Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологическая характеристика штаммов LISTERIA MONOCYTOGENES, выделенных из различных источников, и их типирование

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая характеристика штаммов LISTERIA MONOCYTOGENES, выделенных из различных источников, и их типирование"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА И. Ф. ГАМАЛЕИ

На правах рукописи

КД/ЧКЛЬ ЛАТВИИ!

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ LISTERIA MONOCYTOGENES, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ источников, И ИХ ТИПИРОВАНИЕ

(03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Научный руководитель— доктор биологических наук И. С. Тартаковский.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И. В. Раковская; доктор биологических наук, проф. М. Н. Бой-ченко.

Ведущее учреждение — Российская академия последипломного образования МЗ РФ. *

Защита состоится /¿СсЛ^влА^ . . 1995 года

в . &. . . часов на заседании диссертационного совета К 001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН (123098, г.Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан . . ^^ .... 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета — доктор медицинских наук

Е. И. Коптелова

Актуальность темы.

В настоящее время, в связи с антропогенной трансформацией внешней среды, повысилась роль возбудителей сапроноэных инфекций и,в частности, листерий в инфекционной патологии человека. Как известно возбудитель листериоэа- L.Monocytogenes f-чг swiы«« ло 70 дет назад, оля»**-, «, ¡»1г\»г-;п1и годы проблема листериоэа вапт ^¡¡ооьйлз "-^уалькссть.

В конце 80-х годов в ряде стран (СИЗА,Швейцария,Канада и др.) бьши отмечены многочисленные вспышки листериоэа у здоровых людей, связанные с употреблением в пищу инфицированных продуктов (молоко, сыр, мясо, овоши), а также внутрибольничные инфекции. Смертность при этом достигала 30-50Х (Farber, Peterkin, 1091).

Официальная регистрация листериоэа в России проводится только с 1992 года, тем не менее, данные различных авторов полученные, с помощью серологических методов, указываю- на значительный уровень заболеваемости этой инфекцией и на широкое носительство возбудителя у людей.

Род LISTERIA в настоящее время включает в себя 6 видов, широко распространенных во внешней среде, иа которых L.monocytogenes и- L.ivanovil являются патогенными для человека.

Отсутствие эффективных методов диагностики, чувствите. jHHX и специфичных систем для типирования штаммов листерии затрудняет эпидемиологический анализ инфекций, вызванных этим возбудителем и поэтому в последние годы делаются попытки использовать молекуляр-но-биологические методы (рестрикционый анализ, ДНК-ДНК гибридизация)."

Изучение L. monocytogenes как факультативного внутриклеточио-*

ю паразита и вызываемой им инфекции давно проводится , в разных

странах. Однако, остаются невыясненными ряд вопросов, касающихся биологических•особенностей и поведения листерий в разных объектах, а также эпидемиологии'листериоза. Известно, что L.monocytogenes относится к условно-патогенным микроорганизмам, поэтому риск заболевания листериозом зависит как от состояния макроорганизма, так и от степени вирулентности возбудителя. Особый интерес представляет вопрос о патогенных свойствах листерий, выделяемых из продуктов питания и окружающей среды. В этой связи совершенно Счэвиднз необходимость современных .истем для типирован.ия штаммов данного возбудителя и разработки аффективных методов диагностики листериоза.

В связи с этим, целью настоящего исследования являлось типи-рование штаммов L.monocytogenes на основании изучения биологических и генетических особенностей для оценки их эпидемической значимости. ' ■ Задачи исследования

1- Отработать условия выделения листерий из различных источников..

2- Типировать выделение штаммы L.monocytogenes о использованием специфических сывороток и бактериофагов.

3- Исследовать вирулентность и-'биологические характеристики выделенных культур на различных экспериментальных моделях.

4- Отработать условия для выделения плазмидной ДНК из листерий и изучить плазмидный состав исследуемых штаммов L.monocytogenes

Б- Провести рестрикционный аналиа хромосомной ДНК о использова-' нием рестриктазы, позволяющей четко -дифференцировать рестрик-тограммы вы*¿ленных штаммов.

В- Провести анализ различных методов типирования листерий в плане их использования для оценки эпидемической значимости выде-

ленных культур L.monocytogenes.

Научно-практическая новизна работы

- Разработана схема выделения штаммов листерий из различных источников,позволившая выделить 128 культур L.monocytogenes из клинического материала, продуктов питания и сточнн* г. "^кь»

- С помоги,m ""-zz'.umju*!""?'. т.т.'^ыло. что гыдс-лйнные из разных ичтотг:г.С2 ¿iift^ia откосятся к 4 серовзрам: 1/2а, 1/2в, 1/2с и 4в, иэ них наиболее часто - 62Х культур относились к серовару 4в и 32Z - к 1/2а. Результаты серотипирбвания коррелировали с данными фаготипироваяия.

- Выявлено, что наибольший процент высоковирулентных штаммов, выделенных из клинического материала, относились к серовару 4в (54%) и 1/2а (40Х), иэ пищевых продуктов и окружающей среды - к 4в (76Х).

- На основе модифицированной методики выделен1" плазмиднсй ДНК из штаммов листерий было установлено, что только 12 из 128 выделенных культур несли плазмиды молекулярной массой от 15 до 39 од.

- Рестрикционный анализ хромосомной ДНК штаммов L.monocytogenes с использованием рестриктазы Eco R1 на ochc-s пульс-электро-йпреез позволил отнести рестриктограммы высоковирулентных штаммов L.monocytogenes серсвзра 4в к 1 и 2 типам, а серовара 1/2 - к 2 и 3 типам.

- Сравнительное изучение различных методов тиг.-.рования листерий (серо- и фаготипировзние, анализ ллазмидного состава, рестрикционный анализ) показало, что рестрикционный анализ на основр пульс-электрофореза в сочетании о серотшшрованием позволяет эффективно дифференцировать потенциально опасные для людей штаммы L.monocytogenes.

Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции Отдела медицинской микробиологии НИИЭМ ш.Н.Ф.Гамалеи РАМН 30 мая 1995 года. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи. Материалы диссертации доложены на Всероссийской конференции по проблемам листериова (1993 г., г.Покров), на Международном симпозиуме " Пищевые эооноэы-'' (1995 г., Москва), на 7 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (1995 г., Вена, Австрия) и на 12 Международной симпозиуме 'по проблемам листериоза (1995 г., Западный Перт, Австралия).

0Г,ьем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 114 страницах машинописного текста, иллюстрированы 2 схемами, 13 рисунками и 11 таблицами. Диссертация состоит иэ введения, обвора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 113 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Использованные штаммы

В работе были испольаованц-штаммы Listeria, характеристика которых приведена в таблице 1. '

Выращивание культур проводили на следующих средах: питательном, 'триптозном (Дифко), мясопептонном (производства НИИЗМ •Йм.'Н.Ф.Гамалеи) бульонах и агарах, жидких и плотных средах на ос-'taffie'триптического соевого перевара, сердечно-мозговой вытйжки •(ДЩха) и перевара Хоттингера (производства НИИЭМ им.Н.Ф.Гама-йёи), агаре Энди(производства КИИ питательных сред, Махачкала), питательном агаре с феноловым красным, кровяном агаре и L-буль-оне (Дифко).

Таблица 1. Характеристика использованных в работе штаммов

Изученные штаммы Сер-овар Фаго-вар Вирулентность при тестировании с помощью Образование гемолизина Источник получения

внутрибркшшн-ного заражения мышей К.К *

Ь. топосу^гепез ' ■ 1 ! „г. ! \ Германия

НСТС 7973 |1/2а Л-2а

1 /8а п «V, 1,6.10^0,25 1+ 1+

11СГС Б5143 1/2а Л-2а 3,2.107+0,25 4+ 1+

НСТС 5348 1/2с Л-2а 3,2.10б+0,3 ■ 4+ 2+ — И«.

МСТС 5214 4а — 2,3.10в+0,25 4+ 1+ —

НСТС 10527 4Ь Л-4а 1,8.106+0,3 4+ Н

НСТС 19117 4Д — 3,2.10'+Р,25 1+ 1+

12 1 Л-2а 2,3.10®+0,3 V 2+ лабора- ' торная коллекция

138 1 — 3,2.10®+0,25 4+ 1+

КОСТЮЧЕНКО 1 Л-2а 2,3.105+0,3 4+ 1+

НЕЛШОВА 1 Л-4а 5.6.10б+0,35 4+ 1+

21 1/2а Л-2а 3,2.105±0,35 2+ 2+

616 4 Л-4а 5,6.105+0,25 4+ 2+

1.. 1ппосиа ЗСсС 3379 6а — 3,4.10® - - Др.СоеЬе!, Германия

ЯЛС 3723 6Ь — 5,6.109 - - —

1лз1еПз ввеИгеП 5 Л-2а 3,2-10® - 1+ Др.Зее..»-вег. Германия

Щзяазчание: {*)- кератоконьюнктивалъное заражение морских свинок Не?ода

Биохимические свойства штаммов листерии исследовали на инди-агсраоа среде, с феноловым красным с добавлением различных суСс-разка:тгшоэы, ксшюга, мазатоэы, галактозы,' салицина, сахарозы,

. инозита, дульцита, , машина, глицерина, а также о* помощью АР1 20 -(Ь1о МеПеих,Франция).

-Антигенную специфичность выделенных культур ЛЛ^егЦ определяли обп^пргаятыи методом агглютинаЦии на стекле'оиспольгованием специфических типовых сыворотрк. (Дифко). V- ■ •

• Чувствительность к антибиотикам тестировали с помощью метода; двукратных серийных разведений в жидкой й на плотной питательных '¡' средах (ТБ и ТА), как описано в работе Фоминой И.Ц. и Навашина I.. I. (1991). Также, чувствительное.о к равным антибиотикамбыла исследована с использованием АРI системы (Ь1о Мег1еих).

Гемолитическую активность выделенных культур листерий исследовали- на штатной среде СМВА' и на кровяном агаре о добавлением БХ .. эритроцитов Сарана и кролика. Учет проводили-черва',?*часа в те- ' " чение нескольких суток по измерению дйаыетра аон - гемолиза (бо-; лее 5 ш проСЕетление-силькый гемолиз). ; : " ' 1

Получение лизатов бактериофагов, используемых в работе и.-'.'. оценку чувотвительйосгя к ниц, иооледуемых культур осуществляли! согласно способу , оайсавйОцу Миллер Дж. (1976). .

Биологические ■■•-.'■"''

" ' 4<ше<Ш^Й^^ЫуЬконьюн1СТ>йадьная проба на морских свинках - •'.,'• вьт^ШйЙ^/^'МйбЙйб^ранее (|(а1оу1сН В., 1993).Реакцияоцени- • валаоь выраженномкератоксжьгактивите с возможной

гйбяяйь , '"положитель ная-умеренный кератоконьшктивит.

;Ш№^№йниое и внутривенное заражение мышей проводили ЙУ-'тек "ЭД^Щрбвания животных разведениями культуры (0,6 или 0,2 ил 1В агаровой культуры в физ.растворе) ' в брюшную полость

ЙЙ1 "йоотовую вену. Результаты учитывали-; через 21 день с последу-. Чйзйм определением 1.050. ■ ',;' .

Мод екулярно-биологические и генетические методы

Выделение плазмидной ДНК ^ ... .. у г' "'

... : Исследуемые культуры L. monocytogenes выращивали в жидкой питательной среде при 37°С в течение 18 часов, отмывали в 0,01 М „ фосфатном' буфере jpH 7,0 и

^.^C^lítíi'.-^P^íSJTíSbebh-é^?)^' "инкубкрсзали при 37°С 40 мин,- . добавляли 0,25 U ЭДТА (5 мин во льду), 20Z SDS в ТЕ буфере рН 8,0 . 10 мин инркубации при 55° ) и 0,25 мл ЗН. НзОН. Лизат культуры ак- . . куратно перемешивали и ..увеличивали объем до 2,95 мл.;'Далее, до-,' Савляли 1 мл 2М Трио НС1 рН7,0, 0,65 мл 2GX SDS в ТЕ буфере и 2,5 мл 5MNaClc последующ пёреметиванием смеси; й инкубацией ее в течение ночи при- 4°С. Препарат центрифугировали при 4500 об/мин 90 мин.при.4°С и к супернатанту добавляли РНК-азу. Далее, препарат последовательно обрабатывали равным объемом насыщенного фенола, смесью фенола с хлороформом (1:1), смесью х.--роформа с изоа-миловым спиртом (24:1) с последующим центрифугированием образцов после, каждой обработки и отбором водной фазы. ДНК осаждали двойным объемом 95° этилового спирта в присутствии' 'i/10 ЗМ ацетата натрия и выдерживали при -20° s тс-чс-пие ночи. Образцы центрифугировали (4500-об/мин, 90 мин при 0°С. Осадок промывали 2 раза 70° ^суспендировали в 100 мкл ТЕ буфера и исследовали путем s зктро-форега как описано ниже.

Выделение хромосомной ДНК проводили как оь.сано в работе Meng-aud J. et al. (1988). . .•-•." рестрикционный анализ ДНК проводили с помощью зпдонуклеаз , Eco PI, Hind .Hi,Hind 11,Pst 1,B?1 .1, Нра 1, Not 1, Ваш HI,Acó 1, Sfi i проиаводства Amersham. Реакционная смесь, содержащая 34 мка бидистидлированной воды, 5 мкл соответствующего буфера 50-кратно-

го, 10 мкя ДНК и 1-3 ЕД рестриктазы, инкубировали при 37°С в течение 16 часов. В качестве контроля использовали ДНК бактериофага , обработанную в тех же условиях, что и ДНК исследуемых штаммов. Реакцию останавливали добавлением 0,5 М ЭДТА рН 7,5. Далее, обработанную ДНК с красителем вносили в гель и проводили электрофоре-тическое разделение фрагментов.

Злектрофоретическое разделение молекул ДНК проводили согласно рекомендациям Т.Маниатис с соавт.(1S84).

П.'льо-злекжрофореа осуществля. t в условиях, описанных Lay Е. и др.(1S89).

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятым методам, определяя достоверность различий по критерию Сть-юдента (Урбах, 1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ . 1. Подбор оптимальной схемы для выделения культур лиотерий

из различных источников Нами была поставлена задача подбора оптимальных питательных сред для культивирования лиотерий-и набора ингибиторов для приготовления селективных сред с цедью аффективного выделения культур %и6терий от больных, из пищевы/ продуктов и окружающей среды,

В работе нами был использован 'штамм L.monocytogenes NCTC 7973 серовара 1/2'а (представители которого наиболее часто вызывают дистериозную инфекцию у людей), отобранный нами на' основании исследования свойств имеющихся у нас культур лиотерий и характе-ризирующиися высокой вирулентностью для мышей при обоих способах заражения и для морских свинок (на кератоконьюнктивальной модели) и продуцирующий ряд биологически активных веществ ( та^.,1).

Предварительно,-иамиу 6ыла:'-изучена■ скорость' роста исследуемых " штаммов на различных средах с использованием биофотометра фирмы Juan,который п(»всШЯ-;о11,еюй|ЗЯ5'-'йймл'генерации культур лиотерий. Так, - было установлено, что наиболее эффективной средой' для ,. ..кулцзтивированта.'Листё&ий бйла среда-,'на'основе• •

-л^ерйвлги • рос?' среды на ос-^ой« тртаТ}?ческого .перевара, (ХСБ> й- бульона Хоттингера, а наиме-\' нее питательна.«! средами 'были, среды, типа мясопептонного (МНЕ) и

тркптознсго бульонов (ТВ). . . ' \ ' "'

:" Нзми,также, были протестированы- в предварительном исследовании :ряЯ'аэтимйкроф^'кислота, цикдогок 'полшкксин"'В', колнотин и теллурит калия), взятых для приготовления селективных сред с использованием различных штаммов листерии, 4 а также представителей других видов микроорганизмов, часто входящих в состав микрофлоры и с :чно затрудняющих проведение идентификации культур 1 листерии на уровне колоний (E.coli, Klebsiella, Streptococcus, Staphylococcus) с целью подбора оптимальных коцентращш, .не,, подавляющих 'жизнеспособность - ;;ку^тур.-лиоте'рий. Экспер^ёнты' прп«>дя2йсь ка'различных средах.

На основе полученных нами результатов были отобраны„„анткмнк-,• робные,,.препараты -(в'оптимальных концентрациях), ■ включала. е нали-, 'V дикеовую кислоту (30 мг/л), акри$2зазш • (30 мг/л),.. цйллогексимид (2ДО ш,/л)»:.' полн)«ккс:;н' В (20' мкг/мл) и колистип (16 мкг/мд), которые мы использовали для приготовления селективных- сред в- 'даль-•лнейших исследованиях.

При проведении, сравнения ^ффе»аивйроти-укюаШй;''^атвяьны*' • -; сред и приготовленных на их основе селективных сред для выделения : листерии, нами сшш инфицированы жйдю1е среды, одновременно куль- ■ турами •E.coli 212, ; К.pneumoniae 46,,Str.fecalis 0G1S и Staph.au- "

reus 83254 в концентрация' Ю7 м.к/мд и L.monocytogenes NCTC 7973 в концентрации 100 и. к/ил. Прямой высев взвеси бактерий на селективную среду не позволял выявить колонии листерии из-за низкой концентрации культур листерии и значительного числа колоний дру- . г их видов бактерий. Поэтому нами была использована комбинация селективного и холодового обогащения. Предварительно, взвесь бак-' терий разводили в свежей питательной среде (в 10 раз) с добавлением селективных антимикробных препаратов или без них, подращива- , ли при 3?°С в течение 3 и 24 часа к выдерживали при +4°С в течений нескольких месяцев. Периодически проводили высевы на селекти-ную среду каждые 10 дней.

Было показано, что предварительная инкубация суспензии бактерий при 37°С в различных питательных средах вне зависимости от ее длительности (3 или 24 часа ) не позволяла выявить рост листерий в течение недели от начала выдерживания при температуре +4°С. Можно предполагать, ' что эти результаты обусловлены присутствием значительного числа посторонней микрофлоры, так как наличие антимикробных препаратов (налидиксовая кислота, циклогексимид, по-лимиксин В, акрифлавин, колистин) в"жадной питательной среде в течение срока наблюдения (одна неделя, один месяц, два месяца) приводило к элиминации посторонней микрофлоры практически во всех случаях, за исключением образцов, инкубировавшихся в ШВ.ТСВ и Cl.EE в течение одной недели, а для ТСБ - один месяц.

Удлинение времени инкубации при температуре +'4°С в средах (кроме МОЕ), несодержащих антимикробные вещества, до одного месяца приводило к обнаружению листерии на селективных средах, что было связано со способностью штаммов L.monocytogenes расти при низкой температуре. Другим фактором позволяющим выявить колонии листерий на селективных средах было снижение количества постороц-

ней микрофлоры, связанное с ее гибелью при инкубации в условиях низкой температуры. Среды ТВ и бульон Хоттингера, в максимальной степени обеспечивали условия для выделения листерий, стимулируя размножение листерий и гибель других микроорганизмов, используемых нами в этих экспериментах. Более длительна „¡и:» iiiifue-ш«??? С-и наийгам ггЫДеЛСННЯ листерий на средах ТВ, СМВБ и бульоне Хоттингера. Присутствие антимикробных препаратов в значительной степени усиливало селективные возможности сред в отношении выделения листерии.

На основании разработанной нами схемы (рис.1) были выделены 128 культур L.monocytogenes из клинического материала (93 штамма), продуктов питания (25 культур) и сточных вод (10 штаммов). 2. Серотипирование и фаготипированис штаммов L.monocytogenes, выделенных из различного материала Выделенные нами культуры L.monocytogenes бы—' типирсваны с использованием моноспецифических сывороток. Результаты типирова-нця штаммов приведены в таблице 2. Все исследуемые штаммы относились к четырем сероварам: 1/2а, 1/2Ь, 1/2о и 4b. Наиболее часто среди выделенных культур обнаруживали этаммы серовара 4b (62%), в меньшей степени встречались культуры серовара l/2a (32%), редко nrsiisi серовара 1/2Ь (4,5X) и 1/2с (1,5%). Штаммы cepoi ^a 4Ь также преобладали в группах культур выделенных из пищев-л продуктов, окружающей среды и клинического материала , 2%, 60%, 59%, соответственно). Однако, следует отметить, что среди всех выделенных культур, только среди изолятов, обнаруженных от ноБорп*-леияцх детей, почти с равной частотой, встречались штаммы листерий, относящиеся к серовару 4Ь (46") и 1/2а (3S7.),

Для фаготипироваяя в кашга экспериментах были использованы два бактериофага - Л-2А я подученные из НИИ ветеринарной

разведение 1:10 измельченного или гомогенизированного , образца в трипт031юм бульоне или бульоне хоттннгера ;

с селектив1шш добавками у ü ' 'у

инкубация при 7 в течение 24 часа

процесс хол0дового ОБОГАЩЕНИЯ при :.+4'Чс --, -. ';.'.>■.'',] ( 2 месяца) г

периодические высевы на селекп.лшй ПОДШЗШШЙ ДГДР ИЛИ ЛГА4 хоттщ1гера содержаще

за ма/л налидиксовой'кислота 200нг/л циклогексимида

30 иг/л акрифдавийа 16 иг/л палимиксим в,

otvop п0д03ритель1шх колоний ' ' " ¡I' 4

МОРИШГМЯ свечение в юсолдядацш, ЙЙЙЕ

; /цеюмШЦёШ'Ш'-'-töasus у' s-v'://" Рис.1. Схёма"ввдеде^''тхашо8-листерий'ги0 разд%ных; материалов

. .. . , -vj.3- ".....• •

' f ¿блица 2 ' .....-•-

Соротиттрование и рострикционшД диалиа штаммов L.Ronoayt.OEenes после обработки хромосомной Д11К эндонуклеапой EcoR. I

Происхождение., выделенных штаммов Серо- ¡Число". - , : -;.> Тип1 рестрикто'грамм

сиуа кых штзмм0в I | II | IИ J IV | V ..

Клинические . 1/2а 31 3 : 9 .'*-".'i — • . *"* »

'1 ' -■-1л-л»*1 . - -■ ■■■■i '' ■ -1 --- i .-. 1 ' ' ; ; 1 -

• 1/2с 1 - . - i

- 4в - 55 29 íG 2 8 -

Пшца,- .1/2а 7 ; ■■ -- 1: - 2 з i

4Е - - 18 ; ю 5 . 1 2 --

■Окружающая . - •; -. среда :'.- 1/2а 3 1 1 -V. i .; -

'• ■'!■'Йс ■' ■' 1 " - - i

' 4в б 4 1 - i . I

------L----—-----:_1--;__i_

микробиологии и вирусологии (г.Покров). л псмсцью которых мы ти-• пировали выделенные нами'культуры L.rnonocytog-enes.

Было установлено, что только 75 культур (59%) лнвировались с использованием указанных^бйктерпсфагов. • Айааогичныё данные были ^ ■ получены нами;'-в-, отношении кляптгеских'культур (62%) и культур, "вцц'еленных из пищевых продуктов (55%). Однрко, -только зих штаммов выделецкы:: -из оточньйс': вод - были чувствительны-'к, указанным бактери--офагзм. .Следует-Отметить','*^^ з осно-

. вном,..культуры,-. 'Откпйй'щиеся к первому серовару (58%), тогда как к бактериофагу Л-4А были чувствительны .-штаммы"-четвертого ' серовара ,, (59%)V ' А -'■•• '

Большое количс-стви культур, .ЗЭ-шта1^а;-(41%) . 'были... не ' чувс-.-. у твитёльНы к обоим- бактериофагам','* что подтверждает, имеющиеся в ли-тературе''данны? (Loesner и др,'(Г<90)> .Это является отрицательным

!.i"?,-:&HTOM в использовании этого метода подразделения лиотерий на фзговары. Важно также отметить, что чувствительность к указанным бактериофагам коррелировала с их принадлежностью к первому и второму сероварам, хотя, как было показано ранее, бактериофаг Л-2А лиэировал типовой штамм пятого серовара L.seeligeri, а штамм Не-лзобова первого серовара был чувствителен к бактериофагу Л-4А.

Необходимо отметить, что использованные нами бактериофаги являются типипующими, йо не оероварспецифическими, о чем свидетельствует высокий процент нечувствительных культур L.monocytogenes.

3. Вирулентность штаммов L.monocytogenes выделенных из разных источников

При исследовании вирулентности выделенных культур было показано, что все иголаты характеризовались положительной реакцией в тестах внутрибрюаилного ы внутривенного заражения мышей и керато-коньюнктивальной пробе для ыорск : свинок. Однако, степень вирулентности исследованных культур L.roonocytoger..-s на указанных моделях зар*провала. На»-- был проведен анализ изолированных штаммов L.monocytogenes относительно их вирулентности и была выделена группа культур, характеризовавшихся высокой вирулентностью. В качестве критерия для оценки штаммов L.monocytogenes по уровню вирулентности были выбраны LD 50 при В/Б и в/в заражении, составлявшее 10° и Ю5 ы.к^М, соответственно и резко положительная реакция в виде кератококькнктивита у морских свинок. Необходимо отметить, что степень вирулентности еыдеденных штаммов для мышей при В/Б-ом заражении коррелировавс таковой при В/В-ом.

При изучении вирулентности для мыхей 128 исследованных штам-

Таблица 3

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ WTMWB ¿..monocytogenes ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ОБЪЕКТОВ

Происхождение штампов Процент высоковирулентнцх штаммов при заражении" Процент штаммов образующих*

высокий дкмпимэт«;- деиггги-

мышей | морских го»»^-1 «<|ЭОГ

«........... Г^лплпЧ- еские С5 X 4fl X 19 X 49 X 43 2

Пищевые продукты Б4 X 40 X 12 X 40 X 44 X

Окружающ ая среда ВО X 40 X 10 X 30 X 50 X

Общее 64 X 47 X 17 X 46 Z 44 X

Примечание.* - процент культур указывается по каждой группе штаммов мов L.monocytogenes было показано (табл.3), что более половины культур (64%) характеризовались высокой вирулентностью на этих моделях, причем сходная частота выявлены высоковирулентных иэо-лятов (В5Х) наблюдалась и среди клинических штаммов. Э этой группе наиболее высокий процент высоковирулентнач. культур L.monocytogenes обнаруживался среди штаммов, выделенную Соллиых с дис-бп-'гтгриоэом (80%). Значительное число такого типа культур Силе выделено от здоровых лиц (71%) , от беременных женщин (68%) и, также, от больных о дефектами иммунной системы и новорожденных (по 61%). При исследовании других выделенных нами штаммов было отмечено, что частота обнаружения культур с высоким уровнем вирулентности среди штаммов из пищевых продуктов и окружающей среды, была сходна с таковой преди ¡слпкическнх культур (64?.), тогда как менее часто такие изоляты обнаруживались среди культур из окружающей среды (50%).

Среди клинических культур с большой частотой выявлялись вы-

соковирулентнке.штаммы '^ni^ocytöfehesi'г^отйоояй^вес^.• )?вровару;;'.' 4b (54%) , чем l/2a ,(40a) . . Для; группы йеоляг'ов иэ/тщевых.'предук-' тов и окружающей среды выеоковирулентные штаммы значительно чаще *•.' . выделялись среди' /представителей серозара ¿> (76%), •■ чем • 1/2а - у (24Х). '.

При исследовании вип7лёнтности' выделенных' нами .культур - Ь'.то-nocytogenes с . 'помощью.;' '-кератбконьюнктйвальной /.'пробы' на'морских • свинках было .показано4,;'., .реак~:»'¿'

. цию' на этой 'модели,'-:.однако, её-выраженность'(от'слабой'реакций в у:<\ виде кочьюнктив'ита до: тяжёлого , керотококьюнктивита':.с./> последующей ;'.V,; гибелью ливс-гних) рвзтчёжась - ыежду штаммами; Было'.устзлоьле-'..' ' но,что -ifji ."вЬех выделенных. .культур/ вузываян- "даелую '.¡реагауцо'-./'-'у-';,;,./ морских свинок (тзбл.З)'.-,,; ОднакЬ; -резко '.¿ыралшкн'^;\реагада'Гв этом íecie не коррелировала -с •'виюфой;'/ 'в^адлевдсстаю'' -.и^едоваиных •■;■> . культур-дистерий для' швей,'..'так.'как"тольга;48% штаммов;- .выделен-. 1-.г ных иэ-. различных истстнгашв: и '«^aiCTfр^вав^с?.'. товшвннрй;.; виУ рулентностью для мышей,'.--вызывал:-; сильную реакцию в керзтоконьюк-тивальной лробе. - '..-', -•'.'..;.-' •:.•'■' 'J;'. ■.'"- •.'-.'С;--;-'-, '•'• *"'•'",.'•.•. ■':/■;''

■ . При,-анализе ■ХйЩ№,?сю1>:гЫ?зм4ов' было-яо1^ш0у:-дао.:.-к0^1чест7,', ... во иволятов' • L.rí.cnccytcgcr.es, вызывавших;■„•тяжелую 'реакцию (4+;) у • • морсгезс сеянок,", составляло;-48%: Также " не- было отмечено.-.корреля- -';';. ции между ..вирулентностью-' этих тсудатур,'^ля 'мышей' -.и,'- для -.'-юрских-;.';,: овинок'--'-;54Х . высоковируленткых .шташ0в:-&вя Ишё&' о&адаВД/Лошг^. шенной вирулентное?:" для морских 'сепнок. Не. бкзй' обнаружено связи- меадувирулентностью ^кадничеоких щаШов..й;,их 'лринА5лежйостью'.- -: к раалшным_Ссроварам.'. .v.í '.-'.;.-; "• ■•"'' ;.-■;. - ;..'• / i:';".--./ •''-;-;-"; •'Ч'; -v- ;'" Что .касается'.-'штаммов.L;ifr*-tocytogeh'es,•:' выделенных,-.''из.■■падевых.-''V продуктов ц окружающей.' рреды, то. количество кугь'тур, лр^вхяюфж -;

высокую вирулентность в тесте для морских свинок, было ниже, чем в случае клинических штаммов (по 40%), причем количество культур листерий, обладающих, также, и высокой вирулентностью для мышей, было значительно ниже, чем в случае клинических штаммов (37% и 20%, соответственно). "

*. »'-i7'0.w""'"j:.::: L.monocytogenes биологи-

чески активных веществ и чувствительность к антибиотикам Установлено, что только небольшое количество штаммов листерий, выделенных как из клинич< чого материала, так из пищевых продуктов и окружающей среды, характеризовались высоким уровнем продукции гемолизина (2+ и 3+) (19%, 12% и 10%, соответственно)'.

Не отмечено связи между штаммами, обладавшими значительной гемолитической активностью и их принадлежностью к серовара Также не выявлено корреляции между высоким уровнем продукции гемолизина и высокой вирулентностью для мышей " морских свинок, как в группе клинических штаммов, так и в группах шхаммов, выделенных из пищевых продуктов и окружающей среды.

При исследования продукция изолированными нами штаммами других биологически актив»«- ггщ-огь - лецитинаян и липагы, kctuj иг ¡«»•.•д-г рнпчение для варул*и1нссти L.iccr.-c;yici*e»es (Cossart et а!.,1У94), было установлено, что около половины всех изолятов образовывали децитиназу и липазу. Корреляции межлу ярсасяшденкем штяш/по> сероваром, вирулентностью и продукцией биологически at liianw;, нехеетв не выявлено.

Иольппшствс штаммов L.monocytogenes характеризовались чуво-тьитсльвоотью к следующим антий: тикам? аэлоциллину, ванкомицину,. мандокефу, триметоприму, цефатаксиму, цефалоспорину, хлорамфени-колу, цефалор -дину, ампициллину, - доксициклину, ,рифампицину,

стрептомицину, меглциллшу и эритромицину. Однако часть культур, характеризовалась умеренной устойчивостью к некоторым антибиотикам - ампициллину, метициллину, триметоприму-и. цефатаксиму (МИК. : была в 2-3 раза больше, чем у чувствительных культур). Такие культуры листерий были обнаружены среди штаммов всех, исследован-ных-групп (по 1-3 атыгыа в каждой группе) . Появление такого типа резистентных культур L.monocytogenes может- быть связано, с их толерантностью к этим, антибиотикам/: ...■•' ф ". '.. " '• J ■. . .'

Не было выявлено, корреляции мевду появлением, - устойчивых культуо листерий," их происхождением,и сероваром.Оценка.чувбтви- :■; :;•' тельности к' антибиотикам была -проведена- нами также' для выявле- -ния вс моаных маркеров с целью использования их при, выделении L.monocytogenes из различных источников '(резистокширование). .;■

5. Изучение плаамкдкого состава выделенных штаммов L.gpno- :' cytogenes '■ - * -1' = ,■'" :'•.'/■.' . ' : '-'•'.

При анализе образцов.ДЙК.'вы,- зленных штаммов с помощью элект- ■-/. рофореза в 0,77. агарозном геле ■ было ■ обнаружен - у 12 культур кали- . чие плазмид с различной молекулярной массой. У восьми плазмидсо- '-, держащих культур "L.monocytogenes была выявлена идентичная плзами- . дная ДКК'с молекулярной массой 39 МД.' ./- ...

Молекулярную массу очищенной, в хлористом цезии плазшшнои. -ДНК оценивали с использованием рестрикционного анализа с эндонук-леазами Hind III ' -* ЕссР. I. Молекулярная масса плазмид в других штаммах L.monocytogenes'составляла: 15 Щ у штамма 324, 23 Щ - у 221 и 29 Щ - у штаммов 204 к 259. V" ' f, :

При .:зучении возможной ~вязи'содержания'плазмид в культурах с источником их выделения, сероваром и биологическими " свойствами

-нами было установлено, что большинство штаммов, содержащих плаз-миды (11 штаммов), были выделены из. клинического материала и . только один из сыра. Более половины (7 штаммов) культур L.monocytogenes относились к серовару 4Ь, меньшая часть (4 штамма) к серовару 1/2в , а только плии " *"~~~.~.г,—-и--^ ««« ;

" к'.иеровАлу Л-/Sa: " Пспти ügs-культуры (10 штаммов), несущие . . плазмидную. ДНК с различной молекулярной массой, характеризовались , высокой вирулентностью для мышей, половиьа. обладала высокой вмру-лентностью как.для мышей» так и j г морских'свинок, и только один ' плазмидсодержащий штамм, ■ выделенный из сыра, обладал низкой виру. лентноотью. ; . *

6. Рестрикционный анализ хромосомной ДНК выделенных '• таммов L.monocytogenes

Предварительно проведенные нами эксперименты по рестрикции хромосомной ДНК типового штамма L.monocytogenes 7973 серовара 1/2а рааличными' рестриктазами: Есо RI,Hind III, Hind II, Not I, Bam HI, Bg-1 l,Bgl ll.Sfi 1, Acc I и Hpä 1 показали, что они обра.' зуют мелкие фрагменты (Ёсо"1,Н1па 11, Hind III.Bgl I и Hpa I), крупные (Acc I и Sfi I) или не действуют на ДНК (остальные рест-риктазы) , хотя мы не исключаем, что отрицательный результат может .быть связан.с отсутствием активности этих ферментов. '■'■■• Нами была выбрана рестриктаза EcoR J для рестрикционного анализа хромосомной...ДНК,выдеденныхгкультурХ.monocytogenes, так ' как она образовывала четко различающиеся фрагменту, п?с б некоторой степени упрощало визуальный - анализ полученных рестриктограмм.

; Следует отметитьt что наиболее оптимальной для сравнения была область, ре грйктограмм,. вкточающая фрагменты q молекулярной

массой от 13,6 до 23,1 кб, так как в этой области были четко вы-р лсены полосы, . наличие которых отмечалось не у всех штаммов, а также выявлялись дополнительные полосы, которые могли позволить более тонко дифференцировать укзэаняые штаммы.

При анализе всех рестриктограмм выделенных культур L. monocytogenes наш было показано, что они разделились на 5 групп в зависимости от количества и выраженности полос в указанной области (риа.2, табл.2). Было показано, что рестриктограммы указанных

Тип рестриктограмм

I II III IV V 2Г,1 , - --— -

13,6 - - -— - - -

Рис.2. Типы рестриктограмм выделенных, штаммов L.monocytogenes

штаммов наиболее чйсто относились к первому и второму типам, менее часто к третьему и четвертому , а только 3 культуры относились к пятому типу.

Рестриктограммы хромосс ной ДНК штаммов серовара 4Ь относились, в основном, к первому типу (54Х), тогда как почти половина

(44%) рестриктогрзш хромосомной ДНК штаммов серовара 1/2а принадлежала к третьему типу. Во второй тип входили с равной часта-той рестриктограммы штаммов L.monocytogenes серовара 1/2а и 4b (27% и 28%, соответственно). Часть рестриктограмм штаммов серова-ров 1/2а (20%) и 4в Cl4t^ - -¿^ыиЛ -гт

ш mwukho «ходили в первый, второй и .третий типы, а

рестриктограммы серовара 1/2с относились к пятому типу. Аналогичные соотношения между сероваром исследованных культур и типом ре-стриктограмм наблюдались в отдел? чых группах (по происхождению).

Было показано, что 66% рестриктограмм высоковирулентных штаммов L.monocytogenes серовара 4в относились к первому типу, а Еоа - к второму. 47% рестриктограмм высоковирулентных шта/.мов серовара 1/2а относились к. третьему типу,тогда как 38% - к в-^рому.

Тагаш образом, первый, второй и третий типы рестриктограмм характерны для штаммов серовара 4в и 1/2а. обладающих высокой вирулентностью, т.е. являющихся потенциально опасными для людей.

Проведенные исследования показали, что в России' выделяются от больных, из пищевых продуктов и окружающей среды, в основном, штаммы i.-'nonocytc-Gnis иероваров 4в и i/2a, часть из них обладпк-т .-■Liccixn вирулентностью при исследовании на различных экспериментальных моделях.

Типирование с использованием сывороток и бактериофагов, так-как и исследование плазмидного состава, не позволяло четко дифференцировать эпидемически значимые иткялы L.monocytogenes.

Путем рестрикционного анализа хромосомной ДНК исследованных культур было выявлено 3 типа рестриктограмм, которые в основном обнаруживались у потенциально опасных для людей штаммов L.monocytogenes, что ппволяет использовать этот метод для более тонкое

подразделения штаммов листерий различного происхождения.

Сравнительный анализ различных методов типирования L.monocytogenes (серо-,фаго-,био-,резистотипирование, анализ плазмидного состава и рестрикционный анализ) показал, что в настоящее время сочетание рестрикционного анализа с серотипированием наиболее информативно для выявления потенциально опасных для людей штаммов листерий.

ВЫВОДЫ

1. На основе разработанной схемы выделения штаммов листерий, вкшочаю-ей 2 этапа обогащения и применение ингибиторов роста, выделено 128 культур L.monocytogenes из клинического материала, продуктов питания и сточных вод

2. Выделенные штаммы путем серотипирования были отнесены к 4 серовараы: 1/2а, 1/2в, 1/2с и 4в, причем большая часть выделенных штаммов относится к серовару 4: (62%) и 1/2а (32т.). Результаты серотипирования культур ,L.monocytogenes корре. провали о данными фаготширования.

3. Высоковирулентные штаммы L.monocytogenes, выделенные из клинического материала, относились,в основном,к серовару 4в (54%) и 1/2а (3S2), а из продуктов питания и сточных вод ~ к 4в (74%).

4. Изучен плазмидный состав выделенных культур ¡-.monocytogenes и показано, чтг 12 штаммов несут плазмидную ДНК с молекулярной массой от 15 до 39 МД.' •

5. Рестрикционный аналио хромосомной ДНК выделенных культур с исполъь•^анием рестриктазы на основе пульс-электрофореза позволил разделить штаммы листерий в соответствии с Ъ типами

рестриктограмм. Рестриктограммы высоковирулентных штаммов L. monocytogenes серовара 4в относились к первому и второму типам, а се-ровара 1/2а - к третьему и второму типам

6. Сравнительное применение разных методов тилирования L.mo-

nnr.vt па-опое /рпгу^ rKonrt- Лил- »------ ----, «„««»¿в 1ДЛОО

мндкого состава и реотрикциакиий анализ) показало, -что сочетание серотипирования с рестрикционным анализом на основе пульсэлектро-фореза наиболее перспективно для характеристики выделенных штаммов L.monocytogenes и оценки их •. идемической значимости.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Маракуша Б.И., Дарвиш К., Тартаковский И.С., Прозоровский С.В. " Молекулярно-биологическая характеристика Listeria элосу-togenes, выделенных из различных источников'7/Теэ. Всероссийской конференции по проблемам листериога. - Покров, 1993,с. 32-33.

2. Маракуша Б.И., Дарвиш К., Тартаковский И.С., Прозоровский С. В. " Методы молекулярного тилирования .штаммов L.moriocytogenes " // Tea. Международного симпозиума по проблемам пищевых зооноэов. - Москва, 1595,с. Юг,

3. K.Damich, 8. I.Marakusha, 1.S.Tartakovskii, S. V.rrosorov-skii " DNA restriction endonuclease analysis of chromosomal DNA of different strains of Listeria monocytogenes " Abstract. In the 7th European congress of clinical microbiology and infectious diseases. - Viena/Austria, 1995,с.ВИЗ.

4. Marakusha В. I., Darwich K., Tartakovskii I.S.. Prnsorovs-kii S.V. " Plasmid profile and • ->striction endonuclease analysis of chromosomal DNA of different strains of Listeria monocytogenes " Abstract In the XII International symposium on problems listeriosis. - Perth Western/Australia, 1995,c. 156.

С