Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИНДУЦИРОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ИНДУЦИРОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ"

.¿¡-29370 .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

БАБОША Александр Валентинович

УДК 632.38 + 581.1

ИНДУЦИРОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.12 — Физиология растений 06.01.11 — Защита растений от вредителей и болезнен

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1989

Работа выполнена в Биотехнологическом, центре Научно-исследовательского института картофельного хозяйства.

Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук Л. Н. Трофимец, кандидат биологических наук М. Е. Ладыгина.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук О. Л. Озерецковская, кандидат биологических наук Т. В. Карнаухова.

Ведущая организация — Главный ботанический сад АН СССР.

Защита состоится « . . . . . . 1989 г.

в «/6» часов на заседании специализированного совета Д 120.35.07 при Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, Москва И-550, ул. Тимирязевская, д. 49, ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Московской сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева. „

Автореферат разослан «—' » . .... 1989 г.

Ученый секретарь специализированного совета — кандидат би'"- паук

атьев

сщля^харакгерксбка работы

• ■ -.!. Актуальность;проблей!..Еирусшо болезни наносят огрешшй;'.

• .ущорЗ охоношш>-всвхг строи кфа,-. существенно сникая урояшД и

. уху^ая. качество 'растительного сырья. Зс.щита от вирусоа особенно актуальна для. "вегетативно *размножаемо: культур,"в частности кар- ' тофеля.. Снигоико .урожая .Kaproiоля достигает. 2С8*_и "болеа'; Несло- ■ *'Дования фнзиолэго-биохимлчесяих.механизмов'противовирусной"ус-■.. ; тойчавости растений продставяязот собой необходимую :0азу. для раз-"-.'. . работки средств борьбы "с вируапгет болезнями,.для создшиш .ус-. _. тойчпвых сортов сельскохозяйственных рагтенйй." Важность .изучения /физиологических; основ^естественных-'защитта реакций растений 'опродоляется также экологичеоК12Я1.гфо5ло:г2:л1,Гвсз1шкаю^11.^и при применении этнических средств;защиты от"патогенов."'V-"' • ."••" Внедрение в;1руса:;в;.растительный организм, инцукфует. активную .

■ защктну» реакции, 'вклвчохцую' синтез белков, и веществ,небелковой природы, изменение активности 'формантов.: Особенностью устойчивых растений является способность противостоять повреждающему дейс'т- ; вии патогена на''ыётабояизи: икобилизовывать 'ресурсы 'организма • • для синтеза необходогых • заветных веществ;-'В' исследованиях последних лет особое.внимание-уделено функционированию в. растениях . ■

< интерфероноподобного механизма противовирусной защиты fZ)?\/osh etat, ISSI, 1982, 1985,,1966;"Reichmctn 1963/. Кроме того" проводится интенсивное'изучение роли фитолектинов в устойчивости растений к'патогенам различной природы '/ &?4toh~tt ef.t Ш&Ъ/Мелфю-, 1978; Zefueita, 4/iafiamtWll/.. Таким образом, изучение роли бед--ковых веществ виммунитете растений является одной из актуаль-' :ных задач, "имеющей'-.теоретическое и практическое 'значение. .: ' ■ Целью нашей работы является изучешё;активной защитной реакции растений-картофеля, проявляющейся в иидуигрованикх ви-pycuoft ккфехцией' изменениях белков, обладающих и не обладающих; ферментативной активностью. _ '

Основные задачи исследования: ■ :' .

■ I. Выделение индуцируемых" антивирусных белков и изучение их, свойств. 2. Изучение олигоаденилатсинтетазы картофеля - одного

■из хшочоиах ферментов,системы интерферона у .-животных и растений. -' 3. Изучение индуцируемых вирусной инфекцией изменений восприим---1

^Us:iTp. uayi^ai бч5я:отека Цос-.. г;,. Г i.M икьт. ■'i-Лй. Н:'Л. U.A. T.iAU?fl3i3J

. Й.....................- •■■■•■ " ■

чивости к вирусам, активности пероксидазы и рибонуклеазы,\белт, ;кового состава; 4. Изучение фитогсмагглютининов картофеля'в:

• связи' с действием ¡зируснэЯ нн£о:.*цнн. 5. -Исследование белковых

. вегцеств растительного происхоадения, взаимодействующих с вирусной частице:1.. - • . . .'.. .■....". . '

'у Научная нэрпзна и практическая тонкость гпбг/г». , ,*: '■ '-Еаделеш и.очии^нц шадуцируемйэ вирусной инфекцией антивирусные белки карто.Ъзля, изучош их свойства. Впервые' обнаружена активность • олигоадвюаатсиитст'азы — одного из клшевьк' ферментов система интерферона в листьях иммунного -растения, ис—• 'следовала.некоторые биологические и физико-химические свойства ,-.синтезируемого ею продукта. „Показано,. что "антивирусные ,белки и •

• "олигоадёшгла'тсинтетаза могут быть йедуцироваиц4'в'*листьях картой феля, в' совместимой с вирусньсл патогеном и -несовместимой комби-:

■-нациях,; а таете двуепиральной РНК. Впервые.исследовано :Содер- > жшше' 4и?огемагглю?и!шнов в листьях, картофеля в связи с действием вирусной инфекции. Показало, что. при,инокуляции:авирулент-ным вирусом происходит повшени'е агглютшглрущей активности ;с . /максимумом в точечно первых суток после• инфицирования..;При. инокуляции вирулентным в;:русом таких изменений флтогемагглютининов : не''наблюдается. Установлено, что инокуляция,нижних листьев им-'•цу{юого сорта картофеля Са^ир-приводит к повышению восприимчивости верхних листьев к У-вирусу картофеля и, снижению к 5 -ви-'русу. Разработана методика обнаружения белков, взаимодействуют щих с вирусной частицей, основанная на подавлении ими серологи-, ческих свойств вируса в иммуноферментном анализе. Впервые Еыде-; лены и'очицены белки-ингибиторы"серологической реакции, изуче-, ны их"физико-химические свойства. На основе экспериментальных данных высказано предположение о том, что механизм их,действия связан со взаимодействием "с поверхностными белками вириона, что может:приводить к,деструкции, вируса при повышении концентрации ; ИНГИбИТОра. -Д. Г - • '<

- Полученные результаты углубляют налш знания о природе противовирусной устойчивости и могут быть.использованы при разработке мер борьбы с вирусными болезнями растений.';Предложен метод' получения ферментного препарата олигоаденилатсинтетазы для синтеза антивирусных веществ.. Получаемые при этом соединения

, могут быть использовшы при создании естественных" зенитных средств для борьбы с в;фусными-заболеваниями, а такке.в1лабораторных ви- ; .русологических:и биохимических'.исследованиях. Изучение фитогем-агглютишшов листьев картофеля двух ввдов расширяет■сырьевыо ис- . точники для получения лехтинов^ /Результат!!,исследований измене-. ния содержания агглютишшов под действием 'различных, вирусов и -•двуспиральноЯ РШ могут найти применение для повигеиия. выхода' этих соединений, а также.в'качестве основы для "создшия метода диагностики устойчивости картофеля к вирусным-болезням..

Апробация работа. Результаты работы были доложены на У111 Всесоюзном совещании по„иммунитету сельскохозяйственных .растений к болезням и вредителям ,/?11га, у1986/, на конференции молодых ' ученых НПО по картофелеводству /Коренево,. Московская, сбл., 1987/, на конференции молодых ученых ШУ. /1583/,' на научно-проиэводст-венном совещании %"Селёкционно-гёнетические, физиолого-бкохими-"; ческие и технологические аспекты интенсификации производства картофеля"/ Уфа, 1589/. ч ■ >■-

Публикации. Основное содержание работы отражено в 7 публикациях. . .

Объем работы.. Общий объем диссертации составляет 191 стра- /. ниц/, включая 22 таблицы и'34 рисунка. Списокиспользованной ли- • тературы - 279 наименований, в том числе 199 иностранных.

' МАТЕРИАЛЫ Й ЫЗТОДЫ

Основные эксперименты проведены с безвируснкми растениями ( картофеля $о?апит {иёеточит сорта Сафир /иммунон к ХБК, вое- . приимчив к УЗК/ и £ сЬасоете : ТЕ-1 /сверхчувствителен к • УВК, восприимчив к ХВК/,;вырас;еншми"в условиях изоляции от переносчиков вирусов. ^'-Л-'''г'' - ■ -

Растения в фазе начала бутонизации механически инокулирова-. ли с применением 'карборунд вйруссодерасацего

или контрольного материала."Через 7-12'дней иною/лйровашше листья использовали для выделения антивирусных "соединений из , фракции легкорастворимых белков методами■ высаливания-сульфатом аммония, • ионообменной;хроматографии на ДЭЛЗ-сефэдексс Л-50,пре-.-< тпаративного иэоэлеятрофок1'С1фовшшя, ■ голъфильтрации УОстерман,,

"1981; I985/.;ВыделеннымТбелковым препаратам присваивали обозначения, которые " включают вариант инокуляций.' растений/Х - ХВК,К- -контроль/, полярность A/aCf в элюируицом' буфере при ионообменной хроматографии и степень -насыщения/?*/ сульфата"'аммония при выса-' лнвшсш*. Для выделения- связанных белков' мозгу «дополнительно. Т. экстрагировали буферными растворами, содержавши Ш М>С{ и последовательно -'0,(6 и 0,5* тритона Х-100а аатем инкубировали"в присутствии 1,2555 пектиназы'и 0,25% целдюлазы.\'->Г

' Антивирусную активность'определяли катодом листовых'дисков :/Огарков и др., IS84/, а также-на листьях свертч^ствительных" индикаторных растений: 1E-I,Uieofianyyfatinosa.ifympfnenct gfofosa. Индуцируемую антивирусную активность шчисляли по формуле: V

AiiLzJL ёсли К»X; A=JL=-1 ,'. если К<Х, где X и К - число

.некрозов или концентрация вируса в листовых дисках, обработан-.-1шх-соответственно .белками опытного и контрольного-растений. -Концентрацию вируса определяли методом шмую^ерментного анализа /ИЗА, Cfaik, Mams ■ , 1976/.-Очищенные препараты вирусов любезно предоставлены сотрудниками'КОИХ Ю.А.Варицевшл и'А^И.Ус-• ковш,' за что,выражаю им глубокую благодарность. ,* --W'; -..,*.;Ввделение олигоаденилатсинтетаэы из листьев картофеля и V ; .синтез олигоаденилатов из АТЗ проводили по модифицировашой методике Рейхмана и соавторов / 'Reichman etvctf. ,1963/ о. исполь- : ■зованием аффинного сорбента.поли И*поли.Ц - целлюлозы.. Об ак-тивнэсти фермента судили по антивирусной активности синтезированных соединений. Разделение нуклеотидов осуществляли ионооб-\ менной хроматографией на ДЭАЗ-цзллюлЬзе. ~ ,'. '

Определение активности фитогемагглютшшнов осуществляли ..' на планшетах с круглодоннымиячейками;/Луцик и др., 1981/ с использованием эритроцитов кролика, обработанных трипсином и • 'глютаровым альдегидом'J^TUiner, 'X(«n«t,' , 1975/. Активность , пероксидазы определяли в. реакции 'с 0;1% аминосалициловой кис-'лотой- и: 0,005* перекисью. водорода. Активность РНК-азы, - спект-: рофотометрически /Татарская'и'-да.1966/. ' ■■■■..• , * Статистическую' обработку'проводили с • использованием критерии-.Стьюдента. Вычисляли среднее значение измеряемого.параметра .-и.доверительный интервал или - накменьсее суцественное различно ;-'/НСР/ при Р - 0,05. ' '

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

- Енрусилдудируешо изменения восприимчивости б растениях ■ ■ ».< картофеля ■ • : ' г -

"Индуцированная устойчивость- является вашши доказательством существования активного механизма защити растений от пато- . : .гонов, ото явлешт хорезо изучено в сверхчувствителыых растениях. В Н£ся1Х опытах 2 нижшж, листа растений.картофеля кммун-■ него.сорта Сафир коалировали 'ШЬ Через 7 дней'в^ележ&щио. листья инфицировали'УВК' или "5 Щ-,- Измерение:концентрации виру- •. сов методом ИЗА покфнвает;. что,восприимчивость к ^ЕОииело-' жос?а листьев снижается, - а к УШ незначительно ..возрас?ае?/риа. I/ Поскольку данные последующих опытов свидетельствуют об отсутствии вирусспецифичности антивирусных веществ,'из; листьев :картофо-ля,.уровень устойчивости верхних листьев;' вероятно, ■ является результатом сложения противоположно направленных воздействия, индуцируемых первичной.инокуляцией Х-вируса и компенсирующих друг" друга в случае последующей инокуляции УШ. :

Выделение и характеристика некоторых свойств антивирусных : белков из листьев картофеля -

■ - При исследовании белков картофеля сорта Сафф антивирус-. - • ная активность, ивдущфуемал вирусами, бьиа обнаружена во фрак--ции,.высаливаемой-сульфатом'ашония в диапазоне 60-100#■Насыщения и элюируемой сДЭАЭ-сефадекса 0, ЗМ хлоридом натрия. Резуль-

. тага испытания антивирусной; активностиэтих. белковпредстав- ; :ленные в таблице I,.свидетельствуют'об отсутстввд^специфичнос-" ти действия относительно вируса и растения-хозяина; ¡ Активность -препарата проявляется как при смешивании с вирусным. инокулюмоы, ■ так и при применении до и непосредственно поело инфицирования" / в опытах с листовыми дисками/,_ .

■ - Способностью индуцировать антивирусную активность в белко-; вой фракции, элюируемой О,ЗМ МгС?, обладают не только авиру-лентный ХВК, но и У-вирус, системно 'инфицгфугзщий-картофель сорта Сафир /табл. 2/." - Антивирусная активность повышается также. при

: обработке листьев двуспиральной РНК, применяемой в. модицино в ■ ; качестве индуктора- интерферона, что свидетельствует, сб участии •

<л

е

0,05,

$ листа

3 4

2. 3

НСР,

0,05

№ .листа

4 - Рис. I. - Влшцие ХБК на восприимчивость к УВК и ЕК кар-: тс^елл сорта Са4мр: ,х - -нижний лист /к-О/, инокулн-.ровш» за,7 дной-до инфицирования всех,листьев ЕК или УВК; к - контрольные растения '

интор;[>ероноподобного механизма в про?ивов;(русной защите растений. картофоля. С другой сторош-сходное ивдущруюцее'действие ;вирусов,-вызывающих различную.реакцию растений изучаемого;сор-. та, позволяет предположить,; что образование"антивирусных,ве- > цеств*.на связано о вирулентностью, патогена.. Сигналом?для синтеза 'этих-соединений, по-видимому,/служит.образование двуспираль-ных'репликативных интермедиантов вирусной РНК в,процессе репродукции вируса. ;

■Д Белки, элюируемые 0,ЗМ ЫаС( »использованы для "последую- : чщей'; очистки антивирусного вещества. На рис.2 .представлены ре— * - зультаты испытания антивирусной активности фракций",: полученных препаративным изоэлектрофо курированием.,.; Индуцируемую * активность . наблюдалив двух фракциях в области; слабощелочных значений. изо-электрической•точки /!В 8-9: и г II/..' 1£и- фракции? в'''<Ь»5ою1б)И»яГг.' области /¡¡- I, 3, б/ обладали непостоянной-активностью-в'некотот рых индикаторных системах..При разделении препарата,Р 8-9 на

."'/.■ '•'"':'. -.Таблица.!''., АнгиЕирусная" активность/^'/ препарата Х-0,3-100 из листьев картофеля сорта Сафир . ,.' - ,

Растение-индикатор, \ Еирус

. В1;л ТЕ-1,УВК &отр/->1епо (¡Со ХВК М/абс/сит, ■ УБК

Способ применения препарат

Ответная реакция

индикатора за 1-3 ч до . • нейтраллза- инкубация : инфицирования ция икфек- , в растворе ционностп . , препарата

некроз некроз

некроз .

системная инфекция ,

47,3х* 25,5х*

30-25

50-41 59*22

30,9:

,хх

--Расчет антивирусной активности в данной таблице ив последующих таблицах и рисунках, проведен как указано в разделе "Материалы и методы" ; ••

хх- Средние данные 3-6-опытов, .,. .- ,

Таблица 2

Ивдукция/антивирусной активности вофракции,белков, эля- ируелых О.ШМгС?, инокуляцией вирусов и двуспиральной , РКК в листьях картофеля сорта Са.£ир

Индуктор

Число некрозов на листьях МдМ!по$а

Антивирусная активность,%.

Контроль ХВК УВК дсРНК .

25 ± 6 10 * 3 9 ±4 14 * 5

Е9

tA

А H

• О

о m ■ и м и -

I

10

-10

л

456

?е

10 II

№ $оакции

2 4 НИ6II В U 10 рн.

Рис. 2.

Антивирусная активность белковьк фракций; полученных изоэлектрофокусированием на листьях A/.gfu finóla против ВЕЛ. Средние значения 3-5 опытов ,

сефадексе-100 наблюдали несколько антивирусных соединений. Наиболее активный белок 20 кДа ингибирует ВТМ на листьях ¿tnosa на 66Й в концентрации менее I нМ. :

Таким образом, нами установлено, что-в инфицированных растениях ^содержится комплекс антивирусных белков. Щелочной харак-

тор, низкая молокуляр!1ая массами отсутотиш вирусспедафичности свидетельствуют о близости этих;белков к интерферон}' животных. СледующиЛ'-раэдел посвящен.другому аспекту интерфероноподобного •• механизма, связанному с синтезом олигоаденилатоп. -

- Изучение роли олигоаденилатов я.олигоаденклатсинтетаэы

в за^1т!шх реакГрих растешй картофеля ■ - ... .

" Ои^адоюматаштвтада; образуемые -ев; о процессе лолдае-ризации ATS олигоаденилатц занимают ключевое положение в механизме антивирусного;действия интерферона в тканях животных ¡Ken, \ настоящее время установлено существо-

: вшгле сходного механизма ;Гфи; инфицировании сверхчувствительных : растений табака,_ иццукц-.!я_олигоаденилатсинтетазы при ис обработке интерфероноподобньгяг белками /ßeichtnan efit(,, 1983; De-vosh «ЦК85/.; Имеются данные;об индукции' цитокининовой^активности у рас*ею1й^/обработалшх\олигоаденйЯ др., 193?/. Важность проблем делает, актуальным расширение круга изучаемых растений. ,

Как показали нваи-исследования, инокуляция листьев именного . сорта^кгфмфвля • Хтв^сом. приводит • йцдуцйровани» активности синтстазы олигоаденилата /табл.3/. При этом сила реакции сорта картофеля^, обладающего иммунитетом, не уступает и даже превышает активность, возникающую в;ходе сверхчувствительной ответной, реакции растений MgfuHnow на ВТМ и S.chctcoense на УВК.•

Таблица 3

Индукция олигоаденилатсинтетазы в листьях растений в . ответ на инокуляцию вируса

Растение, вирус ; - -Число некрозов на • • листьях. А/.gfaHnoict .Антивирусная -■^ активность, % ■

S. Me?oium i УЖ 11,0*8,9 57

1 Контроль 25,5*7,7 ' *

Мgtutinoia , ВГМ 12,2*5,5 '; 45

Контроль 22,3*9,7

S..chacotnse , .УВК ' 2,3*1,6' 1 29 ' " '

Контроль' 4,2*1,4

Оодгоадегсдоки,. "сш1?езированш;е npii помогу ферментов как :-картофеля, так и табака,/обладали 'антивирусной активность» против ВШ на лкст.)}гс MgMlhÖsct \ , что свидетельствует "об их .: "сходство. Как следует-из результатов, представленных в таблица ,4, ивдукция олигоаде!гллатсинтетазы происходит на ранних этапах ■ взаимодействия с внедрашкмся"патогеном,.уже "через[ 24'. ч'после. •.-.инокуляции активность фермента достигает каксккальшлс значе'ний, •'В случае инфицирования вирусами высокая активность сохраняется'/ в последу«сций период-по крайней море в течение 7 дней. : - .■/.

■" Способностью н;<цуцировать 'ОлигоодошаатсшггетазучпэмгаЬ . • ХШ.обладслзт У-вирус картофеля.и двусянральная PIK. -Таким образом"индукция активности" фермента при инфицкрозании но зависит % от степени и характера устойчивости/ восприимчивость, сверхчувсз вительность, иммунитет/.. ' . ■ . - -.

Sr /"•;"' ' / : • • '.'/ /.-;'■ : Таблица 4 •

/Динамика активности олигоаденилатсинтетазы после инокуляции • '•'- вирусами и двусяиральной-РК-С -в растсшигс картофеля 'сорта . - Сафир /антивирусная активность, 55/ • • • . • •;•.

Индуктор • . Время поело инокуляцп ¡1,' ч

24 / 72 168 ...'■

JffiiC 55 ' AB ■ ■ ."■ 42 '

ув:{ 45 43 34 -

дсРНК 45 •'-'" .24 26.

, . . ; Г.- .НСР0,С5=20 ' /

В литературе имеются сведения об индукции. антивирусных ве-цеств, в частности "антивирусного фактора табака,, двуспиралъными молекулами РЖ- /.¿б?; £&?(аит 19ЭЗ/.-'и, о другой стороны, ..:.-/ об увеличении/активности олигооденилатсинтетазы в тканях, обра-, ботинок интерфероном /и интерфероноподобными. белками \ffieichinan г? а А". , 1963/. Можно предположить, .что ситная к синтезу олиго-аденилатов, обладшоч!«:Ш1тивирусноГ1: активностью, передается по >, цепочке г вирус; -*/ДсР{£-С рбхмикативкых'-'инторм&диантов. вирусной . РКК г/интерфероноподобше белки ;-* олигоадонилатсинтетазарасто-

нкй. Полученные в нежное опытах данные по ;н!дукцни антисируснчх .. белков и олагоадонияатсингетазы - в ткыих 'картофеля под действием X-.ii У-вирусов, а таксе дсКЗС согласится с этим предяо-. -лечением. ■'

".'.. С цель» выяснения природы синтезируемых из АТэ в црисутс?-ферментативного препарата картофеля вещоотв проводили хро-.

• • магографпческое разделение проектов реакции на ДЭАЭ-целлюлозо. •? Результаты представлены на'рис.3. На хроматографа» реакционной

• смаси; инхубированной в присутствии фесмонга кз гафщпрован.чых . ХЕГрастеюгй, заметно' появление 4-х новых соединений, в суше

; составляющих примерно 1,85» исходной АТС. Молекулы вновь синтезируемых соединений кме»т больший отрицательный засяд, чем у ,АТ2, поскольку -олюируются растворами хлорида натрия большей кон центрации, что совпадает с литературными данными для олигопдона латов^ животного и растительного' праискокдешм'- в?оигл, 1978 : 1986/. Из четырёх новых' веществ три обладает

шгтивирусной активностью по крайней мере на одном виде растения индикатора. . . '...'-...-Г.,:„"; ■ <г*., •■,','''■..':.'■

Тахи.м" образом; в растениях картофеля обнаружено функционирование'системы-сшетеза олигоаденилатоз, которая активируется • при инфицировании'вирусам. Полученные данные свидетельствуют о существовании у растений интерфероноподобной системы защиты от вирусного патогена.

- » . , Изменение акт11вности; лерокевдады и рибонуклеазы ' . при инфицировании'картофеля .

« - Предположение об участии пероксидазы и РНК-азы в защитных реакциях растений ¡ основано на наблюдениях;повышения активности этих ферментов при > инфицировании :'различнкгх;1 патогенами /Рейф- '•■' мани др., 1985; ■&.кр«'г е* сг£ , 1952/.

• ;В наэих(экспериментах активность пероксидазы измеряли во фракциях:растворимых и связанных белков. Инфицирование'карто- ;' феля сорта Сафир'ХШ приводит'к некоторому повышению активности растворимой пероксидазы с максимумом через 24 ч. Отсутствие значительных изменений прл.'инфицировании.в основном согласуется с; данншлг опытов Коваленко и Цербатенко /1981, 1586/."^ Не обнаружено татае существенных различий мачеду инфицированным.

ъ

л

0,5'

100 Объем,мл;

Г 1"' 50 Б 25 0

л, .■.1.Ч'.1 ■ ,; 1 : : J ■ -25 Г

[Г

II

В

25 ' О

3

I .

-25 -50

Ряс.'З. Хроматография на ДЗАЭ-цвлпюлозо олигоаденилатов, ! 'синтезированных ферментом из инокурированных ХЕК листьев'картофеля сорта Сафкр /А/ и антивирусная : ' • активность получегашх фракций на ТЕ-1 /Б/ и М$ги: /В/

и'контрольным вариантами в активности связанных.пероксидаз. 'Инфицирование У-вирусом сверхчувствительных растения £еАа-соете . приводит к значительному сшкенпа активности порокси- : : . :дазы по сравнению с контролем в период, предшествующий.образо-/ ваш» некрозов. В дальнейшем ферментативная активность возрос-; .

- тает до уровня контролыгых растений. Инокуляция ХЕК вызывает ■. более или менее значительное повышение активности.' При обра'-": ботке шщуктором устойчивости /дсРНК/ значительных изменений

пероксидазы у обоих изученных видов картофеля но происходит. Полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии непосред-: ствешого участия пероксидазы в механизме устойчивости. Г „'• Активность рибонуклеазы" повышается при; инфицировании ХБК , и УВК растений картофеля сорта Сафир,' достигая максимума соответственно через 24.и'72 ч после инокуляции вирусов. В изолированных листьях ТЕ-1'заметного изменения активности при шф!ци- \ ровании этими'вирусами не наблюдается..

•••/. -Лектины картофеля в здоровых и инфицированных растениях

. Лектины растений вызывают повышенный интерес в связи с их способностью к узнаванию специфических углеводных структур. Из— . вестны как факты взаимодействия фитогемагглютининов с бактери- ■ ; альными'7 и грибными / Мепс/деп , 1978/

• патогенами, так и способность лектинов воздействовать на синтезу фитоалексинов / Авазходааев и др.', 1987/. ^ :

Активность фитогемагглютининов изучали во фракциях свободных 'и' связанных белков. Как показали опыты, в листьях картофеля

• сорта Сафир большая часть:лектинов содержится во фракциях, экст-рагируеьйк -о применением 0,554-ного тритона Х-100. 3 растениях

£, сАасёгте основное количество агглютининов растворимо в буферном растворе с низкой ионной силой и не содержащем детергент. При инфицировании листьев £ с/гасоетё* У-вирусом картофе-- ля, вызывающим реакцию., сверхчувствительности, происходит повы--- шение количества лектинов примерно через 24 ч после инокуляции

- вируса, особенно.значительное во фракции растворимых белков,,

• наиболее богатой.фитогемагглютининами/ рис.4/. Затем следует резкое снижение активности в период времени, предшествующий •образованию некрозов. Повышение гемагглютинирующей активности

Рис.-4. Содержание фитогемагглютининов /легкораствори-мне белки/ в листьях сЬасоете , икокули-: рованшх: • I■ -"ХВК,-2 УВК, 3 - дсРНК, - ; контроль ■ _

-м-

в растворимой фракции наблюдали также через 24 ч после обработ •ки дсРКК., Количество лектинов в зараженных У-вирусом листьях

1 вновь несколько повь=:аатся после появления локальных повре-еде-ний / во фракции,- экстрагируемой с добавлением детергента в

2 и.более раза/. Кривая изменения лектинов при инфицировании вирулентным Х-вирусом картофеля практически*, не отличается от

■ контроля. Изменения активности агглютининов под действием обработки дсРНК во фракциях связанных белков в разные промежутки времени имеют сходство с изменениями в вариантах инокуляции вирулентным г-та 'авирулеотшм вирусами.." *

■В растениях картофеля сорта Сафир количество агглютшс1-руюцих веществ;в растворимой• фракции;- а также в составе препарата, экстрагируемого/с применением пектиназы ицеллюлазы . увёл11чива'ется при инокуляции азирулентного ХВК и сохраняется на уровне, "близком к-контролю, при инокуляции•вирулентного УВК. Динамика Изменений при обработке дсРШ сходна с реакцией на авирулентный;вирус/ХШ/, однако абсолютные значения отклонений от контроля в этом варианте находились' на более низком уровне. \?*;'Г'.'!: 1 ■

'" ^ Таким'образом, содержание лектинов в листьях' картофеля; закономерно.изменяется при инфицировании растения. Характер ' воздействия" вирулентных и" ¿вирулентных вирусных патогенов , различается:.для 1взаимодёйствия с вирусом"устойчивого растения "свойственно;наличие болееили менее длительного периода высокого содержания гёмагглютининов на ранних этапах инфекционного процесса;.при инокуляции вирулентного патогена таких:изменений не происходит.Эти данныегмогут послужить основой для.создания метода;определения,устойчивости картофеля к вирусным болезням. :По мнению Семёнова"и соавторов//1585/, одной:из функций мембранных,- лектинов в растении является обеспечение взаимодействия пладммёммы'и клеточной стенки;. Возможное:участие ^итогамагглю-тининов в регуляции свойств поверхности клетки, изменении,проницаемости мембран для вирусных частиц и метаболитов, вероятно является одним из механизмов их воздействия на инфекционный.. процесс. • • '' '.V 4 •

-•¿Г-

Ингибиторы.серологических реакций вирусов

• в, листьях картофеля 4

В литературе известно-явленно-нейтрализшрш инфекционное-' ти вирусов под действием специфической ангисыворотки/Боудан, 1552/. Снияенио ин;скцио1Шости■ и серологических свойств вируса является удобным способом изучения веществ растительного про-исхогкдешш, взшмодейсгадвдк.'с': вирусной . частицей в процессе ' ин;ицироват1я."'В работах группы чехословацких ученых'.под-руко-" водством ^мольева было^'установлено '.существование в листьях ■ картофеля 'соединений, ,1и!гибир^ц11х,,серологическую":реакц51ю X-вируса картофеля 'при ;проведени11 • капельной'еотдютинации, ^еьткфеу, предпринята-по- ;

"пытка выделения "и";.очистки указанных ^соединений^а такжэ • выяс- '• ночиэ мехешизма ингибироЕатш. *>Поскольку использование капельной агглютинации для обнаружения пнгибирую^ей активности по *;;■; методу-Ермольева .не-является строго".количественным методом, , , нами предложена методика определения ингибиторов на основе им-муно ферментного анализа. , ' ' .

• ■ Результаты измерения ингибирутецей активности различных ' белковых фракций,. вццеленных высаливанием сульфатом аммония, : и ионообменной хроматографиег},- продетавлены"на рис.5. Эти данные. свидетельствуют о наличии 4-х белковых фракций, ингибирую-"щ;Ьс ИГА. При инфицировании растений Х7 и У-вирусами;картина -1: -распределения.активности.в целок остается неизменной. Таким ч-образом, болькинство-белков-ингибиторов серологических реакций вероятно, является конституционными соединениями. ~ ' " * .

Полученные фракции, как правило, имеют в своем составе •несколько различных ингибиторов. При разделении:на сефадексэ - & -100 препарата Х-0-30.получены-.3.пика ингибирующей актив-;-ности, которые соответствовали белкам с молекулярной массой 60,'-30 и менее <10 кДа.- Наличие-нескольких белков-ингибиторов ? было обнаружено 'в - процесса гольфильтреши и лзоэлектрофокуси-ровання ряда других фракций, • приведешшх на рио.5. '-.у;:-^

Исследования- спэьглфичнэстп показали, что ингибиторы,-выг дсляажо по- их .-активности'в ознс&юнии• УШ.атагасе способны.-по-^ давлять, реакцию -К ЗА о • дау пм - виру oa.ni, / Х-, 5-, ... М-вирусы ;,,;, картофеля/; хотя;величина'-ингпЗкроыщия при-этом может быть

иной. Ингибировашш' максимально при наличии прямого контакта' '. .; раствора, содержащего ингибитор,,и вируса1 в свободном или:км- * •■"■: " мобилизованном состоянии. Величина ингибировашш зависит 'от концентрации ингибитора, уменьшаясь при ого.разведении. Наиболее активно препарата'/ К-0,3-60 и,Х-0-60 / способны сни-кать интенсивность реакции УЗК в И5А до нуля в концентрации 20-30 мкг/мл. Высокие концентрации ингибирукхцих. веществ, по-ввдимому, способ- -■. •ны, вызывать разрушение вириона, которое сопровоздается снижени-; ём рассеяния вирусного препарата-/при ЗОСМОО нм/, а также - ; уменьшешжм на 15-I9?i .поглощения при 260-290 нм. Аналогичные из-v. менения спектра поглоцеютя,вируса описаны в литературе при разрушении В5!русной частицы под действием физических факторов . '/ Куст," 1973/. V -" у '•'-'.■

• Приведенные данные позволяют. предположить, что;ингиб1фова-•ние серологических свойств'вируса происходит благодаря: взаимо-'.v". ' действ*.^ белков-ингибиторов :с поверхностными белка"«! вириона. V .. По всей вероятности .'.'такое комплексирование играет роль в устой- ■ чивости растения,- снжая инфекционность" патогена в процессе ино-куляцпи вируса it "является причиной деградации _ В1фуса в меякле-. точном.пространстве^растения, которую наблюдали Голиновский и , , соавторы / i/ofr'no^ski et а P. , 1981/. ,

ВЫВОДЫ-'- - - -• '

."■!.■ Инокуляция ХВК индуц-.грует в тканях иммунного сорта кар-----

тофеля возрастание восприимчивости к УВК и уменьшение к £ВК. ■V¡2. Выделены и частично очищены антивирусные соединения >. белковой природы, индуцируемые вирусной: инфекцией'в листьях . картофеля. Наиболее активный белок имеет целочную изозлектри-; ■ ческую точку и молекулярную'массу 20 кДа.- Выделенные белки¡не ■ обладают специфичностью в:отношении _вируса и растения-хозяина.:

."■■ • 3. В листьях картофеля обнаружена.олигоаденилатсинтетаза ключевой фермент системы интерферона. В процессе'катализа из АТ5 в присутствии'дсРНК образуется продукт,-.обладающий антивирусной активностью. *

4." Инокуляция, листьев картофеля' вирулентными :И авирулент-■ •'ниш вирусам , а такко дсРНХ;/применяемой--. в 'медицине в .-качестве

индуктора интерферона,• индуцирует образовашс антивирусных белков и олигоаденклатсинтетазы. Приведенные,данные"свидетельствуют о функцио1шровании"'в растениях картофеля антивирусного ии-Л-терфероноподобного механизма защиты. •

5. При инфицировании ХЕК иммунного сорта картофеля но происходит значительна", изменений активности - свободной и связанной • пероксидазы. Активность рибонуклеазы повивается с максимумом . через-24.ч поело инокуляции. В растениях З.сАасосте .при инфицировании УБК происходит уменьшение активности свободной и связанной пероксидазы в, период,-предшествующий образованию некроза^'с последующим повышением этого показателя "до уровня кон?-рольных растений. Инокуляция системно распространяющимся ,Х-ви-русом-картофеля приводила к повышению пероксидазной активности. Полученные;данные свидетельствуют об отсутствии непосредственного" участия пероксидазы_.в механизме устойчивости к вирусам в -растениях картофеля."'

■ !*:;- • б. 'Нсследование свободных и связанных лектинов в листьях картофеля при инфицировании вирусами, различающимися но вирулентности," показаяо, что; в несовместимой комбинации у растений В.^и^егощт - гя Я. с/го/соеп^е происходит повышение активности гемагглютининов в первые.сутки после инокуляции ХВК и УБК соответственно. В совместимой комбинации заметных изменений содер-. жакия" .'лектинов не наблюдается. Эти данные позволяют предположить участие лектинов: в защитных реакциях растений при действии: вирусного'патогена и могут быть использованы для диагностики степени' устойчивости^ ' ■ .

7 В листьях здоровых и инфицированных ХВК и УВК растений картофеля содержится группа белковых веществ', ингибирующих серологические свойства вируса посредством взаимодействия о рецепторами на поверхности вириона. Наделенные ингибиторы пред-! ставляют- собой белки с,молекулярной массой 30-100 кДа, возможно, имеющие олигомерную структуру. Предложена методика количественного? определения этих веществ на основе ингибирования реакции иммуноферментного анализа растительных вирусов.

Список работопубликованных по > томэ.-диссертации .

1. Еабс^а "A.B. Изучение механизмов 1се<у1Ш0.1 реакции растений -картофеля на заражение-Х-вирусом/Селекция■картофеля - на иммунитет и защита от-болезней и вр0дителёй^гМ.71б86.-С.50-58. "

2.*: Ллдыгага U.E.', Eatfcäa-А.3.;;Роль ' белков* а. индуцированной ->;; устойчивости картофеля":к ?вирус1го^ ' Всосоюзн. ■.• • совещание по 1ао.,71игтету;*сел^скохозяйствеШйс<:растений,к бо-.' .лезням и вредителям:"-Тез. ^докл^

3.. Бабоаа А.З.Ладыгина ;:Т£оф:;мец;Л,Н. Антивирусная . -"активность белков .картофзля, йндоц;фовакная вирусной инфекци-

4. Бабсла A.B.- Ингибиторы .серологотеской;реакции вирусного антигена в листьях* картофеля//Проблеш совреме5шой биологии: Тр. "19 .науч." конф. ;ыол'; 'ученюсГбйбл* ^фак.:;ыГУ.-X ¿МГУ, 1968.-Ч.3.-v C.I85-I89.- Деп,- в ВЛНГГЛ24.С8.83> C7I2-B38.' б.'Еабсха А.В/*Ввделенме лектинов;из" листьев.картофеля// Пути-. ;развития картофелеводства: Материалы \конф.":мол. ученых ;Ш0 по-картофолеводству.-Коренево Московской -обл.-1987.-С.354-359,-Деп.- в ЕНИПТЗИагропром* 20.'09.68 " . • , '

6.: Бабоаа A.B., Ладыгина. U.E. Антивирусное действие интерферона в-растениях картофеля/.Селекционно-генетические,.физиолого-биохимические и технологические аспекты производства картофеля Тез. докл. научно-производственного совещания.-Уфа.-1989.т< ; . С.85-86. - : . . ' _ . •

7. Бабоиа A.B., Ладыгина М.Е. Изменение активности'пероксида-зы и рибонуклеазы в листьях картофеля при .инфицировании виру-., сами/ Там же.- С.86-87. . " . ,

Л-32356 19.04.89 г. Объем I1/« п. л. Заказ 1024. Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550, Тимирязевская ул., 44

Бесплатно