Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модулирование А-тока и Cl--тока, активируемого ацетилхолином, внутриклеточным АТФ в нейронах моллюска

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Модулирование А-тока и Cl--тока, активируемого ацетилхолином, внутриклеточным АТФ в нейронах моллюска"

"i • ' n ü ¿ ■

АВДЕМИЯ НШ УКРАИНЫ ИНСТИТУТ Ф1ЕИ0Л0ГШ ЕМ. А. А. БОГОМОЛЬЦА.

На праваг рукописи

ЛОЗОЗАЯ НАТАЛИЯ АЛЕКСЕЕВЫ!

УДЕС 577.352.465:577.175.822

ЮДУЛИРСШВИ A-TOIU И C1_-TG:U, АКТКБКРУШОГО АЦЕТЖШЗЙШ, ШтЧЖЛЕГОЧИа АТЗ В НЕЖШХ НОШЕКА .

(ОЗ.DO.02 - "Еисфгзшш")

Автсрэфзрат дзссортацяи на соисиоекэ ytsnoi стоггакя , капдадагэ биологических паук.

Киев - 13Э2

Работа Едюлсена в Кнституто Слофазики клетки, г. Пущино

Научшэ руководители:

Доктор биологических наук |Б.Н.Вепринцэв

Кандидат биологических наук Е.А.Вульфаус

й|нциальнко оотопеиты:

Член корреспондент АН Украины, доктор биологических наук

М. Ф. Щуба

Доктор биологических наук

А. А. Селянко

Ведупре учревденне: Институт, эволюционной физиологии и биохимии им. Сеченова АНСССР г. Ленинград.

Запциа состоится ""1392 г. в "_"часов на

заседании специализированного совета Д-016.015.01 при институте физиологи: им. А. А. Богомольца по адресу: 252024, г. Киев 24, ул. Богомольца, 4.

С дассертацЕэй колю ознакомится в библиотека Института физиологии им. А. А. Богомольца

ч

Автореферат разослан "_" 1992 г.

Ученый; секретарь специализированного совета доктор биологических наук

3. А. Сорокина - Нарзаа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Клвчэвой проблемой для понимания JdiMj нервной клетки является выяснение механизма регуляции эктрической активности рецептор- п электровозбудимой «браны и участия в атой регуляции внутриклеточных эцессов.

В настояло время накоплено много данных, поназнващих, э метаболические процессы, в частности, энергетические, отэкащнэ в 1СЛ0ткз, влияют на функционирование различных нтрансЕортишс. систем плазматической кембрзнн. Механизм ияния АТР на потенциал- и рецэптор-управляемне каналы знообразна: АТР, как правило, является донором фосфата в акциях фосфоралпровняия; участвует в процессах палкмериза-и-деполимеризации элементов цитоскелэта (Альберте и др., 87), который вааен для поддэргаяия возбудимости аксона егакаяа & НаХауааа, 1985); активирует фосфопротеинфосфата-:, что мезяет приводить к дефосфэрилированию белков канала ¡уепез et al., 1985); слугят субстратом транспортных Таз, регулируя, таким образом ионный Таквостаз. Влияние ювня отергетического метаболизма на хлорный ток, ;тивяруа)ша никотиновыми холинорецепторами (ЮТ), а бастрий игиевай ток (А-ток) не изучено.

Хороией модельной системой длй исследования участия юргетического метаболизма в регуляции электрической стишости электро- и хемовозбудшой мембраны являются галированнне гигантские нейроны Црпаеа. atagnalie, )скольку они лишены влияния окрукащих из клеток через шаптические связи и нвйрогормональше воздействия. Кроме зго, в условиях внутриклеточного диализа, в препаратах 5храняются основные структур» клетки, и активные мембранные эрвенты, что позволяет вводить тестируемые вещества и с их змощыз управлять биохимическими процессами.

Цель_работа закличалась в изучении влияния уровня аергетического метаболизма на характеристика А-тока и горного тока, управляемого HXF в мембране нейронов lymaea tagnalla.

В связи с поставленной целью необходимо было решить ледувдие задачи:

I. Исследовать влияние внутриклеточного Kg2+, как □фактора ¿TP в биохимических реакциях, на параметры

хлорного тока, упразляэкого НХР, в Састрого калгасого tc::j

2. Ессладагагс. влагаю лзкензная кмщоатраху шутрлклз точного АТР на шраитрц хлорного гш;г управляемого т2роняды2л.а HIP, ж быстрого кзлиэеого тока;

в. - зшмнпо внутриклеточного АТР;

б. - влгяша ингибиторов синтеза АТР;

в. - влЕяпгв субстратов синтеза АТР.

3. Шяхзггь воз^огаио кэханлзкы дайсгиая АТР s ларакторпстикн хлараого тока, управляе.чого !ГХР, ¡: Д-тска;

• Впервые показана, что урсззг энергетического -иэтабоягама влиот на ■грангиомОраикыэ тон через два типа пажа каналов: быстрый калгавай тех хлорный ток, акпаваруекай Н2Р, в мембрана нейронов код&с;: Ifr-smsa atoffialla. Кэласеига уровня ДТР, v.si: ауто внутриклеточного вводецгя ¿.TP, так л ингибиторов ил субстратов вазргэтического квтаболшлш созывает су^астгеггп; Езаэшвяя потапцаазоззЕывиюсти быстрого калаевого тс::п кнпатика спада глсрааго тсхса, актаЕцруемэго хшшшроцептора мг. На осасвзнаа ропультагоа эксцарЕ^еатов с аагпдролиауск;

аналогиях ДТР сделано згклочгшя, что bts. яаашния с^я завы с гвдрол52зом АТР. Высказано праддалогапио, что действ» АТР обуслозлано (¡осформироваяив?.! белков каналов ид сопрязишак с шаи Соджв, что иодтаерадавтсл 1хротавспаюи-вам по срапаагаа -с &ТР действием щалочнсй фасфатази.

ЕИэрпаа исследовала дойатваэ Енутрлклаточного Hg2+ in хзрвктаркоташ Д-тоиа л С1~-тока, активируемого холиаороцэп-тор&и. Получена розультага, СЕЭДатольствугцца о тем, чте

з Зпзиологачэсхих копцаптрацаях ехгавыиает сус;2стбэынс£ ЗЛ5ИПШ) на потвш^алозаЕаспшость Систрого нажшвого тока i ализтуду е жшатпку аатухспая С1~-тока, ажепаируашго UXP.

Ка£тао-^^та«ос2до__значопаэ. Результаты раската расгаряот прадставлоаге о разнообразил Еугей виутркклаточхкй регуляцаи хлорной проаодаиоста, ажгавмрувизй НХР, я dacipoi калиевой проводаазсти и вносят шлад з допгканке ойда принципов ф^жцЕонирования и рогулкцаи лошшх каналов.

Дшшые а вляяшш уровня енэрготагаоского кзтаскжшгт на характеристики трансмембранных токов мгут бить шм:эзш«га е гслипичоской а вкешртэвтальной кейролагии.

Дпробоцяя работы. Ыатэрнаян диссертации дасладавалвсь па паучки: езканарах ЯНН АН СССР. Сснонзаа результаты исслвдозшая бшш представлана на Всэ союзных симпозиумах

диночнмэ кенош п биологических моаЗранак" (Карадаг, 1939) "йошкз Ksnaj?i в биологических мзмбрапах" (Карадаг, 1990), Воэсопзшх совэщсякях по прогража "Сигнал" (Москва, 39, IS3I ), ira Западногер;ланско-соЕагскон сгаягозпукэ 9\:5рапная {иппология - 108Э" (ГэЗделъбэрг (СРГ), 1989), вегско - германских симпозиумах "Возбудамкэ момбраш" Геп, 1991) и "Рецепторы и кошта каналы" (ÎJockes, 1991).

По материалам дассэртацка опубликовано 10 печатных бот.

QlEEiïHîS-iSÇSiEÏSlStî- Диссертация состоит из введения, □оро литературы, описания пиюльзоиавнах в работа тэрналоа и кзтадоп иссладовснся, излоаэпая собственных спэрпг.зиталъннх данных, обсуадонля результатов ■слэдсвавия, елзодоп работы и списка цитируемой литературы SO , источников). Работа излояэно на 1-14 страницах стнсппсиого тохстэ п содэрхит 42 рисунка.

ОНЬЕКТ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ.

Опыты проведет на вдентЕфздфованшх гигантских не2ро-¡х (ЕП1,2 и E.ÏII ,2,3) Xjjnnaea stagnai la I. методом фгяссацни 'тенцнала и внутриклеточного диализа. Еэйронн изолировала ( большого и калого паркетальных ганглиев механическим гособсм после протеолатпчэасой обработки мозга. Шйрояы, яользованвыэ а опытах, содарзала ■ гомогениуа популяции котиноеых ХР, уяразлящих хлорными каналами.

Состав наругного раствора (в ыМ) : НаС1 86; К01 1,6; Îll2 1,5; СаС1г 4; трнс-HCl 4; рН 7,6.

Cootsb внутриклеточного раствора (в мМ) : КС1 74; СаС1а 2 (концентрация свободного Саг+-0,04 yiJ); EGTA 1, трис-HCl ); pa 7,2.

Ацеташышн (АХ, 10 (Ш) подавали быстрой суперфузией из )лаатилэново1 палетки с диаметром отверстая около I мм (в -10 раз превншвпцего диаметр клетки). Ответы на АХ ¡гистрароваля при помощи пшеЩного осциллографа HII5. фа де ляли пиковое значение тока (1^) и время, ютветствущев умевызенкю амплитуда от пика до гационарного значений в два раза (Т1/г). Десенситизацив ;9нивалл по постоянным времени быстрой (tg) и медленной сслогонт (Тц!, полученных в результате компьютерной шроксимации спада тока экспонентами.

Электрическую стимуляции для активации А-тока проводи по двухимпуль сной схеме. Стационарную инактивацию устраня податей гипэрголяризуюцего (кондицдашаруицаго) предьмпуль YK, за которым следовал деполяризущий (твстирущий) шул VT- Для оценка потенциалозависимости стационара инактивации ¿-тока аначанкя 7_ меняли с шагом 5 или 10 м

А

затем подавали Vx постоянной амплитуда. Для оцен потенциалозависимости стационарной активации шбирали ' такой амплитуда, при которой достигался полный выход канал А-тока из инактивации, а Ут варьировали с шагом 5 или 10 м

При необходимости вводили поправки в измерени амплитуды А-тока за счет вклада входящих (Na+ и Са2*) выходящего звдерканного К+ токов.

А-токи регистрировали с помощью низкочастотно: запоминающего осциллографа C8-I .и фоторегистратора ФОР-;

Потенциал реверсии (Е^) А-тока определяли пут! экстраполяции прямой мгновенной вольташгерной характерно™ на ось потенциалов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДОВАНИЯ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ.

I. Влияние внутриклеточного Kg2+ на характеристики А-тока.

При активации токов по двухшшульсной схеме развивали! быстрые выходящие токи. По чувствительности к 4-аминохшрад

НУ (5-10 иМ), кинетике кпактивации, необходимости снят! стационарной инактивации и потенциалу реверсии эти токи быи вдэнтЕфадфованы как Сыотрыэ калиевые токи (А-токи).

При добавлении kg2+ (1-х0 мм) ео внутриклеточш раствор происходил сдвиг потенциалозавасишсти стационара« шантивации и активации А-тока в отрицательную облаем потенциалов (рис. I, си. кривые 3,4) и ускорен! инактивации. При атом ток насыщения инактивационнс характеристики А-тока (ток при полностью снятой инактиващ и const) увеличивался как следствие сдвш

активационной характеристики.

Вгеданнэ внутрь клетка не вызывало существенш

ЕЗЫ8ЕЭНИЙ Ер.

Влияние Eg^* на А-токи развивалось медленно - 4 -

Рис. I. Влияние 10 № N1^ и 10 № (соогее гствунцае концентрации свосодних ионов -9 и 9,6 кМ) на потенциалозависимость стационарной активации и инактивации. I-контроль; 2- N1^; 3 -отмывшие 4 -

Внизу - кривые стационарной инактивации в нормированном виде. Видно, что N1^, в отличие от не

влияет на штенциалоза-висююсть А-токов.

родоляало развиваться дааэ после 30 мин внутриклеточной врфузяи раствором, содержа¡цим М^*.

Действие на потенциалозависимость А-тока оказалось ысоко специфичным. Другие двухвалентные катионы (Са^ (2,5 Я), (10 МЫ), по ионному радиусу наиболее близкий к

8чп" 00кй). Бг^* (10 мМ) не вызывала сдвига кривых отенциалозанисЕмости активации и инактивации А-тока рис.1). Кроме лишь Ып^ (10 Ш) вызывал небольшой

двиг кривой стационарной инактивации. Однако, все вухвалентныэ ионы (кроме Мд^*) вызывали уменьшение наклона ктивационной характеристики А-тока (расЛ). Эти факты, о-видамому,. говорят о наличии двух, участков связывания вухвалентяых катионов с быстрым К+-каналом: специфического ля Н^* (находящегося, вероятно, вблизи сенсора напряжения ыстрого К+-канала), связывание с которым приводит к сдвигу отенциалозависимости А-тока; и не специфического (находящего-я, возможно, в устье), взаимодействие с которым Саг+, тг+, 1о2+, Бгг+, Ып^* вызывает уменьшение наклона кривой тационаряой активации

Характер СДВИГОВ ДТП' ^ ^ ЙТТИПТ^Т^ ? й Ц имЯК^-имЯТ^Ис ниГ^ крИВЫХ .-тока таков, как если бн ионы Ые^* просто экранировали 1трицательннэ заряды, фиксированные на внутренней

-160 -120 -80пЬ

поверхности мембраны и пргшдилЕ к ее даполпразацги. Однакс было показано, что при действия щллшодяранх концентрат на Саг+ ток в кэнбране нейронов Lymnaea etagnal (a i происходит сдвига потвЕЦиалозаЕигашости, чего следовало с ожидать, если бы изменялся сук.шрный поверхностный заряд i кзибраае (Ильин и Чемерис, IS83). Следовательно, Mg^ приводит к измененип плотности локального поверхностно! заряда Н+-канала, возможно, вблизи сенсора напряжения, чч долено было бы приводить к сдвигу гютенциалозавкга&а; параметров, управлящих вероятностью открытая каналг Локальная деполяризация в присутствии tóg^ ¡еткет Caí обусловлена экранированием отрицательно заряженных груп (например, фосфатных), лабо в результате актнваци ¡¿£^+-зашсЕшх фосфатаз и отдешюния отрицательно зарякенно фосфатной группы. В пользу второго предполоюэнкя говорит то факт, что bin^, который, ш известно, способен замецзт fíg24 в биохимических реакциях, имитирует действие Mg^*.

2.Влияние внутриклеточного Kg2+ на хлорный ток, вктевйру8&шй нхр.

Нейроны отвечали на IX быстрым входязцим С1~-током затухающим в присутствии постоянной концентрации ¿X результате десенситизацки.

Kgj* влиял на этот ток двояко: вызывал бистро врезанное увеличение и ускорение затухания, а зате; уменьшение при этом ускорение спада продолам

развиваться. Возиозно, снижение происходило за счет уконьиеная постоянной врошни затухания ответов, особенн Застрой фазы дэсенсжтнзацаи.

Действие на дэсеяснтнаацшо к АХ, зависело о

концентрации "gf^- Низкие концентрации Mg^* (2-4 \¡i практически не называли изменения емшиуда ответа постоянной времени медленной фазы дэсенситизации и ускорял: быструю фазу. Высокие концентраций (4-IO кМ) при длительна перфузии вызывали ускорение обеих фаз дэсенситизащш Восстановление амплитуда ответа я кинетики десенситизаци после удаления Eg^^ из внутриклеточной среды происходил! очень шдленно и только частично.

Ш нашему мнению, действие Sig^ на ответы на ¿X мота: быть обусловлено как непосредственным взаимодействием Mg^* (

- 6 -

лком канала или сопрятанянми с ним белками, так и осрвдовано участием Mgf* в активации АТРаз, фосфатаз, отеинкиназ и других Mg^-завиеишх ферментов, активность горых может влиять на работу холшорецвпторов

3. Влияние ATPtri, ингибиторов и субстратов синтеза АТР на характеристики А-тока.

Добавление АТР (5 кМ) во внутриклеточный раствор яводило к сдвигу порога активации и кривых зависимости тока от VK а Ут в сторону деполяризации (рис. 2). ледствие сдвига кривей потенциалозаЕисимости стационарной тивацпи, ток насыщения кривой стационарной инактивации ычно уменьшался (рис.2).

Действие АТР зависело от концентрации, развивалось дленно (десятки мин) и было плохо обратимо при оживании, вышение концентрации Hg2+ на фоне постоянной концентрации Р приводило к уменьшению сдвига вправо и дане (при вкмолярннх концентрациях Hg2+ и АТР) изменению направления рига на обратное.

В качества способа понизить уровень эндогенного АТР пользовали введение в клетку арсената Каа+ (ингибитора иколиза). Арсенат (5—10 мМ) вызывал значительный и обратимый при отмывании сдвиг кривых инактивации и :тивации А-тока в сторону гиперполяризации (рис. 3), т.е. в травлении, противоположном действию АТР. Ер не изменялся и действии арсената.

MgATP или АТР баз Mg2'", добавленный во внутриклеточный ютвор после удаления арсената, приводил к восстановлению ,'ходной штенциалозависимэсти без изменения Ер. Интересно, 'О в отличие от действия в контроле, KgATP (1:1) после об-1ботки арсенатом вызывал такой же сдвиг, как АТР бэз Mg2*.

Повысить уровень внутриклеточного АТР можно, активируя 'о синтез путем введения субстратов энергетического »таболизма. Нам удалось воспроизвести эффект АТР. на »тенцивлозависимость активации и инактивации А-тока с ¡мощью внутриклеточного введения субстратов гликолиза ]уктозо-1,6-дифосфата (P-1,6-Рг, {Ш), фосфоенолпирувата 'ЕР, 2Ш) HAD (1кМ), ADP (I»«), КНгРОд (1мМ) и Hg304 (1мМ) )лько после предварительной обработки клетки арсенатом

Рис. 2. ВЛИЯН1

внутриклеточного ATP i потенциалозависимость А-тока А - зависимость стационарш инактивации от VK; VT=-20 мВ. - то яе, ток нормгфован i максимальному значении в каадс серии. В- потенциалозависийос стационарной активэцш

Ук=-100 мВ; I-контроль, 2 - А'

(рис. 3).

Пируват (субстрат цикла КраОса) в концентрации (2-6 МЫ не устранял эффектов арсената.

Совокупность данных позволяет сделать заклячонаа о том что во всех опытах причиной сдвига потенциалозависимосги А тока, ш-видшоыу, является изменение концэнтраци внутриклеточного АТР.

В отличив от KgATP, еквзмоляраая смесь Mg24 иегидролизуемыми аналогами ATP - АТР7S или AMPPNP (5мМ после арсената не имитировала действие АТР, наоборот продолжалось смещение кривых в сторону гшерголяризаци

Рис. 3. Влияние врсената натрия и смеси субстратов гликолиза па потенциалозависимоать стационарной инактивации (А) я активация (Б) А-тока. I - контроль; 2 - через 30 мин после введения в клетку 10 м!1 врсената; 3 - через 20 мин посла удаления аз клетки арсаната и добавления во внутриклеточный раствор 2 мМ PEP + I мМ 3?I,6P2 + I м?Л ADP +• I ;.iJ HAD + I Ш КНгР04 + I i/£i Vn=>-6Q мВ; в А крише

нормированы, Vr=-2Q мВ; в Б 7к=-ПО мВ.

(рис. 4), гсак прз отшвагои ДзОд", что, . по-видимому, свидетельствует о том, что для наблюдаемых эффектов АТР необходим его гидролиз. Добавление HgATP(5MM) после MgATPfS или HgAMPKiP (БкУ) почти полностью восстанавливало исходную потенциалов авясиаость (рис. 4).

«а предполагаем, что действие АТР на характеристики А-тока мозет быть обусловлено различными механизмами:

1. Являясь источником энергии для активного транспорта ионоа, АТР влияет на концентрации свободных ионов в цятозолэ.

2. АТР иояет участвовать в регуляции А-тока через фосфораларавание белков канала ила сопрженпнх с ним балков, поскольку дополнительный отрицательный заряд в области сенсора напрягеная должен был бы приводить к сдвигу потенцяалозависзадостя стационарной активации я инактивации в сторону деполяризации. Это предположение представляется нам более . аероятазм, поскольку внутриклеточная перфузия нейронов щелочной фосфатазой (100 (ir/мл) приводила к эффектам, протавополозшм действш) АТР, т.е. вызивала сдвиг кривых в сторону гиперполяризацни. Однако, нам не удалось пока получить ответ на вопрос, какая тменно протеинкиназа участвует в' этом процессе.

Рис. 4 Влияние HgAMPFNP и HgATP после отмывания арсената на потенциалозависимость стационарной инактивации (А) и активации (Б) А-тока. I - контроль. 2 - арсенат. 3 -через 40 мин посла замены раствора с арсенатом на расгЕор с 5 Ш HgAHPPNP. 4 - через 30 мин после замены EgAKPPNP на Б ыМ KgATP. Vn= -50 мВ. На рис. А крише нормированы по максимальному значении в каждой серии измерений. Yt=-25mB, на рис. Б - VK=-I0Q мВ.

4. Влияние АТР(п> ингибиторов и субстратов синтеза АТР на характеристики ответов на AJ-

Добавление АТР (5 мН) во внутриклеточный раствор, содержащий Mg2+, приводило к увеличению I т и заметному замедлению затухания (преимущественно за счет быстрой фазы десенситизации) (рис.5). Эффекты АТР развивались медленно (в течении 20- 30 минут) и были плохо обратимы.

Аналогичные результаты были получены при одновременном введении MgATP без предварительной перфузии раствором с Ug?*. АТР без Hg2+ увеличивал I в меньшей степени, чем HgATP, но не влиял на кинетику' десенситизации. Таким образом, АТР действует на десенситизации в комплексе с Mg24".

KgADP и MgGTP в тех хв концентрациях обладали качественно таким та действием, как MgATP, но действовали слабев.

Истощение вндогэнного АТР с помощью ингибитора синтеза АТР арсената (5-10 мЫ) приводило к противоположным результатам - ускорению десенситизации и снижению Эффект неу-

- 10 -

контр. МдСг^ЗО' МдДТР, 30'

О 5 10 15 го 23 с

Ряс. 5. Влияние внутриклеточных ag2* а АТР на кинетику затухания ответов на АХ. Гро£як - кшатака спала трех первых

ответов; черные значки - зсмерч тока по ходу затухания ответов; белые гначкя (быстрая фаза)- разность мэхду замерил!

тока а расчетной медленной фазой десенситизации. 1,1*- контроль, IV с, тб= 2,3 с; 2,2'- к внутриклеточному раствору добавлен Xg01s (10 Ш, 30 ;.сш), i,{= 8,0 с, тб= 2,0 с; 3,3'-К

^аутр5П1леточнозд раствору с XgCl2 добавлен АТР (10 ¡Л,15 кян) та= 16 с, т0= 2,9 с; 4 - АТР (но на SEgClg) отжиг (30 ш) 23 ЕНутрЗКПЭТОЧНОГО раСТЕОрв, 4,^7,3 C,t6= 2,С с.

клонно нарастал в течешго десятков минут, причь;; оплывание арсената не могло остановить начавшийся 'процесс (рис. 6). На клотках с иэдданной одноксжюнантной двсинсятязацшй арсанат вызывал преаде зовго появление быстрой фазы затухэния ответа наряду с небояьтм ускорением мэдленной (рас. 6,7), в дальнейшем обе фаза дэсенситазацки ускорялись.

Действие арсената устранялось,как непосредственным введением в клетку экзогенного АТР, так и увеличением уровня эндогенного АТР в результате введения субстратов гликолиза (PEP (2мМ) ш ?-1 ,б-Р2 (Mi)). Нэйроны, подвергаваився воздействии арсената, были после удаления' АзО®~ еще более чувствительны к KgATP, чем без предварительной обработки

ингибитором. Интересно отметить, что пома обработки субстратами гликолиза быстрая фаза дэсанситизации, появившаяся под влиянием арсената,- исчэзала, а тм почти достигала контрольного значения (рис. 6).

контроль flsoj" отн. is 744д.pep, ц'

Рис. 6. Епзшнже добавления во внутриклеточный раствор Ha3As04 Б мМ и последущего введения в клетку смеси Г1 ,&Р2 (1 Ш) + PEP (2 Ш) на ответы нейрона на АХ. I - контроль, десенсжгизация описывается одаой медленной вкспонвнтой, т =

31 с; 2,2' - через 24 мин. после введения в клетку раствора

с НазАзОд 29 с, тс= 7,1 с; 3,3' - через 16 ш. отмывания арсената из нейрона, тм= 29 с, xQ= 4,8 с; 4 -через 28 мин. после введениями клетку субстратов гликолиза, быстрая фаза десенситизации исчезла , т = 29 с.

Пируват (2-6 мМ), не устранял эффектов арсената. Негидролизуемый аналог ATP - (ATP7S) в концентрации БмМ вместе с HgJQ^ после отмывания из нейронов арсената вызывал некоторое замедление десенситизации, которое однако было намного слабев, чем замедление от последующего применения KgATP в той же концентрации (рис. 7). Однако при применении другого негидролизуемого аналога ATP - (АМРРКР) вместе с Mg2+ аффекты арсената не только не устранялось наоборот,

Контроль fljOÎ",iV M}«rPj3,(3' MjflTP 30'

Ряс. 7. Влияние внутриклеточной перфузия раствором с MgATP-jS 5 ий1 и КдАТР 5 ы?1 после отанвания На3АзОД 10 мМ. I -контроль, дэсенснтизация описывается одной экспонентой, т =

40 с; 2,2* - через 14 мин. после введения в клетку раствора

с Na3Aa04, 29 с, тб= 3,4 с; 3,3* - через 15 мин.

отмывания арсэната из нейрона н введения в клетку HgATPfS,

20 с, 4,1 с; 4,4'- через 30 мин. после введения в клотку UgATP, 37 с, тй= 5,8 с.

продолжаюсь их развитие: дасенситазецая ускорялась и сгилтуда ответа на Aï рлвньиалась. Последуотее введение L'gATP оег'эдляло затухание отвэтов.

Необходимость îîg2* для еф5ектов АТР и нев^фэктивность iUPPSP указывает на то, что при действии АТР на НХР происходит его гидролиз.

Достаточно вероятный нам представляется лредполояение о стимуляции активного транспорта Са2+ во внутриклеточные депо, поскольку повыаенЕЭ концентрации внутриклеточного Саг+ приводит к быстрой инактивации НХР нейронов Цртава stagnaiia (Clieaerls et al., 1982). Однако, эффекты ATP медленно обратима, а арсената вообда необратимы при отмывании, тогда как инактивация НХР ионами кальция быстро

устраняете." црц сшашии кощвитраца: Са'*. Крокэ того, кг;: паказалг Чэкэрго и Циьш (Ctieiimris & IXJln, 1535), EiauxiüiirpyK^e дэйствие Саг+ сильно ослабевало при действии Еазоиа коицэнтрацкЕ АХ (порядка 10 (Ü!, как б е^к. опытах). Эта факты говорят о ток, что аффекты ligATP объясняется по гфайней каре на только транспортом Саг+ иле еоойцз но с&изаш* с нпм.

Другк» обьяснэнкем действия АТР к ATPtS на С1~-ток,

^ может '

активируемый НХР, быть фэсфорклироваика бэлков мембраны шгк

цзтоскэлэта, поскольку известно, что ATP-yS кокет слугить

донором ткофосфатной группы для протегисшшз и

попользоваться прк тиофэсфоррлйровашщ (Ра1т1гг,о et al.,

1935). В пользу последнего прэдполокекЕЯ говорит тот факт,

что шутршелаточноэ введение щелочной фэсфатазы в

концэЕтра1$31 100 цг/ил приводило к сшЕэнкз отвзтов на АХ и

ускорении двсенюиизацш, т. е. Еззывалэ аффекта,

противоположные действия АТР .

Б. Сравнений эффектов АГР на А-ток к С1~-ток, активир1амый НХР.

Б действии на характеристики А-тока к С1_-тока,

активируемого НХР, есть рад супэствэнных различий:

• ш-парных, для действия ¿ГР(пна С1~-ток, активируешЗ НХР, шобходам Kg^, тогда как для влияния на А-ток он не вукен;

во-вторых, дэйствиэ к арсената на С1~-ток,

активируемы!} НХР, развкваэтея значительно медленнее, чем на А-ток;

в-третьих, шгадролизуекай аналог ATP - ATP|S не влияет на А-ток, ко частично кмита¡рует влияние иа кинетику

затухаш!« С1~-тока, активируемого НХР;

" Поэтому ш предполагаем, что действие АТ^ на характеристика А-тока и С1~-тока, активируемого НХР, обусловлено различными механизмами, которые предстоит уточнять.

6. Возможное биологическое значение наблюдаемых эффектов.

Изменениэ потенциаяозависимооти стационарной - 14 -

кпактивсциз ч активации Л-тсиа и кинетики спада С1~-тояз, активируемого НХР, под влиянием АТР и 1,'д^ долззш до-нкэтму мнении влиять на вклад А-гсна з активность ритаоЕодгтоля л, следовательно, па частоту залпопсЗ антипности нэйрснэ, а такта из длительность синоптического отизтэ прл передаче сигнала через НХР в мезге. При спивении АТР следует создать ослабления участия Л-тока в злектрзческоЗ актзотости и учаг.опля генерация потенциалов действия, при nonuaeinoi jt!ol::.t АТР - :;г,айопот, усялсняя вклада Д-тока :i торкогзгпя ыгктрггссттЯ аэтгазпос-га.

ГСсяо гьсопз'пгао концентрация 11 -~эхат л

дтепэзс:» 'Г';!::0,"сп1тсксп. (Corkey fit al., 1985). Колгбгпхя гдет.'гмбрюшеЛ ,псга;зктр9;?з ЛТР зсяможа прл псвсгопст зегрузет гл vi?--ort.-oíjmarjM слс-гэга яги з усдсалях. Г.ар^::;.?"! ;роая езебо'тгаго жгут ¿ыть

сшдстечом зягхшга соот.клгокая лтр: vi'p: (сспспчых хелзтереп з з /зла снеже;;: прз а¡гкпхцла

глзколгзо. Тр-сл сбрзо-."!, ойс.'ругяяиая нгиа модуляция Л-тока :i тепа, члгта-прусмего ПХР, -.:иг:;апю, хюот супзсасзиюв зяачеппз in íjíiíc.

"ЖСДЦ.

"■этодсч лтц'трпют точного г.^зллза з услсглях г i

гезлэдяпегло апяпио глутртьяоточпего ЛТР п ;сзк :;сГ-гггорз ЛТР тз Засгсгяяясгеяс рэтаасот з хяэтхо, л ткг.:э ргаеттпп споссСсп псплз^стгхя на сштаз ондегмпгаго АТР на лврк'-отрч бтстр-сго :н4ходаг,ега if-тока а лходяг.эго С1~-тоиа, зятструсгюга НХР.

1. Обвврупзг.о, что ааутрпклчточнмй ДТР приводил к с.елцзяию :q:.i. чх штешцюлоззЕазжсста стгцпснзрясЗ знахтгЕвацал я еитассцпи А-токэ в сторспу rflvaisxpziisaza. ЛТР з ксюлэксэ с "'jj24 земоддял затухгяпз 01-~?ска, обусловленное досекситкзацзой НХР.

2. Псназеш, что зшггбитор гликолиза зреекзт затрия, а такзе вяутртслеточшЗ Ид24' вызывала претипепологзие изменения: сдепг кривых штеицгалозавясшгостз стпцяснпряса активации и инактивации А-тока з сторону гяпэрполяразециа, снижение вызванного АХ тока з ускоренпе десенсятизации. Действие арсеяата Соло яеобратмо при откязаниз.

3. После нзтацзшш запаса эндогенного ЛТР с шмегдо

арсената, KgATP, а таюке субстраты гликолиза восстанавливала негодные параметры А-тока и ответов на АХ. Субстрат окислительного (¡реформирования пируват был неэффективен. Таким образом, продемонстрирована преобладапцая роль гликолиза в модулировании токов в данных условиях.

4. Нвгидролизуемые аналоги АТ? вместе с Mg24 не восстанавливали потенциалозависимость А-тока после удаления арсената; ATFtS,.ho нэ AMPPNP, замедлял затухание С1~-тока, активируемого НХР, но слабее, чем KgATP.

5. Показано, что щелочная фосфатаза приводила: к изменениям, противоположным действии KgATP: вызывала смещение потенциалозависимости А-тока в сторону гиперполяризации и ускорение. затухания ответов на АХ.

6.Совокупность данных позволяет предположить, что действие АТР и KgATP обусловлено фосфорилированием белков А-ка-нала и НХР или сопряженных белков. Однако, в проведенных экспериментах мезвду двумя типами токов обнаружены существенные различия: в действии негидролязуомнх аналогов, по степени необходимости ионов для развития эффектов АТР и времени развития эффектов, что указывает на различие реакций.

7. Обнарукенные явления могут иметь место в нервной ткани (п vivo при пшоэнергвтических состояниях и последупцих компенсаторных реакциях.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Лозовая H.A., Вульфиус S.A., Эрдели Л., Ильин В.И. утриклеточный магний - модулятор ионной проницаемости вктро- и хемовозбудимых каналов мембран нейронов. Тез. кл. Всесоюзного симпозиума " Одиночные ионные каналы в магических мембранах". Карадаг: 1Э89, с. 58

2. Лозовая H.A., Вульфиус Е.А., Эрдели Л., Ильин В.И. дулирупцее влияние внутриклеточного магния на быстрые ходящие калиевые токи в нейронах моллюска. // алогические мембраны, 1990, т. 7, N 2, с. 198-204

3. Лозовая H.A., Вульфаус Е.А., йлыт В.И. Роль вментов цитоскелета во внутриклеточной регуляции каналов :строго калиевого тока. Таз. докл. Всесоюзного симпозиума" иные каналы в биологических мембранах". Карадаг:1990, с.43

4. L.Erdelyi, V.I.Ilyin, N.A. Lozoraya and O.A. ilílus. Intracellular Mg24' modulates the A-currenta and Its ockage by catechol In isolate! Lyunaea neurons. // uroscience Letters, 117 <1990), 99-104.

5.Лозовая H.A., Вульфяус E.A., Ильин В.И., Крастс И. В. иетяка десенситизации никотиновых рецепторов зависит от утриклеточного АТР. //ДАН СССР, 1990, т.315, с.741-744.

6. Лозовая H.A., Вульфиус Е.А., Ильин В.И., Крастс Я.В. задние внутриклеточного АТР на потенциалозависимость íCTpux калиевых токов в нейроне моллюска. // Биологические 'Мбрзны, I99X, Т.8, С 861-870.

7. Лозовая H.A., Вульфкус Е.А., Ильин В.И., Крастс В. Влияние внутриклеточного АТР пз десенситизации 1Йронзльных никотиновых холннорецепторов к ацетилхолину. В i. "Клеточная сигнализацая и ее использование вдля [рзвления функцией клетки и биотехнологии", 1991, в печати.

8. Ильин В.И., Лозовая H.A., Вульфиус Е.А., Эрдели Л., ¡следование модуляции нейронального А-токз внутриклеточным птшем. Там se.

9. H.A. Lozoyaya, O.A. Vulíius. V.I.Ilyin, I. V. Kraats "he role of energy metabolism in modulation of nicotinic :etylcholine receptora in molluscan neurones", IV iviet-FRG synposium "Receptora and ion chamela" Ко scow, >91, p. 6.

10. N.A. Lozoraya, O.A. Vulíius. V.I.Ilyin, I.V. Kraats iiergy metabolism affecta TOltage dependence of fast •ansieht potassium current in Зцушаеа stagnalia euronea", C&td, P- 41.