Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная организация и экспрессия генов argBJ и ama B. stearothermophilus

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная организация и экспрессия генов argBJ и ama B. stearothermophilus"

чизииБиъь ^иъртьэпшзиъ чьэпиазт-ъъьг* иэаизьъ ици^ьи^и цьъииеьиьизь КЛ^БШ-З

ч^Р ЭЬпищр^ ^ршЦтЬвп^

<ъ

шэьизиъ иъияьэ иип^ьиь

В^еагснЬегторЬПиз рЬрйшф[ц йшйрф агг!В и аша цЬ0Ьр}1 йщЬ^тишрЦищйшЦЬрщфийгир^Оо Ь 1вии|рЬи|1шй

Р.ОО.ОЗ - итьипизир ^ЬШиРиЪГиВЗЛИ» йшиОшчЬтпадшйр 1)Ьйишрш0ш1(ш0 чЬштр|П100Ь51[1 рЫ^шйпф Ч[ипш1|шй шиш[1ЙшО|1 ЬщдйшО штЬйифшигвдшО иЬфкн^р

ЬрЬшй -1998

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

на правах рукописи КОЧИКЯН АНАИТ ВАРДГЕСОВНА

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ argB} и аша В^сагоЛсгторЫНв

03. оъ

4.00.03 - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискаине ученой степени кандидата биа'югических паук

Ерсиан - 199Х

Ru3uusubh 3ULPUTibsnn33Ub Qhsnna3nfbbbPh uaqu3hb UMuabUhu ^bbUU£hlfhU3h hbUShSWS

3bnuiqp|i JipmilruGgniJ

апэьмзиь ubu^hs aumqbUh

B.stcarothermophilus pbpi5tu3>|il Jujüptfi argJB L ama qbGbpfl йщЬ^гнцшр IjiuqúuiljbpujiluiónipjntGQ U 1рии|рЬи|1шй

Q.00.03 - ить^пизир мььиириьпказп^ úuiijGiuqhumpjujdp [|Ьйишршйш1^шй qfiinnipjmQDbpfi рЫ^йшйпф qfimiul^uiG uiumJifiiuGfi hiujgijujü luwbGiufununipjtuG ubqúujqfip

bpLuiG -1998

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

на правах рукописи

КОЧИКЯН АНАИТ ВАРДГЕСОВНА

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ argBJ и ama B.stcarothermophilus

Q.00.03 - МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой стсисии кандидата биологических наук

Ерсиап - 1998

U2|mumiuCigQ ЦшшшрЦЬ^ t RR UprjjruGmpfcpnipjujG U UnLuipfi Giu|uiupuipmpjujü "ЦЬйишшЬ(ийп1Пч[1ш" <*Rh-|j qbGuJjtiG fiGdbGbpluujfi [iupnpiuinnp[iujjnnS

QJiinujljiuü L|bGu. qjitn. r;nl|innp «4.U. UixipujGjUjG

•Пшгшпйш^шй [iGivvh^u'NnuQbp' ЦЬйи.ц(1Ш.|у1Ц1Лпр L.U. biqhuljnujnujujG

l| q p, ryigbGui 3.4. 'nnujnil

Unujguunujp l|uiqi5uil|bpujrupjni.ü - игцЬЦшишр l^bGuujpiuDnipjiuQ fiQumfiinniin UmbGiu|ununLpjujG[! ЦшрЬ^(11 бшйпршйиц RR QUU l)büumßfii5|imjfi fiGuuihuinimfr qpuir)iupiuGniä

Ubqüujq[ipQ шпш£1|ш01 " " UJM/i/~rJ-> 1998p.

UuiuGuiqfiiniugilujö [ипрЬргф qfimiuljujG pujpinruqujp.

IjbüuiupuiGuitjujCi qfiin. ryiljuinp, ujpn}>bunp iß U.U. UfiünGjuifi

_' l(ji i/j) ^J jj _

Работа выполнена в НИИ "Биотехнология" Министерства Промышленности и Торговли 1 в лаборатории генной инженерии

Научный руководитель: д.б.н., проф. ВАСаканян Официальные оппоненты: д.б.н. JI.M. Епископосян

к.б.н., доцент Ю.Г. Попов

Цедущая организация: Институт молекулярной биологии

Защита состоится" 3 " ЫЮНЛ 1998г. в //-" на заседании специализированного совета 042 при НИИ Биохимия ИЛИ РА (375014. Ереван, ул. П.Севака 5/1)

С диссертацией можно ознакомитдем в библиотеке НИИ Биохимия ИЛИ ГА.

Лвторе<1>С|>ат разослан " " CL/hp &M-L l'-M'ttr.

Учений секретарь специализированного

совета, д.б.н..проф1 /1 > А.АСнмоняи

^LiCLi i (Y .<

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее иремя в биотехнологии широко применяют гснно-инжспсрные штаммы-продуценты биологически активных соединений, в том числе аминокислот и ферментов. Конструирование генно-инженерных штаммов-продуцентов зрсбует фундамеиальных знаний о метаболизме микроорганизмов и молекулярной opi-a-низацни соответствующих геноп. Важным грантом сунерактивности конструируемых ш таммов является также правильный выбор штаммов. С этой точки зрения термостабнль-носп> бактерии B.stcarothcrmophilus является существенным технологическим преимуществом. Между тем успешное использование его ограничено вследствие малой изученности этого объекта. В частности к началу настоящей работы не было данных по молеку-ляршы-еиетическому исследованию генов биосинтеза аргинина у B.stcarothcrmophilus. В литературе приводились данные о том, что у Bacillaceac биосинтез аргинина осуществляется по "линейному" пути и ключевую стадию биосинтеза, как и у E.coli, выполняет первый ферменг бносшггетического пути-К-ацетшнлугаматсинтетаза. Однако,благодаря детальным исследованиям нам удалось выяснить, что для B.stcarothermophilus, а также двух других видов Bacillus, характерно трапсацспишрованис N-аиетшюрнитина с возвращением ацетильной группы с помощью оршггипанегшпрансферазы обратно на глутамат. Тшательное изучение клонированных генов и кодируемых ими ферментов биосинтеза аргинина B.stearothermophilus нозволшю показать, что первый фермент- орпитипацепш-трансфераза ингнбируется, но не аргинином, а орнитшюм и в отличие от других видов, осушсстшиюших "циклический" путь биосинтеза, М-ац<тш1лутамат-5-фосфотраисфераза не нпгибируется конечным продуктом биосшгееза. К началу настоящей работы отсутствовали также какие-либо сведения о характсрисгикс фермента аминоацнлазы B.Mcurothcrmophilus, об организации и регуляции гена аминоацнлазы, и об экспрессии бациллярного гена в гстсрологичном щпх)плазматическом окружении кишечной палочки. Вместе с тем фермент амипоацилаза широко используется в производстве аминокислот для разделения стереоизомеров, полуденных химическим сшпезом. Конструирование штамма, продуцирующего чужеродную термостабильиую аминоацилазу B.slcarolhcrmophilus в мезофилыюм хозяине, очень выгодно с биотсхнодогической точки зрения т.к. значительно облегчается задача выделения и очистки фермента. Поэтому представлялось актуальным шучип. opraiunaiiHio и рефляцию гена аминоацнлазы B.stcarothcrmophilus и охарактеризовать этот фермент.

Цель и задачи нсслелнпаиия. Целью работ яимяется изучение молекулярной opi апизашш генов бносшггсза аргинина и i сна аминоацнлазы термофильной бактерии

B.stcarolhcrmophilus и использование полученных результатов дня конструирования высокоактивных штаммов-продуцентов. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

-структурный и функциональный анализ рекомбннантной нлазмиды, содержащей argJB гены биосинтеза аргинина B.stcarolhcrmophilus; -изучение экспрессии argJB генов B.stearothcrmophilus в клегках E.coli. -определение и анализ пуклеотидной поелсдовагелыюсти выделенных генов, -характеристика ферментов - продуктов клонированных генов биосинтеза арпшипа B.stearothcrmophilus.

-молекулярное клонирование гена амипоаинлазы B.stearothcrmophilus. -структурный и функциональный анализ рекомСнпантной нлазмиды, несущей ген аминоацнлазы.

-определение и анализ нуклеотидной последовательности гена амипоаинлазы. -характеристика фермента амшюацнлаза.

Научная новизиа и практическая значимость работа. Определены полные нуклеотидные последовательности arg) и argB генов биосшггеза арпшипа термофильной бактерии B.stearothcrmophilus и проведен детальный компьютерный анализ последовательностей. Показано, что они образуют кластер с другими генами биосинтеза аргинина, располагаясь па хромосоме B.stearothcrmophilus в порядке argC-J-B-D. Установлено,что биосинтез арпшипа у B.stearothcrmophilus осуществляется "циклическим" путем и продуктом гена argJ является иншбируемая ортгпшом бифункциональная орштшацепштрансфераза. Установлено,что продукт гена argB - М-ацстшнлугамат-5-фосфотрансфераза термофильной бактерии B.stearothcrmophilus, синтезированная в клетках мезофилыюй бактерии E.coli, проявляет свойстпешгую ей тсрмостабшп.ную природу и аналогично ферменту E.coli не подвержена ингибировашпо аргинином.

Осуществлено молекулярное клонирование гена аминоацнлазы термофильной бактерии B.stearothcrmophilus. Показано, что не смотря на способность комнлсмспшро-вать мутацию в гене argE E.coli, ген аминоацнлазы B.stcarolhcrmophilus не имеет отпо-шсешя к биосшггсзу арИшипа и в отличие от N-ацетилорнипшдеацетилазы E.coli расщепляет широкий спектр N-ацстлнроизподпмх L-амнпокисжгг, в том числе и аромашческнх. Показано, что амнноацшдоа обладает тсрмостабилыюй природой, что намного облегчает се очистку in экстракгов мезофилыюй бактерии. Определена полная нуклеотидная нислсловагслыюстъ (сна аминоацнлазы и проведен легальный компьютерный анализ л он последовательности.

Ocnomn.ic положении, иыпосимыс на защиту: -Ген argJ B.stcarothcrmophilus кодирует синтез термостабилыюй, бифункциональной ориитинацетшпраисферазы, ннгнбнруемой орнитином.

-Ген argB кодирует синтез термостабилыюй, не ингибируемой конечным продуктом биосинтетического пути, 1Ч-ацетлглутамат-5-фосфотрансферазы. -Определена полная нуклеапщпая последовательность 3,4 тин EcoRI- фрагмента ДНК B.slcarollicrmophilus, несущего гены argJ и argB. -Выделен ген аминоацилазы B.stcarothcrmophilus.

-Фсрмспг аминоацнлаза H.stcaroilicrmophilus обладает термостабилыюй природой и широкой субстратной специфичностью.

-Определена нуклеотндиая последовательность гена аминоацилазы. -Транскрипция гетерологичпых генов argJ, argB и ama в клетках E.coli осуществляется с собстиенных промоторов.

-Осуществлена очистка и охарактеризован фермент аминоацнлаза.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической част, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Обзор литературы состоит из двух глав, касающихся анализа данных об организации и регуляции генов биосинтеза аргинина и гена иммноицшшзы у прокариотов н эукарнотов. Экспериментальная часть состоит из трех глав, которые посвящены исследованию генов биосинтеза арпшипа и гена аминоацилазы термофильной бактерии В.stearothermophilus. Работа изложена на 116 стр. машинописного текста, включая 7 таблиц и 20 рисунков. Библиография включает 177 наименований.

Публикация ц апробация работы. Основное содержанке работы опубликовано в 6 печатных зрудах. Материалы рабош докладывались на I Научной конференции молодых ученых НИТИ А (Ереван, 1987), Международной конференции "Термофнлы:наука и тсхшш>1ни"(Рсйкьявик,1992) и на Научном семинаре НИИБиотехнология (Ереван, 1998).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы и плазмиды , использованные в работе приведены n ra Пл. I. Для выращивания бактерий использовали среды L-бульон, L-arjp, М9 с необходимыми добавками ашибшшжов и ростовых факторов (Миллер, 1976). В качесше мшш-м;ш|.пой среды дня B.stcarothcrmophilus iiciuuii.ioiuuih среду AUF (Picnird & Wiame,

Таблица I.

Характеристика использованных штаммоп и илазмид

Штамм Генотип Источник

Е.соН К-12

МА-102 Га^Е 1ИI ага |Ьг 1си рго

Ыв грвЬ гссА Лаб.коллскция

МЛ-105 Р'а^Н риг 1гр гссА Лаб.кшшскция

ЫК6659 НГгКЫ61ш 1Ьггс1А гряЬ

5г1::Тп10(1еО гссА Лаб.коллскция

ЛИ101 яирЕ ЛИ Д(1ас-ргоАВ)[Р'1га036

ргоАВ 1ас1 Ъ ДМ 15] Дж.Мсссинг

ХА4 Г а^А па!А ХХЧЫГ* С.Баумбсрг

ХВ25 Г агБВ па1А X V Ь$с1Я С.Баумбсрг

ХСЗЗ Г argC гроВ па!А Х+ hsdR С.Баумбсрг

РТЗ Г «гвО ргоЛП Ы» ИуЛ тс|Ц гря1. С.Баумбсрг

ХБюг Р Д(ррс-а^Е) па1А гроВ V ^(Ж С.Баумбсрг

ХР Г Д101(ргоАВ-агйР-1ас)агв1(Ы

<;ирЕ XX* И-яШ С.Баумбсрг

ХвЗ! НГг aгgG Ыя гроВ гряЬ Х'Х' hsdR С.Баумбсрг

Х190 НГг(Р4Х)сагА тс! В хЬг Х+

г^-202::ТпЮЬ5<1Я С.Баумбсрг

ХДЕР8 НГг(Р4Х)сагВ шс1В Лг X'

г^'-202::Тп10 ЬхёЯ С.Баумбсрг

ХБшгя то же, что XSlD2.no гссА Настоящая работа

ХА4агвЕ то же, что ХА4, по аг£Е36::Тп10 Настояния работа

В.а1сагои1спп0-

рЬПиэ N018 8224 Дикий тип Лаб.коллскция

Плазмилы

рВЯ322 Арг Тсг Лаб.коллскция

р11С9 Ар' 1ас2 Ар' Ьасг Арг Тсг аг&В Лаб.коллскция

риС8 Лаб.коллскция

рАУК! Сакалян и др.

рАУК4 Тс' а^В Настоящая работа

рАУК7 Арг argJ Ар' ата Настоящая работа

рАУКб Настоящая работа

рАУКбб Ар' аша Настоящая работа

М13шр8 !асг Дж.Мессинг

М13тр9 1ис2 Дж.Мсссинг

М13шр18 1асг Дж.Мсссииг

М13тр19 1асг Дж.Мсссинг

рВ1ис5спр1-К5 « Ар' 1ас2 Дж.Мсссипг

Клетки В^самЬсгторЬПиз пырамншали при 56"С, клежм Е.соН - при 37"С.

Процедуры трансформации ныдслсния, клониронапия и диектрофореза Д11К оинсанм у МашаП.ч с! а!.,( 19X2).

Ссквсниронание ДНК осущестиляли по методу C3iirepa(Sanger,1977).

ДНК-ДИК гибридизацию проводили согласно процедуре Cay3epna(Sauthcm, 1975).

Активность N-ацетилглугаматсжггетазы (N-АГС) и орпитнпацетилтрансферазы ОАТ) определяли но методу Van de Castcclc at al.,(1990). Активность N-ацетилглута-1ат-5-фосфотрансферазы (N-АГФ) определяли по FcClj-методу Van de Castcclc et al., 1990). Активность ацетнлорнитинаэы и амнноацилазы определяли по методу Vogel & Icl.ellan (1970). В опытах по ингнбировапню экстракты предварительно пропускали срез колонку с сефадексом G-25, уравновешенную экстракционным буфером.

Дипенпздазиую активность измеряли в реакционной смеси содержащей 90 мМ цстат-фосфат-боратного буфера(рН 7,0),1мМ СоС1г,20мМ дипептида и 5мкг очищенного х-рмента. После Юмшмшкубации при 55°С, реакцию останавливали добавлением 0,1мл М 1101. Образовавшиеся аминокислоты определяли па аминокислотном анализаторе leckman 120 С.

Амииопептидазную активность определяли спектрофогометрически, используя ромогсппые субстраты (Ь-аминокислота-р-шпроашшш).

Очистку оонировапной амнноацилазы проводили из грубого клеточного экстракта Lcoli XSlD2(pAVK66), предварительно подвергнув тепловой обработке (65°С, Юмин ), бычиыми методами фракционирования - ионообменной хроматографией па DEAE-сфарозе с элюцией линейным градиентом концешрации К-фосфатпого буфера ?Н 7,5; 50-500мМ) и хроматографией на Сефадексе G-200.

Молекулярный вес нативных ферментов определяли гель-фильтрацией через колонку 'ефадекс G-200.

Электрофоретический анализ клеточных экстрактов в SDS-палиакриламидиом ijie проводили, как описано у (Maniatis et al.,1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I .Сфукчурно-функциопальный анализ гсиоп B.stcarothcrmophilus, комплементирующих мутации argA и argE E.coli

Для локализации гепов па отклониропанном 3,4 тин EcoRI-фрагмснтс ДНК .stcarothcrmophilus, было получено делециошюе производное илазмиды pAVKI-pAVK7. онсфуировапие илазмиды рАVK7 вели направленно в две сгадии.11а первой стадии ¡лсшровапнем 0,5 тли фрагмента EcoRI-Pstl была получена илазмнда pAVK4,Bce cine ).\ра1пшн1ая снособпосп. к комплементации муг.ишн в генах argA.argE и argll E.coli. На и>рой стадии нереклоиироваписм фрагмента P.stl-Pvull из илазмиды pAVK4 na вскшр

Pvul

+Pstl/Pvull

Hlndlll.Psll p AVK7 4.70 Kb

Pvul

Pvull EcoRI.BamHI

Рис. 1

. Конструирование рскомбипашиой плашнди pAVK7.

р11С8 была получена плазмида рАУК7, комплсментируюшая мугации п пенах а^Л и агвК Е.соН. Схема конструирования плазмиды рАУК7 иоказапа па рис.1.

Определение ферментативной активиостя экстрактов Е.соП а^Я мутантов, песу-щих плазмиды рЛУК! или рЛУК7 указывает па высокую орпитапацеталтрапсферазпую, по пс ацетлорпитиназпую активность. Результаты предстаплсны в табл.2. Активности определены при 55"С. 11ри измерении при 37"С активность в три раза ниже. Эго указывает

Таблица 2

Удельная актипиость Ы-анстилглутаматсиптстазы, орнитипацептрансфсразы

и N-ацстилоршпипазы в нггаммах E.coli, несущих гены B.stearolhenpophilus

Штамм Добапле пне ap-ninnna вереду 5мМ Активность фермента (Пл/мг белка) N-ацетил- Ориитиаце- N-ацстял- ß-лакта глугамат- тнлтранс- орпитиназа -маза синтстаза фераза

E.coli К.12 XS1D2 + по <0.001 <0.005 <0.01

E.coli К12 XS 11)2 (pAVKl) но 0.9710.08 0.99±0.07 <0.005 532125 539118

E.coli K12XS1D2 (pAVK7) + по 1.77±0.15 1.2010.10 <0.005 <0.005 653124 633121

E.coli Kl2 ХЛ4 argE + <0.001 . <0.001 <0.005 но

E.coli Kl2 ХЛ4 argE(pAVKl) - 0.32±0.04 0.30±0.04 0.71М.07 0.6710.07 <0.005 <0.005 449122 400117

B.stcarolhermo-philus NC1B 8224 + 0.04±0.01 0.04+0.01 0.28+0.02 0.07+0.005 0.12Ю.02 0.11Ю.02 по по

на то, что комш1смс1пация argE мугапии в мезофильпой бактерии E.coli обусловлена функционированием тсрмоетабильиого фермента оршптшацстаетрапсферазы B.stearo-Ihcrmophilus. Гетерологичная комплементация мутаций argE E.coli показапа и в отоошепие генов argJ N.gonorrlmeae и C.glulamicum (Piccardü Dillon, 1989,Sakanyan et al., 1996). Однако включение орнитинацетшпрапсферазы в биосшггстичсскнй путь аргинина у ипамма B.slearolliermopliiliis псожилавно.так как в литературе приводились данные о линейном пути биосинтеза арппшиа у ВясШяссяе через пщролитический фермент аце-тилоршгшиазу (Vogel & Vogel, 1963). Повторное исследование этана лсаистилнровлпня анетилорнитина у двух мезофильных ппаммов Bacillus -B-Iiclicniformis и B.sublilis, показало, что эти организмы также переносят ацетильную ipyimy с М-ацетил-Ь-орнитииа на L-глугамипопую кислоту (O'Rcilly & I)evine,l994). Ацстилоршгншазная акттюсть

рапее опубликоваппая дня D.sublilis (Vogel & Vogel) могла быть результатом дейстпня амнноацялазы или пептндазы с широкой субс1ратиой специфичностью, как например описало у СЬо el al (1987,1988).

Добавлспие аргипииа в среду выращивания не репрессирует сшпсз ориитииацетшпраисферазы я Ы-апстилглугамагсшггстазы у нпаммов XSID2(pAVK7) и XA4argE (pAVK7), соотвсгствспио.

Для изучепяя ишпбироваиия ферментов конечным продуктом биосинтеза, в реакционную смесь был добавлен арпшип в концентрации 0,01-ЮОмМ. Аргинин слабо ипгибирует активпостъ ОАТ и АОД. Концентрация арпшина для 40% ингибироиапия равна 2,5 и 4 мМ, соответственно. Добавление оршгтина в реакционную смесь показало, <гго потепцвальпым ингибитором для обеих активностей япляется L-орнитнп. При пасьпцсмпой концентрации глугамиповой кислоты (20мМ) и ацетил-ОД (2мМ) или N-ancmiiopiiiniina (ЮмМ) значение К| для орннтипа равно 0,02 и 0,2 мМ, соответственно. Катаболизм apni-пипа у B.stearolhermophUus происходит через аргиназпый пугь-индуцибсльная арпшаза превращает арпшин в орпитнп и мочевину (Dcsmarez & Legrain, unpublished). Следовательно, разумно предположить,что излишек аргинипа приводит к повышению пула оршпяпа, способпого ипгибировать активность траисацетилазы.

В экстрактах XA4argE(pAVK7) был изучен тсрмостаСильпый характер ферментов ОАТ в АТС. Результаты показапы па рис.2. Экстракт штамма XA4argE(pAVK7) инкубировали в тсчепие 20мип. при разных температурах и измеряли остаточную активность ОАТ и АТС. Как вндпо из рис.2, оба фсрмста инактавируются после 20мип инкубации в одинаковом узком диапазопе температуры ближе к 70° С. Ферментативная активность экстракта без прсинкубапии пли после 20 мип. инкубации при 25° С равна 24 сд./мл для АТС и 68 сдУмл дня ОАТ. В то время как зга активпостъ остается неизменной при прсинкубапии в районе 20-65° С для ОАТ, активпостъ АГС увеличивается в три раза. Такое отклопепис в поведении двух активностей является пеожилаппым при предположении, что arg) является бифункциональным ферментом. Причиной такого поведения может быть изменение фсрмста во время прсипкубации пли же разрушение в грубых экстрактах фактора, влияющего па N-ацстлглугама гсннтстазу вследствие тепловой обрабозки. Однако, при гель-фильтрации через Scphadcx G200 экстракта XA4argE(pAVK7) после тепловой обработки N-апстилглугаматснитстаза и оршпинацстшпрансфсраза элюиропались в одной и той же фракции, (см.рис.З) соотесгстоуюшсй молекулярному necy 110000.11ри проведении тех же препаратов через ПЕАЕ-ссфарозную колонку и шноции линейным |радис1гп>м К-фосфатпо|х> буфера (pH 7,5; 0,05-0,5М), оба фермента илюирошишеь при

100 г

60 65

Температур* (*C)

—•— ОЛТ —ЛГС

Гис.2. Тсрмосзабппмюсть N-ацсталглугаматсшггстазпой (ЛГС) и оршггинацспипраисфсразной (ОЛТ) акгавносш.

20 г

I

Г 10

•е-

Й 5

/V'

/

-■-Л

10 20 30

35

- ЛГС ОЛТ

40 50 Ппмср фракции

Рис.3. Гсль-филмрания N-autniunJiyiaMaicmnemu (ЛГС) и ортпипапспипрансферазы (ОЛТ)

концентрации примерно 0,25М. Следовательно, обе активности принадлежат одному бифункциональному ферменту.

Была определена полная иуклеотидная последовательность 3,4 тин фрагмента ДНК B.stcarothermophilus (см.рис.4). Анализ иуклеотидной последовательности выявил 4 олпонапрппленпые открытые рамки считывания (ORF) с оборнаннммн концевыми ORI". Исходя из данных по комплемяггации и по гомологии иуклеотидной и аминокислотной последовательностей с теми же генами E.coli и B.subtilis на выделенном фрагменте можно установить наличие также С-концевой части гена argC и N-копцевой части гена argD и расноложтъ гены в порядке argC-argJ-argB-argD:iianpaiuiciiiie транскрипции от argj к argD. Размер ORF дня argj равен 1230 пн. Ген argA E.coli кодирующий N-ацетилглутамат-синтетазу имеет длину 1332 ни. Следовательно, становится маловероятным, чтобы в последовательности между генами »rgC и argß расположились два фтичсски разобщенных rciia-argA и argJ. Скорее всего наличие единственной открытой рамки считывания свидетельствует о том, что данный район ДНК кодирует полипептид с дпумя активностями. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности оршггинацс-пипрапсфсразы B.stcarothermophilus и последовательностей того же ферме1гга C.glutamicum (Snkanyan et al., 1996), N.gonorrhoeae (Martin & Mulks,1992) и B.subtilis (O'Reilly & Devine, 1994) определенной по программе CLUSTAL V показывает, что argj содержит 39; 38,8 и 62,7% нде1ггичных аминокислот с argj C.glutamicum, N.gonotThocac и B.subtilis, соответственно.

2. Ы-ацеталглугамат-5-фосфоггрансфсраза B.stcarothermophilus

Детальное изучение Ы-ацетилглугамат-5-фосфотраисферазы и соответствующего гена у бактерий, за исключением E.coli, до сих пор не проведено. Эта часть работы посвящена изучению гена и характеристике фермента М-ацетилглутамат-5-фосфотрапс-фераза B.stearothcrmophilus, как возможного кандидата на ключевую роль в биосинтезе аргинина у этой термофильной бактерии.

Огклонированный фрагмент ДНК B.stearothcrmophilus комплемснтируст argB мутацию E.coli. Измерение ферментативной активности подтвердило наличие на данном фрагменте гена, кодирующего М-ацепшглу|амаг-5-фосфшрансфсразу. Сравнение иуклеотидной последовательности с гаюм argB E.coli позволило расположим, ich argB после гена argj. Структурная часть гена argB охватывает район, длиной 777 ни и кодирует полипс1пт1д с молекулярной массой 26918 Да. Перед пинцирующим колоном гена argB па расстоянии 8 пуклеотидов имеется последователь)loen. GTAAGGAG, кошрая комплементарна З'-концу I6S рРНК B.stcarothermophilus (Spraquc et al 1977) и B.subtilis

tree

VDGAVLHKLEI&ALAKYDAVFFATPPGVSG'

e/¿TOXX?JCC«X^TCGTP^TCOOaGJUH^ 180

EWAPAX.VDRGVKVXDLSGDFRLÜDGAVYAQ

TOTATOXCCOTsCa^JXOCCATOI^^ 270

WYGREAAPSAYLERAVYGLTEWNKEAVRGA

CTGCTC сгАтссААтох>хсттхтАТСсалсА5СаАо^^ Збо

VLLSNPGCYPTATLLGLAPLVKEGLIKEDS

ATCAICGTCX^iXCAAATCQGGCGTATCOGOC^CGGGACCGAAAÛCCGGGCrCGGGACACATTTT^ 450

IXVDAKSGV3G&GRKAGLGTHFSEVH¿tIVK

ATTTATAAAGTGAACGCCCACCAGCACATTCCGGAAATTGAACAAQCCCTGCRCÄCGTOG^ 540

XYKVNAHQHXPEXF. QALQTWNEAVAPITFS

ACTCATTT^TTCCGATGACAAOQOGCATTATCKÎOC^CGATTTATtXCAAQGCCAAACAA 630

THLÏPMTRGIHATIYAKAKQSISPMDbVDL

TATA XAACXKrrrATGMGGTTCOCv,^ 11 ^ivCT^ICCCTCAACrrO^ACÍJTTTrCCAS 720-

YKYSYEGSPFVRIRQLGQFPATKDVYOSNY

TGCGACATCGGCCIXXXCTACGATGAQXGA0GGA^CÖ!/J'1CACTJOI c<recy IV fj'^AJCGACAACTTGATGAAACGCGC ШЛ-ЦиисАО 810 CDIGbAYDER7ERVTVVStf li>ilLHKGAAGQ

GCOJTCXJAMCTICAAeTTCATCATCGGT^ ц t 900

AVQNFNLMHGWDEAEObRSLPIYP' sr?J

a^TCA£GATCACMAACAAAaœCCAAg^ 990

MTITKQTGQVTAVADGTVVT'EGFQAAGVS

_ _ t

TGCCOGGCTGCGCTATTCGAAAAACGl .XTTAGGGCnTATTCTATlX!C^CGTGOCOGCTI\rGOCGGCGGOl?7ír?rATAOQCA^ 1080

AGURYSitMDLOVILCDVPASAA».ViY T «3«í

TOCGOT(XXXIX5CTOlAACTOiD3CAGCX^ 1170

QAAPLKVTQASLAVEQXLQAVIVHRPCANA

CTtX^XOJIXXXXJ^AGOtXrlCAAGGACGOT 1260

CTGAQGLKOAYEHREbCAKQFGLA^HHVAV

CCXn'rCAACOGGCGTí ATCGCZXAATATTIXXCGATOT a^AAAATTCTXGCOjGCATCAAACAGCTrG nXXA05XTGí¿?GATÚ3C0GA 1350 ASTGVIQEYLPHEKIRAGIKQLVPGVTHAD

TGCGGACXXXriTTCAAACGGCCAlTriAACGACCGATACGGTGATGAA£X?XGCT 1«0

AEAFQTAILTTDTVHKRACYQTTlDGKTVT

OTTCOCXX»WXœCGAA»OœT7OT3M^ 1530

VGGAAKGSGHIHPNMATHLAFITTDAHVSS

СССС.71СС1ССАСаХХГС£ТССОСЛ1СОАТГ^^ 1620

PVLHAALRSITOVSFNQITVDGDTSTHDHV

ссжхжлтохмссиспхгтхлтау^тсАтаА^^ l7io

VVMASGLAGNDELTPOHPDWENFYEALRKT

GTCCGAAGATnOXXWAIXAAbTCGCCAAAGA^^ 1800

CEDLAKQIAXDGEGATK LIEVRVRCAKTDE

(X^AGCGAAAAiAATCGCCAAUrj^TCCTCOGCTCT^ 1890

EAKlflAKQxvGSNLVKTAVYGADANWGR 1 I

cqcxxxt^tcgtxtattccgatgccgaagtgañcccggacaacgtcga^

gaigysdaevnpdnvdvaigpmvmlkgsep

gcagccgttctoxwagäagmgcggcogcgtatttcx^^^

qpfseeeaaaylqqetvvievdlhigdgvg

fcxgB

cxntgcgtcraxctccgatttgacaticgattat^^ vawgcdltydyvkinasyrt* и g к t v

vikcggsvldelspaffasvnamrkqgmev

22SC

<otcatcct(xacggct5gcoogccqgaaatc®mcacatgctcaa^ 2э4с

VlVltaOOrEIOOHLKTLnVPeErVNaLRKt

gacgaaagacgtcctcccobtj^4bgaaatggigctctccoxaaflgtgaacaaacagctigo^^ 243c

tkdvlavvemvlsgkvnkqlasmlrqhglp

cocœrrcoctctttccikcgtggacgœax^ 252c

avgvsgvdgglleaepidlaklgyvgrvkt

ccrrtosttcrcagctottixccaccctgct^ 261c

vrsqllrtllaagyipvisplgzdqnoqty

caacattaacgccgacacgoccqccgog<xogtcgcaajxccatxx^^ 2700

ninaptaagavaaaigasqlafvtnvpgil

279C

rdgalvaeataehierliedgvitggmipk

agtgcâa£xxx3cgcicimxxxtatccgatcxœ^ vqaalsalsdalpevmivsgkttfyqngtw

argD

GCACGOCACA^CGATTOXAAAGAbSISQSffiXATATrrATGt^^ hgttirke. vgvyl*

msalfptynrwniavqs

aegtvvtdvngkqyldfvsgi avcnlghrh

CCGCATGTCCAAAAGAGCATTGAACAACAGCTCAATCAATATTQGCACXjrcTCGAALT^^

phvqksieqqlnqywhvsnlftipiqeeva

sllvahsagdyvffcnsgaeaneaalklar

AAACATAccGoc^eutcaeAAACT^TTAcgiTccocc«tiv^ тх^ссс^ссслххгпохаАсачтоосас^Асоууклгагло^ khtgrhkvitfrqsfhgrtfatmaatgqek

GTGCATAGCGGTÎTTGGTCCGCTGCTTCCOSAATTC vhsgfgpllpef

3366

1>ис.4. Нуклсозидная и аминокислотная нослсдопа.и.ьности 3.4 тип EcoRI-фратс.гга

шшзмидм pAVKI. Подчеркну,« нотенш^п.нис риГ.оашостпипакшшс еай.ы leiion argj, argB и argD.

(McLaughlin el al., 1981). Свободная оперши взаимодействия AG для образования стабильных нар нуклеотндоп этою участка, определенная но известной формуле (Tinoco ct al., 1972) равна 12,8 ккатЛюль. Это согласуется с пысоким значением ДО, характерным для рибо-сомоспязывающнх сайгоп матричной 14IK генов бактерии рода Bacillus (Ilager & Rabinovitz, 1985).

Runic рибосомосвязываютего сайта имеется несколько потенциальных -10 и -35 сайтов, которые Moiyr учпапагься основными а-факторямн B.subtilis и R.coli (Moran ct а1.,1982;Саканян,1985). Эго позволяет предположить, что ген argD D.stcarothcnnophilus может транскрибироваться с собственного промотора.

Фермент Ы-ацст11ПГлугамат-5-фосфотрансфсраза n.stearolhe'rmopliilus имеет около 38% гпмплоши с пминокислслипП нослсдпвятсльнпсгыо фрагмента фермста R.coli длнпой 225 аминокислот п 25% гомологии фрагмента фермента S.cercvisiac (Boonchird ct ni., 1991) длиной in 184 аминокислот. Ha piic.5 приведены данные по сравнению аминокислотной последовательности фермента некоторых микроорганизмов. Каталитическая функция М-апстнлглугамат-5-фосфозрансфсразь1 заключается в переносе фосфанюй грунш.1 с ЛТФ на N-ancnui-L-rjiyraMar. ЛТФ и ГГФ связывающие белки имеют две консервативные последовательности, обозпаченные как "motifA" и "rnotifB". В последовательности К-апетилглугамат-5-фосфотрапсфсраз паиболее реальпым прстспдептом па роль Р-пстли (molifA) является остаток лизина, встречающийся в белках

V

всех четырех микроорганизмов в консервативной последовательности GXXXK( ) в

1

терминальном участке фермента. Еще один консервативный остаток лизина встречается

X

блнже к середине аминокислотой последовательности в виде К(_) сайта. Причем для бактериальных белков этому сайту опять же предшествует последовательность GXXX. На роль "molifB", в котором остаток яеппрапшовой кислоты (D) может отвечать та взаимодействие с магнием (Walker ct al., 1982), претендуют расположенные через одну

V

аминокислоту от первого консервативного участка ( )IKXGG слабо консервативная

I

V

последовательность ( )LD для бактериального и и (II)XD для дрожжевого фермента, L I

последовательность ()1) в ссрсднне и NAO в С-тсрмннальной половине белков (см.рис.5). L

Выяш1СН11С ПС1ИНН01Х» АТФ-связымаюшст сайга в М-ацсшлглу1;1Мат-5-фосфотрапсфсразс,

PRETTYBOX of: argB.msf{") November 21, 1997 23:48:49.62

1

argll.s.p ......

argse.s.b К P S A S

argb.b.st .....

argb.e .*....

HLIEL QQIVK SGLVR H G А К H LLVST KRINA S К F Q К FVS..

С T S R S S L N К S

, L LC S N T I A G F

36

argll.s.p A S V I A arg56.s.c ASVPL

argb.b.st .....

argb.e .....

S X R F Q R A P P S

G S F A P V a F T R

... G 0

К К y С t

Q Q P L N

S К R V V-

PLÍ.KP S S T N G

70

I E Q D R F 5 A T R

105

argll.s.p D A I I R I L S S I G S R R £ V E Q Y L R Y F T S

argSi.s.c S T V I Q L L N H I S T К R E V E Q Y L К Y F T S

argb.b.st . . ..... ..... . . . . . .....

argb.e • • • • •■ • • • • •

106 ин V..

argll.s.p V GG A I I T D E L D T L A Q S Lf JFL

arg56.s.c V axs A I I S DU L HELAS С iT JF L Y H V . .

argb.b.st с QG S V L D . . . E L S P A F F[ JS V ElAH R К

argb.o L a с V L L D S E E A L E R L F SE Jl V El y RES

F E Л Q P. V S Q Q Q . . ¡1 G К ..MMN

141

argll.s.p AM jp L atgSC.S.C TCJJQV argb.b.st сГыЕ X argb.a C0C V V

175 sQa R К aMv r к

A П V F. M D .I I T G

176

argll.s.p V F L E E arg56.s.c С F L E Q argb.b.st V L S G К argb.e A LAGT

DQL e К tQl e q

A S M L R

LQwak

. ... L

. . . . L

Q H G L P К H Q I A

G T R A R CWR A R AWGV S AHG L F

argll.s.p argS6.s.c argb.b.st argb.e

211

Y

Y P

Q

H К А P T К E P R S Q L G S P К L

e

E II S I E A S I LRTLL

Qu su

Bf

к

A E

Щ

N E

245

3 ij. TR

I'L T0 Y I Qv ISP vQ Qvve0

346

argll.s.p МЛЕПа argSG.s.c laeQa argb.b.st L G I O Q argb.e IgvQd

S 00 L L

s ao M L

N ao T Y

E 00 L M

n vu a p nvhad nQnad

H vn a D

Ie EHrvl

JE EHRVF

JA \J1AAI

|т A ШЛА T L

К P L к V E P L К X G A S Q L G A . D L

280 D Y Д N E V YHN E A F V T N I I.QS D

argll.s.p argS6.».c «qb.b.st aiib.e

281 к cl к c[

V pf

V si

[l i II

J L

IL

Nplï 110:

ÍE t к S T G R D . G A

dQkg о

К К I s s E К I S M L V A E A R I A E К

I Y L D R

1 III D E

T . . A E

T . . A A

V К Y

V К Y I T I-

1 T L>E

31ь

nrtjl J .» .p К I I arg56.s.c К il argb.b.st I PI argb.« I Vf

E I К £ L F, I К . L

Î\L S A OA

DTQP D Y0P

_S DAL

A R TUG

BP R T s V Qi

p usssv Qi

It s V s S s V P E V M I

Qpvdi

i t

I M V

V s "g к t Q s w r H

к i) i R к

Q D I.WK T F Y И H A E 0 L P

350

]t D G T W H G

AßQN G

_J

1-РП1

t. Haï

PRETTYBOX of: argB.msff4) November 21, 1997 23:18:49.62 351

«roll. 8. p ЗОЛПЯ LlJSRP FVINK HDSLD SI pda .ai, BN I, I ток orase а.с я олШП мНпло у к L V к R3SIO е гп ол пк aLohr argb.b.st TT IHK eKoVI L..............пцльккльопп

argb.e m p мец r||la......................

386 400

nrgll.s.p NSLAA PSESL KQFKD

arg56.s.c AGI SS G К E.......

argb.b.st . ■..............

argb.e ...............

Рис.5. Сравпспис аминокислотной последовательности различных К-апсТилглугамат-5-

фосфотрапсфсраз. Идсшичпые аминокислотные остатки обозпачепы черным цветом, а одинаковые по химической структуре-серым, t p.-S.pombe; s.c.-S.cerevisiae; b.st.-D.stearotliermophilus; е- E.coli.

требует проведения дополнительных экспериментов.

Сравнительный анализ пепользования кодопоп показал, 'по наиболее заметное отличие между генами argB E.coli и B.stcarothcrmophilus заключается в преимущественном использовании О или С в третьей позиции кодоиов гепа argB B.stearothcrmopbilus. Использование в третьей позиции кодопа G или С усиливает прочность взаимодействия кодон-аптикодон и это может отражать эволюционную адаптацию термофильных бактерий к высоким температурам (Barstow el al., 1986) па фоне высокого GC содержания генома (Mulo & Osawa, 1987).

В экстрактах пггаммов E.coli К-12 XB25(pAVKI), P4X(pAVKl) B.stcarothcrmophilus, выращенных в минимальной среде с арпшилом я без аргипипа была определена актиппость М-ацстнлглугамат-5-фосфотрансфсразы. Результаты, приведенные в табл.3, указывают на то, 'по сшпез Ы-ацстилглутамат-5-фосфотрансфсразы в клетках B.stcamthermophilus подвержен истинной рефляции артнином. Однако фермент, сшпезирусмый с бациллярного raía argB в хозяине E.coli, независимо от состояния его гена nrgR, практически не подвержен нашивной рефляции.

Iстсроло1ИЧная К-ацстилглу1змаг-5-фосфотрансфсраза, синтезированная в клетках E.coli, характеризуется тсрмосгабилыюстью, удел1.ная акпшпость фсрмстя повышается с подъемом температуры и при температурной обработке эффективно защищается субстратами MgAT'I» и М-ацстил-Ь-глугамшювой кислотой (рис.6).

<

30

40

50

60

70

80

Тсмпсрггур* ("С )

Рис.6. Зависимость актаппости Н-ацегшлглугамат-5-фосфотрапсфсразы

В.ЯеагоЛеппорЬПиз, сиитезироваппой в ппамме Е.соП ХВ25(рАУК1),

от температуры. 120

ео 65

Температура (*С)

—•— бег субстрата —«— 25мМ Мг АТФ —»— 25мМ Mg ЛТФ чМ-адстил-Ь-глутамат —О— 50мМ К-я11Стил-Ь-1лу1амат

Рис. 7. Влияние М{>ЛТФ и Ы-ацстил-Ь-глугамата па акшвностъ Ы-анс1илглу|амат-5-фосфотраисферазы при температурной обработке.

Время панужшпи необратимой ннактивашш для фермента В.я1еаго1ЬсгторЫ1и5 п экстрактах Е.соН при 68°С на порядок выше п присутствии М§АТФ и Ы-ацепш-Ь-глутамн-нопой кислоты, чем в присутствии каждого из этих компонентов в отдельности (рис.7) Следовательно, субстраты оказывают сннсртчсский защитный эффект при их одновременном добавлении к клеточным экстрактам.

Добавление Ь-аргиннна в концентрации 0,01 мМ до 100 мМ к клеточным экстрактам штамма Е.соН К-12 ХП25(рЛУК.1) в присутствии 40 мМ ацсцш-Ь-глутамата и 10 мМ

Таблица 3.

Влияние арпшипа па синтез Ы-ацспинлугамат-З-фосфо-

трапсферазм в штаммах B.stcarothcrmophilus и E.coli

111 гамм Добавление арпшина к удельная активность

среде (5 мМ) мкмоль/ч/мг белка

Е.соН К-12ХВ25 nrglV + < 0.05

XB25(pAVKI) - 206

+ 158

ХВ25 argR (pAVKl) - 227

+ 244

Р4Х - 1.3

- 1.8'

B.slearothermophilus - 0.30

NCIB 8224 + 0.07

* Активность определяли при 37°С. В остальных случаях измерение проводили при 55°С

MgATФ не приводит к сколь-нибудь заметному снижению активности М-ацетилглутамат-5-фосфотрапсферазы.

Таким образом, синтезированная в клетках мезофнлыюй бактерии Е.соН Ы-аце-пи1Глуглмат-5-фосфтрансфсраза термофильной бактерии В^сшчЯЬсгторЫКи прояштст свойственную ей термостабильную природу и аналогично ферменту Е.соП не подвержена ши нбнрованшо аршинном.

Молекулярную массу Ы-ацетлп1угамат-5-фосфотрансфсразы определяли тсль-фнльтрацней супсрнатаита, полученном) из клеточного экстракта штамма Е.соН К-12 ХВ25 (рАУК1) через сефадскс С-200. Прн оптировании 50мМ К-фосфатным буфером активность М-ацспшглутамат-5-фосфотрансфсразы была обнаружена в единственной фракции, соотистстуюшсй молекулярной массе 29000 Да. Это значение находится п хорошем согласии с молекулярной массой выведенной из аминокислотной последовательности белка. Важно замстшь, чти добавление к клеточным экстрактам и к

алюирующсму буферу ЮмМ И-ацетил-Ь-глутамата позволило пыишгп. пик ферментативной активпости во фракции с молекулярной массой около 53000 Да. Эго позволяет предположить, что фермепт В^еагоШеппорЬПиБ имеет димерпую форму. 3.Молекулярное клопиропапие и структурио-фупкциопальпый анализ

гепа амипоацялазы В.ЛеагоШсппорЬПиз В.51еаго(Ьсгпк>рМ1и$ обладает ампноацилазной актшшостью. Ген амипоацилазм В.ЯсагоШспяорЬПиз способен комплсмснтировать мутацию в гене оршпипдеацетилазы атр1г Е.соН. С целью выяспевия природы этой актиппости у В^сагоШегторЬПия, ее значения в биосинтезе аргинина в выявления возможности использования тсрмостабильного фермеша с амипоацплазпой активпостью в производстве аминокислот, мы провели молекулярное клопяровапие гепа, ответственного за аминоацнлазную функцию бактерия В.51еап)1ЬсппорЫ1|и.

Клопировапве гепа амяпоацилазы В.з1еаго|ЬсгторЬЛи8 провели по сайгу НЫШ па векторе рВВД22 по комплементации мутации а^Е Е.соН Х5Ю2. Полученная рскомби-паптпая плазмида была обозначена рАУКб. Трансформация ипаммоп П.соН, мушншых но одпому из генов аг£Л,П,В,С,Р.О или Н плазмидой рАУКб, показала, что данная плазмида содержит гео комплеменгируюншй мутацию только в гене aгgE Е.соН. Для устранения ссгрсгапиоппой пестабвльпостя плазмиды рАУКб и облепепня изучения отхлониропанного гепа В.51еаго1ЬегторЫ1из, провели делегирование бациллярной вставки. Дм этого вставку в виде ЗаиЗА субфрагмсптов псрсклоииропали па вектор р1ГС8 по сайту ВатШ. Была отобрана плазмида, пссущая паямепыпую вставку, па которой содержался ген, комплемен-тирующий мутацию аг|Е Е.соН. Плазмида была обозначена рАУКбб. Физическая карта плазмиды рАУКбб приведена па рнс.8. Эксперименты по ДНК-ДНК 1ибридизацин меченого [а - "Р^дЦТФ РвИ-ЕсоИ фрагмента плазмиды рАУКбб с хромосомной ДНК термофильных микроорганизмов, расщепленных рсстриктазой НшЛН, подтвердили принадлежность клопироваппого фрагмс1па хромосоме В^сапМЬстюрЬПиз. Кроме того, вставка этой плазмиды пе имеет какой либо заметной гомологам со вставкой плазмиды рАУК1. Следовательно, плазмиды рАУК1 и рАУКб несут фрагменты ДНК из различных районов хромосомы П.вк-апЦЬсгторЬПиз.

Дня идентификации каталитической функции, ответственной за комплементацию мутации а^Е Е.соН, в клетках Х51П2(рДУК66) определяли орнитинацспипрапсфсразиую и ацстилорпитиндсацстилазную актипность. Бсснлазмнднмй пггамм не проявляет пи одну из этих двух активностей, тоща как в клеточных экстрактах ппамма Х.ЧШ2(рАУК66) одно-

Рис.8. Физическая карта рскомбипатпой плазм иди рЛУКбб.

зпачио определяется М-ацстилоршггипдсацетилазная активность и пе определяется орпитип-ацстшпрапсферазиая активность. Добаппепие аргипипа в ростовую среду пе плияет па И-ацсталорнитацдеацетнлазную актиппоеть, детерминированную плазмидой рЛУКбб.

Измерение аминоацилазпой активности в грубом белковом экстракте штамма Х8Ю2 (рДУКбб) показало, что оптамалыюй температурой клонироваппой амипоацилазы П.я1сяго1Ьсгтор1м1и5 является 70°С (рис.9). После 15 мип. инкубации экстракта при различных температурах измеряли остаточную аминоацилазпую акгивпостъ при 55°С. Крипая на рис.10 показывает, что активностьфсрмс1гга незначительно падаете новышепием температуры и резкое падение происходит в районе около 75°С.

I) Свободном Университете Белытш, п лаборатории Н.Глансдорффа амипоацилазу П.я1еаго1|1сгтор1н1и5 очистили по'пи до гомогенного состояния из клеточного экстракта рекомбннатного штамма ХЯ1П2(рЛ\'Кбб).

Молекулярную массу суГплдиницы амипоацилазы определили с помощью Я1)8-РЛО электрофореза. Она состаттяст 420001500 Да. Молекулярная масса нашипого белка,

Остаточная активность (%)

определенная гель-фпльтрацией, составляет 180000+30000 Да, что указывает на тетрамерную структуру белка, состоящего из четырех эквивалентных субьедишщ. Кинетический анализ показывает, что Co3t и MilJt действуют как активаторы фермс!гга с константами 0,8 и б мМ соответственно. Другие бивалентные катионы не плияют на активность фермента.

Фермент амипоашшпза B.slcarothcrmophilus обладает широким спектром субстратной специфичности. Она шдролнзуст все 13 тестированные И-ацстил-ироизводные L-амннокнслот, включая все ароматические аминокислоты. Среди лучших субстратов L-тнрознн и L-феннлалашш. N-ацетнлорпнтипдеацетчазная активность фермента при 55°С составляет менее чем 0,2% активности по отношению к лучшему субстрату фермента Ы-ацстил-Ь-аланнну и тем не менее ген ama B.stcarothcrmophilus комш1емептнрует мутацию п гено etßH П слН. Потможно, увеличение дозы гена, находящегося па многокопнПноП 1шазмнде, обеспечивает достаточное освобождение L-opnimnia при 37°С для роста argE-мупнггов на минимальной среде без аршнипа. Низкая активность и низкое сродство фермента к N-ацетилорннтнну, как и к N-ацетиларпншну, позволяет предположит!», чго данный фермент не имеет отношения к метаболизму аргинина.

Определена полная пуклеотидная последовательность 2.32 тин фрагмента ДНК B.stearothermophilus. Компьютерный анализ выявил наличие двух открытых рамок считывания (ORF).обозначенных ORF1 и ORF2. Конец неполного ORF1-TAA стоп кодон, локал-зован в позиции 1050. Пинцирующий кодон ORF2, локализован на 33 нуклеотида ниже, п позиции 1087, с предшествующей последовательностью Шайн-Дальгарно, комплемаггарнон З'-концу 16S рРНК B.stcarothermophilus. Стоп кодон (TGA) ORF2 локализован в позиции 2197. Ниже этого стоп кодона не обнаруживается нн одна терминатор-подобная структура. Полная пуклеотидная последовательность 2.32 тпн фрашенга B.slcarothcrmophilus приведена на рис.11. ORF2 кодирует иолниенпщ из 370 аминокислот с молекулярной массой 41,649, что хорошо коррелирует с экспериментально определенной молекулярной массой 42 кД очищенной вмннолцнлазы. На основании этих данных можно заключи л., что ORF2 представляет собой ген амипоацнлазы H.stcarothcmophilus. впредь обозначенный нами ama.

Фермент амипоашшаза широко используется в производстве аминокислот для разделения сгсреоизомсров аминокислот, полученных химическим сшпсзом. Нами рапсе был сконструирован продуцент амипоацнлазы на основе фермента N-ацстилорпнпш-деацетнлазы E.coli. Ген argF., огклониропаниын на мношконннпон нлатмнле, детерминировал и.ч-икую активность к Ы-анстил-Ь-мстонину.

ORfl

GATCGGGAGCGGAAAGAAGGGACGAATCCGGATGCCACGGTCGTCCTTGTTGGATCTCAT 6 0 DRERKEGTNPDATVVLVGSH

CTCGATTCGGTTTACAACGGCGGCTGCTTTGATGGACCGCTCGGGGTGTTGGCCGGCGTG 120 LDSVYNGGCFDGPLGVLAGV

GAAGTCGTTC AGACGATGAACGAGC ACCGTGTTGTGACGCACC ACCCAATTGAAGTAGTG 180 EVVQTMNEHGVVTHHPIEVV

GCGTTCACTGACGAAGAGGGAGCGCGCTTTCGTTTCGGCATGATCGGCAGCCGCGCCATG 240 AFTDEEGARFRFGHIGSRAM

GCCGGAACACTGCCGCCGGAAGCGCTCG AGTGCCGCGACGCGGAAGGGATTTCCCTCGCT 300 AGTLPPEALECRDAEGISLA

CAAGCGATGAAACAGGCGGGGCTTGACCCGGACCGCTTGCCGCAGGCAGCGCGAAAACCA 360 EAMKQAGLDPDRLPQAARKP

GGAACGGTGAAAGCCTATGTCGAATTGCATATCGAACAAGCACGGGTGCTGG AGGAGGCT 420 GTVKAYVELHIEQGRVLEEA

GGTCTTCCAGTTGGCATCGTC ACTGGCATCGCCGGTCTGATTTGGGTGAAATTTACCATC 480 GLPVG 1VTG1 AGL1WVKFT 1

GCCGGCCCGGCGGAACATGCCGGCGCCACGCCGATGTCATTGCGGCGCGACCCGATGGCG 540 AGPAEHAGATPMSLRRDPMA

GCGGCCGCCCAGATCATCATAGTGMCGAAGAGGAAGCAAGACGAACAGGGACAACGGTC 600 AAAQIIIVIEEEARRTGTTV

CGTACTGTAGGACAGTTGCATGTATATCCGGOCOOTATTAATOTCATTCcaa AACGGOTC ÖCO GTVGQLHVVPaGIHVIPERV

GAATTTGTGCTCGATTTGCGCGACTTGAAGGCTGAGGTGCGCGATCAAGTATGGAAAGCC 720 EFVLDLRDLKAEVRDQVWKA

ATAGCCGTGCGGGC AGAG ACG ATCGCC AAGG AGCGGAACGTTCGCCTCACGACCG AGCG А 800 IAVRAETIAKERNVRLTTER

CTGCAAGAAATGGCGCCGGTGTTATGTTCCGAGGTGGTGAAACAGGCCGCGGAAAGAGCG 860 LQEHAPVLCSEVVKQAAERA

TGCAAGCAGCTCGGGTATCCGCCGTTTTGGCTGCCGAGCGGCGCAGCCCATGACGGCGTA 9 2 0 0 CKQLQYPPFWLPSUAAHDGV

CAGTTGGCTCCGATTTGCCCGATCGGGATGATTTTTGTCCGCTCCCAAGACGGGGTGAGT 960 QLAPICPIGMIFVRSQDGVS

CATAGTCCGGCGGAATGGAGTACTAAAGAAGACTGCGCCGTTGGAGCAGAGGTGCTTTAT 1020 HSPAEWSTKEDCAVGAEVLY

CATACAGTGTGGCAACTGGCCCAAGGGGAATAACGAAAAAGACAAACGAACAGCCOGAnA 1080

HTVWQLAQGE*

■u (ORF2)

CTATGGATGACAAAGGAAGAAATCAAACGGCTCGTCGATGAAGTGAAAACGGACGTCATC 1140 HTKEEIKRLVDEVKTDVI

GCCTGGCGCCGTCATTTGCATGCCCATCCGGAATTGTCGTTCCAAGAAGAGAAAACAGCG 1200 AWRRIILHAHPELSFQEEKTA

CACTTTGTC-rAl'CiAGACGC.TGrAAl'CA'rTCCGTCATCTTGAACTTTCCtGGCCCACCAAA I 2 «,U QFVYETLbbFGHLELSRPTK

ACCAÜCG rCATGGCGCGGCTCATTGGCCAACAGCCAGGCCGGGTCGTCGCCATTCGCGCT 1320 TSVHARLIGQQPGRVVAIRA.

САТАТССАСОСЛТТСССОАТТСААСАСЮААЛЛСАСОТГГСАОТТТОССТСАААЛАЛСССА 1380 ОМОАЬРХОЕЕПТГЕГАЗКПР

ССССЗТСАТССАТСССТСЮССАСАТСАСССССАТАСССССАТССТТСТССССАССССПЛАА 1440 вУИНЛСОНООНТАНЬЬеТАК

АТТТТСТСССЛССТСССССЛТСЛСАТТСССССТСЛЛАТССССГГГГГСТТССЛАСАСССС 1500 1Р80ЬНОО1КСВ1ЯРЬР0НА

САЛСААТТОТТСССССССССССССС АСОЛС АТССТССААСССССССТСАТОСАССОСОТа 1560 ЕЕЬРРСаАЕЕМУОАОУМООУ

САССТСОТСАТСССС АСТСАССТТТССТССССОСГгеАССССССЛА'ШАТССОС АТТОТО 1620

ТАТССССССАТСАТ(ЗСССССАССССАССССТТТТТСАТССССАТСАТССССАААСССССС 1690 ТОРММААРПНРР1В1ГСКСО

САТССАСССАТСССССАССАААССАТССАТСССАТССССАТСССАССССААСТССТСАСО 1740 НСАМРН0Т1ОАХА1СА0УУТ

ААСТГОСАССАСАТТСТСТСОСССТАТСТССАСССССТСХЗАОССССТТСТТСТСТСССТС 1800 НЬаПХУЭКУУОРЬЕРЬУЬЗУ

АСССАЛТТТаТОССООСТАССССССЛТААТаТССТСССТСИССЛСОТСаЛЛАТССААООО 1 в « о Т0ГУАСТАНН7ЬРОЕУЕ10а

АСАСТССССАССГТССАТСАСАСССТСССССССАСССТСССССААТССАТССАССССАТТ 1920 ТУЯТГПЕТЬИКТУРОММЕК I

СТСАААООСАТСАСССАЛОСОСАССССХЗССКХЗТАТОАСПТССАГГТО АСТАССвСТАС 1980 УК01ТЕАН0АЗУЕРКГПУСУ

СССССОСТСАТС ААСТАСОАТСААООТОАСССССаТСАТОСЛСа АЛАСОССОТОССАССТ 2040 ВРУ1ЫУОЕООРЯНОСЫОУКА

ОТТССССОАЛСЛООС АСТОССССССТТС АААСССЛЛСЛТССОССОССЛЛОАТТТСТСССС 2100 УИИИазаРЬЕТЕНОНИЯРЬЯ

СГГХТТССААЛЛАССОСССОССАССТТТГГСТАСаТССССССССаСААТСТАСАААААСС; 2160 ЬГАКЗАЯОЬГЬКККООСККК

САТССТТТАСССССАССАССАСССССОСТТТАСОАТТСАСОААОАСОСССТТСАОАТТСС 2220 НИЬРАРРРАЬУО*

ССТССЛЛАТСТТТаТССССОССАСаТТСАААСТСТТСССССССССОаЛАТЛасТОТТТТС 2280

ССТТСАСЛТАТССААСАТТСТСАСТТСАААССТТГСАТС 2319

Рис.11. Нуклеотидная и аминокислотная нослсдоватслытости гена аминоанилазы

и нрсднгсстауютего района В.51сагоШегторЫ1и5. Подчеркнут потенциальный рибосомоспязываюншй сайт гена аша.

Ш гамм нродуцируюншй чужеродную тсрмостибильную амшюацшшу и мезофильиом хозяине очень выгоден с биотсхпологической ючки трения. Кратковременным надеванием можно резко пошить фон белков мезофильного хозяина в клеточных экстрактах, таким образом облетая очистку тсрмосгабнльнош белка (Inagaki el al., 1986; Kubo & Imanaka, 1991; Nagahari el al.,1980; Obsbima & Soda, 1989). Действительно, даже кратковременная обработка клеточиых экстрактов lZ.coli XSlD2(pAVK66) при 65°С приводит к немедленному трехкратному новышешно удельной активности аминоацилазы n.slcarolhermopbilus к Ы-ацоип-Ь-фенилалашшу н М-хиорацеттш-Ь-фсннлаланину, <гга делает лот термостабильный фермент или клетки, анкетирующие этот фермент очень полетными дли биотехнолошческот производства L-фснилалашша. С практической точки зрения, широкая субстратная специфичность амнноацилазы B.stcarolbermopbilus может быть использована дни удаления ацетильных групп, использованных в защите компонентов химически синтезированных коротких пептидов или производных амииокислог.

ВЫВОДЫ

1. Определена полиая нуклсотидная последовательность arg] В геиов: установлси иорцдок нх расположения па хромосоме D.slcarolbermopbilus в составе кластера argC-J-B-D.

2. Показано, -по продуктом гена arg) яшыася шнибирусмая орнитином бифункциональная оршгшиацстшпраисфераза.

3.Показано, что нродуктом icua argB яшшется пеиигибируемая, термостабильиая Ы-ацетилглутамат-З-фосфотрансфсраза.

4. Осуществлено молекулярное клонирование ama гсиа аминоацилазы U.slearolbcrmopbilus.

5. Определена иолная нуклсотидная последовательность гена имшюацшшзы и проведен детальиий компьютерный анализ.

6. Показано,'по продуктом гена ama является термостабильиая аминоацнлаза с широкой субстратной специфичностью

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ 110 THMI; J1ИССЕРТАЦИИ 1.Саканяи В.А., Кочнкяи A.B., МстгИ.Л., Чахалян А.Х., Тср-Каранстян В.Г., Овссшш A.C. (1986). Рскомбииашпая нлатмидная Д1 IK pAVK7, несущая ich биосинтеза аргинина, и способ сс конструирования. A.c.//1405312.

2.Саканяи I).A.,Oiuxiuiii А.С.МетгИЛ., Ко-шкяи Л.1).,11стросян Ц.К. Молекулярное клонирование и структурно-функциональный анализ ichob биосинтеза арпншна термофильной бактерии Bacillus slcarolliermophilus. Генетика, 1990, т.26, SII, сзр.1915-1925.

3.Саканяи В.А, Лсгрсйн Х.,Чарлиср Д.,Кочикяц А.В.,Осина Н.К., Глапсдорфф Н. N-ацстилглугамат-5-фосфотрансфераза термофильной бактерии B.stearolhermophilus: нуклеотидная последовательность гена и характеристика ферме1па.Гепетика,1993, т.29,стр.556-569.

4.Sakanyan,V.,Kochikyan,A.,Mell,I.,Lcgrain,C.,Charlier,D.,Pierard,A. & Glansdorff,N.(1992). A rc-exaininalion of the path way Tor ornithine biosynthesis in a thermophilic and two mcso-philic Bacillus'spccies.J.ofGencral Microbiology, 138,125-130.

5.D.CharIicr, V.Sakanyan, A.Kochikyan, I.Mctt.C.Legrain.A.Pierard and RGlansdorfT. 1992. Organization and expression orarginine biosyntbetic genes of Bacillus stcarothermopbilus. International Conference "Tbcrmophilcs: Science and Technology" Reikjavilc.

6.V.Sakanyan, I.Mctt, A.Kochikyan, A.Savchcnko, L.Dcsmarez, C.Lcgrain, D.Charlier, A.Picrard and N.GlansdorlT. 1992. Isolation, sequence and expression in Escherichia coli of the aminoacylase gene from Bacillus stearothcrmophilus. International Conference "Thermophiles: Science and Technology" Reikjavik.

7.Sakanyan V.,Charlicr D.,Legrain C.,Kocbikyan A.,Melt I.,Pierard A. & GlansdoriTN. (1993). Primary structure,partial purification and regulation of key enzymes of the acetyl cycle of arginine biosynthesis in Bacillus slearothermophilus:dual function of ornithine acetyl-transferase. J.of Gen.Microbiol., 139, 393-402.

8.Sakanyan V.,Desmarez L., Legrain C., Charlier D.,MctI I.,Kochilcyan A., Savchcnko A., Boyen A., Falmagne P.,Pierard A. & Glansdorff N. Gene Cloning, Sequence Analysis, Purification, and Characterization of a Thermostable Aminoacylasc from Bacillus slcarolliermophilus. Applied and Environmental Microbiology. 1993, vol.59,Nol 1,p.3878-3888.

ШФЛФЦЧЬР

B.stearothermophilus pbpi5tu$fii diuGplfi argJB I» ama qbGbpfi tinibljniuuip l)mqi3uiljbpu(4uJ6nipjniG[] U tpumpbu|nuG InjfiljjujG UCuihfiLn >4ujpriqbufi 4uiGqmgujj|iG puinbp. uupq|iGfiG[i t)bGuujut)Gpbq,. В stearothcrmophilus, (цпСшЦпрпи), qbQ, Drul|ibnm|ir)uij|i(i hujgnpriuiljiiiDriipjrHG: U2tuuimuiGpfi Gu|UJinuit{Q- В stearothermophilus йшйрф uipqfiGfiD|i IjbDumufiG-pbq|i qhGbph U iui3[iGiuuig|iluiq[j qbG|r hbiniuqninniiJQ:

4 Jiudqgf)minmlng gmtinriuiubminqq-mimjb dqddrnm 'dmpmq gmji6muin i|dqgpminZ fn|uil)mJpilmd budbmindm bmliJ6mmgi|pm Jiutiminmtag gmp6muqi| ijdqgingqguhiputi gmf)mgmlnuiZmhi jnu36mdg0 i|bqdgi]n i|dqrjlnjuihiqhi pdml) 'gmpgmpmd ijdqg -bdiugumn] f)i]pq6mo tJdqgiuddmgiJíim lii|uinipudm nqtnmtjuimq 'iJdqgiu<Jdmgi|pm liu|ibqdrji)n liuiidmtnmgmp gmlirm|pi|3 'Утртц gmpBtmnn ijilrjrjpmuiZ )ni|tn^milpümd budbmmdm gijgijbdm Iqjipdubminbo gq budmt] üdqg3giuíbdm i|3gmuimn|Zn

mgqçnlqt

pmjimpo dpmídiulii](tiJ6qtrin gijímmmdmndiuri gíml 'giufmfimpdqd übmltJBm -mgijpm t]-sn|!qdoumt|iojB3js-g du 'lqjidm } Bíiug :gmfdiupiuldqîi gi]fm?bümfimpmq 1 Iqfihdmdgq ч ügiufdiugmtimbdu3mi| gtjrmUi|inuqlhiug ]iijdl ijgqb lifm } lqjiZudu :Dgqb cura iJbmliJBmmgiljim iJldgmji sn|ii|doiuj¡>4iojBais-g 1IqtiduJimgulKi :Odqggiufd -luliuimq gmlimií[ii|3-m(njbijit i|bmdq<tngmdinu(tnu<t-g-uim[imwiu1b Itjuiq6m-N 1 ijbmüqitnr)mdui1ijmq6m rjt|dtJotIo .(Jdqguigqpdqt iul]dq i|bqdgi]nmngqti ijgi|gt]bdm gq Iqbdijnmgpiumu rgiufdiuçiuldqfi gtjfmíbdmtimpmq gnmpmdgmp l lqjidmuimli q Dgiufdiugmlimbdu3mq gt]fmbi|uiuq"ll]iug ilpmjiinmq iJ-Gnij b g q f£ i|"snl -¡qdouusqiojBajs'g ^ lqjiZuüy :(j3jB-g3jr-f3jB-33iB ögiurdiudutimnmb lmfqmqq gqgiu mdji i|punujiud3 ч piujibmti gq Uquinmlt] ündu? gbmjigum 6iJUqgqb ijbqdgijnmngqli i|gtjgi|bdm du 'Iqjiiim } 6hug :|iugi|gijbdm piu|itimlqbdm Ц7 Dbmdq<tngmdmu<tnu<t -g-inmpmuiiulb Iijinq6m-N ,05i|nmbdm ijgqb g3.re rnup t}- snimdouusqiojnsis g 'ijdqg -}dgmp muíp bubqdgi|n gijgijbdm fiuijlnu .gijimltnjß, giufdiudqddmin g rObmdqt -ngmdm1ijinq6m gi|diJgilo lmgu^6f]giu<ttldq bufif]mlqbdm fiugi^gdo piugmnijbgmq 5 g3ijnmbdm i|gqb [Sre q Jiuijbiu .gt|fm1fii|6. í piu|i6mgmlimdi| Dbqdgijnmngqti ijgijgijbdm rnup iftdgmp lijttmpdqd snnqdouiMtpo-resis g du 'pmjidui } 6íiug

:dqgbudqp lfm ч i]fmi|6mbi|bi]ddiji) ИЦгбЛЪ "dqgtnuinubij JiiJuilim -ui|ümu 'bqdu<tuüuitiqll 'dqgüudqp ht^üuricipuijnuttmüiniiqhnn 'gmp6mdbqtngijbqb ijdqg3i|3d gq 1q|iumdi|ti dmpmq gmp6mgmhmdi| i|dqg3gmuimri|Zm ргтф?1 :dpmíd -iugbo (glim i dqdmф-0Э0 'ivismo '«PiflS VNQ) iJdqdbmUp 3dmZ i|p 6i|hmli -mgmpmp } Iqjidmmmti ügiufdiupiuldqfi gi|fm?bdmhmpmt :dqgbudqp mdmbgmmn gmpZudu ijdqggiuídiuf]uimq gml]mi|pi|ff-mtii|bij<t i дтрфт? gmfdiujiijuifim tjdqgmgqpdqt 'gmpZudu gmfdiugmlimbduSmq gijfmbijuiuqlhiug 'gmpdutimbqtndm3 q gmpdufimgult] ijgqb "дтрттЗдт фию 04 Iqtipdubmuibo piu3gminmnJZn

и