Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологическая диагностика типов Ph'-транслокаций при хроническом миелолейкозе человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологическая диагностика типов Ph'-транслокаций при хроническом миелолейкозе человека"

РГБ ОД

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

Покровская Екатерина Сергевзна

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГЛЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТИПОВ РЬ*-ТАНСЛОГСАЦИЙ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛ0ЛЕЙК03Е ЧЕЛОВЕКА

/

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФРРАТ

на соискание ^"ченой степени кандидата биологических наук

Москва 1994г.

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН

Научный руководите!.: доктор химических наук, профессор Гринева Н.И.

Официальные оппоненты: дэктор биологических наук . профессор Копнин Б П., доктор биологических наук, ЕвграфовО.В

Ведущее учреждение: Медико-генетический центр РАМН

Залита дасссртации состоится__1994г в_час.

на заседании диссертационного совета Д 001.45.02 в Гематологической научном це.лре РАМН (1251о7, Москва, Новозыковский проезд, д 4а) ;

С дассертаци-й ыохаю ознакомиться в библиотеке ГЬЩ РАМН Автс реферат разослан___1994г.

Ученый са.*ретарь диссертаццош: эго совета,

кандидат биологических наук Релтс Б.Д.

Т00аРосгапро1зас?Щ)оувЗак276 Т^.1С0

' ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Хронический миелолейкоз (ХМЛ) относится к числу нсошмстическнх заболеваний, характеризующихся злокачественной трансформацией стволовых клеток-прсдшествеиников rcvioncma

Специфическим маркером ХМЛ является филадельфийская хромосома (Ph% которая обнаруживается у 95% больных и возникает в результате реципрокной транслокащш t(9;22). Почти во всех случаях ХМЛ и в 50% случаев Ph'-ОЛЛ разрыв 22 хромосомы происходит в небольшом локусе МЪсг, размером 5.8 Icb. В результате транслокации образуется "химерный* ген BCR/ABL, с которого считывается гибридная Ъсг/аЫ мРНК размером 8,5kb и синтезируется скнтпый белок bcr/abl р210.

КлассггчссгийметоддетехтированияPh'-хромосомы- щггогенетические исследования. Однако, обьпчюс кариотапнрование без применения флуоресцентной in situ гибридизации является недостаточно чувствительным методом. Кроме того, существует 10% цотогснетвчески РЬ-негативных ХМЛ, когда транслокация на молекулярном уровне происходит, но бывает замаскирована вовлечением в неё других хромосом. Существующие молекулярно-биологнческие методы детекции Fh'-хромосомы позволяют с большой точностью определить ее присутствие в клетках крови и костного мозга и тем самым установить диагноз ХМЛ.

• Наконец, существует еще одна причина для применения молехулярно-биологических методов для изучения Ph'-транслокаций. В зависимости от точка разрыва внутри локуса МЪсг образуются различные тепы Ph'-хромосом, не отличимые на цитогенетическом уровне. В настоящее время в литературе широко обсуждается вопрос о возмозвоа прогностической значимости зоны разрыва в МЪсг для характера протекания ХМЛ. Методы молекулярной диагностики, обладающие высокой чувствительностью, оказываются полезными не только для диагностики ХМЛ и определения типа Ph'-хромосомы. С развитием кардинальных в интенсивных программ лечения они находят широкое применение для слезсения за поведением лейкозного клона после применённого лечения. Успешные пересадки костного мозга и интерфероиотерапия приводят иногда к полной, но чаще к практически полной элиминации лешеозного клона. Для выявления "остаточного заболевания", т.е. тех лейхозных клеток, которые, несмотря на лечение остались и могут начать вновь пролиферировать, представляя тем самым опасность нового ветка болезни, методы молекулярной биологии являются незаменимыми. Для определения зоны разрыва внутри локуса МЪсг в гене BCR променяют методы блот-гибридязашш и полимеразпой цепной реакции (ПЦР).

Цель работы - разработать и предложить для практического применения в клинике м олекулярно-биологические методы диагностики РЬ'-гранслокапий в оценить значение типов Ph'-транслокащга для характера протекания ХМЛ.

Задачи исследования:

1. Клонировать геномные ДНК-пробы для блот-гибрядизацконного анализа локуса МЪсг у больных ХМЛ,

2. Синтезировать прабмеры и наладить использование метода ПЦР для диагностики двух основных типов BCRMJ3L мРНК,

3. Определять типы РЬ'тралслокаций у больных ХМЛ, используя

-к-

мстоды блот-тибрщщзащга и ПЦР и изучить зависимость стадий заболевания от типа РЬ'-транслохации,

4. Проанализировать возможность применения разработанных методо; дна оценки прогностической значимости типа РЬ-хромосомы для характера протек ашк ХМЛ. ,

Научная новизна. Получены ДНК-пробы и применены для молекулярно-бнояошческой диагностика ХМЛ. Для определения типа РЬ'-траяслокации разработав метод блот^гнбридтадии с применением только одного молекулярного зонда, что упрощает и удешевляет этот анализ. Разработан модифицированный метод ПЦР с двумя парами прайм еров для детекции двух основных типов ВСИУЛВЬ мРНК. Применяя методы блот-гкбрцдкмднп и ПЦР, проанализированы типы РЬ'-транслокацнй у 41 больного ХМЛ и, совместно с сотрудниками Отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона ГНЦ показано, что тип РЬ'^ шелокацип может иметь значение для прогнозирования характера течения ХМЛ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Первой всесоюзной конференции "Геном человека", 1990, г.Псреславль-Залесскин, на Международной конференции патофизиологов, Москва, 1991.

В целом работа была апробирована на заседании проблемной комиссии "Экспериментальная гематология в биотехнология" ПЩ РАМН 1 Еоабря 1993 ■ года.

Практическая значимость. Разработанные молекулярно-бнологичсскве методы диагностики РЬ'-транслокахрш при ХМЛ предложены для широкого внедрения в практическую медицину. Эта методы позволяют не только однозначно определять наличие РЬ'-транслокацин в клетках костного мозга н крови больных ХМЛ, но и детектировать тип транслокации, что жжет иметь прогностическое значение. Кроме того, данные методы детекции РЬ'-транслокацнй незаменимы при контроле за результатами лечения, в том числе после пересадок костного мозга. Поэтому мы убеждены, что молекулярно-биологическве методы долзгаи найти питрохос прсаспишЕ рдя дгтегащн РЬ'-транслюкаций при диагностике ХМЛ н контроля за леченжы.

Полоксшя. выносамьта из зшзгдту. Получена ДНК-проба на локус МЬст, и разработаны системы определенна тппоэ Рп'-трснслосацай прп ХМЛ -методами бдот-габрадпзашпз с прикежииен одного ДНК-зонда & 4х рестриктаз в пояамгразной цепной реакции на специфических праймерах. Проведена гснодаагеосшка тина РЬ'трахсоохацни У 41 больного ХМЛ.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 5 научных работах.

страницах мяшлношггиого текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы н методы исследования, результаты, обсуждение, зазидачеаие, выводы п список литературы. Список литературы содержит 78 ссылок ва отечественные в зарубгжпые источники. Диссертация иллюстрирована 8 ркгукгамд.

-

Работа выполнена в лаборатория геяноь инженерия ГНЦ РАМН. Зав. лаб. и руководитель - доктор химических наук, профессор Грине»? Н.И. ; со-русовпд!Пхль - с.н.с. Дошотпский Д.А.; в сотрудничестве с отделением химиотерапии лейкозов ГНЦ, зав. этд. доктор мгцициискил наук, Хорогпко Н.Д.

Содержание работы

По мере развития цнтогенетнчесхнх и молеку яриых технологий выаснятгса, что все большее число хчокачественных заболеваний крови связа. .о с генетическими аномалиями. Поэтому проблема молскулярно-биологической диагностики лейкозов приобретает все большее зр~чение. Клао. леским при? -ером приложения молекулярных технологий для диагностики лейкозов является молекулярно-биологнческая детекция ГЬ-хромосомы при хроническом ммелолейкозе человека. РЬ'-хрсчооома образуется в результате рецкп^окной транслокация i(9;22), на молекулярном уровне приводящая к перемещению протоонкогеиа ABL в локус МЬсг с образованием химерного геля, и является специфическим маркером клеток крови при ХМЛ (рис. 1). К началу нашей работы было известил что -ромосомтя траислокацня t(9;22) при ХМЛ протекает t образованием РЬ'-хромосомы двух основных тшк.;,, 5'- и 3'-, в результате которых образуются тра"схрипты Ь2а2 и Ь?г~ соответствег но (рис. 2), и которые могут быть детектированы с помощью методов молекулярной биологии. Такж; появились предвг ригельные данные о корреляции типа Ph'-хрочосо? >ы и характера течения ХМЛ.

Для тоге, чтобы иметь возможности детектировать 51- и 3'- типы РЬ'- хромосом • при ХМЛ и подвиги к зученшо их значения для течения XUii на? ч были peau, юваяы два подхода; !> Блог-riit ¿ядизации геномной ДНК из слеток крови и костного мозга пациентов с ДНК-зондами на локус МЬсг. Для этого были полупены клонир аанисм ДНК-пробы, выбрав компетента jfi ЧНК-з^ яд в разработаны методы детекции П"тов Ph'-транслокацин блог-гибриднзацпей с применением одного этого зонда и 4х эпдонукдеаз; 2) Анализа химерных Ьсг/аЫ мРНК ..з клеток кро а и костного мозга больных ХМЛ с приме, етга» полимеразпой цепной реащии с использованием выбранных нами аяигонуклеогндиых праймеров.

Таким с'разом, в настоящей работе предложена модифицированные системы для диагностги разных типов Ph'-транслокацнй с помощь' методов блот-гибрлдизяцки и полиыеразяой цеггоой реакции. Система шпробарована при двагиоегке ттша Ph'-транслокацни у 41 больного ХМЛ в предложена для широкого внедрения в практику для милекулягчо-бпологической детекции Ph'-травеяохацнй. Совместно с сотрудниками отделения химиотерапии леё_:озов ПЩ проведено исследование с целью определить, существует ля корреляция между типом Ph'-тран локации г характером прс гекания ХМЛ н установлено, что тип транедокациа могет иметь прогностическое эпапение.

Для получения геномных проб на локус МЬсг провели скрининг биг тиитеки л снов "еловека. Для скрининга использовали библиотеку геиоывог ДНК человека в век »ореСЬагог 4А, полученную Мааиатиса (США). В клчг-лте проб дот скрининга бкблнотегч исп1льзо_-алн два |32]Р- мечешых 22-члеяяых олнгопуклеотпда из этнов Ь2 и ЬЗ локуса МЬсг (В1 н ВЗ соответственно). Экзгчы Ь2 и ЬЗ находа.-сг в центральной, летя МЬсг, внутри

К)

Ь -

22

век

АВЬ

9;+ Щ-(РЪ')

Е23

,5'ВСЯ З'АЫ.

Г 51 АВ1.

I 5'ВСК

В)

50

100

<50 20о

250 КЬ

1к

А&1- 4-

.11

л_и

!1

а

1 ♦ 11 1-№

РЦ'Аи

CML РЦ*л 1.1.

¿С А

11 Л

1с ьы л оку; л Нксг

-нда^А.'»-

. с*.

Н!л<М'

Ж I Ж ♦

2Ь Ч

МЬсг ^

n

^ I ]

_Ш_I

ЧЬ

З'-ЛроК»

Ш

РИС. 1 А. Схет хроносоиной т;зяелокацни Ь (¿;22).

К Структура локусов АЛЬ и ВСЯ человека. С В 1 ЛВ1~ и ВСЯ- экзопы; И ] - об лас. к разрыве хромосом 9 и 22;

----------------.р/^^гчпп |ГЗГ¥РЯ ЛПКЧПЯ- Ы-Ьсг.

-т-

'Ы Ь2 ЬЗ Ь4 15

r/—CZ3—19—0—О-Q4ZZZZ]-

г** У Ь2 ¿2 у Ш ЪЪ hl

inPHK

шслпшш

Рис.2. Струхтура лохусоз ABL и BCR чая*река. 1а и 1Ь -альтернативные явргче э^зокы гена ABI. а2,аЗ,.экзокы гена AF.X.; Ы,Ь2, ..- экзоны лсуса НЬсг. Приведена структура химерны." Ьсг/аЫ генов и мРНК, образующихся п^и хромосомной транслояации t(9;22). Iопизонгатьными стрелками обозначено положение праймероз для ПЦР. 120 и 200Ь - размеры фрагментов Ьсг/гЬ1 к ДНК, образ; тяихс : при амплификации с использован, гм пары праймеров А1>В1.

одного EoR I-фрагмента ДНК, поэтому скрининг библиотеки генов (полученной по EcoR 1- сайтам) с использованием указанных зондов позволял с высокой вероятностью env орать интересующие нас геномные фрагменты. После * повторного скрининг? полученные индивидуальные клоны анализировали методом рсстриктного анализа и блст-гибридизацнь. В качестве тобь; исполь зовалн 32-Р меченный 0.8kb фрагмент ДНК, содержащий геномные последовательности Mbcr и полученный в реакции амплификации (ПЦР) с ДНК челочка с использовшгием тех же прайме^эв В! чВЗ. hi 500000 рскомбняантных клонов было отобрано четыре, гнбрнднзующихся г зондами В1 и ВЗ. '"»дин го этих итогов -BCR 1.1 был препаративно наработан и картирован рестршсци^нным и блот-гибридмацнонным методами (рис.3, его рестрикция карта приведена на рис. 4). В качестве ДНК-зонда для картирования слона нспо. . ^зовали 0,8 kb прагме т ,~НК ло!г ia Mbcr, полученный в реакции амплифик.-чщи с матрицы геномне.» ДНК с использованием олигонуклеотндов В1 и ВЗ как прай. 1еров. Мечеть. агтлифицнрованного фрагмента гс..омной ДНК осуществляли методов ПЦР с использованием меченых праймеров и добавлением ь реакционную среду -32Р dNTP ч соотношении к "Чолодныч" ''NTP 1:'0.

В1: У- GGAGC 1GCAG ATGCT GACCA АС - 3'

ВЗ: 3'- CAGTA GCAGG ТС \GT CGGTG АС - У

К as рчдно ш рис.4, рестризщионная карта полученного клоня несколько отличается от литературных данных. Особенно сильные отклонения обнаруживаются в области, соответствующей З'-МЪ-т, размером в 1,5 т т.н. По-квдкыому, расхондсшы в естрлкццг тшон карте этого клона с литературными данными объясняются перестройками, происшедшими в процессе клонирования.

И^ клона BCR1.1 нами были субклонированы в гшазмидь. два фрагмента: 2,0 ко BglII/НшиШ (р2,0 Bg/H) в 1,9 kb riamHI/EcoRI (pl,9 В/Е). Для субклоннровапиа ДНК клона BCR1.11лдролизовали ресгрнг-азамя Bglll (Bg) a Hiadlll (Н)апя полу -»ення 2.0 kb Bg/H фрагмент^, и { ?стршггазамн Ваш ГЧ «.В) и EcoRI (Е) для получения 1.9 kb В/Е фрагмента. После электрофореза продуктов рестрикции в 0.7% агарозном геле фрагменты нужного молекулярного веса вырезала из геля. Лвгнроааны изолирова.лшх фрагментов фш ового клона 4CR1.1 п лианерпзованного соотБстствующнмч рестригтаза: а вектора проводили в шшгмалъыом об'еме из расчета 1 икг ДНК на 10 мкл лигазной смеси в молярном соотношс чи вектор: вегавка -1:1 в тет- ^нис ночи гри 11J С. Лигазной смесью трансформировали компетештше бактерии штамма JM109.

ДНК- пробя р2.0 Bg/H соответствует огшеанк^му в литера! ,т>е так Еазызатому 5'- зопду (рис.4), который пп.роко приз .-няется для картирования логу с? хромосомной трапелокацп t(9;22).

Клонированный :ами З'-участок BCR1.1 (pi,9 Bip'E) при гибридизации с геномной ДНК давал большое количство несп' тифическнх полос ("тлену"), что говорит о присутствии повторяющихся последовательностей в этом районе, и поэтому в сачгстае зонда использоваться не мог. Ввиду того, что рсс^риктная карта этого района сильно отличалась от онпсанвого в лнттоатур^, оыло просадсао сегБикфовани® ветархив плазмидс pl,5 Зт/Е с EcoKl-r ->нца и oszsa-iocb, то bmcv ."О охпвдаемого в эго_х раяо~е эгзона Ь4 (рис.4) здесь • jsosisjniso&aH Alu-позтор («сканирование по Сэнгеру в этом случае, . также 0.8 kb фретешга, полученного истодом ПЦР, было пр. ведаю совместно с Суриньш ЧЛ. и Тш-вевьш А.Ф.).

1 5 Й 5Г £ « 3

Рис.З Рестрикиио-'н^е и Слот-гибрякизаш .энное картиропнме клоп.. ВС1Г.1. Наверху представлены результаты электрофорзтиче~кого разделения в 0.7% агарозном геле растрикиионнкх фрагментов ДНК ^точа В<_а1.1, вгизу -результаты блот-гибри„изаиий этих фрагментов с [32Р] -' меченным 0,й кЬ фрагментом гагомной ДНК метоюм ^СЯ) . Маркер - ДНК фага , т зролизованная Н1пс11Х1;1). ДНК фа'га ВСМ 1 гиь^олиэовали рес^риктата..« ЗсоК- (2), Lincn.II (3), Н1г-ии+Ес7Е1 (4), ЗатМ ВаиН1+ЕсоЯ1 (б), ватнл+н1пс1111(7), ВдШ :3), Крп1 (9).

-Ъ-

$Ы1!И АОфСА Икс.

Со 6

л_г.

I г.п.н.

Во к ? 1—*

15 В

8о

1

" .. с

—

-1 I

р'г.ов о/н

' ы иг м1

ы

>1 1!

Л I

I

^-/»»¿е I ' з-'/тай.

{ - I 6.8 т.п.н.

вТ~& ■

Р Г.ги/Вд

од

1*1 * 1 Т

Во

-в-

?.! . " •

I

I

р 2.0 00/н I-

Ы О2 -3-

I I 8 * |

J

о (.9 о/е

р 0.5 ь/х

£

Рис.4 Рестрикционные карты 17 т.п.н.' ЕсоГЯ-фрагые'.тов: гена исй, содержащего локус МЬсг (бверху)и аналогичного участка из клона ВСЕХ.1(вниау). Звездочками отмечены измененные сайты некоторых рес^риктаз, значком 3'-область МЬсг в клоне ВСЯ1.1, отличала"яся от хчномных последователь: зстей гена ВСЯ. ".низу рестрикииошшх карт показано положение фрагментов, используемых'в к.честве ДНК-проб(описанных в литергтуре и порученных нами). Принятые сокращения в названии рестриктаз: Вд -• Вд1И, В - ВашН1, Е - ЕсоЩ, Н - Н1пс1Х1Х, Ч - КрЩ, Б - £ -с1. X -

Полученные результаты позволяют нам предположить, 'пхз во вставке ; фагового клона BCR 1.1 произошла рскомбиллщм, в результате которой в У-область МЬст встро1иась последов;, ¿-ельность неизвестного происхождения. j

Полученную нал. ,i ДНК-пр бу p2.0Bg/h мы применили для дегегция типа РЬ'-транслокаций методом блот-гибриднзации. I

Анппиз структуры локуса МЪсг методом ^лот-гибршпоапии. _Критерии разделения РЬ'- транслокаций пг типы,

Г -номную ДНК выделяли из 10 мл крови kid I мл суспензии клеток костного мозга, сметз1шых в соотношешш 5:1 с . люгкчиром для предотвращушя свертыва,а.л. Ядерные клетки лизировали и инкубировали в течение ночи гри t 55 С со 100мкг/мл протеиназы К. ДНК отослали от белков экстракцией фенолом (рН 7.5) и затем хлороформом.

Блот-гаориднзацию проводили при 65 С в течение иочя с использованием мечешплх 32-Р ДНК-проб, полученных в рез'_, тьтате субклонирования. 10 мкг геномной высокомолекулярной ДНК подвергали гидролизу соответствующими рестрикт-чзамк проводили электрофорез продуктов рестрикции в 0.7 % агарозном геле. Затем ДНК в геле денатурировали, нейтрализовали и переносили на нитроцеллюлоза te фильтры методом хапиллярног. переноса в растворе 20xSSC.

После гибридизации фильтры отмывали и автографы зкгпонитоголи 16-24 часа с усиливающими экранами при -70 С. ,

На [-тс. 5 приведены данные определения точки разоыва 22 хромосомы в ' геномной ДЬК m лейкоцитов крови двух больных (N19 и WJ) с помощью . :олучеяного вами 5- зонда <р2,0 3g/H). Методом блот-i лбрндюяцпи с помощь» нашей пробы выявляются индивидуальные полосы, характерные для 22-й хромосомы: (10 kb - HL.dIII, 12kb-BamHI, 4,Ь leb - Lgl Г и 5,0 Lb - SacI), a также присутствуют дополнительные, вариабельные полосы, характерные для Ph'-хромосчмы. Ht~nrme нормальных полос гибридизации связано с тем, что в тр'нслокацию t/(5;22) вовлечены по одной го»<ологачной хромосоме из пары ((9,22), поэтому в кленах крови больных обычьо присутствуют нормальные 9-я и 22-я хромосомы. Результат., этого эксперимента показали, что полученная проба является пецифичной для локуса М">сг и может быть использована для определения мести транслокации в МЪсг. Действительно, область разрыва 22-й хромосомы локалнзовлчз у пациента N19 между с; тгами рестриггаз BamHI и SacI, а у пациента N28 - между сайтами рестриггаз SacI и Bgl II. В литературе принято относить первый случай к 51- типу, а второй - к типу хромосомной транслокации t(9;22). Критерием дл- разделения на два основных т_ла Ph'-траислокидай (на уровне ДНК) принято считать наличие (З'-тип) кчи отсутствие (б'-тип) неизменёгного сайт» реегриктазы HLdlll, лежащего в З'-направлении от экзона ЬЗ. Хота по сути дела значение, по-вктимому, имеет при'-угсгвие или отсутствие j химерной ЪсгУаЬ» .Л-НК экзона ЬЗ локуса МЪсг (рис.2,4^ Описанные в mr-eparryp методы опреде-ения точи разрыва внутри локуса МЪсг в гече BCR основаны на использовании двух ДНК-зондов (3'- в 5"- ггр бы МЪсг) и Зх рестрикяионных адонуклеаз (BamH I, Г*1 II и Hind III). 3' -прооа гомологична 4 зсае МЪ-г (рис 4) и представляет собой 1,2 kb HindIII/Bgl ii -фрагмент. л локуса МЬст. Э\ у проС у пркмещрот для того, чтобы ут^ таить нахождение сайта, оестриктазы Hind III, что, в сво»-> очереди, опр деляет о гаессние ,-адной транслокации к 5"- или i - ivny. Мы предложили отказаться от применения 2х проб и упростить анализ, примени, рестризггазу SacI. Тем самым, мы кмесм

- а-

а*»"! н;«ав

5'

В-гё Нт<5§ ^ &4П,И1 и.

-М-

Г~

I ь)^ Ц—в-»

| е> гь

I—■—

5 ргоЬе

-19

зы

I I

ь

£8 I.

*Г

ч

Риг.5 Елот-гибрштизационный анализ геномной ДНК больных <N19 и N2?) ХМЛ (а). В кау->стве Щ1К-пробы использовали р2, ОВд/Н. ДНк гидролиэовали рестрикта^аыт': Н1пс11Х1 (1), ВатН1 (2/, Вд1 11(3) ч Бас1(4) Значком А отмечены измененные фра.манты ДНК, относящиеся к РЬ'-хромосоме. (б)- Рестрикционная карта токуса МЬсг с указанием мест хромосомной транслокации для бол" ных Р19 и N¿8. Сокращения в названиях рестриктаз,

ЗЬ

-Ai-

возможность детектировать с помощью У-пробы с большей в'тюятностью присутствие или отсутствие экзона ЬЗ. Если сравнить структуру геномного ло-уса М-Ьсг (см.puc.l) со структурой гибридной bcr/abl мРНК (см. рис. 2), то можно заметить, ты использ(..шше сайта S~c Î в качетве "граница" для различных типов транслокации t(9;22) более корректно (ввид" его более близкого расположения к эгзону Ь'), чем общепринятого З'-сайга HindIII. Таким образом применение дополшт-тьного анализа по рсстриктазе Sac I и 5 -пробы позвотяет разделить больных на две группы: с 5'-(зоны 1-3) и 3'-(зона Ph'-транслокаииями (рис. j, 7V

И ак, полученная нами ДНК-проба, р2.0 Bg/H, может быть использована для тестирования различных пшов Ph'-транс)юкэцпЗ- Мы погашали, что, ь-пользуя ,гтя анализа ДИК дополнительно рестргастазу Sacl, можно ограничиться применением одной S'-пробы. Это позволяв» достаточно точно определять присутствие экзона ЬЗ МЬсг ча уровне "ЦК, что и является критерии для разделения i*h'- транслокаций на два типа: У- и 34

методом г элимс разной пепой реакция.

С молекулярно-био-огической точки зр< тия более правомерно дифференцировать типы транслогаций по структуре образующихся химерных Ьст/аЫмРНК. В зависимости от точки разрыва 22 хромолок^л прт ГМЛ могут образовываться гибридные Ьег/аЫ мРНК двух типов Ь2а2 и Ь3а2, что соответс. .вует 5Ы 3'- типам транслстации соответственно. В случае Ph'-транслокации для ПЦ1 анализа невозможно использовать гег змную ДНК в качестве матрицы, так г*к разрывы находятся в шггронах большого размера. Однако, возможно анализировать мРНК, проведя сначала синтез кДНК, а ззггем ПЦР, исполк./я в качестье прайм еров олигонуклеотиды из экзона о2 Mbcr а экзона а2 гена abl (см. схему Fa рис.б). Такие олигояутлеотиды была синтезированы, и мы использовали их в качестве праймеров для ПЦР.

В зависимости г места транслокации в результате ПЦР образуются 2 типа урагмевтов: 120 Ьр (Ь"а2 - тип мРНК) и 200 bp (b_ta2 - тип мРНК) (рпс.1,6а). При S- типе транслокации синтезируется Ь2а? мРНК,

а при 3' типе - ЬЗа- мРНК. Надо отметить, что Je всегда удается получить результат в описанной системе амплификации. Мы щ даожияи модифицировать эту систему, используя две йнук^ систему праймеров В. +А1 и В2+А2. РНК выделяли го клеток крови и костного мозга гуанидин-изоти<чшанат/ОС1 -методом. Для анализа р-зличных ьариаятов bcr/abl mPI.K методом ПЦР сначала получала кДНК с матрицы РЧК реакгче*1 обратной транскрипции с использованием в качестве прайм ера олигонуклеотида А2, а затем гтоводшг: ПЦР.

Для снижения неспецифичносга и д"чвнзуа~изацип продуктов Ашлвфнгации «сполыовала двойную систему прадмеров: А1/В1 -внутренние ИА2.32-внет^ие пра. .меры (рис 8а). Сначала п/хзводшш амплификацию в присутствие парь* праймеров (А2+В2^ при температуре отжига 45 С. Затек. в реакционна среду добавляли в.орую пару праймгтоь (А1+В1) и проводили еще 15-20 тиклов амялифгтацин при температуре отжига 65 С. При этом отсекалась г -с веспецифичные продукты ai тишфихации, которые получались в первой реакции, г пара праймеров А2+В2 не рабоЦл-, так как-»лшература отжил была существенно выше температуры денатурация для этой пары.

А

В2 Bl

Hl

AI Ä2

Ь2а2: Ъ2 |

' 120 п ч. —i

В2 Bi Н2 Al А2

ЬЗа2:

Ък

ЬЗ

h2

2С0 п.н.

Рис.б; а: Структ.-ра .имерных 1-~г/ао1 мРЧК, образующихся при хромосомной транслокацк .- t<9;22). Горизонтальными стрелками обозначено положение праймеров (Al и В1- внутренне, А2 и В2-внвшнив праймеры для PCR; Нх и Н2-гибризацйоонныа олигонуклеотиды). 120 и 200 н.п.-размеры фрагментов Ьсг/аЫ кДНК, образующихся при амплификации с ис -.ользованием пар,- npaíUepos А1/В1.

б: Результаты ПНР анализа Ьсг/аЫ к ДНК: метоим электрофореза в 5% полиакрила^дном rej.j (слева) и гибридизацией [32р]- меченными олигонухлеотидами Н1 и НГ (справа). мРНК выделяли из клеток jq-ови (1,4) ь^и костного мозга (°,Э,5,6) четырех больных ХМЛ '1,2- N12; З-К-З: 4.5 -.;2: 6-N27) .

-

Al: 3' - CTGAAACTCGGAGTCCCAUACT - S A2: 3' - TAAAACACCGGTCACCTC - 5 41: S- GGAGCTGCAGATGCTG/iCCAAC - 3' B2-. 5' - TTCAGAA3CTTCTCCCTG - 3*

Таким образом, в первом цикле с исполг зовапием внешних прайм еров В1+А1 реакционная смесь обогащается специфическим п^юдуктом ПЦР, а последующее применение внутрешшх праймеров В2+А2 позволяет добиться визуализации продукта ПЦР.

На рш /ике бв приведены результаты ПЦР анализа для двух больных XMJI. В клетках костного мозга больного N 12 детектируете" при электрофорезе продуттов ПЦР в акриламидном геле полоса 120 п.н. (рис.6,6, дорожка 2), чгго говорит о присутствии Ь2а2 типа мРНК, т_гда как у больного N 23 - 200 п.н. (ркс.бб, дор.З), что соответсг-ует присутвию Ь3а2 теп мРНК. Интересно ^тмспгть, что у Ьольного N12 даже с использованием двойной системы праймеров (см. ркс.бб, трек 1,) в клетках периферической крои отсутствовал продукт амплификации, что указывает, по-видимому, на элиминацию лейкозного клона из г-риферичеекгт кро: з в результате лечешя.

Варианты транслокации, при котормх точка разрыва 22 хромосомы находится правее Ь4 экзоиа будут тес—кроваться при дани й системе ан. лиза структуры мРНК как фрагменты большей, чем 200 Ьр длины ( размеры амплнфицнрованшьл фрагментов ber/at* кДНК при этом будут отличаться от 200 Ьр *»а вогтчт ту экзонов М,Ь5,..). ,

Необходим, отметить, что описанные в литературе системы амплификации bcr/abl кДНК с использованием только одной пары праймеров потти всегда требуть г дополнительного блог-грбрнд^зационного анализа для определения продуктов амплификации. Использование двойной системы праймеров позволяет в болыт_лстве случаев избежать применения блот-^'Н? ^ндизидии продугтов ПЦР. Блот-гябридязапию продуктов ПЦР проводили с i ".пользованием [32]Р- мечепнкх олигонуклеотидов Ы и Ш (рве. 6а). Из рис. 66 вцлно, ч. э и блот-гиб; гщиззцией не всегда удается обнаружить ocr/abi мРНК в хлеп. л крови больных. Об ^том свидетельствует отсутствие полосы гибридизации в препарате мРНК т. клеток кр">ви ( рис.66, трек 4 ), хотя в препарате м^НК, выделенных параллельно нз кле.ок костного мозга этого же мюльного, она присутствует (рис.бб, трек 5). Учитывая вас-кую чувствительность ыь,ода ПЦР, это связано, по-г щимому, с особенностями. рспарзтов мРНК. мРНК, выделенные из костного мозга, более информативны, чем из периферической крови. Особенно это капается больных, коте tbie прошли курс химиотерапии. j>ro связано, во" ложно, с э~ташнацией т переферическс"; крови яейкозных клеток с повышенной экспрессией bcr/abl мРНК. Клетки ж<-ксстного мозга в сроят: э более резистентны к воздействию цитостатиков.

Таким I. Зразом, применение метода ПЦР мРНК из клеток крови н -устного моз! i больных XMJI позволяет оиредслить не только ьаличие Ph'-трансяокь зга, но .-акаге тип bcr/аГ. мРНК. Применяя двойную систему праймеров, в большинстве случаев мы детектировчли Ph'- хромосому без допо/ чительного применения блот-гибркдизацин продуктов ПЦ~> с ояигонухлеопдамн h 1 н Н2 в качестве проб. Одна-о, в отдельных случаях мы применяли и такой анализ.

_£гздацис крдлегтшьШК яРНК больных XMJI анализом 51- и 3'- типов Ph'- транслокагог".

РазраЬотвэ опасагоше выше кптзды, мы поставили задачу определить тип РЬ'-трансижддаи у больных с диагнозом ХМ Л. Была составле".з коллекция ю более чем 200 образце i ДНК в мРНК, выделенных из клеток крови к костного мозга больных ХК Л. В общей сложности у 41 больного тип РЬ'- транслокации был усгано^лсп с помощью обоих методов, Ьшт-гибрид._мц}т в ПЦР

На рис.7 представлены результаты установления типа Р* '-трапеяокации у 2S больных ХМЯ, определенные с помощью метода бло. -гибридизации (вверху) и методом ПЦР (- кизу). Учет больных, усгчювлегчг клинического диагноза и лечение осуществляли сотрудники отделения химиотерапии лейкозо" и патолс_и эритрона ГНЦ, заз. отд. докп:.мед.наук Хоронпсо Н. Д.

Р зультаты ПЦР и блот-гибридизацио! юго анализа совпали н позволили одн значно ) становяп» тип РЬ'- транслокации. Интересно отмстшг, что в некоторых случаях взго^исслед^вг-ши прис-тствовали Ь2а2 и Ь3а2 типы мРН'С одновременно (рис. 7, NN '!, 161:; Мы предположили, что это примеры альтернат iiBH^rc сплайсгвгго. Те есть, точка разрыва находится в irrponc »кжду ЬЗ и Ь4, и экзон ЬЗ и кет *>ьпъ включен или нет в мРНК. Как видно нз рисунка 7, методом блот гибридизации эти больные попали в третью эо'-у, что подтверждает возможность описанного выше явление. В литературе опйсашл аналогичные примеры и было показано, что даже при наличии экзона ЬЗ г химерном гене BCRj ABL за счет альтернативного спла,<"инга мо. jet образовываться не только ЬЗ-f'' , но в Ь2-а2мРНК. Аналогичные результаты были опкеалы и для пациентов с точкой разрыва 22 хромосомы в зонах 4 и 5. В общей сложности тал Pú'-трдислокации был установлен у 41 бояьпого ХМЛ: 25 - с S- типом и 16 - с 3'- типом траяслокацни. При определения точки транслокации в сложных случаях необходимо применять оба метопа: ПЦР пблот-гнбридиэацнонный анаак- так как метод ПЦР является высоко чувствительным и ничтожнейшая контаминация чужеродной Т.НК может прывесга с вссажешпо результата и ошибке в диагнозе.

Опенка прогностической значимости tm.j РЬ'-транслоагаяяи.

В литературе обсуж/^етса вопрос о влиянии места разрыла 22-м хрпмоесмы ва клшшко-гематологические особенности течения ХМЛ н о возможной прогностической значимости ¿очг- разрыва в экуи.; М-Ъсг. Неооходгеио отмстить, что полученные па настоящий момент данные, г >стзго«шо противоречивы, Иашьш согзторам.» из отделения химиотерапии лейкозов и патологи.- эритрона ГНЦ было проведено сопоставление их. ничечшх даняых и особенностей протекания ХМЛ у 41 больного с полученными нами результатами по определению .очек разрыв^ у эт"х больных в. .окусг Mbcr. В анализ ^ьиш вк^иочены паписты с типич: .)й клиго; о-геиатологй"-жко" картиной ХМЛ, в лейкозных слет-ax которых присутствует РЬ'-хроиосоыа а х^мекп са изменения чнут[~ч зоны М-Ьсг Мее. о разрыва 22-й хромосомы в soseyes M-bcr определяли 2 методами: бдот-гЕбрндизацио-шым анализом гсьсмной дНК п амплификацией последовательностей bcr/abl мРНК.

По месту транслокации t(9;22) больные бьшп разделены ка 2 группы с 5*-типомтрапсло1.лцп1 п с 3'-типомтралсяикащш (рис.7). Одяэхо, кои^^пяция пша РЬ'- хромосомы со стадией заболевания в этих иссл довавнах пе обнаружена. Это согла< уегтея с дапнь" ш зарубежных рабо^.

В то же время анализ выявил почти 2-кратное увипгчгш«; выгпя .сиости у больных с 5*- типом транслокации пс :равитих> с З'-типо*- (рнс.8). На рисунке 8 приведем! кривые выашваемоста для бсаьши с 5*- и 3'- типами РЬ'-

5S

5,7,8,11, i2s 17,18, 19,20,21

9,22

I

î

23,^.27,28

I ï

1 « ! i i i i _ 1 _ 1

I ïï -A ml iv I v I

i 2 * M 5

2 о i 2 S ( й ^ ^ 2?

ьа^а &ьза

7, 16,17

Рис.7. Распределение "больных ХКЛ " п"о~ группам с 5'-и 3'-№'-транагокациями методами блот-гибркдизации (вг-ерху|и ПЦР (внизу). Римскими цифрами обозначены зоны, на которые принято в литературе делить локус МЬсг. Ы, ЬГ,

100

Ыс. § Крив'Аи выживаемости больных ХИЛ с 5'- к 3'-типами РЬ' -тран^лохаций. Кру>зыа построены .ю методу Каапаиа-г-иера

тганслокаций. Kptreue построены по методу K.apl£~i-Meier ,195С (из книги В.В. Двойрнн, А.А. Климснков "Методика контролируемых клипнческил испытаний", Медицина 1985). Вьа нвасмость как характеристика группы больнь* включенных в исследовашгс, представлена ломан чй кривой, каждая точка которой отражает 1 смерть в популяции больных. Медиана выживаемости - это тот срок, до которого доживает 50% больных дашгай группы. Медиана выжга. демости в группах с 5'- и 3'- типами РЬ'- транслокаций составила 60,8 и 32,4 мес. соответственно. Следует также отмет«.гь, что в обеих группах *Чши "долгожип.ш". Однако оличество больных, проживших больше 5 чет в группе с 5'-1атом составило 40% (7 человек), а в группе с 3-т"пс л -18% (3 человека) от общего числа больных, наблюдавшихся в каждой группе (25 и 16 соответственно). Таким образом, тин данные свидетельствуют, что наличие У-тапа Ph'-хромосомы в лейкозных клетках указывает на более благоприятный прогноз течения ХМ Л. Однако, исследования в этой области требуют продолжения, и, прежде всего, не бходимо накопление данных о большем количестве больных.

Л о данным литературы вопрос о прогностической значимости места точки разрыва гена М-Ьсг является спорным. Так, К. Mills и соавт., 1989 обнаружили прямую взаимосвязь между 5'-типом Ph'-тромосомы и более длигег~.вой ХФ по сравнению с больными ХМЛ с 3'- типом, продолжительность X которых составила 55 и 25 мес. соответственно. Однако имеются и сообщения, где такой взаимосвязи не установлено. Предполагаете, что возможные причины неоднозначности оценки полученных результатов обусловлены отсутствием учета проведенных программ лечения, включающих использот мше моьохи-миотерапии или более интенсивных методов, таких как трансплантация кос лого мозга или интерфер нотералия, приводящих к элиминации РЬ' положительного клеточного клона. Очевидно, что болег определенное мнение по Дивному вопросу может бьггь высказан^ по -<ере накопления клинических и экспериментальных данных.

Таким образом, проведенный анализ не установливает взаимосвязи стадии заболевания с -илом Р*1'- транслокидаи. Вмес ; с тем треде авленные данные достаточно убедительно свидетельствуют, что определение типа Ph'-xpovocoMbi »->жет играть существенное значение в прогнозировангч клинического течевгч ХМЛ. При эх ju, исследования, проводимые молекулярно-биологичесхими методами, могут открыт, возможность качестьсяно нового уровня диагностики и г-югпозировияия в сравнс ши с предложенными ранее.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован и картировач.еномныйфрагм ' .Л', содержащий локус МЪсг, в фаговом векторе СЬ4/

2. Субк знированвем в плазмидном век.ope pUC19 получена ДНК-npcôa, р2.0 Bgl/H, которая использована нами для детекции "h'-транслог 'тгй методом бдегг-гибриднзации.

3. разработан метод определения типг ТЬ-^анслокации с использование*! р2.0 Bgl/H ДНК-пробы и с применением для анализа 4х рсстриктаз. Предложеж^ный метод поз-лж.етг^ет-ифнцироватьн 5*- типы Л'-транслопций г ДНК из крови и костного м^зга пациентов ХМЛ

4.1 азработаг"» модифицированная система полимеоазной цепной реакции с двумя парами праймеров для детекции У- (Ь2а2) и 3'- <ЪЗа2 bcr/ibl мРНК) типов Pu'- тр^нслокаций. Показано, ч о эти т«шь. мРН^С встречаются у пациевюв на разных стадиях заболевания, а тахже выявлены случаи при^утствп

одвозрсменно 2х типов Ьсг/аЧ mPF "С, что по-видимому, говорит о наличии альтернативного сплайсинга.

5. Разработанные исгодьг и полученные пробы использованы дня гено- ' диагностики типов РЬ'-тр<шслохаций у 41 большого хроническим ынелолейхозом н на этой выборке показано, что тип трлнелокации коррелирует с выживаемостью больных.

СПИСОК РАБС Г, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТГМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. ДомшшстаЙ ДА., Е.А. Бабущюша, Е.С. Покровская. Молекулярно-бвологнч^скве аспекты структурных особенностей хромосомной транслогацна 1(9,22) с.ри хронь доском мнелолейкозе, Первая всесоюзная конференция "Геном челоь~-ка", 1990,

2. Домштскин Д.А.ДС.Покровска..,Е.А.Бабушкина,Н.И.Гринева Применение полим еразн011 цегвой реакции д).л определения Ьсг/аЫ мРНК при хро.лческом миедолейкозе человека, "chi ика, 1994, т. 30, №11

3. Покровская F С., Е.А.Бабушкина, Д.А.Домгинский, Н.И.Гргп ?ва. Получение ДНК-зондов для анализа структуры локуса хромосомной транслогацнм t(?;22) при ХМл, Первая всесоюзная конференция "Геном человека", 1990,176.

4. Покровская Е.С., Д.А.Домнкр -кяй, Е.А.БабушкншгА.А.Крутов, А.Ф.Тагисв, Н.И.Гринева, Клонирование области 22 хромосомы, участвующей в транслокации t(9;22) при хроническом мислолсйгтозс человека., Мол. бизл., 1993, 27:185-191.

5. Туркича А.Г., Д.А.Домнянский, Е.С.ПокровскаяД:. А.. Бабушкина, И.Н.Моисеенкова, А.В.Захар ва, Н.В.Архнпова,Н.И.Гринева, Н.Д.Хорошко. Оценка прогностической значимости структуры токуса хромосомной транспо:.&цгн t(9;22) при хроническом ииеяолейкозе. Гематолог-us и трансфу аологпг, 19Г3, 3:8-11.