ко-фармацевткчняй ia-т, Санкт-Петербург), к.х.н. 1.0. Ямс-ковим Пн-т елементоорганчно! xiMi'i РАН, Москва) та к.б.н. В.М. Ва-сильевим (Науково-досл1дний техшчний центр "СОНАР"), транспорту та персистенцП в рослинах 14С-манану - з проф. 3. Клуге (Лойшцгськпй ун-т, СРН), ультраструктури кл!ткн - з к.б.н. Л.В. Колесим«, екс-тремально! ст1Йкост1, культур тканин 1 протопласт1в - а к.б.н. I.C. Щербатенком, рибосомального матер1алу - з к.б.н. Л.Ф. Д1денко, лек-тиново! активной! OUKiB - э к.б.н. Е.О.КоЕалекко (1н-т м!кроб!о-логаЗ i Bipycojori'i НАНУ). Консультативна допомога при пхдготоец1 дисертацП издана академ!ком УААН А.Л. Бойко.
Апробац1я pofkmi. OcHOBHi положения дисертацП i науков! результата автора допов1 дались на нарадах тов-ва iu. Д. ¡.Менделеева (Ленинград, 1971) i а проблем ф1тонцид!в (Кшв, 1973; Ужгород, 1985; Льв1в, 1990), з'1здах м!кробЮл. тов-в (Кшв, 1975; Донецьк, 1980; Алма-Ата, 19S5; Чернгвц!, 1933; Одеса, 1933), 12-му Mixaap. ботан. конгрес1 (Лен1нград, 1975); нарадах з питаиь BipycHHX хвороб рослин (Лен1нград, 1978; В1льнюс, 1984), м1кробних пол!сахарид1в (Ленинград, 1984) та 1мун1тету рослин (Рига, 1986); м!жнародних симпоз1умах з проблем антив1рускнх речоЕИч (Szeged,1980; Riga,1982; Smolenice, 1985; Варна, 1987); 9-й конф. чехословацьких фхтов1русо-лог1в (Brno, 1931); конф. "Вирусы микроорганизмов" (Пушено, 1982), М1жнар. конф. з проблем стп:кост! рослин (Halle, 1982), мхжнар.сим-noai'/Max з б1отехнологП (Leipzig, 1984), "Recent Results in Plant Virology"(Reinhardsbrunn, 1986; Eberswalde, 1989); 1-й конф. з iMy-ногенетики (Соф1я, 1986), та 3-й болгарськ1й.конф. з 1мун1тету (Со-ф!я, 1987) рослин; Mi*nap. конф. з лектинологН (Praque, 1988; Tartu, 1989; Szeged, 1993); 5-му евролейському (Prague, 1S89) та 5-му Бpaтicлaвcькoмy (1990) симпоз1умах з проблем Еуглеводхв; конф. "Ми-кробиол. основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата, 1990); наук, конф., присвячекай 100-р1ччзо в1дкриття Bi-pyciB Д. 1.1вановськкм (Ростов-на-Дону, 1992) та мЬкнар. симп. "Fundamental and Applied Problems in Phytovirology"(Yalta, 1994), а таксис на зас1даннях вчено! ради (08.08.1983), вiддiдy ф1топатогаших
BipyciB та секцП а молекулярно! б!олог1! 1н-ту мжроб!олог!! i Bi-русолог!! HAH Украши.
Структура робота. Рукапис дисертацИ »пстить вступ, огляд Л1-тератури, опко об'ект!в, Marepiaziia 1 методхв дослхджеть, 5 роздх-л!в э викладекням результата власних дослхджень, гагальний Шдсу-. мок роботи, висноеки та список л1тератури (638 дкерел). Робота зай-мав 413 cTopinoK, 1люстровача 59 таблицями та 72 рисунка»,«!.
Пу0д1кацй'. За матэр1алэми дисертацИ олубл1ковако 124 роботи, в т.ч. 5 проблемннх i оглядових статей, 1 Орошора, 68 експеримен-тальних статей та 39 тез допов.!дей у сЯтчизняних та эаруб!жних ви-даннях; сдержано 9 авторсъких св!доцтв i патентов на винаходи.
OcHQEiii положения, nsü 22ККОСЯТ5СЯ на загнет
1. Екстремальна ст1йк1сть рослин до "<ЕК i ВТМ, незвалзючи на сл!льн! soEHiEHi ознакк, в!руооспеш;ф1чна, каз ввдшш! механхеми i реалхзуеться на р1энкх р1впях орган!зац!! oiTin-mnr. популяц1й.
2. У надчутлквих до Eipycis рослин хснукгь принайми! два тип» эахисних механхзмхв, од;ш is шк ефективний на тканкнному, !кшкй -i ка кл1тинному piBHi. 0станн1й мае два р!зних за утворенкям та СПОСОбОМ Д11 ailTHEipyCHi ЧНННИКИ.
3. При скстемн!и некроткчн1й 1кфекцП у рослин тютюну функцхо-нують saxncHi реакц!!, под1бях до КЧ-реагаш, якх проявляются в самооздоровленШ рослин i кзлусно! тканкни in vitro, ультраструк-турн1й перебудоз1 1нф!коваяих югхткн, пздукцП неспецкфхчно! вхру-cocTiiiKDCTi та синтезу патогекезасоциювачих i антив!русних б!лк!в.
4. ПорЯД 3 BipyCSAill 2 рсл! 1ДукТОр1Б BipyCOCTiflKOCri рослин можуть виступати природн! dsPHK, Ix синтеткчт аналоги,' полхкарбок-силати та пол!сахариди. 0станн1 s пол!фуккц!оналъними эахисними агентами, hki дштъ залежно в1д ix xi!,ii4Ko'i структур'/., концентрацИ та качв!юст1 в систем! природного механизму резистентности
5. В реал1зац1"! мвхан!зм1в BipycccTiüKocTi у рослин вахливе значения маоть "ix вуглеЕодн! компонент:-:, лектини та лектинонод!бн! б!лки, здатн! до специфично! (л!гандно!) взаемодП.
ОВ'еХГИ, MATEPIAJ3I ТА МЕТОДI ДОСМЩЕНЬ
Оснозюл! оО'ктамя досл1джень булл: ХВН, штамп ки!вський, су-ворий, розлитпй (Еелудько, Козар, 1957.), к1льцево! та буро! плямис-TOCTi; ЗТМ, штзми U1 i аукуба моза!ки томат1в; полати ВБТ рхзно!
в1рулентност1, вилучен1 нами э рослин тютюну в Крипу. В окремих до-сл1дах використовувались також Y-, M-, S- та !нш1 в1руси картопл^ Bipyc oripKOBOï мозаики (ВОМ), Bipyc крапчастот! гвоздики, а також эбудник кутаото"1 плямистост1 огхрка - Pseudomonas syringae pv. lachrimans.
Рослинами - хазяшами BipyoiB i рослинами-1ндикаторами слугу-вали pi3Hi эа ст!йк1стю види, г1Сриди, л1нИ та сорти картошИ (So-Jan um tuberosum, S. acaule, S. demissum, S. chacoense, S. famatine, S. stoionife.rujn та 1н.) тютюну (W. tatacum, N. alata, N. glauca, N. sanderae, N. debneyi, N. glutinosa, N. langsdorfii, N. didebta та iH.), томата (Licopersicon esculentum), дурману (Datura stramonium i D. metel), ог!рка (Cucumis sativus), гомфрени (Gomphrena globosa) та лободи (.Chenopodium amaranticolor). Бульби i нас!ння картогш лю-б'язно надан1 нам д.б.н. Н.О. Лебедевою (1н-т загально! генетики РАН), нас!ння тютюну - к.б.н. е.К. МироноЕШ (BITIM) та к.с.-х.н. S.O. Рудвм (Кршська досл1дна сталц1я тютшництва).
Поряд г вдлши рослинами, за експершентальн! системи правили 1зольован1 стебла, ростки, листов! пластинки, ïx половинки ! диски, меристеми, культури калусу i протопластов, а також поэагттинн! системи трансляцП эа участга екстрамчв э асцитних шптин Ерл1ха або зародк1в пшениц! та глоб!нов<Я РНК або PKK ХВК як матриць.
BipycHi препарати в досл1дах використовували як у неочищеному станг, так i очищеними методами диференц!ального центрифугування (Коваленко и др., 1985), центрифугування в град!ент! густини саха-рози або гель-хроматографП на сефароз1 2R та б!огел! А-150 (Kova-lenko et al., 1977, 1932), BipycHi РНК - вид!леними з в!русних пре-napaTiB та очищеними за Л.П.Гавриловою та О.С.Сп!р!ним (1969). Bi-русн! препарати збер1гали л!оф1л1зоваиши або в буферних розчинах в асептичних умовах (Щербатенко и др., 1988).
Матер1алами дослдаень були: 1нф1кований вирусом м1цел1й гриба Pénicillium funiculosum M 2319, культурзльна piдина та 6iOMaca др1ждж!в Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisiae, S. carlsber-gensis та 1н., вирощених на природному (солодове сусло) або синтетичному (Р!дер) середовищ1 глибинним методом; кормов! др1ждж!, ви-рощен1 на n-алканах (C.raJtosa) або на рослинних г!дрол!затах (Candida sp.); промислов! др1жджов! екстракти (ф-ми "Merk" i Олайн-ського э-ду xiMpeaKTHBiB); пол!сахаридн1 препарати з др!ждж1в, ви-д1лен1 pisHHMH способами нами (A.c. 687120, 1659053) або люб'язно 1адан1 нам д.б.н. Г.О. Вотовською, к.б.н. В.Г. Колошиним та д.х.н.
Е.С.Корбелайненом (Xi mí ко-фармацептичний 1н-т, С.-Петербург), та Н сульфатован! noxiflHl (Корбелайнен'и др., 1978); пол!рибонуклеотид-ний комплеко пол!(Г) 'пол1(Ц), наданий для доол!д1в д.х.н. Н.С. Тихомирове*)- Сидоровою (1н-т високомолекулярних ополук РАН); пол1в1-н!лп1рол1дон (ШП) 1 сп!впол!мери в!н1лп1рол1дону (РП) з кротоновою кислотою (КК) та крогоновим альдег1дом (КА), надан1 нзм д.х.н. В.А. Кропачевим (IBC РАН).
Для блокування мэтзОол!чних процео1в роолин, JI8I, IBC i анти-BipycHoí активное?! npenapaTiB використовували антиметаболхти: ак-тином!цин Д (АВД, Calbioohem), рифамЩин (Calbíochem), хлорамфен!-кол (Sigma) i циклогексим!д (Serva), а також íhtskthí i х!м!чно мо-диф!кован! моносахарида,- УФ- 1 г-опромхнюваяня, екстремалый темпе-ратури (8-10° та 28-35° С),, обводнения (rinoKoira) тканин. Як синер-г1сти др1жджових манан1в випробовували ц!аногуан!дин, 2,4-д1сксо-гексаг1дро-1,3,5-триазин (ДГТ), д1ацетил-ДГТ, алкансульфонов! кис-лоти (сульфобета'1н), люб'зно надан! нам проф. Г. Шустером (ФРГ), а також диметилоульфоковд та 1нш1 поверхкево активн1 речовини.
Рослини для доол!д1в вирощували у кв1ткових вазонах, наловне-них сум1шшю л1сового грунту, п!ску та перегною, в теплиц! та кл1ма-тичних камерах (Feutron, KTLK-1250) за контрольованих параметр1в EoiorocTi, температутри i осв!тлення. Для одержання i культивування !зольованих орган!в, меристем, калусу i протопласт!а користувались поверхкево стершизованим росдиннш матер1алом, е!дпов!днкми сере-довищами та методиками (Бутенко, 1977; Сидоров и др., 1985; Трофи-мец и др., 1976). Мезоф1льн1 протоплаоти з листя отримували фермен-тативним методом (Kassanis, White, 1974).
1нокуляц1ю рослин эд!йснювали за допомогою скляного шпателя чи эконструйованого наш пристрою (Коваленко, 1978), протопластов тютюну ВМТ - за Otsuki et al. (1972), картопл! ВТМ та ХВК - за ори-г1нальними методами (Коваленко и др., 1985; Щербатенко и др.,1987).
В робот! використовували загальнов1дом1 в!русолог1чн1 (Меттъ юз, 1973; Кирай и др., 1974), 1мунолог1чн1 (Кэбот, Меиер, 1968) ме-тоди, методи xímí'í вуглевод1в (Кочетков и др., 1967; Захарова, Ко-сенко, 1982), рэд!оактивних isoToniB, авторадЮграфП, УФ-, 14- та 1ЭС-ЯМР-спектроскопП, спектрофотометр!'!, анал!тичного центрифугу-вання, у ль тр. кротом i i, cbítjioeoí , люм1несцентно1 та електронно! MiK^ocKoni'i, м1чених антит!л, полово! МбридизацП та íh.
Bmíot 01лк1в в очищених препаратах i рослинних екстрактах еиэ-начали за М.М. Bradford (1976), вуглевод!в - за Хагедорном-1енсеном
або антроновим методом (Захарова, Носенко, 1982), нушехнових кислот - за О.С. CnipiHiM (1969), фосфору - за ®!ске-Суббароу. Рй-б!л-ки видияли за S. Qianinazzi et al.(1977), ABO - за R. Mozes et al. (1&78), IBP - за G. Loebenstein, A. Gera (1931). Електрофорез 01л-kíb проводили в 5-10%-но.чу колоночному año 8-20%-ному град i битному пластинчаотому гел! пол1акрилам1ду (ПААГ) за B.J.Davis (1964) в лу-жних буферних системах, крашения - за G. Fairbanks et al. (1971).
Чкалов! екопериментальн! дан1 тдцавали статиотичн!й обробц!, використовуичи параметрич.н! критерП нормального розпод!лу варгант (Урбах, 1975), методи попарного з1стаалення р!зниць або в!дношень чисел (Молостов, 1965) та трансформацП даних (Kleczkowski, 1968).
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛЦЖЕНЬ
I. ПОРШШЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА KEXAHI3MB BKCOXOÏ СТ1ЙХ0СТ1 КАРТ0ПЛ1 ДО ХВК I вта
1.1. Ексгреиальна ст!йи1сть картопл! до ХВК
Характерным прикладом кадзвичайно високо'1 otíhkoctÍ росл!Ш до BipyciE в екстремальнз ст!йк!сть картоплi до ХВК, яка аула виявлена у с1янця американсько! селекцП 41S56 i coptíb Сако, Тгва, Саф1р, Анет, а також у деяких ~íhíh S. acaule та ¡Лжвидових гхбрид!в. За Cockerham (1970), ця cTiÜKicrb контролюеться одним дом!нантним геном Rx. Для пояснения природи ЕВС було висунуто декшъка г!потез, зпдно з якими репродукц1я ХВК у тканинах ЕВС-форм картопл! взагал! немешшва (Hooker et al., 1954), локализована окремими кл!тинами i ыожлива лише за певних умов (Delhey, 1974) або в!двертавться завдя-ки активацП эахисних механ!зм!в рослин (Липсиц, Князев, 1971). 3 метою анал!эу даних г!потез нами Сули проведен! всеб!чн! досл1джен-кя взаемов1дношень ХВК э ЕВС-фо^маод картопл!, зокрема smíh метабо-л1зму, эахисних реакц1й та активноот1 iHr!6iíopiB !нфекц!йност1 в1-руоу, а також наявност! в тканинах в1русоспециф!чпих продукт!в та уражень в норм! 1 г.ри дП антиметабол!т!в та екстр^мальних ф!зичних факторов.
Було встановлено, шр ст1йк1сть картопл! збер!галась при !ноку-ляцП ïï 7-ма 1золяташ1 i штамами ХВК pianoï в!руленткоот1, концен-троваиими препаратами ХВК, РНК ХВК та сум1шшю ХВК i ВТМ.
iHOKyjnuiH ЕВС-рослин ХВК за звичайних умов (1б-28°С) не приз-
водила до суттввих зм!н вм!сту 1 фракЩйного складу розчгашпх 01л-К1В, акттаност1 пол1фенолоксидаэи та пероксидаэи (рис.1), 1нгЮ1то-р!в в!русу 1 захисних реакц!й. В 1нокульованих листках не вдавалося виявити 1кфекц1йку РНК 1 б1лок оболокки ХВК, а також в1русних ура-кень за допомогою електронно! м!кроскопП, флуоресцэнтних антит1л, йод-крохматьно! проби 1 субстрату пероксидаэи - гваяколу.
ЕВС не блокувалась при дП на 1кокульаван1 ХВК рсслини УО-оп-ромиаовання (до та п1сля пгакуляцП), актином!цкну Д (25 мкг/мл), рк$зм1цину (20 мкг/мл), хлорауфенгколу (80 мкг/мл) та щмлогексш!-ду (0,05 мкг/мл). Передпосадкове т~опрсм1кшакня бульб сгянцю кар-топл! 4195В 1 сорту Сако в дозах 200-500 рад тзксж не призводило до втрати ЕВС рослин до ХЕК. Однак при зшжких температурах '(8-10° С) ЕВС-форми картопл1 реагували на 1нокуляц1ю ХВК дохальними некрозами або хлоротичними шимачи, в яккх вклзлявся 1нфекц1йний вхрус. •
Таким чином, репродуыця ХВК в ЕВС-формах картоши за звичай-них умов неможлива. 11 в1дсутн1сть не поз'яэзне з активац!ею захио-них мехзн1зм1в у рослин. Пояза сп9циф1чн:ж скмптомгв та 1нфв1щ1шю-го ХВК в ¡.нокульовачих листках ЕЕС-рослкя при эшстенш температур! моле бути насд1Дком перероэпод!лу активное?! кл!ткянкх генхв в екс-тремакьнкх умовах.
1—1.
.1_1_Л_1
НПО. 1. акгявн1с?ь полцренолокси-дази (ПО), пероксидаги (НИ) та ем: ~т розчкнних б!лк1я у листках картсшп сорту Сако, 1нокульова-КК ХВК.
/ 2 3 4 5 6 г а 9 Час т'спд1шуазцШ, Ш
1.2. Спйисть картопл! до ВТО
3 метою визначенна спеидф1чност1 ЕВС картогш! до ХВК Суда до-слпдиенз реакц1я деягскх ЕВС-форм та 1нсих иредстаннкк1в So^sлu/г¡ на 1нскул-цш ВТ).!. Серед випробуваних эраэк1В картопл! Сули вкладе»!
экстремально ctíííkí (Ca$ip, Анет), надчутлив! (с1янець 41356, сорти Сако i Приекулъсьгаш ранн!й, гЮрид Рання роза х Ерлайн, S. demis-sum та ík. ), толерантм (Ерлайн) i чутлив1 (S. acaule, л!нП 4 та 7к154) до ВТМ форми (табл. 1).
Таблиця 1
Реакщя деяких представник!в роду Solanum на 1нокуляц1ю ВТМ та ХВК
1 | Вид, сорт, г!0рид Тип !нфекцП i CTilIKiCTb до 1
| чл л1н!я картопл! ВТМ ХВК ВТМ ХВК |
| S. acaule, л1н!я 4 Системна Системна - |
| S. acaule, л!н!я 7к154 Системна - - ЕВС |
| S. demlssum Локальна Системна НЧ - !
I S. tuberosiLm:
| Ерлайк Цнцухт-лШя) Безсимптомна Системна НЧ - Í
| Рання роза х Ерлайн Локальна Системна НЧ - 1
¡ Привкульський ранней Локальна Системна НЧ - 1
| Схянець 41956 Локальна - НЧ ЕВС |
| Сако Локальна - НЧ ЕВС |
| Саф1р Обмежена*) - U8C ЕВС |
| Анет • - - 11ЗС ЕВС | t
ПриШтка: *) поодинок1 некрози; НЧ - надчуиишсть: ЕВС - екстре-м эль на ctikkíctb; "-" - в!дсутн!сть !нфекцП /ctííikoctí.
Пор1вняльний анал!з реькц1й зразкав картопл! на ВТМ- та ХВК-iHÍenuia показав, що у б!лыпост! з них, за винятком сорт!в Саф1р та Аиет, ЕВС цщо ХВК не зб1гавться з такою щодо ВТМ. Проте ст1йк!сть указаних copTiB, як i хнпшх форм картопл!, щодо ВТМ, очевидно, обу-мовлена íhuihmji, н1ж ст!шисть ix до ХВК, генетичними дзтерм!нанта-ыи, оск!льки S. acaule, шр слугував батьк1вською формой при виве-денн1 цих coptíb (Ross, 1974), вияеився високочутлгjUM до ВТМ.
Щ дан! св1дчать про високу в1русоспециф1чн1оть ЕЕС картошИ.
1.3. Взаемсдая ВТЫ xa ХВК у рослинах картаэшп
3 ыетоа вивчення мехашзму ЕВС була дослдаена вааемод!я ВТМ та ХЕК у 14 ctííikik i чутливих до ХВК зразках картопл! при амшанш
ШфеюцЗ. При цьому бур виявлеккй прогилежний характер взнемодП BipyciB: антагшпзм - в ЕБС-формач i скнергХэм у чутлишж до aipycy формах. Антагонизм BipyciB проявлявся у значному пригн!ченн! локально'! (с1янц! 41596 ! 7к154) i системно! (с!янець 7к154) !нфекц1й ВТМ. Результатом слнергетичного ефекту були: п!дсилення та !ндукц1я с/е novo НЧ-реакц! "i (некроз1в), а також стимуляция системно! !кфек-
Tt nn^TTMUiV Цз ri-'ijn'DT TTT^V fiif ТТЛ ПЛЯПП^ИРНП ПППГТЧШ
* " ^WW— ...W— .. ---. ------—,--- -------,---------- -J--- , - . .
i ефективний cnooi6 выбору рослик, CTiroaix щодо XBK, та практичн! рекомендацП з селекцП каргопл1 на ст1Йк1сть до Bipycnux хвороб.
1.4. Crifeicrs до ВТИ та XSK у культураз протопласта
Для того щоО перевхрити, чи в в клхтинах ЕЗС-форм картопл1 умоЕи для синтезу ХВК. та ВТМ, ми маяи на мет! дос-здити чутлив!сть до цих BipyciB !зольованих протопласт!в. Осга.льки 1зольава;п про-топласти картопл! на nepiofl проведения дослав у Е1русолог!чтй практиц! не використовувались, нам належало EiipiraiTii ряд метод1гч-них питань, пов'язаних з 1х видхленням, культквуваяням та !нокуля-ц!ею в!русачи.
Одержахня i кулътиБуваяяя протопластов. Завдяки Еипробовуванню р!зних г1дрол!тичних ферментхз (целюлаз ! пекткназ) та осмотгаив нами була п!д1брана ферментатквна сум!и, яка забезпечувала вих!д 1нтактних протопласт!в картошО 70-S0X. CyMim MicTiuia у соб1 \\ це-люлази Onozuka R-10, 0,05-0.2% мзцерсзшлу R-10, 0,4 М маШтолу та 0,01 М К-фосфатшга буфер рН 5,6. Одержан! протопласта закачались нормальною морфологгею ! хоролюш життездатяХстю, в тому числ1 здат-нЮтю виключати BiTazmHi барвники та тдтримувати репродукц!ю в!ру-су. Для культивуЕання протопласт1в еиявились придатнйми середовище Upadchi (1975), а також модиф!коваье середозице Aoki-Takebe (1972), тир застовувалось при кулътявуванн1 мезоф1льних протопласт1в тютюну.
1яокулящя протпластв ВТМ. В основу розроблено! нами методики були покладен1 результата 1нф!кування ВТМ гхротопласт1в тютюну (Otsuki et al., 1972). Щдб1р концентрацП компонент1в !ноку-люму за iH$era;iiiHicTra Bipycy в протопластах як критер!вм ефектив-ност! шокуляцН показав, що найО!льи придатноя для ц!в1 мети з су-м1и 1 мкг/мл ВТМ i 2 мкг/мл полЫ-орн^ину в 0,01 М К-нитратному буфер1 рН 5,5. ' Юльк!сть !нф1кованих протоплаот1в сягала 68Z, !н-фегадйтсть Bipycy за 36 год зростала .б!лыпе, Hi*, у 1000 раз!в.
Поо1вняльне вьвчення динашки росту 1нфекц1йност1 ВТМ в прото-
пластах екогремально ctíkkkx (Ca$ip, Анет), чутлшзих ,(л1нП S. acaule) i надчутливих (с!янець 41956, сорти Caí® та Приекульський ран-н1й)'<до ЕТМ форм картопл! не виявило суттево! р!зниц! н! в р!внях репродукцП BipyciB у кл!тинах, н! в характер! репл!кац1йного циклу (рис.2). Щ дан! св!дчили про те, що шптини сприйнятливих, надчутливих i ЕВС-форм картопл! тдтримують репродукц1ю ВТМ р1внош м1рою.
1нскулщ1я npomomtacmiB ХВК. Застосовуючк спектрофотометрич-
~ 4
Рис. 2. Нагромадження ВТМ в протопластах i а мезофыу листя екстре-ыально ctíükhx сорт!в картопл1 Анет (1) i Ca$ip (2), а исож чут-
§ ливого виду S. acaule (3).
??
I
s"
«э
í>
fe
г
ч,
п
1Í 2Д 3 6 4 В
Час пипя in оку ля цп, гид кий метод оптим1аацП скллду 1кокулуму (ЩерОатенко и др., 1934), ыи пЩОрапи оптимальи сп1вв1дношення Eipycy (2 мкг/мл), пол1-Ь-орн1-тину (1. мкг/мл) та иротопласт1в (1-3 к 10 кн/мл), ва якж нам удалось !нф1кувати 40-Б0Х протопластов S. acaule (лШя 4) та 30-407. протопластíb тютюну.
Пор!вняння нагромадженш ХВК у протопластах чутливих (Темп, Пркекульоький рашпй, S. acaule, 4) та ЕВС-форм (с1янець 41956, Caito, Саф1р, Анет) картопл! показало, що в шИтинах сприйнятливих форм Eipyc репродукувавоя у 5-2w pasiB 1нтенсивн1ше, н1ж у шйтинах ЕВС-форм. Ц1 дан! показують, що в ЕВС-формах картопл1 репродукц1я ХВК мождива, але вона оСмежена i на piBHi !аольованих протопласт1в.
* А *
Резюмуючи результата пор1вняльного вивчення механ!зм1в ЕВС картопл! до ХВК та ВТМ, сл1д в!дзначити, що ц1 ыехан1зми мають принципов! BifiMiHEOcTi. ЕВС картопл! до ВТМ функцшнув в !нтактн1й ро-слин! 1 не абер!гаеться в культур! хзольованих протопласт1в, подЮ-но до' BipycocTiíiKooTí картошй (Коваленко и др., 1982, 1S85) та по-
тюну (Otsuki' et' al. ,'1972), надчутливих до цього Bipycy, i обумов-лена, очевидно, 'блокуванням системного транспорту aipycy (Atabekov, Dorokhov, 1984).
Стосовно ЕВС картопл! до ХВК, вона эа cbo'ím м-эханхзмом б особ-ливим типом ctíhkoctí, який в!др1зняЕТ1>ся# з одного боку, з1д над-_ чутливост1, остальки при шокуляцП ЕЕС-форм за ззичайнкх умов оз-наки 1н4>екцП, smíim метабол!зму 1 захнсн! резкц1! рослкк не вияв-ЛЯЮТЬСЯ. 3 !НШОГО бОКу, ЦЯ CTiflKicTb в1зкяеться в1д !мунност!, тому шр в ЕВС-формах картопл! можлива обмэжена релродукц1я sipycy в рсс-линах при энмен1й температур! i за и-ормальких умов в !зольованих протопластах. Таким чином, жодна !з висунутих paniie г1потез про пр!фоду ЕВС картопл! щодо ХВК не узгоджувалась з нашими експеримен-тальними даними. Тому ми д!йпли до висновку, що мехая1зм ЕВС обу-мовлений шдиф!кгц1ею шатанного продукту -'еобхадного для 1н!ц!ацИ X-BipycHO'i !нфекЩ'! (Коваленко и др., 1934). На баз! ц!в1 !де! була сформулъозана гпютеза (Щербатенко и др., 1935), вПдно з якою причиною еес б мутаЩя гена сприйнятливос?! картопл! (г;;), пр гонтро-люв, mow-theo, синтез фактора, яккй biairpas певну роль в реал!зацП ранн!х стад!й репл!кац! 1 ХВК (Otsuki et al., 1974; Goodinan, Ross, 1974). В1дпов1дно до цього дом!иантш*.й алеломорфнпй ген Rx, як де-тэрм!нант ЕВС (Cockerhsni 1970), е мутантом гену гх i кодуе аномаль-ний (модиф1ковапий) фактор сприйнятлизост! рослин щодо ХВК. Тому за звичайних умов репродукд!я ХВК в ЕЕС-рослинах кемогшшва. При субоп-ттзльнШ температур!, а гакок у npoqeci вэдхлення протопластis за-вдяки ф!зЮлог!чним стресам можуть В1дбуватися перерозпоД1л актив-hoctí reHiB (Pierpoint et al., 1981; Титов и др. 1983) i активащя рецесивного гена гх.
2. 1ЕХЛШЗИН В1РУСОСГЛЙФСТ1 У РОСЖЯ, НАДЧУТЛИВИХ ДО В1РУСП01 1КЭЕКЦП
РеакцЗя надчугливост1 (НЧ) до ВТМ у N. glutinosa, сорт!в i ri-брщЦв тютюну, одержаних за участи цього виду, в тому числ1 амф!-дипл01ду N. didebta, coptíb KcaHTi нк, Самсун NN, Сачсун 27, Самсун 158-7, 1муннил 580 та íh. , контролюеться одним дом!нангним геном N (Sela, 1981, Терновский, 1969, Терентьева, 1971). Хоч 6íox!mísm НЧ-. раклИ уже досить детально вивчений (Fritig et al., 1987), взавмо-зз'язок Mi* нею, з одного боку, 1 такими явгадами в1русост1йкост! як ЛВ1 та IBC - з iHiüoro, дошйджений недостатньо, а механ!зми 'ix не-
eîдом!. Тому нами Сули детальна досл!дкен1 ц1 явища на р1вних моделях, аокрема на тютюн! та дурман!.
2.1 Взгсмоав'яаои ni« НЧ-рвакщки, ЛВ1 та IBC
Досл!дження ефективност! системно! IBC у комб!нац!ях двох Bi-pyciu (ВТ}.', ХВК) ia 8-ма надчутливши до них видами та формами рослин (тютюну Самсун 27, Самсун 158-7, 1мунний 580, N. didebta, кар- , TOimi, дурману та гомфрени) за критер!ем зниження к!лькоот1 та роз-Mipy локальних некроз1в, викдкканих повторною 1нокулпц1ею, виявило ïï эначне варйсвання: в!д 0 до ВЗХ - за к1лък1отю ! в!д 49 до 65% -за розм!ром h'eKposiB у максимум! IBC (6-9 днхв). Цоб вивч^ти причини Bapiioi'aHHii IBC, ми досл!дми динамжу зб1лыпення розм!ру докаль-них уракень, що формувашись п1сля першо! пюкуляцН, i розвитку IBC до повторно! хНокуляцП ВТМ у форм тютюну, як1 реагують на цей Bi-рус р!зними за величиною некрозами. Було встановдено, що м!ж некро-тизац!ею тканин i розвитком IBC не icHye певного зв'язку, сп!льного для Ecix форм (рис. 3). Так, у сорИв 1мунний 5SO i Самоун 27, як! в!др!зняюгься в1д 1нших форм тютюну уповШненкм темпом некротиза-цП тканин, а отасе, i високою ефективн!стю ЛВ1, хнтенсивнЮть розвитку i максималънии р!вень IBC Сули разними - високий у першого ! низькик у другого; i, навпаки, р!зним !нтенсивнс,ст! некротизацП та ефективноот1 ЛВI у N. didibta i сорту Самсун 158-7 в!дпов1дали од-наково невисок! темпи розвитку системно! IBC.
OcKijQKH час утаоре.чня некроэ!в у НЧ-рослинах можэ Сути покзэ-ником не лише ефективност! JBI (Conti et al., 1978), але й 1нтенси-BHOcri репродукцП Bipycy в них (Matthews, 1982), вахливо бую дсс-Л1дити роль ЛВI та репродукцП Bipycy в розвитку IBC. Для блокуван-ня НЧ та ЛВ1 заотосовували занурення 1нокулюваних листк1в у воду, а також обробку 'ix iHriöiTopaMH активност! кл1тинного генома - акти-ном1цином Д та рифам1цином. ДооЛдами було встановдено, що при за-HypeHHi листк1в дурману, тютюну 1муннш 58D та гомфрени, 1нокульо-ваких в!дпов1дно ВТМ та ХВК, на 5-8 д!б у воду локальн! некрози не утЕорювались, a Bipyc нагромаджувзвся у 100 раз!в !нтексивн!ше, н!ж у норыальних некрозах. В таких роолинах IBC не виявлялась. Чаоткове блокування IBC cnocTepiranocb також при обробц! первинно !нокульо-ваних ВТ),! листк!в тютюну АМД (10 мкг/мл) та рифашцином (20 мкг/мл).
Оск!льки у ркфашцину поряд з Олокуванням IBC наш була вияв-лена також iHriöiTopHa д1я на ЕТМ та ХВК, ми не викдючади того, що
часткове Слскування ним IBC обумовлене пригн1ченням репродукц!3 El-русу-!ндукторз. Тому в настугших доаидзх ми вивчали хндукщю в!ру-сом ст!йкост! рослин за умов, якл виключають його репродукцш. Було встановлено, що ВТМ, !н'бкований у ммкгптинний npocTip napeuxiMii листя тютюну Гмунний 580, не спричиняв уражень тгсанини, але îctotho впливав на сприйнятлив1сть ïï до 1нокуляцП тим же в1русом. Ц1 дан1 сз!дчать про те, що 1нтенсквн1сть репродукцП Blpycy не 6 вирщаль-ним для !ндукП IBC i що нвдукторами ст!йяост! можуть бути BipioiiH або ïx складов! компоненти.
Л
Л? 12 </Йв
nie па woKÇdecftt, Si?
« !
I
i .5: -
4û
2!
Час mLx t-w i 2-m (wxgaaqka, Si S
Рис. 3. Динам!ка росту poBMipy локальних некрозiв (А, Б) та 1н-дуковано! 'ст!йкост! (за величиною некроз!в) до повторно! ВТМ-!нфек-Uiï (В) у амф!дилло!да N. didebta (1) 1 N. ta-bacum copiiB: 1мунний 580 (2), Самсун 27 (4) та Самсун 158-7 (3).
2.2. Еиявлеиня IBC у культур! протопласт^
В!домо, що НЧ-реакц1я i ЛВ1 у тютюн! (Otsuki et al. 1972) ! картоши (див. розд. 1.4), харакгерн!.для 1нгактних рослин, ке еко-пресуються на piBHi !зольовааих протопласт!в. У эв'зку з цим важли-
во було досл1дити,-чи эбер1г2Бгься ст1ЙК1сть, 1ндукована в рослинах, у вид1лбних 1в них протопластах. Вилробувания природно! ст!йкост1 протопласт1в, гзольованих is мезоф1лу листя здорових рослин тютюну чутливого (Самсун) 1 надчутливого (1мунний 580) сорту тютюну, щодо 1нокуляцП ЕШ показало, що протопласт надчугливого сорту, хоча 1 не проявляли ознак НЧ, були б1льш стгйкими до цього Bipycy 1 в 10 раз1в слабкИае п!дтримували його репродукщю, н1» протопласти чутливого сорту. Проте Екявлена CTiiiKiCTt не в специфичною 1, отке, обу-мовленою геном N, оск!льки вона д1яла такси црдо 1нфекцП ХВК, на яку обидва сорти тютюну реагують системно.
Що стосуеться IBC, то вона характерна i для протопласт1в. Нами було виявлено', що протопласти, вид1лек1 э базально! частини листка тютюну 1мунний 580 через 7 д1б П1сля ^.окуляцп ВТМ його ап1кально1 частини, були у два-три рази ст1йк1шшли до Bipycy, тж у контрол1 (табл. 2). Обробка 1нокульованих частик листя АМД 1, особливо, за-
Таблиця 2
Виявлення IВС та 'i'i кл!тинних чинникхв у тютюну 1мунний 580 In situ на piBHl 1зольованих прзтопласт1в
I-----1
11нокуляЩя, обробка К1льк1сть неушкоджених про- 1нфекц1й
|ап1кально! частини топласт1в, 7. ний титр
|листка Усього В тому числ! ВТМ, %*)
| уражених ВТМ
|Несправжня 1НОкуляц1я (контр.) 78,5 ± 2,9 27,7 4,4 100
|1нокуляц1я ВТМ 78,7 ± 4,6 13,1 ± 2,5 29 i 12
|ВТМ, 24 год - АВД (Ю мкг/мл) 75,0 ± 4,6 15,8 ± 3,4 57 ± 10
!ВТМ, занурення в воду (7 д!б) 69,7 ± 5,2 15,9 ± 3,1 80 i 5
ПримИка: *) через 48 год П1сль 1нокуляц11 протопласт1в.
нурення ix у воду призводили до эначного эменкення IBC щодо репродукцП Bipycy, але не до ураження ним протопласт!ь. Ц1 дан1 пере-конливо св!дчать про 1снування принайшп двох кл1тинних чинник!в, один з яких обыежуе релродукщю Bipycy в протопластах, iHnnoi - ура-ження ix ВТМ. Причому, перший - чутливий, другий нечутливий до дП АВД i rinoKci'i - фактор1в, як! здатн! блокувати ЛВ1.
- 17 -
2.3. Иожлиа! чинниии J!BI та IEU
У процес! ЛВ1 i розвитку IBC в тканинах уражених BipycoM над-чутлкЕИХ рослин yTBoprasться ряд нових ксмпонент!в, як! можуть роз-глядатись як чинники в1русост1йкост1, зокрема РК-б!лки (Bianinazzi et al., 1070; Van Loon, Van Kämmen, 1970), aHTiraipyjHi речовини типу антив1русного фактора (ЛЕО, Sc-la., 1991) та 1нг1б1торя nipycHoi репл!кацП (IBP, Spiegel et al., 1989). IBP був виявлений також у культур! протоплаот1в надчутливого сорту тютюну KCSHTi нк, 1нску— льованих ВТМ in vitro (Loebenstein, Бега, 1981). Однак функциональна роль згадаккх компонен?!в у реал1эац1'2 захисних HexanisMiB зали-шзлась дискусШюю, оск!лъки одночзсного досл!дження "ix в одн1й i тШ же систем! не проведено, а випробування б!олог1чяо1 активност! aHTHBipycHHX агент!в здшснювалось иеревакно в гетеролоПчних системах. Тому нами було проведено одночасне виявлення РН-б1лк!в та антив!руских чинштав у едшпй систем! - тютюн! сорту 1мунний 580, надчутливого до ВТМ, в динам1ц! EipycHoi 1нфекцП.
PR-6lJiim. Було встановлено, що 1нскуляц1я рослин тютюну ВТМ призводить до п!двищення вм!сту (на 30-90л) кислих, екстрагонаних при рЯ 2,8, але не основних (екстрачц!я при pH 8,2) CiJKiB в ino-кульованих та протилежшв: 1м половинок листк!в, у пор!внянн! з в!д-П0в1дниш половинками jaгогк1а контролъних рослин. Досл1дження фрач-ц!йного складу б1лк1в за допомогош електрофорезу в 10Х-нсму ПААГ показало, що в iH$iKOBaHiä половшц! тютюну вже через 4 д1б пЮля 1нокудяцП вияелябться 2, а через f д1б - 3 б1лкових компоненти, в!дсутн1 у здоровкх половинкзх заражених листйв та !нтактних рос-линах (табл. 3). А через 14 д1б п1сля !нокуляцП електрофоретично найб!льш моб!льний б!лок виявлявться i в адорових половинках зара-жених листков. Ц! балков! компоненти за електофоретичною моб1льн!с-тю в 10%-ному ПААГ (Rf 0.88, 0.80 i 0,68) под1бн1 la- та 1Ь-б!лкач тютюну copriB Cawcys NN га Ксант! нк (Antoniw et al.,19S0), а такой bl"-бiлкy, характерному для N. glutinosa (Ahl et'al., 1982).
У амф1дипло1ду N.didebta, поряд ia РН-6!лкеми la, lb та bi" нами виявлен! ще дв1 додаткоа! мент моб1льн1 фракци з Rf 0,57 та 0,48 (рис. 4). Ков! PR-6ijiKH виявлен! у D. metel ! D. stramonium, !нф!кованих ЗТМ. Препарати Рй-б!лк1в мали гемаглютинуючу активн!сть.
Ангпиз1русн1 чивники. Як i Рй-б1лкл, антив!русн! препарати типу АВФ га IBP одержували з !нф!коваких ВТМ та протилежних !м половинок листк1в тютюну через 4, 7 i 14 д1б п!сля !нокуляцП ВТМ. До-
- 18 -Таблица 3
Виявлеккя АВФ, IBP 1 PR-6iJiKiB у тютюн! 1мунний 580, ураженому ВТМ
Дн! п!сля Половинка 1нокуляц1 листка
АВО
IBP
Р1?-С1лки
I II III
I II III
4
7 14
Уражена ВТМ Здорова Ураженй ВТМ Здорова Уражена ВТМ Здорова
Б Ш g
| - -
а - ш
- s -
0 - -
S Ш 13
g - - la, lb s - a la.lb.b" В Е 1 la, lb
Притткз: "-" - BijoyxHiCTb активност! або Рй-б1лка; i - наявн!сть активност!, Щ - непоот1йка активтсть у протопластах тютюну Самсун (I) 1 листових дисках тютюну Самсун (II) 1 Самоун 27 (Щ).
сл!дження 'ix ак.тивкост! в культур! !вольованих протоплгст!в тютюну Самсун 1 дисках 1з листя Самоун та Самсун 27 у пор!внянн! а конт-
о о: о. ot os ю с ог оь es ю
02 it ев ы a i a ii и î» Га
Рис. 4. Електрофорегрзми та денси- Рис. 5. Результата електрофоре-
тограмк розчинних (рК 2,8) б!лк!в зу й!лк!в i3 !нф1копаного ВБТ
е 1кф!кованого ВТМ (A) i здорого- (А) ! здорового (Б) листя тютю-
го (Б) листя N.didsbta. ну 1мунний 580.
листк1в здорових рослин, показало, щр АВФ виявлявся упродовж всього перЮду спостерелень (4-14 дн!в п!сля 1нокуляц1!) в 1нокульован1й i здоров1й половинках заражених рослин, в той час. як IEP - лиге в 1нокульован1й половинц! (див. тайл. 3). Причому 01льш стаб!льна ак-тивн1стъ антив1русних фактор1в виявлялась у протопластах, н1ж у ли-стковкх дисках як тест-системах.
У препаратах АВФ, вид1лених is листк1в тютюну через 7 дн!в ni-сля 1нокуляцП ВТМ 1 очищения на колонц! з сервацвлем ДЕ-52 (фрак-ц1я, елюйована 0,65 М NaCl), електрофорезом у град15нтному (8-2GX) ПААГ в нативному стан i виявлено 3 OUraBi компонента. Найб1льш ио-С1льний з них мав антив!русну активн1сть i позитивну реакд1ю з реактивом Шифа, що вказувало на його гл1копроте!нову природу. Молеку-лярна Maöa вид!леного гл1копроте'1ну, визначена за допомогою елект-рофорезу в умовах денатурацП (ДСП), виявизась р!вною 20 ><Да.
* 1* *
Щдсумовуючи представлен! результат, cлiд В1дзначити, що у фунюцонуванн! JIBI та IBC рослин, надчутливих до в!русних !нфекц!й, не мае вир1шального значения некротизаиЦя тканкни, хоча пусковим механ!змом ctímkoct! е, очевидно, в!рус-1ндукована КЧ-реакц1я, де-терм1нована кл!тинним геномом N. IBC за своею природою под1бна до ЛВ1 i s п1дсиленим вар!антом останньо!. У рол! 1ндуктора пускового механ1аму виступаять продукти з!руского генома, мождиво, структур-ний б!лок Bipycy або його, як! виявлен! за межами некрозу(Шмигля та íh. , 1991). Чинниками ЛВ1 та IBC мокуть бути РН-б1лки i антив1русн1 речовини типу АВФ та IBP, ефективн!сть яких виявлена нами вперше в протопластах In situ. Остаян! s кл1т!шними чинниками в!русост1йкоо-т! на в1дм!ну Bifl РР-б!лк!в, як! поряд a íwinm речовинами можуть виконувати функцП посередник1в Mix 1нтегрованими в тканину ураже-ними i здоровими кл!тинами,. м1ж 1ндуктораш i факторами ЛВ1 та IBC.
з.в1руссст1йк1спъ та Ti ОДИЛИВ1 0актори
при систшия В1РУСН1Й iiraaaui
НаявнЮть !дуковано5 в1русост!йкост! у сприйнятливих рослин показан! рядом атор1в (Atkinson, Matthews., 1970; Kluge, 1976) на приклад! мозаТчних 1нфекц1й. Пор!вняно з 1ншими системными !нфек- . Щями характерними особливостями ВБТ-1нфекдН е И висока патоген-HicTb, особливо цодо рослин роду tllcotiana, а також недостатя вив-
чен1сть вваемсшдношень эбудника з рослинсю-хазяшом. 3 огляду на це, а також на з1дсутн1стъ сортов татону, стхйких до ЕБТ (Шмидт, Клайнхемпель, 1083), природн1 та 1ндукован1 захисн1 jexaHisMii при системн1й BlpycHin 1нфек!Ц1 ми досл1дкувалк в систем! ВБТ - тютюн.
ЗЛ. Реаящя рослин Nicotians иа игокулшйм ВБТ
3 '.етою виявленкя рослин - донор1в високо! BipycocTiiMocTi бу-ла випробувзна реачщя на ВБТ у 139 селекщйних spasKiB, у тому числа 7 диких вид!в Wicotiana, 119 мшвидових rispimib i síhík та 13 районованкх i перспекгивних coptíb тютюну. Bci випробувзт сорти виявились чутливкмк до ВБТ, хоча 1 pisKrjnicn míjs собою аа ступеней i дпнамхксю розвитку хворсбк. Серед досл1ддених вадхв дюзе N. glauca був 1мунним, N. sanderae та N. alata - надчумивими та вхдносно стойкими до ВБТ. Вхдтак у популящях останШх вид1в була виявлена широка гетэрогенн!сть реакц1й рослин ка 1нокуляцш ВБТ. N. lansdor-ffli, N. palmer!, N. trigonophylla, як! panice були в!дом! як 1мун-hí подо ЕБТ (Терновский, 1S71), уражунались цим aipyooM, хоча i мэншою игрою, hík N. debneyi та сорти N. tabacum. М1жвцдов1 г1бриди Асан (Американ 361 х N. sanderae) та ТГ (Трапезунд 19 х N. glauca) виявились EncoKOOTiÍKKkffl i реагувалн на 3.нокуляц1ю ВБТ лише локаль-Н1ши уражекннмп (Асан) або системною слабкозираженов некротизац1еа (ТГ). У польсиих умовач ц! г1бриди практично не у разувались ВБТ, то:«;/ вони були викоркстанз. для одержання coptíb, ctíwcix до цього Bipycy, на Кримськгй станцП тютюншщтва та в наши робот1.
3.2. Елпйпащя SBT у ¡"yJüxypi ткаюяш як saaicna реалщя
В1домо, s;o ЕТМ3 ХВК та íhsií Eipycn можуть досить довго sOepi-гатися у калуских культурах i передаватися рослинаы-регенэрантам (Marakishi, Carlson, 1976; Shepard, 1977). На в1д>.йку в1д цього, в наикх доолйдах показана, ио bmíct БЕТ у катускш культур! тютюну 1ыуиний 580 до 12 noffliB дещо збалызувазся, через 15 тижпв. - змен-пувавоя, 1 через 18 tmxhíb Bipyc noBHiCTso ел1м1нуваЕСя. Причиною ел1м1нацП Bipycy могло бути переважаиче размножения безв!русних KíúTíui над BipycBMicHiiMK, обумовлеке fiie¡o неопецифхчних хндукова-них захисних MexanisMiB. В1дкрите явице було використане нами для одержанвя форм тютюну, ctíükjix до ЕБТ.
Культивування листово! тканини уракеких ВБТ 5 ссрт!в тютюну на
- Si -
соред"'Еиц! КС з фггогсрыспачи дало kojuuíbíctí одержатн оздоровлений калуо, а вхдтач на тому к середсзвд (без $iTorop:/.oHiB) регенерува-ти рослиии. nepeoipKa 184 рослин-регенерантгв на уракен1сть ВБТ показала, шр б!лып1сть is них (79%) - спркйнятлива, 127. - в!дносно ctíjík! i 9% - виооко отита до дього Bipycy; част/ча 'ix була фер-тильною i давала повноц1нне кас!кня. Найб!льшик вих!д фертильних
X^-W --.. т г ——.....---,------/лг*<»\-------—......
ys-t^íil Jp.^U i wi.Ji UACíllUmiil lU'g) X.CX lltf ^CJ.IUA':! Oü t /oj .
Однак досл!дженням трьох покол1нь потомства CTiüratx сомаклон!в у популяц1ях була Еиявлена значна к1лькЮть високочутливих щрдо ВБТ, морфолог1чно дефэктних та стерильних форм. Продуктивн1 та високос-tíkkI форми тютюну copTiB Кршський степовий, Американ 361, Перема-кець 83 та íh. булк передан! Кримськ1й станцП тмюнництва для подальше! седекд!йно1 роботи.
Осгальки ctíct:í до ВБТ kííkeürobI Пбридн тютюну були стериль-ними, нами була зроблена спроба одержати 'ix фертилья! форм! за до-помогою клонувакня тканин in vitro, регенерацП сомаклойв та об-робки регекеракт1в аценафтексм. Досл1дяували самостгрильн1 г1бриди Асан, Асаксан (Асан к N. sands гае), ТГ (Грапезунд 19 х N. glauca), 105з (Харманл1 х N. glauca), 6а (Кучерявий 140 х N. glauca), 91а (Кучерявий 73 х N. sanderae) i lia (М. tabacun N10 x N. glauca), a яких одержували nepEHHHi сомаклоки, потомстео в1д самозалилення ос-танн!х, а також гЮриди Fi В1д схрещування сомаклств иЫ собою, з материнськкми формами або сортами Гавана 38, 1мушпш 580, Перемо-жець 83 та Кркмський степовий. В результат! були одержан! дач i, як! дашть пхдстави вважати, що ст!йк!оть до ВВГ у тютюну мае пол!генний характер. Окрем! клони м!жвидових ri6pnfliE виявились фертильними i знайжли застосунання при одержанн! нового сорту тютюну Американ 63.
3.3. !5q)i®hbí чинникн cxiñKocTi тмтюну до ВЕХ
Виявлене нами явище спонтанно! ел1м1нацИ ВБТ у калусних культурах эа деякими ознаками подхбнэ до локал1зад1"! ВТМ-1нфекц11 у НЧ-рослин. Це., очевидно, б причиною того, що при ВБТ-1нфекцП нам удалось одержати набагато б!льший вих!д ст1йких клонав, Hi« це мож-ливо при моза!чних 1нфекц!ях (Murakishi, Karlson, 1976; Shepard, 1977). У звЧку з цим взжливо було досл!дити можлив! фактори ст!й-кос Л тютюну при ВБТ-!нфекц!!, зокрема залежн!сть реакц1! в1д Bipy-лентност! Bipycy на макро- та ультрам!кроструктурному píbhhx, утво-рення 1ндуковано'1 ctíhkoctí, PR-Oíjkíb ! антив1рус:них речовин.
Патогена! ешь ВБТ. 32 !золяти ВБТ, вид i лен! нами а рослин тютюну в передг1рськ!й (с. Табачне, Бахчисарайського району) та суО-троп1чн!й (ок1л м. Ялти) зонах Криму, за допомогою рослин-iндикато-piB було дкференц!йовано на три групи Bipycy з ргзною патогенн1стю: високою (ВБТс), середньою та низькою (ВБТм). ВБТс хндукував на ího-кульованих листках тютюну велик! локальн! некрози, . на верх1вкових листках - г:рав!рування, "дубуватий" малюнок та серпаст!сть листово'Г пластинки, ВБТм - лише прижилкову моза!ку листа.
Ультраструктура кл!тия ттхту. урамзних ВБТс i ВБТм. Електрон-HOMiKpocKoni4Hi досл!дження,ультратонких spisiB листово! паренх!ми тютюну1мунний 580, ураженого ВБТс, показали, що вiрус викликае де-струкц!ю органел, в першу чергу хлоропласт i в i 'ix мембран, дезорга-Hisayíra цитоплазми ендоплазматичного ретикулуму, вакуол1зац!ю цито-плазми, дегенерад!ю плазмолеми i тонопласта та м1тохондр!й (набухания, дегрздац!ю крист). У цитоплазм!, особливо по периферН кл1-тин, виявляються скупчення сферичних Bipycmcc часток (80-120 нм), обмежен1 мембранними структурами. В клiтинах, уражених ВБТм, навпа-ки, деструктивн! процеси слабко виражен1, BipycHi частки трапляють-ся piflKO; привертае увагу значна кШкЮгь в1русоспециф1чних вкЛю-чень, як! в рослинах, уражених ВБТс, майже bobcím не виявляються.
1нтер$еренц1я bípvcíb i дэдуковаяа ст!йк1сть. Встановлено, що ВЕТо i ВБТм у рослинах iнтерферують м!ж собою. Попередня механ1чна 1нокудяц1я тютюну 1мукнии 580 моза'1чним 1золятом захищала росдини в!д повторно! 1нокуляцП суворим !золятом максимально (на 100Х) через 20 д1б п1сля !нокуляц!1 моза!чним 1золятом. 1Ц дан! св!дчать про MCHunfflicTb використання слабких штам1в ВБТ для захиоту рослин _в!д суворо! бронзовост1.
3 метою перев!рки специф!чност! IBC рослини тюткну 1ыуннии 580, уражених ВБТс, 1нокудювали ВТЫ i врзховували величину захиоту за зменшенням к1лькост1 кекроа!в, 1ндукованих повторною 1накуляц!бю як на !нокульоваиих (локальна IBC), так i на верхних не 1нокульова-них ВБТ листках (системна IBC). Досл1ди покрали, щр локальна i системна IBC виявлялись уже через 3 доби 1 досягали максимуму (87%) через 12 д1б п1сля «окуляцП ВБТ,
Таким чином, системна 1нфекц1я рослин тютюну ВБТ здатна хнду-кувати неспециф1чну'IBC, подхбну до тако! надчутливих рослин.
Рй-б!лки i, актив!pycHi чинники. tommlpycHi факт'ори типу AB® та IBP виявляються в рослинах тютюну 1мунний 580, уражених ВБТс, як у гостр!й (на 21-й день), так i в хрон1чн1й (на 84-й день) фаз!
1нфекч11. Вони в концентрацП 60 i 30 мкг/мл, в1дпв!дно, 1нг!бували репродукц!ю ВТМ у дисках !э листя тютюну Самоун на 80-90Z. За допомогою електрофорезу в ЮХ-ному ПААГ у С1лкових препаратах, вид1ле-них 1а 1нф1кованих ВБТа рослин тютюну 1мунний 580, виявлека три PR-б!лки э Rf 0.57, 0.71 i 0,81 (рис. Б). Sa електрофоретичною моб!ль-híctd вони були !дентичними Рй-б!лкам la, lb i lo, виявленим у рослин цього оорту тютюну при локальн1й !нфекц11 ВТМ. Привертае увагу в1дсутн1сть на електрофореграмах б!лка bi", характерного для згада-ного 'сорту тютюну i успадкованого ним разом э геном N в!д N. glutinosa. Цей факт може бути св!дченням того, що активован1 ВБТ эахисн1 механ!зми не ыаить в!дношення до N-гена, а обумовлен! 1ншими гене-тичними детермхнантами.
•* * *
Отже,. наведен! дан! св!дчать про наявн!сть у тютюну та !нших вид1в роду Nicotians природно! га !ндуковано! ст!йкост! до системно! i нфекц! 'i ВБТ. Хоча природна от!йк!сть тютюну до системно! ВБТ-1нфек!1, на в!дм!ну в1д моногенного контролю надчутливо! реакцП його до ВТМ, контролювться скорi□ пол1генно, неспециф!чна 1Ндукова-на ст!йк!сть рослин до цих в!рус!в мае багато сп!льного i виявЛя-бться в самооэдоровленн! рослинно! тканини, ультраструктурнхй пере-будов1 !нф!каваних кл!тин, а також а !ндукцп синтезу Рй-б1лк1в i антив!русних чинник1в. Ц! властивост! ВБТ-1нфекцП використан! нами при одержан^ форм рослин, ст1йких до ВБТ, за допомогою нетрадтЦй-них метод!в, зокрема культури !нф!кованого калуоу i регенерацП э нього соматичних клон!в.
4. НЕСПЕЩИ1ЧН1 1НДУКТ0РИ В1РУС0СТ1ЙК0СТ1
Одним is п!дход1в до вивчення механ!зм1в BipycocTiüKocTi рослин б експериментальне моделюваиня ix за допомогою речовин певно! xímí4hoí будови. 0ок1льки в л1тератур1 неодноразово висловлювалось припущення про те, що неспедиф!чна !ндукована ст1йк1сть рослин по-д1бна до оистеми 1нтерферону тварин (Loebenstein, 1972; Sela, 1981, Gianina22í, 1982; Kassanis, 1983), нами були випробуван! як !ндук-тори IBC препарата, як! мають !нтерфероногенн1 властивоот1, зокрема: гетеролог.чн! РНК, синтетичний аналог dsPHK, пол!кэрбоксилати та пол1сахариди.
- 24 -
4.1 Bipyc Penicilliusi ftiniculosuxt та його Pi IK
Досшдження BlpycHnx npenapariB, вид!лених is м:^ел1ю гриба P. funiculosm M 2319, показало, яр BÍpyc мае сферичну форму i УО-спе-ктральн! властивост!, характеры! для нуклеопроте!д!в. Видiлена з нього нукле!нова кислота давала поэитивну реакщю з орцином, але не з дифейлаыхном, г1дрол1зувалась в присутност! РНК-ази, але не ДНК-ази i при HarpiBairai з lZ-нкм формал1ном мала г1перхромний ефект 32%. Ц1 данх св!дчать про те, цо в1русна нукле!нова кислота е дволанцюговою рнк.
Bipyc та РНК Bipycy P. funiculosm, под!бно до др!жджово! РНК, чинили подв!йну д!ю на в1русну 1нфекц1ю у рослин. При додаванн! до !нокулюму в концентрацН 3-БО мкг/мл вони на 30-90£ пригн1чували 1нфекц!шйсть ХВК i ВТМ у N. glutinosa, D. stramonium, але не у В. globosa. Поряд з цим, MiKOBipyc та його РНК, введен! в м1жкл!тинний npocTip лкстово! паренх!ми тютюну Самсун 158-7, 1ндукували не лише локальну (як др1жджова РНК), але й системну ст1йк1сть до ВХМ, яка виражалась у эменшекн! к!лькост1 та posMipy локальних некроз!в у nopiBHHHHi з контролем. Причому, динам!ка стшкост!, !ндуковано! BipycoM i його dsPHK, мала р1зний характер (рис. 6), обумовлений, очевидно, тим, що чинником IBC в не б1лок, a dsPHK Bipycy.
Ркс.б. Динам1ка розвигку локально! (a) i системно! (б, в) ctíükoctí тютюну Самсун 153-7 до ВТМ, !к-дуковано! BipycoM Я. fu-nlculosum (1) та його РНК (2). Зменшання к!лькост1 (а, в) та posuipy (б) локальних некроз1в.
BipycocTiHKiCTb, !ндукована у НЧ-рослин MiitoBipycoM ! його РНК, виявилась вищою, hííí ст1йк!сть, !дукована суыарноо др!жджовою РНК, однак також чутливою до дП актином!цину Д (20 мкг/мл).
4.2. Пшйрибонуклеотиднкй комплекс пол! (Г) пол! (Ц)
Св!дченням того, ср для 1ндукцП BipycccriHKOCTí за допомогою
РНК Bipycy гриба важливою ..умовою s П дволанцюгова структура можуть бути наш! дан! про !ндукц!ю дволанцюговим полануклеотидним комплексом пол!(Г) * полЦЦ) ст!йкост! до ВТМ у надчутливих рослин тютюну та дурману. Досл!ди показали, що пол:(Г) • пол!(Ц) здатний !ндуку-вати як локальну (до 80%), так i системну (до 30%) ст!йк1сть тютюну 1мунний 580 до цього Bipycy з максимумами, под1бнши до таких cTiü-koctI, шдуковачо! dsPHK MiKOBipycy. Проте, динам1ка роэвитку ст1й-ivGCTi, 1кдукоб2до'1 пол! (Г) " пол!(ц), и'у'ла дешр Ikujuiü (рио. ") . дн BipycocTiüKicTb також виявилась чутлигою до дП акт;отом1цину Д.
Нашими досШдженнями показано, що ПВП з ргзнсю мслекулярною масою (14, 30, 60 1 85 кДа), а також сп1впол!мери ЕП з КК (вм!ст ланок ВП 78,3 - 93,3%) в 1%-н!й кокцентрац!! на 20-70% пригн!чувапи роэвиток некро31в, !ндукованих ВТМ на листках Af.g-iutlr.osa 1 О.яЬга-лотшп. Антив1русна активШсть пол1карбсксилат1в частково бдокува-лась актином!цином Д (5мкг/мл). Сп1впол1мер ВП-КК (0,05-0,1%), введений в м1жкл!тинний прост1р листка тютюну !мунний 580 за 3 год до !нокуляцп, !ндукував локальну стияисть рослин до ВТМ (36-57%).
Таким чином, ПВП та його походи! у пор1внянн! э нукле!новими кислотами е б!льш слабкими вдукторзми в1русост!йкост! росл!ш.
Ще в 1967 роцх L.V. Eorecky et al. покззали, що др!жджовии ма-нал здатний 1ндукувати синтез 1нтерферону в орган1зм! тварин. Шз-Hime !нтерфероногенн1 властивост! були в1дкри?1 у р!зних полЮаха-рид!в (Аксенов и др., 1972, 1976; Бектемиров, Соловьев, 1Q81 ). Та,
Рис. 7. Дкнамгка розвитку локально! CTiilKOCTi до ВТМ, in-дуксЕано! пол!рибснуклеотид-ним комплексом пол! (Г) • по-л1(Д) в лист! тютюну 1мунний 530.
1, 2 - змениення к!лькост! та po3Mipy некроз1в, в!дпов!дно.
Vffc топя дЗв^шЛндукторп. №'
4.3. Пол1в1н1лп1рол!дон та його позпдн1
4.4. Др1ждшз1 пол1салприди
хоч iHriöiTopHi властивост! пол!сахарид!в щрдо Blpycla рослин були BiflOMi давно (Takahashi, 1948; Bawden, Freeman,-1952), неханхзми Ix дП 'залишалксь нез'ясованими, а вказ!вки на те, що ц1 пол!ыери ыо-жуть !ндукувати регистентн!сть рослин до в1руоно1 !нфекц!1 (Gupta et al., 1974), - cnipHM.ffl (Osterman, Leiser, 1986). Тому нами Сули проведен! Eceöi4Hi досл1дження др!жджових пол!сахарид!в як эахионих агент1в.
Одерманяя i будава ан/шшрусно активних под!сахарид1в. Досл!-дження близько 50 пол1сахаридних препарат!в is кл!тин, культураль-них р1дин i плазмол!зат1в др!ждж!в щодо ВТМ i ХВК показало, що наи-б1льш антив!русноактивн! полЮахариди продукуються р1зними видами Candida та Säccharomyces, менш активн! - видами Cryptococjs, Rhodo-torula, Sporobolomyces. Високоактивн1 пол!сахариди виявлен! також у др1жддових екстрактах таплазмол!затах кормових др!ждж1в промио-лового виробництва. Всгановлено, що вих!д, антив!русна активн!сть i хШчний склад препараПв залежать не лише в!д продуцента чи джере-ла пол!сахариду, аде и в!д способу його екстракцП та очистки. Го-ловними компонентам:! вид!лених препарат!в б пол1сахариди: манани, глюкани, глюкогалактани, ксилоглюкогалактани. Молекулярна маса глга-кан!в становить 10-16 кДа, манан1в Candida - 14-48 кДа, манану Rh. rubra та його фракц!й - 114-138 кДа. Манани, очищен! через утворэн-ня м1дного комплексу, мали у своему склад! незначну к1льк!сть (0,5-0,6Х) С!лк!в, що умсшшвлнэ в!днеоти Ix до протеогл!кан!в. На осн-OBi манан1в С. maltosa та Rh. rubra були .одержан! сульфатован! по-х!дн! з pisHHM ступеней зам1щення ОН-груп.
Досл!джено структурн! особливост! манан!в С.tropicalis, С.maltosa та фракц!й екстрацелвлярного манану Rh, rubra. Показано, щр манани др!ждж!в Candida, под1бно до мананхв Saccharomyces (Ballou et al., 1978), - високорозгалужен! структури, в яких иачоп!ранозн! рештки зв'язан! м1ж собой «-(1,2)-а(1,3)-о((1,6)-гл1коэидними зв'яэ-ками; у манану Rh. rubra мзноп1^анозн! залишки зв'язан! 0(1,3)- та В(1,4)-гл1козидними зв'язками, що чергуються м1ж собою, в лШйний ланцюг (Елинов, Витовская, 1970). У фракций остаинього, р1зних за в'язк!стю водних розчшйв, гл1козидн1 зв'язки були анадоПчними.
Cir.pyKmypxi особливостi i аншЫрусиа актви!сть по:11сахарид!в. Вивчення р!зних гомо- i гетеропол!сахарид!в з др!ждд1в показало, що найб!льш активкими iHriöiTopaMH !нфекц1йност1 ВТМ та ХВК е розгалу-жен! а-манани (РМ) з кл1гин Candida i Saccharomyces, менш активни-ми - лШйн! 0-манани (ЛМ) i3 Rh. rubra i манансульфати (MC), одер-
xaHi на ochobI PM та JIM. Ц1 дан! вказуютъ на важливу роль елемент!в отруктури пол1сахарид!в, зокрема пол1мерносг! та типу гл!коэидних зв'язк!в, а також в!льних ОН-груп, эдатних зам!щатися сульфатними трупами при сульфатуванн! пол!мер!в.
Щоб б!льи детально досл!дити значения пол!мерност! ! окремих гл!козидних зв'яэк!в в антив!русн!й активност! РМ, шляхом частко-вого кислотного пдрол1зу з ¿нтактного ! окисленого перйодатом ма-нан!в Candida буш одержан! фрагменти р!зно! пол!мерност1 та отруктури 1 досл!джена !х активн!сть щодо локально! !нфекц!1 ВТМ. Досл!-ди показали, тр антив!русну активн!сть мамть ол1госахаридн! фрагменти, як! м!стять у своему склад! не метле 6-10 маноп!ранозних за-лишк!в. Окисления РМ перйодатом призводило до порушення а(1,2)- та а(1,6)-гл1козидних зв*язк!в i повно! втрати антивирусно! активност! пол!сахариду. У частково окислених пох1д1"тх РМ втрата антив!русно! активност! корелювала з! зменшенням у спектрах 13С-ЯМР !нтенсивноо-т! ' сигнал1в (область С-1), характерних для «(1,2)-зв'язаних мано-з иль них залишк!в у бокових ланиргах пол!меру (рис,-
Рис.8. Антив!русна активн!сть (a) i 13С-ЯМР-спектральн! характеристики (б, область С-1) !тактного манану С. maltosa та про-дукт!в чаоткового г!дрол1зу його перйсдат-окислених пох!дних. По ос! х - концентравдя NáJ04 (моль/моль); по oci у - протн1-чення 1нфекц!йност1 ВТМ на листках дурмзну (X); по ос! z -концентращя манану (мкг/мл). Праворуч наведено д1лянки С-1 спектр!в 13С-ЯМР iнтактного i окисленого манан!в та концентра-ц1ю NaJ04 (моль/моль полЮахариду).
Таким чином, для прояву антив1рудно! активност! у РМ вахливою в не липе певна ступ!нь пол!мерност!, але й ц1л!сн1сть маноп!раноз-
них вашшиДв, зв'язаних míja собою й(1,2)-глхкозиднимк зв'язками у боковкх лазщзгач полимеру, ¡цо маять BizbHi ОН-групи при С-3, С-4 та С-6 'вуглецевогс скелету маноп1ранози.
Me хая iam аакисно! дИ махангв. За допомогою гельхроматогра-фП га розведення неЛнфегацйних cyí.íimeü Bipyc + полЮахарид, а та-кож ультрацентрифугування сумшей м!чених 14С-манан1в (Ж1, FM) з BipycoM у град1бнт1 густини сахарози показано, що нейтральн1 полЛ-сахариди не здатн1 1нактивувати в!русних часток чи утворювати з ними не1нфекц1йн1 комплекс» in vitro. 0ск1льки активiрусна ак!ивн1сть нейтральних полхсахарщцв значною Miposo залежала в1д виду тест-сис-теми, нами було зроблено прилущення, що вони зменшують аптшш1сть EipyciB in vivo завдяки взаемодП з компонентами рослини-..азяша.
Способи ззхисно1 манан!в у рослин: запежить в!д íx структурных особливостей, зокрема наявност! електричного заряду, i мають р!эноб1чний характер (рис. 9).
Риа.' 9. Мажлив! споооби антив1русно'1 д11 пол!оа-харвд!в у рослинах.
Нейтраль ni манат: у надчутливих рослин здатн1 акишувати ста-дп ЛВ1, як! не потребують синтезу речовин de novo. Аргументами на кориоть такого твердження можуть бути наступи! дан!:1) ефективн!сть ыанан!в з_начно вища у тканинах надчутливих, Шж чутлших до Bipycy росл!Ш i в 1зольованих протопластах; 2) антив1русна активн1сть ма-нан!в у надчутливих рослин не зменшувться в присутност! АМД. У ви-соких концентрад!ях нейтральн! манани можуть впливати на paHHi ета-пи репрсдукцП BipycHHx РНК як у чутливих, так i у надчутливих роо-линах, а також протопластах. Вони здатн! Лнгхбувати траксляц1ю кл1-THHHoí i BipycHo'i (ХВК) РНК у Сезкл1тинних системах in vitro. Однак депротеШэац1я Bipycy in vivo др1жджовими полисахаридами, очевидно, не порушувться, . оскЛльки вони однаково активно пригн!чують 1нфек-ц1йн!сть як ВТМ, так i РНК ВТМ у рослинах дурману.
Ыанахсульфат (НС). 0стаян1й механ1зм, очевидно, властивий i для анЮнних пох1дних манан!в - манансульфатЛв (МС), тому що в дос-л1дах'було в!дм1чено пригнхчення репродукцП ВТМ у тканинах чутли-
вого до нъого сорту тютюну.. Але, на в!дм!ну в!д нейтраль них мана-н!в, МС здатн! також Хндукувати у НЧ-рослкк в1русост!йк1сть, чутли-эу до дП АЭД та екстреызлъикх (32° С) температур i ефективну в об-роблени!й нши ткангай та 1зольоЕаних протопластах.
Механ1гм МС-1ндуковано1 CTiiiKooTi складнкй i базусться, очевидно, на двох протилежних процесах. 3 одного боку, п!д вплнвом МС • у рослин1 виявленг значн! порушэння у формуваин! цитсплаэматичних полном i рибосом (130 S, во S, SO S) i змекшання зм1сту цитоплазма-тичних бхлкхВ. Ц1 эм1шт корелюоть з поручениям ультраструктури цн-топлазми (вакуол!защя плазми, везжу'яхия ендоплазмзтичного рети-кулуму), мотохондрш та хлоропласт1з (набухання мембранного матрик-су ¡йтохондрхй, деструкц1я ламел 1 гран хлорспластхв). 3 imcoro боку, в оброблених МС тканинах спостер1гались активац1я бхлкового синнтезу, особливо в ядер:-пй фракцП, а також хндукц1я синтезу РК-б1лк1з та антив1руских речовин типу IBP, як! пригнхчували репро-дукц1ю Bipycy як у лкстових тканинах, так i у вид1лэнпх i3 них протопластах. Цх змхни корелкють з з1дносною стаОхдыпстю ультраструктури ядерного апарату, частковою чи повнсе стойкости оброблених тканин до ВТМ.
Перспектив и практичного зикорислз! тя. Серед досл!джених речовин-хндукторхз 1 модуляторов BipyCOCTiHKOCTX, 3 огляду на ix б!оло-гхчнх 1 $i3inio-ximi4hi влэстиеостх, а такая егалогхчн1 та екошЛч-Hi аспекта захисту рослин, найб1льи детально у практичному вхдно-сеннх нал! досл!джен1 др1жджов! пол!сахариди, зокрема розгалужегп а-манани (R,!) та ix сульфатованх noxiflHi. Попуки илях!з практичного використання FM базувались на одержачих нами данкх по гшвченню мехахЛзмхз ix д!х, погликання, транспорту i перспстекцП в рослин-них тканинах. Досл1дження проводили головнкм чином у Таких напрям-ках: а) попуки дешево"! i придатно! для виготовлення npenapaTiB си-ровнни; б) розробка cnoco6iB i техкслогхй промксловсго одержання препаратов; в) вкзченкя спектра С1олог!чно'1 активностх Ш i иомли-зостей коу.бхнуЕання ix з iKEiiMii препаратами; г) розробка способХв застосування простих i комбоноваких npenapaTiB у практиц! рссдин-ництва та тваринкицтва.
В результат! проведених досл!джень булр встансзлецо, що б1льи доцолъно для одержання антизорусни npenapaTiB використсвувати кор-;.iC3i др1мд;и роду Candida, вирогдеи на выходах рослинництва або пзраф!нач нафти. Розроблен1 нами лабор.аторн! способи одержання препарат!" були вдосконален1 стосовно виробничих умов (А.с. 1659053,
Пат. UA 7462), роэроблена практично безвыходна технолоПя одержан-ня !х на основ! технологи виробнидтва кормових др1ждж!в.
Досл1дження способ1в застосування препарат!в показали, цо РМ, кр1м ф1топатогенних BipyciB (ВТМ, ВБТ, Х-, У-, S-BipycH картопл1, Bipyc крапчатост1 гвоздики), можуть значно пригн!чувати в!руси гри-пу та венесуельського енцефал!ту коней, а також збудника кутасто! пля!.истост1 oripKiB - Pseudornonas syringae pv. lachriirans. Антив1ру-сна ак~ивн1сть РМ у рослинах тютюну 1 в культур! тканин картопл! (А.с. К 16823388) значно п!дсилювалаоь за наявност! ДГТ, д!ацетил -ДГТ, ц1аногуан!дину та оульфобета!ну, здатних !тчбувати р1зн! стад!! репродукцП з1русу (Schuster, 1982) або 1ндукувати неспецифгчну ст1йкЮть рослин до BlpycHO'i 1нфекцП (Schuster,1989). Проф!лактич-на i терапевтична д!я мананвмЮного препарату з др!жджового екс-тракту ¡цодо ВБТ була вадрю також у прксутност! диметилсульфоксиду i фракцП р1дких п-алкан1в, як1 caMi по co6i не мали виражено! анти-BipycHO'i активности На основ! виявленого нами синерПзму РМ 1 ДГТ був створении ефективний проти BipyciB р!зних таксоном!чних труп (ВТМ, ВБТ, ХВК та У-Bipycy картоплi) комб!нований засЮ, захищений
патентами (Pat. DD 299149; Пат. RU 2036583; Пат. UA 6525).
* * ■*
Шдсумовуючи наведен! в цьому розд!л1 експериментальн! дан1, сл1д в!дзначити, пр серед дослдаених !ндуктор!в 1нтерферону най-б!льш активними в надчутлизих роолинах б дволанцогова нукле!нова кислота Bipycy P. funiculosum, дволанцюговий пол!нуклеотидний комплекс пол!(Г) пол!(Ц), а також манансульфати, одержан! шляхом суль-фатування л1н!йного i розгалуженого др1жджоеих манан!в. 1кдукуюча активн!сгь dsPHK MiKOBipycy, виявлена нами i Шдтверджена на iHmo-му об'вкт! С.Х. George et al.(19Bl), в свечениям того, що в !ндук-Ui1 неспециф!чно! ст!йкост1 у рослин важлива роль належить продуктам в!русного генома, можливо, репл1кативн1й форм! РНК. 3 nien думкою узгоджуються каш! дан!.та дан! iramx авторов про !ндукушчу активиста дволанцюгових пол1рибонуклеотидних комплекс1в. Однак речо-вини типу РНК - не един1 !ндуктори BipycocTimocTi рослин. Це пока-зують Kami дан! про !ндукуючу активность пол1карбоксилат!в i псш!-с ах ар ид i в, як1 можуть розглядатись як модельн! молекули ендогенних !ндуктор1в под1бно'1 природи. Активн!сть 1 механхзми д!! пол1саха-рид!в значною м!рою залежать в!д !х xiMi4H0i структури, концентра-ц11 а також наявностх природного мехатзму резистентност! в експе-риментальн!й систем!.
- 31 -
5. Б1ЛК0В0-ВУГЛЕВ0ДНА ВЗАЕМ0Д1Я
I CTIßKICTb РОСЛЙН ДО В1РУС1В %
Манансульфзти за механ1змом захисно! дП под!бн1 до 1нших по-л!ан1он!в - !ндуктор1в резистентност1 рослин до BipycHo'i 1ифекц1 "i, чого не моина сказахи про нейтральHi пол!сахариди. С.ск1льки др!жд-*оз! манан:! 2 нигьхкс ¡'.спцгптрац!;:;: булл офс-ктishisäil п;одй Bipyaia у надчутливих i неефективними в чутливих рослинах, нами було зроблено припудення про 1снування у НЧ-рослин отад1й вiрус-1нду.ковано! Л31, як! можуть п1дсилзоватись екзогенними гл!копол1мерами а рахунок спе-циф1чно! б1лок-Еуглеводно! взаемод1! (Kovalenko, 1986, 1992). Для перев!рки ц!е! г1потези були проведен! досл1дження, ochobhI результата яких наведено в даному роэдШ.
5.1. "окттгаз'язукча та анткв1русна активность еязогонния гл1копшйиер1в (ГЯ)
Як модельн! ГП в робот! використовували препарата розгалужено-го ot-манану (FM) 1з кл!тин С. tropicalis та позакл!тинний л1н1йний ß-1/.анан (JIM) Rh. rubra, а також манансульфат (MC), одержаний на основ! ЛМ. Досл1дження показали, щр активн!сть пол1сачарид!в щрдо !н-феюцйност! ВТМ на дурманi корелюе 3i здатн1стю !х хнгхбувати гем-аглютинукзчу активнЮть манозоспециф1чного конкакавалшу А (Кон А), але не галактозоспецифхчного ф!тогемаглютин!ну (ФГА, табл. 4).
Таблица 4
Антив1русна i лек?ин!нг!буюча активн1сть др1жджових манан1в
|Манан Лектин Активнгсгь — i АКТИВН1СТЬ |
актив1- лектин!н- Манан Лектин антив1- лектин1н-|
русна*) г1буюча*) русна*) Пбуюча*) I
1 та Кон А 0,1-1 0,1-0,3 РМ ФГА 0,6-1 - |
| ЛМ Кон А 50-100 25-50 ФГА 50-100 - |
| MC Кон А 1000 1000 MC ©ГА 1000 - | 1
Прим1тка: *■) гранично мала концентрац!я манану (мкг/мл), за яко! гпостер1галооь пригн!чення хнфекцшност! ВТМ (на 501 i виде) i ре-акц1! гемаглютинацП (РТА). "-" - в1дсутн1сть гальыування РГА.
Додаванкя Кон А до сум!п! РМ аСо ЛМ з ВТМ приэЕодило до част-koboi (ЛМ) або поено! (РМ) хнактивац!I манан!в (рис.10). Аналог!чну днз.на активн1сть маяан!в чинили ct-метил-О-манопхранозвд (ММ) та а-метил-0-глю1юп1ранозид (ГМ) (рио.11)але не D- i L-маноза, D-ма-н!тод, р-н1трофен1л-в-0-галактоп1ракозид i ОГА.
|85 §60
2
«о о
«о
№
I
[II
ЛМКРГЛ
Т .
eeQ
ФГЛ [il
i« a-
«■ to
оююо о/оюо юл Нэнченафаийя /юктинд, мке/ил
ЯЙ|
КОнцмтрацй» шленд, шг/нл
Рис.10. Д1я конкакавапну А (Кон А) та ф!тог1-к'аглютин1ну (ФГА) на антив!русну активн!сть розгалуженого (Pvt) (1мг/мл) 1 лШйного (ЛМ) ;25м;:г/мл) манан1в в систем! ВТ..1 - дурман. Рис. 11. Д1я. 0,1 М а-метил-0-маноп!ракозиду (ММ) ! 0,01 М а-метил-0-глюкоп!ранозиду (Ml') на ангив1руону акт:тан!сть розгалуженого' (РМ) i л1н1йного (ЛМ) манан1в в лист! дурману. . Tema колонка - !нфекц! йн!сть ВТМ за наявност! РМ аОо ЛМ; б!ла колонка - за наявност! РМ i ЛМ в сумш! ММ або МГ.
Факт, щр незам!1ден! моносахариди не впливачзть на антив!русну активн!сть макан!в, а а-метшилЛкозиди значно пригн1чують 11, мож-ливо, псв'заний з тим, щр останн! в сильнздими !нг!б1торами лектшИв, н!ж незам!цен1 мсносахариди (Хомутовский и др., 1976), 1 тому спро-можними конкурувати з макаками за 1х кл!тинн! рецедтори. На специ-ф!чн!сть взавмоди манан!в а рецепторами вкаэують ! дан! про 1нерт-нгсть ФГА та йоге гапгену по вхдношеннв до манангв, а також вища активность Кон А та ММ щодо «-(РМ)-, ни щодо р-(ЛМ)-манану.
Таким чином, кореляц!я м1ж антив!русною ! лектинзв'язуючою актганостями др!жджозих манан!в, з одного боку, 1 повне або частко-
-заве бгжування 'ix SHTHBipycHoi активное^ п!д fliera в1дпов1дного лек-тину та його гаптену - э 1неого дозволягать зробитн припущення, вр взаемод1я маная!в ai специф!чним(и) рецепторсм(ами) лектиново! при-роди лежить в ochobí 'ix антив!русно! дП. 0ск1льки антиварусна д!я ManaHiB у малих концентрац!ях виявляеться в тканнгах надчутливих, але не чутливих до BipyciB рослин, молена вважати, в;о у НЧ-реакцш втручагаться шйтинн! ГП, nofli6Hi до др!жджових манан!в чн продукта ix часткоЕо! деградаци (Kovalenko, Kluge, 19SS), виконуючи функцп iiiflyKTopiB (модулятор1в) захисних реакц1й.
5.2. ñin а-метилгл1козид1в на J5BI та IBC
Для експериментально! nepeBiprai вксунутого припущення нами були випробуван1 деяк1 моносахариди як можлив1 конкуренти ендогенних ГП-1ндуктор1в i, отже, супресори Зехисних механ!зм1в НЧ-рослин.
В nepaiñ cepi'i дасл!д!в колби заповнывали 0,05 М розчинами Ш, D-, L -манози або 0-ман!толу, а вхдтак ставили в них шокульован! ВТМ молод i рослини дурману; контрольн1 роолини ставили у воду. Шд-рахунок к!лькост1 та вим!рювання posMipy ВТЪЫндукованих некроз1в показали, що ММ спричиняв зб1льшення к1лькост1 (в 4 рази) i роз-Mipy (в 2,5 раза) некроз!в, L-маноза дещо зменшувала к1льк1сть нек-po3iB, а D-маноза, 0-ман1тол не впливали на щ параметри.
Аналог!чна д!я 0,1 М розчшав ММ була в!дм1чена нами у тютн-HÍ 1ыунний'580: блокування локально! i системно! IBC (табл. 5).
Таким' чином, аамщен! вуглеводи, зокрема Ш та МГ як низькомо-лекулярн! гаптен.ч манозоспециф1чних лекттив, можуть блокувати ЛВ1 та IBC у надчутливих роолинах. Це п!дтверджуе висловлене вами при-пущення про !снування в íh$íkob3hhx Bipycou НЧ-рослинах в1дпов!дних ГП-1ндуктор1в, !х лектинових рецептор!в, hkí BiflirpaioTb певну роль у peaaisaui'i механ!зм1в в1русоот!йкост! цих рослин. 3 !ншого 6ow, одержан! дан1 умодливлюють також припущення про !снування в!дпов1д-них ranTeHiB-cynpecopiB BipycocTiñKOOTi. Зважаючи на вищенаведен1 результат, ,ц!каво було досл1дити залежн!сть м1ж ефективн1стю захисних механ!зм1в i лектиновою активн1стю у р!зних рослин.
J.3. Лекхинопа акташйсть та JIBI у рослин
Залежн1сть м!ж наявн1отю та ефективн1стю мехаизму ЛВ1 i гем-аглютинуючою активн1стю 6í.ikíb вивчали у рослинах тютюну (Самсун,
- 34 -
Таблица 5
Вплив a-метил-О-манотранозиду на локальну i сиотемну 1ндуковану
ст1Йк!сть до ВТМ у тютюн1 Тмунний 5SC i i | Обробка рослин KiffLKicTb Розм1р |
¡ П1сля 1нокуляцП*) кекроз1Е некроз1в |
¡ штук X мм % |
I-1
| Контрольний вар!ант | | Через 6 год nicjra псевдо1нскуляцП | |листя íh'вковано 0,1М розчином ММ 130*22 125 2.4*0,15 104| IТе ж, iH'EKOBaHO водою 104*18 100 2.3*0,09 100| | Локальна сИйкЮть; | | Через 6 год п1сля 1нокуляцП ВТМ | |листя iH'EKOBaHO 0,1М розчином ММ 52*8 98 2.5*0,18 227| |Те ж, iH'EKOBaHO водою 53*6 100 1.1*0,07 100| | Системна ст1йк1сть | |Через 6 год хйсля 1нокуляцП ВТМ | |листя íh'бковано 0,1М розчином ММ 249±45 229 2.4±0,1 1601 I Те ж, 1н'ековано водою 105*18 100 1.5±0,1 1001 i_i
ПршЛтка: *)тест-1нокуляц!я рослин проведена через 7 д1б niara íh-дукуючо'1 йгокуляцП; локальну CTiÜKicTb враховували в мiжн6кpoзниx зонах первинно 1нокудьованих полоеинок листов; сиотемну - на половинках листов, протилежних первинно 1нокульованим.
Самсун 27 та 1муннии 580), дурману i гомфрени, здорових та уражених ВТМ, ВОМ або ЕБТ. Установлено, що в 1нтактних рослинах розчинн! та структурнозв'язан! гемаглютшйни виявляються в реакцП з кролячими еритроцитами в ycix тканинах листа: eniflepMici, мезофШ, апопласт1 i листових жилках. üopiBHHHHH гемаглютинуючоТ активноот! б1лкових фрамдй, одержаних is здорових рослин чутливого i надчутливих щодо ВТМ сорт1в тютюну, а також дурману та гомфрени, HKi значно рхзнили-ся за ефективн!стю ЛВ1, не вжвило певно! KiiiKicHO'i кореляцП м!ж цими ознаками. Однак у процес1 лoкaлiзaдii хнфекцП ВТМ у цих рослинах cnocTepirajiocb п!двищення акгивноот! чи BMiciy гемаглютшп-HiB, екстрагованих буфером (pH 7,4 або 3,0) is листових тканин, iH-ф1кованих локально (але не системно), особливо при зб!льшенн1 BiKy 1нфекцП.
Птже, актквя1сть лектшйв у здорових рослинах не корелюв з! CTifiKicTio 1х до Bipycy. Однак при локальн1й BipycHiii 1нфекц11 у над-чутливих рослинах мае м1сце п!двшцення лектиново! активноит! розчин-них б1лк!з, ЩО М0Ж9 СВ1ДЧИТИ про В1руС1НДуКОВаяу М0б1Л13ац1Ю струк-турних лекткнхЕ i участь Ix у реагизацП механ!зм!в ЛВ1 та IBC.
5.4. Еззеыод1я лектннш а модеханимн ИМндугагорамя
Як модел1 гл1копол1мер!в-1ндуктор1в використовували др1жджов1 й(1,2)-«(1,3)-а(1.6)-зв*яззний розгалужений (И,!) та 3(1,3)-0(1,4)~ звяэанкй Л1н1йний (ЛМ) манани, 1ммоС1л1заван1 на сферон1. Попередн! випробуванкя манан!в як аф1нных сорбент!в св!дчили про ix специф1ч-HicTb. Причаму РМ зв'зувазГКок А (активнее, нгж IM), але не СТА.
За допомогою афпшо! хроматограф!i на колонках э рм-сфероном досл!джували в!льн! та ЗЕ'язан! б!лки здорових та уракених ВТМ рос-лин тютюну 1муняий 580, його сприйнятливого резертанта та дурману. Встаковлено, що серед розчинних öixKiB, вид!лених is листя дурману, iH®iK03aHoro ВТМ, наявн1 два, а серед структурнозв'язаних ~ три лектинопод!бн1 б!лки (JIHB), як! не виявляються в коктрол1. У тютю-Hi, надчутливому до ВТМ, також виявлено в!рус1ндукозан! SMiHii у фракц!йному склад! РМ-спор1днених ЛПБ, чого не можна сказати сто-совно чутливого до цього Bipycy ревертанта.
Ц1 дая1 вказушь на момлив!сть виявленяя у НЧ-рослинах, !н-ф1коЕаних вiрусом, мананспециф!чних ЛПБ, здатних до л!гандно1 взаз-
модП з модедьним ИЫндуктором - розгалуженим др!жджовим мананом.
***
На основ! анап1зу наведених вице результат1в власних досл!д-мень i деяких джерэл л1тератури, що стосуються переважно нев1русних ф!топатоген!в (Любимова, Салькова, 1988; Проценко, 1995; Albershe'n, Darvil, 1985; Albersheim et al., 1990), нами пропонуеться рецептор-1ндукторна модель ШгцацП MexaHiBMiB BipycocTiÜKOOTi у НЧ-рослин (рис. 12), яка грунтувться на б1лск-вуглеЕодн1й концепцП. Остання полягае в тому, що в регуляцП вэавмов!дкошень Bipycy з надчутливою рослинога-хазя1ном пров1дна роль налехить специф1чному б1лок-вугле-в од ному вп!знаван1ш за участю кл!тинних лектинопод!бних б!лкових рецзптор!в, гл1копол!мер!в-!ндуктор1в i гаптен1в-супресор1в.
Беручи до уваги ци концепц!ю, момиа вважати, що:
¡штшши Фецыеиг
г1н0м
1. Сприниятлнв1СТ1>
Рио. 12. Рецептор-!ндукторна .■3 —модель реал!вад11 в!русост!й-кост! у надчут.лвих рослин-ха-
{¡¡руснии ГЕНОМ
зя!н1в за участи вуглевод1в.
с
Р - лектинопод!бний б1лок-ре-цептор; В - з!рус або його компонент, И - гл!копол1мер -1ндуктор; о - гаптен-супресор НЧ-реакцП,
2. Ст1и1ит>
т ¿линувеипгл.илггиут! ГДПТВН18
ГДПТМ18
с
©
1. Вхдторгнення рослиною в!русу як чужер!дного агента в!дбува-вться не в!дразу, а п!слл утворення гл1копол!меру-1ндуктора (1в) НЧ-реакцП за схемою, зсбраженою у верхней частжй даного рисунка.
2. ГП-1ндуктор окупуе один 1э эктиених центр!в лектинового рецептора (друге положения схеми). В результат! алостеричного ефекту остатЛй виявлябться нездатним до взаемодП з в1русом чи продуктом в1русного генома (негативна модель) або ж акгивуегься синтез аяти-В1русного чинника (позитивна модель).
3. Поряд з ГП-!ндуктором в 1нф1кован1й в1русом рослин! можуть утворюватись гаптени В1ДП0В1ДН01 специф1чност1, як1 виконують роль супресор1в НЧ-реакцП (1-ше положения схеми). Гаптени-супресорн насичують вуглевод-специф1чний сайг рецептора! залишають його про-сторову структуру без зм!н.
Трете положения г!потетично"! схеми !люструе результати експе-риментального моделювання конкуренцП екзогенних ГЛ-!ндуктор1в та супресор1в за рецептори НЧ-реакцП.
П!дсумовуючи вищенаведен! результати, сл!д наголосити, що активация ! функц!онування в!русост!йкост! у НЧ-рослин - це складне, багатоступеневе явище, в основ! якого знаходяться рхзн! р1вн! втэ-наваиня ! взавмод!! функц!ональних молекул: генний, фермент - суб-стратний та специф1чний б!лок-вуглеводний. Наявн!сть згаданих ета-п!в шдтверджуеться моделаванням процес1в за допомогою в!дпов1дних 1ндуктор!в та !нг!б!тор1в, виявленням антив!русних та патогенезасо-цшованих б!лк!в.
- 37 -ЕШЮ2КЯ
1. Вперие встановлено принципов! BiflMiHHOCTi мехен1ам1в екс-тремалыга! ст!йкосг1 картопл! до ВТМ та ХВК. Ст1йк1сть до ВТМ, по-дЮно до надчуглквост!, реал1зуеться на тканинному, а стлШсть до ХВК - 1 на юл тинному piEHi. Зггдно з пропонованою ппотезога, ст1Й-к!сть рослин до ХВК обумовлена мутац1ею в кл!тинному тп.який кон-тролюе синтез чинника, необхЛдного для Шщац!! BipycHoi !нфекцП.
2. Показано протилежний характер взаемоди ХВК i ВТМ у росли-нах картопл! залежно в1д CTiiiKooTi '¡х ¡цодо ХВК: антагон!зм у - екс-тремалъко ст!йких, синерг!зм - у сприйнятливих форм.
3. У дчутливих рослинач, уражених ВТМ, виявлено два BipyciH-дукован: захисн1 механ!зми: перший ефективний на piBHi тканин, дру-гий - ка piBHi окремо! клхтини. Кл!тинний механ1зм функщонуе за учаотю двох тгапв антивЛрусних бхлкових чинник!в, один is яких (не-чутлизий до д1л актиномЩину Д i rinoKci'i) перешкоджав 1нф1куван1по кл!тия, 1нший (чутлиЕий до д!1 актиномЩину Д i rinOKCli) - npurHi-чуе репродукщю sipycy.
4. У представнитав роду cotiana встановлено значну Bapia-белънЛсть реакций на пюкулящю ВБТ; серед диких видЛв виявлен! до-нори стйжост! до цього sipycy. Встановлено, що при системн!й нек-ротичн1й ВБТ-!нфекцп в тютюн! активуюгься захисн1 мехшизми, по-дЛбнх до таких надчутливих рослин, хоча i менше виражен1. Вони проявляют! ся у самосздоровленн! рослин i калусних тканин, культквоза-них 1л vitro, ультраструктурнш перебудов! ЛнфЛкованих шптин, а також в ЛндукцИ неспециф1чно1 BipycocriimocTi i синтезу антив1рус-них i патогенезасоц1йованих б1лк1в.
Б. Виявлено нов! активн1 неспецифЛчн! 1ндуктори в1русост1йкоо-Ti, зокрема Bipyc P. funiculosum i його dsPHK, пол!рибонуклеотидний комплекс пол1(Г) чгалКЦ), полЛкарбоксилати на основ! пол1в1н1л£!1-рол1дону i манансульфати на основ! л!н!йного та розгалуженого др1ж-джових манан!в. Установлено, що зктиен!сть i характер дп пол1саха-рщдв аалежать в1д "ix х!м1чно1 структур« та концентрат!, а також наявност1 в систем! природного механ!зму резиотентност1.
6. Показано, що у надчутливих рослинах у процес1 локалЛвацП BipycHO'i iK$e щП i розвитку !кдуковано! в!русост!йкаст1 в!дбува-этгся мобШзащя лектшйв ! лектинопод1бши б!лк1в; екзогенн1 гл1-кополхмери здатн! актиаувати, а замщен! гл1комономери - анПбуаати Д1» захиских MexaHiBMiB цих рослин.
7. Основано бд.лак-вуглеводну концепцШ у BipycHiii патологи рослин i розроблено рецептор-1ндукторну модель, зПдно з якими ре-гулящя взаемов1дношень BipyciB та надчутлтих рослгч здакснюеться за участю кд1тинних глхкополгмерав-пздукторхв, в1дпов1дних гапте-HiB-cynpecopiB та 'ix лектинових penenTopiB.
8. Розроблено методики приготування 1нокулктв та 1нокуляцП 1эольованих протопласт!в картоши ХВК i ВТМ; спрособк i безвхдходну технологш одержання антив!русних npenapaTiB is др1ждж1в; способи оздоровления картошп в1д BipyciB i в1дбору ix BipycocTiüraix форм; комб1нований антив1русний aaci6 широкого спектра дП. Видано реко-мендаци для селекщонер1в стосовно выбору форм картошп, CTiiiraix до BipycHiix хвороб. Одержано г1бриди, клони i сорт тютюну, CTiKKi до Bipycy 6p0H30B00Ti TOMaTiB.
OciJOBHi роботи за темою дисертацг i
1. Коваленко О.Г. Досл1дження BipyciB i м1коплазы рослин у НДР // MiKp06i0J. журн.- 1974.- 35. N 5.- С. 668-674.
2. Коваленко А.Г. Природные механизмы ограничения вирусных инфекций у растений и пути их практического использования // Игоги науки и техники. Серия "Защита растений"- Том 3.- 1983.- С. 91-167.
3. Kovalenko A.G. Antivirale Eigenschaften mikrobieler Polysaccharide - ein Überblick // Zbl. Mikrobiol.- 1987,- 142, N 3.- S. 301-310.
4. Коваленко А.Г. Белок-углеводное взаимодействие в реализации устойчивости растений к вирусам // Мшробюл. журн.- 1993.- 55, N 6- С. 74-91.
5. Коваленко А.Г. Генетический контроль и экспрессия "интерфероно-подобной" защитной функции у растений // Цитология и генетика. -1996.- 30, N 3.- С. 58-71.
6. Коваленко А.Г., Бобырь А.Д., Щербатенко И.С. Вирус табачной мозаики в селекции картофеля на устойчивость к вирусным болезням.
Рекомендации // Киев: МСХ УССР.- 1984.- 23 с.
***
7. Коваленко О.Г. Вгдьтення, очистка та деяк1 властивост1 антив!-русних речовин э jр1хда!в // Мжроб1ол. журн.- 1971.- 33, N 1. - С. 75-81.
8. Коваленко О.Г. AnraBipycHi властивост! пол!сахаридних npenapaTiB та РНК з др1ждав // М1кроб1ол. журн.- 1972.- 34, N 1.- С.
9. 1 Коваленко А.Г. Инокулятор растений ИР-1 // Защита сельскохозяйс-
твенных растений от болезней и вредителей.- 1978.- N В.- С. 38.
10. Коваленко А.Г. Исследование антивирусных веществ, продуцируемых дрожжами Candida tropicalis К-41. 1. Выделение, очистка и антивирусная активность препаратов // Микробиол. журн.- 1978.- 40, N 1.- С. 85-91.
А А Т/•-...-Л * Г« i4-.« „А, . . J J
xi. i\.u i СИ. c;i Ui ua^ci ibiuiiuai ihuuuij a ux ^ttouy иицих i и и p iuiiu
resistance to viruses // Plant Virology. Proc. 9th Conf. Czechoslovak Plant Virologists.- Brno.- 1981.- P. 81-81.
12. Коваленко А.Г. Кнгкбирование системной индуцированной устойчивости растений к вирусам при погружении первично инокулированных листьев в воду // Мккробиод. журн.- 1988.- 50, N 4.- С. 62-67.
13. Kovalenko A.G. Yeast тачпалз: lectin-inhibitory and antiphytovi-ral activities // Lectins: Biology, Biochemistry and Clinical Biochemistry / Eds. T.C. Eag-Hansen etc. - Copenhagen.- 1992.-Vol.8.- 18 p.
14. Коваленко О.Г., Еаркалова A.O. Одер.жання б1олог1чно активних ма-HaHBMiCHiix препаратов з др!ждаив // Мхкроб^л. журн,- 1935,- 57, Н 3.- С.41-47.
15. Коваленко А.Г., Еаркалова А.А., Еобырь А.Д., Воцелко С.К. Характер" действия .маннана Candida tropicalis К-41 на инфекционность вируса табачной мозаики // Микробиол. журн.- 1981.- 43, N 5.- С. 627-632.
16. Коватенко А.Г., Еаркалова А.А., Бобырь А.Д. Влияние дрожжевых - полисахаридов на поражаемость томатов вирусом табачной мозаики
// Микробиол. журн.- 1984.- 46, N 4.- С. 58-62.
17. Коваленко A.F., Еаркалова А.А., Бобырь А.Д. Влияние актиномицина Д на антивирусную активность препаратов дрожжевого маннана в сверхчувствительных к ВТМ растениях // Микробиол. журн.- 198г,-48, N 4.- С. 58-62.
18. Коваленко О.Г., Еаркалова А.О., Колошин В.Г. та iH. Досл1джен-ня Ki'i дрьжджових полхсахарщив pi3HO'i будови на Bipyc твтюново! мозахки // MiкрабiСЛ. журн." 1974.- 36, N 4.- С. 490-497.
19. Коваленко А.Г., Баркалогз А.А., Михеева И.И. Сравнительное исследование действия полисахаридов Candida tropicalis К-41 на инфекционность вируса табачной мозаики и его РНК // Микробиол. журн.- 1981.- 43, N 5.- С. 633-639.
20. КоЕаленко О.Г., Бобир А.Д. Реактиващя Bipycy тютюново! моэа'ши
та X-Bipycy картам!, !нактивоваиих речовинами з др!ждж!в // Mi-кроС1ол. журн.- 1973.- 35, N 4.- С. 451-467.
21. Коваленко А.Г., Бобырь А.Д. О химической природе и характере антивирусного действия веществ из дрожжей // Вирусы и вирусные болезни растений.- Киев: Наук, думка.- 1974,- С. 71-74.
22. Коваленко А.Г., Бобырь А.Д. Мкковирусы кач индукторы неспецифической противовирусной устойчивости у растений // Бактериофаги. - П'-щино: АН СССР.- 1982.- С. 167-172.
23. Коваленко О.Г., Бобир А.Д., Воцеяко С.К., Дячок В.В. Антив!руон! речовини з др1ждж1в Saccharomyces cerevisiae i Sacch. carls-bergensis // Мжроб!ол. журн.- 1974.- 36, H 2.- С. 191-194.
24. Kovalenko A.G., BGbyr A.D., Votzelko S.K. et al. Untersuchungen (Iber gegen Pflanzenviren wirksame Heniivstaffe aus Hefepilzen // Phytophath. Z.- 1977,- 88, N 2.- S. 322-340.
25. Kovalenko A.G., BobyrA.D., KlugeS., Barkaiava A.A. Über den antiviralen Wirkungsmechanismus von Hefemannan als einem Vertreter mikrobieler Polysaccharide // Wiss. Z. Karl-Marx-Univ. Leipzig. Math.- Naturwiss. R. - 1982.- 31, N 4.- S. 360-371.
26. Коваленко А.Г., Васильев .Н. Получение фрагментов маннача Candida tropicalis К-41 и действие их на инфекционность вируса табачной мозаики // Микробиол. журн,- 1981.- 43,- N 4.- С.462-467.
27. Коваленко А.Г., Васильев В.Н., Воцелко С.К. Исследование антивирусных веществ, продуцируемых дрожжами Cardida tropicalis К-41. 2. Физико-химическая характеристика препаратов // Микробиол. журн.- 1978.- 40, N 6,- С. 767-772.
28. Коваленко А.Г., Васильев В.Н., Воцелко O.K. Антивирусная активность и фиэико-химичесьэя характеристика препаратов, выделенных из дрожжевого экстракта // Микробиол. журн.- 1979.- 41, N 1.- С. 75-81.
29. Коваленко А.Г., Васильев В.Н., Гриммеке X.-Д. Антивирусная активность продуктов ацетолиза и перйодатного окисления дрожжевого мзннана // Микробиол. журн.- 1984.- 46, Н 4.- С. 67-69.
30. Коваленко А.Г., Воцелко С.К. Молекулярный зес и некоторые особенности отроения дрожжевых полисахаридов, обладающих антивирусными свойствами // Прикл. биохимия и микробиология,- 1977. - 13, N 1.- С. 46-54.
31. Коваленко А.Г., Грабина Т.Д., Бобырь А.Д. и др. Маннаноулъфаты -индукторы устойчивости растений к вирусной инфекции'// Вопр. вирусологии.- 1988,- Н 6.- С, 732-737.
32. Коваленко А.Г., Грабина Т.Д., Коваленко Э.А., Пилипенко В.Г. Индукция устойчивости к вирусу табачной мозаики и изменения в составе растворимых белков у табака // Микробшл. журн.- 1987.- 49, N 3.- С. 80-86.
33. Kovalenko A.G., Grabina T.D., Kolesnik L.V. et ".1. Virus resistance induced with mannan sulphates in hypersensitive host plants // J. Phytopathology.- 19S3.- 137, N 2.- P. 133-197.
34. Коваленко А.Г., Емурко Л.И., трухманоза л.в. и др. Влияние некоторых синтетических полимеров на инфекцию, вызванную вирусом табачной мозаики у сверхчувствительных растений // Tag.-Ber. Akad. Landwirtsch. Wiss. DDR.- Berlin.- 1983.- 216.- S. 59-68.
35. Коеэлс-г!>:о А.Г., Клаге 3. Поглощение, транспорт и сохранность дрожжеЕЫх маннанов различного строения в растениях // Микроби-ол. курн.- 1985.- 47, N 6.- С. 86-71.
36. Kovalenko A.G. and Kluge S. Uptake,transport and persistance of [14C]-yeast mannans in plants // Biochem. Physiol. Pflanzen. -1908,- 183.- P. 283-290.
37. Kovalenko A.G. and Kovalenko E.A. Antiphytoviral action of yeast шаппзпз and hemag-glutinine activity in plants // Lectins: Biology. Biochemistry and Clinical Biochemistry / Eds: Т.е. Bog-Han-sen etc.- Copenhagen.- 1992.- Vol.8.- 12 p.
38. Коваленко А.Г., Коваленко Э.А., Грабина Т.Д. Лектинсвязываюидя и антивирусная активность дрожжевых маннанов в сверхчувствительных растениях // Микробкол. журн.- 1991.- 53, N 2.- С. 83-89.
39. Коваленко А.Г., Коваленко Э.А., Телегеева Т.А. Локализация вирусной инфекции и гемагглютинирующая активность у растений // Микробиол. журн.- 1991.- 53, N 2.- С. 69-76.
40. Коваленко А.Г., Колесник Л.В., Олещенко Л.Т. Изменения в ультраструктуре клеток мезофилла табака, индуцированные некоторыми полианионами // Цитология и генетика.- 1993.- 27, N 2.- С. 6-12.
41. Коваленко О.Г., Коробко О.П., Корбелайнен Е.С. та iH. Вплив ма-нану Candida maltosa та його сульфатованих пох1дних на сприйнят-лив!сть рослин до BipycHO'i П1фекц1'1 // Микробиол. журн.- 1992.54, N 6.- С. 63-59.
42. Коваленко А.Г., Лебедева Н.А., Бобырь А.Д. Антивирусные свойства экстрактjb из листьев картофеля различной устойчивости и генетического происхождения /У Фитонциды. Эксперимент, исслед., вопросы теории и практики.- Киев: Наук, думка.- 1975.- С. 218-223.
43. Коваленко А.Г., Олевинская З.М., Телегеева Т.А. и др. Антивирус-
ныэ к патогенезозависимые белки в растениях табака с локальной и системной индуцированной устойчивостью //.Микробиол. журн.-1Ö91.- 53, Н 5.- С. 58-65.
44. Коваленко А.Г., Рудь Е.А., Стреляева Н.И., и^щенко Л. Т. Реакция •сортов, диких видов и межвидовых гибридов табака на искусственное заражение вирусом бронзовости томатов // Микробиол. журн.-1987.- 49, N 1.- С. 85-89.
45. Коваленко А.Г., Рудь H.A., Стреляева Н.И. и др. Гетерогенность популяций Nicotiana a lata Link et Otto и N. sanderae Hort по устойчивости к вирусу Сронзовооти томатов // Цитология и генетика.- 1991.- 25, N 4.- С. 29-31.
46. Коваленко 0.Г., Шашков O.G., Васильев В.М., Телегьзва т.А. Структур^ особливocri та б^лог1чна активн1сть манан!в Candida sp. // В1опол1мери i кл!тина.- 1995.- 11, N 3-4.- С. 77-84.
47. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С. Динамика содержания и антивирусная активность веществ из листьев картофеля в связи с вирусо-устойчивостью // Фитонциды. Эксперимент, исслед., вопросы теории к практики,- Киев: Наук, думка.- 1975.- С. 215-218.
48. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С. Взаимоотношения вируса и растения-хозяина в присутствии рифамицина // Вопр. е..,реологии. -1977,- N 5.- С. 622-625.
49. Коваленко А.Г., Щербатенко И.О. Локализация инфекции и развитие индуцированной устойчивости к ВТМ у Nicotiana dldebtí: Ternov. и N. tabacum L. // Микробиол.журн.- 1986.- 48, N 4.- С. 51-55.
50. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С., Бобырь А.Д. Изучение вирусинак-тинирующей системы у растений картофеля, крайне устойчивых к Х-вирусу // Фитонциды. Роль в биогеоценозах, значение для медицины.- Киев: Наук, думка.- 1981.- С. 293-295.
51. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С., Бобырь А.Д. Взаимоотношения между Х-вирусом картофеля и вирусом табачной мозаики в растениях картофеля, устойчивых и Еосг.ришчивых к Х-вирусу картофеля // Микробиол. журн.- 1984,- 46, N 6.- С. 58-64.
62. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С., Коган Э.М. и др. Индукция уо-тойчивости растений к вирусу табачной мозаики двунитевым комплексом поли(Г) -поли(Ц) // Вопр. вирусологии.- 1980.- N 3 - С. 364-368.
63. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С., Лебедева H.A. Различия в устойчивости двух линий Solanum acaule Bitt к Х-вирусу картофеля и вирусу табачной мозаики // Микробиол. журн.- 1984.- 46, N 6.- С.
52-58.
54. Коваленко А.Г., Цербатенко И.С., Олещенко Л.Т. Выделение K-вируса из локальных поражений на листьях крайне устойчивого картофеля // Микробиол. журн.- 1981.- 43, N 4,- С. 511-513.
55. Коваленко А.Г., Щербатенко И.С., Олощен:ю Л.Т. Восприимчивость интактных растений и мезофильных протопластов картофеля к вирусу табачной мозаики // Микробиол. журн.- 1982.- 44, Ы б,- С. 71-75.
&б. Коваленко А.Г., Щербатенкэ И.О., Олещенко Л.Т. й природе крайней устойчивости картофеля к Х-зирусу // Tag1. Вег. Akad. Landwirtsch. WiSS. DDR.- Berlin.- 1983.- 215.- S. 85-99.
57. Коваленко А. Г., ¡Дербатенко И. С., Олещенко Л.Т. Инфицирование протопластов мезофилла картофеля гирусом табачной мозаики // Виол. науки.- 1985.- N 2.- С. 42-47.
58. Коватенко А.Г., Щербагенко И.С., Ол щекко Л. Т. и др. Получение соматических кленов межвидовых гибридов табака, обладающих фер-тильностью и высокой устойчивостью к вирусу бронзовости томатов // Цитология и генетика.- 1989.- N 4.- С. 59-62.
59. Бобырь А.Д., Коваленко А.Г. Применение природных веществ для профилактики растений от Х-зируса картофеля // С.-х. биология. -1973.- 8, N 6,- С. 851-856.
60. Бобырь А.Д., Коваленко А.Г. Вещества растительного происхождения - ингибиторы фитопатогенных вирусов // Оитснциды. Эксперимент. исслед., вопросы теории к практики.- Киев: Наук, думка. -1975.- С. 210-215.
61. Бобырь А.Д., СадоЕский Ю.П., Коваленко А.Г. Индукция локальной и системной устойчивости табака к вирусу табачной мозаики с помощью вируса и РНК знруса, поражающего Pénicillium funiculosum и Биол. науки.- 1974.- M 10.- С. 99-105.
61 Блинов Н.П., Витсзс.чая Г.А., повалеяко А.Г. и др. Изучение ман-нача Rhodotorula rubra и его фракций // Прикл. биохимия и микробиология.- 1980.- 16, N 2.- С. 249-253.
63. Кук И.П., Шачабай В.К., КоЕалекко А.Г. Пути повышения эффективности метода культуры меристем при оздоровлении картофеля от ви-руснач болезней // Защита картофеля от вирусных болезней в семеноводстве,- М: МСХ СССР.- 1977.- SO.- С. с-3-66.
64. Козар Ф.Е., Коватенко А.Г., Зарицкий Н.М., Романенко Н.В. Применение антивирусных веществ для оздоровления растений картофеля от вирусов методом культуры ткани // Цитология и генетика. -1096.- 30, N 6.- С. 28-32.
65. Московец С.H., Бобырь А.Д., Садовский Ю.П., Коваленко А.Г. Изучение антивирусных свойств вируса гриба Pénicillium funiculosum U 2319 // Вирусы и вирусные болезни растений.- Ьгев: Наук, думка.- 1974.- С. 37-43.
66. Московець С.М., Коваленко О.Г., Бобир А.Д. Деяк! ф!зичн1 та ф1-3hko-xiMi4Hi властивост1 антив!русних речовин - продукт!в метабол Î3 му дрмщж!в // Доп. АН УPCP. Сер. Б.-1971.- N 2.-С.172-174.
67. Мое: овець С.М., Коваленко О.Г., Боцелко С.К. ®1эико-х!м1чна характеристика антив!русних препаратов, одержаних з др1вдк!в // Мжробюл. журн.- 1971.- 33, N 1.- С. 82-88.
68. Садовський Ю.П., Коваченко О.Г. Лор1вняльна антивхрусна актив-н1сть Bipycy Pénicillium funiculosum та його РНК // MiKpofii-ол. журн,- 1974.- 36, К 3.- С. 341-346.
69. Садовський Ю.П., Коваленко О.Г., Бобир А.Д. Деяк! ф1вико-х1м1чн1 властивосг! РНК Bipycy Pénicillium funiculosum i вплпв ï'i на ai-рус тютюново! мозаоки // М1кро£иол. журн.- 1973.- 35, N 3.- 0. 330-335.
70. Садовський А.Д., Коваленко О.Г., Бобир А.Д., Заксрдонець О.А. Вплив npenapariB Bipycy Pénicillium funiculosum на Bipyc тютюново ï МОза!ки // М1кроб!ол.журн." 1973.- 35, N 3.- С. 335-341.
71. Щербагенко U.C., Бобырь А.Д., Олец&нко Л.Т., Коваленко А.Г. Гипотеза о детерминировании крайней устойчивости доминантным ал-лелем гена воспргашчивости // Първа нацконална конф. по ишуно-генетике на растенията. Доклады. София.- 1986.- С. 251-254.
72. Щербагенко И.С., Коваленко А.Г., Олещенко Л.Т. Взаимосвязь между инфицированием протопластов картофеля Х-вирусом и увеличением оптической плотности инокулюма // Микробиол.журн.- 1984.- 46, N 2.- С. 57-62.
73. Щербагенко И.С., Коваленко А.Г., Олещенко Л.Г. и др. Получение соматических клонов табака, устойчивых к вирусу бронзовости томатов // БИОЛ. науки.- 1989,- N 6.- С. 24-27.
74. Щербатенко И.С., Коваленко А.Г., Олещенко Л.Т. и др. Устойчивость сомакдонов табака к вирусу бронзоЕости томатов // Микробиол. журн.- 1991.- M 3.- С. 75-80.
75. Щербагенко А.Г., Олещенко Л.Т., Коваленко А.Г. Сохранение инфек-ционности очищенных препаратов х-вкруса картофеля в асептических условиях // Микробиол. журн.- 1967,- 49, N 4.- С. 67-71.
76. Щербатенко И.С., Олещенко Л.Т., Коваленко А.Г. Увеличение оптической плотности шгакулюмз рак критерий оптжизацли условий за-
ражения изолированных - протопластов растении Х-вирусом картофеля // Микробиол. журн.- 1987.- 49, N 4.- С. 73-60.
А**
77. А.с. 302368 СССР МКИ3 С 12К 5/00, А 01 N 15/00. Способ получения омплекса физиологически активных веществ из дрожжей / С.Н.Мсско-вец, А.Г.Коваленко, В.П.Чернецкий. - Опубл. 28.04.71. Еюл. N 15.
78. А.с. 687120 СССР МКИ3 С 12К 5/00,А 01 N 15/00. Способ получения антивирусных препаратов из дрожжей / А.Г. Коваленко, А.Д. Зобырь. - Опубл. 25.09.79. Вол. N 35.
79. А.с.1043840 СССР от 23.05.1083. Способ отбора устойчивых к Х-зи- . русу растений картофеля / А.Г. Коваленко, И.С. Щербатенко, А.Д. Бобырь (не подлежит опубликованию в открытой печати). ■
80. А.о. 1659053 СССР МКИ3 А 51 К 35/76. Способ получения антивирусного препарата из дрожжей / А.Г. Коваг нко, А.Д.Бобырь, Т.Д.Грабила, - Опубл. 30.06.91. Бюл. N 24.
81. А.С. SU 16823388 МКИ3А1 С 12 N 5/04, А 01 Н 4/00. Способ оздоровления картофеля от вирусов в культуре ткани /Н.В.Щербина, Ф.Е. Козар, А.Г. Коваленко и др.- Опубл. 07.10.91. Бюл. N 37.
82. Pat.DD 299 149 А5 BRD, А 01 N 43/66, А 01 N 63/00. Mlttel zur Bekampfung von Pflanzenvlren / G. Schuster, S. Kluge, A.G. Ko-valenko.- Veroffent. 02.04.92.
83. Пат. UA 6524 CI, A 01 N 63/00 . (A 01 N 63/00-, 43:64).. Зас1б боро-тьби з 3ipyсами рсслин / Г.Шустер, З.Клугэ., О.Г.Коваленко.-Опубл. 29.12.94. Еюл.И 8-1. •
84. Пат. RU 2035583 МКЙ3 CI, А 01 N 63/00 (А 01 N 63/00; 43:64). Средство борьбы с вирусами растений / Г. Шустер, 3. Клуге, А.Г. Коваленко.- Опубл. 09.06.95. Бюл. N 16.
85. Пат. UA 7462 Al, А 61 к 35/75., CnociO c-держанкя антив1русного препарату is др1ждлйз / О.Г.Коваленко, А.Д.Бобир, Т.Д.Граб1на,
А.0. Баркалоза.- Опубл. 29.09.95. Бюл. N 3.
***
84. Коваленко А.Г. Индуцирование устойчивости табака к вирусу табачной мозаики // Тез. докл., представленных XII междунар. бота-нич. конгрессу,- Л: Наум.- 1975,- С. 438.
86. Коваленко А.Г. Индукция неслецифическсй эирусоустойчмвости у растений и ее практическое значение // Теория и практика исполь-зоважи иммуннитега с.-х. растений к вирусн. болезней (Вильнюс, 1984): Тез. докл.- 1984.- С. 15-13.
87. Кс alenko A.G. Antiviral activities of polysaccharides // Leip-
zig-ег Biotechnologiesymposium "Phagen in der techniscnen Mikrobiologie" (Leipzig, 1984): Abstrs.-1984.- S. 52-53.
88. Коваленко А.Г. Выявление природной и индуцированной устойчивости к БТМ у табака в культуре мезофильных протопластов // Достижения микробиологии; - практика. 7-й съезд Бсесоюзн. микробиол. о-ва. Т. 5. Вирусы растений и микроорганизмов (Алма-Ата, 1985): Тез. докл.- 1985.- С. 17.
89. Коваленко А.Г. Фитонциды в изучении механизмов вирусоустойчивос-ти растений // Фитонциды. Бактериальные болезни растений (Ужгород, 1985): Тез. докл. часть. 1.- 1985.- С. 146-147.
90. Kovalenko A.G. Phytolectins: a possible base of antiviral activity of carbohydrate polymers in the hypersensitive host plant // Recent Results in Plant Virology (Reinhardsbrunn, GDR, 1986): Abstrs.- 19S6.- P. 50-51.
91. Kovalenko A.G. Pnytolectines and antiphytoviral activities of polysaccharides // 10th Internat. Conf. "Interlec-10" (Prague,
1988): Abstrs.- 1938.- P. 44.
92. Kovalenko A.G. Correlation between lectin - inhibitory and antiphytoviral activities in polysaccharides // 11th Internat. Conf. "Interlec-ll" (Tartu, 1989).- 1989.- P. 39.
93. Kovalenko A.G. Mew aspects of systemic aquired virus resistance in plants // Recent Results in Plant Virology (Eberswalde, DDR,
1989): Abstrs. - 1989,- S. 59-60.
94. Kovalenko A.G. Antiphytoviral action of yeast mnnan in the pre-cence of some monosaccharides // 5th European Symp. on Carbohydrates (Prague, 1989): Abstrs.- 1989.- P. 43.
95. Kovalenko A.G. The rale of poly (oligo)saccharides in initiation of hypersensitive reaction in plants at viral infection // 5th Bratislava Symp. on Saccharides (Bratislava, 1990): Abstrs.-1990.
96. Kovalenko A.G. The role of lectin - carbohydrate interaction in plant resistance to viruses: a hypothesis // 15th Internat. Conf. "Interlec-15" (Szeged, 1993).- 1993. P.
97. Kovalenko A.G. Some evidences of the important role of protein-carbohydrate interaction in virus - plant relationship //Intern. Conf. "Fundamental and Applied Problems m Phytovirology" (Yalta, 1994): Abstrs.- 1994.- P. 22.
98. Kovalenko A.G., Bobyr A.D. The possible mechanisms of antiviral 'action polysaccharides // 7th Internat. Symp. on Antiviral Substances (Varna, 1987): Abstrs.- 19S7.- P. 71.
Alexey G. Kovalenko tialecular biological aspects of natural and induced plant resistance to viruses Thesis for scientific degree of doctor of biological sciences by the speciality 03.00.06 - Virology. Zabolotny Insi Itute of Microbiology and Virology, Nat. Ukr. Acad. Sci., Kyiv. 1996.
The object of defence are 124 ¿cientifio works which contain the experimental data about natural and induced virus resistance of plants on different levels of cell populations organisation at subliminal, local and systemic types of infection. The differences and analogies in mechanisms and factors of the virus resistance in various systems (intact plants, isolated organs, tissues and cell protoplasts) were demonstrated. Fhysico-chemical properties, structure and functions of the natural virus-resistant inducers were investigated. On the basis of own results and literature data the protein - carbohydrate conception in virus plant pathology v/as founded and the receptor - inducers model of protection mechanisms initiation and regulation of interaction between viruses and resistant host plants was elaborated.
А.Г. Коваленко ймекулярко-биологические аспекты естесстен.чсй и кндуцущгроваккой устойчивости растений к ir< трусам.
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.0В - вирусология. Инотитиут микробиологии и вирусологии км Д.К. Заболоткого НАН Украины, Киев, 1996.
Защищается 124 научные работы, гаторые содержат материалы экспериментальных исследований естественной и индуцированной устойчивости растений к в ярусам на разных уровнях организации клеточных популяций при сублиминальной, локальной и системной инфекциях. Показаны различия и аназогии механизмов и факторов вирусоустойчивости в различных системах (целые растения, изолированные органы, ткани и протопласты). Исследованы физико-химические свойства, особенности строения и ф>нкции природных индукторов вирусоустойчивости. На базе собственных результатов и данных литературы основана белок-углеводная концепция в вирусной патологии растений, а также разработана рецептор-индукторная модель инициацию! защитных механизмов и регуляции взаимоотношений вирусов и устойчивых к ним растешш-xosiiea.
IÜD040BÍ олова:. фз.тов1руси, мекангвми BipycacriñKOCTí рослир, надчутлива реакц!я, 1ндуктори га супресори ctíükoct!, пол1нуклеоти-ди, йЬлЮахариди, aHTitBipycHi агенти, лектини, РК-б1лки, ферменти.
Л1дл. до друку 12.11.96. Формат £0x84/16. Ilanip oí с. Орс. друк. Ум. друк. арк. ¿,7Э. Ук. |[арбо-в1дб. 2,91. Обл.-вид. арк. 3,0.
опм. ii:7. Типа?". 100 приу._;_
РедакцИшо-ввдавничкЯ в1;щ1л з пол1гргф1чною д1лыицею 1нстлтуту кИернвтшш 1глен1 В.М.Глушкова 1LIH УхраХли KjiIb ¿¿, проспект АкадемХка Глушкова, 40
-
Коваленко, Алексей Григорьевич
-
доктора биологических наук
-
Киев, 1996
-
ВАК 03.00.06
- Физиологические аспекты системной индуцированной устойчивости к вирусным болезням у растений семейства Solanaceae Juss
- УСТОЙЧИВОСТЬ СЛИВЫ К ВИРУСУ ШАРКИ
- Идентификация и биологическая характеристика поти- и тобамовирусов
- ИНДУЦИРОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
- Ультраструктурные аспекты вирусного патогенеза и индуцированной 1,3;1,6- β-D-глюканом устойчивости растений
