Молекулярно-биологическая характеристика и методы идентификации клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis

Шемякин, Игорь Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологическая характеристика и методы идентификации клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая характеристика и методы идентификации клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis"

На правах рукописи

Шемякин Игорь Георгиевич

Молекулярно-биологическая характеристика и методы идентификации клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Оболенск - 2005

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Государственный научный центр прикладной микробиологии Министерства Здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Гергерт Владислав Яковлевич доктор медицинских наук Мазурова Изабелла Константиновна

доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Габибов Александр Габибович

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

диссертационного совета Д 208.646.01 при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского МЗ РФ по адресу. 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского

Защита состоится

часов на заседании

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Комбарова С.Ю.

Тираж 100 экз.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Согласно данным медицинской статистики, эпидемическая обстановка по туберкулезу резко ухудшилась в последние годы во всем мире (Pfyffer G.E. et al., 1998; Soini H., Musser J.M., 2001). В настоящее время от туберкулеза умирает людей больше, чем от всех других инфекционных заболеваний (Стародубов В. Л. и др., 1999).

Заболеваемость туберкулезом увеличилась и в России, достигнув в среднем по стране в 2002 году 86,1 на 100 000 населения (из них более 96% - туберкулезом органов дыхания) (Государственный доклад «О состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2002 году»). Примерно треть от общего числа больных являются бактериовыделителями, то есть существует огромный резервуар распространителей инфекции.

В последние годы существующая стратегия борьбы с туберкулезом теряет эффективность, что, возможно, связано с изменением свойств возбудителя туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis и первостепенную важность приобретает широкое распространение лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis и, как следствие, снижение эффективности химиотерапии, являющейся основным мероприятием в лечении инфекции. В мире уже зарегистрировано несколько вспышек туберкулеза, вызванных полирезистентными штаммами М. tuberculosis (Moss A.R., 1997; Moro M.L. et al., 1998). Особую угрозу для больных представляют мультирезистентные (MDR) штаммы - штаммы, резистентные одновременно к изониазиду и рифампицину. Так как известно, что заболевания, вызванные MDR штаммами М. tuberculosis, имеют остро прогрессирующий характер и плохо поддаются лечению (Хоменко А.Г. и др., 1996). Изучение мутаций, приводящих к появлению лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis, создаст реальные предпосылки для разработки методов экспресс-диагностики лекарственно-резистентных форм микобактерий туберкулеза.

большого числа клинических штаммов микобактерий туберкулеза невозможно в связи со значительной трудоемкостью, то реальной альтернативой становятся методы сравнения геномов вновь выделенных штаммов с уже описанными геномами методами вычитающей гибридизации (выявление инсерций) и гибридизации на ДНК-чипах (анализ делеций). Определение геномных различий среди микобактериальных штаммов также может быть использовано для разработки новых методов выявления субпопуляций циркулирующих штаммов и для выявления ключевых генетических районов и соответствующих функциональных различий.

Цель исследования

Изучить с применением микробиологических, биохимических и молекулярно-биологических методов циркулирующие в центральных регионах России штаммы М. tuberculosis, выявить их генетические особенности, установить их чувствительность к антимикробным препаратам, а также мутации, определяющие резистентность к лекарственным средствам и разработать на этой основе новые методы генотипирования возбудителя туберкулеза и экспресс-идентификации мультирезистентных клинических штаммов М. tuberculosis для оптимизации мониторинга и химиотерапии туберкулеза.

Задачи исследования

1. Создать и систематизировать коллекцию клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в Центральном и Приволжском федеральных округах России (г. Тула и Тульская обл., г. Серпухов Московской обл., г. Калуга, Нижегородская обл.).

2. Определить лекарственную резистентность клинических штаммов М. tuberculosis in vitro; оценить вирулентность лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis в опытах на модели животных (на мышах).

3. Изучить молекулярные механизмы, детерминирующие резистентность клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду. Создать на основе полученных данных диагностическую ПЦР тест-систему, обеспечивающую экспресс-идентификацию резистентности клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду и рифампицину.

4. Осуществить внутривидовую идентификацию штаммов возбудителя туберкулеза методами RFLP-IS67/0, RFLP-PGRS, VNTR и сполиготипирования.

5. Провести сравнение геномов современных штаммов М. tuberculosis, выделенных на территории РФ, с уже описанным геномом штамма H37Rv методами вычитающей гибридизации для выявления инсерций и гибридизации на ДНК-чипах для анализа делеций. Определить частоту встречаемости выявленных кодирующих последовательностей среди штаммов различных геногрупп М. tuberculosis и разработать на основе полученных данных новый метод генотипирования клинических штаммов возбудителя туберкулеза.

6. Создать компьютерный каталог данных клинических штаммов М. tuberculosis.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Штаммы М. tuberculosis, выделенные в центральном регионе РФ, преимущественно относятся к геногруппам W/Beijing - 40,7 %, AI/LAM - 40% и Haarlem - 8,9 %. Частота встречаемости микобактерий туберкулеза, относящихся к разным геногруппам, варьирует от территории к территории. Штаммы, принадлежащие к семействам W/Beijing и AI/LAM, обладают широким спектром лекарственной резистентности.

2. Геномы штаммов, относящихся к различным семействам, отличаются не только расположением и количеством повторяющихся и инсерционных элементов, но и наличием или отсутствием определенных открытых рамок считывания. Выявленные различия в кодирующих последовательностях геномов микобактерий отражают современную делеционно-инсерционную эволюцию возбудителя туберкулеза.

3. Для семейств W/Beijing и AI/LAM характерны определенные сочетания мутаций, детерминирующих резистентность к рифампицину и изониазиду. Штаммы семейства W/Beijing в 73% случаев несут мутацию в 531 кодоне гроВ и в 100% случаев имеют одновременно две мутации в гене katG в 315 и 463 положениях. В AI/LAM семействе ведущее положение занимает мутация в 516 кодоне гроВ (72 %) и выявляется только одна мутация в 315 положении гена katG (99%).

4. Метод деплиторной аллель-специфичной ПЦР позволяет одновременно с определением мультирезистентности идентифицировать культуру М. tuberculosis и может быть использован для обнаружения лекарственно-резистентных бактерий в смешанной популяции, в которой присутствуют и чувствительные к лекарственным средствам микобактерий.

Научная новизна

• Впервые выявлены и подтверждены различия в кодирующих последовательностях геномов современных штаммов М. tuberculosis, выделенных на территории РФ. Установлено, что вирулентный штамм М. tuberculosis в сравнении с менее вирулентными штаммами несет в хромосоме дополнительные структурные гены фосфолипазы С и интегрального мембранного белка семейства MmpL. Выявлена ранее неизвестная делеция DS1540 с геномными координатами 357305 - 358264.

• Показано, что среди больных туберкулезом Центрального и Приволжского федеральных округов России наряду со штаммами W/Beijing семейства широко распространены штаммы AI/LAM семейства. Штаммы AI/LAM семейства обладают широким спектром лекарственной резистентности, в частности к препаратам первой линии.

• Установлено, что из наиболее распространенных на территории РФ штаммов М. tuberculosis геногрупп W/Beijmg, AI/LAM и Haarlem, штаммы семейства AI/LAM обладают наибольшей генетической вариабельностью кодирующих областей геномов.

• Определена сравнительная частота хромосомных мутаций, детерминирующих резистентность к изониазиду и рифампицину клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в Центральном и Приволжском федеральных округах России. Впервые выявлены новые мутации в гене гроВ - 479TTG, 515-517 AATGGACCAG, 516TTC, 524ТСС, 525ACG, 535СТС, 565AGT, 566AGGG, 580CAG, в гене katG - 335GTC, в гене рпсА - 22АСТ, 63GAA, 63GCC, 96AGG, 108GTA, 132 CGT, 164CCG, 17AGG, 78AG, деления с 87 по 148 кодоны, вставка 131GGTC.

Практическая значимость работы

Компьютерный каталог, содержащий микробиологическую, биохимическую и молекулярно-биологическую характеристики клинических штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в настоящее время среди больных туберкулезом в Центральном и Приволжском федеральных округах России, будет представлен на сайте в Internet и станет доступен широкому кругу специалистов-фтизиатров, занимающихся как исследовательской, так и практической деятельностью. Содержащиеся в каталоге данные позволят быстро и точно отслеживать пути циркуляции штаммов возбудителя туберкулеза в эпидемических очагах. Полученные данные могут быть использованы при выборе противотуберкулезных лекарственных средств на ранних стадиях лечения пациентов.

Разработанная на основе деплиторной аллель-специфичной ПЦР диагностическая система, обеспечивающая экспресс-идентификацию лекарственной резистентности клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду и рифампицину одновременно с видовой идентификацией возбудителя заболевания, позволит сократить время определения лекарственной резистентности к указанным препаратам от трех-четырех недель до одного рабочего дня. Метод прост в исполнении и экономически выгоден. Методические рекомендации «Молекулярно-генетическая экспресс-идентификация лекарственной резистентности клинических штаммов М. tuberculosis к рифампицину и изониазиду», утвержденные 17 декабря 2004 директором института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН академиком Ивановым В.Т. и заместителем директора ГНЦ прикладной микробиологии профессором Волковым В.Я. прилагаются.

Разработан новый метод генотипирования клинических штаммов М. tuberculosis, основанный на использовании полимеразной цепной реакции и определенных методом вычитающей гибридизации последовательностей, позволяющий дифференцировагь клинические штаммы микобактерий.

Апробация материалов диссертации Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Российских и международных научных конференциях: 8 Международном Конгрессе по инфекционным заболеваниям, Boston, USA, May 15 - 18, 1998; П Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний", 20-22 января 1998, Москва; 29th World Conference of the IUATLD Global Congress on Lung Health, Bangkok, Thailand, 23-26 November, 1998; б* Western Pacific Congress of Chemotherapy and Infectious Diseases, 29 November - 3 December, 1998, Kuala Lumpur; Юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии", Оболенск, ГНЦ прикладной микробиологии, 14-15 декабря, 1999; ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities, May 3-4, 1999, Brussel; 23"1 Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, Dubrovnik, Croatia, June 23-26, 2002; Tenth anniversary conference of the federation of infection societies, Cardiff, UK, November 19-21,2003.

Публикация результатов исследования По теме диссертации опубликована 51 работа (из которых 19 опубликовано в центральной печати и 32 в материалах конференций и съездов).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 227 страницах машинописного текста, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Иллюстративный материал включает 21 таблицу и 29 рисунков. Список литературы содержит 219 наименований, из них 26 отечественных и 193 иностранных источника.

Основные экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично автором. Исследования проводились также в соавторстве с сотрудниками института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, а также с сотрудниками отдела молекулярной биологии ГНЦ прикладной микробиологии, работающими под руководством диссертанта.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы М. tuberculosis H37Ra и H37Rv получены из ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва) и национального института здоровья (США) соответственно. Клинические штаммы М. tuberculosis

получены из микробиологических лабораторий НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова, ТМО "Фтизиатрия" (г. Калуга), Областного противотуберкулезного диспансера г. Нижний Новгород, Областного противотуберкулезного диспансера г. Тула, туберкулезной больницы УК) 400/3, (пос. Озерки, Тульской области) и туберкулезной тюремной больницы, расположенной в г. Серпухов. Для культивирования штаммов М. tuberculosis использовали питательную среду Левенштейна-Йенсена. Культуры хранили в лактозо-глицериновой среде при температуре -70°С.

Принадлежность клинических штаммов к микобактериям туберкулезного комплекса определяли по отсутствию способности к росту на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей натрий салициловокислый, по наличию термолабилыюй каталазы (Приказ МЗ РФ №558 от 8 июня 1978 г. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе, Москва, 1978) и по присутствию В6110-элемента в геномной ДНК.

Чувствительность М. tuberculosis к стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину определяли методом абсолютных концентраций (Приказ МЗ РФ №558 от 8 июня 1978 г. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе, Москва, 1978). Определение молекулярных механизмов лекарственной резистентности М. tuberculosis проводили в соответствии с ранее описанным методом (Stepanshina V.N. et al., 1999).

Определение вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis на мышиных макрофагоподобных клетках J774 и на мышах линии BALB/c проводили по описанной ранее методике (Шемякин И.Г., 2002). Результаты статистически обработаны по ранее опубликованному методу (Ашмарин И.П., Воробьев АА., 1962).

Генотипирование М. tuberculosis проводили с применением методов RFLP-IS6770, сполиготипирования, RFLP-PGRS и VNTR. Хромосомную ДНК выделяли по методу Torrea G. et al. (1993). Генетическое типирование RFLP-IS67/0 (restriction fragment length polymorphism -полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) осуществляли с использованием общепринятой методики (Van Embden J.D.A. et al., 1995). RFLP-IS67/0 данные сканировали при 200 dpi и анализировали с помощью программы GelCompar II (Windows 98, version 2,5; Applied Maths, Belgium). Размеры фрагментов рестрикции определялись по 25 внешним маркерам молекулярных масс от 700 до 15 100 пар оснований (п.о.). RFLP профили обрабатывались по UPGMA (коэффициент подобия Жаккара, погрешность определения молекулярных масс 1,0%). Штаммы сполиготипировали по классической методике (Kamerbeek J. et al., 1997). RFLP-PGRS (polymorphic GC-reach sequence). 1-1,5 мкг хромосомной ДНК расщепляли эндонуклеазой рестрикции Smal ("Fermentas", Литва) в течение 4 ч при температуре 37°С. Продукты гидролиза объёмом 20 ц1 смешивали с 4 ц1 бромфенолового синего и разделяли электрофорезом в 1% агарозном геле при напряженности электрического поля 3,0 V/см В течение 17 ч. Фрагменты ДНК

после окрашивания геля бромистым этидием переносили на нейлоновую мембрану (Hybond-N+, "Amersham") в вакуумном блоттгре ("BioRad 785", USA) в течение 3 ч при давлении 31 кПа. Гибридизацию и хемилюминесцентную детекцию проводили согласно рекомендации фирмы "Amersham". В качестве зонда использовали олигонуклеотид PGRS 5'-CGG CGG CAA CGG CGG САА CGG CGG CGG CGG CAA CGG CGG CAA CGG CGG- 3' размером 48 п.о. VNTR (variable number tandem repeat). Исследованы шесть ETR (exact oftandem repeats) - локусов: ETR-A, ETR-B, ETR-C, ETR-D, ETR-E, ETR-F. Праймеры синтезированы фирмой "Синтол" (Москва) в соответствии с последовательностями, приведёнными в работе (Frothigham R., Wilson K.H., 1993). Эксперименты проводились согласно методике, представленной в этой же работе.

Поиск и определение нуклеотидпых последовательностей в международных базах данных проводили с использованием BLAST WWW-сервера в NCBI http://www.ncbi,nlm,nih gov/BLAST: http://yyww.sanger.ac.uk: http://www.pasteur.fr/mvcb. Использовали программы BlastN и Blast2. Редактирование нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы "GeneRunner" V 3.00 (©1996, Hastings Software Inc). Подбор олигонуклеотидных праймеров и определение температур их плавления проводили с помощью программы "Primer" V 0.5 (©1991, The Lander Lab, Whitehead Institute for Biomedical Research) и программы "Primer 3.0" (http://www-eenome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3 www/cgi).

Оптимальные условия расщепления и супрессивной вычитающей гибридизации между М. tuberculosis H37Rv и другими штаммами определяли согласно ранее описанному методу (Diatchenko et al., 1996; Gurskaya et al., 1996). Конструирование двух библиотек продуктов вычитания для каждой пары сравниваемых штаммов микобактерий осуществляли согласно опубликованной методике (Akopyants et al., 1998; Bogush et al., 1999). Определение делегированных последовательностей в штаммах микобактерий проводили в лаборатории П. Смолла (Division of Infectious Diseases and Geographic Medicine, Stanford University Medical Center) с использованием Affimetrix GeneChip технологии согласно ранее описанному методу (Kato-Maeda М. et al, 2001). Наличие делеций подтверждалось методом ПЦР, а точные координаты делеций устанавливали секвенированием.

Для проведения деплиторной аллель-специфичной ПЦР использовали 10 нг очищенной геномной ДНК в объеме 50 мкл. Анализируемая смесь содержала 50 пмоль аллель-специфичного прямого праймера и 5 пмоль обратного праймера, 10 нмоль вспомогательных праймеров (mptFor и mptRev, и /или ISFor и Isrev) (Табл. 1), 50 мкМ каждого dNTPs, 2 Ед Taq полимеразы (Promega, США), 2 мМ MgSO4, 25 мМ КС1 и 2% DMSO в 10 мМ Tris-HCl, pH 8.85. Амплификацию проводили в РТС 200 DNA термоциклере ("M&J Research", США) в следующих условиях: начальная денатурация (96°С, 5 мин), затем 30-50 циклов денатурации при 95°С в течение 40 сек,

отжига (62°С, 20 сек) и элонгации (72°С, 30 сек). ПЦР-продукт анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле.

Таблица 1 - Праймеры для деплиторной аллель-специфичной ПЦР

Ген Праймер Замена Последовательность (5'-3') Ген ПраЯмер Замена Последовательность (5'-3')

гроВ ipoBrev TCQGCOAATTGGCCTGTGCCACCAC гроВ wt531c S GGTTGACCCACAAGCGCCGACTGAC

гроВ WI5I6J D CCAGCCAGCTQAGCCAATTCATGGA rpoB ml531l S>L GGTTGACCCACAAGCGCCGACTGAT

гроВ mtS16t D>V CCAOCCAOCTOAGCCAATrCATGGT katG ketGrev CTCGCAACGGGACCCATGTCTCGGT

гроВ WÖ26-IC H AACAAOCCGCTGTCGCGGTrGACAC katG wt315g S GAACCGGTAAGGACGCGATCACCAG

гроВ mt526-18 H>D AACAACCCGCTGTCGGGGTTGACAG katG mt3!5c S>T GAACCGGTAAGGACGCGATCACCAC

гроВ ПН326-11 H>Y MCAACCCGCTCTCGGGOTTGACAT mpt40 mptFor - CGCACATGCAAGCAAATCGAACG

гроВ wt526-2a H AACAACCCGCTGTCGGGGTTGACACA mpríO mplRev - CGCTGCGGATCTTGCTGTCCAAT

гроВ mt526-26 H>R AACAACCCXiCTGTCGGGGTTGACACG IS ílld ISFor - TCAGGTGGTTCATCGAGGAGGTAC

гроВ mtS26-2t H>L AACAACCCGCTGTCGGGGTTGACACT IS 6110 ISRev - GGTCrrGTATAGGCCGTTGATCGT

Основные результаты работы и их обсуждение Молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в Центральном и Приволжском федеральных округах России

В отделе молекулярно-биологических исследований ГНЦПМ собрана коллекция М. tuberculosis, содержащая 585 клинических штаммов, из которых 559 являются лекарственно-резистентными. Все штаммы из данной коллекции проанализированы методами генетического типирования RFLP-IS6770 и сполиготипирования. Двести тридцать восемь (40,7 %) штаммов коллекции относятся к W/Bcijing семейству (Bifani P.J. et al., 1999; Kremer K. et al., 2004). Штаммы этого семейства имеют характерный набор рестрикционных фрагментов: 4320, 3750, 3230, 2850, 2180 , 2080, 1920, 1240, 1150, 1090 п.о., а также среднее арифметическое количество рестрикционных фрагментов на один штамм, равное 17. Распределение рестрикционных фрагментов в штаммах, относящихся к W/Beijing семейству, представлено на рис. 1.

■ I

lin;

сполиготипу, который характеризуется наличием положительного сигнала в 35-43 позициях и отсутствием сигнала в 1-34 позициях (восьмеричный код 000000000003771). Указанный сполиготип является характерным для штаммов, входящих в состав "/Бещк^ семейства (К1Шо1 I. et а1., 2000; К1Шо1 I. et а1., 2002). К этому сполиготипу были отнесены также 3 штамма, у

Рисунок 1 - Количество копий IS6110-

элемента в клинических штаммах М. tuberculosis семейства W/Beijing.

которых спейсеры отсутствуют не только в 1-34 позициях, но и в 37. Как было показано ранее (Mokrousov I. et al., 2002), потеря сигнала в 37 позиции может быть обусловлена встраиванием дополнительной копии элемента 1S6110 непосредственно в область DR3. VNTR профиль штаммов этого семейства имеет следующий вид - 424253. Все секвенированные штаммы W/Beijing семейства из коллекции ГНЦПМ имеют в 463 кодоне гена katG последовательность CTG и в 95 кодоне гена gyrA последовательность АСС, сочетание которых является характерными для первой эволюционной группы М. tuberculosis (Ramaswamy S., Musser J.M., 1998).

В W/Beijing семействе 79,8 % штаммов устойчиво одновременно к изониазиду и рифампицину, то есть, являются мультирезистентными. Высокая частота лекарственной резистентности среди штаммов Beijing семейства отмечена в разных регионах земного шара (Bifani P.J. et al., 1999; Diaz R. et al., 1998).

Штаммы генотипа Beijing распространены в тех регионах, где широко используется BCG вакцинация, например, в странах Юго-Восточной Азии, где такая вакцинация проводится уже в течение нескольких десятилетий. В связи с этим Hermans с соавт. (1995) сделано предположение, что BCG вакцинация создает условия для селекции штаммов М. tuberculosis, резистентных к иммунитету, формируемому под влиянием BCG. В России среди больных Санкт-Петербурга и Ленинградской области (Нарвская О.В. и др., 2000), Архангельской области (Toungoussova O.S. et al., 2002) и в Сибири (Медведева Т.В. и др., 2004) также преобладают штаммы этого семейства.

Вторым по представительности семейством в анализируемой выборке штаммов является AI (п-234,40 %). AI семейство впервые подробно охарактеризовано при выполнении данной работы. Определены характерные фрагменты рестрикции при RFLP-IStf/./0-типировании (6010, 4840, 4640, 4510, 4120, 3280, 2750, 2620, 2000, 1280 и 920 п.о.), а также среднее арифметическое количество рестрикционных фрагментов на один штамм, равное 11. Распределение рестрикционных фрагментов в штаммах,

относящихся к AI семейству, представлено на рис. 2.

сполиготипирования, штаммы семейства AI относятся к сполиготипу LAM, для которого характерно отсутствие сигнала в позициях 21-24 и 33-36 (Fillliol I. et al., 2002). VNTR профиль

Согласно

результатам

„ -------—' •; г-»-—

Г--.1 4 9 S . Т ( i Itf ti t2 14' U 15 "IB I?1

штаммов этого семейства имеет следующий вид ¡,

уМнШйлтйА imfldft

95 кодоне гена gyrA - АСС, что свидетельствует об их принадлежности ко второй эволюционной группе (Ramaswamy S., Musser J.M., 1998). Количество мультирезистентных штаммов в семействе AI составляет 87,6 %. Это даже больше чем в семействе Beijing.

В Санкт-Петербурге и Ленинградской области (Нарвская О.В. и др., 2003) штаммы сполиготипа LAM составляют всего 4,1%. Штаммы этого семейства встречаются среди заключенных больных, находящихся в тюрьме города Иваново (Черноусова Л.Н. и др., 2001).

Последнее крупное KFLP-IS6110 семейство представлено в коллекции 52 (8,9 %) штаммами и характеризуется наличием следующих фрагментов рестрикции: 11800, 9170, 4570, 3774, 3044, 2686, 2363, 1856, 1394, 1315 п.о. Среднеарифметическое количество рестрикционных фрагментов равно 12. Штаммы этого семейства относятся к Haarlem сполиготину. Сполиготип Haarlem включает штаммы, у которых одновременно отсутствуют спейсеры 31 и 33-36, и присутствует хотя бы один из спейсеров с 1-30 (Fillliol I. et al. 2002; Sebban M. et al., 2002).

Согласно полученным результатам, свидетельствующим об отсутствии спейсерных последовательностей 33-36 в области прямых повторов штаммов AI, W/Beijing, Haarlem семейств, эти штаммы принадлежат к "современной" ветви. Возможно, это объясняется редукционной эволюцией предка современного комплекса М. tuberculosis, в результате чего возникли М. tuberculosis ("современный") и, несколько позднее, М. bovis, а также другие представители туберкулезного комплекса. В ходе этого процесса у микобактсриальных штаммов появилось не менее 9 делеций. Этот сценарий подтверждён как делеционным анализом, так и последующим полным секвенированием генома М. bovis (Brosch R. et al., 2002).

При анализе штаммов М. tuberculosis, выделенных от 105 заключенных тюрьмы поселка Озерки, пациенты были разделены на две когорты. Когорта А включает вновь выявленных пациентов, являющихся бактериовыделителями, которые или никогда ранее не принимали противотуберкулезные препараты или принимали их менее одного месяца (п 30, 28,6 %), Когорта В включает пациентов, которые принимали один или несколько лекарственных препаратов более одного месяца и при этом продолжали выделять с мокротой микобактерии (п 75, 71,4 %). В когорте А 36,7 % штаммов относится к AI семейству и 30 % штаммов относится к Beijing семейству. В когорте В семейству AI принадлежит 49,3 % штаммов, семейству Beijing - 44%. Штаммы AI и Beijing семейств были представлены почти с одинаковой частотой в обеих когортах больных, что еще раз подчеркивает эпидемическую значимость штаммов этих геногрупп как среди первично выявленных больных, так и среди хронических пациентов.

В ряде работ приведены данные, свидетельствующие о том, что небольшое количество штаммов является причиной непропорционально большого количества случаев заболевания. Это может объясняться тем, что одни штаммы имеют некоторые преимущества перед другими в

распространении среди людей (Small P.M. et al., 1994; Barnes P.F. et al., 1997; Soolingen D. et al., 1999). Например, для штаммов типа Beijing показана увеличенная скорость размножения в макрофагах человека по сравнению с менее распространенными штаммами (Zhang M. et al, 1999). Хорошо известно, что мультирезистентные штаммы М tuberculosis W/Beijing семейства способны вызывать крупные вспышки туберкулеза (Agerton B.T. et al., 1999). Но, возможно, MDR штаммы семейства AI представляют не меньшую угрозу здоровью населения. Если учесть, что больные, от которых получены эти штаммы, в течение длительного времени являются бактериовыделителями, становится очевидным, какую опасность они представляют для здоровья окружающих.

Результаты анализа частоты встречаемости клинических штаммов М. tuberculosis, принадлежащих к основным генетическим семействам, в городах и населенных пунктах представлены на рисунке 3. На основании полученных данных можно сделать заключение, что среди больных в г. Тула преобладают штаммы AI семейства. Среди больных, живущих в пос. Озерки (тюрьма) и городах Богородицк и Калуга, примерно с равной частотой встречаются штаммы AI и W/Beijing семейств. От больных в городах Серпухов (тюрьма), Павлово и Дзержинск чаще выделяют штаммы, относящиеся к семейству W/Beijing

Тула Озерки Богородицк Калуга Серпухов Павлово Дзержинск (тюрьиа) (тюрьма)

Рисунок 3 - Частоты встречаемости спотиготипов штаммов М tuberculosis в разных регионах.

Определение лекарственной чувствительности клинических штаммов М. tuberculosis микробиологическими методами

В работе использовано 559 лекарственно-резистентных штаммов. Каждый штамм обладал резистентностью, по крайней мере, к одному из перечисленных противотуберкулезных препаратов: стрептомицин, канамицин, изониазид, этамбутол, рифампицин.

В результате проведенных исследований установлено, что только 3,8% клинических штаммов М. tuberculosis резистентно к одному из лекарственных препаратов. Большинство изученных штаммов обладают резистентностью одновременно к нескольким препаратам: к двум препаратам - 7,9%, к трем - 16,8%, к четырем - 29,5%, к пяти - 41,9%. Чувствительность к стрептомицину выявлена у 2,0% штаммов, к изониазиду - у 9,3%, к рифампицину - у 12,2%, к канамицину у 38,6%, к этамбутолу - у 40,4%.

Определение мутаций, детерминирующих резистентность микобактериальных штаммов к рифампицину, изониазизу и пиразинамизу

Ген гроВ секвенирован у 278 рифампицин-резистентных штаммов. Наиболее часто мутации встречались в 516 - 36,3% (GTC п=96, ТАС п=4, ТТС п=1), 531 - 34,5% (TTG n=95, TGG п=1) и в 526 - 16,6% (GAC п=28, ТАС n=12, GTC n-3, CGC п=2, ААС п=1) кодонах гена гроВ (Рис. 4). Наряду с ранее описанными мутациями в гене гроВ выявлен ряд новых мутаций: 479TTG, 515-517 AATGGACCAG, 516TTC, 524ТСС, 525ACG, 535СТС, 565AGT, 566AGGG, 580CAG.

Большинство клинических штаммов, чувствительных к 20 мкг/мл рифампицина, оказались резистентными к 0,5-10 мкг/мл этого антибиотика. Так, к 10 мкг/мл рифампицина резистентны 25,5%, к 5,0 мкг/мл - 54,5%, к 2,0 мкг/мл -13,4%, к 1,0 мкг/мл - 2,2% , к 0,5 мкг/мл - 4,4% штаммов. Фрагмент гена гроВ (431 п.о.) этих штаммов был исследован ПЦР-секвенированием с целью выявления мутаций в р-субъединице РНК-полимеразы. Ни у одного из них мутации в анализируемом локусе гена гроВ не были обнаружены.

В арсенале возможностей M. tuberculosis противостоять ингибирующему действию антимикробных препаратов имеются четыре основных группы механизмов. 1) Барьеры, связанные с проницаемостью клеточной стенки. Бактерии туберкулезного комплекса, как известно, имеют специфическую клеточную стенку, для которой характерна низкая проницаемость для различных молекул, включая антибиотики и химиопрепараты (Nikaido H., 1994). 2) Продукция ферментов, способных инактивировать или деградировать лекарственные вещества, например, Р-лактамаз (Kwon H. et al, 1995). 3) Системы активного выброса ксенобиотиков, локализованные в

Рисунок 4 - Мутации в гене гроВ, детерминирующие резистентность клинических штаммов М. tuberculosis к рифампицину.

цитоплазматической мембране, могут отвечать за невысокий уровень резистентности к аминогликозидам и тетрациклину, а также к целому ряду других антибиотиков (Siddiqi N. et al., 2004). 4) Модификация блока лекарство-мишень путем мутирования генов, кодирующих белки, непосредственно участвующие во взаимодействии с противотуберкулезными препаратами (Telenti А., 1997).

Первые три из перечисленных механизмов позволяют объяснить причины природной резистентности М. tuberculosis только к некоторым антибиотикам и химиопрепаратам, часто при их низкой концентрации (например, к рифампицину в диапазоне концентраций 0,5-10 мкг/мл).

На рис. 5 представлена частота встречаемости мутаций в гене гроВ, детерминирующих

устойчивость мультирезистентных

штаммов М. tuberculosis к

рифампицину, в различных

геногруппах. В сполигосемействе

Beijing преобладает мутация в 531

кодоне (73 %). В LAM семействе

ведущее положение занимает

мутация в 516 кодоне (72 %).

Мутации в штаммах Haarlem

семейства распределились более

Рисунок 5 - Частоты встречаемости мутаций в гене rpoB у равномерно. В 516 кодоне этого MDR штаммов М. tuberculosis из разных сполигосемейств. семейства выявлено 14 % мутаций,

в 526 и 531 кодонах - по 23 %. Haarlem семейство отличается от других большим количеством мультирезистентных штаммов, у которых не выявлены мутации в "горячем" регионе гена гроВ (WT- wild type)

Ген katG секвенирован у 284 изониазид-резистентных штаммов. Наиболее часто встречались одиночные мутации в 315 кодоне гена katG - 53,5% (АСС п=149, АСА n=2, AGA п=1) и парные мутации в 315 и 463 кодонах гена katG - 42,6% (315 АСС + 463 CTG п=120, 315 AGA + 463 CTG п=1) (Рис. 6). В одном штамме была обнаружена

одиночная мутация 463 CTG и в „ ,

J Рисунок 6 - Мутации в гене katG,

одном тройная мутация детерминирующие резистентность клинических

штаммов М. tuberculosis к изониазиду.

315AGA + 335GTC + 463CTG. Выявлена одна новая мутация (335GTC) в гене katG.

При анализе взаимосвязи между мутациями в гене katG и генетическими семействами соответавующих штаммов показано, что для сполигосемейства Beijing характерной является парная мутация в 315 и 463 кодонах (100 %), для сполигосемейства LAM - мутация в 315 кодоне (99 %). В Haarlem семействе у 27 % мультирезистентных штаммов мутации в гене katG отсутствуют, 73 % штаммов имеют мутацию в 315 кодоне (Рис. 7).

В 75 случайно выбранных из 585 штаммов М. tuberculosis бвш просеквенирован фрагмент рпсА гена, кодирующего синтез пиразинамидазы. Одиннадцать (14,7%) из 75 штаммов содержали мутации в гене, расположенные в интервале с 22 по 184 кодон. Одна (1.3%) из мутаций являлась "спящей" - 22АСС—»ACT (Thr-»Thr), а остальные 10 (13%) были значимыми: 63GAC—>GAA (Asp—>GIy), 63GAC-GCC (Asp—Ala), 85CTG-CCG

Рисунок 7 - Частоты встречаемости мутаций в кодонах гена katG у MDR штаммов М. tuberculosis из разных сполигосемейств.

(Leu—Pro), 96AAG—AGG (Lys—Arg), 108GGA—GTA (Gly—Val), 134GCC—GTC (Ala—Val), 139GTG—»GCG (Val—»Ala), делеция 78AG, делеция рамером 1В4 п.о. (В7-14В кодоны) и инсерция 131GTC—»GGTC. Показано, что мутации рпсА гена чаще возникают в штаммах семейства Beijing (26%), чем в штаммах семейства LAM (7%) и других (18%) (Рис. В). Таким образом, полученные данные

подтверждают то, что основным механизмом

устойчивости M. tuberculosis к рифампицину,

изониазиду и пиразинамиду являются

мутации в генах rpoB, katG, рпсА

соответственно.

Выявленная взаимосвязь между

определенными генетическими семействами и

частотой встречаемости соответствующих

мутаций свидетельствует о клональном

Рисунок 8 - Частоты встречаемости мутаций в гене

распространении штаммов М. tuberculosis рпсА у случайным образом выбранных штаммов

г т., U. tuberculosis из разнвгх сполигосемейств.

среди больных. Мутации, детерминирующие L

лекарственную резистентность микобактериальных штаммов, могут служить вспомогательными маркерами при проведении эпидемиологического анализа. В свою очередь генетическая

паспортизация штаммов может быть использована при выборе средств антибактериальной терапии на ранних стадиях лечения больного до получения результатов анализа лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза.

Разработка молекулярного метода экспресс-идентификации лекарственной резистентности к рифампицину и изониазиду клинических штаммов М. tuberculosis

Известно, что воспроизводимость классической аллель-специфичной ПЦР зависит от условий амплификации, выбранных праймеров и концентрации матричной ДНК. Элонгация несовершенного дуплекса приводит к накоплению мутантной матрицы, полностью комплементарной выбранным праймерам. В зависимости от условий ПЦР, эффективность элонгации несовершенного дуплекса может варьировать от 0,0001% до 1% в одном цикле. Проведение ПЦР совместно с амплификацией произвольно выбранных фрагментов генома М. tuberculosis значительно повышает чувствительность метода и точность обнаружения мутаций. При использовании областей гена трt40 или элемента IS6110 в качестве произвольно выбранных продуктов амплификации или "вспомогательных" ампликонов, метод деплиторной аллель-специфичной ПЦР позволяет одновременно обнаруживать мутации, определять

видовую принадлежность микроорганизма и контролировать качество анализируемого материала.

Семь точечных мутаций, ответственных за лекарственную резистенгность большинства случаев туберкулеза, были идентифицированы методом ДАС-ПЦР: шесть мугаций в гене гроВ (D516V, H526Y, H526R, H526L, S531L) и одна мутация в гене katG (S315T). Фрагмент гена mpt40 (622 п.о.) и фрагмент элемента IS6110 (1085 п.о.) использовали в качестве вспомогательных ампликонов. Различия в длине вспомогательных и целевых ампликонов позволяют дифференцировать их при проведении гель электрофореза.

Были проведены эксперименты по оптимизации температуры отжига и концентрации праймеров. Применение вспомогательных праймеров, объем которых превышал в два раза концентрацию аллель-специфичных праймеров, позволило улучшить разрешающие возможности реакции. Оптимальный диапазон концентраций dNTP, при котором эффективная и специфичная ПЦР все еще происходит на фоне подавления накопления "неспецифического" продукта, был определен эмпирически и составил 30-50 мкМ. При более высоких концентрациях dNTP накопление миспримированного ампликона возможно на последних этапах ПЦР. Выявлено, что в оптимизированных условиях нарастание вспомогательного ампликона эффективно подавляет накопление ложноположительного продукта ПЦР. В то время как эффективность обычной аллель-специфичной ПЦР снижалась, ДАС-ПЦР с использованием любого из праймеров полностью сохраняла способность к точному выявлению аллелей.

Для проверки надежности разработанного метода проанализировано 39 клинических штаммов М. tuberculosis, лекарственная резистентность которых была параллельно определена микробиологическими методами и ДНК-сиквенсом. Резистентность к рифампицину методом ДАС-ПЦР определялась путем выявления мутаций в гене гроВ. Десять штаммов имели мутацию D516M, другие 10 штаммов содержали одну из мутаций H>D, Y>Y, Y>R и Y>L в кодоне 526, а еще 10 - имели замену S531L. Из 39 проверенных штаммов 26 (66,7%) несли мутации, ответственные за резистентность как к рифампицину, так и к изониазиду. Резистентность к изониазиду обеспечивалась S315T аллелем гена katG. У 9 штаммов были обнаружены аллели генов гроВ и katG штаммов дикого типа. Эти штаммы оказались чувствительными к изониазиду и рифампицину. Результаты ДАС-ПЦР представлены на рис. 9 и полностью согласуются с данными, полученными микробиологическими методами и сиквенсом.

Чтобы установить, позволяет ли этот метод различать аллели в зависимости от количества используемой геномной ДНК, был проведен ряд ПЦР-анализов с использованием ДНК, количество которой варьировало от 10 пг до 100 нг. Вспомогательным ампликоном служил фрагмент гена mtp40 размером 622 п.о. Как показано на рис. 10, ДАС-ПЦР сохраняла специфичность при

разбросе концентраций матрицы, по меньшей мере, величиной в 5 порядков. В описанных условиях данный метод обеспечивал эффективное обнаружение мутаций при использовании всего лишь 10 пг ДНК генома.

Данный вид ПЦР может быть использован для обнаружения

лекарственно-резистентных бактерий в смешанной популяции, в которой присутствуют и чувствительные возбудители (рис. 11). Таким образом, впервые создана чувствительная диагностическая система для выявления появляющихся резистентных микобактерий, когда их

М A/..ICDI1* r»0lCD>l< rraí С О ИI lifGCDJIJ

Рисунок 9 - Профили, полученные при проведении ДАС-ПЦР штамма И37Ку (А) и клинических штаммов, содержащих мутации в генах гроВ и katG (В), гроВ И526Я и katG 8315Т (С), гроВ И526У и ишО 8315Т (Э) и Э516У (Е). Кодоны штаммов дикого типа и мутантов указаны над дорожками. Большими буквами обозначены позиции в кодонах. Аминокислотные замены (аа) указаны над дорожками. Ш6110 - вспомогательный ампликон; А8 - аллельный ампликон; М - маркеры размеров ДНК (100 п.о.)

доля в общей популяции еще крайне мала (не превышает 5%). Этот метод может найти применение в клиниках для мониторинга эффективности химиотерапии.

М 1 2 3 4 5

<mpt40 ■*гроВ

wt mt wt mt wt mt wt mt wt mt

Рисунок 10 - Определение специфичности ДАС-ПЦР как функции количества исходной геномной ДНК. 100 нг (1), 10 нг(2), 1 нг (3), 0,1 нг (4), 10 пг (5) ДНК генома штамма М. tuberculosis H37Rv использовали в качестве матрицы. Было проведено 50 циклов с использованием либо wt516a (wt), либо mt516t (mt). rpoB - аллельный ампликон; mpt - вспомогательный ампликон; М - маркеры размеров ДНК (100 п.о.).

М 100 95 90 10 5 0 М 0 5 10 90 95 100

А Б

Рисунок 11 - Определение чувствительности ДАС-ПЦР к выявлению смеси, состоящей из геномов дикого и мутантного типов. Смесь ДНК М. tuberculosis H37Rv и клинического штамма с мутацией D516V в соотношении: А - от 100% до 0 хромосомы H37RV и Б - от 0 до 100% мутантного типа. В обоих случаях использовали соответствующий аллельный праймер. AS - аллельный ампликон; mpt 40 - вспомогательный ампликон; М - маркеры размеров ДНК (100 п.о.).

Вирулентность клинических штаммов М. tuberculosis

Анализ 375 историй болезни пациентов, находящихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях города Серпухова, Тульской и Калужской областей в течение 2000 года позволил установить, что 96,6% больных имеют тяжелые формы туберкулеза легких.

Для экспериментальных исследований были отобраны 10 клинических штаммов М. tuberculosis: 8 лекарственно-резистентных (6 из них мультирезистентных) и 2 лекарственно-чувствительных. Данные по лекарственной резистентности приведены в табл. 2. Как резистентные, так и чувствительные штаммы были выделены из мокроты больных с тяжелыми формами туберкулеза. По данным анализа все исследованные клинические штаммы являются М. tuberculosis.

В опытах по заражению макрофагоподобных клеток J774 микобактериальными клетками активность фагоцитоза выражали фагоцитарным числом, характеризующим количество фагоцитированных бактерий одним макрофагом. Фагоцитарные числа для всех исследованных культур М. tuberculosis имели близкие значения (3-30). Микобактерии всех культур в течение 5 суток сохраня-

лись внутри макрофагов. Другой учитываемый параметр - фагоцитарная активность, выраженная в процентном содержании фагоцитирующих макрофагов. Фагоцитарная активность в 1-е сутки варьировала от 30 до 100%. На 5-е сутки этот показатель для всех культур был равен 100%. Таблица 2 - Лекарственная резистентность клинических штаммов М. tuberculosis

Штамм Лекарственная Мутации в гене rpoB Мутации в гене katG

М tuberculosis резистентность

1643 чувствителен - •

1544 чувствителен - -

1626 STR - -

1402 STR.INH - 315 AGC->ACC

155/6 STR.R1F 531TCG-»TTG -

1462 STR, INH, RIF 531TCG->TTG 463 CGG-*CTG

I486 STR, INH, RIF, KAN 526 CAC-+CGC 315 AGC-+ACC

1481 STR, INH, RIF, KAN, ЕМВ 516GAC-»GTC 315 AGC-»ACC

1397 STR, INH, RIF, KAN, ЕМВ 516GAC->GTC 315 AGC-»ACC

1540 STR, INH, RIF, KAN, EMB 531TCG-»TTG 315 AGC-»ACC; 463 CGG-»CTG

Примечание: STR - стрептомицин, INH - юоюшид, RIF - рнфампицкн, KAN - какамицин, ЕМВ - этамбутал.

Для оценки вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis после внутривенного заражения мышей через 28 суток проводили высев бактериальной культуры из легких и селезенки инфицированных животных - индивидуально из органов каждого животного. В качестве контроля использовали заражение животных микобактериями штамма H37RV. Обсемененность паренхиматозных органов выражали в десятичных логарифмах концентрации бактериальных клеток. Полученные результаты приведены в табл. 3.

Таблица 3 - Вирулентность клинических штаммов М. tuberculosis

Штамм Диагноз Высев Падеж мышей Фагоцитарное число, бактерий/макрофаг (1сут) Фагоцитарная акгиность,%(1 сут)

из легких, IX • из селезенки, Is

H37Ra - 0 0 0/6 8 97

H37Rv • 5,56±0,46 5,4410,41 0/6 Н/д Н/д

1643 Инфильтрятивный туберкулез легких 7,99±0,13 6,6710,22 0/6 5 30

1544 Инфильтрзгквный туберкулез легких 7,8610,22 6,4610,27 0/6 10 100

1626 Фиброзно-кавернозный туберкулез легких 6,34±0,31 5,2210,25 0/6 3 30

1402 Диссеминированный туберкулез легких 7,66±0,20 6,7610,20 0/6 3 40

1462 Фиброзно-кавернозный туберкулез легких 5,92±0,15 5,3110,14 0/6 20 30

155/6 Инфнльтрстивный туберкулез легких 6,10±0,15 5,1910,13 0/6 10 100

I486 Инфильтративный туберкулез легких 7,0510,09 5,8910,14 0/6 3 40

1481 Инфильтрэтивкый туберкулез легких 5,9710,10 4,9910,28 0/6 10 50

1397 Дисеемииировакный туберкулез легких 6,6410,16 5,5810,17 0/6 7 98

1540 Фиброзно-кавернозный туберкулез легких 8,2310,24 6,6310,25 3/6 30 100

По уровню вирулентности штаммы распределились на 3 группы. Первая группа включает клинические штаммы: 1462, 1481, 1626, 1397, 155/6 и контрольный штамм H37Rv (показатели инфицированности легких зараженных животных - lg 5,56-6,64). Вторая группа является промежуточной по уровню вирулентности и содержит только 1 штамм (1486), обсемененность легких которым составляла lg 7,05. В третью группу входят наиболее вирулентные штаммы: 1402, 1544, 1643, 1540. В этой группе наряду с лекарственно-резистентными микобактериями оказались и лекарственно-чувствительные. Концентрация микобактериальных клеток в легких мышей, зараженных этими культурами, равнялась lg 7,66 - 8,23. Штамм 1540 вызвал гибель 50% зараженных животных.

Таким образом, культуры М. tuberculosis, выделенные от больных с тяжелыми формами туберкулеза, различались как по чувствительности к лекарственным препаратам, так и по степени вирулентности в опытах на мышах.

Полногеномный анализ четырех клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных в России в 1999-2000 годах, в сравнении с лабораторным штаммом H37Rv

Для выявления вариабельности геномов штаммов одной геногруппы, так же как и вариабельности геномов штаммов разных геногрупп были выбраны для исследования три представителя семейства W/Beijing и один представитель семейства Haarlem (табл. 4). Эти штаммы также отличались степенью вирулентности на модели туберкулеза мышей (табл. 3), что позволяло проводить поиск генов, продукты которых могут влиять на исход туберкулезной инфекции.

Дня сравнения геномов штаммов 1462, 155/6, 1643 и 1540 с уже описанным геномом штамма H37RV использовались методы вычитающей гибридизации для выявления инсерций и гибридизации на ДНК-чипах для анализа делеций.

Таблица 4 - Генотипические характеристики штаммов М. tuberculosis, использованных для сравнения с геномом М. tuberculosis H37Rv

Штамм Сполиготип' (43 спейссрный формат) VNTR Размер кластера® Восьмеричный код

1462 Beijing 424253 3 000000000003771

155/6 Beijing 424253 75 000000000003771

1643 Beijing 424253 3 000000000003771

1540 Haarlem 425222 3 774777777420771

а. Согласно Sebban M. et al., 2002; б. Кластеры RFLP профилей определяли внутри коллекции штаммов М. tuberculosis, состоящей из 585 штаммов

Выявлено, что в каждом штамме семейства Beijing отсутствует 0,7% генома H37Rv или 40 открытых рамок считывания (ORF), тогда как в штамме 1540 семейства Haarlem отсутствует

0,26% генома или 20 ORF (табл. 5, 6). Делеционные профили были идентичны для штаммов семейства Beijing, за исключением одной дополнительной делеции в 1643 штамме. Напротив, штамм 1540, принадлежащий к семейству Haarlem, значительно отличался от других исследованных штаммов (табл. 6). Единственной делецией, общей для всех четырех изученных штаммов, является ассоциированная с фагами делеция 149. Кодирующие последовательности, представленные в 149 делеции, не требуются для проявления вирулентных свойств (Mahillon J., Chandler M., 1998.).

Большинство делегированных последовательностей, обнаруженных в исследованных штаммах по сравнению с H37Rv, были описаны ранее (Tsolaki A.G. et al., 2004). Однако нами была обнаружена одна новая геномная делеция DS1540. Концы делеций практически поровну распределены между межгенными и кодирующими областями.

Четыре индивидуальные делеции (105, 149, 167 и 181) имели те же размеры и геномные координаты, что и обнаруженные у штаммов, изолированных в Сан-Франциско (Tsolaki A.G. et al., 2004). Полученные данные позволяют предположить наличие общего предшественника или независимые делеционные события в этих областях генома. 5' область DS105 содержит семь прямых повторов 5' tggacccgg 3', тогда как в лабораторном штамме H37R.V их обнаруживается только пять (Cole S.T. et al., 1998).

Таблица 5 - Характеристики делеций геномов штаммов М. tuberculosis

Делеции Начало Конец Левая фланкирующая последовательность (5'-3') Правая фланкирующая последовательность (5--31) размер (пно) Делегированные / разрушенные гены

105 79567 83034 CgtfiRtC^CC gtj>ffi>acggg 3467 flv0071 -flv0074

1540 357305 358264 васцссрЛ ájÉetcgacc 959 flv0293c-«v0294

149 1779264 1788512 gttggtgciSi SKttggccg 9248 ЛУ1572С-/М586С

152а 1986636 1987700 tctccgacct t^aaccgccc 1065 /¡vl754c-«vl756c

152Ь 1989056 1998621 gggcggt® ¿jccccacga 9564 JM758 -iM765c

167 2179566 2180652 agacgatgcc ettcacccgg 1086 ivl927 -/?vl928c

181 2535429 2536140 Ижассайй llXtCKtacg 711 ДУ2262С-ЙУ2263

207 3120297 3127928 gtcccctctc ttcaffitcRK 7629 Z!V2814C-«V2820C

215 3378551 3379021 cgcaattggc cagcgacttt 471 «v3019c

Выделены прямые совершенные и несовершенные повторы

Две делеции, DS152a и DS152b, разделенные 1S6110, находятся в одном из локусов предпочтительного встраивания 1S6110 (insertion preferential loci, ipl). Сравнение DS152a-DS152b с описанной делецией RD152 (Tsolaki A.G. et al., 2004) позволяет предположить, что DS152a-DS152b являются предшественниками полноразмерной делеции RD152.

Делеция DS215 была обнаружена только в одном из исследованных штаммов - 1643, в котором ген Лу3019С был замещен на IS6110. Выделение от больных людей штаммов М. microti, несущих делецию MiD4, подобную DS215, является прямым указанием на то, что эта область

микобактериального генома не кодирует существенных факторов вирулентности (Garcia-Pelayo M. et al., 2004).

Впервые обнаруженная делеция DS1540 содержит гены с неизвесткой функцией. Эта делегированная последовательность фланкирована несовершенным прямым повтором из трех пар нуклеотидов (табл. 5), что предполагает участие инсерционного элемента в этом делеционном событии (Mahillon J., Chandler M, 1998).

Таблица 6 - Делеции, обнаруженные в геномах клинических штаммов М. tuberculosis

Делеции ЩЩЩЩ 1540 Функции

105 Äv0071 - интронмая матураза группы II; Rv0072 - трансмембранная единица АВС-транслортера; Rv0073 - ATP-связывающая субъедккица АВОгранпортера; Rv0074 - не известна

1540 ЩШ щш щл Не известны

149 ^^^Н Белки фага phiRvl

152а Rvl754 - не известна, Rvl755c - фосфолипаза С, Rvl756c -тракспозаза IS6110

152Ь Rvl758 - предположительно кутиназа, Rvl759 -фибронектин-связывающий белок wag22 из семейства PE-FGRS, RvI760 -триацилглицерол сингетаза, Rvl763-Rvl764 - субъединицы IS6110, Rvl76I-Rvl762, Rvl765 - не известна.

167 { ] Ш Rvl927 - не известна, Rvl928c - родственна 7-альфа-гидроксистероид дегидрогеназе Е coli

1S1 - Rv2262c - аполипопротеии N-аацилтрасфераза; Rv2263 - родственный оксидоредуктазам.

207 Rv2814c-Rv2815c - субъединицы 1S6110; Rv2816c-Rv2820- не известна.

215 ИИ Rv3019c - esxR из семейства ESAT-6, антигенный белок.

Таким образом, показаны значительные различия делеций между геномами штаммов, принадлежащими к семействам Haarlem и Beijing, тогда как внутри последнего наблюдали только минимальные различия.

Обнаруженные инсерции в геномах клинических штаммов представлены в таблице 7. Инсерции, гомологичные участкам генома CDC 1551, обозначены в соответствии с обозначениями генов этого штамма. Необходимо отметить, что дальнейшие оценки возможного вклада инсерции в вирулентность микобактерий проводятся с допущением того, что они несут функционально активные гены. Шесть инсерции являются общими для всех четырех штаммов, независимо от генотипической принадлежности, и семь из них характерны для штаммов семейства Beijing. Следовательно, первые не могут претендовать на роль, определяющую различия в вирулентности для мышей штаммов различных семейств, а вторые - между штаммами одного семейства. Инсерции в геномах штаммов 155/6 и 1643 идентичны, тогда как штамм 1462, также принадлежащий к семейству Beijing, обладает дополнительными инсерциями. Ген МТ1771 кодирует пенициллин-связывающий белок 4, который, возможно, участвует в биосинтезе пептидогликанов - компонентов клеточной стенки микобактерий. Гены МТ3425 и МТ3426

участвуют в метаболизме низкомолекулярных соединений и кодируют белок биосинтеза кофактора молибдоптерина С и птерин - 4 альфа - карбиноламин дегидратазу соответственно. Ген 02 гомологичен секвенированому фрагменту штамма 210.

Таблица 7 - Инсерции, обнаруженные в геномах клинических штаммов M.tuberculosis

Полный сиквенс генома штамма 210 еще не завершен и гены не аннотированы. Анализ белковой последовательности, кодируемой фрагментом G2, показал 55% гомологию микобактериальным белкам семейства РРЕ (Rv3429/MT3533). Наименьшая обсемененность как легких, так и селезенки мышей бактериями штамма 1462 в сравнении с двумя другими штаммами этой группы (табл. 3) позволяет предположить отсутствие значения этих белков для размножения бактерии in vivo. Единственной делецией, отличающей штамм 1643 от двух других, является ген, кодирующий антигенный белок esxR из семейства esat-б, удаление которого, возможно, придает преимущество этому штамму во взаимодействии с хозяином. Действительно, бактериальная обсеменешюсть органов модельных животных клетками именно этого штамма была сравнима с бактериальной нагрузкой наиболее вирулентного для мышей штамма 1540 (табл. 3). Однако, штамм 1643, как и другие исследованные штаммы семейства Beijing, был менее вирулентен, чем штамм 1540. Возможно, это связано с делецией генар/cD у штаммов геногруппы Beijing, кодирующего белок из семейства фосфолипаз С (Raynaud С. et al., 2002).

Штамм 1540 из семейства Haarlem отличает от остальных штаммов наличие генов, кодирующих фосфолипазу С и интегральный мембранный белок семейства MmpL, что позволяет предположить роль этих белков в повышенной вирулентности.

Определение инсерцинно/делеционных профилей штаммов М. tuberculosis и разработка нового метода генотипирования - Ш-типирования

При проведении ДНК вычитающей гибридизации референс-штамма H37Rv и четырех клинических штаммов М. tuberculosis вьывлен ряд локусов инсерционно-делеционного характера, позволяющих различать геномы штаммов М. tuberculosis. Для дальнейшей работы нами были выбраны 12 локусов (МТ1360, МП 799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425, МТ3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rvl762c, G2), характеристика которых приведена в таблице 8.

К дифференциальным нуклеотидным последовательностям подобраны и синтезированы олигонуклеотидные праймеры (Табл. 8). Для всех синтезированных праймеров подобраны условия для проведения ПЦР на геномной ДНК М. tuberculosis. Смесь для ПЦР включает: 16,6 тМ сульфата аммония, 67 mM Tris-HCl рН 8,8, 0.01% Tween 20, 2,5 тМ MgCl2, 0,25 тМ каждого из четырёх нуклеозидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), no 10 pmole каждого праймера (for и rev), 10 pmole геномной ДНК и 0,5 единиц ДНК-полимеразы BioTag (SibEnzyme, Россия). Конечный объём смеси равен 25 мкл. Условия ПЦР амплификации: 1 цикл - денатурация ДНК при 95°С в течение 40 сек, 25 циклов - денатурация при 95°С в течение 20 сек, отжиг при соответствующей тем тературе Тт 25 сек и элонгация при 72°С в течение 1 мин (для всех праймеров, кроме МТ1799, для которых время элонгации увеличено до 1 мин 20 сек). Температура отжига для каждого праймера приведена в табл. 8.

С целью выявления дифференциальных инсерционно-делеционных локусов методом ПЦР протестировано 172 клинических штамма М. tuberculosis, из них 46 штаммов семейства Beijing, 51 штамм семейства LAM и 49 штаммов семейства Haarlem. Сорок четыре (96%) штаммов семейства Beijing характеризуются наличием локусов G2, МТ1360, МТ2081, МТ2082, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428 и отсутствием локусов МП 799, МТ1802, МТ2508, Rv0073, Rv1762c, a 2 (4%) штамма-наличием локусов G2, МТ1360, МТ2081, МТ2082, МТ3427, МТ3428 и отсутствием локусов МТ1799, МТ1802, МТ2508, МТ3425-3426, Rv0073, Rvl762c (рис. 12).

Тридцать один (61%) штамм семейства LAM характеризуется наличием локусов МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073 и отсутствием локусов G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, Rv1762c; шесть (12%) штаммов - наличием локусов МТ1360, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, Rv0073 и отсутствием локусов G2, МП799, МП802, МТ3427, МТ3428, Rv1762c; четыре (8%) штамма - наличием локусов МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rv1762c и отсутствием локусов G2, МТ1360; три (6%) штамма - наличием локусов МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rv1762c и отсутствием локусов G2, МТ1360, МТ1799, MTJ802; три (6%) штамма - наличием локусов G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2508, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073 и огсутстрием локусов МТ2081, МТ2082, Rv1762c; два (4%) штамма - наличием локусов МТ2081,

Таблица 8 - Характеристика дифференциальных локусов М. tuberculosis

Дифференциальный локуе Штачм Координаты Alu-Alu фрагмента, к которому подбирались праймеры Функциональный район Функция Структура праймеров Температура оran (Tm'C) ПЦР-продукти

МТ1360 M tuberculosis CDC ISS1 1481360-1481719(363) МТ1360 (1480435-1482033) putative adenylate cyclase For aactcggtgagcatgtagca Rev actacgtcaaggtgcagacc 54 (255 п о )

МТ! 799 M tuberculosis CDC 1551 1978777-1979038(261) МТ1799 (1977868-1979412) phospholipase С For ataaaggcggttgggcag Rev agtcgtggaatggtggcg 61 (197 по)

UTIS02 M tuberculosis CDC 1551 1982771 - 1983231(460) МТ1802 (1982216-1985053) membrane protein, MmpL family For tcctcttgttgategtctacc Rev KKttKttKCKaacataccx 54 (365 no)

MT20SI M tuberculosis CDC1551 2267114-2267443 (330) МТ2081 (2266670-2267607) conserved hypothetical protein For ttcggtagcacttgaactcg Rev gttcgaagacggagtcgatg 55 (206 по)

MT20S2 M tuberculosis CDCI551 2269838-2271004(1167) МТ2082 (2267752-2272572) helicase, putative For cacaatgaagtccacgacct Rev ctacgggtacgtcatcttgc 56 (823 л о )

MT2S0S M tuberculosis CDC1J51 2726406-2727095 (691) МТ2508 (2725964-2727409) cyclic nucleotide-binding protein For ggcggactccacacgttc Rfiv ctacccgccatcttcgtc 55 (654 по)

МТ3425-МТ3426 M tuberculosis CDC1551 3704911-3705344 (432) МТ3425 (3704602-3705156) МТ3426 (3705132-3705506) molybdoptenn cofactor biosynthesis protein С ptenn-4-alpha-caibinolamme dehydratase For cggtcgctatgacatcgc Rev gacaaattcaatcatcacccc 56 (345 л о )

МТ3427 M tuberculosis CDC 1551 3706153-3706748 (596) МТ3427 (3705603-3706790) molybdoptenn cofactor biosynthesis protein A For cgccgatmaactttctgg Rev ccaatgactcgggtttttc 57 (454 по)

МТ3428 M tuberculosis CDC 1551 3707241-3707768(528) МТ3428 (3707312-3708457) transcriptional regulator, AfsR/Dnrl/RedD family For cggtgaatcgctcatcaaac Rev aattcacgcagatcgtccag 57 (497 по)

ÄvOO/J M tuberculosis H37Rv 81908-82315(406) RV0073 (81674-82666) ABC transporter for tgttccaggcgttcaatc rev gacctccgctcagatcae 51 (174 по)

fívl 762с M tuberculosis H37Rv 1995244-1995714(473) Rvl762c (1995052-1995840) putative For atcccgtccgctttgag Rev cgteRKCttccaattcag 55 (148 по)

02 210 auain 1118 5964-6340 (377) not annotated putative PPE For gccgactcgch-aacgaca Rev ctgcatagaggttcattgcttgc 61 (340 по)

МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, Rv0073, RvJ762c и отсутствием локусов G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802 МТ3427, МТ3428; один (2%) штамм - наличием локусов G2, МТ1360, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, МТ3428, Rv0073 и отсутствием локусов МТ1799, МТ1802, МТ3427, Rv1762c; один (2%) штамм - наличием локусов G2, МТ1360, МТ0799, МТ1802, МТ2081, МТ2508, Rv0073, Rv 1762с и отсутствием локусов МТ2082, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428(рис. 12).

Тридцать девять (80%) штаммов семейства Haarlem характеризуются наличием всех двенадцати локусов (G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rv1762c); шесть (12%) - наличием локусов G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МГ2508, Rv0073, Rv1762c и отсутствием локусов МТ2082, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428; два (4%) - наличием локусов МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rv1762c и отсутствием локуса G2; один (2%) штамм - наличием локусов G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rv1762c и отсутствием локуса МТ3425-3426; один (2%) штамм - наличием локусов G2, МТ1799, МТ1802, МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073, Rv1762c и отсутствием локуса MTJ360 (рис. 12).

Штаммы семе Чства Beijing являются генетически однородными по проанализированным 12 последовательностям, промежуточными являются штаммы семейства Haarlem и наиболее генетически гетерогенными оказались штаммы геногруппы AI/LAM.

Известно, что транспозиции IS6110 в М. tuberculosis (и инсерционно/делеционные события соответственно) стимулируются низким давлением кислорода в пораженных участках легких (Ghanekar К. et al., 1999). Чем чаще происходит последовательная передача штамма от человека к человеку и длиннее история циркуляции - тем больше транспозиций IS6110 и степень разнообразия геномов. Исходя из того, что в штаммах семейства LAM выявлено наибольшее разнообразие кодирующих областей генома, можно предположить, что штаммы этого семейства являются эволюционно наиболее древними из трех проанализированных семейств.

Beijing LAM Haarlem

Рисунок 12 - Вариабельность кодирующих последовательностей геномов штаммов М. tuberculosis разных сполигосемейств. Под графиками указаны наборы делстированных генов из общего количества проанализированных последовательностей (табл. 8).

Циркулирующие субпопуляции М. tuberculosis были охарактеризованы с использованием геномной ПЦР (рис. 13). В случае, когда размер ПЦР-продукта соответствовал расчетной величине, результат реакции учитывался как положительный. Если же размер ПЦР-продукта был больше или меньше расчетной величины, результат реакции учитывался как отрицательный. Графически результаты реакции представлены в виде черных кружков (положительный результат) или светлых кружков (отрицательный результат).

Степень родства двух штаммов оценивалась по коэффициенту подобия Жаккара: .ÍC=Ni2/(Ni+N2-Ni2), где Ni (N2) - количество выявленных фрагментов инсерций/делеций штамма 1 (2), а N12 - количество общих выявленных фрагментов инсерций/делеций у обоих сравниваемых штаммов. Построение дендрограммы производилось с помощью программы GelComparll (version 2.5, Applied Math, Belgium) методом невзвешенного попарного группирования (Unweighted Pair Group Method using Arithmetic averages -UPGMA). Разработанный методический подход получил название ID-типирование.

Методом ГО-типирования проанализировано 172 клинических штамма М. tuberculosis (рис. 13). Штаммы, имеющие 100% гомологии, объединены в 16 кластеров. Кластеры включают 165 штаммов (95,9%). Уникальные Ю профили имеют 7 штаммов (4,1%).

Три наиболее крупных кластера состоят из 44 (25,6%), 43 (25,0%), и 31(18,0%) штаммов. Первый крупный кластер (штаммы 0488-0693) характеризуется наличием локусов G2, МТ1360, МТ2081, МТ2082, МТ3425, МТ3426, МТ3427, МТ3428 и отсутствием локусов МТ1799, МТ1802, МТ2508, Rv0073, Rvl762c. Штаммы этого кластера принадлежат сполиготипу Beijng и имеют IS6110 профиль, характерный для W семейства.

Два штамма 0064 и 0065 формируют один ГО кластер и характеризуются наличием локусов G2, МТ1360, МТ2081, МТ2082, МТ3427, МТ3428и отсутствием.локусов МТ1799, МТ1802, MT2S08, МТ3425-МТ3426, Rv0073, Rv1762c. Эти два штамма также принадлежат сполиготипу Beijing и имеют IS6110 профиль, характерный для W семейства.

Второй крупный ГО кластер (штаммы 0460-0510) характеризуется наличием локусов МТ2081, МТ2082, МТ2508, МТ3425-МТ3426, МТ3427, МТ3428, Rv0073 и отсутствием локусов G2, МТ1360, МТ1799, МТ1802, Rv1762с. Двадцать восемь штаммов "этого кластера принадлежат сполиготипу LAM1 и три штамма относятся к сполиготипу LAM9. IS6110 профиль штаммов этого ID кластера имеет характерный набор ДНК фрагментов (6010, 4840, 4640, 4510, 4120, 3280, 2750, 2620, 2000, 1280 и 920 п.о).

При ГО-типировании 172 штаммов было выявлено 23 уникальных профиля. Таким образом, разрешающая способность метода оказалась равной 13,4%, что в два раза ниже, чем разрешающая способность сполиготипирования (47 уникальных профилей, или 27,3%), и в четыре раза ниже, чем разрешающая способность RFLP-IS6770 типирования (99 уникальных профилей, или 57,6%).

оооооосо _

8§о§о888§о88§о§88§о8ооо§888§оо^

22222222SSSSSSSSSoôSSSSôS*oSSSoooôSSoS о««

• •SSSSSSS0O080OOO080OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO О-ия*

ъ.

ït.

оооо*«*воо*вФ*«вв»*в««««*оооооооооооооооооооооооооооооооооо оооо««»и»и»»#о»«и«««»»оооооооооооооооооооооооооооооооооо —i#«ooociooooooo«»m«m»oooooooooooooooooooooooooooooooooo

• •ооо«иши»ш»»«»«»оооосооооооооооооооооооооооооооооо

• ••«••ooooooooooooooooo»«»»mm««t»»t»»»«»t««»»«»««««»r

•••••••••••••••••••••••с*

• •ооооооии«о«»»оооооо»»

ооооооооооооооооооооооооооооооо

Рисунок 13 - Дендрограмма 172 клинически штаммов М. tuberculosis, построенная на основании ID-типирования.

Выводы

1. Проведен полногеномный анализ клинических штаммов микобактерий и выявлено наличие в хромосоме вирулентного штамма М. tuberculosis 1540 генов фосфолипазы С и интегрального мембранного белка семейства MmpL.

2. Охарактеризовано генетическое семейство штаммов М. tuberculosis AI. Определены размеры и количество фрагментов рестрикция при В6110-типировании. Показана принадлежность штаммов семейства AI к LAM сполиготипу. Определен VNTR шифр AI семейства - 22222. Показано, что штаммы семейства AI/LAM обладают большей генетической вариабельностью кодирующих областей генома, чем штаммы геногрупп W/Beijing и Haarlem.

3. Установлено преимущественное распространение среди больных в Центральном и Приволжском федеральных округах России штаммов М. tuberculosis, относящихся к двум семействам: W/Bcijing (40,7%) и AI/LAM (40%). Показано, что микобактерии этих двух семейств обладают широким спектром лекарственной резистентности.

4. Показано, что для семейств W/Beijing и AI/LAM характерны определенные сочетания мутаций, детерминирующих резистентность к рифампицину и изониазиду. Штаммы семейства W/Beijing в 73% случаев несут мутацию в 531 кодоне rpoB и в 100% случаев имеют одновременно две мутации в гене katG в 315 и 463 положениях. В AI/LAM семействе ведущее положение занимает мутация в 516 кодоне rpoB (72 %) и выявляется только одна мутация в 315 положении гена katG (99%).

5. Выявлено, что среди штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в Центральном и Приволжском федеральных округах России, рифампицин-резистентность в 87,4% случаев детерминирована мутациями в 516, 526 и 531 кодонах гена rpoB, а резистентность к изониазиду в 96,1% - обусловлена мутацией в 315 кодоне katG гена. ВрпсА гене в 13,0% случаев выявлены мутации, детерминирующие пиразинамид-резистентность. Мутации расположены в интервале с 22 по 184 кодон. Идентифицирован ряд вновь выявленных генетических мутаций, обусловливающих резистентность возбудителя туберкулеза к изониазиду (ген katG 335 GTC), рифампицину (ген гроВ 479TTG, 515-517 AATGGACCAG, 516ТТС, 524ТСС, 525ACG, 535СТС, 565AGT, 566AGGG, 580CAG) и пиразинамиду (ген рпсА 22АСТ, 63GAA, 63GCC, 96AGG, 108GTA, 132 CGT, 164CCG, 17AGG, 78AG, делеция с 87 по 148 кодоны, вставка 131GGTC).

6. Разработан метод экспресс-идентификации мультирезистентных штаммов М. tuberculosis, основанный на использовании деплиторной аллель-специфичной ПЦР. Метод может быть использован для обнаружения лекарственно-резистентных бактерий в смешанной

популяции, в которой присутствуют и чувствительные к лекарственным средствам микобактерии.

7. Разработан простой и быстрый метод генотипирования (ГО-типирование) штаммов М. tuberculosis на основании полимеразной цепной реакции при использовании последовательностей, выявленных методами вычитающей гибридизации, для выявления инсерций и гибридизации на ДНК-чипах для анализа делеций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сгепаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярно-биологические аспекты изучения возбудителя туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis. //Туберкулез и экология. - 1997. - № 2. - С. 36-42.

2. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Нетуберкулезные микобактерии: лекарственная устойчивость и эпидемиология. //Новости науки и техники. Сер.: Медицина. Вып.: Туберкулез. -1998. - № 5. - С. 1-8.

3. Жиленков Е.Л., Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Оборотов M.B., Дорожкова И.Р. Свойства микобактериофага МТРН11. //Микробиология. - 1998. - т. 67. -№5. - С. 660-665.

4. Жиленков ЕЛ., Шемякин И.Г., Фомченков В.М., Иванов А.Ю., Гаврюшкин А.В., Оборотов М.В. Изучение взаимодействия микобактериофага МТРН11 с клеткой-хозяином на основе электронной микроскопии, флуориметрии и электро-ориентационной спектроскопии. //Микробиология. -1998. -т. 67. - №5. - С. 666-671.

5. Панферцев Е.А., Митрофанова Г.Н., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Использование ПЦР-секвенирования для экспресс-идентификации рифампицин-резистентности клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis.// Материалы П Всероссийской конференции. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. - Москва, -1998. - С. 107-109.

6. Zhilenkov E.L., Sherayakin I.G., Korobova O.V., Stepanshina V.N. infrastructure, biological and physical-chemical properties of mycobacterial phage MTPH11. // 8-th International Congress on Infectious Diseases. Abstract Book. - Boston, -1998. - P. 173.

7. Stepanshina V.N., Kiseleva N.V., Kopylov P.C., Los TA., Korobova O.V., Shemyakin I.G. Antigenic analysis of M.tuberculosis isolates. //8-th International Congress on Infectious Diseases. Abstract Book. - Boston, -1998. - P. 173.

8. Panfertsev E.A., Mitrophanova G.N., Stepanshina V.N., Shemyakin I.G. Using PCR-sequencing for express-identification of rifampin-resistant clinical strains of M.tuberculosis. //8-th International Congress on Infectious Diseases. Abstract Book. Boston, -1998. - P. 173.

9. Manzenyuk O.Y., Stepanshina V.N., Shemyakin I.G., Korobova O.V., Medvedeva I.M., Dorozhkova I.R. Identification of mycobacteria other than tuberculosis isolated in Russia by a restriction analysis of amplified rDNA 16S-23S. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1998. - Vol. 1(11). -Suppl.2.-P.402.

10. Stepanshina V.N., Panfertsev E.A., Korobova O.V., Shemyakin I.G., Stepanshin Yu.G., Medvedeva I.M., Dorozhkova I.R. Drug-resistant-strains of M.tuberculosis isolated in Russia. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1999. - Vol. 3(1). - P. 149-152.

11. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам. //Антибиотики и химиопрепараты. - 1999. - т. 4. - № 44. - С. 39-43.

12. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Лекарственноустойчивые штаммы Mycobacterium tuberculosis и их эпидемическая значимость. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -1999. - № 3. - С. 84-89.

13. Stepanshina V.N., Shemyakin I.G., Manzenyuk O.Y., Anisimova VA., Panfertsev EA., Korobova O.V., Medvedeva I.M. Molecular epidemiology of tuberculosis caused by drug-resistant mycobacterial strains in Russia. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. - Brussel, -1999. - P. 14.

14. Korobova O.V., Stepanshin Y.G., Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Medvedeva I.M. Relationship between drug resistance in clinical strains of Mycobacterium tuberculosis and treatment regimen. /flSTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. - Brussel, -1999. - P. 10.

15. Kiseleva N.V., Kopylov P.Ch., Stepanshina V.N., Korobova O.V., Dorozhkova I.R., Shemyakin I.G. Electrophoretic and numeric analysis of secreted proteins from clinical strains of M. tuberculosis. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book.-Brussel,-1999.-P. 10.

16. Manzenyuk O.Y., Stepanshina V.N., Shemyakin I.G., Korobova O.V., Medvedeva I.M. Identification of mycobacteria other than tuberculosis isolated in Russia by a restriction analyzis of amplified r DNA 16S-23S. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. - Brussel, -1999. - P. 11.

17. Panfertsev EA., Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Mitrofanova G.N., Dorozhkova I.R.. Study of molecular mechanisms of rifampicin and isoniazid resistance in clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book.-Brussel,-1999.-P. 12.

18. Zhilenkov E.L., Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Korobova O.V., Oborotov M.V., Dorozhkova I.R. Rapid identification of using DAPI-labeled specific phage DS6A Mycobacterium tuberculosis. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. - Brassel, -1999. - P. 17-18.

19. Medvedeva L., Ignatkin V., Dorozhkova I., Bogodelnikova I., Stepanshina V., Shemyakin I. Aerosol transmission of Mycobacterium tuberculosis in ТВ hospital premises. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. - Brussel, - 1999. - P. 11.

20. Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Манзенюк О.Ю., Анисимова В.А., Панферцев ЕА., Коробова О.В. Использование методов геномной дактилоскопии для характеристики клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. //Тез. докл. юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". - Оболенск, -1999.-С. 261.

21. Шемякин И.Г., Панферцев ЕА, Степаншина В.Н., Митрофанова Г.Н., Коробова О.В. Изучение молекулярных механизмов устойчивости к рифампицину и изониазиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. //Тез. докл. юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". - Оболенск, -1999.-С. 155.

22. Манзенюк О.Ю., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Коробова О.В. Дифференциация туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий методом рестрикционного анализа амплифицированного спейсера 16S-23S рибосомной ДНК. //Тез. докл. юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии".- Оболенск, -1999.-С. 100.

23. Копылов П.Х., Киселева Н.В., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Шемякин ИГ. Изучение секреторных белков клинических лекарственноустойчивых штаммов М. tuberculosis. //Тез. докл. юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". - Оболенск, -1999. - С. 76-77.

24. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н. Проблема лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: молекулярно-генетические аспекты. //Тез. докл. юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". - Оболенск, -1999.-С. 300.

25. Степаншина В.Н., Панферцев ЕА, Митрофанова Г.Н., Коробова О.В., Степаншин Ю.Г., Шемякин И.Г., Медведева И.М. Клинические штаммы Mycobacterium tuberculosis: изучение

молекулярных механизмов устойчивости к рифампицину и изониазиду. //Проблемы туберкулеза. - 2000. - № 1. - С. 32-36.

26. Степаншина В.Н., Манзенюк О.Ю., Шемякин И.Г., Коробова О.В. Идентификация нетуберкулезных микобактерий с помощью молекулярно-биологических методов. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2000. - № 6. - С. 61-64.

27. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Манзенюк О.Ю., Анисимова ВА., Панферцев ЕА., Коробова О.В., Медведева И.М., Дорожкова И.Р. Использование молекулярно-биологических методов для оценки эпидемической ситуации по туберкулезу в Российской Федерации. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2000. - № 2. - С. 611.

28. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Иванов И.Ю. Лазарев АА., Скалдина А.А., Левачева В А. Изучение вирулентности клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2002. - № 1. - С. 711.

29. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Анисимова ВА., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Лазарев А.А., Скалдина А.И., Чернавская ЛА., Тарасова Т.И. Генетическое типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis методами сполиготипирования и геномной дактилоскопии. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2000.-№6.-С. 30-35.

30. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Иванов И.Ю. Клинические штаммы М. tuberculosis - оценка вирулентности. //В сб.: Нозокомиальная туберкулезная инфекция. -Москва,-2001.-С. 38.

31.Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Ivanov I.Y. Characterization of M. tuberculosis strains isolated from Russian prisoners. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2001. - Vol. 5(11). - Suppl. 1. - P. 237.

32. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Korobova O.V., Lipin M.Y., Ivanov I.Y. Investigation of drug-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis derived from ТВ prisoners. //23rd Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. Abstract Book. - Dubrovnik, -2002.-P. 73.

33. Maiorova A.A., Shemyakin I.G., Gavryushkin A.V., Stepanshina V.N. Development of rapid diagnostic test for rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis. //6th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Molecular basis of the immune response. Abstract Book. - Pushchino, - 2002. - P. 82.

34. Shemyakin I.G., Anisimova VA., Stepanshina V.N., Korobova O.V. Comparing genomes of Mycobacterium tuberculosis isolates. 6lh John Humphrey advanced summer programme in immunology. Molecular basis of the immune response. Abstract Book. - Pushchino, - 2002. - P. 123.

35. Анисимова В.А., Шемякин И.Г., Степаишина В.Н., Коробова О.В. Сравнение геномов клинических изолятов М. tuberculosis. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров 'Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 106.

36. Майорова А.А., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Видовая идентификация микобактерий методом ПЦР - секвенирования гена 16S rRNA. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 111.

37. Липин М.Ю., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Коробова О.В., Онасенко А.Г. Частота встречаемости мутаций в генах rpoB, katG и рпсА клинических изолятов М. tuberculosis. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров 'Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. -С. 111.

38. Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Иванов И. Ю., Шемякин И.Г., Ильина ЕА. Характеристика клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Нижегородской области. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров 'Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 114.

39. Иванов И. Ю., Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетическое типирование методом RFLP-IS6/70 клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных-заключенных. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 109.

40. Шемякин И.Г., Гаврюшкин А.В., Степаншина В.Н., Майорова А.А. Разработка диагностической тест-системы для определения устойчивости М. tuberculosis к рифампицину. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". -Москва,-2003.-С. 116.

41. Степаншина В.Н., Иванов И. Ю., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Сполиготипы клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных о г больных туберкулезом Центрального региона России, //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, -

2003.-С. 115.

42. Липин М.Ю., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Коробова О.В. Лекарственная устойчивость клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от заключённых и от городского населения. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". -Москва, - 2003. - С. 87.

43. Иванов И. Ю., Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетическое типирование методом RFLP-IS67/0 клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 109.

44. Shemyakin I.G., Lipin M.Yu., Stepanshina V.N., Korobova O.V. Prevalence of drug resistant tuberculosis in Tula (Russia). //Tenth anniversary conference of the federation of infection societies. Abstract Book. - Cardiff, - 2003. - P. 24.

45. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Коробова О.В., Анисимова ВА Характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов. //Журнал молекулярной генетики, микробиологии, вирусологии. - 2003. - №1. - С. 32-40.

46. Майорова А.А., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Шемякин И.Г., Лазовская А.Л., Ильина ЕА. Видовая идентификация микобактерий нетуберкулезного комплекса методом амплификации и секвенирования генов 16S рРНК. //Журнал молекулярной генетики, микробиологии, вирусологии. - 2004. - №3. - С. 11-20.

47. Иванов И. Ю., Степаншина В. Н., Липин М. Ю., Коробова О. В., Шемякин И. Г. Сполиготипы клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом в Центральном Регионе России. //Проблемы туберкулеза и болезней легких. -

2004.-№4.-С. 23-27.

48.Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Ivanov I.Y., LipinM.Y., Anisimova V.A.,Onasenko A.G., Korobova O.V., Shinnick T.M. Characterization of drug-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis derived from rassian prison inmates, //bit J Tuberc Lung Dis .- 2004. -№10. P. 1194-203.

49. Майорова АА., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Коробова О.В. Исследование коллекции микобактерий нетуберкулезного комплекса рестрикционным анализом амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2004. - №11. - С. 34-37.

50. Dubiley S., Mayorova A., Ignatova A., Kirillov E., Stepanshina V., Kolesnikov A., Shemyakin I. New PCR-based assay for detection of common mutations associated with rifampin- and isoniazid-resistance in Mycobacterium tuberculosis. //Clin Chem. - 2005 - Vol. 51 (2). - P. 447450.

51.Дубилей СА., Игнатова А.Н., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетические методы идентификации лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis. //Журнал молекулярной генетики, микробиологии, вирусологии. - 2005. - № 1. - С. 3-7.

Подписано в печать 25.03.2005 г. Формат 60 х 847в.

Объем 21,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ 669.

ГУЛ МО « Серпуховская типография» Министерство по делам печати и информации Московской области

2 2 АПР 2005

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Шемякин, Игорь Георгиевич

Список сокращений и условных обозначений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Геном М. tuberculosis - возбудителя туберкулеза в сравнении с геномами близкородственных микобактерий.

2.2. Молекулярное генотипирование М. tuberculosis.

2.3. Лекарственно-резистентные штаммы М. tuberculosis, их эпидемическая значимость.

2.4. Молекулярные механизмы резистентности М. tuberculosis к лекарственным препаратам.

2.5. Методы молекулярной диагностики лекарственной резистентности М. tuberculosis.

2.6. Молекулярно-генетические особенности современных клинических штаммов М. tuberculosis.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы.

3.2. Питательные среды.

3.3. Определение лекарственной чувствительности микобактерий in vitro.

3.4. Определение молекулярных механизмов лекарственной резистентности М. tuberculosis.

3.5. Генотипирование клинических штаммов М. tuberculosis.

3.5.1. Видовая идентификация клинических штаммов микобактерий.

3.5.2. Выделение хромосомной ДНК.

3.5.3. RFLP-IS6770.

3.5.4. Сполиготипирование.

3.5.5. RFLP-PGRS.

3.5.6. VNTR.

3.5.7. Программное обеспечение.

3.6. Определение вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis.

3.6.1. Заражение макрофагов.

3.6.2. Заражение животных.

3.7 Определение делетированных последовательностей в геномах штаммов uw кобактерий.

3.8. Деплиторная аллель-специфичная ПЦР.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Клинические штаммы М. tuberculosis: изучение молекулярных механизмов резистентности к рифампицину и изониазиду.

4.2. Разработка молекулярных методов экспресс-идентификации лекарственной резистентности к рифампицину и изониазиду клинических штаммов М. tuberculosis.

4.3. Изучение вирулентности клинических штаммов М. tuberculosis.

4.4. Сравнение геномов микобактерий с использованием метода гибридизации на ДНК-чипах: выявление различий, важных для функционирования микобакте-риальной клетки и дифференциации клинических штаммов мико

4.5. Характеристика лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных-заключенных, находящихся в СИЗО города Серпухов.

4.6. MDR туберкулез у заключенных в Тульской области.

4.7. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в городе Тула и Тульской области.

4.8. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Нижегородской области.

4.9. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в городе Калуга.

4.10. Коллекция клинических штаммов М. tuberculosis

ГНЦ ПМ, Оболенск).

4.11. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis AI/LAM семейства.

4.12. Сравнение разрешающей способности разных методов генотипирования.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Эпидемическая значимость лекарственно-резистентных клинических штаммов М. tuberculosis.

5.2. Молекулярные механизмы резистентности клинических штаммов М. tuberculosis к изониазиду, рифампицину и пиразинамиду.

5.3. Разработка молекулярных методов экспресс-идентификации лекарственной резистентности к рифампицину и изониазиду клинических штаммов М. tuberculosis.

5.4. Вирулентность клинических лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis.

5.5. Сравнение геномов микобактерий с использованием метода гибридизации на ДНК-чипах: выявление различий, важных для функционирования микобактериальной клетки и дифференциации клинических штаммов микобакте-рий.

5.6. Характеристика лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных, находящихся в СИЗО города Серпухов.

5.7. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в городе Тула и Тульской области.

5.8. Сравнительный анализ генотипов штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в городах Серпухов, Тула, Калуга, в Тульской и Нижегородской областях.

5.9. Характеристика клинических штаммов М. tuberculosis AI/LAM семейства.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологическая характеристика и методы идентификации клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis"

Актуальность темы. Согласно данным официальной медицинской статистики, эпидемическая обстановка по туберкулезу резко ухудшилась в последние годы во всем мире [49, 73, 74, 96, 149, 172, 177]. В настоящее время от туберкулеза умирает людей больше, чем от всех других инфекционных заболеваний [19].

Заболеваемость туберкулезом увеличилась и в России, достигнув в среднем по стране в 2002 году 86,1 на 100 тысяч населения (82,8 - туберкулезом органов дыхания) [Государственный доклад «О состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2002 году»].

Ежегодно в России выявляется более 120 000 вновь заболевших туберкулезом (123 340 в 2002 году), среди них около 4 000 детей (15,9 на 100 000 населения). Среди всех новых случаев туберкулеза в мире (по данным ВОЗ) 0,6 - 0,8% приходится на Россию.

Всего по данным 2002 года в нашей стране зарегистрировано 388 627 больных туберкулезом (271,1 на 100 тысяч населения), среди них - 359 110 туберкулезом органов дыхания (250,5 на 100 тысяч населения) и 9 730 детей (40,4 на 100 тысяч населения).

Примерно треть от общего числа больных (126 000 человек) является бакте-риовыделителями, то есть огромным резервуаром непосредственных распространителей инфекции.

Смертность от туберкулеза в 2002 году достигла в России 21,5 на 100 тысяч населения. По сравнению с 1990 годом этот показатель увеличился в 2,8 раза. Число умерших от туберкулеза в России составляет 1 % от всех смертельных случаев от туберкулеза на всей нашей планете.

Существующая стратегия борьбы с туберкулезом теряет эффективность, что, возможно, связано с изменением свойств возбудителя туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis.

Вопросом первостепенной важности в борьбе с туберкулезом становится широкое распространение лекарственно-резистентных штаммов М. tuberculosis и, как следствие, снижение эффективности химиотерапии, являющейся основным мероприятием в лечении инфекции. В мире уже зарегистрировано несколько вспышек туберкулеза, вызванных полирезистентными штаммами М. tuberculosis. Особую угрозу для больных представляют мультирезистентные штаммы - штаммы, резистентные одновременно к изониазиду и рифампицину, так как известно, что заболевания, вызванные мультирезистентными штаммами М. tuberculosis, имеют остро прогрессирующий характер и плохо поддаются лечению [23]. Исследование мутационных процессов, приводящих к развитию лекарственной резистентности клинических штаммов М. tuberculosis, создаст реальные предпосылки для разработки методов экспресс-диагностики лекарственной резистентности.

Генетическая вариабельность различных штаммов М. tuberculosis является причиной измененных патогенных свойств возбудителя, что существенно затрудняет лечение заболевания. Наиболее информативным методом полного генетического сравнения микобактерий является понуклеотидное сравнение их геномных последовательностей. Данные по первичной структуре хромосом различных видов микобактерий Mycobacterium leprae [75]; Mycobacterium bovis [88] и трех штаммов М. tuberculosis (H37Rv, CDC1551 и 210) свидетельствуют о высоком уровне межвидового разнообразия, вызванного инсерционно-делеционными перестройками [183]. Среди штаммов М. tuberculosis при геномном сравнении также выявлен высокий уровень полиморфизма, включающий как полиморфизм длинных последовательностей (больше 10 нукпеотидов) так и однонукпеотидный полиморфизм [83]. Так как определение первичной структуры хромосом большого числа клинических штаммов ми-кобактерий туберкулеза невозможно в связи с большой трудоемкостью, то реальной альтернативой становятся методы сравнения геномов вновь выделенных штаммов с уже описанными геномами методами вычитающей гибридизации (выявление инсер-ций) и гибридизации на ДНК-чипах (анализ делеций). Определение геномных различий среди микобактериальных штаммов также может быть использовано для разработки новых методов выявления суб-популяций циркулирующих штаммов и для выявления ключевых генетических районов и соответствующих функциональных различий. щих функциональных различий.

Цель исследования

Изучить с применением микробиологических, биохимических и молекулярно-биологических методов циркулирующие в центральных регионах России штаммы М. tuberculosis, выявить их генетические особенности, установить их чувствительность к антимикробным препаратам, а также мутации, определяющие резистентность к лекарственным средствам и разработать на этой основе новый метод экспресс-идентификации мультирезистентных клинических штаммов М. tuberculosis для оптимизации мониторинга и химиотерапии туберкулеза.

Задачи исследования

4. Осуществить внутривидовую идентификацию штаммов возбудителя туберкулеза методами RFLP-IS6770, RFLP-PGRS, VNTR и сполиготипирования.

5. Провести сравнение геномов современных штаммов М. tuberculosis, выделенных на территории РФ, с уже описанным геномом штамма H37Rv методом гибридизации на ДНК-чипах для анализа делеций.

6. Создать компьютерный каталог данных клинических штаммов М. tuberculosis.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Геномы штаммов, относящихся к различным семействам, отличаются не только расположением и количеством повторяющихся и инсерционных элементов, но и наличием или отсутствием определенных открытых рамок считывания. Выявленные различия в кодирующих последовательностях геномов микобактерий отражают современную эволюцию возбудителя туберкулеза.

3. Для семейств W/Beijing и AI/LAM характерны определенные сочетания мутаций, детерминирующих резистентность к рифампицину и изониазиду. Штаммы семейства W/Beijing в 73% случаев несут мутацию в 531 кодоне гроВ и в 100% случаев имеют одновременно две мутации в гене katG в 315 и 463 положениях. В Al/LAM семействе ведущее положение занимает мутация в 516 кодоне гроВ (72 %) и выявляется только одна мутация в 315 положении гена katG (99%).

Научная новизна

• Впервые выявлены и подтверждены различия в кодирующих последовательностях геномов современных штаммов М. tuberculosis, выделенных на территории РФ. В штаммах семейства Beijing отсутствует 0,7% генома H37Rv или 40 открытых рамок считывания (ORF), тогда как в штамме 1540 семейства Haarlem отсутствует 0,26% генома или 20 ORF. Установлено, что вирулентный штамм М. tuberculosis в сравнении с менее вирулентными штаммами несет в хромосоме дополнительный структурный ген фосфолипазы С. Выявлена ранее неизвестная делеция DS1540 с геномными координатами 357305 - 358264.

• Охарактеризовано генетическое семейство штаммов М. tuberculosis А1. Определены размеры и количество фрагментов рестрикции при 136770-типировании. Показана принадлежность штаммов семейства Ai к LAM сполиготипу. Определен VNTR шифр AI семейства - 22222.

• Определена сравнительная частота хромосомных мутаций, детерминирующих резистентность к изониазиду и рифампицину клинических штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в Центральном и Приволжском федеральных округах России. Впервые выявлены новые мутации в гене rpoB - 479TTG, 515-517 AATGGACCAG, 516ТТС, 524ТСС, 525ACG, 535СТС, 565AGT, 566AGGG, 580CAG, в гене katG - 335GTC, в гене рпсА - 22АСТ, 63GAA, 63GCC, 96AGG, 108GTA, 132 CGT, 164CCG, 17AGG, 78AG, делеция с 87 по 148 кодоны, вставка 131GGTC.

Теоретическая значимость

Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в определении структурных особенностей геномов современных клинических штаммов М. tuberculosis, циркулирующих на территории Российской Федерации. Геномы штаммов, относящихся к различным семействам, отличаются не только расположением и количеством повторяющихся и инсерционных элементов, но и наличием или отсутствием определенных открытых рамок считывания. Показана редукционная эволюция геномов микобактериальных штаммов семейства Beijing. Выявлена частота встречаемости штаммов различных геногрупп М. tuberculosis. Определены мутации в генах штаммов М. tuberculosis, ответственные за резистентность к основным противотуберкулезным лекарственным средствам, в том числе и новые, что является основой для разработки молекулярно-биологических методов экспресс-диагностики лекарственной устойчивости.

Практическая значимость работы

Ивановым В.Т. и заместителем директора ГНЦ прикладной микробиологии профессором Волковым В.Я. прилагаются.

Методические приемы, разработанные в ходе работы над диссертацией, охарактеризованные штаммы М. tuberculosis и хромосомная ДНК микобактерий различных геногрупп применяются в микробиологических и молекулярно-биологических исследованиях ряда лабораторий ГНЦПМ (Оболенск), ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва), московского научно-практического центра по борьбе с туберкулезом и центрального института туберкулеза (Москва).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Молекулярно-биологические аспекты изучения возбудителя туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis. //Туберкулез и экология. -1997.-№2.-С. 36-42.

2. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Нетуберкулезные микобак-терии: лекарственная устойчивость и эпидемиология. //Новости науки и техники. Сер.: Медицина. Вып.: Туберкулез. - 1998. - № 5. - С. 1-8.

3. Жиленков Е.Л., Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Оборотов М.В., Дорожкова И.Р. Свойства микобактериофага МТРН11. //Микробиология. - 1998. - т. 67. - №5. - С. 660-665.

4. Жиленков Е.Л., Шемякин И.Г., Фомченков В.М., Иванов А.Ю., Гаврюшкин А.В., Оборотов М.В. Изучение взаимодействия микобактериофага МТРН11 с клеткой-хозяином на основе электронной микроскопии, флуориметрии и электро-ориентационной спектроскопии. //Микробиология. - 1998. - т. 67. - №5. - С. 666-671.

Всероссийской конференции. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний. - Москва, - 1998. - С. 107-109.

6. Zhilenkov E.L., Shemyakin I .G., Korobova O.V., Stepanshina V.N. Ultrastructure, biological and physical-chemical properties of mycobacterial phage MTPH11. // 8-th International Congress on Infectious Diseases. Abstract Book. - Boston, - 1998. - P. 173.

7. Stepanshina V.N., Kiseleva N.V., Kopylov P.C., Los T.A., Korobova O.V., Shemyakin I.G. Antigenic analysis of M.tuberculosis isolates. //8-th International Congress on Infectious Diseases. Abstract Book. - Boston, -1998. - P. 173.

11. Степаншин Ю.Г., Степаншина В.H., Шемякин И.Г. Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам. //Антибиотики и химиопрепараты. - 1999. - т. 4. - № 44. - С. 39-43.

13. Stepanshina V.N., S hemyakin I .G., M anzenyuk 0 .Y., Anisimova V.A., Panfertsev E.A., Korobova O.V., Medvedeva I.M. Molecular epidemiology of tuberculosis caused by drug-resistant mycobacterial strains in Russia. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. - Brussel, -1999. - P. 14.

14. Korobova O.V., Stepanshin Y.G., Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Medvedeva I.M. Relationship between drug resistance in clinical strains of Mycobacterium tuberculosis and treatment regimen. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. - Brussel, - 1999. - P. 10.

17. Panfertsev E.A., Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Mitrofanova G.N., Dorozhkova I.R. Study of molecular mechanisms of rifampicin and isoniazid resistance in clinical strains of Mycobacterium tuberculosis. //ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. - Brussel, -1999. - P. 12.

19. Medvedeva I., Ignatkin V., Dorozhkova I., Bogodelnikova I., Stepanshina V., Shemyakin I. Aerosol transmission of Mycobacterium tuberculosis in ТВ hospital premises.

ISTC EXPERT WORKSHOP on International Public Health Priorities. Abstract Book. -Brussel, - 1999. - P. 11.

20. Степаншина B.H., Шемякин И.Г., Манзенюк О.Ю., Анисимова В.А., Панферцев Е.А., Коробова О.В. Использование методов геномной дактилоскопии для характеристики клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. //Тез. докл. юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". -Оболенск, - 1999. - С. 261.

21. Шемякин И.Г., Панферцев Е.А., Степаншина В.Н., Митрофанова Г.Н., Коробова О.В. Изучение молекулярных механизмов устойчивости к рифампицину и изониазиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. //Тез. докл. юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". - Оболенск, -1999. - С. 155.

23. Копылов П.Х., Киселева Н.В., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Шемякин И.Г. Изучение секреторных белков клинических лекарственноустойчивых штаммов М. tuberculosis. //Тез. докл. юбилейной научной конференции "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии". - Оболенск, - 1999. - С. 76-77.

25. Степаншина В.Н., Панферцев Е.А., Митрофанова Г.Н., Коробова О.В., Сте-паншин Ю.Г., Шемякин И.Г., Медведева И.М. Клинические штаммы Mycobacterium tuberculosis: изучение молекулярных механизмов устойчивости к рифампицину и изониазиду. //Проблемы туберкулеза. - 2000. - № 1. - С. 32-36.

27. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Манзенюк О.Ю., Анисимова В.А., Панферцев Е.А., Коробова О.В., Медведева И.М., Дорожкова И.Р. Использование молекулярно-биологических методов для оценки эпидемической ситуации по туберкулезу в Российской Федерации. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2000.-№2.-С. 6-11.

28. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Иванов И.Ю. Лазарев А.А., Скалдина А.А., Левачева В.А. Изучение вирулентности клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2002.-№1.-С. 7-11.

29. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Анисимова В.А., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Лазарев А.А., Скалдина А.И., Чернавская Л.А., Тарасова Т.И. Генетическое типирование штаммов Mycobacterium tuberculosis методами сполиготипирова-ния и геномной дактилоскопии. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2000. - № 6. - С. 30-35.

31. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Ivanov I.Y. Characterization of M. tuberculosis strains isolated from Russian prisoners. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2001. - Vol. 5(11). -Suppl. 1.-P. 237.

34. Shemyakin I.G., Anisimova V.A., Stepanshina V.N., Korobova O.V. Comparing genomes of Mycobacterium tuberculosis isolates. 6th John Humphrey advanced summer programme i n i mmunology. M olecular b asis о f t he i mmune r esponse. A bstract В ook. -Pushchino, - 2002. - P. 123.

35. Анисимова B.A., Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Коробова О.В. Сравнение геномов клинических изолятов М. tuberculosis. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 106.

36. Майорова А.А., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Видовая идентификация ми-кобактерий методом ПЦР - секвенирования гена 16S rRNA. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 111.

37. Липин М.Ю., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Коробова О.В., Онасенко А.Г. Частота встречаемости мутаций в генах rpoB, katG и рпсА клинических изолятов М. tuberculosis. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". -Москва, - 2003. - С. 111.

38. Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Иванов И. Ю., Шемякин И.Г., Ильина Е.А. Характеристика клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом в Нижегородской области. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 114.

39. Иванов И. Ю., Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетическое типирование методом RFLP-IS6770 клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных-заключенных. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 109.

40. Шемякин И.Г., Гаврюшкин А.В., Степаншина В.Н., Майорова А.А. Разработка диагностической тест-системы для определения устойчивости М. tuberculosis к ри-фампицину. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". -Москва, - 2003. - С. 116.

41. Степаншина В.Н., Иванов И. Ю., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Сполиготипы клинических изолятов М. tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом Центрального региона России. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 115.

43. Иванов И. Ю., Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетическое типирование методом RFLP-IS6770 клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных туберкулезом. //Материалы VII Российского съезда фтизиатров "Туберкулез сегодня". - Москва, - 2003. - С. 109.

45. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Коробова О.В., Анисимова В.А. Характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов. //Журнал молекулярной генетики, микробиологии, вирусологии. - 2003. - №1. - С. 32-40.

46. Майорова А.А., Степаншина В.Н., Коробова О.В., Шемякин И.Г., Лазовская А.Л., Ильина Е.А. Видовая идентификация микобактерий нетуберкулезного комплекса методом амплификации и секвенирования генов 16S рРНК. //Журнал молекулярной генетики, микробиологии, вирусологии. - 2004. - №3. - С. 11-20.

48. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Ivanov I.Y., Lipin M.Y., Anisimova V.A., Onasenko A.G., Korobova O.V., Shinnick T.M. Characterization of drug-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis derived from russian prison inmates. //Int J Tuberc Lung Dis .- 2004. - №10. P. 1194-203.

49. Майорова A.A., Степаншина B.H., Шемякин И.Г., Коробова О.В. Исследование коллекции микобактерий нетуберкулезного комплекса рестрикционным анализом амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибо-сомной ДНК. //Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2004.- №11. - С. 34-37.

50. Dubiley S., Mayorova A., Ignatova АКirillov Е., Stepanshina V., Кolesnikov А., Shemyakin I. New PCR-based assay for detection of common mutations associated with rifampin- and isoniazid-resistance in Mycobacterium tuberculosis. //Clin Chem. - 2005 -Vol. 51 (2). - P. 447-450.

51. Дубилей C.A., Игнатова A.H., Шемякин И.Г. Молекулярно-генетические методы идентификации лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis. //Журнал молекулярной генетики, микробиологии, вирусологии. - 2005. - №1. - С. 3-7.

Основные экспериментальные данные, представленные в диссертации, получены лично автором. Исследования проводились с сотрудниками отдела молекулярной биологии ГНЦ прикладной микробиологии, работающими под руководством диссертанта, а также в соавторстве с сотрудниками института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шемякин, Игорь Георгиевич

1. В штаммах семейства Beijing отсутствует 0,7% генома H37Rv или 40

открытых рамок считывания (ORF), тогда как в штамме 1540 семейства

Haarlem отсутствует 0,26% генома или 20 ORF. Установлено, что

вирулентный штамм М. tuberculosis в сравнении с менее вирулентными

штаммами несет в хромосоме дополнительный структурный ген

фосфолипазы Выявлена ранее неизвестная делеция DS1540 с

геномными координатами 357305 - 358264. 2. Охарактеризовано генетическое семейство штаммов М. tuberculosis А1. Определены размеры и количество фрагментов рестрикции при \S6110-

типировании. Показана принадлежность штаммов семейства А! к LAM

сполиготипу. Определен VNTR шифр А1 семейства - 22222. 3. Установлено преимущественное распространение среди больных в

Центральном и Приволжском федеральных округах России штаммов М.

tuberculosis, относящихся к двум семействам: W/Beijing (40,7%) и AI/LAM

(40%). Показано, что микобактерии этих двух семейств обладают широким

спектром лекарственной резистентности. 4. Показано, что для семейств W/Beijing и Ai/LAM характерны определенные

сочетания мутаций, детерминирующих резистентность к рифампицину и

изониазиду. Штаммы семейства W/Beijing в 73% случаев несут мутацию в

531 кодоне гроВ и в 100% случаев имеют одновременно две мутации в гене

katG в 315 и 463 положениях. В AI/LAM семействе ведущее положение

занимает мутация в 516 кодоне гроВ (72 %) и выявляется только одна

мутация в 315 положении гена katG (99%). 5. Выявлено, что среди штаммов М. tuberculosis, выделенных от больных в

Центральном и Приволжском федеральных округах России, рифампицин резистентность в 87,4% случаев детерминирована мутациями в 516, 526 и

531 кодонах гена гроВ, а резистентность к изониазиду в 96,1% -

обусловлена мутацией в 315 кодоне katG гена. В рпсА гене в 13,0% случаев

выявлены мутации, детерминирующие пиразинамид-резистентность. Мутации расположены в интервале с 22 по 184 кодон. Идентифицирован

ряд вновь выявленных генетических мутаций, обусловливающих

резистентность возбудителя туберкулеза к изониазиду (ген katG 335 GTC),

рифампицину (ген гроВ 479TTG, 515-517 AATGGACCAG, 516ТТС, 524ТСС,

525ACG, 535СТС, 565AGT, 566AGGG, 580CAG) и пиразинамиду (ген рпсА

22АСТ, 63GAA, 63GCC, 96AGG, 108GTA, 132 CGT, 164CCG, 17AGG, 78AG,

делеция с 87 по 148 кодоны, вставка 131GGTC). 6. Разработан метод экспресс-идентификации мультирезистентных штаммов

М. tuberculosis, основанный на использовании деплиторной аллель специфичной ПЦР. Метод может быть использован для обнаружения

лекарственно-резистентных бактерий в смешанной популяции, в которой

присутствуют и чувствительные к лекарственным средствам микобактерии. 7. Экспериментально доказано приобретение клиническими штаммами М.

tuberculosis лекарственной резистентности в процессе

противотуберкулезной терапии и выделение смешанных культур М.

tuberculosis от хронических больных туберкулезом.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Шемякин, Игорь Георгиевич, Оболенск

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград.: Медицинская литература, 1962.-176 с.

2. Воронин A.M., Анисимова Л.А., Степаншина В.Н., Ганелин В.Л. Плазмиды Pseudomonas aeruginosa, контролирующие устойчивость к стрептомицину. // Антибиотики,- 1979. № 24. - С. 588-590.

3. Ганелин В.Л., Виноградова Л.Г., Петюшенко P.M., Степаншина В.Н., Чернышев А.И., Есипов С.Е., Сазыкин Ю.О. Стрептомицин-З-фосфотрансферазы из клеток устойчивых к стрептомицину штаммов Escherichia coli. II Биохимия. 1980. - № 12. -С. 2197-2205.

4. Дорожкова И.Р., Медведева И.М. Проблема лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза на современном этапе. IIТуб и экология.- 1997. № 2.-С. 25-28.

5. Дорожкова И.Р., Попов С.А., Медведева И.М. Мониторинг лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза в России за 1979-1998 гг. // Пробл. туб. -2000. -№ 5. С. 19-22.

6. Егоров A.M. Достижения фундаментальных наук и новые подходы к химиотерапии туберкулеза. //Пробл. Туб. 2000. - № 5. - С. 11-15.

7. Егоров A.M., Сазыкин Ю.О. Некоторые проблемы химиотерапии туберкулеза с учетом новых данных о его возбудителе. //Антибиотики и химиотерапия. 2000. -Т. 5,- № 45. - С. 3-5.Ю.Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. М., Мир, 1985.- 272 с.

8. Лекарственно-устойчивые формы туберкулеза: клинико-эпидемиологическое значение, профилактика и методика антибактериальной терапии. Методические указания. Минск, 1999.

9. Нарвская О.В., Мокроусов И.В., Лимещенко Е.В., Стеклова Л.Н., Оттен Т.Ф., Гращенкова О.В., Вишневский Б.И. Молекулярная эпидемилогия туберкулеза. //БЦЖ 2000. - №7-8. - С.4-6.

10. Приказ №558 от 8 июня 1978 г. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе. Москва, 1978.

11. Скалдина А.И. Основные показатели противотуберкулезной работы органов и учреждений здравоохранения Тульской области за 1999 год. Департмент здравоохранения администрации Тульской области. Тула, 2000.

12. Сон И.М. Заболеваемость туберкулезом. //ВИНИТИ. 1997. - № 6,- С. I-XIV.

13. Стародубов В. Л., Перельман М.И., Борисов С.Е. Туберкулез в России. Проблемы и пути их решения. //БЦЖ. 1999. - №3. - С. 8-10.

14. Тогунова А.И. Туберкулез. В книге «Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней». М.: Медицина, 1964. С.387-422.

15. Хоменко А.Г. Туберкулез как международная и национальная проблема.// Пробл. Туб. -1994. -№ 2.-С. 2-4.

16. Хоменко А.Г., Васильева И.А. Динамика выделения микобактерий туберкулеза при 2-этапной стандартной химиотерапии. //Пробл. Туб. 1996. - № 6. - С. 52-54.

17. Хоменко А.Г., Чуканов В.И., Корнеев А.А. Эффективность химиотерапии туберкулеза в легких с лекарственно-устойчивыми микобактериями. //Пробл. Туб. 1996.-№ 6.-С. 42-44.

18. Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Катулина Н.И., Шудрова М.А. Генотипирование микобактерий, выделенных от больных туберкулёзом из пенитенциарного учреждения. // Проблемы туберкулёза. 2001. - №7. - С. 60-62.

19. Anastasis D., Pillai G., Rambiritch V., Abdool Karim S.S. A retrospective study of human immunodeficiency virus infection and drug-resistance tuberculosis in Durban, South Africa. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - Vol.1. - P. 220-224.

20. Вапи S„ Gordon S.V., Palmer S., Islam R., Ahmed S., Alam K.M., Cole S.T., Brosch R. Genotypic analysis of Mycobacterium tuberculosis in Bangladesh and prevalence of the Beijing strain. //J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42(2). - P. 674-682.

21. Bercion R., Kuaban C. Initial resistance to antituberculosis drugs in Yaounde, Cameroon in 1995. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - Vol.1. - P. 110-114.

22. Brosch R., Gordon S., Eiglmeier K., Tekaia F., Yeramian E., Cole S. Genomics, biology and evolution of the Mycobacterium tuberculosis complex. In Molecular Genetics of Mycobacteria. 2000. Edited by C. Hatfull and W. Jacobs. P. 19-36.

23. Butler W.R., Kilburn J.O. Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide ^ and its relation-ship to pyrazinamidase activity. //Antimicrob. Agents Chemother.1983. Vol. 24. - P. 600-601.

24. Cambau E., Jarlier V. Resistance to quinolone in mycobacteria. //Res. Microbiol. -1996.-Vol. 147.-P. 52-59.

25. Camus J.C., Pryor M.J., Medigue C., Cole S.T. Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. //Microbiology. 2002. - Vol. 148(Pt 10). - P. 2967-2973.

26. Canetti G., Froman S., Grosset J., Handuroy P., langerova M., Mahler H.T., Meissner G., Mitchison D.A., Sula L. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. //Bull. WHO. 1963. - P. 565.

27. Centers for Disease Control and Prevention. Multidrug-resistant tuberculosis outbreak an HIV. Ward Madrid Spain, 1991-1995. //MMWR. 1996. - Vol. 45. - P. 330-333.

28. Centers for Diseases Control and Prevention. Primary multidrug-resistant tuberculosis -Ivanovo oblast, Russia, 1999. //MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 1999. - Vol. 48(30). - P. 661-664.

29. Chaulet P., Bonlahbal F., Crosset S. Surveillance of drug resistance for tuberculosis control: Why and How? //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1996. - Vol. 78. - P. 487-492.

30. Chaves F., Dronda F., Alonso-Sanz M., Noriega A. Evidence of exogenous reinfection and mixed infection with more than one strain of Mycobacterium tuberculosis among Spanish HIV-infected inmates. //AIDS. 1999. - Vol. 13. - P. 15-20.

31. Cole S.T. Comparative and functional genomics of the Mycobacterium tuberculosis complex. //Microbiology. 2002. - Vol. 148(Pt 10). - P. 2919-2928.

32. Cole S.T. Learning from the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. //FEBS Lett. -1999. Vol. 452(1 -2). - P. 7-10.

33. Cole S.T. Rifampicin resistance in mycobacteria. //Res. Microbiol. 1996. - Vol. 147. -P. 48-52.

34. Dahle U.R., Sandven P., Heldal E., Caugant D.A. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis in Norway. //J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 1802-1807.

35. Dalcolm M., Fraga H., Hijar M.A. AIDS is taking on the same profile as ТВ, incrisingly reaching the poor in Brasil. //ТВ and HIV. 1995. - № 5. - P. 20-22.

36. David H.L., Newman C.M. Some observations on the genetics of isoniazid resistance in the tubercle bacilli. //Am Rev Respir Dis. 1971. - Vol. 104(4). - P. 508-515.

37. Dawson D. Tuberculosis in Australia: bacteriologically confirmed cases and drug resistance, 1994 and 1995. Report of the Australian Mycobacterium Reference Laboratory Network. //Commun. Dis. Intell. 1997. -Vol. 21(18). - P. 245-249.

38. Del Portillo P., Thomas M. C., Martinez E., Maranon C., Valladarez В., Patarroyo M.E., and Lopez M.C. Multiprimer PCR system for differential identification of Mycobacteria in clinical samples. //J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 324-328.

39. Delgado M.B., Telenti A. Detection of mutations associated with quinolone resistance in Mycobacterium tuberculosis. In Persing D.H. (ed): Selected PCR protocols for emerging infectious diseases. Washington, DC, American Society for Microbiology, 1996.

40. Demissie M., Gebeyehu M., Berhane Y. Primary resistance to anti-tuberculosis drugs in Addis-Ababa, Ethiopia. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. -Vol.1. - P. 64-67.

41. Dessen A., Quermard A., Blanchard J.S., Jacobs, Jr., W.R., Sacchettini J.C. Crystal structure and function of the isoniazid target of Mycobacterium tuberculosis. //Science- 1995. Vol. 267. - P. 1638-1641.

42. Drobniewski F., Tayler E., Ignatenko N., Paul J., Connolly M., Nye P., Lyagoshina Т., Besse C. Tuberculosis in Sibiria: I. An epidemiological and microbiological assessment. //Tuberc. Lung Dis. 1996. - Vol. 77. - P. 199-206.

43. Eckstein T.M., Belisle J.T., Inamine J.M. Proposed pathway for the biosynthesis of serovar-specific glycopeptidolipids in Mycobacterium avium serovar 2. //Microbiology. -2003. Vol. 149(Pt 10). - P. 2797-2807.

44. El Baghdadi J., Lazraq R., Ibrahimy S., Bouayad Z., Guinet R., Benslimane A. Survey of primary drug resistance of Mycobacterium tuberculosis in Casablanca, Morocco. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1997. Vol. 1(4). - P. 309-313.

45. Ellis B.A., Crawford J.T., Braden C.R, McNabb S.J., Moore M., KammererS. Molecular epidemiology of tuberculosis in a sentinel surveillance population. //Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P. 1197-1208.

46. Fang Z., Doig C., Kenna D.T., Smittipat N., Palittapongarnpim P., Watt В., Forbes K.J. IS6110-mediated deletions of wild-type chromosomes of Mycobacterium tuberculosis. //J. Bacterid.-1999.-Vol. 181(3).-P. 1014-1020.

47. Ferrero L., Cameron В., Crouzet J. Analysis of gyrA and grIA mutations in stepwise-selected ciprofloxacin-resistant mutants of Staphylococcus aureus. //Antimicrob. Agents Chemother. 1995. - Vol. 39. - P. 1554-1558.

48. Fillliol I., Sola C., Rastogi N. Detection of a previously unamplified spaser within the DR locus of Mycobacterium tuberculosis: epidemiological implication. //J. Clin. Microbiol. -2000.-Vol. 38.-P. 1231-1234.

49. Filliol I., Sola C., Rastogi N. Detection of a previously unamplified spacer within the DR locus of Mycobacterium tuberculosis: epidemiological implication. //J. Clin. Microbiol. -2000.-Vol. 38,-P. 1231-1234.

50. Fletcher H.A., Donoghue H.D., Taylor G.M., van der Zanden A.G., Spigelman M. Molecular analysis of Mycobacterium tuberculosis DNA from a family of 18th century Hungarians. //Microbiology. 2003. - Vol. 149(Pt 1). - P. 143-151.

51. Frothingam R., Meeker-C'Connell W.A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats. //Microbiology 1998. -Vol. 144. - P. 1189-1196.

52. Fujiwara P.I., Sherman L. F. Multidrug-resistant tuberculosis: many paths, same truth. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - Vol. 1. - P. 297-298.

53. Ghanekar K., McBride A., Dellagostin O., Thome S., Mooney R., McFadden J. Stimulation of transposition of Mycobacterium tuberculosis insertion sequence IS6110 by exposure to microaerobic enviroment.//Molec. Microbiol. 1999. Vol. 33(5). P. 982993.

54. Girardi E., Antonucci G., Tronci M., Bordi E., Ippolito G. Drug-resistance patterns among tuberculosis patients in Rome 1990-1992. //Scand. J. Infec. Diseases. 1996. -Vol. 28. - P. 487-491.

55. Glynn J.R., Whiteley J., Bifani P.J., Kremer K., van Soolingen D. Worldwide occurrence of Beijing/W strains of Mycobacterium tuberculosis: a systematic review. //Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P. 843-849.

56. Godfrey-Faussett, P., Sonnenberg P., Shearer S.C., Bruce MC, Мее C, Morris L, Murray J. Tuberculosis control and molecular epidemiology in a South African gold-mining community. //Lancet. 2000. - Vol. 356. - P. 1066-1071.

57. Godlee F. Tuberculosis "A global emergency". //Brit. Med. J. - 1993. - Vol. 306. - P. 1147.

58. Gordon S.V., Brosch R., Billault A., Gamier Т., Eiglmeier K., Cole S.T. Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome arrays. // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 32(3). - P. 643-655.

59. Hacek D. 1992. Modified proportion agar dilution test for slowly growing mycobacteria, p. 5.13.1-5.13.15. In H.D.Isenberg (ed.), Clinical microbiology procedures handbook, vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

60. Heifets L.B., Lindholm P.J., and Iseman M.D. Rifabutin: Minimal inhibitory and bactericidal concentrations for Mycobacterium tuberculosis. //Am. Rev. Respir. Dis.-1988.-Vol. 137.-P. 719-721.

61. HeymB., Alzari P.M., Honore N., Cole S.T. Missense mutations in the catalase-peroxidase gene, katG, are assotiated with isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis. //Mol. Microbiol. -1995. Vol.15. - P. 235-245.

62. Heym В., Zhang Y., Poulet S., Young D„ Cole S.T. Characterization of the katG gene encoding a catalase-peroxidase required for the isoniasid susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. //J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 4255-4259.

63. Honore N., Cole S.T. Streptomycin resistance in mycobacteria. //Antimicrob. Agents Chemother. 1994. - Vol. 38. - P. 238-242.

64. Imaeda Т., Deoxyribonucleic acid relatedness among selected strains of Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium microti and Mycobacterium africanum. 1985. //Int. J. Syst. Bacteriol. -Vol. 35.-P. 147-150.

65. Jensen M. A., Webster J.A., Straus N. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. //Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - Vol. 59. - P. 945-952.

66. Kapur V., Whittam T.S., Musser J.M. Is Mycobacterium tuberculosis 15,000 years old?//J. Infect. Dis. 1994. - Vol. 170(5). - P. 1348-1349.

67. Kato-Maeda M., Rhee J.T., Gingeras T.R., Salamon H., Drenkow J., Smittipat N., Small P.M. Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis. //Genome Res. 2001. - Vol. 11 (4). - P. 547-554.

68. Kato-Maeda M., Bifani P.J., Kreiswirth B.N., Small P.M. The nature and consequence of genetic variability within Mycobacterium tuberculosis. //J. Clin. Investig. 2001. - Vol. 107(5). - P. 533-537.

69. Kenney T.J., Churchward G. Cloning and sequence analysis of the rpsL and rpsG genes of Mycobacterium smegmatis and characterization of mutations causing resistance to streptomycin. //J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - № 19. - P. 6153-6156.

70. Mahillon J., Chandler M. Insertion sequences. // Microbiol Mol Biol Rev. 1998. -Vol. 62(3). - P. 725-774.

71. Mankiewicz E., Liivak M. Phage types of Mycobacterium tuberculosis in cultures isolated from Eskimo patients. //Amer. Rev. Respir. Dis. 1975. - Vol. 111. - P. 307312.

72. Manns B.J., Fanning E.A., Cowie R.L. Antituberculosis drug resistance in immigrants to Alberta, Canada, with tuberculosis, 1982-1994. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - Vol. 1. - P. 225-230.

73. Mitchison D. A. The action of antituberculosis drugs in short course chemotherapy. //Tubercle. 1985. - Vol. 66. - P. 219-225.

74. Mokrousov I, Otten Т., Vyshnevskiy В., and Narvskaya O. Allele-specific rpoB PCR assay for detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis in sputum smears. //Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - Vol. 47. - P. 2231-2235.

75. Mokrousov I., Narvskaya 0., Otten Т., Vyazovaya A., Limeschenko E., Steklova L., Vyshnevskyi B. Phylogenetic reconstruction within Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia. //Res. Microbiol. 2002. - Vol. 153. - P. 629-637.

76. Moore M., Onorato I. M., McCray E., and Castro K. G. Trends in drug-resistant tuberculosis in the United States, 1993-1996. //J.A.M.A. 1997. - Vol. 278. - P. 833837.

77. Nash K.A., Gaytan A., Inderlied C.B. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis by use of a rapid, simple, and specific RNA/RNA mismatch assay. //J. Infect. Dis. 1997. - Vol. 176(2). - P. 533-536.

78. Nielsen P.E., Egholm M., Berg R.H., Buchardt O. Sequence spesific inhibition of DNA restriction enzyme cleavage by PNA. //Nucleic Acid Res. 1993. - Vol. 21. - P. 197-200.

79. Nikaido H. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability barriers and active efflux. //Science. 1994. - Vol. 264. - P. 382-388.

80. Otal I., Martin C., Vincent-Levy-Frebault V., Thierry D., Gicquel B. Restriction fragment length polymorphism analysis using IS6110 as an epidemiological marker in tuberculosis. //J. Clin. Microbiol. -1991. Vol. 29. - P. 1252-1254.

81. Outbreak of multidrug-resistant tuberculosis at a hospital New York City, 1 991. //MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 1993. - Vol. 42. - P. 427-434.

82. Pavlic, M., Allerberger F., Dierich M.P., Prodinger W.M. Simultaneous infection with two drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis strains in an immunocompetent host. //J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 4156-4157.

83. Pfyffer G.E., Strassle A., Rose N., Wirth R., Brandli O., Shang H. Transmission of tuberculosis in the metropolitan area of Zurich: a 3 year survey based on DNA fingerprinting. //Eur. Respir. J. 1998. - Vol. 11. - P. 804-808.

84. Pfyffer G.E., Strassle A., van Gorkum Т., Portaels F., Rigouts L., Mathieu Ch., Mirzoyev F., Traore H., van Embden J.D.A. Multidrug-resistant tuberculosis in prison inmates, Azerbaijan. //Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7(5). - P. 855-861.

85. Pym A.S., Brodin P., Brosch R., Huerre M., Cole S.T. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti. //Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 46(3). - P. 709-717.

86. Pym A.S., Brodin P., Majlessi L., Brosch R., Demangel C., Williams A., Griffiths K.E., Marchal G., Leclerc C., Cole S.T. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. //Nat. Med. 2003. - Vol. 9(5). - P. 533539.

87. Qian L., Van Embden J.D., Van Der Zanden A.G., Weltevreden E.F., Duanmu H., Douglas J.T. Retrospective analysis of the Beijing family of Mycobacterium tuberculosis in preserved lung tissues. //Clin. Microbiol. 1999. -Vol. 37(2). - P. 471-474.

88. Raleigh J.W., Wichelhausen R.H., Rado T.A., Bates J.H. Evidence for infection by two strains of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary tuberculosis: report of 9 cases. //Am. Rev. Respir. Dis. 1975. Vol. 112. - P. 497-503.

89. Ramaswamy S., and Musser J. M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update. //Tuberc. Lung Dis. -1998. -Vol. 79. P. 3-29.

90. Ramos M.C., Soini H., Roscanni G.C., Jaques M., Villares M.C., Musser J.M. Extensive cross-contamination of specimens with Mycobacterium tuberculosis in a reference laboratory. //J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37(4). - P. 916-919.

91. Raynaud C, Guilhot C, Rauzier J, Bordat Y, Pelicic V, Manganelli R, Smith I, Gicquel B, Jackson M. Phospholipases С are involved in the virulence of Mycobacterium tuberculosis.// Mol Microbiol. 2002. - Vol.45(1). - P. 203-217.

92. Reyes, H., Coninx R. Pitfalls of tuberculosis programmes in prisons. //BMJ. 1997. -Vol. 315.-P. 1447-1450.

93. Ristow M., Moehling M., Rifai M., Schartz A., Feldman K., Pfeifer A. New isoniazid /ethionamide resistance gene mutation and screening for multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis strains. //Lancet. 1995. - Vol. 346. - P. 502-503.

94. Rodrigues L.C. Smith P.G. Tuberculosis in devoloping countries and methods for its control. //Tans. Roy. Soc. Trap. Med. Hyg. 1990. - Vol. 84. - P. 739-744.

95. Ross В .С., Raios К., Jackson К., Dwyer В. Molecular cloning of highly repeated DNA element from Mycobacterium tuberculosis and it use as an epidemiological tool. //J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 942-946.

96. Rouse D., Li Z., Bai G.-H., Morris S.L. Characterization of the katG and inhA genes of isoniazid-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. //Antimicrob Agents Chemother 1995. - Vol. 39. - P. 2472-2477.

97. Rouse D.A., DeVito J.A., Li Z., Byer H., Morris S.L. Site-directed mutagenesis of the katG gene of Mycobacterium tuberculosis: effects on catalase-peroxidase activities and isoniazid resistance. //Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 22(3). - P. 583-592.

98. Sacchettini J.C., Blanchard J.S. The structure and function of the isoniazid target in M. tuberculosis. //Res. Microbiol. 1996. - Vol. 147. - P. 36-43.

99. Salmoniere Y.-O.G., Li H.M., Torrea G., Bunschoten A., Embden J., Gicquel B. Evaluation of spoligotyping in a study of the transmission of Mycobacterium tuberculosis. //J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35(9). - P. 2210-2214.

100. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5463-5467.

101. Saunders N.A., Metherell L., Patel S. Investigation of an outbreak of multidrug resistant tuberculosis among renal patients using rpoB gene sequencing and IS6110 inverse PCR. //J. Infect. 1997. - Vol. 35(2). - P. 129-133.

102. Scorpio A., Zhang Y. Mutations in pncA, a gene encoding pyrazinamidase/nicotinamidase, cause resistance to the antituberculousis drug pyrazinamide in tubercle bacillus. //Nature Med. 1996. - Vol. 2. - P. 662-667.

103. Sebban M., I. Mokrousov, N. Rastogi, C. Sola. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis. II Bioinformatics. 2002. - Vol. 18(2). - P. 235-243.

104. Shemyakin A.V., Isakov A.M., Barnashov A.V., Andreev E.G., Ponomarenko O.I. DOTS effectiveness. ТВ mortality and MDR-TB in the penitentiary system of Tomsk Oblast, Russia. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2003. - Vol. 7 (11). - P. 140.

105. Shemyakin, I. G., V. N. Stepanshina, and I. Y. Ivanov. Characterization of M. tuberculosis strains isolated from Russian prisoners. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2001. - Vol. 5. - P. 237-238.

106. Siddiqi N„ Das R„ Pathak N., Banerjee S., Ahmed N„ Katoch V.M., Hasnain S.E. Mycobacterium tuberculosis isolate with a distinct genomic identity overexpresses a tap-like efflux pump. //Infection. 2004. - Vol. 32(2). - P. 109-111.

107. Soini H., Musser J.M. Molecular diagnosis of mycobacteria.//Clin. Chem. -2001.-Vol. 47(5). P. 809-814.

108. Sullivan E.A., Kreiswirth B.N., Palumbo, Kapur V., Musser J.M., Ebrahimzadeh A., Frieden T.R. Emergence of fluoroquinolone-resistant tuberculosis in New-York city. //Lancet. 1995. - Vol. 345. - P. 1148-1150.

109. Tadao S. Disaster awaits Asia as ТВ and AIDS are neglected. //ТВ and HIV. 1995. - № 5. - P. 2.

110. Takayama K., Kilburn J.O. Inhibition of synthesis of arabinogalactan by ethambutol in Mycobacterium smegmatis. //Antimicrob. Agents Chemother. 1989. - Vol. 33. - P. 1493-1499.

111. Telenti A. Genetics of drug resistance in tuberculosis. //Clinics in Chest Medicin. -1997.-Vol. 18.-P. 55-64.

112. Telenti A., Imboden P., Marchesi F., Lowrie D., Cole S., Colston M. J., Matter L., Schopfer K., and Bodmer T. Detection of rifampin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis. //Lancet. 1993. - Vol. 341. - P. 647-650.

113. Telenti A., Persing D.H. Novel strategies for the detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. //Res. Microbiol. 1996. - Vol. 147. - P. 73-79.

114. Telzak E.E., Sepcowitz K., Alpert P., Mannheimer S., Medard F., El-Sadr W., Blum S., Gagliardi A., Salomon N., Turett G. Multydrug-resistant tuberculosis in patients without HIV infection. //N. Engl. J. Med. 1995. - Vol. 333. - P. 907-911.

115. Thierry D„ Cave M.D., Eisenach K.D., Crawford J.T., Bates J.H., Gicquel В., Guesdon J.L. IS6110, an IS-like element of Mycobacterium tuberculosis complex. //Nucleic acids Res. 1990 - Vol. 18. - P. 188.

116. Titball R.W. Bacterial phospholipases C. //Microbiol. Rev. 1993. - Vol. 57(2). - P. 347-366.

117. Torres M.J., Criado A., Palomares J.C., Aznar J. Use of real-time PCR and fluorimetry for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance-associated mutations in Mycobacterium tuberculosis. IIJ. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38(9). - P. 31943199.

118. Van Soolingen D. Molecular epidemiology of tuberculosis and other mycobacterial infections: main methodologies and achievements. //J. Intern. Med. 2001. - Vol. 249. -P. 1-26.

119. Viskum K., Кок-Jensen A. Multidrug-resistant tuberculosis in Denmark 1993-1995. //Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - Vol. 1. - P. 299-301.

120. Watterson S.A., Wilson S.M., Yates M.D., Drobniewski F.A. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis. //J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36(7). - P. 1969-1973.

121. Wild L.J.F., Werely C., Beyers N„ Donald P., van Helden P.D. Oligonucleotide (GTG)5 as a marker for Mycobacterium tuberculosis strain identification. //J. Clin.Microbiol. -1994. Vol. 32. - P. 1318-1321.

122. Wilson T.M., Collins D.M. ahpC, a gene involved in isoniazid resistance of the Mycobacterium tuberculosis complex. //Mol. Microbiol. 1996. - Vol.19. - P. 1025-1034.

123. Winder F.G., Mode of action of the antimycobacterial agents and associated aspects of the molecular biology of the Mycobacteria. In Ratledge C., Stanford J. (ed.): The Biology of the Mycobacteria. New York, Academic Press, 1982, P. 354-438.

124. World Health Organization Tuberculosis Programme and International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis. Document WHO/TB/94.178, Geneva, 1994.

125. Yusuf H.R., Braden C.R., Greenberg A.J., Weltman A.C., Onorato I.M., Valway S.E. Tuberculosis transmission among five school bus drivers and students in two New York counties. //Pediatrics. 1997. - Vol. 100(3). - P. 6-9.

126. Zhang M., Gong J., Yang Z., Samten В., Cave M.D., Barnes P.F. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages. //J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179(5). - P. 1213-1217.

127. Zhang Y., Heym В., Allen В., Young D., Cole S. The catalase-peroxidase gene and isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis. //Nature. 1992. -Vol. 358. - P. 501-593.

128. W 0410 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC - М - - - - Богородицк

129. W 0399 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC - М - - - - Тула

130. W 0278 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 39 М инф. 1977 В Нет Богородицк

131. W 0468 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC - М - - - - Богородицк

132. W 0563 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 62 М циррот. 1993 В Есть Калугаб W 0726 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC 46 м инф. 1987 В Есть Озерки*

133. W 0023 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TGG WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

134. W 0044 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 516GTC 78del(G) 95ACC - - - - Есть Серпухов*

135. W 0013 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN 315ACC, 463CTG WT 95ACC - - - - А Есть Серпухов*

136. W 0014 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

137. W 0018 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

138. W 0026 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 63GCC 95ACC - - - - Есть Серпухов*

139. W 0036 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF 315ACC, 463CTG 511CCG WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

140. W 0037 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 5I4-5I5dei(CAT) 97AGT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

141. W 0040 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC - - - - Есть Серпухов*

142. W 0046 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF 315ACC, 463CTG 513ССА 95ACC - - - - - Есть Серпухов*

143. W 0058 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG WT 95ACC 25 м инф. дне. 2000 А Есть Богородицк

144. W 0055 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG WT 95ACC 39 ж инф. 2000 А Нет Богородицк

145. W 0065 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF ■. 531 TTG - 95ACC 34 - - 2000 В Есть Серпухов*

146. W 0093 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG WT 95ACC ж инф. - - - Богородицк

147. W 0114 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG WT 95ACC м - - - Есть Серпухою*

148. W 0116 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 164CCG 95ACC м - - - Есть Серпухов*

149. W 0121 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 526TAC 95ACC - м - - - Есть Серпухов*

150. W 0127 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 526GAC 95ACC - м фиб.-кав. - - Есть Серпухов*

151. W 0129 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 526GAC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

152. W 0137 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

153. W 0145 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF 315ACC, 463CTG 526GAC 95ACC - - - - А Есть Серпухов*

154. W 0135 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

155. W 0057 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 45 M инф. дне. 1995 В Есть Богородицк

156. W 0406 000000000003771 Beijing STR, INH,.EMB, RIF 315ACC, 463CTG 526TAC 95ACC - - - - - Есть Серпухов*

157. W 0418 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 46 M инф. 2000 В Нет Богородицк

158. W 0414 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC - M - - - - Богородицк

159. W 0424 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 41 M фиб.-кав. 1990 в Есть Озерки*

160. W 0284 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 47 M фиб.-кав. дис. 1995 в Есть Богородицк

161. W 0292 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC 43 M фиб.-кав. 1998 в Нет Богородицк

162. W 0294 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 54 M инф. 1999 в Нет Богородицк

163. W 0323 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 38 M фиб.-кав. 1999 в Нет Тула

164. W 0335 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 42 M инф. 1999 в Есть Тула

165. W 0356 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 49 M инф. 1996 в Нет Тула

166. W 0368 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 44 M инф. 2001 А Нет Тула

167. W 0374 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 533CCG 95ACC 44 M дис. 2000 В Есть Тула

168. W 0370 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 525ACG,526TAC, 527CAG 95ACC 32 M фиб.-кав. 1994 В Есть Тула

169. W 0431 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

170. W 0440 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

171. W 0445 000000000003771 Beijing STR, INH - - 95ACC - M - - - - Тула

172. W 0450 000000000003771 Beijing STR, INH - - 95ACC - M' - - - - Тула

173. W 0415 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 50 M инф. дис. 1983 В Есть Богородицк

174. W 0719 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463 CTG 531TTG 95ACC 34 M инф. 2001 А Есть Озерки*

175. W 0753 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC 21 M инф. 2001 В Есть Озерки*

176. W 0466 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

177. W 0482 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB - - 95ACC - M - - - - Тула

178. W 04S8 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

179. W 0499 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC - M инф. дис. - - - Богородицк

180. W 0506 000000000003771 Beijing KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

181. W 0509 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC - M - - - - Богородицк

182. W 0554 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF - - 95ACC 40 M инф. 1998 В Нет Калуга

183. W 0557 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 34 ж фиб.-кав. дне. 2000 А Нет Калуга

184. W 0555 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF - - 95ACC 54 M дне. 1971 В Нет Калуга

185. W 0570 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 36 M инф. .1999 В Нет Калуга

186. W 0574 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF - - 95ACC 60 M инф. 2000 А Нет Калуга

187. W 0579 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 43 M инф. 1998 В Есть Калуга

188. W 0582 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 32 M фиб.-кав. 1990 В Есть Калуга

189. W 0589 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 52 M - 1977 В Есть Калуга

190. W 0588 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF - - 95ACC 37 ж инф. 2000 В Нет Калуга

191. W 0608 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

192. W 0607 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

193. W 0614 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

194. W 0645 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN - - 95ACC - M - - - - Павлово

195. W 0654 000000000003771 Beijing STR, INH - - 95ACC - M - - - - Павлово

196. W 0674 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Павлово

197. W 0673 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB - - 95ACC - M - - - - Павлово

198. W 0669 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Павлово

199. W 0033 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF 315ACC, 463CTG 526GAC 134GTC 95ACC - - - - Есть Серпухов*

200. W 0735 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC 45 ж инф. 1997 В Есть Озерки*

201. W 0578 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF - - 95ACC 36 M инф. 1999 В Нет Калуга

202. W 0675 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB - - 95ACC - M - - - - Павлово

203. W 0385 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC 59 M ннф. 1999 в - Тула

204. W 0436 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

205. W 0442 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

206. W 0650 000000000003771 Beijing STR, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Павлово

207. W 0366 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC 48 M фиб.-кав. 1997 в Нет Тула

208. W 0365 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF 315ACC, 463CTG 516GTC 95ACC 49 M фиб.-кав. 1997 в Нет Тула

209. W 0107 000000000003771 Beijing STR, INH 315ACC, 463CTG WT 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

210. W 0613 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

211. W 0572 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 47 M ннф. 1997 в Есть Калуга

212. W 0585 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF - - 95ACC 60 M фпб.-кав. 1985 в Нет Калуга

213. W 0593 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 59 M фиб.-кав. дне. 1985 в Нет Калуга

214. W 0117 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315 ACC, 463 CTG 516GTC WT 95ACC M - - - Есть Серпухов*

215. W 0113 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG WT 95ACC M - - - Есть Серпухов*

216. W 0118 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 53ITTG WT 95ACC M - - - Есть Серпухов*

217. W 0577 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF - - 95ACC 49 M дне. 1989 В Нет Калуга

218. W 0623 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

219. W 0628 000000000003771 Beijing STR, INH - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

220. W 0639 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

221. W 0661 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF - - 95ACC - M - - - - Павлово

222. W 0587 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF - - 95ACC 38 M дне. 1999 В Нет Калуга

223. W 0642 000000000003771 Beijing Лекарственно-чувствит. - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

224. W 0029 000000000003771 Beijing STR, EMB - 22ACT 95ACC - - - - - Есть Серпухов*

225. W 0004 000000000003771 Beijing STR - WT 95ACC - - фиб.-кав. - А Есть Серпухов*

226. W 0125 000000000003771 Beijing STR - - 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

227. W 0730 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 52 M инф.+СПИД 1976 В Есть Озерки*

228. W 0001 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF 315ACC, 463CTG 516TAC WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

229. W 0009 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 87del.l84bp 95ACC - - - - Есть Серпухов*

230. W 0019 000000000003771 Beijing STR - WT 95ACC - - - - А Есть Серпухов*

231. W 0047 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC - - - - - Есть Серпухов*

232. W 0749 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF 315ACC, 463CTG 531TTG 95ACC 32 M инф. 1996 В Есть Озерки*

233. W 0463 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

234. W 0685 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN - - 95ACC 35 M инф. 2001 А Есть Озерки*

235. W 0640 000000000003771 Beijing Лекарственно-чувствит. - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

236. W 0042 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 526TAC WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

237. W 0609 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

238. W 0619 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

239. W 0060 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 45 M инф. - В Есть Озерки*

240. W 0400 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 526GAC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

241. W 0672 000000000003771 Beijing STR, INH - - 95ACC - M - - - - Павлово

242. W 0423 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 30 M инф. 2000 В Есть Озерки*

243. W 0517 000000000003771 Beijing STR, INH, EMB, RIF - - 95ACC 39 M фнб.-кав. 1985 В Есть Озерки*

244. W 0056 000000000003771 Beijing STR, INH, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG WT 95ACC 23 M инф. 2000 А Есть Озерки*

245. W 0552 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 52 M инф. 2000 В Нет Калуга

246. W 0535 000000000003771 Beijing STR, INH, KAN, RIF 315ACC, 463CTG 531 TTG 95ACC 20 ж инф. 1999 В Есть Тула

247. W 0434 000000000003731 Beijing STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

248. Al 0061 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 24 M инф. 2000 А Есть Озерки*

249. Al 0079 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC 46 M инф. 1998 В Нет Тула

250. Al 0408 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 51 M ннф. 1999 В Нет Богородицк

251. Al 0416 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 88 Ж - - В Нет Богородицк

252. Al 0395 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 60 M инф. 2000 В Нет Тула

253. Al 0367 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC - M - - - - Тула

254. Al 0322 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 26 M фиб.-кав. 1998 В Есть Тула

255. Al 0346 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 41 M фиб.-кав. 1996 В Нет Тула

256. Al 0354 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 53 M инф. 1996 в Нет Тула

257. Al 0362 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 531 TTG 95ACC 38 M дне. 2000 в Нет Тула

258. Al 0379 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315 ACC 516GTC 95ACC 23 M инф. 1998 в Есть Тула

259. Al 0382 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 37 M инф. 1998 в Есть Тула

260. Al 0435 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

261. Al 0392 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 24 M инф. 1998 в Есть Тула

262. Al 0353 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 52 M инф. 2000 в Нет Тула

263. Al 0712 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 42 M инф. 2001 в Есть Озерки*

264. Al 0480 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

265. Al 0502 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

266. Al 0504 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

267. Al 0505 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

268. Al 0537 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 48 M инф. дис. 1999 в Нет Тула

269. Al 0543 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 37 M инф. 2001 в Есть Озерки*

270. Al 0545 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 28 M инф. 2001 А Есть Озерки*

271. Al 0699 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 27 M инф. 1996 В Есть Озерки*

272. Al 0536 777477607760771 LAM1 STR, EMB, RIF - - 95ACC 30 M фиб.-кав. инф. 1997 В Есть Тула

273. Al 0538 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 25 M инф. 1998 В Есть Тула

274. Al 0727 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 33 M инф. 1997 В Есть Озерки*

275. AI 0738 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 26 M инф. 1997 В Есть Озерки*

276. А! 0531 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 30 M инф. дне. 2000 В Есть Озерки*

277. AI 0516 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 48 M инф. 2000 В Есть Озерки*

278. AI 0016 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC - - - - -

279. AI 0054 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC 53 M инф. дис. 1996 В Есть Богородицк

280. AI 0051 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC 40 M инф. дис. 1999 В Богородицк

281. AI 0062 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC 38 M эск. плеврит 1999 В Есть Озерки*

282. AI 0059 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC 38 M фиб.-кав. 1985 в Есть Озерки*

283. AI 0066 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 5I6GTC WT 95ACC 39 M очаговый 1994 в Есть Озерки*

284. AI 0070 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC 31 M инф. 1995 в Есть Озерки*

285. AI 0071 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 38 M инф. 1997 в Есть Озерки*

286. AI 0084 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC 49 M инф. 2000 А Нет Тула

287. AI 0083 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 63GAA 95ACC 47 M цпррот. 1999 в Нет Тула

288. AI 0087 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC M - - - - Богородицк

289. AI 0092 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC M инф. дис. - - - Богородицк

290. AI 0096 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 29 ж инф. 2000 в Нет Тула

291. AI 0098 '777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC ж - - - - Тула

292. AI 0091 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC - м инф. дис. - - - Богородицк

293. AI 0053 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 34 м фиб.-кав. дис. 1993 в Есть Богородицк

294. AI 0259 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 47 м дис. 1995 в Нет Тула

295. AI 0274 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC WT 95ACC 41 м циррот. 1989 в Нет Богородицк

296. AI 0267 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 43 м фиб.-кав. 1995 в Есть Тула

297. AI 0394 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 52 м дис. 1980 в Есть Тула

298. AI 0380 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 48 м дис. 1999 в Нет Тула

299. AI 0421 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 36 м инф. 1982 в Есть Озерки*

300. AI 0285 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 45 м ннф. 1993 в Нет Богородицк

301. AI 0291 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 25 м фиб.-кав. 1999 в Нет Богородицк

302. А1 0289 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 56 М инф. дис. 1994 В Есть Богородицк

303. А1 0311 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 53 М инф. 1997 В Нет Тула

304. А1 0313 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RJF 315АСС 516GTC 95АСС 45 М инф. дис. 1980 В Нет Тула

305. AI 0315 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 36 М фнб.-кав. 1993 В - Тула

306. А1 0317 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 45 М фнб.-кав. 1995 В Нет Тула

307. А1 0314 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, R1F 315АСС 5I6GTC 95АСС 27 М фнб.-кав. 2000 А Есть Тула

308. А1 0321 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 52 М инф. 1995 В Нет Тула

309. А1 0324 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 46 М инф. 1995 В Нет Тула

310. А1 0329 777477607760771 LAMI STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 5I6GTC 95АСС 63 М дне. 1996 В Нет Тула

311. AI 0334 777477607760771 LAMI STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС WT 95АСС 54 М инф. 1996 в Нет Тула

312. А1 0339 777477607760771 LAMI STR, INH, KAN, EMB, RIF 3I5ACC 516GTC 95АСС 56 М дне. 1990 в Нет Тула

313. AI 0336 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 36 М фнб.-кав. 1995 в Есть Тула

314. AI 0332 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 48 М инф. 1998 в Нет Тула

315. А1 0326 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 5I6GTC 95АСС 32 М очаговый 1986 в Нет Тула

316. А1 0345 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 35 Ж инф. 1993 в Нет Тула

317. А1 0349 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 36 М инф. дис. 1994 в Есть Тула

318. А1 0351 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 52 М фнб.-кав. 1998 в Есть Тула

319. А1 0348 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF 315АСС 53ITTG 95АСС 53 М инф. дис. 1986 в Нет Тула

320. А1 0344 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 49 М инф. 1997 в Нет Тула

321. А1 0355 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 53 М очагов, инф. 1998 в Нет Тула

322. А1 0361 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 36 М фнб.-кав. 1995 в Есть Тула

323. А1 0360 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 5I6GTC 95АСС 58 м инф. 1999 в Нет Тула

324. А1 0371 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 5I6GTC 95АСС 49 м инф. 2000 в Нет Тула

325. А1 0372 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 22 м фиб.-кав. 1996 в Есть Тула

326. А1 0377 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 32 ж инф. 1993 в Нет Тула

327. AI 0378 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 3I5ACC 516GTC 95АСС 63 м дис. 1999 в Есть Тула

328. А1 0388 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315АСС 516GTC 95АСС 51 м инф. 1999 в Нет Тула

329. AI 0428 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

330. AI 0432 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула37S AI 0439 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

331. AI 0444 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

332. AI 0446 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

333. AI 0449 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - ж - - - - Тула

334. AI 0451 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

335. AI 0447 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB - - 95ACC - M - - - - Тула

336. AI 0413 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC - M - - - - Богородицк

337. AI 0716 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - 95ACC 25 M инф. 1999 В Есть Озерки*

338. AI 0725 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 38 M инф. 1994 В Есть Озерки*

339. AI 0722 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 40 M инф. 1997 В Есть Озерки*

340. AI 0734 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 44 M инф. 1977 В Есть Озерки*

341. AI 0718 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 41 M инф. 1990 в Есть Озерки*

342. AI 0743 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 20 M инф. 2000 в Есть Озерки*

343. AI 0750 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 51 M инф. дне. 1998 в Есть Озерки*

344. AI 0460 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

345. AI 0461 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

346. AI 0471 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 46 M фиб.-кав. 1991 в Есть Тула

347. AI 0478 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

348. AI 0483 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

349. AI 0485 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

350. AI 0487 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

351. AI 0486 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

352. AI 0484 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

353. AI 0489 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 45 M фиб.-кав. 1996 в Нет Тула

354. AI 0503 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

355. AI 0507 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 32 M инф. 1995 В Есть Озерки*

356. AI 0508 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC - M - - - - Богородицк

357. AI 0510 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 39 M фиб.-кав. 1985 В Есть Озерки*

358. AI 0542 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 25 M инф. 1999 В Есть Озерки*

359. AI 0496 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 49 M инф. 2000 А Нет Тула

360. AI 0592 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 52 M дне. 1990 В Нет Калуга

361. AI 0452 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

362. AI 0692 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 24 M инф. 2001 А Есть Озерки*

363. AI 0694 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 34 M дис. 1999 В Есть Озерки*

364. AI 0695 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 56 M инф. 1998 В Есть Озерки*

365. AI 0381 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 48 M дис. 1996 В Нет Тула

366. AI 0565 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95 ACC 50 M фиб.-кав. 1998 в Есть Калуга

367. AI 0338 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95АСС 47 M дис. 1996 в Нет Тула

368. AI 0433 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95АСС - M - - - - Тула

369. AI 0319 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95АСС - ж - - - - Тула

370. AI 0318 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95АСС 65 ж фиб.-кав. 1990 в Нет Тула

371. AI 0263 777477607760731 LAM1 STR, INH, KAN, RIF 315ACC 516GTC 95АСС 58 м инф. 1999 в Нет Тула

372. AI 0472 777477607760731 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95АСС 42 м инф. 1991 в Есть Тула

373. AI 0347 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95АСС 39 м фиб.-кав. 1990 в Нет Тула

374. AI 0710 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95АСС 40 м фиб.-кав. 1995 в Есть Озерки*

375. AI 0714 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95АСС 28 м инф. 2001 А Есть Озерки*

376. AI 0473 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95АСС 74 м фиб.-кав. дис. 1961 в Нет Тула

377. AI 0598 077777607760771 LAM1 STR, INH, RIF - - 95АСС 38 ж инф. 2001 А Нет Калуга

378. AI 0604 777740003760771 LAM1 STR, INH, EMB, RIF - - 95АСС - м - - - - Калуга

379. AI 0741 777400001760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 39 м фиб.-кав. 1989 В Есть Озерки*

380. AI 0560 777400001760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95АСС 61 м фиб.-кав. 1999 в - Калуга

381. AI 0393 777740000360771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95АСС 43 м фиб.-кав. 1989 в Нет Тула

382. А1 0086 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 526GAC WT 95ACC 46 M фиб.-кав. 1987 В Есть Тула

383. А1 0133 775740003760771 LAM1 STR, INH, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

384. А1 0138 775740003760771 LAM1 STR, INH, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

385. А1 0477 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC 50 M инф. дис. 1994 В Нет Тула

386. А1 0402 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

387. А1 0443 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

388. А1 0358 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC 50 M дис. 1994 В Нет Тула

389. А1 0352 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC 61 M дис. 1990 В Есть Тула

390. А1 0384 775740003760771 LAM1 STR, INH, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC 71 M инф. 1998 В Нет Тула

391. А1 0736 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 41 M ннф. 1979 В Есть Озерки*

392. А1 0454 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

393. А1 0143 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

394. А1 0350 774000000760771 LAM1 STR, INH, RIF 315ACC 531TTG 95ACC 23 M инф. 2000 В Нет Тула

395. А1 0689 774000000760771 LAM1 STR, INH, RIF - - 95ACC 44 M инф. 1987 в Есть Озерки*

396. А1 0390 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 52 M инф. 1998 В Нет Тула

397. А1 0591 777700003760771 LAM1 KAN, RIF - - 95ACC 59 M дис. 2000 В Нет Калуга

398. А1 0043 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF 315ACC 516TTC WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

399. А1 0457 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

400. А1 0073 777777607760771 LAM9 STR, INH 315ACC - 95ACC 43 M инф. 2000 А Есть Озерки*

401. А1 0426 777777607760771 LAM9 STR, INH, EMB, RIF 315ACC WT 95ACC 32 M инф. - В Есть Озерки*

402. А1 0386 777777607760771 LAM9 STR, INH, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC 47 M фиб.-кав. 1986 В Есть Тула

403. А1 0038 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF 315ACC 516GTC 131GGTC 95ACC - - - - Есть Серпухов*

404. А1 0102 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF 315ACC 522CAG 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

405. А1 0568 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 37 M фиб.-кав. 1999 В Нет Калуга

406. А1 0583 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF - - 95ACC 66 M ннф. 2001 А Нет Калуга

407. А1 0581 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF - - 95ACC 41 M инф. 1994 В Нет Калуга

408. А1 0575 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 70 ж дис. 1998 В Нет Калуга

409. Al 0666 777777607760771 LAM9 STR, INH - - 95ACC - Ж - - - - Павлово

410. Al 0521 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF - - 95ACC 37 M инф. 1995 В Есть Калуга

411. Al 0524 777477607760771 LAM1 STR, INH, RIF - - 95ACC 36 M инф. 1995 В Есть Калуга

412. Al 0012 777777607760771 LAM9 STR, INH 315ACC WT 95ACC - - - - А Есть Серпухов*

413. Al 0405 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 526CTC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

414. Al 0720 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 39 M инф. 1998 В Есть Озерки*

415. Al 0566 777777607760771 LAM9 STR, RIF - - 95ACC 44 M дис. 1998 В Нет Калуга

416. Al 0584 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF - - 95ACC 49 M фиб.-кав. 1995 в Есть Калуга

417. Al 0590 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF - - 95ACC 26 M инф. 2000 в Нет Калуга

418. Al 0660 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF - ' - 95ACC - M - - - - Павлово

419. Al 0404 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 526GAC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

420. Al 0465 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

421. Al 0089 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB 315ACC WT 95ACC - M фиб.-кав. - - - Богородицк

422. Al 0088 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN 315ACC WT WT 95ACC 44 M фиб.-кав. 1995 в Богородицк

423. Al 0417 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, RIF 315ACC 526TAC 95ACC - M - - - - БогородицкAll Al 0011 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

424. Al 0010 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

425. Al 0341 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, RIF 315ACC 531 TTG 95ACC 40 ж инф. дис. 1995 в Нет Тула

426. Al 0514 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 69 M фиб.-кав. 1979 в Нет Калуга

427. Al 0528 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 68 M фиб.-кав. 1979 в Нет Калуга

428. Al 0595 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC 31 M фиб.-кав. 2000 в Нет Калуга

429. Al 0479 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, RIF - - 95 ACC - M - - - - Тула

430. Al 0082 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC 62 M фиб.-кав. 1998 в Нет Тула

431. Al 0397 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 77 ж остат. измен. 1955 в Нет Тула

432. Al 0533 777477607760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 54 M циррот. 1997 в Нет Тула

433. Al 0576 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF - - 95ACC 70 M эмпиема 1994 в Нет Калуга

434. Al 0597 770000000760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 38 M фиб.-кав. 1998 в Нет Калуга

435. AI 0636 775740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - M - - - - Дзержинск

436. AI 0558 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - - Калуга

437. AI 0561 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 70 M дис. 2000 А Нет Калуга

438. AI 0596 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC 23 ж ннф. 2000 В Нет Калуга

439. AI 0376 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516GTC 95ACC 42 M ДИС. 1982 В Есть Тула

440. AI 0076 777760007760771 LAM1 STR, INH, EMB, RIF 315AGA 531 TTG WT 95ACC 48 ж фиб.-кав. 1994 В Нет Тула

441. AI 0653 777760000760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF - - 95ACC - M - - - Есть Павлово

442. AI 0704 777777607760771 LAM9 STR, KAN - - 95ACC 49 M инф. 1999 В Есть Озерки*

443. AI 0697 777777607760771 LAM9 Лекарственно-чувстшгт. - - 95ACC 32 M инф. 2001 А Есть Озерки*

444. AI 0721 777760007760771 LAM1 Лекарственно-чувствит. - - 95ACC 38 M инф. 2001 А Есть Озерки*

445. AI 0032 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF 315ACC 516GTC WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

446. AI 0008 777763007760771 LAM1 STR, INH, RIF WT WT WT 95ACC - - - - Есть Серпухов*

447. AI 0606 777760001760771 LAM1 STR, INH, RIF - - 95ACC - ж - - - - Дзержинск

448. AI 0047 777760007760771 LAM1 STR, INH, RIF 315ACC 526GAC 95ACC 28 M фиб.-кав. 1996 В Нет Тула

449. AI 0665 777000000000371 LAM1 Лекарственно-чувствит. - - 95ACC - M - - - - Павлово

450. AI 0030 777740003760771 LAM1 STR - WT 95ACC - - - - А Есть Серпухов*

451. AI 0646 777740003760771 LAM1 Лекарственно-чувствит. - - 95ACC - M - - - - Павлово

452. AI 0100 777740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 531 TTG 95ACC 53 M фиб.-кав. 1992 В Нет Тула

453. AI 0737 777760007760771 LAM1 STR, INH, RIF - - 95ACC 31 M ннф. 2001 В Есть Озерки*

454. AI 0131 777760001560771 LAM1 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 516TAC 95ACC - M - - - Есть Серпухов*

455. AI 0342 777777607760771 LAM9 STR, INH, RIF 315ACC WT 95ACC 31 M каз. пневм. 2000 В Есть Тула

456. AI 0490 777777607760771 LAM9 STR, INH - - 95ACC 30 M каз. пневм. 2000 А Есть Тула

457. AI 0739 777777607760771 LAM9 STR, INH, KAN - - 95ACC 29 M инф. 1999 В Есть Озерки*

458. AI 0715 777760007760771 LAM1 STR, RIF - - 95ACC 23 M инф. 2001 В Есть Озерки*

459. AI 0077 775740003760771 LAM1 STR, INH, EMB, RIF 315ACC 531 TTG WT 95ACC 36 M инф. 2000 В Нет Тула

460. AI 0438 775740003760771 LAM1 STR, INH, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

461. AI 0455 775740003760771 LAM1 STR, RIF - - 95ACC - M - - - - Тула

462. AI 0409 777740003760771 LAM1 STR, INH, RIF 315ACC 526GAC 95ACC 53 Ж инф. дис. 1998 В Нет Богородицк

463. AI 0518 777740003760771 LAM1 STR, INH, KAN, RIF - - 95ACC - Ж - - - - Плавск

464. AI 0420 777740003760771 LAM1 STR, INH, RIF 315ACC 526GAC 95ACC - Ж - - - - Богородицк

465. AI 0419 777740003760771 LAM1 STR, INH, RIF 315ACC 526GAC 95ACC - ж - - - - Богородицк

466. AI 0469 777740003760771 LAM1 INH, RIF 315ACC 526GAC 95ACC 26 ж инф. 2000 - Нет Тула

467. AI 0020 777740003760771 LAM1 STR, INH 315ACC - 95ACC - - - - А Есть Серпухов*

468. AI 0025 003777607760771 LAM1 STR WT - 95ACC - - - - А Есть Серпухов*

469. AI 0094 777777607760771 LAM 9 STR, INH, KAN, EMB, RIF 315ACC 531TTG 95ACC 53 м фиб.-кав. 1992 В Есть Тула

470. AI 0104 777777607760771 LAM 9 STR WT - 95ACC - м - - - Есть Серпухов*

471. AI 0052 777401607760771 LAM1 STR, INH, RIF 315ACC 531TTG 95ACC 41 м инф. дне. 1998 А - Богородицк

472. AI 0462 777401607760771 LAM1 STR, KAN, RIF - - 95ACC - м - - - - Тула

473. AI 0476 777401607760771 LAM1 STR, INH, EMB, RIF 315ACC 531TTG 95ACC 46 м инф. 1995 В Есть Тула

474. AI 0682 777777607760771 LAM 9 STR, EMB - - 95ACC 22 м инф. 2000 В Есть Озерки*

475. AI 0683 777777607760771 LAM9 STR - - 95ACC 42 м инф. 2001 А Есть Озерки*

476. AI 0688 777777607760771 LAM9 STR - - 95ACC 28 м инф. 2001 А Есть Озерки*

477. AI 0687 777777607760771 LAM9 STR - - 95ACC 34 м инф. 1995 В Есть Озерки*

478. AI 0696 777777607760771 LAM9 Лекарственно-чувствит. - - 95ACC 24 м инф. 2001 А Есть Озерки*

Информация о работе

Шемякин, Игорь Георгиевич
доктора биологических наук
Оболенск, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Молекулярно-биологическая характеристика и методы идентификации клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы